CN107523568B - 毕赤酵母的一种组成型启动子及其应用 - Google Patents

毕赤酵母的一种组成型启动子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了毕赤酵母的一种组成型启动子及其应用。本发明提供了特异DNA分子甲和特异DNA分子乙；所述特异DNA分子甲为序列表中序列3所示的DNA分子；所述特异DNA分子乙由区段1和区段2组成；所述区段1包括所述特异DNA分子甲；所述区段2包括N个片段甲；所述片段甲如序列表的序列10所示；N为1以上的任意自然数。本发明通过改造3‑磷酸甘油酸激酶启动子获得了系列组成型强启动子，利用强启动子调控β‑Ffase基因分泌表达，构建了β‑Ffase高效分泌表达的毕赤酵母重组菌，为β‑Ffase的工业化生产奠定基础。

Description

毕赤酵母的一种组成型启动子及其应用
技术领域
本发明涉及毕赤酵母的一种组成型启动子及其应用。
背景技术
作为真核生物，毕赤酵母(Pichia pastoris)具有高等真核表达系统的许多优点还可实现高密度发酵，且基因操作简单。此外，毕赤酵母分泌到胞外的内源蛋白较少(Mattanovich,D.,A.Graf,J.Stadlmann,M.Dragosits,A.Redl,M.Maurer,M.Kleinheinz,M.Sauer,F.Altmann and B.Gasser(2009)."Genome,secretome and glucose transporthighlight unique features of the protein production host Pichia pastoris."Microb Cell Fact8:29.)，易于发酵上清外源蛋白的分离纯化，其表达系统中强启动子的应用对于外源蛋白的高效表达起到关键作用。得益于这些优势，毕赤酵母已成功用于异源蛋白的表达(Ahmad,M.,M.Hirz,H.Pichler and H.Schwab(2014)."Protein expressionin Pichia pastoris:recent achievements and perspectives for heterologousprotein production."Appl Microbiol Biotechnol98(12):5301-5317.)，广泛地应用于基础研究和大规模工业化生产Dikicioglu,D.,V.Wood,K.M.Rutherford,M.D.McDowalland S.G.Oliver(2014)."Improving functional annotation for industrialmicrobes:a case study with Pichia pastoris."Trends Biotechnol32(8):396-399.)。
为了提高目的产物产量，代谢工程中常用的手段是利用强启动子过量表达合成代谢途径中关键酶的编码基因，但毕赤酵母中启动子活性较强的大多为诱导型启动子，如PAOX1(Tschopp,J.F.,P.F.Brust,J.M.Cregg,C.A.Stillman and T.R.Gingeras(1987)."Expression of the lacZ gene from two methanol-regulated promoters in Pichiapastoris."Nucleic Acids Res15(9):3859-3876.)和PFLD1(Shen S,S.G.,Jeffries T W,et al(1998)."A strong nitrogen source-regulated promoter for controlledexpression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris."Gene216(1):93-102.)。诱导表达过程中需添加诱导剂，但诱导剂通常比较昂贵，不适于大规模生产，还可能对细胞具有一定的毒性。细胞对诱导剂感应也存在非均一性(Khlebnikov,A.,O.Risa,T.Skaug,T.A.Carrier and J.D.Keasling(2000)."Regulatable arabinose-induciblegene expression system with consistent control in all cells of a culture."Journal of Bacteriology182(24):7029-7034.)，即诱导物浓度效应往往只是增加群体中基因表达的细胞数而非各单个细胞的表达水平，不具有表达的均一性(Hammer,K.,I.Mijakovic and P.R.Jensen(2006)."Synthetic promoter libraries--tuning ofgene expression."Trends Biotechnol24(2):53-55.)。
毕赤酵母表达系统中最常用的诱导型强启动子为甲醇氧化酶启动子PAOX1，它受甲醇的严格调控，在碳源为非甲醇的条件下，AOX1基因转录的mRNA检测不到，但在甲醇为唯一碳源的培养基中，AOX1基因编码的mRNA可达到总RNA的5％，AOX1则占到可溶性蛋白的30％(Ellis,S.B.,P.F.Brust,P.J.Koutz,A.F.Waters,M.M.Harpold and T.R.Gingeras(1985)."Isolation of alcohol oxidase and two other methanol regulatable genesfrom the yeast Pichia pastoris."Mol Cell Biol5(5):1111-1121.)。但甲醇不适用于食品工业生产，还是一种火灾隐患，这在一定程度上限制了AOX1启动子的使用。
利用组成型启动子可以避免诱导剂甲醇的应用，无需改换碳源，可以实现连续表达，简化了发酵工艺。大多数组成型启动子强度较PAOX1低(Wang,J.,X.Wang,L.Shi,F.Qi,P.Zhang,Y.Zhang,X.Zhou,Z.Song and M.Cai(2017)."Methanol-Independent ProteinExpression by AOX1 Promoter with trans-Acting Elements Engineering andGlucose-Glycerol-Shift Induction in Pichia pastoris."Sci Rep7:41850.)，且可供选择的启动子有限，无法满足外源蛋白在毕赤酵母中高效表达的要求。目前应用较广泛的组成型启动子为PGAP(3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子)(Zhang,A.L.,J.X.Luo,T.Y.Zhang,Y.W.Pan,Y.H.Tan,C.Y.Fu and F.Z.Tu(2009)."Recent advances on the GAP promoterderived expression system of Pichia pastoris."Mol Biol Rep36(6):1611-1619.)，其强度略低于PAOX。毕赤酵母3-磷酸甘油酸激酶(3-phosphoglycerate kinase，PGK1)启动子PPGK1(de Almeida,J.R.,L.M.de Moraes and F.A.Torres(2005)."Molecularcharacterization of the 3-phosphoglycerate kinase gene(PGK1)from themethylotrophic yeast Pichia pastoris."Yeast22(9):725-737.)强度与PAOX相当，但因序列过长(1992bp)不便于表达框构建和启动子分子进化，限制了其在外源蛋白表达中的广泛应用。因此，本研究拟通过PPGK1序列截短和改造，构建强组成型启动子以应用于外源蛋白的高效表达。
β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase，β-Ffase，EC 3.2.1.26)又称蔗糖酶或转化酶，可水解蔗糖成果糖和葡萄糖，同时可将果糖转移至蔗糖的果糖基上形成低聚果糖(Fructooligosaccharides，FOS)。低聚果糖具有低甜度、低热量、降血脂、改善肠道菌群、预防龋齿、增强免疫力等功效，在双歧杆菌增殖方面也表现优异。随着人们对保健品需求和健康生活方式的日益重视，对FOS的需求与日俱增，而产生FOS的β-呋喃果糖苷酶(β-Ffase)(Ganaie,M.A.,A.Lateef and U.S.Gupta(2014)."Enzymatic trends offructooligosaccharides production by microorganisms."Appl Biochem Biotechnol172(4):2143-2159.)尚未实现商业化，这正是FOS大规模生产的瓶颈所在。天然微生物β-Ffase产量较少，无法实现工业化生产。因此，利用强启动子调控β-Ffase基因的表达，构建毕赤酵母重组菌以提高β-Ffase酶活。
发明内容
本发明的目的是提供毕赤酵母的一种组成型启动子及其应用。
本发明首先提供了特异DNA分子甲，为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)序列表中序列3所示的DNA分子；
(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；
(a3)与(a1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。
本发明还保护特异DNA分子乙，由区段1和区段2组成；所述区段1包括所述特异DNA分子甲；所述区段2包括N个片段甲；所述片段甲如序列表的序列10所示；N为1以上的任意自然数。
具体来说，1≤N≤5。更具体来说，N为1、2或5。
所述特异DNA分子乙中，自5’端至3’端方向，依次包括所述区段2和所述区段1。
所述特异DNA分子乙具体可如序列表的序列8所示。
所述特异DNA分子乙具体可如序列表的序列7所示。
所述特异DNA分子乙具体可如序列表的序列6所述。
本发明还保护含有所述特异DNA分子甲的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
本发明还保护含有所述特异DNA分子乙的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
本发明还保护所述特异DNA分子甲或所述特异DNA分子乙在启动目的基因表达中的应用。
所述目的基因具体可为β-呋喃果糖苷酶基因。
本发明还保护所述特异DNA分子甲或所述特异DNA分子乙在制备β-呋喃果糖苷酶中的应用。
本发明还保护一种制备β-呋喃果糖苷酶的方法，包括如下步骤：采用所述特异DNA分子甲或所述特异DNA分子乙启动β-呋喃果糖苷酶基因表达，得到β-呋喃果糖苷酶。具体来说，所述方法包括如下步骤：在生物反应器中，采用所述特异DNA分子甲或所述特异DNA分子乙启动β-呋喃果糖苷酶基因表达，得到β-呋喃果糖苷酶。所述生物反应器可为毕赤酵母，更具体可为毕赤酵母GS115。
本发明还保护特异DNA分子丙或含有特异DNA分子丙的重组菌；
所述特异DNA分子丙由区段A和区段B组成；所述区段A包括所述特异DNA分子甲或所述DNA分子乙；所述区段B包括片段乙；所述片段乙包括酿酒酵母杂交信号肽和β-呋喃果糖苷酶基因。
所述片段乙中，自5’端至3’端方向，依次包括所述酿酒酵母杂交信号肽和β-呋喃果糖苷酶基因。
所述片段乙具体可如序列表的的序列9所示。
所述特异DNA分子丙中，自5’端至3’端方向，依次包括所述区段A和所述区段B。
所述重组菌是将所述特异DNA分子丙导入宿主菌中得到的。
所述重组菌是将含有所述特异DNA分子丙的重组质粒导入宿主菌中得到的。
所述重组质粒是将所述特异DNA分子丙插入载体质粒的多克隆位点得到的。
所述载体质粒具体可为质粒p9K-BF。
所述宿主菌为毕赤酵母GS115。
本发明还保护所述特异DNA分子丙或含有特异DNA分子丙的重组菌在制备β-呋喃果糖苷酶中的应用。
本发明还保护一种β-呋喃果糖苷酶的制备方法，包括如下步骤：培养含有所述特异DNA分子丙的重组菌，得到β-呋喃果糖苷酶。
以上任一所述的β-呋喃果糖苷酶基因为β-呋喃果糖苷酶的编码基因。
本发明通过改造3-磷酸甘油酸激酶(3-phosphoglycerate kinase，PGK1)基因的启动子PPGK1获得了系列组成型强启动子，利用强启动子调控β-Ffase基因的分泌表达，构建了β-Ffase高效分泌表达的毕赤酵母重组菌，为β-Ffase的工业化生产奠定基础。
附图说明
图1为启动子PPP、PPE和PPD构建。A：重组质粒pPHg、pPPHg、pPEHg、pPGHg和pPDHg构建过程；B：pPHg、pPPHg和pPEHg经酶切和PCR验证。
图2为重组菌G/PH、G/PHg、G/PPHg、G/PEHg、G/PGHg和G/PDHg菌落PCR验证。
图3为重组菌G/PHg、G/PEHg、G/PPHg、G/PDHg表达yEGFP的荧光强度检测。
图4为载体pPD1Hg、pPD2Hg和pPD5Hg构建。
图5为启动子PPD1、PPD2和PPD5调控报告基因egfp表达质粒和重组菌验证。A：载体pPD1Hg、pPD2Hg和pPD5Hg经SpeI/NotI双酶切验证；B：重组菌G/PD1Hg、G/PD2Hg和G/PD5Hg利用引物BF-F/BF-R菌落PCR验证。M：DNA Marker；+：以质粒pPD1Hg为模板PCR；－：以毕赤酵母GS115DNA为模板PCR。
图6为重组菌G/PD1Hg、G/PD2Hg和G/PD5Hg表达yEGFP的荧光强度。
图7为改造的强启动子调控β-呋喃果糖苷酶基因表达。A：β-呋喃果糖苷酶基因表达载体构建；B：载体pPGK-BF、pPE-BF、pPD-BF、pPD1-BF、pPD2-BF和pPD5-BF经NotI/HindIII双酶切验证；C：分泌表达β-Ffase毕赤酵母重组菌G/PGK-BF、G/PE-BF、G/PD-BF、G/PD1-BF、G/PD2-BF和G/PD5-BF菌落PCR验证，所用引物为BF-F/BF-R。M：1 kb DNA Maker，+：对应重组质粒为模板PCR，-：毕赤酵母GS115的DNA为模板PCR。
图8为重组菌的β-Ffase酶活、分泌效率和PoFF32A相对表达水平。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
毕赤酵母GS115：Invitrogen公司，货号：C18100。
载体pGHg：参考文献：Qin X,Qian J,Yao G,et al.GAP promoter library forfine-tuning of gene expression in Pichia pastoris.Appl Environ Microbiol,2011,77(11):p.3600-8.；公众可以从广西大学获得。
BMD培养基：1.34％(质量百分比)无氨基酵母氮源(YNB)，1％(质量百分比)葡萄糖，4×10-5％(质量百分比)生物素，100mM K2HPO4/KH2PO4缓冲液，pH＝6。
质粒p9K-BF：参考文献：Xu Q S,Zheng X Q,Huang M P,et al.Purification andbiochemical characterization of a novel beta-fructofuranosidase fromPenicillium oxalicum with transfructosylating activity producingneokestose.Process Biochemistry,2015,50(8):p.1237-1246.；公众可以从广西大学获得。
BMDY培养基：1％(质量百分比)酵母抽提物，2％(质量百分比)蛋白胨，1.34％(质量百分比)无氨基酵母氮源(YNB)，1％(质量百分比)葡萄糖，4×10-5％(质量百分比)生物素，100mM K2HPO4/KH2PO4缓冲液，pH＝6。
实施例中所用引物信息见表1。
表1实施例中所用引物
Figure BDA0001434674720000051
Figure BDA0001434674720000061
*下划线序列为酶切位点，小写斜体序列为Aft1结合位点。
实施例1、携带毕赤酵母组成型强启动子的重组质粒构建
一、携带启动子PPGK1的重组质粒pPHg的构建
1、提取毕赤酵母GS115的总DNA，以总DNA为模板，采用引物PGK-FS/PGK-RN进行PCR扩增，得到扩增产物(启动子PPGK1)。
2、采用SpeI和NotI双酶切步骤1得到的扩增产物，得到酶切产物。
3、采用SpeI和NotI双酶切载体pGHg，得到约7kb的载体骨架。
4、将步骤2得到的酶切产物与步骤3得到的载体骨架连接，得到重组质粒pPHg。根据测序结果，对重组质粒pPHg描述如下：将载体pGHg的SpeI和NotI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列1所示的DNA分子。
二、携带启动子PPP的重组质粒pPPHg的构建
1、提取毕赤酵母GS115的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物PP-FS/PGK-RN(表1)进行PCR扩增，得到扩增产物(启动子PPP)。
2、采用SpeI和NotI双酶切步骤1得到的扩增产物，得到酶切产物。
3、采用SpeI和NotI双酶切载体pGHg，得到约7kb的载体骨架。
4、将步骤2得到的酶切产物与步骤3得到的载体骨架连接，得到重组质粒pPPHg。根据测序结果，对重组质粒pPPHg描述如下：将载体pGHg的SpeI和NotI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列2所示的DNA分子。
三、携带启动子PPD的重组质粒pPDHg的构建
1、提取毕赤酵母GS115的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物PD-FS/PGK-RN(表1)进行PCR扩增，得到扩增产物(启动子PPD)。
2、采用SpeI和NotI双酶切步骤1得到的扩增产物，得到酶切产物。
3、采用SpeI和NotI双酶切载体pGHg，得到约7kb的载体骨架。
4、将步骤2得到的酶切产物与步骤3得到的载体骨架连接，得到重组质粒pPDHg。根据测序结果，对重组质粒pPDHg描述如下：将载体pGHg的SpeI和NotI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列3所示的DNA分子。
四、携带启动子PPE的重组质粒pPEHg的构建
1、采用ClaI酶切步骤二得到的重组质粒pPPHg，得到约8.2kb的载体骨架。
2、将步骤1得到的载体骨架自连，得到重组质粒pPEHg(携带启动子PPE)。根据测序结果，对重组质粒pPEHg描述如下：将载体pGHg的SpeI和NotI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列4所示的DNA分子。
五、携带启动子PPG的重组质粒pPGHg的构建
1、采用XhoI酶切步骤四得到的重组质粒pPEHg，得到约7.9kb的载体骨架。
2、将步骤1得到的载体骨架自连，得到重组质粒pPGHg(携带启动子PPG)。根据测序结果，对重组质粒pPGHg描述如下：将载体pGHg的SpeI和NotI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列5所示的DNA分子。
六、对照载体pPH的构建
1、采用HindIII酶切步骤一得到的重组质粒pPHg，得到约8.3kb的载体骨架。
2、将步骤1得到的载体骨架自连，得到对照载体pPH(不含gfp基因)。根据测序结果，对重组质粒pPGHg描述如下：将重组质粒pPHg的HindIII酶切位点之间的小片段(gfp基因)删除。
重组质粒pPHg、重组质粒pPPHg、重组质粒pPDHg、重组质粒pPEHg、重组质粒pPGHg和对照载体pPH的构建过程如图1A所示。
七、重组质粒鉴定
1、采用SpeI和NotI双酶切重组质粒pPHg、重组质粒pPPHg、重组质粒pPEHg、重组质粒pPGHg和重组质粒pPDHg，将酶切产物进行电泳。
2、采用HindIII酶切对照载体pPH，将酶切产物采用引物PGK-FS/3’AOX进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳。
结果如图1B所示，结果表明，重组质粒pPHg、重组质粒pPPHg、重组质粒pPEHg、重组质粒pPGHg、重组质粒pPDHg和对照载体pPH均构建成功。
实施例2、启动子PPGK1、PPP、PPE、PPG和PPD强度表征
1、将实施例1制备的重组质粒pPH、重组质粒pPHg、重组质粒pPPHg、重组质粒pPEHg、重组质粒pPGHg和重组质粒pPDHg用限制性酶BSpeI酶切线性化，分别电击转化毕赤酵母GS115，构建得到重组菌G/PH、G/PHg、G/PPHg、G/PEHg、G/PGHg和G/PDHg。
2、对步骤1得到的重组菌G/PH采用引物PGK-FS和3’AOX进行菌落PCR鉴定，对重组菌G/PHg、G/PPHg、G/PEHg、G/PGHg和G/PDHg采用引物PGK primer和3’AOX进行菌落PCR鉴定，结果如图2所示。结果表明，PCR条带大小与预期相符(重组菌G/PH的阳性克隆PCR条带为2.2kb，其余重组菌的阳性克隆PCR条带为1kb，)，证实了这些转化菌株含有新整合的片段。
3、检测重组菌G/PH、G/PHg、G/PPHg、G/PEHg、G/PGHg和G/PDHg的yEGFP荧光强度，具体方法如下：
将待测重组菌接种于含有BMD培养基的48孔深孔板中培养36h，然后取30μL菌液转接至每孔含有220μL PBS的96孔板中，利用多功能酶标仪(BioTek Synergy H1)检测酵母增强型绿色荧光蛋白yEGFP荧光强度(激发波长：395nm，发射波长：509nm)。检测yEGFP荧光强度时，以不表达yEGFP的重组菌G/PH作为对照去除背景。比荧光强度F/OD600nm(RFU/OD600nm)为荧光强度值比上对应细胞密度OD600nm，以比荧光强度表征启动子强度。
4、采用定量PCR检测重组菌G/PH、G/PHg、G/PPHg、G/PEHg、G/PGHg和G/PDHg中的egfp基因转录水平(以GAPDH作为内参基因)，检测egfp基因的引物为RT-GFP-F和RT-GFP-R，检测GAPDH的引物为RT-GAP-F和RT-GAP-R。
结果如图3所示。结果表明，与G/PHg(野生型启动子PPGK1调控egfp表达)相比，重组菌G/PEHg和G/PDHg的yEGFP比荧光强度分别显著提高了32％和71％。各重组菌的egfp转录水平与yEGFP的比荧光强度趋势一致，说明比荧光强度的改变是因启动子强度变化引起。启动子PPE和PPD强度较野生型PPGK1分别提高了32％和71％，启动子PPP和PPG强度与PPGK1相同。
实施例3、启动子PPD的改造
一、重组质粒pPD1Hg的构建
1、以重组质粒pPDHg为模板，采用引物PD1-F和PD-R进行PCR扩增，得到扩增产物(启动子PPD1，在启动子PPD的5’端引入一个Aft1结合位点)。
2、采用SpeI和NotI双酶切步骤1得到的扩增产物，得到酶切产物。
3、采用SpeI和NotI双酶切载体pPHg，得到约7kb的载体骨架。
4、将步骤2得到的酶切产物与步骤3得到的载体骨架连接，得到重组质粒pPD1Hg。根据测序结果，对重组质粒pPD1Hg描述如下：将载体pPHg的SpeI和NotI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列6所示的DNA分子。
二、重组质粒pPD2Hg的构建
1、以重组质粒pPDHg为模板，采用引物PD2-F和PD-R进行PCR扩增，得到扩增产物(启动子PPD2，在启动子PPD的5’端引入两个Aft1结合位点)。
2、采用SpeI和NotI双酶切步骤1得到的扩增产物，得到酶切产物。
3、采用SpeI和NotI双酶切载体pPHg，得到约7kb的载体骨架。
4、将步骤2得到的酶切产物与步骤3得到的载体骨架连接，得到重组质粒pPD2Hg。根据测序结果，对重组质粒pPD2Hg描述如下：将载体pPHg的SpeI和NotI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列7所示的DNA分子。
三、重组质粒pPD5Hg的构建
1、人工合成序列8所述的双链DNA分子(启动子PPD5，在启动子PPD的5’端引入五个Aft1结合位点)。
2、采用SpeI和NotI双酶切步骤1得到的双链DNA分子，得到酶切产物。
3、采用SpeI和NotI双酶切载体pPHg，得到约7kb的载体骨架。
4、将步骤2得到的酶切产物与步骤3得到的载体骨架连接，得到重组质粒pPD5Hg。根据测序结果，对重组质粒pPD5Hg描述如下：将载体pPHg的SpeI和NotI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列8所示的DNA分子。
重组质粒pPD1Hg、重组质粒pPD2Hg和重组质粒pPD5Hg的构建过程如图4所示。
四、重组质粒的鉴定
采用SpeI和NotI双酶切重组质粒pPD1Hg、重组质粒pPD2Hg和重组质粒pPD5Hg，将酶切产物进行电泳。结果如图5A所示。结果表明，重组质粒pPD1Hg、重组质粒pPD2Hg和重组质粒pPD5Hg均构建成功。
五、启动子PPD1、PPD2和PPD5强度表征
1、将重组质粒pPD1Hg、重组质粒pPD2Hg和重组质粒pPD5Hg用限制性酶SalⅠ酶切线性化，分别电击转化毕赤酵母GS115，构建得到重组菌G/PD1Hg、G/PD2Hg、G/PD5Hg。
2、对步骤1得到的重组菌G/PD1Hg、G/PD2Hg、G/PD5Hg采用引物PP-F/GFP-R进行菌落PCR鉴定，结果如图5B所示。结果表明，PCR条带大小与预期相符，证实了这些转化菌株含有新整合的片段。
3、检测重组菌G/PD1Hg、G/PD2Hg、G/PD5Hg的yEGFP荧光强度，以重组菌G/PDHg作为对照，具体方法如下：
将待测重组菌接种于含有BMD培养基的48孔深孔板中培养36h，然后取30μL菌液转接至每孔含有220μL PBS的96孔板中，利用多功能酶标仪(BioTek Synergy H1)检测酵母增强型绿色荧光蛋白yEGFP荧光强度(激发波长：395nm，发射波长：509nm)。检测yEGFP荧光强度时，以不表达yEGFP的重组菌G/PH作为对照去除背景。比荧光强度F/OD600nm(RFU/OD600nm)为荧光强度值比上对应细胞密度OD600nm，以比荧光强度表征启动子强度。
4、采用定量PCR检测重组菌G/PDHg、重组菌G/PD1Hg、G/PD2Hg和G/PD5Hg中的egfp基因转录水平(以GAPDH作为内参基因)，检测egfp基因的引物为RT-GFP-F和RT-GFP-R，检测GAPDH的引物为RT-GAP-F和RT-GAP-R。
结果如图6所示。结果表明，重组菌G/PD1Hg、G/PD2Hg、G/PD5Hg的比荧光强度和egfp转录水平均呈依次上升趋势，改造后启动子PPD1、PPD2和PPD5的启动子强度分别较PPD提高了32％，59％和60％。
综上所述，基于PPGK1改造的启动子，强度由高至低依次为：PPD5、PPD2、PPD1、PPD、PPE、PPGK1。
实施例4、应用改造的强启动子调控β-呋喃果糖苷酶基因表达
一、β-呋喃果糖苷酶表达载体构建
1、以质粒p9K-BF为模板，采用引物αF-FN和αF-R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(酿酒酵母杂交信号肽α-MF)。
2、以质粒p9K-BF为模板，采用引物BF-FL和BF-RH进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(PoFF32A基因片段)。
3、将步骤1得到的酿酒酵母杂交信号肽α-MF和PoFF32A基因片段进行融合，采用引物αF-FN和BF-RH对融合产物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(αF-BF)。
4、采用NotI/HindIII双酶切步骤3得到的PCR扩增产物(αF-BF)，得到酶切产物。
5、采用NotI/HindIII双酶切重组质粒pPHg，回收载体骨架。
6、将步骤4得到的酶切产物与步骤5得到的载体骨架连接，得到重组表达载体pPGK-BF。根据测序结果，对重组表达载体pPGK-BF描述如下：将重组质粒pPHg的NotI和HindIII酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列9所示的DNA分子。
7、采用重组质粒pPEHg替代重组质粒pPHg，按照步骤5和6进行操作，得到重组表达载体pPE-BF。根据测序结果，对重组表达载体pPE-BF描述如下：将重组质粒pPEHg的NotI和HindIII酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列9所示的DNA分子。
8、采用重组质粒pPDHg替代重组质粒pPHg，按照步骤5和6进行操作，得到重组表达载体pPD-BF。根据测序结果，对重组表达载体pPD-BF描述如下：将重组质粒pPDHg的NotI和HindIII酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列9所示的DNA分子。
9、采用重组质粒pPD1Hg替代重组质粒pPHg，按照步骤5和6进行操作，得到重组表达载体pPD1-BF。根据测序结果，对重组表达载体pPD1-BF描述如下：将重组质粒pPD1Hg的NotI和HindIII酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列9所示的DNA分子。
10、采用重组质粒pPD2Hg替代重组质粒pPHg，按照步骤5和6进行操作，得到重组表达载体pPD2-BF。根据测序结果，对重组表达载体pPD2-BF描述如下：将重组质粒pPD2Hg的NotI和HindIII酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列9所示的DNA分子。
11、采用重组质粒pPD5Hg替代重组质粒pPHg，按照步骤5和6进行操作，得到重组表达载体pPD5-BF。根据测序结果，对重组表达载体pPD5-BF描述如下：将重组质粒pPD5Hg的NotI和HindIII酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列9所示的DNA分子。
上述重组表达载体的构建过程如图7A所示。
12、采用NotI和HindIII双酶切步骤6-11得到的重组表达载体，将酶切产物进行电泳。结果如图7B所示。结果表明，上述重组表达载体均构建成功。
二、重组菌的构建
1、将重组表达载体pPGK-BF、重组表达载体pPE-BF、重组表达载体pPD-BF、重组表达载体pPD1-BF、重组表达载体pPD2-BF和重组表达载体pPD5-BF用限制性酶SalI酶切线性化，分别电击转化毕赤酵母GS115，构建得到重组菌G/pPGK-BF、G/pPE-BF、G/pPD-BF、G/pPD1-BF、G/pPD2-BF和G/pPD5-BF。
2、对步骤1得到的重组菌采用引物BF-FL和BF-RH进行菌落PCR鉴定，结果如图7C所示。结果表明，PCR条带大小与预期相符，证实了这些转化菌株含有新整合的片段。
三、重组菌β-Ffase酶活和PoFF32A基因转录水平检测
将步骤二制备的重组菌G/pPGK-BF、G/pPE-BF、G/pPD-BF、G/pPD1-BF、G/pPD2-BF和G/pPD5-BF接种于BMDY培养基中发酵36h，各重组菌生长无显著差异(图8A)；取1ml发酵液经12000r/min，4℃，10min离心收集上清(胞外β-Ffase粗酶液)；β-Ffase酶活通过HPLC(YMC-Pack NH2氨基柱，70％乙腈为流动相)检测(具体参考文献：Xu Q S,Zheng X Q,Huang M P,et al.Purification and biochemical characterization of a novel beta-fructofuranosidase from Penicillium oxalicum with transfructosylatingactivity producing neokestose.Process Biochemistry,2015,50(8):p.1237-1246.)。酶活单位定义：1个酶活单位定义为40℃下，1min内从蔗糖中释放出1μM还原糖所需的酶量。
采用定量PCR检测重组菌G/pPGK-BF、G/pPE-BF、G/pPD-BF、G/pPD1-BF、G/pPD2-BF和G/pPD5-BF中的PoFF32A基因转录水平(以GAPDH作为内参基因)，检测PoFF32A基因的引物为RT-BF-F和RT-BF-R，检测GAPDH的引物为RT-GAP-F和RT-GAP-R。
结果如图8B所示。随着调控PoFF32A表达启动子强度的增加，重组菌胞外的β-Ffase酶活也增加，其中重组菌G/PD5-BF胞外的β-Ffase酶活最高(6.6U/mL)，较G/PGK1-BF的提高了74％。
<110> 广西大学
<120> 毕赤酵母的一种组成型启动子及其应用
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<210> 1
<211> 1992
<212> DNA
<213> 毕赤酵母
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tttgaatgag atattaactg aactaagtgt tttaaagggc aaatttcata tataatgtac 120
aataccaact ccaaatcgag gtgctctctc gacacctcta ttatgcggaa ggatacagca 180
tgtagacgca attttgaacg cttgcagcta tattataaag aacgcatgca ctgcagttgc 240
agtagtaagt gtaaggctca aactaggaaa ttttagtacc cgaatggtct atgtaggtat 300
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gcactccttg cgagccctag attttagttt agtggatgct ctcatcaatc aaatttgagg 540
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tacaatccaa gacacaagga tggtgacgta tcagaatgtg gattccattg cgattctatc 660
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agcttgtaca gtgaggtgca tatgctgcct gtacacggta tgcattcctc agataagaaa 780
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caagtgtcct atgctgtagg ccgcagccct tttggttcga cgacgtgcgt ggttatgaga 1320
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<212> DNA
<213> 毕赤酵母
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agacttacta atcgcagaat gttggtgcag tatttgtcgt aagccaaaac catcgatgtt 480
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<400> 9
atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60
ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120
tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180
aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240
tctctcgaga aaagagaggc tgaggcttac tcgctcaccg ttgaccagat cgacggcatg 300
gccaacaata ctctcttcac acgatggagg ccaacttctc actttctcgc tcctgcggga 360
tggatgaacg acccttgtgg acccatgtac gaccccatca acaaaattta ccacctgcat 420
tatcaattcc accctaatca tgtcaactgg ggcaacatct cctggggaca tgctacctcg 480
gatgacctca tcacctggaa agatgtggat agtaacccac aagacggaac tgccgcttgg 540
aaggaccagc aagctcaatc acttggcact accaatctga caagcgacca ccacactccg 600
gctctgtaca atcacctcgg aattttctcc ggaaccgccc agcctgtcaa cctgaccggt 660
ggatcggacg gcactttgct ggcattctac acatccgttt ctgaactccc cacctcgtgg 720
accaagcctt acctcaaggg caccgagagt caaagcctgg cctactctac ggacggcgga 780
gtgacttggc aggagtatga gaacaaccct gtcatgtccg accctcccga gggttggaat 840
gtcaccggct ggcgggaccc cttctaccat gcttggcccg agatggacgc tttcttgaac 900
gtgtccgagc cgtactacta tgctgttctc ggctctggta tcaaggaggt tggccctcga 960
atgcctctct ataaggcacc tgcgtcagac ctgaccaact ggaccttcat gggctctctg 1020
tttgagccca agatgaacag ctctctgggt gctctgccag agactggctc ttacggattc 1080
aactttgaag tctccaactt cttctccatt ggggatcgct acttcgtcac catgggtgcc 1140
gagggcggcg ataccgactt ccacactcgc cgttggtccc tctggaacga gggaaccctg 1200
tctgtccggg ctaacggcag cgttgaattc accccagtgg ccggtggtgc cggagactgg 1260
ggattgctgt acgctatgac taccttcgac gacaccaaga acaaccgtcg cattcagtgg 1320
ggttggtgtc ccgaggacat gaacaacttt gctatcactc agcaaggcta ccagggctcg 1380
ttcgctcttc cccgtgagat cttcatcaag gatacccaca acgtgatcca cgacatgtcc 1440
aacagctccg tgcccggaaa ctcccgctac ttcgctcagc ccaacgggac ctggactgcc 1500
agcactctgg gcaccaagcc cgcgtccgac gtcgtgcagg gtctccagcg cggcgccaaa 1560
catcacaagt tcccttgtca cgatcacaag tgcgataccg agaagatcaa gctccccacc 1620
aacatgtcca agtcatacca aatcaatgtg gagatcaaga gcaccaccgg catcgccggt 1680
ctcaccattg ctgcatcccc caaccgcgag gagtatacca acatcttcta caacccttcc 1740
aattacagca tcgccgtgga ccgtagccac tccagccaga tcaacatgtt ctccaacgac 1800
acccaccagg gctacttcaa gccatacacc gtccgcgacc gcgaatatgg caagaacacc 1860
accgagtcca ttcagatgag catcttcgtc gatggatctc tcgtcgaagt ctacgtcaac 1920
gagcgtttcg ctctgaccac ccgcatctac cccagtcggg aagacagtac cggtcttgca 1980
ttctactctg ccccttgcgc ccaagtcgag tactcgaaca ttgagatttg ggacggtctg 2040
ttgaatgtct ggcccgagcg tcctcagaac agcagctccc tgctcgtgtt tgatactgct 2100
gcggagacga ataactacac ctggtgggat ggtaatcacc atcatcatca tcattaa 2157
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 10
tcactgtcac ccgtc 15

Claims (8)

1.特异DNA分子乙，自5’端至3’端方向，依次包括区段2和区段1；所述区段1为序列表中序列3所示的DNA分子；所述区段2包括N个片段甲；所述片段甲如序列表的序列10所示； N为1、2或5；
N为5时，所述特异DNA分子乙如序列表的序列8所示；
N为2时，所述特异DNA分子乙如序列表的序列7所示；
N为1时，所述特异DNA分子乙如序列表的序列6所示。
2.含有权利要求1所述特异DNA分子乙的重组载体、表达盒或重组菌。
3.权利要求1所述特异DNA分子乙在启动β-呋喃果糖苷酶基因表达中的应用。
4.权利要求1所述特异DNA分子乙在制备β-呋喃果糖苷酶中的应用。
5.一种制备β-呋喃果糖苷酶的方法，包括如下步骤：采用权利要求1所述特异DNA分子乙启动β-呋喃果糖苷酶基因表达，得到β-呋喃果糖苷酶。
6.特异DNA分子丙或含有特异DNA分子丙的重组菌，
所述特异DNA分子丙由区段A和区段B组成；所述区段A为权利要求1所述的DNA分子乙；所述区段B为片段乙；所述片段乙为酿酒酵母杂交信号肽和β-呋喃果糖苷酶基因。
7.权利要求6所述的特异DNA分子丙或含有特异DNA分子丙的重组菌在制备β-呋喃果糖苷酶中的应用。
8.一种β-呋喃果糖苷酶的制备方法，包括如下步骤：培养权利要求６所述的含有特异DNA分子丙的重组菌，得到β-呋喃果糖苷酶。
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Molecular characterization of the 3-phosphoglycerate kinase gene (PGK1) from the methylotrophic yeast Pichia pastoris;Jo˜ao Ricardo Moreira de Almeida et al;《Yeast》;20051231;摘要，第736页右栏最后一段 *
单因素优化提高重组毕赤酵母β- 呋喃果糖苷酶产量;赵西浩等;《基因组学与应用生物学》;20170925;第36卷(第9期);摘要 *
棉花不同 GbU6 启动子截短克隆及功能鉴定;雷建峰等;《作物学报》;20160218;第42卷(第5期);摘要 *

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