CN111454927B - 一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统及其应用,本发明利用λRed重组酶促进模板DNA与基因组靶位点发生双交换,结合CRISPR/Cas9系统作为筛选手段,结合一步法同源重组快速构建打靶质粒,可实现基因的插入、替换或敲除。本发明完全根据设计同源模板替换基因组DNA,无其他片段残留。本发明可在3~4天内高效完成基因组编辑,降低实验强度,缩短实验周期。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,具体涉及一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统及其应用。
背景技术
沙门氏菌是常见的人畜共患病原菌,是各国细菌性食物感染中最常见的致病菌,能导致胃肠炎、伤寒、败血症及肠外灶性感染等多种症候群。通过基因组编辑技术改造沙门氏菌基因组,获得不同遗传背景的菌株,有助于研究沙门氏菌生长、繁殖及其致病过程的机制,为预防和治疗奠定基础。减毒沙门氏菌还能够应用于肿瘤治疗,例如,减毒沙门氏菌VNP20009菌株在动物模型上对多种肿瘤有一定的治疗效果。对沙门氏菌基因组进行遗传改造是进一步提升其治疗效果的重要手段,可通过改造沙门氏菌基因组上的侵染、运动或代谢等相关基因,或将治疗基因整合到细菌染色体上稳定表达提高治疗效果,或将报告基因整合到染色体上稳定表达进行体内示踪。
基于λ噬菌体的Red同源重组系统是常用的改造细菌基因组的方法,在大肠杆菌[Datsenko,K.A.2000]和沙门氏菌[Husseiny M I等,2005;Solano C等,2010]中均有应用。利用Red同源重组方法敲除后的基因组中会留下抗性基因筛选标记,或去除标记后残留80bp左右的FRT(重组酶FLP识别位点)序列疤痕[Datsenko,K.A.2000],残留的疤痕序列会限制利用该系统进一步改造其他基因。近来发展了一些无痕基因编辑方法,如基于I-SceI及λRed的无痕编辑系统[Kim J等,2014;Blank K等,2011],仍存在实验过程繁琐、周期较长,难以进行大片段插入等缺点。
来源于链霉菌的获得性免疫系统CRISPR-Cas9(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins,成簇的规律间隔的短回文重复序列及关联蛋白)系统是近年出现的高效的基因编辑工具,已在诸多真核细胞及包括大肠杆菌,链霉菌,梭状芽孢杆菌,乳酸菌[Jiang Y等,2015]等原核细胞上获得了应用。CRISPR/Cas9系统包含两个部分:sgRNA及核酸酶Cas9,sgRNA通过特异的20个碱基序列靶向基因组上的靶位点,介导Cas9切割该位点DNA双链,能够提高同源重组比例或起到筛选作用。但是,这个来源于链霉菌的基因编辑工具能否在沙门氏菌上应用。如果能够适用的话,应该怎样进行改造才能够在沙门氏菌中方便地开展基因组编辑,这些问题都无人探讨和研究过。
目前,缺乏一种快速高效无痕的沙门氏菌基因编辑系统及其应用。
发明内容
本发明目的在于提出一种快速高效无痕沙门氏菌基因编辑系统及其应用。
为了解决上述技术的问题,本发明提供了如下技术方案:本发明的一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统,所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统包括Cas9蛋白、sgRNA、λRed重组酶和同源重组的DNA片段及携带或表达这些组分所用的载体及基因序列。
进一步地,所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统由双质粒CRISPR/Cas9系统构成,包含表达相关功能蛋白的辅助质粒A及表达靶位点sgRNA的打靶质粒B。
进一步地,所述的辅助质粒A包含以下元件的核酸序列:Cas9蛋白、λRed重组酶、温敏型复制子、打靶质粒B复制子的sgRNA表达框和辅助质粒A筛选标记基因,其中重组酶及sgRNA为诱导表达。
更进一步地,所述的打靶质粒B包含以下元件的核酸序列:复制子、打靶质粒筛选标记基因、靶位点sgRNA表达框以及进行同源重组的DNA片段,所述的辅助质粒A和打靶质粒B所含有的复制子可在大肠杆菌及沙门氏菌中复制,其中质粒B的复制子及筛选标记基因应与质粒A不同,且打靶质粒B不可选用与辅助质粒A不相容的复制子。
进一步地,所述的sgRNA表达框具有启动子-(N)X-sgRNA骨架-终止子结构,所述的靶位点DNA具有5’-(N)X-NGG-3’结构,(N)X表示X个N,N为A、T、C或T任一碱基,X为大于15小于25的自然数。
进一步地,所述的靶位点DNA的X为20,所述的同源重组的DNA片段用于敲入或替换时为上游同源臂-插入片段-下游同源臂,用于敲除时为上游同源臂-下游同源臂,该DNA片段构建在打靶质粒B中或PCR产物中;所述基因编辑系统可同时对多个靶位点进行基因编辑。
更进一步地,所述的打靶质粒B包含多个靶位点的编辑模块,结构为质粒骨架(抗性基因-复制子)-编辑模块1(靶位点1sgRNA表达框-上游同源臂1-敲入(或替换)片段-下游同源臂1)-编辑模块2(靶位点2sgRNA表达框-上游同源臂2-敲入(或替换)片段-下游同源臂2)-编辑模块n;但随着靶位点增多,编辑成功率逐渐下降,且考虑质粒构建的时间成本,一般不超过3个靶位点。
本发明的一种打靶质粒B的构建方法,包括如下步骤:
(1)用于敲入(或替换)时:分别扩增打靶质粒B骨架,靶位点sgRNA表达框,上/下游同源臂,敲入(或替换)片段,使用一步法同源重组连接所有DNA片段;
(2)用于敲除时:分别扩增打靶质粒B骨架,靶位点sgRNA表达框,上/下游同源臂,使用一步法同源重组连接所有DNA片段;
(3)打靶质粒B也可不包含同源臂,上/下游同源臂单独扩增连接作为线性DNA模板。
本发明的一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统在基因组编辑中的应用方法,包括如下步骤:
(1)将辅助质粒A导入沙门氏菌,诱导λRed重组酶表达,制备感受态细胞;
(2)向步骤(1)所述感受态细胞导入打靶质粒B及线性DNA模板;或导入包含模板DNA的打靶质粒B;
(3)将步骤(2)的细胞复苏后涂布平板,该平板含有质粒A及B对应的两种抗性,筛选发生了双交换的阳性克隆;
(4)将对阳性克隆进行PCR或测序验证后,诱导打靶质粒B复制子的sgRNA表达,去除所含质粒B;
(5)验证去除质粒B后,提高细菌培养温度,去除质粒A,获得改造成功的沙门氏菌克隆。
进一步地,在步骤(4)结束后,保留质粒A,重新进行步骤(2),导入靶向其他位点的打靶质粒B及模板DNA。
本发明的一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统在沙门氏菌基因组编辑中的应用。
本发明的一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统在制备沙门氏菌抗肿瘤药物中的应用。
本发明的一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统在基因组编辑制备eutC基因缺失的沙门氏菌中的应用。
本发明的所述的基因组编辑eutC基因缺失的沙门氏菌在制备沙门氏菌抗肿瘤药物中的应用。
本发明的一种实施方式中,质粒A为pCas[6],包含:组成型表达Cas9蛋白;λRed重组酶(Exo、Beta和Gam三个蛋白),λRed的启动子ParaB受L-阿拉伯糖诱导表达;温敏复制子repA101;打靶质粒B复制子的sgRNA表达框,sgRNA的启动子Ptrc受乳糖操纵子调控;卡那霉素抗性基因及乳糖阻遏蛋白lacI。
本发明的一种实施方式中,质粒B为pTAT质粒,按照片段1质粒骨架(包含pMB1复制子,氨苄霉素抗性基因),片段2靶位点sgRNA表达框,片段3模板DNA(靶位点上游同源臂,外源插入DNA,靶位点下游同源臂)连接而成。实际应用中连接顺序可随意组合。
有益效果:本发明借助CRISPR/Cas9系统,将基因组上的靶位点(N)X-NGG序列作为反向筛选野生型沙门氏菌的靶点,建立高效、稳定的沙门氏菌无痕基因编辑方法。该方法利用组成型启动子持续表达Cas9蛋白及靶位点sgRNA,持续切割野生型细菌(N)X-NGG序列处的DNA双链,细菌不能或来不及修复DNA损伤,就无法存活。只有自发或借助λRed重组酶,靶位点DNA与模板DNA发生了双交换的阳性克隆,不再具有(N)X-NGG序列,才能存活。同时利用诱导表达的sgRNA切割质粒B的复制子DNA,从而可以快速去除质粒B,提高操作效率。
附图说明
参考以下附图,将有助于更好地理解本发明的方案;
图1为本发明的打靶质粒B pTAT-X-insert质粒的设计及构建示意图;P1~P10为引物,上:靶位点上游同源臂,下:靶位点下游同源臂,X:靶位点序列,insert:插入片段;a为pTA质粒及其引物设计示意图;b为野生型沙门氏菌基因组靶位点及其引物设计示意图;c为pTAT-X质粒及其引物设计示意图;
图2为本发明的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统的流程图;
图3为本发明的沙门氏菌VNP20009 msbB位点替换RFP实施例PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图;其中,1-15为实验组沙门氏菌;V为对照组沙门氏菌;M为DNA分子量Marker;
图4为本发明的msbB菌株的生长曲线图;以pCas-VNP为对照。三个独立重复,mean±SEM;
图5为本发明的msbB菌株的荧光强度图;以pCas-VNP为对照。三个独立重复,mean±SEM;
图6为本发明的沙门氏菌VNP20009 eutC位点替换RFP实施例PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图;其中,1~10为实验组沙门氏菌;V为对照组沙门氏菌;M为DNA分子量MarkerDL2000,条带分别为2000、1000、750、500、250、100bp;
图7为本发明的eutC菌株的生长曲线图;以pCas-VNP为对照。三个独立重复,mean±SEM;
图8为本发明的eutC菌株的荧光强度图;以pCas-VNP为对照。三个独立重复,mean±SEM;
图9为本发明的荷瘤小鼠肿瘤生长曲线图;分别为eutC::RFP组、msbB::RFP组与PBS空白组;
图10为本发明的荷瘤小鼠生存曲线图;分别为eutC::RFP组、msbB::RFP组与PBS空白组。
具体实施方式
下面结合附图对本发明内容作进一步详细说明。
本发明的附图和实施例,是对本发明的具体实施方式进行更加详细地说明,以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点,而不是对本发明的限制。
以下通过具体实施例进一步说明本发明。实施例中所涉及的方法如无特殊说明,均为本领域研究人员所理解的常规技术手段。实施例中所涉及的实验方法都是经过长时间的摸索,每个浓度点、时间点、引物序列等尝试了6个以上的有效数值范围,本实施例都只列举了其中的一个参数,而不是唯一的可选参数。实施例所涉及的试剂、材料等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
本发明的一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统,所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统包括Cas9蛋白、sgRNA、λRed重组酶和同源重组的DNA片段及携带或表达这些组分所用的载体及基因序列。
所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统由双质粒CRISPR/Cas9系统构成,包含表达相关功能蛋白的辅助质粒A及表达靶位点sgRNA的打靶质粒B。
所述的辅助质粒A包含以下元件的核酸序列:Cas9蛋白、λRed重组酶、温敏型复制子、打靶质粒B复制子的sgRNA表达框和辅助质粒A筛选标记基因,其中重组酶及sgRNA为诱导表达。
所述的打靶质粒B包含以下元件的核酸序列:复制子、打靶质粒筛选标记基因、靶位点sgRNA表达框以及进行同源重组的DNA片段,所述的辅助质粒A和打靶质粒B所含有的复制子可在大肠杆菌及沙门氏菌中复制,其中质粒B的复制子及筛选标记基因应与质粒A不同,且打靶质粒B不可选用与辅助质粒A不相容的复制子。
所述的sgRNA表达框具有启动子-(N)X-sgRNA骨架-终止子结构,所述的靶位点DNA具有5’-(N)X-NGG-3’结构,(N)X表示X个N,N为A、T、C或T任一碱基,X为大于15小于25的自然数。
所述的靶位点DNA的X为20,所述的同源重组的DNA片段用于敲入或替换时为上游同源臂-插入片段-下游同源臂,用于敲除时为上游同源臂-下游同源臂,该DNA片段构建在打靶质粒B中或PCR产物中;所述基因编辑系统可同时对多个靶位点进行基因编辑。
所述的打靶质粒B包含多个靶位点的编辑模块,结构为质粒骨架(抗性基因-复制子)-编辑模块1(靶位点1sgRNA表达框-上游同源臂1-敲入(或替换)片段-下游同源臂1)-编辑模块2(靶位点2sgRNA表达框-上游同源臂2-敲入(或替换)片段-下游同源臂2)-编辑模块n;但随着靶位点增多,编辑成功率逐渐下降,且考虑质粒构建的时间成本,一般不超过3个靶位点。
本发明的一种打靶质粒B的构建方法,包括如下步骤:
(1)用于敲入(或替换)时:分别扩增打靶质粒B骨架,靶位点sgRNA表达框,上/下游同源臂,敲入(或替换)片段,使用一步法同源重组连接所有DNA片段;
(2)用于敲除时:分别扩增打靶质粒B骨架,靶位点sgRNA表达框,上/下游同源臂,使用一步法同源重组连接所有DNA片段;
(3)打靶质粒B也可不包含同源臂,上/下游同源臂单独扩增连接作为线性DNA模板。
本发明的一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统在基因组编辑中的应用方法,包括如下步骤:
(1)将辅助质粒A导入沙门氏菌,诱导λRed重组酶表达,制备感受态细胞;
(2)向步骤(1)所述感受态细胞导入打靶质粒B及线性DNA模板;或导入包含模板DNA的打靶质粒B;
(3)将步骤(2)的细胞复苏后涂布平板,该平板含有质粒A及B对应的两种抗性,筛选发生了双交换的阳性克隆;
(4)将对阳性克隆进行PCR或测序验证后,诱导打靶质粒B复制子的sgRNA表达,去除所含质粒B;
(5)验证去除质粒B后,提高细菌培养温度,去除质粒A,获得改造成功的沙门氏菌克隆。
在步骤(4)结束后,保留质粒A,重新进行步骤(2),导入靶向其他位点的打靶质粒B及模板DNA。
本发明的一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统在沙门氏菌基因组编辑中的应用。
本发明的一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统在制备沙门氏菌抗肿瘤药物中的应用。
本发明的一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统在基因组编辑制备eutC基因缺失的沙门氏菌中的应用。
本发明的所述的基因组编辑eutC基因缺失的沙门氏菌在制备沙门氏菌抗肿瘤药物中的应用。
本发明的一种实施方式中,质粒A为pCas[6],包含:组成型表达Cas9蛋白;λRed重组酶(Exo、Beta和Gam三个蛋白),λRed的启动子ParaB受L-阿拉伯糖诱导表达;温敏复制子repA101;打靶质粒B复制子的sgRNA表达框,sgRNA的启动子Ptrc受乳糖操纵子调控;卡那霉素抗性基因及乳糖阻遏蛋白lacI。
本发明的一种实施方式中,质粒B为pTAT质粒,按照片段1质粒骨架(包含pMB1复制子,氨苄霉素抗性基因),片段2靶位点sgRNA表达框,片段3模板DNA(靶位点上游同源臂,外源插入DNA,靶位点下游同源臂)连接而成。实际应用中连接顺序可随意组合。
实施例1
一、材料与方法
1.菌株及培养方法
本实施例所用到的菌株和质粒都列于表1中。其中大肠杆菌DH5a作为克隆菌株,沙门氏菌VNP20009为待改造菌株。所有菌株均在LB培养基中培养,除含pCas质粒的菌株在30℃培养外,无特殊说明的话,其余菌株均在37℃培养。菌株在培养箱中静置或者于摇床中以220rpm进行振荡培养。细菌生长使用Eppendorf分光光度计测定600nm波长处的光吸收值(0D600)。
LB培养基配方:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L,固体培养基添加琼脂15g/L。根据需要在培养基中加入抗生素:卡那霉素(Kan+)工作浓度50mg/L,氨苄霉素(Amp+)工作浓度100mg/L。L-arabinose及IPTG作为诱导剂,按下述步骤中所标注的浓度加入到培养基中。本发明所用到的菌株与质粒如表1所示:
表1
2.试剂材料
质粒提取小量质粒提取试剂盒,PCR产物纯化使用琼脂糖凝胶纯化试剂盒均购自天根公司,构建质粒所用片段使用高保真PCR酶预混液2×Phanta Max Master Mix,鉴定PCR使用快速PCR酶预混液2×Rapid Taq Master Mix,DNA片段连接使用同源重组一步克隆试剂盒ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit等均购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
所有试剂均为市售。
3.PCR条件
如无特殊说明,为获得PCR产物的反应体系如表2所示:
表2
PCR反应条件为94℃5分钟,30个循环(94℃15s,56~58℃15s,72℃5分钟),72℃7分钟,16℃。72℃反应时间根据30秒/kb计算。
为进行PCR鉴定查看DNA片段长度的反应体系如表3所示:
表3
PCR反应条件为94℃5分钟,30个循环(94℃15s,56~58℃15s,72℃5分钟),72℃7分钟,16℃。72℃反应时间根据15秒/kb计算。
4.DNA连接与转化。
DNA片段同源重组与转化条件。于冰上配制以下反应体系如表4所示:
表4
根据ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit说明书计算各DNA片段加入体积,每个片段最适使用量=[0.02×片段碱基对数]ng(0.03pmol),线性化克隆载体的使用量应在50ng-200ng之间,各插入片段的使用量应大于10ng。
重组产物取10μl加入到100μlDH5a感受态,冰上放置30分钟。42℃热激60s,立即置于冰上冷却3分钟。加入900μl无抗LB培养基,37℃摇菌1小时。5000g离心5分钟,弃掉900μl上清,剩余培养基将菌体重新悬浮,涂布正确抗性的培养平板,37℃倒置培养过夜。
5.DNA测序
寄送质粒或菌液,由南京金斯瑞生物科技有限公司(金斯瑞)公司完成DNA测序。
6.沙门氏菌感受态制备
1)实验前一天,将沙门氏菌VNP20009菌株接种于3ml LB培养基中,37℃震荡培养过夜。2)次日转接于新鲜LB培养基中震荡培养,待OD600≈0.8时,5000g离心4分钟收集细菌。3)用10%甘油洗涤3次,调节每管细菌数量至1×109CFU,最后将细菌重新悬浮于80μl10%甘油中。
7.沙门氏菌电转化
1)将质粒X ug加入沙门氏菌VNP20009感受态,混匀后加入2mm Bio-Rad电击杯。2)使用Gene Pulser XcellTM电穿孔仪,电击参数设置为2400V、25μF、400Ω,电击。3)电转化后在适宜温度下于无抗LB中复苏1小时,涂于相应抗性的LB平板上,适宜温度倒置培养过夜。
实施例2
基因编辑系统的设计和构建
msbB改造位点选择及sgRNA设计。鼠伤寒沙门氏菌菌株VNP20009基因组全序列数据获取自NCBI数据库,编号CP007804.2。沙门氏菌VNP20009菌株在pykA和yebA基因之间的msbB基因已经部分缺失,首先选择在这两个基因位点之间插入片段,替换529bp基因组序列(CP007804.2,1,886,524~1,887,052),预期不会改变菌株的特性。在被替换序列中选择具有5’-(N)X-NGG-3’结构的序列,(N)X表示X个N,N为A、T、C或T任一碱基,X为大于15小于25的自然数。本例选择了其中的一个序列设计:atgtcgacgccccagccatg,即msbB-N20,根据选取的N20序列设计引物pTargetF-msbB-F(序列为atgtcgacgccccagccatggttttagagctagaaatagc)构建打靶质粒,从而表达出可以介导Cas9蛋白切割msbB基因相应靶位点的sgRNA。
TagRFP-ORF设计。终止子B0014-启动子J23100-核糖体结合位点B0034-TagRFP蛋白-终止子B0015,共1073bp,由金斯瑞公司合成。具体序列如序列表中序列1。
质粒BpTAT-X-insert质粒设计及构建(图1)。设计引物(如表5),通过PCR分别扩增载体、目的基因sgRNA、目的基因上游同源臂、插入片段、目的基因下游同源臂。上述DNA片段两两之间具有15~20bp的同源序列,可以通过一步法同源重组连接多个片段,缩短试验周期。
目的基因sgRNA引导Cas9切割位点目的DNA序列,该DNA序列具有5’-(N)X-NGG-3’结构,该方法设计时无insert片段,直接连接目的基因上下游同源臂,即可进行基因敲除。
该方法在进行点突变时,通过设计引物PCR得到携带突变位点的同源模板,即可进行基因组点突变。本例所用引物如表5所示:
表5
pTA载体构建。沙门氏菌VNP20009菌株基因组自带aadA基因表达链霉素腺苷酰转移酶,需要将pTargetF的aadA抗性基因更换为合适的抗性基因作为筛选标记。本实验构建的pTargetT-msbB-RFP(序列未展示)无法在沙门氏菌VNP20009中工作,表明不是所有设计和构建的质粒都是可以工作的,而是需要进行实验筛选和选择的。替换pTargetF抗性基因aadA为AmpR。引物pT V-F/pT V-R以pTargetF为模板PCR扩增载体;引物pT amp-F/pT amp-R以pET-22b(+)为模板PCR扩增AmpR。胶回收纯化上述两个线性DNA片段,通过一步同源重组(依据上述DNA连接条件)37℃连接30分钟。重组产物取转化DH5a后,涂布Amp+抗性平板,37℃倒置培养过夜。挑选单克隆验证。
pTAT-msbB-RFP质粒构建(如序列表中序列2)。构建方法如图1,引物pTargetF-msbB-R(P1)/pTA-载体-R(P10)以pTA质粒为模板PCR扩增pTAT载体骨架;引物pTargetF-msbB-F(P2)/pTA-载体-F(P3)以pTA质粒为模板扩增msbB-sgRNA;引物pTA-RFP上-F(P4)/RFP-msbB-上-R(P5)以沙门氏菌VNP20009基因组为模板扩增msbB位点上游同源臂678bp;引物RFP-msbB-中-F(P6)/RFP-msbB-中-R(P7)以合成TagRFP片段为模板扩增RFP-ORF;引物RFP-msbB-下-F(P8)/pTA-RFP下-R(P9)以沙门氏菌VNP20009基因组为模板扩增msbB位点下游同源臂587bp。胶回收纯化上述五个线性DNA片段,通过一步同源重组(依据上述DNA连接条件)37℃连接30分钟,重组产物取转化DH5a后,涂布Amp+抗性平板,37℃倒置培养过夜。挑选单克隆验证。验证引物msbB-N20/pTA-PCR鉴定-R,阳性克隆PCR条带为2770bp。
实施例3
将沙门氏菌VNP20009 msbB位点替换为RFP基因
沙门氏菌高效无痕基因编辑系统的应用流程图如图2所示。第一天向沙门氏菌转入pCas质粒,该步骤所得菌株可保种用于一系列靶基因的编辑。第二天制备pCas-沙门氏菌感受态时加入L-阿拉伯糖诱导表达λ-Red重组酶,然后转入pTAT-X质粒,涂布Kan+/Amp+平板。阳性克隆中同源模板与目的基因进行双交换,野生型克隆被X-N20 sgRNA介导Cas9持续切割双链DNA导致野生菌株难以生长。第三天挑取单克隆鉴定基因组编辑效果,编辑成功的克隆加入IPTG诱导靶向pTAT-X质粒的复制子的pMB1-N20 sgRNA表达,去除pTAT质粒。如需进行多基因改造,该步骤获得的菌株含有pCas质粒,可进一步用作其它基因改造的宿主菌,进行新一轮编辑。第四天42℃培养去除pCas质粒。本例所用引物如表6所示:
表6
pCas质粒电转化沙门氏菌VNP20009。制备沙门氏菌VNP20009感受态如材料与方法6所述。将pCas质粒1μg加入沙门氏菌VNP20009感受态,电转化后30℃于无抗LB中复苏1小时,涂于Kan+抗性LB平板上,30℃倒置培养过夜。挑取单克隆30℃培养保种,获得pCas-VNP20009(pCas-VNP)菌株。鉴定引物pCas-鉴定-F/pCas-鉴定-R,含pCas质粒阳性菌落条带为765bp。
制备沙门氏菌pCas-VNP20009感受态。1)挑选电转获得的沙门氏菌pCas-VNP菌株,在Kan+抗性LB平板划线,30℃培养过夜。2)挑取单克隆,于Kan+LB培养基中震荡培养,OD600至0.2~0.3时加阿拉伯糖(10mM终浓度),诱导Red重组酶表达。3)至OD600约为0.6~0.8时,5000g离心4分钟收集细菌。4)用10%甘油洗涤3次,调节每管细菌数量至1×109CFU,最后将细菌重悬于80μl 10%甘油中。
pTAT-msbB-RFP质粒电转化沙门氏菌pCas-VNP。将pTAT-msbB-RFP质粒1ug加入沙门氏菌pCas-VNP感受态,电转化后30℃于无抗LB中复苏1小时,涂于Kan+/Amp+抗性LB平板上,30℃倒置培养过夜。
msbB位点RFP替换验证。在上述Kan+/Amp+抗性LB平板上述若干单克隆,同时以沙门氏菌VNP20009野生型(WT)克隆作为阴性对照,使用引物msbB-RFP-鉴定-F/msbB-RFP-鉴定-R,菌落PCR后进行琼脂糖凝胶电泳。敲入成功的阳性条带为2475bp,未敲入成功或WT阴性条带为1931bp。编辑效率=阳性菌落数/总菌落数X 100%。
msbB位点RFP替换结果如图3所示,15个单克隆中有14个敲入成功,1个失败,编辑效率为93.3%。
pTAT质粒的消除。验证敲入成功的克隆转接至3ml Kan+LB培养基,加入IPTG(终浓度0.5mM)于30℃培养8小时,诱导靶向pTAT复制子的sgRNA表达,结合Cas9使pTAT质粒复制子处DNA双链断裂。培养后的菌液在Kan+/Amp+抗性LB平板及Kan+抗性LB平板上划线。如双抗平板无沙门氏菌克隆生长,则已消除pTAT质粒,如有沙门氏菌克隆长出,则再次在含IPTG的Kan+LB培养基中转接。从Kan+抗性平板上挑选若干单克隆于10ul无菌水中吹打混匀,分别将5μl加入Kan+LB及Kan+/Amp+LB,仅在Kan+LB长出的沙门氏菌单克隆即确认pTAT质粒已消除。亦可对在IPTG诱导后Kan+平板上长出的若干沙门氏菌单克隆直接进行PCR鉴定,如使用引物pTA-PCR鉴定-R/RFP-msbB-下-F,以未去除pTAT的沙门氏菌克隆作为阳性对照,PCR鉴定无条带,即表明pTAT质粒已去除。
pCas质粒的消除。将已去除pTAT质粒的沙门氏菌克隆转接无抗LB,于42℃培养8小时,菌液在无抗LB平板上划线,挑选沙门氏菌单克隆分别转接Kan+或无抗LB,在Kan+LB中不生长的沙门氏菌克隆即去除pCas成功。
细菌菌体生长曲线及荧光测定。分别挑选三个去除pTAT质粒的克隆及三个含有pCas的沙门氏菌克隆,转接到3ml Kan+LB中过夜培养。向Bioscreen全自动生长曲线分析仪专用培养板中每孔加入300ul Kan+LB培养基,加入1μl过夜菌液。30℃培养24小时。上述过夜培养菌液按照1/1000体积转接到3ml Kan+LB试管中,30℃培养24小时,使用TECANInfinite M200酶标仪测量RFP荧光强度(激发波长550nm,发射波长590nm)及OD600。
沙门氏菌msbB菌株的生长曲线如图4,编辑成功的沙门氏菌克隆msbB::RFP与沙门氏菌pCas-VNP生长曲线无显著区别,说明本专利发明的一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统技术定位准确、设计精准,未产生除目标靶点外CRISPR-Cas9可能发生的脱靶现象。三个独立重复,mean±SEM。
沙门氏菌msbB菌株的荧光强度如图5。编辑成功的沙门氏菌克隆msbB::RFP检测到显著的荧光,沙门氏菌VNP20009基本等同LB背景荧光值。荧光计算公式为(荧光-荧光LB)/(OD-ODLB),三个独立重复,mean±SEM。
实施例4
将沙门氏菌VNP20009 eutC位点替换为RFP基因
构建pTAT-eutC-RFP质粒(序列3)。用RFP-ORF替换eutC-ORF中的636bp(CP007804.2,2,508,639~2,509,274)。选择5'-ggcgctgttgcgcttcctgg-3'为eutC2-N20,根据选取的N20序列设计引物pTA-eutC2-F(序列为ggcgctgttgcgcttcctgggttttagagctagaaatagc)构建打靶质粒,从而表达出可以介导Cas9蛋白切割msbB基因相应靶位点的sgRNA。引物pTA-eutC2-R/pTA-载体-R扩增以pTA质粒为模板PCR扩增pTAT载体骨架;引物pTA-eutC2-F/pTA-载体-F以pTA质粒为模板扩增eutC2-sgRNA;引物eutC2-质粒模板上-F/eutC2-上RFP-R以沙门氏菌VNP20009基因组为模板扩增eutC位点上游同源臂301bp;引物RFP-msbB-中-F/RFP-msbB-中-R以合成TagRFP片段为模板扩增RFP-ORF;引物eutC2-下RFP-F/eutC2-质粒模板下-R以沙门氏菌VNP20009基因组为模板扩增eutC位点下游同源臂304bp。连接步骤同实施例1。验证引物eutC2-N20/pTA-PCR鉴定-R,阳新克隆PCR条带为2110bp。本例所用引物如表7所示:
表7
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制备沙门氏菌pCas-VNP感受态方法同实施例2。
pTAT-eutC-RFP质粒电转化沙门氏菌pCas-VNP方法同实施例2。
eutC位点RFP替换验证。方法同实施例2。eutC-RFP-鉴定-F/eutC-RFP-鉴定-R,敲入成功的阳性条带为1953bp,未敲入成功或野生型阴性条带为1750bp。
eutC位点RFP替换结果如图6所示,10个单克隆中有9个敲入成功,1个失败,编辑效率为90%。
pTAT-eutC-RFP质粒及pCas质粒的去除方法同实施例2。
eutC菌株的生长曲线如图7,编辑成功的沙门氏菌克隆eutC::RFP与沙门氏菌pCas-VNP生长曲线无显著区别,说明本专利发明的一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统技术定位准确、设计精准,未产生除目标靶点外CRISPR-Cas9可能发生的脱靶现象。三个独立重复,mean±SEM。
eutC菌株的荧光强度如图8。编辑成功的沙门氏菌克隆eutC::RFP检测到显著的荧光,沙门氏菌VNP20009基本等同LB背景荧光值。荧光计算公式为(荧光-荧光LB)/(OD-ODLB),三个独立重复,mean±SEM。
试验例1
基因编辑的沙门氏菌VNP20009 eutC的抗肿瘤应用评价
B16F10黑色素瘤小鼠模型的构建。B16F10小鼠黑色素瘤细胞在DMEM细胞培养基中生长至指数生长期后用0.5%胰酶消化,接着1000rpm/min离心3min,去除上清培养液后用PBS洗涤2次后进行细胞计数,最后用PBS重悬细胞将细胞终浓度调整为2×106个/ml。每只C57BL/6小鼠接种100ul于小鼠腋下脂肪垫处,即2×105个/只。接种后小鼠饲养于清洁级动物房中,待小鼠肿瘤体积生长至约150mm3时进行后续实验。
评价改造菌株抗肿瘤效果。无质粒的沙门氏菌VNP20009-msbB::RFP(msbB)及沙门氏菌VNP20009-eutC::RFP(eutC)菌株在无抗LB平板划线37℃培养过夜,挑去沙门氏菌单克隆转接3ml LB复苏,再转接至3ml LB培养至OD值为0.8左右,随后5000g离心3分钟收集菌体,用无菌PBS洗涤两遍,用PBS重悬细菌将其终浓度调整为1×106cfu/ml。随后取荷瘤小鼠22只,随机分为3组(PBS组6只,msbB及eutC组8只),分别腹腔注射msbB及eutC沙门氏菌菌株100μl,即1×105cfu。PBS组腹腔注射100μlPBS。连续记录肿瘤大小及小鼠存活状态。
荷瘤小鼠肿瘤生长曲线如图9。沙门氏菌eutC组与沙门氏菌msbB组肿瘤大小无显著差异,说明eutC基因缺失对沙门氏菌VNP20009抑瘤效果影响不显著,从而验证了体外的细菌生长的结果。但沙门氏菌实验组较阴性对照PBS有显著抑瘤效果。
荷瘤小鼠生存曲线如图10。沙门氏菌eutC组小鼠生存时间较沙门氏菌msbB组显著延长(P<0.05),沙门氏菌组较PBS组均显著延长小鼠生存时间。沙门氏菌eutC组小鼠生存时间较沙门氏菌msbB组显著延长的结果与体外细菌生长的结果以及图9结果的显著不同,显示出利用本专利发明的一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统技术改造产生的沙门氏菌eutC具有制备抗肿瘤药物的应用前景。
利用本专利发明的一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统技术,本专利还围绕沙门氏菌染色体的复制起始位点选择了在染色体上选择了均匀分布的8个不同的靶位点/靶基因进行编辑,其位置分别位于细菌染色体的245,209、1,290,176、1,886,549、2,509,349、3,299,845、3,988,068、3,996,444、4,483,494bp位置,编辑效率均在90%以上,从而系统性验证了本专利发明的一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统技术在沙门氏菌基因组编辑的高效性。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述试验例的限制,上述试验例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
Claims (7)
1.一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统在沙门氏菌基因组编辑中的应用,其特征在于包括如下步骤:所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统由双质粒CRISPR/Cas9系统构成,包含表达相关功能蛋白的辅助质粒A及表达靶位点sgRNA的打靶质粒B;所述的辅助质粒A包含以下元件的核酸序列:Cas9蛋白、λRed重组酶、温敏型复制子、打靶质粒B复制子的sgRNA表达框和辅助质粒A筛选标记基因,其中重组酶及sgRNA为诱导表达;所述的打靶质粒B包含以下元件的核酸序列:复制子、打靶质粒筛选标记基因、靶位点sgRNA表达框以及进行同源重组的DNA片段,所述的辅助质粒A和打靶质粒B所含有的复制子能在大肠杆菌及沙门氏菌中复制,其中质粒B的复制子及筛选标记基因应与质粒A不同,且打靶质粒B不可选用与辅助质粒A不相容的复制子;所述的sgRNA表达框具有启动子-(N)X-sgRNA骨架-终止子结构,所述的靶位点DNA具有5’-(N)X-NGG-3’结构,(N)X表示X个N,N为A、T、C或T任一碱基,X为大于15小于25的自然数;
所述沙门氏菌基因组编辑的具体步骤为:
(1)将辅助质粒A导入沙门氏菌,诱导λRed重组酶表达,制备感受态细胞;
(2)向步骤(1)所述感受态细胞导入打靶质粒B及线性DNA模板;或导入包含模板DNA的打靶质粒B;
(3)将步骤(2)的细胞复苏后涂布平板,该平板含有质粒A及B对应的两种抗性,筛选发生了双交换的阳性克隆;
(4)将对阳性克隆进行PCR或测序验证后,诱导打靶质粒B复制子的sgRNA表达,去除所含质粒B;
(5)验证去除质粒B后,提高细菌培养温度,去除质粒A,获得改造成功的沙门氏菌克隆。
2.根据权利要求1所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统在沙门氏菌基因组编辑中的应用,其特征在于:所述的靶位点DNA的X为20,所述的同源重组的DNA片段用于敲入或替换时为上游同源臂-插入片段-下游同源臂,用于敲除时为上游同源臂-下游同源臂,该DNA片段构建在打靶质粒B中或PCR产物中;所述基因编辑系统可同时对多个靶位点进行基因编辑。
3.根据权利要求2所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统在沙门氏菌基因组编辑中的应用,其特征在于:所述的打靶质粒B包含多个靶位点的编辑模块,结构为包含抗性基因-复制子的质粒骨架-编辑模块1-编辑模块2-编辑模块n;
所述质粒骨架包含抗性基因-复制子,所述编辑模块1包含靶位点1sgRNA表达框-上游同源臂1-敲入或替换片段-下游同源臂1;编辑模块2包含靶位点2sgRNA表达框-上游同源臂2-敲入或替换片段-下游同源臂2;但随着靶位点增多,编辑成功率逐渐下降,且考虑质粒构建的时间成本,不超过3个靶位点。
4.根据权利要求1所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统在沙门氏菌基因组编辑中的应用,其特征在于:在步骤(4)结束后,保留质粒A,重新进行步骤(2),导入靶向其他位点的打靶质粒B及模板DNA。
5.根据权利要求1所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统在沙门氏菌基因组编辑中的应用,其特征在于:在沙门氏菌染色体全基因组均匀分布的不同的靶位点/靶基因的基因编辑效率均在90%以上。
6.根据权利要求1所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统在沙门氏菌基因组编辑中的应用,其特征在于:所述应用具体为构建eutC基因缺失沙门氏菌,其包括如下步骤:
(1)构建pTAT-eutC-RFP质粒,将沙门氏菌VNP20009eutC位点替换为RFP基因;
(2)制备沙门氏菌pCas-VNP感受态;
(3)将pTAT-eutC-RFP质粒电转化沙门氏菌pCas-VNP;
(4)eutC位点替换为RFP的验证;
(5)pTAT-eutC-RFP质粒及pCas质粒的去除;
(6)eutC::RFP菌株的生长曲线测定;
(7)eutC::RFP菌株中RFP表达水平测定。
7.根据权利要求6所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统在沙门氏菌基因组编辑中的应用,其特征在于:eutC基因缺失的沙门氏菌eutC组的肿瘤生存时间显著延长。
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