CN114085831A - 一种基于双链dna重组工程的细菌基因组多重编辑方法及其应用 - Google Patents

一种基于双链dna重组工程的细菌基因组多重编辑方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于因工程技术领域，具体涉及一种细菌基因组多重编辑方法及其应用。基于双链DNA重组工程的细菌基因组多重编辑方法，包括：（1）将靶向不同靶标序列的dsDNA底物混合后导入到带有重组酶质粒的宿主感受态细胞内；（2）将感受态细胞在低于最适生长温度的温度下复苏；复苏过程中添加终浓度为10 nM的dNTPs；（3）对复苏后的感受态细胞筛选出带有标记的单菌落，进行鉴定。本发明的方法具有底物制备成本低、插入基因长度无限制、非双链DNA断裂依赖、无需构建多个引导RNA表达载体、无需对宿主菌细菌的限制性修复系统进行失活等优点。

Description

一种基于双链DNA重组工程的细菌基因组多重编辑方法及其 应用
技术领域
本发明属于因工程技术领域，具体涉及一种细菌基因组多重编辑方法及其应用。
背景技术
细菌基因组的解析和编辑是基础生物学和应用生物学研究的关键。需要精确和高效的基因组编辑技术来更好地理解性状的遗传基础，并开发高度工程化的微生物细胞工厂来获取有价值的物质。多重基因组编辑能够同时修改多个基因组位点，极大地促进了基因组多样性的创造，加速了定向进化。多重基因组编辑需要借助精确和高效的基因组编辑技术来更好地理解性状的遗传基础，并开发高度工程化的微生物细胞工厂来获取有价值的物质。CRISPR-Cas 系统和单链DNA(single-stranded DNA,ssDNA)重组工程这两项关键技术已被广泛应用于细菌基因组的高效多重编辑。这些方法极大地加快了细菌基因组多重精确靶向修饰的应用，促进了菌株工程用于生物制造和工业重要产品的生产优化。然而，这两种方法都有其局限性。
CRISPR-Cas系统的Cas核酸酶利用短引导RNA(gRNA)识别目标DNA区域并在该处制造双链断裂(double strand breaks,DSB)。DSB可以通过非同源端连接(NHEJ)修复以实现基因的敲除也可以通过同源重组(HR)修复来实现基因替换和插入。通常来说DSB对大多数细胞是有害的，一次引入过多的DSB往往会导致细胞的死亡，因此目前利用 CRISPR-Cas系统能够同时编辑的位点一般不超过三个。
重组工程(recombineering)是基因打靶和基因组工程的重要技术，Red/ET重组技术是一种首先在大肠杆菌中被使用的，能够在基因组复制阶段，利用短的同源臂(～50bp)在复制叉处通过同源重组实现基因改造，而不引发基因组的双链断裂。重组工程是以来源于大肠杆菌λ噬菌体Red操纵子的redα/redβ或者是Rac前噬菌体recE/recT的表达为基础进行工作的。基于ssDNA的重组工程一般只需要Redβ或者RecT的存在就能完成精确的基因组编辑，因此ssDNA重组工程被广泛的应用于多重基因组编辑工作，MAGE、TRMR,DlvERGE 都是通过Redβ介导ssDNA重组在自动化设备的协助下，利用能启动冈崎片段合成的ssDNA 作为底物实现基因组多重编辑的技术。然而ssDNA重组相关的多元基因组编辑技术的应用在一定程度上被长链ssDNA(＞150nt)的获得所限制，多功能基因序列(在1kb)的插入以及有效筛选标记的使用因长链ssDNA繁琐的获得过程而变得困难。此外，传统的由ssDNA重组工程介导的多重基因组编辑技术需要通过对被编辑菌株的错配修复系统(mismatch repair,MMR)进行缺失或抑制来提高编辑效率，常会导致自发突变率的大幅度提高。
双链DNA(double strand DNA，dsDNA)能够通过PCR反应方便的获得(最高可达10kb)，以dsDNA作为重组底物能够极大的延长插入长度，可以将目标片段和选择标记放在一起，提高多区域修饰突变株的筛选效率。近年来通过对不同宿主特异性重组酶对的发现和鉴定，dsDNA重组工程已被广泛应用于细菌基因组改造中。来源于S.brevitalea DSM7029的噬菌体重组酶Redαβ7029能够实现菌株本身和其他几种Burkholderiales菌株的基因组进行了有效的基因组编辑。来源于铜绿假单胞菌噬菌体Ab31的lambda Red-like重组酶-BAS能够完成4种假单胞菌的基因组编辑工作。综上所述dsDNA重组工程的特点使其具有成为介导基因组多区域置换、删除和插入的工具的潜力，而ssDNA重组工程在这方面是效率低下的。然而或许是由于编辑效率较低，至今为止尚未有基于dsDNA重组工程的多重基因组编辑方法在大肠杆菌中建立。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用于多种细菌的基于dsDNA重组工程的多重基因组编辑方法(dsDNA-recombineering assisted Multiplex Genome Editing,dReaMGE)及其在五种细菌多重基因组编辑中的应用，是一种通过改变宿主细胞体内脱氧核糖核苷酸(dNTP,deoxynucleoside)的浓度及调整筛选标记使用策略等措施提高了3种不同来源的同源重组酶在5种宿主细胞中介导dsDNA重组工程的效率，实现以dsDNA为底物进行多重基因组编辑在5种细菌中的成功应用的方法。
为了实现本发明的目的，本发明首先采用的技术方案是：一种基于双链DNA重组工程的细菌基因组多重编辑方法，包括：
(1)将靶向不同靶标序列的dsDNA底物混合后导入到带有重组酶质粒的宿主感受态细胞内；
(2)将感受态细胞在低于最适生长温度的温度下复苏；复苏过程中添加终浓度为10nM 的dNTPs；
(3)对复苏后的感受态细胞筛选出带有标记的单菌落，进行鉴定。
作为本发明的一种优选方式，所述步骤(2)中，复苏时间为1-4小时。
进一步优选地，添加的dNTPs中GC含量与宿主基因组GC含量相近或者相同。
进一步优选地，所述宿主为E.coli GB2005，在30℃下复苏时间为1小时。
进一步优选地，所述宿主为Schlegelella brevitalea DSM7029或Paraburkholderia. megapolitana DSM 23488，在22℃下复苏4小时。
进一步优选地，所述宿主为Pseudomonas.putida KT2440，在22℃下复苏1小时。
进一步优选地，所述宿主为P.syringae DC3000，在22℃下复苏3小时。
进一步优选地，所述宿主为E.coli GB2005，并且其脱氧核酸还原酶的原始启动子被替换为庆大霉素启动子Pgenta，在30℃下复苏时间为1小时。
进一步优选地，所述靶向不同靶标序列的dsDNA底物带有相同的抗性基因。
进一步优选地，所述所述靶向不同靶标序列的dsDNA底物带有能够锚定不同靶标位点短的同源臂。
本发明还进一步提供了所述方法的应用，采用所述方法介导细菌宿主内的多重基因组编辑。
进一步地，采用所述方法对细菌宿主中抗肿瘤化合物的基因簇进行多启动子替换，获得多种该抗肿瘤化合物的衍生物。
进一步地，采用所述方法改造细菌代谢网络，实现基因组挖掘和目标代谢产物产量优化。
本发明提供的基于双链DNA重组工程的细菌基因组多重编辑方法及其应用，具有如下有益效果：
1.本发明与现有基于ssDNA重组工程或者CRISPR-Cas技术相比，具有底物制备成本低、插入基因长度无限制、非双链DNA断裂依赖、无需构建多个引导RNA表达载体、无需对宿主菌细菌的限制性修复系统进行失活等优点，能够有效地介导包括大肠杆菌E.coliGB2005，伯克氏菌Polyangium brachysporum DSM 7029，伯克氏菌Paraburkholderia.megapolitana DSM 23488，假单胞菌Pseudomonas.putida KT2440和Pseudomonas.syringae DC3000在内的五种不同细菌的多重基因组编辑。
2.本发明建立的dReaMGE方法是探测基因型与表型关系，增强化学生产和菌株优化的潜在且便捷的工具，是对当前基因组工程技术的理想补充。
附图说明
图1 dsDNA recombineering介导E.coli基因组双区域同时编辑的决定因素；其中，
a：不同复苏时间(1h、4h、6h、8h、10h、12h)dsDNA recombineering介导双区域替换效率；
b：在1小时和6小时复苏时间下，不同复苏温度(16℃、20℃、24℃、28℃、30℃、 32℃、37℃)下dsDNA recombineering介导双区域替换效率；
c：在1小时或者6小时的30℃复苏条件下，不同抗性标记使用策略对dsDNArecombineering介导双区域替换效率的影响；
图中，Amp/cm：使用amp和cm双抗构建的GB2005ΔregionA::cm-ΔB::amp突变体，cm/cm：使用cm单抗构建的GB2005ΔregionA::cm-ΔB::cm突变体；
d：在30℃复苏温度，1小时、4小时和6小时复苏时间下，大肠杆菌GB2005中过表达RNR对dsDNArecombineering介导的双区域替换的影响；
e：在1小时或者6小时的30℃复苏条件下，大肠杆菌GB2005中添加dNTP对dsDNArecombineering介导的双区域替换的影响；
f：添加/不添加dNTP的野生型E.coli GB2005，RNR过表达突变株E.coli GB2005-Pgenta-nrdAB和mutS基因敲除突变株GB2005ΔmutS::genta中重组效率和自发突变率比较；10nM：添加10nM dNTPs的E.coli GB2005，Pgenta-nrdAB:RNR启动子替换的突变株E.coli GB2005-Pgenta-nrdAB；ΔmutS:敲除mutS基因的突变株E.coli GB2005ΔmutS，Ctrl:不添加dNTP的GB2005。
图2为大肠杆菌GB2005中dReaMGE的建立；
其中，a和b，在大肠杆菌GB2005、GB2005-Pgenta-nrdAB和添加10nM dNTPs的GB2005中，30℃复苏1-12个小时下dsDNA recombineering介导的六个区域替换的效率比较；
图3为dReaMGE方法在Paraburkholderia.megapolitana DSM 23488基因组精简方面的应用；其中，
a：dReaMGE介导的DSM23488基因组精简的示意图；
b：在添加或不添加10nM dNTP的情况下，在22℃下恢复12小时后，dReaMGE介导的DSM23488中5个生物合成基因簇(BGC)同时敲除的效率：Single-只有一个基因簇被敲除的突变株，double-有两个基因簇被完全敲除的突变株，triple-有三个基因簇被完全敲除的突变株，quadruple-有四个基因簇被完全敲除的突变株，quintuple-有五个基因簇被完全敲除的突变株。纵坐标表示在108个细胞中不同的突变株的个数。
图4为KT2440中dReaMGE的应用；其中，
a：KT2440中在BAS重组系统介导下，不同复苏时间下双区域替换的效率比较；
b：不同复苏温度下，经过22℃2小时或10小时复苏后双区域替换的效率比较；
c：经过22℃2小时或10小时复苏后，不同抗性基因使用策略下三个区域替换的效率比较；
d：经过22℃2小时复苏后，添加dNTP对三个区域替换的影响；
e：在最优条件下，KT2440中经过22℃1小时复苏后dReaMGE介导的三个区域替换的效率；
f：三个区域替换的PCR检测结果；M：DL5000 DNA ladder，检测引物：p1-genta-5out， p2-KT2440-regionA-check-5，p3-KT2440-regionB-check-5，p4-KT2440-regionC-check-5；
图5为DC3000中dReaMGE的应用；其中，
a：不同复苏时间下dsDNA recombineering介导双区域替换的效率比较；
b：经过22℃2小时或10小时复苏后，不同复苏温度下双区域替换的效率比较；
c：经过22℃2小时或10小时复苏后，不同抗性基因使用策略下三个区域替换的效率比较；
d：经过22℃4小时复苏后，添加dNTP对三个区域替换的影响：Ctrl：不添加dNTP 的野生型DC3000，0.1nM～1000nM：复苏阶段添加0.1nM～1000nM GC含量为50％的 dNTPs；
e.在最优条件下，DC3000中经过22℃4小时复苏后dReaMGE介导的三个区域替换的效率；
f.三个区域替换的PCR检测结果：M：DL5000 DNA ladder，检测引物：p1-genta-5out， p2-DC3000-regionA-check-5，p3-DC3000-regionB-check-5，p4-DC3000-regionC-check-5；
图6为本发明的dReaMGE方法在DSM7029的glidobactin生物合成基因簇多启动子替换以及多个负转录调控因子组合敲除方面的应用；其中，
a：DSM 7029中glidobactin基因簇多启动子替换示意图；
b：HPLC/MS分析(BPC+All MS)DSM7029野生型、DSM7029 glidobactin基因簇单启动子替换突变株(7029::PapraglbB和7029::PapraglbC)和双启动子替换突变株 (7029::PapraglbB-PapraglbC)的甲醇提取物；
c：通过glidobactin生物合成基因簇双启动子替换获得的新型衍生生物：luminmicinF-luminmicinI；
d：glidobactin生物合成基因簇四个赖氨酸家族负转录调控因子组合敲除示意图： lysR2-AAW51_4987；lysR18-AAW51_5436；lysR23-AAW51_2727和lysR29-AAW51_4579；
e：HPLC/MS分析(BPC+All MS)DSM7029野生型和DSM7029 glidobactin基因簇四个负转录调控因子敲除突变株(7029Δ4LTTRs)的甲醇提取物。
图7为dReaMG在DSM7029多转录调控因子敲除中的应用；其中，
a：DSM 7029野生型、7029::Papra glbB和7029Δ4LTTRs中glb基因簇核心基因(glbB、 glbC和glbF)转录水平比较；
b：敲除49个LTTRs对glbB基因转录水平的影响；
c：四个LTTR替换的示意图。d.四个LTTR替换的效率；
e：四个LTTR替换的PCR验证结果；
f：DSM 7029野生型和7029Δ4LTTRs中glidobactin A的产量比较：
M：DL5000 DNA ladder，检测引物：p1-genta-5out，p4-7029-lysR2-check-5， p5-7029-lysR18-check-5，p6-7029-lysR23-check-5，p7-7029-lysR29-check-5。
具体实施方式
本发明提供的实施例中，如无特殊说明，实验方法均采用实验室常规方法，使用的试剂为常规市售试剂或按常规方法配置的试剂。
试剂及生物材料：
本实施例中试剂主要为分子生物学实验试剂，单链核苷酸由上海生工生物技术有限公司合成，限制性内切酶、DNA聚合酶和DNA标记来自新英格兰生物公司(New EnglandBiolabs)，抗生素从英杰公司(Invitrogen)购买，普洛麦格的荧光素酶检测试剂盒购自普洛麦格生物试剂公司。本发明中涉及的大肠杆菌：GB05-dir购自德国基因桥公司(GeneBridges)；伯克氏菌E.coli GB2005,Pseudomonas.putida KT2440，Pseudomonas.syringae DC3000，Burkholderiales strain DSM 7029，Paraburkholderia.megapolitanaDSM 23488，均购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)。
实施例一：本发明提供的一种适用于多种细菌的基于dsDNA重组工程的多重基因组编辑方法(dsDNA-recombineering assisted Multiplex Genome Editing,dReaMGE)，具体实现步骤如下：
(1)针对不同的宿主选择能够有效介导recombineering的Red/ET类型重组酶，合适的诱导型启动子、强启动子、抗性标记和骨架质粒；其中，宿主包括大肠杆菌E.coliGB2005，伯克氏菌Polyangium brachysporum DSM 7029，伯克氏菌Paraburkholderia.megapolitana DSM 23488，假单胞菌Pseudomonas.putida KT2440和Pseudomonas.syringae DC3000 在内的五种不同细菌。
(2)用(1)中筛选到的诱导型启动子控制重组酶并构建在合适的骨架质粒上，通过电转化(或接合转导等适合于目的宿主的遗传操作)的方式将构建好的重组酶表达质粒导入到宿主细胞中。
(3)通过PCR的方法获得带有能够锚定不同靶标位点短的同源臂(100bp)和相同抗性基因(例如：氯霉素抗性基因)的dsDNA底物。
本实施例中，带有能够锚定不同靶标位点短的同源臂(100bp)的底物是通过对dsDNA 底物中与能引发冈崎片段合成的链的互补链5’末端进行磷酸化修饰，促进5’-3’核酸外切酶 Redα对非目标链的降解，加速目标ssDNA底物在宿主细胞体内的形成，使宿主细胞能够更加充分和迅速的利用dsDNA底物。
(4)将步骤(1)中的带有重组酶质粒的宿主细胞用合适培养基培养至对数生长期，添加诱导剂，诱导重组酶的表达，并根据不同宿主细胞的特性制备带有重组酶质粒的宿主细胞感受态，将靶向不同靶标序列的dsDNA底物混合后通过电转化导入到感受态细胞内。
(5)将电转化后的感受态细胞，在低于最适生长温度的温度下进行复苏，并在复苏过程中添加终浓度为10nM的dNTPs(GC含量与宿主基因组GC含量相近或者相同)。
不同宿主细胞的复苏时间和复苏温度不同：E.coli GB2005，30℃，1小时；Schlegelella brevitalea DSM7029，22℃，4小时；Pseudomonas.putida KT2440，22℃，1小时； Paraburkholderia.megapolitana DSM 23488，22℃，4小时P.syringae DC3000，22℃，3小时)；
(6)将复苏后的感受态细胞离心弃上清后重悬于100μL适宜培养基中，均匀涂布于带有相应抗性的固体培养基平板上，在不同宿主对应的复苏温度下进行孵育直至单菌落长出；
(7)挑取单菌落进行鉴定，然后在含有相应抗生素的1mL液体培养基中培养：E.coli GB2005，30℃，6小时；Schlegelella brevitalea DSM7029，12小时；Pseudomonas.putida KT2440，6小时；Paraburkholderia.megapolitana DSM 23488，12小时；P.syringae DC3000，12小时。
取100μL菌液与900μL无菌水混合后95℃加热15min，取1μL煮沸样品作为PCR 模板。检测引物被设计成用于扩增外源基因与基因组连接处大小为0.5-1.5kb的片段。
实施例二：dsDNA介导的E.coli基因组双区域同时编辑
大肠杆菌GB2005中验证本发明的dsDNA recombineering在不同的复苏时间和不同的复苏温度下介导基因组双区域同时编辑的情况。
引物序列：其中小写部分用于介导充足的同源臂，大写部分为扩增抗性基因的引物。
Pgenta-nrdAB-DH10B-3：gcagtccttctgccgCccaatccagaacgcgatgGattttgtcgagattgatgcg ctctgtgctaccgtcgcgctttgtcaccagcagattctgattcatATGTATATCTCCTTTAGGTG；
Pgenta-nrdAB-DH10B-5：tcgcttatatattgaccacaactgatacatcagattatgtgatgactcgtgcttagatca atttttgcaatcattagcaaaaagattaataagccatctaAGGCACGAACCCAGTTGACA；
GB2005-regionA-delet-3：tgcacttcctgccggatatctacgtgccgtgcgaccagtgcaaaggtaaacgc tataaccgtgaaacgctggagattaagtacaaaggcaaaaccatccaTTACGCCCCGCCCTGCCACT；
GB2005-regionA-delet-5：gctgccagattcgcaaatctattatctggtggatgcgtcttatcagcaggcggt gaatttactgccggaagaaaaacgtaaattgctggtgcaactctgaCGTTGATCGGCACGTAAGAG；
GB2005-regionB-delet-3：taatgttggcaactgcgccaccatttggcatgtagcgtacttccgggtcctgaccc agattaccaacgagaataaccttgtttacgcctctgctggccatTTACGCCCCGCCCTGCCACT；
GB2005-regionB-delet-5：ccaacgcgggcgaataacaaacgcaaatagtcgtggatttcggtgattgtcccca ccgtagaacgcgggttatgagacgtcgatttctgctcaattgagaCGTTGATCGGCACGTAAGAG。
用上述引物扩增出5’端经过磷酸化修饰并分别携带靶向两个区域同源臂和氯霉素抗性基因的dsDNA，将2μg dsDNA底物混合物电转化入感受态细胞。电转化后的细胞使用1ml不含抗生素的LB培养基分别在不同温度(16℃，20℃，24℃，28℃，30℃，32℃，37℃) 下复苏不同时间(1-12小时)，然后涂布在含有15μg/mL氯霉素和15μg/mL卡纳霉素的LB 固体培养基平板上，37℃培养12h，每个生物学重复挑选48个单克隆进行菌落PCR检测。首先，本实施例验证了复苏时间的影响。实验结果如图1a，在amp和cm两个抗性选择压力下，当复苏时间延长至6h时双区域替换的突变株开始出现，当复苏时间从6h增加到12h时，突变体的数量明显增加(每108个细胞菌落中突变体数量由60增加到720)。如图1b所示，在 GB2005大肠杆菌中，仅通过复苏温度的调节不能获得双区域替换的突变体，但在复苏时间延长到6h的前提下，不同的复苏温度确实影响了重组效率。在大肠杆菌GB2005中，dsDNArecombineering介导双区域替换的最佳复苏温度为30℃，这与之前报道的在大肠杆菌中重组的复苏温度(37℃)明显不同。
然后，本实施例研究了抗性基因使用策略对dsDNA recombineering介导大肠杆菌中双区域替换的影响。在大肠杆菌中分别使用amp和cm双抗性基因或两个cm抗性基因进行双区域替换。结果如图1c所示，经过30℃复苏1小时后，通过双抗性基因使用策略没有得到重组子，而挑取通过单抗性基因策略获得的48个单克隆进行菌落PCR检测也没有得到双区域替换重组子。当复苏时间延长至6h，通过单抗性基因策略获得的双区域突变突变体(GB2005ΔregionA::cm-ΔB::cm)的克隆数(每108个细胞中有954个正确克隆)是通过双抗性基因突变策略获得的双区域突变体(GB2005ΔregionA::cm-ΔB::amp)的克隆数(每108个细胞中有340个正确克隆)的3倍。该结果证明，使用相同的抗性基因进行多区域编辑足以筛选可用于重组的细胞亚群，并且可以防止重组体被多种抗生素杀死。这一发现表明，虽然抗性基因的使用不是dsDNA recombineering介导多元基因组编辑的决定因素，但它确实是一个重要的影响因素，既可以影响效率，也可以解决缺乏筛选标记的问题。
综上所述，复苏时间是影响dsDNA recombineering介导多元基因组编辑的决定因素， dsDNA recombineering介导的大肠杆菌双区域替换的实现是以延长时间为代价，这是阻碍该技术在微生物细胞构建中广泛应用的瓶颈，因此本发明下一步通过加快重组来缩短工作时间。重组发生在DNA复制过程中的复制叉处，重组的速度由复制叉的移动速度决定，而复制叉的移动速度受体内dNTP水平的限制。核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase，RNR)可以催化核苷酸二磷酸(ribonucleotide diphosphate，NDP)形成脱氧核苷酸二磷酸(deoxyribonucleoside diphosphate，dNDP)，dNDP是脱氧核苷酸三磷酸(deoxynucleosidetriphosphate，dNTP)形成的限速条件。大肠杆菌通过维持RNR的亚表达水平来维持dNTP 的亚饱和水平，从而导致DNA复制叉移动保持较慢的速率。因此，本实施例用庆大霉素抗性基因的组成型强启动子Pgenta替换了编码RNR基因(nrdAB)的原始启动子，通过过表达RNR 来加速复制叉的移动速度进而加速重组，从而来缩短dsDNA recombineering介导双区域替换的时间。由图1d可知，在过表达RNR的菌株中(E.coli GB2005-Pgenta-nrdAB)，经过1小时的复苏可以得到双区域替换的突变体(GB2005-Pgenta-nrdABΔregionA::cm-ΔB::amp)，复苏时间相较于野生型E.coli GB2005缩短了80％，经过30℃复苏6小时后，E.coli GB2005-Pgenta-nrdAB中双区域替换的效率(每108个细胞中有1032个正确克隆)是野生型 E.coli GB2005中双区域替换效率(每108个细胞中有120个正确克隆)的8.6倍。
考虑到RNR过表达对重组的影响主要与细胞内dNTPs水平的上调有关，可以推断，这种促进作用也可以通过添加dNTP来实现，从而避免基因组的预修饰。因此，本实施例比较了大肠杆菌中过表达RNR和直接在复苏阶段添加dNTP对dsDNA recombineering介导双区域替换的影响。结果如图1e所示，经过30℃复苏1小时后，添加10nM dNTPs的野生型大肠杆菌双区域替换效率是E.coli GB2005-Pgenta-nrdAB的2.2倍，而不添加dNTP的野生型大肠杆菌无法得到双区域替换突变体。经过30℃复苏6小时后，添加10nM dNTPs的野生型大肠杆菌双区域替换效率(每108个细胞中有2262个正确克隆)是不添加dNTPs的野生型大肠杆菌中双区域替换效率(每108个细胞中有119个正确克隆)的19倍。另一方面，当添加dNTP浓度达到1000nM时，重组受到抑制，这可能是由于细胞内dNTP水平显著增加导致RNR的反馈抑制。本部分的结果表明，在复苏阶段适量添加dNTP比过表达RNR对重组的促进作用更显著。
过去的研究表明体内dNTP水平提高会导致自发突变率的上升，对不同条件下dsDNA recombineering介导E.coli GB2005单区域替换的重组子进行利福平(rifampicin)耐受度检测，如图1f所示，添加10nM dNTPs对重组的促进效果与敲除宿主负责识别碱基错配mutS基因 (GB2005ΔmutS::genta)接近，但自发突变率仍保持在5×10-7～8×10-7，与野生型E.coli GB2005中的自发突变率接近但远低于mutS基因敲除突变株GB2005ΔmutS::genta中的自发突变率。这一结果证明了调控细胞内dNTP浓度是促进重组和相关衍生技术的安全且有效的途径。
综上所述，本实施例的研究结果证明，足够长的复苏时间是dsDNArecombineering介导双区域替换的决定因素，RNR过表达和添加dNTP能够极大地缩短复苏时间并提高双区域替换的效率，同时复苏温度和抗性筛选标记使用策略在一定程度上影响dsDNA recombineering介导双区域替换的效率。
实施例三：大肠杆菌GB2005中六个区域同时替换
本实施例测试了dsDNA recombineering在野生型E.coli GB2005和GB2005-Pgenta-nrdAB 中在添加/不添加dNTP条件下，介导基因组六个区域(0.5kb)同时替换的能力，如图2a。
引物序列：
GB2005-regionC-delet-3：attgaagcagaagcctgcgatgtcggtttccgcgaggtgcggattgaaaatggt ctgctgctgctgaacggcaagccgttgctgattcgaggcgttaaccTTACGCCCCGCCCTGCCACT；
GB2005-regionC-delet-5：gccagctggcagttcaggccaatccgcgccggatgcggtgtatcgctcgccactt caacatcaacggtaatcgccatttgaccactaccatcaatccggtCGTTGATCGGCACGTAAGAG；
GB2005-regionD-delet-3：cgcctaatacatctacactttctatttattgacaagtgatacgttgcaaaaggagca acaccccacagactcgatgactgcgcagtcatacagtgaaattTTACGCCCCGCCCTGCCACT；
GB2005-regionD-delet-5：taggaatttcggacgcgggttcaactcccgccagctccaccaaaattctccatcgg tgattaccagagtcatccgatgaagtcctaagagcccgcacggcCGTTGATCGGCACGTAAGAG；
GB2005-regionE-delet-3：atcaatttatagctaaattaccgcctttcagccaatttgatcgagaacaatttatctcttt ttgatgcccatttccaagacttatacattgataaatatcTTACGCCCCGCCCTGCCACT；
GB2005-regionE-delet-5：atagcaatcaaaccgaagccacatatgcgcggccagattgttgacaaagggcg ctttgttcatgccggatacggcatgaacgctttattcggtctacaaaCGTTGATCGGCACGTAAGAG；
GB2005-regionF-delet-3：tttccatttctcaatgaatcaagggcgtattgcaatgacagatggcgacaaaaaat agcgtcagaaggagattgcaaaaaacatgcactaccattgagatTTACGCCCCGCCCTGCCACT；
GB2005-regionF-delet-5：tgagattaatgacgaagtggtcatatcacaatgataaaagtgacacaattcttataa caatttttcgtgcacatttcgttctggcgataataattaatcaCGTTGATCGGCACGTAAGAG。
用上述引物序列扩增出5’端经过磷酸化修饰并分别携带靶向六个区域同源臂和氯霉素抗性基因的dsDNA，将6μg dsDNA底物混合物电转化入感受态细胞。电转化后的细胞使用1ml 不含抗生素的LB培养基(添加/不添加GC含量为50％的10nM dNTPs)950rpm 30℃孵育1 h，然后涂布在15μg/mL的氯霉素固体培养基平板上，37℃培养12h。每个生物学重复挑选 48个单克隆进行菌落PCR检测。结果如图2b所示，在野生型E.coli GB2005中，在添加10nM dNTPs的条件下，经过1小时的30℃复苏后，一轮重组可以得到六重突变体 GB2005ΔregionA-ΔF::cm(每108个细胞中有196个正确克隆)，而不添加dNTP时经过12小时复苏依然无法得到正确克隆。在无dNTP添加的情况下，GB2005-Pgenta-nrdAB 30℃复苏4小时后，可以通过一轮重组得到六重突变体(GB2005-Pgenta-nrdABΔregionA-ΔF::cm)。野生型E.coli GB2005通过添加10nM dNTP经过30℃复苏1小时获得的转化子中有2％为六重突变体，意味着六重突变体可以通过菌落PCR验证少量的转化子得到，而无需大量的测序工作。通过一轮dsDNA recombineering获得六重突变体GB2005ΔregionA-ΔF::cm标志着dReaMGE技术的成功建立。
在大肠杆菌GB2005中经过关键因素的优化和体内dNTP的调节成功建立了dReaMGE技术，鼓励发明人在更多的细菌中通过类似的策略建立dReaMGE技术。
实施例四：本发明的dReaMGE方法实现DSM23488基因组精简
本实例中，通过dNTP添加、复苏时间和温度调整，利用Redγ-Redβα7029重组酶，在伯克氏菌DSM 23488中成功实施了dReaMGE方法，并实现了基因组精简，如图3a所示。
引物序列：
23488-delet-BGC1-5：gctgctgctcgtgatgcttgtctatccggtcggccagttgttgttgctgagcatgcac agaaggcacgaacccagttgaCCAACCGCGTGGCACAACAA；
23488-delet-BGC1-3：gctgcgcacgcatcatctgtttgggcgggatggcgcgcgttgcgacacggtga ttggcgtcggcttgaacgaattgttaCAACTTAAATGTGAAAGTGG；
23488-delet-BGC3-5：attgcctctcagcgatttgcaccgttgcggtgcgacctatgccgcatccgcacaga atcgaaggcacgaacccagttgaCCAACCGCGTGGCACAACAA；
23488-delet-BGC3-3：cgtcacagccggcacgacgattacctgcgctaccggttccaacaccaatagcttt tccatcggcttgaacgaattgttaCAACTTAAATGTGAAAGTGG；
23488-delet-BGC5-5：gcaacgcggcgaatgacgggcccatcggacgcacgcggatctgcggatcgagg tgttgcgaaggcacgaacccagttgaCCAACCGCGTGGCACAACAA；
23488-delet-BGC5-3：cgtgcgcggcctgccgcacttcgatcacacgctgcacgaaaattccgggcgtgac gatctcggcttgaacgaattgttaCAACTTAAATGTGAAAGTGG；
23488-delet-BGC6-5：ggtcactgatagtgacgaagttctggccgtgattgaacgccgtggctgcagtcttgccc gaaggcacgaacccagttgaCCAACCGCGTGGCACAACAA；
23488-delet-BGC6-3：cacccggcgccacgcctgtccagctacggaacgcgcgatagaacgacgggatatcg ccgtcggcttgaacgaattgttaCAACTTAAATGTGAAAGTGG；
23488-delet-BGC8-5：cagcgaggcgcctgcggcgacgcccgacgcaccgcacttccagcgttcggtggggc tgtgaaggcacgaacccagttgaCCAACCGCGTGGCACAACAA；
23488-delet-BGC8-3：cgccgctgcgctcggcgcaatcggttctccatcggtttccggcgcggtggctgtggcgg tcggcttgaacgaattgttaCAACTTAAATGTGAAAGTGG。
dReaMGE方法在DSM 23488(pBBR1-rha-Redγ-Redαβ7029-kan)中的实施步骤具体为：以R6K-loxM-genta为模板，用上述引物序列扩增出5’端修饰并针对五个BGC区域(BGC1,3,6,8,9)同源臂的庆大霉素抗性基因，将5μg的dsDNA底物混合物电转化入感受态细胞。电转化后的细胞使用1ml不含抗生素的CYMG培养基(添加/不添加GC含量为50％的10nMdNTPs)950rpm 22℃孵育12h，然后涂布在4μg/mL的庆大霉素固体培养基平板上，30℃培养48h。每个生物学重复挑选96个单克隆进行菌落PCR检测。
实验结果如图3b所示，通过添加10nM dNTPs，经过22℃复苏12小时后，DSM 23488的1号染色体上五个BGCs：BGC1(13kb)、BGC3(32kb)、BGC5(95kb)、BGC6(69kb) 和BGC8(11kb)被同时完全删除，如表1所示，在庆大霉素筛选压力下检测重组子中2.1％为正确突变体(DSM23488Δ5BGCs::genta)，而不添加dNTP，经过22℃复苏12小时后无法得到正确突变体。DSM23488Δ5BGCs::genta与野生型相比基因组精简了200kb(1号染色体的6.3％，全部基因组的2.6％)。
该实施例的结果证明dReaMG能够在伯克氏菌DSM23488中成功应用，且在细菌基因组精简方面具有良好的应用前景。
实施例五：P.putida KT2440中三个区域同时替换
引物序列：
KT2440-regionA-delet-3：ggtgccatcttctcgaatagatactgatttaaggagatgctggctaagcatggagg ggtgtgaaggggtataaccctgctcgaaagcttcagtctcttttCAACTTAAATGTGAAAGTGG；
KT2440-regionA-delet-5：ccagctccgcgatatccaaccgaaggccgcataagagatctacgaccttagc gaggcaagcgtactgccgggccactcgaaagagggagatcgcaaagccCCAACCGCGTGGCACAACAA；
KT2440-regionB-delet-3：gtcatccgtagcgaggctggatattgtgaagcccgcctttcccaaggatagatc aatttctttaggtatcgtcaaggagttcaaaaatgggggtgtagtgCAACTTAAATGTGAAAGTGG；
KT2440-regionB-delet-5：cccgcgccattctgagtagcacaaactttggcgagcatcagtccagcgtatacga tctagattaatttatggataaatcatcaatgagccacgctccagaCCAACCGCGTGGCACAACAA；
KT2440-regionC-delet-3：cacgatgtaggcgcctattcacctttccgcccttccggcgggttactttggtcgtggc caaagtaaccaaaaccgtcggctcccatcatccggcccctacCAACTTAAATGTGAAAGTGG；
KT2440-regionC-delet-5：tcgacggatcgggtcatcaaagccgccaaaaccaaaagaccttgaaagggatg gcccttacggcgggtccctttttgtcgtggcaaaaaggaaccaaaaaCCAACCGCGTGGCACAACAA。
以BAS重组酶为工具，通过延长复苏时间(图4a)、优化复苏温度(图4b)、抗性筛选标记使用策略(图4c)的改进和dNTP添加(图4d)，dReaMGE方法在P.putida KT2440中也得以应用。以R6K-loxM-genta为模板，用上述引物扩增dsDNA底物。对于KT2440 (pBBR1-Rha-BAS-kan)，过夜培养的菌液转移到1.3ml新鲜LB培养基中，添加10μg/mL的卡那霉素(起始OD600为0.15)，30℃，950rpm培养2h，加入L-鼠李糖诱导表达重组酶60min。 9600rpm室温离心30s，尽量弃掉上清液，悬浮于1ml室温ddH2O中。重复这个步骤，最终细胞悬浮在30μlddH2O中，加入3μg携带有两端靶向KT2440 region A(2087242-2087743)、 region B(4371516-4372016)和region C(4372487-4372987)区域同源臂的庆大霉素抗性基因的等量dsDNA混合底物，使用2510electroporator电转仪进行电击，设置为：1250V，使用1mm间隙宽度电击杯，电转化后的细胞使用1ml不含抗生素的LB培养基(添加GC含量为50％的10nMdNTPs)950rpm 22℃孵育2h，然后涂布在15μg/mL的庆大霉素固体培养基平板上，30℃培养12h。每个生物学重复挑选24个单克隆进行菌落PCR检测。
实验结果如图4e，4f所示，添加10nM dNTPs，经过22℃复苏2小时后，KT2440基因组上三个区域可以被携带两端带有不同同源臂的庆大霉素抗性基因的dsDNA底物混合物同时替换，在庆大霉素筛选压力下检测重组子中33.8％为三区域突变体 (KT2440ΔregionA-ΔC::genta)。通过添加dNTP，KT2440基因组上三个区域同时替换所需的复苏时间由10小时缩短到2小时，该结果证明本发明的dReaMGE方法能够在假单胞菌P. putida KT2440中成功应用。
实施例六：P.syringae DC3000中三个区域同时替换
引物序列：
DC3000-regionA-delelt-3：gaaaacaccgataatttagttaggagcaacattgttagtgagaatattaatagc ttgctaactaatatctcgtaacaagatcttacggtcaacccgtaacCAACTTAAATGTGAAAGTGG；
DC3000-regionA-delelt-5：gattctgcgaggtaaattttttcgtaaagcttgtactcttcgtcatctgacttcatgtgcg tacagttaccatccgaggtttgagctgtatcatagagtcCCAACCGCGTGGCACAACAA；
DC3000-regionB-delelt-3：gaaaacaccgataatttagttaggagcaacattgttagtgagaatattaatagc ttgctaactaatatctcgtaacaagatcttacggtcaacccgtaacCAACTTAAATGTGAAAGTGG；
DC3000-regionB-delelt-5：gattctgcgaggtaaattttttcgtaaagcttgtactcttcgtcatctgacttcatgtgc gtacagttaccatccgaggtttgagctgtatcatagagtcCCAACCGCGTGGCACAACAA；
DC3000-regionC-delelt-3：aggaacgtgggtaagtctgagggttttcatgcgctaatcctttatccttacggctca atacttggcgagggttggtcggtactttgcgtgtgcaaggctgCAACTTAAATGTGAAAGTGG；
DC3000-regionC-delelt-5：attggcagctcaaagccgccagttttacccaggggggtcaattctaggttggcgtt agggggtcatttttacagtggcggtgacaactacgtactgtcttCCAACCGCGTGGCACAACAA。
以BAS重组酶为工具，通过延长复苏时间(图5a)、优化复苏温度(图5b)、抗性筛选标记使用策略(图5c)的改进和dNTP添加(图5d)，dReaMGE技术在P.syringae DC3000中得以应用。P.syringae DC3000(pBBR1-Rha-BAS-kan)中三个基因组区域同时编辑的步骤与KT2440类似。以R6K-loxM-genta为模板，用上述引物扩增dsDNA底物。DC3000中加入3μg 携带有两端靶向DC3000 region A(1826364-1826865)、region B(4078273-4078773)和region C(4079362-4079862)区域同源臂的庆大霉素抗性基因的等量dsDNA混合底物，电转化后的细胞使用1ml不含抗生素的LB培养基(添加GC含量为50％的10nM dNTPs)950 rpm 22℃孵育4h，然后涂布在4μg/mL的庆大霉素固体培养基平板上，30℃培养48h。每个生物学重复挑选24个单克隆进行菌落PCR检测。结果如图5e所示，通过添加10nM dNTPs，22℃复苏2小时，DC3000基因组上三个区域被携带两端带有不同同源臂的庆大霉素抗性基因的dsDNA底物混合物同时替换，在庆大霉素筛选压力下检测重组子中10.9％为三区域突变体(DC3000ΔregionA-ΔC::genta)。通过添加dNTP，DC3000基因组上三个区域同时替换所需时间由10小时缩短到4小时，如图5e，5f所示，该结果证明dReaMGE能够在假单胞菌P.syringaeDC3000中成功应用。
实施例七：dReaMGE在DSM 7029中glbB和glbC启动子同时替换
引物序列：
glbB-genta-GFP-Papra-5：tgctacagcttaacgagtccgtaaagatgtccaacaagtcgacaacacaagca gcaggcaagcgcccgcggtcttgaccgcgagcctcaacccacaacgtTTACTTGTACAGCTCGTCCA；
glbB-genta-GFP-Papra-3：cccatccgcgttgctgcaaggctgcgcgcacgtcgccgggttccgtttccggtgc tgcggcagcccattcctgtcctgtcatttttgacatgctttcccgGACATTGCACTCCACCGCTG；
glbC-genta-Papra-5：ggctgtcagctgcagccccggcgcctcacacggcacgcgcaccgtgatcttgatcga cttctcgcccttgaaccctgcgtccagcgcgcaacccacctgaTTACTTGTACAGCTCGTCCA；
glbC-genta-Papra-3：gggctccagcgagacgacggtggtggcgccggtggtgtcgtggcgatcggggctgg cggaggaggagatgtcagaacgttggctcacggtggtcgattccGACATTGCACTCCACCGCTG。
DSM 7029中的glb基因簇能够产生一类具有良好抗肿瘤活性的蛋白酶体抑制剂glidobactin A及其衍生物(glidobactin B-I和luminmycin A-E)。glb基因簇由8个基因组成 (glbA-glbH)，glbC和glbF分配编码多肽模块合成glidobactin A的核心骨架。glbB编码负责4 位赖氨酸环化，是glidobactin A合成的限速步骤138。glbB和glbC属于不同的转录单位，我们通过将glbB转录单位和glbC-glbF转录单位的启动子替换为外源的强启动子来提高glidobactin A的产量。以Redαβ7029重组酶为工具，以genta-Papra为模板，用上述引物扩增出针对DSM 7029glbB和glbC启动子区域不同同源臂的genta-Papra组件，将2μg的dsDNA底物电穿孔至诱导后的DSM 7029中(pBBR1-rha-Redγ-Redαβ7029-kan)。电转化后的细胞使用1ml不含抗生素的CYMG培养基950rpm 30℃孵育4h，然后涂布在15μg/mL的庆大霉素固体培养基平板上，30℃培养48h。每个生物学重复挑选24个单克隆进行菌落PCR检测。如图6a所示，我们利用dReaMGE技术成功的用组成型启动子(Papra)替换了glbB转录单元和glbC-glbF转录单元的启动子，并得到了三种启动子替代突变体。在7029Papra glbB-Papra glbC的提取物中， glidobactins的产量显著提高，并检测到四种新型的化合物luminmycin F-I(1-4)，如图6b， 6c所示，其中，luminmycin G(2)对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231(IC50＝10.98μM)具有一定的抗肿瘤活性，而对人肝细胞株LO2(IC50>400μM)则无杀伤作用，如表1所示。
表1 Luminmycin F-I的细胞活性
Figure RE-GDA0003315804440000151
该部分结果证明，可以通过对活跃基因簇的不同转录单元进行外源启动子替换或者插入对该基因簇进行深度发掘获得更多活性衍生物，为基因簇资源挖掘提供了一种新的方向。
实施例八dReaMGE在DSM 7029的glidobactins合成基因簇四个负调控赖氨酸家族转录调控因子(lysR transcriptional regulator，LTTR)的同时敲除中的应用
在上一部分中，虽然通过多启动子替换获得了新型的glidobactin衍生物，但是却并未实现本发明的最初目的：提高glidobactin A的产量。转录组数据显示，在DSM 7029野生型和 7029Papra glbB中，glbB基因的转录水平显著低于glbC和glbF，如图7a所示。推测DSM 7029 基因组中存在一个或者多个针对glbB基因的抑制因子，因此本实施例首先通过单因子敲除实验研究了DSM 7029中一类对次级代谢产物的产生具有重要影响的LTTRs中所有成员对 glbB基因的影响，分析49个单一删除LTTR敲除突变体中glbB基因的转录水平的变化，发现DSM 7029基因组中确实存在多个能够显著影响glbB基因转录水平的LTTRs，如图7b所示，而启动子更换不能完全消除抑制效果。因此，本发明期望通过敲除DSM 7029基因组中对glbB基因抑制作用最强的4个负调控LTTRs(lysR2-AAW51_4987、lysR18-AAW51_5436、lysR23-AAW51_2727和lysR29-AAW51_4579)来提高glidobactin A的产量。
引物序列：
7029-delet-lysR1-5：ataaatttcgcgcatccgaaactgttggttttgaatcgatggacaagctgcgcagcatgg aggttttcgtcgcgCCAACCGCGTGGCACAACAA；
7029-delet-lysR1-3：tgggcagggcctgccgatcgggcagatagacgaggtgcaccggccgcggtgccggca ggaagtcgtccagcaccaacTTAAATGTGAAAGTGGG；
7029-delet-lysR2-5：agcctgctaaggttgcttcattcccaactggcggtgttgaatatggaccggatcgagagcct gcaagtcttcgtCCAACCGCGTGGCACAACAA；
7029-delet-lysR2-3：tcgggcaggtagagcaagtgtgccggccgctccggcggcgcgtaacgaggcaacac cctcaccagccggcgtAACTTAAATGTGAAAGTGGG；
7029-delet-lysR3-5：atggatcgtctgacttccatgcgggcgtttgcgaaagtgatcgatgaaggcggcttcgcgg ccgcggcacgggcCAACCGCGTGGCACAACAAC；
7029-delet-lysR3-3：gcacgaacttgcgcgagggcatggcggcatagagcgtgaaggtgggggtgcgccact gcggcagcagctgcaccAGATCCTTTCTCCTCTTTAG；
7029-delet-lysR4-5：aaagaaatagttcactgcgagagaatagtgcgatggatcgctataccgccctccaggtg tttcgccatgtCCCAACCGCGTGGCACAACAA；
7029-delet-lysR4-3：tcgagaaaaacgcggatctttggagcgaggtgctggcgagacggatagacggcgtaga gcgtggtttccacAACTTAAATGTGAAAGTGGG；
7029-delet-lysR5-5：acaaaggcggtcatcacggcgacgatcaggttcttcttggcgttcatggtgcttctccgttca caagggtCCAACCGCGTGGCACAACAA；
7029-delet-lysR5-3：tccatgaaggctcgggtgcgggccggcacgtacttgcggctgggcatcgccgcataga tcgtgtagctcatgaCAACTTAAATGTGAAAGTGG；
7029-delet-lysR6-5：tggcggcatttgagcgccacactgttgccacagaggcgccaataatcgggcgatgaacg accgattgaatggCCAACCGCGTGGCACAACAA；
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以R6K-loxM-genta为模板，用上述引物扩增出靶向DSM 7029四个glidobactin合成基因簇四个负调控LTTRs的带有庆大霉素抗性基因的dsDNA底物，将4μg的dsDNA底物混合物电穿孔至诱导后的DSM 7029中(pBBR1-rha-Redγ-Redαβ7029-kan)。电转化后的细胞使用1ml不含抗生素的CYMG培养基950rpm 30℃孵育4h，然后涂布在15μg/mL的庆大霉素固体培养基平板上，30℃培养48h。每个生物学重复挑选48个单克隆进行菌落PCR 检测。在庆大霉素抗生素筛选压力下，一轮重组后挑出的重组子中4％为7029Δ4 LTTRs::genta正确突变体，并获得一个复杂的突变文库可以进行表型分析，如图7c，7d， 7e所示。通过转录水平分析，可以看到7029Δ4LTTRs::genta中glbB基因的转录水平显著高于DSM 7029野生型菌株和7029Papra glbB，如图7a所示，这证明glbB被抑制状态得到了显著的缓解。与此相对应的是，LC-MS分析显示7029Δ4LTTRs::genta中glidobactin A 的产量比野生型菌株提高了4倍，如图7f所示。
本实施例的结果证明，本发明的dReaMGE方法在系统性的改造细菌代谢网络、实现基因组挖掘和目标代谢产物产量优化方面具有应用潜力。

Claims (10)

1.一种基于双链DNA 重组工程的细菌基因组多重编辑方法，其特征在于，包括：
（1）将靶向不同靶标序列的dsDNA 底物混合后导入到带有重组酶质粒的宿主感受态细胞内；
（2）将感受态细胞在低于最适生长温度的温度下复苏；复苏过程中添加终浓度为10 nM的 dNTPs；
（3）对复苏后的感受态细胞筛选出带有标记的单菌落，进行鉴定。
2.根据权利要求1所述的基于双链DNA 重组工程的细菌基因组多重编辑方法，其特征在于，所述步骤（2）中，复苏时间为1-4小时。
3.根据权利要求1所述的基于双链DNA 重组工程的细菌基因组多重编辑方法，其特征在于，添加的dNTPs 中GC含量与宿主基因组GC含量相近或者相同。
4.根据权利要求2所述的基于双链DNA 重组工程的细菌基因组多重编辑方法，其特征在于，所述宿主为E.coli GB2005，在30 ℃下复苏时间为1小时；或者，
所述宿主为Schlegelella brevitalea DSM7029或Paraburkholderia. megapolitanaDSM 23488，在22 ℃下复苏4小时；或者，
所述宿主为Pseudomonas. putida KT2440，在22 ℃下复苏1小时；或者，
所述宿主为P. syringae DC3000，在22 ℃下复苏3小时。
5.根据权利要求1所述的基于双链DNA 重组工程的细菌基因组多重编辑方法，其特征在于，所述宿主为E.coli GB2005，并且其脱氧核酸还原酶的原始启动子被替换为庆大霉素启动子Pgenta，在30 ℃下复苏时间为1小时。
6.根据权利要求1-5任一项所述的基于双链DNA 重组工程的细菌基因组多重编辑方法，其特征在于，所述靶向不同靶标序列的dsDNA 底物带有相同的抗性基因。
7.根据权利要求6所述的基于双链DNA 重组工程的细菌基因组多重编辑方法，其特征在于，所述靶向不同靶标序列的dsDNA 底物带有能够锚定不同靶标位点短的同源臂。
8.一种如权利要求7所述的基于双链DNA 重组工程的细菌基因组多重编辑方法的应用，其特征在于，采用所述方法介导细菌宿主内的多重基因组编辑。
9.根据权利要求8所述的基于双链DNA 重组工程的细菌基因组多重编辑方法的应用，其特征在于，采用所述方法对细菌宿主中抗肿瘤化合物的基因簇进行多启动子替换，获得多种该抗肿瘤化合物的衍生物。
10.根据权利要求8所述的基于双链DNA 重组工程的细菌基因组多重编辑方法的应用，其特征在于，采用所述方法改造细菌代谢网络，实现基因组挖掘和目标代谢产物产量优化。
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