CN109652435A - 用于鼠伤寒沙门氏菌基因靶向点突变的重组质粒及相应的基因靶向点突变方法 - Google Patents

用于鼠伤寒沙门氏菌基因靶向点突变的重组质粒及相应的基因靶向点突变方法 Download PDF

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敬文宪
李学瑞
周建华
马丽娜
陈启伟
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Abstract

本发明提供用于鼠伤寒沙门氏菌基因靶向点突变的重组质粒，所述重组质粒含有Kan抗性基因与sacB基因片段。本发明还提供应用该重组质粒进行鼠伤寒沙门氏菌基因靶向点突变的方法。本发明结合red同源重组系统和自杀性质粒构建系统这两种方法的优点，成功构建了同时具备以上两种功能的重组质粒，同时本发明还结合了目前成熟的商品化的对质粒中基因进行点突变的试剂盒，成功的对鼠伤寒沙门氏菌进行了基因的靶向点突变。

Description

用于鼠伤寒沙门氏菌基因靶向点突变的重组质粒及相应的基 因靶向点突变方法
技术领域
本发明涉及用于鼠伤寒沙门氏菌基因靶向点突变的重组质粒，本发明构建成含有Kan抗性基因与SacB基因片段的质粒，在此质粒基础上，通过普通的red同源重组系统即可得到改造的目的基因，可用于对目标基因进行精准的点突变，本发明为给为精细的靶向基因功能的鉴定奠定了基础。
背景技术
基因功能组学的研究离不开基因的靶向操作系统，通过基因的靶向操作系统对目标基因进行有目的性的改造，并验证其所造成的生物学特性的改变，已成为目前生物学领域的热点，但对于鼠伤寒沙门氏菌的基因靶向操作系统主要有red同源重组系统和自杀性质粒构建系统，这些系统在鼠伤寒沙门氏菌的靶向基因敲除操作中都有出色的表现，red同源重组优势在于操作需要短的同源臂，而且同源臂短到可以设计在引物上，因此操作流程简便许多，但缺点是，在敲除基因后会产生疤痕序列，因此也就不能够用于基因点突变的构建；自杀性质粒构建系统能够对靶向基因进行操作，但需要很长的同源臂的构建，操作相对繁琐，但能够产生无任何外源序列的基因缺失，而且也主要更适用于基因的敲除。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明结合red同源重组系统和自杀性质粒构建系统这两种方法的优点，成功构建了同时具备以上两种功能的重组质粒，同时本发明还结合了目前成熟的商品化的对质粒中基因进行点突变的试剂盒，成功的对鼠伤寒沙门氏菌进行了基因的靶向点突变。
本发明提供用于鼠伤寒沙门氏菌基因靶向点突变的重组质粒，所述重组质粒含有Kan抗性基因与sacB基因片段。
作为优选，所述重组质粒的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1。
本发明提供上述重组质粒的制备方法，将Kan基因和sacB基因串联，然后通过含有red同源重组系统通用打靶片段扩增引物的引物对串联片段进行扩增，酶切连接转化入感受态细胞，诱导表达，得到重组质粒。
本发明提供一种鼠伤寒沙门氏菌基因靶向点突变方法，包括以下步骤：
(1)制备权利要求1或2所述的重组质粒；
(2)pKD46质粒转化鼠伤寒沙门氏菌感受态细胞；
(3)应用步骤(1)中所述的重组质粒制备线性打靶DNA片段；
(4)Red同源重组：将步骤(3)的线性打靶DNA片段与步骤(2)的pKD46质粒转化的鼠伤寒沙门氏菌感受态细胞进行Red同源重组；
(5)将目的改造序列进行点突变，并构建成线性基因点突变打靶DNA片段；
(6)基因点突变菌株的构建：将步骤(5)的线性基因点突变打靶DNA片段与步骤(4)Red同源重组的产物再进行一次Red同源重组。
作为优选，步骤(1)中，所述重组质粒的制备方法为：通过含有red同源重组系统通用打靶片段扩增引物的引物分别对Kan基因和sacB基因扩增，然后分别酶切后将两个片段经连接酶连接到质粒，转化入感受态细胞，诱导表达，得到重组质粒。
作为优选，所述扩增Kan基因的引物为：
Pet30akan-F-BamHI:CGCggatccAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCC
Pet30akan-R-EcoRI:CCGgaattcatatgaatatcctccttagGGAACAACACTCAACCCTATCT。
作为优选，所述扩增sacB基因的引物为：
sacb-F-sphI:ACATgcatgcgtgtaggctggagctgcttcCCATGCAACAGAAACTATAA
sacb-R-BamHI:CGCggatccAAGGTTAGGAATACGGTTAG。
作为优选，所述质粒为pHSG398；
作为优选，所述感受态细胞为大肠杆菌DH5α感受态细胞。
作为优选，步骤(3)中，包含用含有目的改造序列同源臂的引物扩增重组质粒的步骤。
作为优选，步骤(2)和步骤(3)的顺序互换。
本发明结合red同源重组系统和自杀性质粒构建系统这两种方法的优点，成功构建了同时具备以上两种功能的重组质粒，同时本发明还结合了目前成熟的商品化的对质粒中基因进行点突变的试剂盒，成功的对鼠伤寒沙门氏菌进行了基因的靶向点突变。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明的实验流程图。
图2为pKansacB质粒构建片段电泳图。
图3为CVCC541cpxR/kansacB菌株鉴定。
图4为CpxR点突变基因的构建。
图5为cpxR*打靶片段凝胶电泳。
图6为CVCC541cpxR*菌株鉴定。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1
以对CVCC541的cpxR基因进行点突变为例，来说明鼠伤寒沙门氏菌基因的靶向点突变方法。
图1为本发明的实验流程图。其中，步骤1，同源臂引物设计；步骤2，含有Kan和SacB盒子的打靶片段的扩增，并进行λRed同源重组；3：应用商品化的点突变试剂盒在相应质粒上构建目的改造序列并制成打靶片段；4：进行再一次的λRed同源重组。
1质粒pkansacB的构建
1.1通过引物设计将pet30a载体上的kan基因盒子扩增下来，并通过酶切连接转化对其kan抗性进行鉴定。
引物为：
Pet30akan-F-BamHI:CGCggatccAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCC
Pet30akan-R-EcoRI:CCGgaattcatatgaatatcctccttagGGAACAACACTCAACCCTATCT
扩增kan基因长度为1268bp。
下划线部分为酶切位点。
1.2通过参考文献的报道，送公司合成sacB基因，用下述引物进行PCR扩增，并通过酶切连接转化对其蔗糖敏感性进行鉴定。
引物为：
sacb-F-sphI:ACATgcatgcgtgtaggctggagctgcttcCCATGCAACAGAAACTATAA
sacb-R-BamHI:CGCggatccAAGGTTAGGAATACGGTTAG
sacB基因长度为1903bp。
下划线部分为酶切位点。
1.3将Kan基因和sacB基因这两个片段进行酶切连接转化，获得kan和sacB串联的片段。具体步骤为：
将Kan基因片段经BamHI和EcoRI酶切，sacB基因片段经sphI和BamHI酶切，两个片段经T4连接酶连接到经EcoRI和sphI酶切的质粒pHSG398。
将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布在氯霉素抗性(50ug/ml)的LB平板上,37℃培养过夜，挑取单个菌落进行PCR鉴定，将鉴定阳性的质粒送公司测序，确保序列正确。
1.4为进一步验证质粒pkansacB中Kan抗性基因与SacB基因片段是否具有相应的功能，分别对其Kan抗性及蔗糖敏感性进行鉴定，结果证明其对Kan(50ug/ml)具有抗性，对8％蔗糖具有敏感性，说明成功构建具有功能的pkansacB质粒。
含有red同源重组系统通用打靶片段扩增引物为：
P1:gtgtaggctggagctgcttc
P2:catatgaatatcctccttag
Kan-sacB片段的核苷酸序列为：
下划线序列为酶切位点，第一个方框中为sacB的ORF，第二个方框中为Kan的ORF，加粗序列为red同源重组系统通用打靶片段扩增引物P1和P2，斜体加粗序列为KansacB片段插入被编辑基因的鉴定引物Kansacb-k1/K2。
图2为pKansacB质粒构建片段电泳图；其中，M:250DNA Ladder Marker；1：Kan片段1268bp；2：sacB片段1903bp；3：KansacB片段3228bp。
2 CVCC541/pKD46菌株的构建
2.1菌种复苏
用接种环无菌挑取一环保存在甘油中的菌种鼠伤寒沙门氏菌CVCC541菌株，划线接种于LB琼脂平板上，倒置于37℃温箱中，培养12-18h，然后挑取单个菌落接种于LB肉汤中，37℃，200rpm，培养12h。
2.2 pKD46质粒转化CVCC541
2.2.1 CVCC541电转感受态的制备
(1)从新鲜的LB琼脂培养板上挑取单个CVCC541菌落，接种于5ml的LB液体培养基中，37℃，200rpm，过夜培养12-18小时；
(2)将过夜培养的菌液以1：100的体积比接种于50mL的新鲜LB液体培养基中，37℃，200rpm，每20min测一次OD值，直到OD值达到0.4-0.6；
(3)迅速将培养物冰浴30min，不时轻摇使菌液均匀充分冷却；
(4)将冷却的菌液转移到冷却的50mL离心管中，4℃，5500rpm，离心3-5min，弃去上清，用50mL预冷10％甘油重悬菌体；
其中，冷却的离心管的温度为4℃；预冷甘油的温度为4℃；
均为冰浴完成。
(5)4℃，5500rpm，离心3-5min，弃去上清，用25mL预冷10％甘油重悬沉淀；
(6)4℃，5500rpm，离心3-5min，弃去上清，用10mL预冷10％甘油重悬沉淀；
(7)4℃，5500rpm，离心3-5min，弃去上清，并小心吸取残留液体，用500μL预冷10％甘油重悬菌体。
(8)将重悬菌体按50μL/管分装到1.5mL的无菌预冷EP管中，封口，-70℃保存备用。
2.2.2 pKD46电转化
提取的100ng的pKD46与制备的CVCC541电转感受态进行混合后，转移到1mm规格的电转杯中，以2.3kV，2.5ms条件进行电转化，转化后加入1mL无抗生素的LB或SOC培养基中，200rpm，30℃，1h。取100μL均匀涂布在含Amp 100μg/mL的LB平板上，30℃培养筛选阳性转化子，得到CVCC541/pKD46菌株。
3线性含有Kan和sacB基因的打靶DNA片段制备
3.1以pkansacB质粒为模板，用cpxR-H1P1/H2P2引物扩增含有cpxR同源臂及kan和sacB基因的线性PCR产物，即线性打靶DNA片段。
cpxR-H1P1/H2P2引物为：
CpxR-H1P1:GATGATGACCGAGAGCTGACTTCCCTGTTAAAAGAGCTCCTCGAAgtgtaggctggagctgcttcCpxR-H2P2:CAATGTTTTAAACCACGGGTGACCGTCTTTGCGTTCCGGCAGTTTcatatgaatatcctccttag
3.2按Takara DNA凝胶回收试剂盒的说明书对PCR产物进行胶回收(条带不单一时)或PCR产物回收(条带单一时)。
3.3纯化后的PCR产物用Dpn I酶37℃酶切过夜，除去原有的质粒模板，再进行胶回收。
4 Red同源重组
重组菌CVCC541/pKD46，先1:100接种，30℃，200rpm，培养至OD600＝0.2时，在30mmol的L-阿拉伯糖中诱导1h，至OD600＝0.6。按步骤2.2.1进行制备电转感受态。
取100ng步骤3.3中得到的线性PCR产物，与CVCC541/pKD46进行混合，加入预冷的电转杯，以2.3KV、2.5ms进行电转，然后立即加入无抗生素LB/SOC液体培养基中，37℃静止培养1h，一半在含有kan(50μg/mL)的LB平板上筛选重组突变体，如不长斑，另一半在室温过夜后再次涂板进行筛选。
挑取重组子，5ml无抗生素LB，37℃，200rpm过夜培养(进行PCR鉴定)，接种于无抗生素LB平板上，42℃，进行克隆纯化，挑取单个菌落，稀释并分别加入Amp(100μg/mL)和Kan(50μg/mL)的LB中，鉴定pKD46是否消失，如不消失，再在42℃培养一次。
分别用引物Kansacb-k1/k2:1750bp，CpxR-F/Kansacb-k2:2500bp，Kansacb-k1/CpxR-R:4100bp，CpxR-F/R:5100bp对其进行PCR鉴定，结果见图3。对pKD46鉴定消失的重组子，并鉴定其是否具有蔗糖敏感性。同时具有kan抗性和蔗糖敏感性的菌株为目的菌株，命名为CVCC541cpxR/kansacB。
引物
CpxR-F:cagcgttgaggccataaca
CpxR-R:cgctacaagtgggtgaagaagg
Kansacb-k2:CGGATAAAATGCTTGATGGTCG
Kansacb-k1:GCCTGGACGTTTGGGACA。
图3为CVCC541cpxR/kansacB菌株鉴定；其中，M:250DNA Ladder Marker；1：Kansacb-k1/k2:1750bp；2：CpxR-F/Kansacb-k2:2500bp；3：Kansacb-k1/CpxR-R:4100bp；4：CpxR-F/R:5100bp。
5线性基因点突变打靶DNA片段制备与鉴定
5.1应用商品化的点突变试剂盒(点突变试剂盒的购买厂家为：全式金，商品名为：pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit)对目的cpxR基因进行点突变，并将其构建在BamH I酶切的pMD18-T载体上，操作步骤详见说明书；最后对其进行测序。
引物
D51(GAC)——A51(GCC)
CpxRSF：GAATTCGAGCTCGGTACCCGGgatgaataaaatcctgttagt
CpxRSR：catcatgacGGCaagcaaaagtaaatcga 162bp
扩增点突变片段的上游片段，下划线字母为点突变碱基。
CpxRXF:cttttgcttGCCgtcatgatgccgaaga
CpxRXR：CCTGCAGGTCGACTCTAGAgTCATgaagcggaaaccatca 558bp
扩增点突变片段的下游片段，下划线字母为点突变碱基。
5.2用引物CpxR*-F/R对以上点突变的基因进行扩增，并应用DpnI酶进行酶切消除模板质粒的影响，再进行胶回收，即获得点突变打靶片段。
引物CpxR*-F/R为：cpxR*-F:TCCTGTTAGTTGATGATGACCGAG
cpxR*-R:CATCAGATAGCCGCGACCAC 674bp
图4为CpxR点突变基因的构建；其中，M：250DNA Ladder Marker；1,2：点突变构建上游片段；3,4:点突变构建下游片段。
图5为cpxR*打靶片段凝胶电泳；其中，M：250DNA Ladder Marker；1：cpxR*打靶片段。
6基因点突变菌株的构建
将步骤4中获得的CVCC541cpxR/kansacB菌株再一次按照步骤2中的方法构建成CVCC541cpxR/kansacB/pKD46，并按照步骤4中的方法将步骤5获得的点突变打靶片段转入其中，并在37℃孵育1h，涂布于含有8％蔗糖的LB平板上，37℃，过夜培养。
挑取单个菌落，在无抗性LB中37℃培养过夜，并用同源臂的外围引物对其进行扩增鉴定，对鉴定为阳性的菌株进行PCR产物测序，对测序正确的菌株进行pkd46的鉴定，最终获得的测序正确无pkd46的菌株即为cpxR点突变菌株CVCC541cpxR*。
图6为CVCC541cpxR*菌株鉴定；其中，M：250DNA Ladder Marker；1-6：鉴定正确的CVCC541cpxR*；7：CVCC541cpxR/kansacB菌株对照。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 用于鼠伤寒沙门氏菌基因靶向点突变的重组质粒及相应的基因靶向点突变方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3228
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcatgcgtgt aggctggagc tgcttcccat gcaacagaaa ctataaaaaa tacagagaat 60
gaaaagaaac agatagattt tttagttctt taggcccgta gtctgcaaat ccttttatga 120
ttttctatca aacaaaagag gaaaatagac cagttgcaat ccaaacgaga gtctaataga 180
atgaggtcga aaagtaaatc gcgcgggttt gttactgata aagcaggcaa gacctaaaat 240
gtgtaaaggg caaagtgtat actttggcgt caccccttac atattttagg tcttttttta 300
ttgtgcgtaa ctaacttgcc atcttcaaac aggagggctg gaagaagcag accgctaaca 360
cagtacataa aaaaggagac atgaacgatg aacatcaaaa agtttgcaaa acaagcaaca 420
gtattaacct ttactaccgc actgctggca ggaggcgcaa ctcaagcgtt tgcgaaagaa 480
acgaaccaaa agccatataa ggaaacatac ggcatttccc atattacacg ccatgatatg 540
ctgcaaatcc ctgaacagca aaaaaatgaa aaatatcaag ttcctgaatt cgattcgtcc 600
acaattaaaa atatctcttc tgcaaaaggc ctggacgttt gggacagctg gccattacaa 660
aacgctgacg gcactgtcgc aaactatcac ggctaccaca tcgtctttgc attagccgga 720
gatcctaaaa atgcggatga cacatcgatt tacatgttct atcaaaaagt cggcgaaact 780
tctattgaca gctggaaaaa cgctggccgc gtctttaaag acagcgacaa attcgatgca 840
aatgattcta tcctaaaaga ccaaacacaa gaatggtcag gttcagccac atttacatct 900
gacggaaaaa tccgtttatt ctacactgat ttctccggta aacattacgg caaacaaaca 960
ctgacaactg cacaagttaa cgtatcagca tcagacagct ctttgaacat caacggtgta 1020
gaggattata aatcaatctt tgacggtgac ggaaaaacgt atcaaaatgt acagcagttc 1080
atcgatgaag gcaactacag ctcaggcgac aaccatacgc tgagagatcc tcactacgta 1140
gaagataaag gccacaaata cttagtattt gaagcaaaca ctggaactga agatggctac 1200
caaggcgaag aatctttatt taacaaagca tactatggca aaagcacatc attcttccgt 1260
caagaaagtc aaaaacttct gcaaagcgat aaaaaacgca cggctgagtt agcaaacggc 1320
gctctcggta tgattgagct aaacgatgat tacacactga aaaaagtgat gaaaccgctg 1380
attgcatcta acacagtaac agatgaaatt gaacgcgcga acgtctttaa aatgaacggc 1440
aaatggtacc tgttcactga ctcccgcgga tcaaaaatga cgattgacgg cattacgtct 1500
aacgatattt acatgcttgg ttatgtttct aattctttaa ctggcccata caagccgctg 1560
aacaaaactg gccttgtgtt aaaaatggat cttgatccta acgatgtaac ctttacttac 1620
tcacacttcg ctgtacctca agcgaaagga aacaatgtcg tgattacaag ctatatgaca 1680
aacagaggat tctacgcaga caaacaatca acgtttgcgc caagcttcct gctgaacatc 1740
aaaggcaaga aaacatctgt tgtcaaagac agcatccttg aacaaggaca attaacagtt 1800
aacaaataaa aacgcaaaag aaaatgccga tatcctattg gcattttctt ttatttctta 1860
tcaacataaa ggtgaatccc atatgaacta tataaaagca ggcaaatggc taaccgtatt 1920
cctaaccttg gatccaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 1980
cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 2040
tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 2100
tttggtcatg aacaataaaa ctgtctgctt acataaacag taatacaagg ggtgttatga 2160
gccatattca acgggaaacg tcttgctcta ggccgcgatt aaattccaac atggatgctg 2220
atttatatgg gtataaatgg gctcgcgata atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc 2280
gattgtatgg gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg 2340
ccaatgatgt tacagatgag atggtcagac taaactggct gacggaattt atgcctcttc 2400
cgaccatcaa gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc 2460
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atgcgctggc agtgttcctg cgccggttgc attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta 2580
acagcgatcg cgtatttcgt ctcgctcagg cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg 2640
atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa 2700
tgcataaact tttgccattc tcaccggatt cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg 2760
ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa 2820
tcgcagaccg ataccaggat cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt 2880
cattacagaa acggcttttt caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc 2940
agtttcattt gatgctcgat gagtttttct aagaattaat tcatgagcgg atacatattt 3000
gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 3060
cctgaaattg taaacgttaa tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc 3120
tcatttttta accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc 3180
gagatagggt tgagtgttgt tccctaagga ggatattcat atgaattc 3228

Claims (10)

1.用于鼠伤寒沙门氏菌基因靶向点突变的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒含有Kan抗性基因与sacB基因片段。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1。
3.权利要求1或2所述的重组质粒的制备方法，其特征在于：将Kan基因和sacB基因串联，然后通过含有red同源重组系统通用打靶片段扩增引物的引物对串联片段进行扩增，酶切连接转化入感受态细胞，诱导表达，得到重组质粒。
4.一种鼠伤寒沙门氏菌基因靶向点突变方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)制备权利要求1或2所述的重组质粒；
(2)pKD46质粒转化鼠伤寒沙门氏菌感受态细胞；
(3)应用步骤(1)中所述的重组质粒制备线性打靶DNA片段；
(4)Red同源重组：将步骤(3)的线性打靶DNA片段与步骤(2)的pKD46质粒转化的鼠伤寒沙门氏菌感受态细胞进行Red同源重组；
(5)将目的改造序列进行点突变，并构建成线性基因点突变打靶DNA片段；
(6)基因点突变菌株的构建：将步骤(5)的线性基因点突变打靶DNA片段与步骤(4)Red同源重组的产物再进行一次Red同源重组。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述重组质粒的制备方法为：通过含有red同源重组系统通用打靶片段扩增引物的引物分别对Kan基因和sacB基因扩增，然后分别酶切后将两个片段经连接酶连接到质粒，转化入感受态细胞，诱导表达，得到重组质粒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述扩增Kan基因的引物为：
Pet30akan-F-BamHI:CGCggatccAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCC
Pet30akan-R-EcoRI:CCGgaattcatatgaatatcctccttagGGAACAACACTCAACCCTATCT。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述扩增sacB基因的引物为：
sacb-F-sphI:ACATgcatgcgtgtaggctggagctgcttcCCATGCAACAGAAACTATAA
sacb-R-BamHI:CGCggatccAAGGTTAGGAATACGGTTAG。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述质粒为pHSG398；
作为优选，所述感受态细胞为大肠杆菌DH5α感受态细胞。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，包含用含有目的改造序列同源臂的引物扩增重组质粒的步骤。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)和步骤(3)的顺序互换。
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