JP2023528484A - Ｄｎａ生産のための細菌株 - Google Patents

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Abstract

プラスミド核酸の生産のための組成物、ならびにそれを作製及び使用する方法が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２０年６月５日に出願された米国特許出願第６３／０３５，６３０号の出願日の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張する。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、バイオテクノロジー及び医薬品開発において長い歴史を持ち、プラスミドＤＮＡ生産の宿主として長年使用されてきた。これは様々な理由によるもので、その中にはＥ．ｃｏｌｉの遺伝的単純性（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの遺伝子数が４，４００未満で少ない）、成長率、安全性、外来ＤＮＡを受け入れることの成功、及び管理の容易さがある。また、Ｅ．ｃｏｌｉは長い歴史と使用から、様々な方法で操作されてきた、特徴がはっきりした生物にもなっている。例えば、クローニング、プラスミドＤＮＡ生産及びタンパク質の発現を含む様々な目的のためにいくつかの異なる株が作成されてきた。最も一般的には、ＤＨ５α、ＪＭ１０８、ＤＨ１０βなどのＥ．ｃｏｌｉＫ１２誘導体が、クローニング目的に望ましい特定のゲノム変異を有することから、プラスミドＤＮＡのクローニング及び生産に使用される。これらは主に、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼならびに株のＤＮＡの安定性、純度及びクローニング効率を低下させる他の酵素をコードする遺伝子の不活性化をもたらす。
増強されたプラスミドＤＮＡ生産のための操作された細菌株及びベクターが、本明細書で提供される。
一態様において、本発明は、定常期誘導プロモーター及びプライモソーム集合部位（ＰＡＳ）を含む操作された核酸ベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは更に、ＲＮＡＩＩ上に重要なステムループ、ＳＬ４の形成を引き起こす点変異を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡＩＩの天然プロモーターは破壊されている。いくつかの実施形態において、ＲＮＡＩＩの天然プロモーターは欠失している。
いくつかの実施形態において、定常期誘導プロモーターは、Ｐ（ｏｓｍＹ）である。いくつかの実施形態において、Ｐ（ｏｓｍＹ）は、配列番号２７の配列を有する。いくつかの実施形態において、ＰＡＳは、配列番号２８の配列を有する。
いくつかの実施形態において、ＳＬ４は、配列番号２９の配列を有する。いくつかの実施形態において、ベクターは、プラスミド１（＋ＰＡＳ＋Ｐ（ｏｓｍＹ））である。
いくつかの実施形態において、ベクターは、プラスミド２（＋ＰＡＳ＋Ｐ（ｏｓｍＹ）＋ＳＬ４）である。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号１９（プラスミド１の配列）に対して少なくとも７０％同一の配列を有する。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号２０（プラスミド２の配列）に対して少なくとも７０％同一の配列を有する。
いくつかの実施形態において、ベクターは更に、以下の５’から３’への配置：
（ａ）複製起点、
（ｂ）プロモーター及び
（ｃ）抗生物質耐性遺伝子を含む。
いくつかの実施形態において、ベクターは更に、目的のｍＲＮＡをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。
他の態様において、遺伝子型：｜＜ｒｅｐＡ｜ｏｒｉ＿ｔｓ｜＜ｒｅｃＡ｜＜ｂｌａ｜＜ｔｅｔＲ｜＜Ｐ（ｔｅｔＲ）｜Ｐ（ｔｅｔ）＞｜ｇａｍｍａ＞｜ｂｅｔａ＞｜ｅｘｏ＞｜ａ＞｜を含む組換えプラスミドが提供される。
他の態様において、配列番号１９に対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列を含む組換えプラスミドが提供される。
他の態様において、配列番号２０に対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列を含む組換えプラスミドが提供される。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を実施する方法は本発明の他の態様において提供され、前記方法は、本明細書に記載の操作された核酸ベクターを使用する。
いくつかの態様において、本発明は、ｐｒｓＡバリアントを含む核酸である。いくつかの実施形態において、核酸は、ｐｒｓＡに対して７０％～９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、核酸は、ｐｒｓＡ＊（配列番号２３）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、核酸は、ｐｒｓＡ＊（配列番号２３）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、核酸は、ｐｒｓＡ＊（配列番号２３）に対して少なくとも９０％、９５％または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号２３である。いくつかの実施形態において、核酸は、ｐｒｓＡ＊（配列番号２４）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする。他の実施形態において、核酸は、配列番号２３に対して１００％の配列同一性を有するか、または配列番号２４に対して１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする。
ｐｒｓＡバリアントを含む遺伝子改変微生物であって、前記遺伝子改変微生物はリプレッサー遺伝子ｐｕｒＲが破壊されているゲノムを有する、前記遺伝子改変微生物が、本発明の他の態様において提供される。いくつかの実施形態において、ｐｒｓＡバリアントは、ｐｒｓＡに対して７０％～９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、ｐｒｓＡバリアントは、ｐｒｓＡ＊（配列番号２３）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、ｐｒｓＡバリアントは、配列番号２３を有する。いくつかの実施形態において、ｐｕｒＲは、欠失している。いくつかの実施形態において、ｐｕｒＲは、配列番号２５を有する。いくつかの実施形態において、ＥｃｏＫＩ制限系は、ゲノムから欠失している。いくつかの実施形態において、ｅｎｄＡは、ゲノムから欠失している。いくつかの実施形態において、ｒｅｃＡは、ゲノムから欠失している。いくつかの実施形態において、遺伝子改変微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の組換え株である。
本発明のいくつかの態様において、少なくとも以下の遺伝子欠失：ｅｎｄＡ（ΔｅｎｄＡ）及びｒｅｃＡ（ΔｒｅｃＡ）を有するＥ．ｃｏｌｉゲノムを含む、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の組換え株が提供される。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉは、ＭＧ１６５５に由来する。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、ＭＧ１６５５に関して少なくとも以下の遺伝子欠失：ｅｎｄＡ（ΔｅｎｄＡ）及びｒｅｃＡ（ΔｒｅｃＡ）を含むＭＧ１６５５ゲノムの核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、ＭＧ１６５５ゲノムと少なくとも９５％の配列同一性の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＥｃｏＫＩ制限系は、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムから欠失している。
いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、ＭＧ１６５５ゲノムに対して少なくとも８０％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムがＭＧ１６５５ゲノムに関してＥｃｏＫＩ制限系欠失を含むＭＧ１６５５ゲノムの核酸配列を含む、核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉは、ｐｒｓＡバリアントを含む。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、ＭＧ１６５５ゲノムに対して少なくとも８０％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、配列番号２３の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ｐｕｒＲ配列は、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムから欠失している。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、ＭＧ１６５５ゲノムに対して少なくとも８０％同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、ＭＧ１６５５ゲノムに関して欠失した配列番号２５の核酸配列を有する。
一態様において、本開示は、少なくとも以下の遺伝子欠失：ｅｎｄＡ及びｒｅｃＡを有するＥ．ｃｏｌｉゲノムを含むＥ．ｃｏｌｉの組換え株に関する。
いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは更に、ｍｒｒ、ｈｓｄＲ、ｈｓｄＭ、ｈｓｄＳ、ｓｙｍＥ及びｍｃｒＢＣを含む群から選択される遺伝子欠失の少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは更に、ｍｒｒ、ｈｓｄＲ、ｈｓｄＭ、ｈｓｄＳ、ｓｙｍＥ及びｍｃｒＢＣを含む群から選択される遺伝子欠失の少なくとも２つを含む。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは更に、ｍｒｒ、ｈｓｄＲ、ｈｓｄＭ、ｈｓｄＳ、ｓｙｍＥ及びｍｃｒＢＣを含む群から選択される遺伝子欠失の少なくとも３つを含む。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは更に、ｍｒｒ、ｈｓｄＲ、ｈｓｄＭ、ｈｓｄＳ、ｓｙｍＥ及びｍｃｒＢＣを含む群から選択される遺伝子欠失の少なくとも４つを含む。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは更に、ｍｒｒ、ｈｓｄＲ、ｈｓｄＭ、ｈｓｄＳ、ｓｙｍＥ及びｍｃｒＢＣを含む群から選択される遺伝子欠失の少なくとも５つを含む。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは更に、遺伝子欠失：ｍｒｒ、ｈｓｄＲ、ｈｓｄＭ、ｈｓｄＳ、ｓｙｍＥ及びｍｃｒＢＣを含む。
いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５または株１に由来する。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、Ｅ．ｃｏｌｉ株４に由来する。
一態様において、本開示は、Ｅ．ｃｏｌｉの組換え株に関し、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは更にプラスミドを含む。いくつかの実施形態において、プラスミドは、ｐｒｓＡ＊を発現するか、またはｐｕｒＲをノックアウトすることができる。いくつかの実施形態において、プラスミドはｐｒｓＡ＊を発現し、かつｐｕｒＲをノックアウトすることができる。
一態様において、本開示は、遺伝子型：
｜＜ｒｅｐＡ１０１｜ｏｒｉ１０１＿ｔｓ｜＜ｒｅｃＡ｜＜ｂｌａ｜＜ｔｅｔＲ｜＜Ｐ（ｔｅｔＲ）｜Ｐ（ｔｅｔ）＞｜ｇａｍｍａ＞｜ｂｅｔａ＞｜ｅｘｏ＞｜６０ａ＞｜を含む組換えプラスミドに関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥ．ｃｏｌｉゲノムは更に、第１の環境因子に基づくポジティブ選択マーカー、または第２の環境因子に基づくネガティブ選択マーカーの遺伝子を発現し得、第１の環境遺伝子及び第２の環境因子は同じではない。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥ．ｃｏｌｉゲノムは更に、第１の環境因子に基づくポジティブ選択マーカー、及び第２の環境因子に基づくネガティブ選択マーカーの遺伝子を発現し得、第１の環境遺伝子及び第２の環境因子は同じではない。いくつかの実施形態において、ポジティブ選択マーカーは、カナマイシン耐性を付与することができる遺伝子である。いくつかの実施形態において、ネガティブ選択マーカーは、レバンスクラーゼを発現することができる。
いくつかの態様において、株３を含む遺伝子改変微生物が提供される。
いくつかの態様において、株４を含む遺伝子改変微生物が提供される。
いくつかの態様において、配列番号２１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号２１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号２１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号２１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号２１を有する核酸を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号２２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号２２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号２２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号２２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号２２を有する核酸を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号１～１５のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号１～１５のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号１～１５のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号１～１５のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号１～１５のいずれか１つに対して少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号１～１５のいずれか１つの核酸配列を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号１０に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号１１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号１０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号１１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号１０に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号１１に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号１０の核酸配列を含む操作された核酸ベクターが提供される。
いくつかの態様において、配列番号１１の核酸配列を含む操作された核酸ベクターが提供される。
本発明の制限のそれぞれは、本発明の様々な実施形態を包含し得る。そのため、任意の１つの要素または要素の組み合わせを伴う本発明の制限のそれぞれは、本発明の各態様に含まれ得ることが予測される。本発明は、その適用において、以下の説明で示されるまたは図面で例示される構成の詳細にも構成要素の配置にも限定されるものではない。本発明は、他の実施形態であることができ、様々な方法で実施または実行することができる。また、本明細書で使用される表現及び用語は、説明を目的としており、限定的なものとみなされるべきではない。本明細書における「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」または「ｈａｖｉｎｇ（有する）」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」、「ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ（伴う）」及びこれらの変形の使用は、その後に列挙される項目及びそれらの等価物ならびに追加の項目を包含することを意味する。
添付の図面は縮尺どおりに描いたというわけではない。図面において、様々な図に示されている各々の同一またはほぼ同一の構成要素は、類似の数字によって表されている。わかりやすくするため、あらゆる構成要素があらゆる図面において標識されているとは限らない。以下の図面である。
野生型Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２株におけるプリン及びピリミジンの生合成（Ａ）を示し、ＰｒｓＡ＊のゲノム由来の過剰発現及びｐｕｒＲノックアウトによる株４からのプリン合成への炭素フラックスの増加を示す（Ｂ）。 遺伝子ノックアウトをＥ．ｃｏｌｉに導入するために使用される例示的なポジティブ選択及びネガティブ選択処理を示す。 株２、株３及び株４からそれらの親株である株１までの系統を示す。 株１から調製された様々なプラスミドのスーパーコイルモノマーの割合を示すグラフである。 株１／プラスミド１（配列番号１９）を含有する振盪フラスコ培養物及びｙ軸上に示された遺伝子を担持する単一コピープラスミドから得られたプラスミド収量（Ａ）を示す。 株１／プラスミド１（配列番号１９）を含有する振盪フラスコ培養物及びｙ軸上に示された遺伝子を担持する単一コピープラスミドから得られたプラスミ培養密度（Ｂ）を示す。 株１／プラスミド１（配列番号１９）を含有する振盪フラスコ培養物及びｙ軸上に示された遺伝子を担持する単一コピープラスミドから得られたＣｔ差分値（Ｃ）を示す。 ｐｒｓＡ＊の発現のための単一コピープラスミドを保有する株１におけるＰＬ－００７９４８のプラスミドコピー数を示す。 振盪フラスコ中の１６時間でのプラスミド１（配列番号１９）を保有する株３及び株１のプラスミド収量（Ａ）を示す。 振盪フラスコ中の１６時間でのプラスミド１（配列番号１９）を保有する株３及び株１の培養密度（Ｂ）を示す。 ＰＬ－００７９４８を保有する株１、株３及び株４から得られた光学密度（Ａ）を示す。 ＰＬ－００７９４８を保有する株１、株３及び株４から得られたプラスミドＤＮＡ収量（Ｂ）を示す。 Ａｍｂｒ２５０系の株３及び株１によって生産されたプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を示す。Ａは、ｐＤＮＡ蓄積の動態プロファイルを示す。 Ａｍｂｒ２５０系の株３及び株１によって生産されたプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を示す。Ｂは、２２時間ＥＦＴで株３及び株１によって生産されたｐＤＮＡの統計分析を示す。 経時的な株３及び株１の比生産性を示す。 Ａｍｂｒ２５０系の株４及び株１によるｐＤＮＡ生産を示す。Ａは、ｐＤＮＡ蓄積の動態プロファイルを示す。Ｂは、２２時間ＥＦＴで株１及び株４によって生産されたｐＤＮＡの統計分析を示す。 経時的な株１及び株４の比生産性を示す。 長期ｐＤＮＡ安定性実験のプロセス図を示す。図は、２つの異なるプラスミドを保有する株を増殖させ、数日間新鮮な培地に継代し（Ａ）、続いてポリＡテールサンガーシークエンシングしたことを示す。 長期ｐＤＮＡ安定性実験のプロセス図を示す図は、ＮＥＢ株（市販の株と同様の株）、示したプラスミドを保有する株１及び株４の総世代数（Ｂ）を示す 長期ｐＤＮＡ安定性実験のプロセス図を示す。図は、ＭＣＢバイアルから３０リットルまたは３００リットルスケールの発酵スケールまで、株が受けると予想される世代数（＃）をモデル化したプロセスフローダイアグラムを示す。「ＭＣＢ」－マスター細胞バンク、「ＷＣＢ」－ワーキング細胞バンク（Ｃ）。 示されたプラスミドを保有する株１及び株４の増殖プロファイルを示す。 プラスミド１を保有する株１及び株４の経時的なプラスミドＤＮＡ生産を示すグラフを示す。 プラスミド１及びプラスミド２を構築するために行われた改変を伴うプラスミドマップを示す。 様々なプラスミドを使用して株１で得られたプラスミド収量（Ａ）を示す。 様々なプラスミドを使用して株１で得られた１６時間での最終培養光学密度（Ｂ）を示す。 改変９（配列番号１０、Ｏｒｉ１０）及び改変１０（配列番号１１，Ｏｒｉ１１）のプラスミド生産データを示す。Ａは、親プラスミド（配列番号１６）に対するプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の増加ミリグラム／リットル（ｍｇ／ｌ）を示す。対照プラスミドに基づく（ＰＬ＿００７９８４）。Ｂは、湿細胞重量１グラムあたり（ｇＷＣＷ）のｐＤＮＡのｍｇによって測定される、改善された全体的な生産性を示す
Ｅ．ｃｏｌｉは、プラスミドＤＮＡ生産の宿主として長年使用されてきた。クローニング、プラスミドＤＮＡ生産及びタンパク質の発現を含む多くの様々な目的のためにいくつかの異なる株が作成されている。最も一般的には、ＤＨ５α、ＪＭ１０８、ＤＨ１０βなどのＥ．ｃｏｌｉＫ１２誘導体が、プラスミドＤＮＡのクローニング及び生産のために使用されている。これらは主に、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼならびに株のＤＮＡの安定性、純度及びクローニング効率を低下させる他の酵素をコードする遺伝子の不活性化をもたらす。
そのうえ、Ｅ．ｃｏｌｉは、他の生物の中でも、大量に有することが望ましい場合がある（例えば、ヌクレオチド）、他の産物の発現を制限または調節する調節経路を保有している。したがって、これらの経路を制御する遺伝子が活性化されている間、所望の産物を生産するＥ．ｃｏｌｉの効率を高めることは困難である。
プラスミドＤＮＡ生産を大幅に改善する株及びベクター工学の多くの開発が提供される。改善には、過剰発現した場合により高いプラスミドＤＮＡ収量をもたらすＥ．ｃｏｌｉ中の酵素（ＰｒｓＡ）の同定及び操作が含まれる。下流の代謝産物によるフィードバック抑制を大幅に破壊するこの酵素のバリアントが開発され、宿主細胞に組み込まれてきた。宿主では、バリアント酵素は、細胞のＤＮＡ生合成経路を介して炭素を動態化できる。他の工学的開発には、ゲノムからのＤＮＡ合成経路のリプレッサー、ＰｕｒＲのノックアウトが含まれる。本明細書に記載の操作された改善を組み込んだＥ．ｃｏｌｉ株は、収量が著しく向上し、例えばプラスミド収量の２倍を超える増加が観察され、かなり有意な改善である。
Ｅ．ｃｏｌｉは様々な方法で使用されてきたが、特定の用途での使用に関しては依然として制限があり、場合によっては望まれている多くのことが放置されている場合がある。本明細書に記載の改善した株は、先行技術の株よりも著しい利点を提供する。本明細書に開示される株は、例えば、欠失もしくは突然変異したＥｃｏＫＩ制限系、ｅｎｄＡ欠失（ΔｅｎｄＡ、精製中にプラスミドＤＮＡを分解することができるエンドヌクレアーゼ）、ｒｅｃＡ欠失（ΔｒｅｃＡ、ＤＮＡ及びポリＡテールの不安定性の原因であるリコンビナーゼ）、ＰｒｓＡ酵素の追加、ｐｕｒＲ（ヌクレオチド生合成経路の転写リプレッサーをコードする）の欠失、及び／またはｍｒｒ、ｈｓｄＲ、ｈｓｄＭ、ｈｓｄＳ、ｓｙｍＥ及びｍｃｒＢＣのうちの１つ以上の欠失を含む操作された構成成分の様々な組み合わせを含む。
また、プラスミドＤＮＡ生産のための強化された方法、ならびにそれらの方法に関与するツール及び組成物も提供される。株１と称される第１世代のカスタムＥ．ｃｏｌｉ株には、２つの遺伝子欠失：ΔｅｎｄＡ（精製中にプラスミドＤＮＡを分解できるエンドヌクレアーゼ）及びΔｒｅｃＡ（ＤＮＡ及びポリＡテール不安定性の主な原因であるリコンビナーゼ）が含まれている。この株は、本明細書において株２と称される新しい株を生産するために、ＥｃｏＫＩ制限系を除去するために更に操作された。
天然のＥ．ｃｏｌｉは、ＥｃｏＫＩ制限系を保有している。ＥｃｏＫＩは、非メチル化外来ＤＮＡの識別及び制限、ならびに自己識別のためのメチル化による天然ヘミメチル化ＤＮＡの修飾を担う制限修飾酵素複合体である。そのままにしておくと、ＥｃｏＫＩ系は非メチル化ＤＮＡを異物として認識し、ＤＮＡが独自のＥｃｏＫＩ認識部位も保有している場合はそれを分解する。プラスミドＤＮＡをクローニングするためにＥ．ｃｏｌｉからのＥｃｏＫＩ系を不活性化することは必須ではないが、所望のプラスミドＤＮＡがＥｃｏＫＩ認識部位を保有している場合、欠失によってクローニング及び形質転換の効率が著しく向上する。
したがって、一態様において、本開示は、少なくとも以下の遺伝子欠失：ｅｎｄＡ及びｒｅｃＡを有するＥ．ｃｏｌｉゲノムを含むＥ．ｃｏｌｉの組換え株に関する。ｅｎｄＡ遺伝子は、発現すると二本鎖切断活性を誘導することができる、エンドヌクレアーゼ１タンパク質をコードする。この活性は、遺伝子を保有するＥ．ｃｏｌｉによるプラスミドＤＮＡの生産物を分解し、さもなければ損なう可能性がある。ｒｅｃＡ遺伝子は、ＤＮＡの修復及び維持に関連するｒｅｃＡタンパク質をコードする。ただし、ｒｅｃＡは、ＤＮＡ修復を促進するというその特性を通じて、ＤＮＡの相同組換え、ならびに相同ペアリング、相同組換え、ＤＮＡ切断修復及びＳＯＳ応答を媒介する役割を果たし、ＤＮＡ損傷は、細胞周期がＤＮＡ修復及び突然変異誘発の開始を阻止することを誘発する。ｅｎｄＡ及びｒｅｃＡの両方の特性は、一貫しかつ同一のＤＮＡプラスミドの生産物には有益ではない。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉの組換え株は、ｅｎｄＡ及びｒｅｃＡが欠失したＥ．ｃｏｌｉゲノムを含む。
いくつかの態様において、本開示は、Ｅ．ｃｏｌｉの組換え株に関し、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは更に、プリン生合成酵素をコードする外因性ＤＮＡを含む。外因性ＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉゲノム内に組み込まれている。変異プリン生合成酵素をコードするｐｒｓＡ＊発現カセットを株２または株１のゲノム内に組み込むことは、プラスミドＤＮＡ収量の大幅な増加を提供する。株２から設計され、ｐｒｓＡ＊を付加する株は、株３と称される。株３は、ヌクレオチド生合成経路の転写リプレッサーをコードするｐｕｒＲをノックアウトすることによって更に改変され得る。本明細書において株４と称されるこの株は、更なる機能強化を有することができる。株４を、株１及び株３と共にプラスミドＤＮＡ生産性について試験した場合、株１、株３及び株４のそれぞれは、元のＥ．ｃｏｌｉ株よりも高い改善されたプラスミドＤＮＡ収量を示した（図８のＡを参照）。試験した３つの株のうち、株１は、株４よりも低い収量を示した株３よりも低い収量を示した。ポリＡテールの安定性はまた、形質転換後で及び何世代にもわたる増殖で株４において改善されることもわかった（例えば、表４を参照。これは、株４は、市販の株（対照）及び株１と比較して、形質転換後のポリＡテールの安定性を改善したことを示している）。
いくつかの実施形態において、本発明は、ホスホリボシルピロリン酸シンテターゼタンパク質（ｐｒｓＡ）をコードする遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ株を包含する。他の実施形態において、本発明は、ホスホリボシルピロリン酸シンテターゼタンパク質（ｐｒｓＡ＊）バリアントをコードする遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ株を包含する。Ｅ．ｃｏｌｉ株は、ｐｒｓＡバリアントを含み得る。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、ｐｒｓＡ及びｐｒｓＡバリアントを含み得る。ＰＲＰＰ（ホスホリボシルピロリン酸）は、遺伝子ｐｒｓＡによってコードされる酵素ホスホリボシルピロリン酸シンテターゼによりリボース５－リン酸及び１つのＡＴＰから形成されるペントースリン酸である。ホスホリボシルピロリン酸シンテターゼの生成は、プリン、ピリミジン及びニコチンアミドヌクレオチドの生合成、ならびにヒスチジン及びトリプトファンの生合成における初期ステップである。
ｐｒｓＡバリアントは、天然に存在する酵素ホスホリボシルピロリン酸シンテターゼとは少なくとも１つのアミノ酸の違いがある酵素ホスホリボシルピロリン酸シンテターゼのバリアントをコードする核酸のことを指す。好ましくは、ｐｒｓＡバリアントは、ＤＮＡ生合成経路の下流の代謝産物による負のフィードバック調節に耐性がある。負のフィードバック調節に対する耐性は、エネルギーを節約するために経路がシャットダウンされるのを防ぎ、核酸合成の処理を促進させる。
いくつかの実施形態において、ｐｒｓＡバリアントは、ｐｒｓＡに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、ｐｒｓＡバリアントは、ｐｒｓＡに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｐｒｓＡバリアントは、ｐｒｓＡに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むが、少なくとも１つのヌクレオチドの相違、すなわち欠失、挿入または置換を含む。いくつかの実施形態において、ｐｒｓＡバリアントは、ｐｒｓＡ＊（配列番号２３）を含む。いくつかの実施形態において、ｐｒｓＡバリアントは、ｐｒｓＡ＊（配列番号２３）である。ｐｒｓＡ＊はまた、ｐｒｓＡ＿Ｄ１２８Ａとも称される。他の実施形態において、ｐｒｓＡバリアントは、配列番号２３に対して少なくとも７０％の同一性（例えば、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％の同一性）を有する核酸配列を含む。
２つの配列（例えば、核酸またはアミノ酸）の「パーセントの同一性」、「配列同一性」、「％の同一性」または「％の配列同一性」（本明細書では同じように使用され得る）は、２つの配列（例えば、核酸またはアミノ酸）間の類似性の定量的測定のことを指す。パーセントの同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３－７７，１９９３のように修正したＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４－６８，１９９０のアルゴリズムを使用して決定することができる。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施し、目的のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２，１９９７に記載のようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用できる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）を使用してもよい。パーセントの同一性またはその範囲（例えば、少なくとも、より多いなど）が記載されている場合、特に明記しない限り、エンドポイントは包括的であり、範囲（例えば、少なくとも７０％の同一性）は、引用された範囲内のすべての範囲を含むものとする。
いくつかの実施形態は、機能的リプレッサー遺伝子ｐｕｒＲを欠くゲノムを含むＥ．ｃｏｌｉ株を包含する。フィードバックインヒビター／リプレッサーｐｕｒＲの影響を軽減するためのＥ．ｃｏｌｉ株の遺伝子改変は、本明細書に開示される系においてプラスミドＤＮＡ合成を更に促進するために有用であり得る。いくつかの実施形態において、ｐｕｒＲ遺伝子は、フレームシフト変異を引き起こすか、または遺伝子をノックアウトすることによってＥ．ｃｏｌｉで破壊される。遺伝子機能の破壊は、ｐｕｒＲ遺伝子による機能的酵素ｐｕｒＲの正常なコード化が改変され、微生物における機能的酵素の生産が低減されるかまたは排除されるように実現され得る。破壊には、遺伝子の欠失、ならびにこれらに限定されないがｍＲＮＡ転写レベル及び／または安定性に影響を及ぼす及びポリペプチドをコードする遺伝子の上流のプロモーターまたはリプレッサーを変更する遺伝子の改変（例えば、終止コドンの導入、フレームシフト変異、遺伝子の一部の導入または除去、分解シグナルの導入）が広く含まれる。いくつかの実施形態において、遺伝子破壊は、ＤＮＡ、ＤＮＡからコードされるｍＲＮＡ及び／または微生物のコードされた遺伝子の酵素機能の少なくとも５０％の低減をもたらすアミノ酸配列に対する任意の遺伝子改変を意味すると解釈される。いくつかの実施形態において、ｐｕｒＲは、野生型ｐｕｒＲを含む。いくつかの実施形態において、ｐｕｒＲは、野生型ｐｕｒＲに対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｐｕｒＲは、配列番号２５に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｐｕｒＲは、配列番号２５の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｐｕｒＲは、配列番号２５の配列を有する。
したがって、いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、ｐｒｓＡ＊などのｐｒｓＡバリアントを発現する及び／またはｐｕｒＲの発現は中断される。いくつかの実施形態において、両方のプラスミドは、ｐｒｓＡ＊を発現するか、またはｐｕｒＲをノックアウトすることができる。
いくつかの態様において、本開示は、遺伝子型：
｜＜ｒｅｐＡ１０１｜ｏｒｉ１０１＿ｔｓ｜＜ｒｅｃＡ｜＜ｂｌａ｜＜ｔｅｔＲ｜＜Ｐ（ｔｅｔＲ）｜Ｐ（ｔｅｔ）＞｜ｇａｍｍａ＞｜ｂｅｔａ＞｜ｅｘｏ＞｜６０ａ＞｜を含む組換えプラスミドに関する。
いくつかの実施形態において、組換えプラスミドは、配列番号２６に対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えプラスミドは、配列番号２６の核酸配列を含む。
いくつかの態様において、本開示は、プラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉの組換え株に関し、プラスミドは、遺伝子型｜＜ｒｅｐＡ１０１｜ｏｒｉ１０１＿ｔｓ｜＜ｒｅｃＡ｜＜ｂｌａ｜＜ｔｅｔＲ｜＜Ｐ（ｔｅｔＲ）｜Ｐ（ｔｅｔ）＞｜ｇａｍｍａ＞｜ｂｅｔａ＞｜ｅｘｏ＞｜６０ａ＞｜、配列番号２６と少なくとも７０％の同一性を有する核酸を有する。一態様において、本開示は、Ｅ．ｃｏｌｉの組換え株に関し、プラスミドは、遺伝子型｜＜ｒｅｐＡ１０１｜ｏｒｉ１０１＿ｔｓ｜＜ｒｅｃＡ｜＜ｂｌａ｜＜ｔｅｔＲ｜＜Ｐ（ｔｅｔＲ）｜Ｐ（ｔｅｔ）＞｜ｇａｍｍａ＞｜ｂｅｔａ＞｜ｅｘｏ＞｜６０ａ＞｜を含むプラスミドである。
株３及び株４の両方は、株１と比較してより高いプラスミドＤＮＡ収量を示すことがわかった。株３は、１６時間のＥＦＴ（経過発酵時間）後に株４よりも高いｐＤＮＡを生成した。株３の収量は、９５％の信頼区間で株１の収量よりも統計的に高かった。バイオマス１ｇあたりの生成されたｐＤＮＡとして計算された株４の比生産性（ｍｇ／Ｌ）は、株１よりも大幅に高いことがわかった。
いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは更に、ｍｒｒ、ｈｓｄＲ、ｈｓｄＭ、ｈｓｄＳ、ｓｙｍＥ及びｍｃｒＢＣを含む群から選択される少なくとも１つの遺伝子欠失を含む。
ｍｒｒ遺伝子は、特にアデニン及びシトシンメチル化ＤＮＡを制限する（すなわち、分解する）外来ＤＮＡの認識ならびに調節に関与するタンパク質ｍｒｒをコードする。ｈｓｄＲ遺伝子は、核酸（例えば、ＤＮＡ）のエンドヌクレアーゼ切断を生成し、末端５’－リン酸を有するランダムな二本鎖断片を付与するＩ型制限酵素ＥｃｏＫＩ Ｒタンパク質をコードし、ＡＴＰは同時に加水分解される。ｈｓｄＭ遺伝子は、Ｉ型制限酵素ＥｃｏＫＩ Ｍタンパク質をコードし、ｈｓｄＳ遺伝子は、Ｉ型制限酵素ＥｃｏＫＩ特異的（Ｓ）タンパク質をコードする。Ｍサブユニット及びＳサブユニットは、２分ＤＮＡ認識配列の相補鎖の２つのアデニン残基をメチル化する、メチルトランスフェラーゼ（ＭＴａｓｅ）を一緒に形成する。Ｒサブユニットの存在下で、複合体はまた、エンドヌクレアーゼとしても機能し、同じ標的配列に結合するが、この部位からいくらか離れたところでＤＮＡを切断する。ＤＮＡが切断されるかまたは修飾されるかは、標的配列のメチル化状態に依存する。標的部位が修飾されていない場合、ＤＮＡは切断される。標的部位がヘミメチル化されると、複合体は、両方の鎖がメチル化されるようにＤＮＡを修飾するメンテナンスＭＴａｓｅとして機能する（ＵｎｉＰｒｏｔ、ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ０５７１９）。ｓｙｍＥ遺伝子は、損傷したＲＮＡの分解と再利用に関与するタンパク質である、毒性タンパク質ＳｙｍＥをコードする。ＳｙｍＥタンパク質の過剰発現は、細胞にとって有毒であり得、コロニー形成能及びタンパク質合成に影響を及ぼす。ｍｃｒＢＣ遺伝子は、５－メチルシトシン特異的制限酵素ＭｃｒＢＣ、サブユニットＭｃｒＢをコードする。ＭｃｒＢは、一方または両方の鎖の５－メチルシトシンまたは５－ヒドロキシメチルシトシンを含むＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは更に、ｍｒｒ、ｈｓｄＲ、ｈｓｄＭ、ｈｓｄＳ、ｓｙｍＥ及びｍｃｒＢＣを含む群から選択される遺伝子欠失の少なくとも２つを含む。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは更に、ｍｒｒ、ｈｓｄＲ、ｈｓｄＭ、ｈｓｄＳ、ｓｙｍＥ及びｍｃｒＢＣを含む群から選択される遺伝子欠失の少なくとも３つを含む。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは更に、ｍｒｒ、ｈｓｄＲ、ｈｓｄＭ、ｈｓｄＳ、ｓｙｍＥ及びｍｃｒＢＣを含む群から選択される遺伝子欠失の少なくとも４つを含む。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは更に、ｍｒｒ、ｈｓｄＲ、ｈｓｄＭ、ｈｓｄＳ、ｓｙｍＥ及びｍｃｒＢＣを含む群から選択される遺伝子欠失の少なくとも５つを含む。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは更に、遺伝子欠失：ｍｒｒ、ｈｓｄＲ、ｈｓｄＭ、ｈｓｄＳ、ｓｙｍＥ及びｍｃｒＢＣを含む。
いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５または株１に由来する。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、Ｅ．ｃｏｌｉ株４に由来する（株４＞ΔｅｎｄＡ ΔｒｅｃＡ Δｍｒｒ－ｍｃｒ：：Ｐ（Ｊ２３１１９）＞ｐｒｓＡ＊ ΔｐｕｒＲ）。
いくつかの態様において、増強されたプラスミド生産のための固有の構造的及び機能的属性を有する操作された核酸ベクターが提供される。本明細書に記載の核酸ベクターは、要素の新規な組み合わせを使用して操作及び合成されている。１つ以上の設計改変を有する得られた核酸ベクターは、スーパーコイル生成物の収量が著しく増加していることがわかった。
プラスミドＤＮＡ生産のためのベクター工学における取り組みは、主にプラスミドＤＮＡのコピー数及びプラスミド高次コイル形成の増加に集中してきた。プラスミド構造に対するいくつかの改変の組み合わせが、プラスミドＤＮＡ収量及び品質の大幅なかつ予想外の向上をもたらすことが、本明細書において発見された。改変には、ＲＮＡＩＩの天然プロモーター（複製用のプライマー）を定常期誘導プロモーターで置換すること、プラスミドＤＮＡの複製を開始するために必要なＲＮＡＩＩ上の重要なステムループ、ＳＬ４の形成を引き起こす点変異を導入すること、及び／またはプラスミド骨格にプライモソーム集合部位を組み込むことの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、プラスミドの複製起点（図１６に示すプラスミドなど）に対するこれらの改変を使用して、新しい増強されたプラスミドが作製された。例示的な改変プラスミドには、プラスミド１（＋ＰＡＳ＋Ｐ（ｏｓｍＹ））及びプラスミド２（＋ＰＡＳ＋Ｐ（ｏｓｍＹ）＋ＳＬ４）が含まれる。プラスミド１には、定常期誘導プロモーター、Ｐ（ｏｓｍＹ）に置換されたＲＮＡＩＩの天然プロモーター（複製用プライマー）、及び骨格に挿入されたプライモソーム集合部位（ＰＡＳ）が含まれる。プラスミド２は、プラスミド１の改変を含み、ｐＤＮＡ複製の開始に必要なＲＮＡＩＩ上の重要なステムループ、ＳＬ４の形成を促進する４つの点変異の導入を更に追加する。これらのプラスミドを様々なアッセイで試験し、プラスミド１及びプラスミド２で得られたプラスミドＤＮＡ収量は、対照プラスミドであるプラスミド１（配列番号１９）と比較して著しく高いことがわかった（図１７のＡ及びＢ）。更に、ＰＡＳの導入により、高次コイル形成モノマーであるプラスミドＤＮＡの割合が大幅に増加することが示された（図４）。
ＲＮＡＩＩプロモーターは、プラスミドＤＮＡの複製を開始する。コピー数は、ＲＮＡＩＩ（プライマー）とＲＮＡＩ（インヒビター）の相対比率によって制御できる。ＲＮＡＩＩ発現の強度及びタイミングを微調整することで、Ｅ．ｃｏｌｉの過負荷を低減し、プラスミド収量を増加させることができると判断された。ＲＮＡＩＩプロモーターは、点変異による及びＲＮＡＩＩ発現用のプロモーターの追加を介するＲＮＡＩＩ発現を増加させるための様々な変更の対象とされた。ＲＮＡＩＩプロモーターを完全に除去し、定常期に増加されるＥ．ｃｏｌｉプロモーターに置き換える試みでは、多くが毒性であることが判明し、株は生存できなかった。非常に対照的に、Ｅ．ｃｏｌｉの天然ＲＮＡＩＩプロモーターを定常期プロモーターであるＰ（ｏｓｍＹ）プロモーターに置き換えると、大幅な改善が見られた。ｏｓｍＹ転写産物の比率は、対数期に比べて定常期で約５０倍高かった。
いくつかの態様において、本発明は、機能的Ｐ（ｏｓｍＹ）プロモーターを含むプラスミドである。いくつかの実施形態において、プラスミドは、機能的ＲＮＡＩＩプロモーターを有さない。機能的Ｐ（ｏｓｍＹ）プロモーターは、配列番号２７に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｐ（ｏｓｍＹ）プロモーターは、配列番号２７である。他の実施形態において、Ｐ（ｏｓｍＹ）プロモーターは、配列番号２７に対して少なくとも７０％の同一性（例えば、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％の同一性）を有する核酸配列を含む。
更に、ステムループ４（ＳＬ４）変異は、ＲＮＡＩ抑制を阻止するために行われている。ＳＬ４変異は、ＳＬ４形成の速度を増加させることができ、したがって複製速度が増加する。
ポリＡテールの存在は、プラスミド高次コイル形成及び異性体分布に大きな影響を及ぼす。高次コイル形成の喪失は、ＰＡＳをプラスミドに組み込むことで相殺できることがわかった。ＰＡＳを追加すると、高次コイル形成モノマーの割合が大幅に増加し、収量はわずかに改善された。
本明細書に開示された新規の株を既存のベクター骨格で評価することに加えて、２つの株、株１及び株４を、最適に操作されたベクターであるプラスミド１で分析した。プラスミド１ベクターで、株１及び株４の両方の株は同程度の量のプラスミドＤＮＡを生産し、これは、基本ベクターによって生産されたプラスミドＤＮＡよりも２倍高かった（図１５）。
「核酸」は、互いに共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドであり、場合によっては、ホスホジエステル結合（例えば、ホスホジエステル「骨格」）を含み得る。本明細書で使用する場合、「核酸配列」及び「ポリヌクレオチド」という用語は同じように使用され、長さの制限を意味するものではない。本明細書で使用する場合、「核酸」及び「ヌクレオチド」という用語は、同じように使用される。「核酸配列」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）及びＲＮＡ配列を包含する。本発明の核酸配列は、それらの天然に存在する環境から除去された核酸配列、組換えまたはクローン化ＤＮＡ単離物、及び化学的に合成された類似体または異種系によって生物学的に合成された類似体を含む。
「操作された核酸」は、天然には存在しない核酸である。しかしながら、操作された核酸は全体として天然に存在しないが、天然に存在するヌクレオチド配列を含み得ることを理解すべきである。いくつかの実施形態において、操作された核酸は、異なる生物からの（例えば、異なる種からの）ヌクレオチド配列を含む。例えば、いくつかの実施形態において、操作された核酸は、細菌のヌクレオチド配列、ヒトのヌクレオチド配列及び／またはウイルスのヌクレオチド配列を含む。操作された核酸には、組換え核酸及び合成核酸が含まれる。「組換え核酸」は、核酸（例えば、単離核酸、合成核酸またはこれらの組み合わせ）を結合することによって構築され、いくつかの実施形態において、生細胞内で複製できる分子である。「合成核酸」は、増幅されたか、または化学的にもしくは他の手段によって合成された分子である。合成核酸には、化学的に修飾されたか、または別の方法で修飾されたものが含まれるが、天然に存在する核酸分子と塩基対を形成することができる。組換え核酸及び合成核酸にはまた、前述のいずれかの複製から生じる分子も含まれる。核酸は、天然に存在するヌクレオチド及び／または修飾ヌクレオチドなどの天然に存在しないヌクレオチドを含み得る。
本開示の操作された核酸は、分子生物学的方法を使用して生産され得る。いくつかの実施形態において、操作された核酸は、ＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）クローニングを使用して生産される（例えば、Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３４３－３４５，２００９及びＧｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，９０１－９０３，２０１０を参照）。ＧＩＢＳＯＮ ＡＳＳＥＭＢＬＹ（登録商標）は通常、単一管反応で３つの酵素活性：５’エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼの３’伸長活性及びＤＮＡリガーゼ活性を使用する。５’エキソヌクレアーゼ活性は５’末端配列をチューバック（ｃｈｅｗ ｂａｃｋ）し、アニーリングのために相補配列を露出させる。ポリメラーゼ活性は、アニーリングされた領域のギャップを埋める。次に、ＤＮＡリガーゼがニックを封止し、ＤＮＡ断片を共有結合させる。隣接する断片のオーバーラップする配列は、ゴールデンゲートアセンブリで使用されるものよりもはるかに長いため、正しいアセンブリの割合が高くなる。
本発明の核酸ベクターはまた、存在するかまたは除去された１つ以上の終結配列を有し得る。終結配列は、発現カセットまたは転写領域の終わりをシグナル伝達する核酸配列である。有効な転写ベクターは、通常、１つ以上の終結配列を含む。終結配列には、例えば、Ｔ７終結配列及びＴ４終結配列が含まれる。
本発明の好ましいベクターはまた、１つ以上の耐性マーカー、または特定のベクターに固有のマーカーを有し得る。例えば、ベクターは元々アンピシリン耐性マーカーを有していた可能性がある。本発明のいくつかの好ましい実施形態において、アンピシリンマーカーは、カナマイシン耐性マーカーなどの異なるマーカーで置き換えられる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥ．ｃｏｌｉゲノムは更に、第１の環境因子に基づくポジティブ選択マーカーまたは第２の環境因子に基づくネガティブ選択マーカーの遺伝子を発現し得、第１の環境因子及び第２の環境因子は同じではない。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＥ．ｃｏｌｉゲノムは更に、第１の環境因子に基づくポジティブ選択マーカー、及び第２の環境因子に基づくネガティブ選択マーカーの遺伝子を発現し得、第１の環境遺伝子及び第２の環境因子は同じではない。いくつかの実施形態において、ポジティブ選択マーカーは、カナマイシン耐性を付与することができる遺伝子である。いくつかの実施形態において、ネガティブ選択マーカーは、レバンスクラーゼを発現することができる。
本明細書に開示されるベクターはまた、任意の病原体由来の配列が除去されていてもよい。病原体由来配列を除去することで、生産物収量にプラスの効果をもたらすことができる。
複製起点（ｏｒｉ）は、核酸に含めることができ、本明細書に開示するように改変することができる。核酸は、いくつかの実施形態において、いくつかのｏｒｉ、例えば２つのｏｒｉを含み得る。それは、例えば、コピー数の少ないｏｒｉと温度依存性ｏｒｉとの組み合わせ、または例えば、様々な宿主生物での増殖を可能にするｏｒｉであり得る。
いくつかの実施形態において、プラスミドは操作された核酸ベクターを含む。いくつかの実施形態において、プラスミドが複製される。いくつかの実施形態において、プラスミドはプラスミド１（配列番号１９）を含む。いくつかの実施形態において、プラスミドは、配列番号１９に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、プラスミドは複製起点（ｏｒｉ）を含む。いくつかの実施形態において、プラスミドは、配列番号１６に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含むｏｒｉを含む。いくつかの実施形態において、プラスミドは、配列番号１６の配列を含むｏｒｉを含む。いくつかの実施形態において、ｏｒｉは、少なくとも１つの突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ｏｒｉ変異は、以下のｏｒｉ１～ｏｒｉ１６のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、ｏｒｉは、配列番号１～１５のいずれか１つに対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｏｒｉは、配列番号１０に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｏｒｉは、配列番号１１に対して少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｏｒｉは、配列番号１～１５のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態において、ｏｒｉは、配列番号１０の配列を含む。いくつかの実施形態において、ｏｒｉは、配列番号１１の配列を含む。
核酸はまた、他のベクターからの１つ以上の要素を含み得る。例えば、他のベクターには、ファージ、コスミド、ファスミド、フォスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、ウイルス及びレトロウイルス（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病、バキュロウイルス）及びこれらに由来するベクターが含まれる。他の実施形態において、本明細書に記載の核酸は、任意の１つ以上の他のベクターからの任意の要素を含まない。
核酸配列に適用される場合、本発明の文脈における「単離された」という用語は、ポリヌクレオチド配列がその天然の遺伝的環境から除去され、したがって、他の外来性のまたは望ましくないコード化配列を含まず（ただし、プロモーター及びターミネーターなどの天然に存在する５’及び３’非翻訳領域を含むことができる）、遺伝子操作されたタンパク質生産系内での使用に適した形になっていることを示す。そのような単離された分子は、その自然環境から分離された分子である。
したがって、いくつかの実施形態において、核酸ベクターは、配列番号２１の核酸配列を有する。他の実施形態において、本発明の核酸ベクターは、配列番号２２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８５％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９８％または９９％の配列同一性を有する核酸配列を有する。
核酸配列またはその断片は、他の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列（適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴う）されたときにヌクレオチド塩基の少なくとも約７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８５％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９８％または９９％にヌクレオチド配列同一性がある場合、参照配列に対して「実質的に相同」または「実質的に同一」である。核酸配列の配列同一性決定のための方法は、当技術分野で既知である。
「バリアント」核酸配列は、「バリアント」配列及び参照配列がストリンジェントな（例えば、高度にストリンジェントな）ハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成できる場合、参照配列（またはその断片）と実質的に相同（または実質的に同一）である。核酸配列ハイブリダイゼーションは、当業者であれば容易に理解するであろうように、塩基組成、相補鎖の長さ及びハイブリダイズする核酸間の塩基ミスマッチの数に加えて、塩濃度（例えばＮａＣｌ）、温度または有機溶媒などの条件によって影響を受ける。ストリンジェントな温度条件を採用することが好ましく、一般に、３０℃を超える温度、典型的には３７℃を超える温度、好ましくは４５℃を超える温度が含まれる。ストリンジェントな塩条件は、通常、１０００ｍＭ未満、典型的には５００ｍＭ未満、好ましくは２００ｍＭ未満である。ｐＨは通常、７．０と８．３の間である。パラメータの組み合わせは、任意の単一のパラメータよりも重要な場合であり得る。
２つの核酸配列を整列させるために利用できるアルゴリズムは多数ある。典型的には、１つの配列が参照配列として機能し、これと試験配列を比較し得る。配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数可）の配列同一性パーセントを算出する。比較のための核酸配列の整列化は、例えばコンピュータで実施されるアルゴリズム（例えば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡまたはＴＦＡＳＴＡ）、またはＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムによって行うことができる。
配列同一性比較では、同一性は、長さが少なくとも１０核酸残基である、例えば長さが少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０または６８５ヌクレオチドである、配列の領域にわたって、例えば参照配列の完全長まで存在し得る。
実質的に相同または実質的に同一の核酸は、１つ以上のヌクレオチド置換、欠失または付加を有する。多くの実施形態において、これらの変化は、例えば、翻訳中にコードされる同じアミノ酸、または異なるが保存的アミノ酸置換をもたらし得る保存的核酸置換のみを含む、マイナーな性質のものである。保存的アミノ酸置換は、以下の群：塩基性：アルギニン、リシン、ヒスチジン；酸性：グルタミン酸、アスパラギン酸；極性：グルタミン、アスパラギン；疎水性：ロイシン、イソロイシン、バリン；芳香族：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン；小：グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン；内の１つのアミノ酸を別のアミノ酸に置き換えることによって行われる置換である。実質的に相同な核酸はまた、翻訳産物の折り畳みまたは活性に著しく影響を及ぼさない他の置換を含むものも包含する。
本発明の核酸ベクターは、空のベクターであってもよい、または発現カセットもしくはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であり得る挿入物を含んでもよい。「オープンリーディングフレーム」とは、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧ））で始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）で終わるＤＮＡの連続した伸長であり、タンパク質またはペプチドをコードする。発現カセットは、少なくとも以下：５’非翻訳領域、ｍＲＮＡをコードするオープンリーディングフレーム領域、３’非翻訳領域及びポリＡテールの要素を含むＲＮＡをコードする。オープンリーディングフレームは、任意のｍＲＮＡをコードし得る。
「５’非翻訳領域（ＵＴＲ）」とは、タンパク質またはペプチドをコードしない開始コドン（すなわち、リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写産物の最初のコドン）からすぐ上流（すなわち５’）にあるｍＲＮＡの領域のことを指す。
「３’非翻訳領域（ＵＴＲ）」とは、タンパク質またはペプチドをコードしない終止コドン（すなわち、翻訳終了をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写産物のコドン）のからすぐ下流（すなわち３’）にあるｍＲＮＡの領域のことを指す。
「ポリＡテール」とは、複数の連続したアデノシン一リン酸を含む３’ＵＴＲの下流、例えば、すぐ下流（すなわち、３’）にあるｍＲＮＡの領域である。ポリＡテールは、１０～３００個のアデノシン一リン酸を含み得る。例えば、ポリＡテールは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００個のアデノシン一リン酸を含み得る。いくつかの実施形態において、ポリＡテールは、５０～２５０個のアデノシン一リン酸を含む。関連する生物学的環境（例えば、細胞内、ｉｎ ｖｉｖｏなど）において、ポリ（Ａ）テールは、（例えば、細胞質での）酵素分解からｍＲＮＡを保護し、転写終結、核からのｍＲＮＡの輸送及び翻訳で補助するように機能する。
当業者であれば、異なる種が「優先的なコドン使用」を示すことを理解する。本明細書で使用する場合、「優先的なコドン使用」という用語は、特定の種の細胞で最も頻繁に使用されるコドンのことを指し、したがって、各アミノ酸をコードする可能性のあるコドンの１つまたはいくつかの代表を支持する。例えば、アミノ酸スレオニン（Ｔｈｒ）は、ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧまたはＡＣＴによってコードされ得るが、哺乳動物宿主細胞ではＡＣＣが最も一般的に使用されるコドンである。他の種では、異なるＴｈｒコドンが優先され得る。特定の宿主細胞種に対する優先コドンは、当技術分野で既知の様々な方法によって、本発明のポリヌクレオチドに導入することができる。あるいは、好ましくないコドンが使用されてもよい。本発明のいくつかの実施形態において、核酸配列は、コドン最適化されている。
目的のポリヌクレオチドの「断片」は、前記完全長ポリヌクレオチドの配列からの一連の連続したヌクレオチドを含む。例として、目的のポリヌクレオチドの「断片」は、ポリヌクレオチドの配列からの少なくとも３０の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも３５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００の連続した前記ポリヌクレオチドの核酸残基）を含み得る（またはそれからなり得る）。
「核酸ベクター」は、少なくとも１つの外来または異種核酸断片を運ぶポリヌクレオチドである。核酸ベクターは、「分子担体」のように機能し得、核酸の断片、ポリヌクレオチドをそれぞれ宿主細胞に送達するか、またはＩＶＴの鋳型として機能し得る。本明細書で使用する場合、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）鋳型」とは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の生産のためのＩＶＴ反応での使用に適したデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のことを指す。いくつかの実施形態において、ＩＶＴ鋳型は、５’非翻訳領域をコードし、オープンリーディングフレームを含み、３’非翻訳領域及びポリＡテールをコードする。ＩＶＴ鋳型の特定のヌクレオチド配列組成及び長さは、鋳型によってコードされる目的のｍＲＮＡに依存する。
いくつかの実施形態において、本発明による核酸ベクターは、プラスミドなどの環状核酸である。他の実施形態において、それは、線状化核酸である。一実施形態によれば、核酸ベクターは、ベクターの線状化に使用できる所定の制限部位を含む。制限部位はベクター核酸が開かれる／線状化される場所を決定するため、線状化制限部位のインテリジェントな配置は重要である。線状化のために選択された制限酵素は、ベクターの重要な構成要素内を切断しないことが好ましい。
５’及び３’という用語は、遺伝子要素の位置及び／または例えば、ＲＮＡポリメラーゼによる転写、もしくは５’から３’の方向に進行するリボソームによる翻訳などに事象の方向（５’から３’）のいずれかに関連する核酸配列の特徴を記述するために本明細書では使用される。同義語は、上流（５’）及び下流（３’）である。従来、ＤＮＡ配列、遺伝子地図、ベクターカード及びＲＮＡ配列は、左から右へ５’から３’で描かれるか、または５’から３’方向が矢印で示され、矢印は３’方向を指している。したがって、この慣習に従った場合、５’（上流）は左手側に向かって配置された遺伝要素を示し、３’（下流）は右手側に向かって配置された遺伝要素を示す。
実施例１：宿主株の改変はプラスミド生産を変える
序論：
目的と意義
Ｅ．ｃｏｌｉは、クローニング目的及びプラスミドＤＮＡ生産に使用されてきた微生物である。高収量で、特に大規模でプラスミドを生産する株も貴重である。様々な代謝工学技術を用いてＥ．ｃｏｌｉのプラスミドＤＮＡ収量を増加させる方法が、本明細書に開示される。場合によっては、内因性ＤＮＡ制限系であるＥｃｏＫＩが除去され、非メチル化プラスミドのクローニング効率が向上した。
プラスミドＤＮＡをクローニングするための現在市販されているＥ．ｃｏｌｉ株
ＤＨ５α、ＪＭ１０８、ＤＨ１０βなどを使用したＥ．ｃｏｌｉＫ１２誘導体は、プラスミドＤＮＡのクローニング及び生産で使用されてきた。これらは主に、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼならびに株のＤＮＡの安定性、純度及びクローニング効率を低下させる他の酵素をコードする遺伝子の不活性化をもたらす。ここでは、真核もしくは非メチル化ＤＮＡのクローニングを可能にするＥｃｏＫＩ制限系のすべてまたは一部の不活性化が示されている。そのままにしておくと、ＥｃｏＫＩ系は非メチル化ＤＮＡを異物として認識し、ＤＮＡが独自のＥｃｏＫＩ認識部位も保有している場合はそれを分解する。プラスミドＤＮＡをクローニングするためにＥ．ｃｏｌｉからのＥｃｏＫＩ系を不活性化することは必須ではないが、所望のプラスミドＤＮＡがＥｃｏＫＩ認識部位を保有している場合、それによってクローニング及び形質転換の効率が著しく向上する（表１）。
Figure 2023528484000002
経路を通るフラックスを増加させるためのＥ．ｃｏｌｉでのヌクレオチド生合成
ヌクレオチド生合成は、炭素、エネルギー及び酸化還元集約的なプロセスであり、そのため、細胞のヌクレオチド生合成経路の発現は、転写抑制によって厳密に制御され、更に、これらの経路のいくつかの重要な酵素は、下流の代謝産物及び／または細胞の低エネルギー状態を示す補因子によってアロステリックに調節される。簡単に説明すると、ピリミジン及びプリンは、ヌクレオチドの主要な構築ブロックとして機能する５－炭素前駆体、５－ホスホ－α－Ｄ－リボース１－二リン酸（ＰＲＰＰ）を使用して生成される。この代謝産物は、リボースリン酸ジホスホキナーゼ（ＰｒｓＡ）によって、ペントースリン酸経路の中間体であるＤ－リボース５－リン酸（Ｒ５Ｐ）から生成される。ＰＲＰＰの合成はエネルギー集約型のヌクレオチド生合成経路に炭素を関与させるため、細胞は、ｐｒｓＡ遺伝子の発現を制御することによって、及びＡＤＰによるアロステリック抑制によってＰｒｓＡ酵素の活性を調節することによって、このステップを厳密に調節する。Ｅ．ｃｏｌｉはまた、ピリミジン及びプリン生合成経路の重要な転写調節因子であるＰｕｒＲも保有しており、それ自体がプリン経路の産物であるイノシン及びグアニンによって調節されている。イノシン及び／またはグアニンの細胞内濃度が増加すると、代謝産物はＰｕｒＲ酵素と会合し、ＰｕｒＲの３２遺伝子のレギュロンのプロモーターへの結合を誘導して、ヌクレオチド生合成経路の発現を抑制する。実際、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムからｐｕｒＲ遺伝子がノックアウトされると、通常はＰｕｒＲによって抑制される遺伝子の転写が著しく増加する。プラスミドＤＮＡ生産性を向上させるためにＥ．ｃｏｌｉのヌクレオチド生合成経路を代謝操作した例は知られていない。
この作業で、Ｅ．ｃｏｌｉ株、株１が作成され、その後、プラスミドＤＮＡ収量（ｐＤＮＡ ｍｇ／バイオマスｍｇまたはプラスミドのコピー数）が更に改善され、ならびにそれぞれ、プリン及びピリミジン生合成経路の活性を増加させることにより及びＥｃｏＫＩ制限系を除去することによりクローニング効率が高くなった株１の子孫が作成された。
方法
Figure 2023528484000003
Figure 2023528484000004
 振盪フラスコ内のＥ．ｃｏｌｉ株のプラスミド収量の測定
Ｅ．ｃｏｌｉの各株は、データで指定されたようにプラスミドで形質転換された。培養物を、指定どおりコロニーまたはグリセロールストックからの５０ｍＭのＭＯＰＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ ｃａｔ＃Ｍ８４０５）及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシン（Ｔｅｋｎｏｖａ、ｃａｔ＃Ｋ２１２５）を含む６０ｍｌのＴＢアニマルフリー（ＴＢＡＦ）ブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ、ｃａｔ＃Ｔ７６６０）を含有する５００ｍｌの振盪フラスコ内でインキュベートし、３７℃にて３００ｒｐｍでインキュベートした。増殖は６００ｎｍでの吸光度を使用して測定し、プラスミド収量は、各培養物からの細胞ペレットのアルカリ溶解及びＵＰＬＣ分析によって得た。
Ａｍｂｒ２５０バイオリアクターでのＥ．ｃｏｌｉ株のプラスミド生産性の測定
種発酵：種発酵のために、培地は、ＴＢＡＦ培地１リットルあたり５０ｍｇ／ｍｌカナマイシンストック１ｍＬ及び１０％消泡剤２０４を１００μＬを添加して調製した。１２５ｍＬのバッフル付き振盪フラスコに、１８．７５ｍＬの種培地を無菌で添加し、グリセロールストックから解凍した種菌９４μＬを播種した。０．６～０．８のＯＤ６００に到達するまで（中間対数増殖を目標に）、種フラスコを撹拌インキュベーターで３７℃にて２５０ＲＰＭ（軌道直径１インチ）で４～５時間インキュベートした。この種培養物は、０．１％（ｖ／ｖ）菌種でＡＭＢＲ容器に播種するために転送された。
生産発酵：発酵の基礎培地は、１ｍｌ／Ｌの５０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを含んだＴＢＡＦだった。各ＡＭＢＲ容器に、この培地１６０ｍＬを無菌で添加し、１６ｍＬの５０％滅菌グリセロール（６０ｇ／Ｌグリセロールバッチ）及び１ｍＬの１０％滅菌消泡剤２０４でバッチ処理した。発酵中のｐＨは、１５％水酸化アンモニウム及び５０％（ｖ／ｖ）グリセロール（ｐＨスタット炭素源供給）を使用して７．３±０．１に維持した。発酵中、温度は３７±０．５℃に維持した。溶存酸素（ＤＯ）は、７００～３０００ＲＰＭの撹拌ランプを使用して３０％飽和に維持され、その後、２１～４０％の酸素濃縮を行った。気流は、発酵全体を通して１．０ＶＶＭで一定に維持された。１２時間のＥＦＴで、ＴＢＡＦ供給は２ｍｌ／時で開始された。プラスミドＤＮＡ測定（ミニプレップに続いてナノドロップを使用）、バイオマス測定（ＯＤ６００及びｇ／ｌ湿細胞重量（ＷＣＷ））及び残留代謝産物分析（グリセロール、アセテート、リン酸塩及びアンモニア）のために、各容器から一定時間ごとに試料を採取した。
製造用プラスミド（複数可）を保有するＥ．ｃｏｌｉ株のプラスミドコピー数の測定
プラスミドのコピー数（ＰＣＮ）は、以下のようなＴａｑＭａｎベース（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法を使用して、決定された。手短に言えば、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を遠沈させ、水に再懸濁し、希釈した（１０－１→１０－７）。希釈後、試料を９８℃で１０分間加熱して細胞を溶解させた後、酵素ミックス、プライマー及びプローブを含有するｑＰＣＲプレートに移した。ＰＣＮは、ΔΔＣｔ法（所定の希釈でのプラスミドＤＮＡ及びゲノムＤＮＡのＣｔ値の差）によって、及びプラスミドＤＮＡとＥ．ｃｏｌｉｇＤＮＡの標準曲線を使用して、プラスミド：ゲノムＤＮＡの相対比を計算することによって決定される。
ノックアウトカセットの構築
株操作作業用のノックアウトカセットには、ネガティブ選択のためのｓａｃＢ（酵素レバンスクラーゼをコードする）に加えて、カナマイシン耐性マーカー（ｋａｎ）をコードするＤＮＡカセットが含まれていた。このｋａｎ－ｓａｃＢノックアウトカセットをゲノムの正しい位置に組み込むことを可能にするために、ＰＣＲ（図２）及びヘラクレスＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｃａｔ＃６００６９７）を使用して、上流と下流の４５ｂｐの小さな相同領域をノックアウトカセットに付加した。ノックアウトカセットは、ｋａｎ－ｓａｃＢカセットを含む内部で生成されたプラスミド、プラスミド５から増幅された（図３）。
Ｅ．ｃｏｌｉの痕跡を残さないゲノム欠失の導入
遺伝子改変される株は、最初にプラスミド６で形質転換され（図３）、形質転換体は、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｃａｔ＃Ｌ１０９２）を含有するＬＢアニマルフリー（ＬＢＡＦ）寒天上に播種することによって選択された。次に、単一の形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢＡＦブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ ｃａｔ＃Ｌ８９００－０６）で３０℃にて１６時間培養し、続いて、この一晩培養した培養物３０μｌを、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｃａｔ＃Ｃ２１３５）を含む３ｍｌのＬＢＡＦブロスを含有する試験管内に移し、３０℃にて２５０ｒｐｍで２時間インキュベートした。２時間のインキュベーション後、λレッド系及びコドン最適化されたＥ．ｃｏｌｉｒｅｃＡをコードする遺伝子の発現を、１００ｎｇ／ｍｌのアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ、Ｆｉｓｈｅｒ＃ＡＣ２３３１３１０００）及び１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｃａｔ＃７０５２７－３）を使用してそれぞれ誘導した。更に２～３時間、３０℃にて振盪培養した後、ＯＤ６００が約０．６～１．０のとき、１ｍｌの培養物を回収して、０．１ｍｌのエレクトロコンピテント細胞を調製した。５０μｌのエレクトロコンピテント細胞を１μｇの精製ノックアウトカセットと混合し、１ｍｍギャップキュベットで１８００ボルトでエレクトロポレーションした。１ｍｌのＳＯＣ培地（ＮＥＢ ｃａｔ＃Ｂ９０２０Ｓ）で３０℃にて３００ｒｐｍで２時間、形質転換体をレスキューし、次いで、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンと１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン（Ｔｅｋｎｏｖａ、ｃａｔ＃Ｌ３８１９）を含むＬＢＡＦ寒天培地に播種し、３０℃にて一晩インキュベートした。次に、ＬｏｎｇＡｍｐ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、ｃａｔ＃Ｍ０２８７Ｌ）を使用したコロニーＰＣＲ（ｃＰＣＲ）を利用して、カナマイシン耐性遺伝子、ｋａｎに結合するユニバーサルプライマー、及びノックアウトの対象となる遺伝子の上流に結合する位置特異的プライマーを使用して、一次組込み体をスクリーニングした。ｃＰＣＲと並行して、同じクローンを、３５μｇ／ｍｌのカナマイシンと１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢＡＦ寒天及び６０ｇ／ｌのスクロース（Ｔｅｋｎｏｖａ、ｃａｔ＃Ｌ１１４３）を含むＬＢ寒天上にスポットした。これらのプレートを、３０℃で一晩インキュベートした。ｃＰＣＲによる一次組込み体の確認後、６０ｇ／ｌのスクロースを含むＬＢＡＦ寒天上にクローンがスポットされた「成長なし」表現型を視覚的にチェックすることにより、スクロース感受性を確認した。一次組込みクローンがｃＰＣＲによって確認され、スクロース感受性であることも確認されたら、ノックアウトカセットを、以下に説明する同様の方法を使用して除去した。
所定のノックアウトカセットを除去し、痕跡を残さない欠失を得るために、ＵＨＲ及びＤＨＲ領域のみを含む線形ｄｓＤＮＡ断片（「ポップアウトカセット」）をｇＢｌｏｃｋ（ＩＤＴ）及びプライマーから増幅させた。確認された一次組込み体は、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢＡＦブロスで３０℃にて１６時間培養し、続いて、この一晩培養した培養物３０ｕｌを、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む３ｍｌのＬＢＡＦブロスを含有する試験管に移し、３０℃にて２５０ｒｐｍで２時間インキュベートした。２時間のインキュベーション後、λレッド系及びコドン最適化されたＥ．ｃｏｌｉｒｅｃＡをコードする遺伝子の発現を、１００ｎｇ／ｍｌのａＴｃ及び１ｍＭのＩＰＴＧを使用してそれぞれ誘導した。更に２～３時間、３０℃にて振盪培養した後、ＯＤ６００が約０．６～１．０のとき、１ｍｌの培養物を回収して、０．１ｍｌ のエレクトロコンピテント細胞を調製した。５０μｌのエレクトロコンピテント細胞を１μｇの精製ポップアウトカセットと混合し、１ｍｍギャップキュベットで１８００ボルトでエレクトロポレーションした。１ｍｌのＳＯＣ培地で３０℃にて３００ｒｐｍで２時間、形質転換体をレスキューし、次いで、９ｍｌのＬＢＡＦブロスを含む１２５ｍｌの振盪フラスコに移した。次に、この希釈培養物を３０℃にて３００ｒｐｍで５～１６時間増殖させ、続いて、５０ｕｌの培養物を、スクロース（１０ｇ／ｌのソイトン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ＃２４３６２０））、５ｇ／ｌの酵母抽出物（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ＤＦ２１０９２９）、６０ｇ／ｌのスクロース（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃Ｓ５－５００）を含む５ｍｌのＬＢＡＦ無塩ブロスを含有する試験管に移した。次に、希釈した培養物を、０．２ｕＭのフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃４３０７６９）でフィルター滅菌した。次に、このスクロース含有培養物を、３０℃にて２５０ｒｐｍで一晩（約１６時間）インキュベートし、無菌ＬＢＡＦブロスで１０－６希釈し、ＬＢＡＦ寒天培地に播種し（２００μｌ播種）、３７℃にて一晩インキュベートした。
単離されたコロニーがＬＢＡＦ寒天プレート上で得られたら、ｃＰＣＲとノックアウトされる遺伝子（複数可）の上流及び下流に結合するプライマーを使用して、クローンをスクリーニングし、ノックアウトカセット（ｋａｎ－ｓａｃＢ）の除去に成功した。並行して、クローンを、ＬＢＡＦ寒天上及び１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢＡＦ上に複製スポットした。これらのプレートを３０℃にて一晩（１６時間）インキュベートし、ゲノム編集に必要な温度感受性プラスミドであるプラスミド６が失われていることを確認した。株３の構築のために、ＵＨＲ＿Ｐ（Ｊ２３１１９）→ｐｒｓＡ＿Ｄ１２８Ａ＿ＤＨＲ（ＵＨＲ及びＤＨＲは、ｍｒｒ－ｈｓｄＲＭＳ－ｓｙｍＥ－ｍｃｒＢＣ遺伝子座に隣接する領域に特異的である）を含有する線形「ポップアウトカセット」を使用して、株５のｋａｎ－ｓａｃＢノックアウトカセットを同時に除去し、ｐｒｓＡ＿Ｄ１２８Ａ（ｐｒｓＡ＊）の恒常的発現を可能にした。
株４におけるポリＡテールの安定性の決定
形質転換後のポリＡテールの安定性を決定するために、５０μｌの株４または対照株の化学的コンピテント細胞を環状プラスミドであるプラスミド１及び２で形質転換した。１ｍｌのＳＯＣで３０℃にて３００ｒｐｍで１時間、形質転換体をレスキューし、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢＡＦ寒天に播種した。形質転換体ごとに９６コロニーを、５００ｕｌのＴＢＡＦ＋５０μｇ／ｍｌのカナマイシンに採取し、３７℃にて３００ｒｐｍで１６時間、増殖させた。プラスミドＤＮＡを単離し、ポリＡテールのサンガー配列決定のために発送した。次に、配列決定をＣＮＮ分析（社内で開発）を使用して分析し、ポリＡテールを保有している可能性が高いクローンの割合を定量化した。
何世代もの増殖にわたるポリＡテールの安定性を決定するために、株４、株１及びプラスミド２（配列番号２０）を保有する対照株をコロニーから採取し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５ｍｌのＴＢＡＦを含有する試験管に入れ、３７℃にて３００ｒｐｍで１６～２４時間インキュベートした。翌日、培養物をＯＤ６００についてサンプリングし、プラスミドＤＮＡを単離した。次に、各培養物１μｌを使用して、別のセットの５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢＡＦ入りの試験管を播種した。この工程を６日間繰り返した。各株からのプラスミドＤＮＡをミニプレップ（Ｑｉａｇｅｎ）によって単離し、ポリＡテールの配列決定のために各時点からの試料を送付した。ポリＡテールの長さはサンガー配列決定を使用して決定され、ＣＶスコア＜３０で５塩基以下である。
グリセロールストック及びコンピテント細胞バンクの作製
長期保存用のグリセロールストックを作成するために、株３及び株４をグリセロールストックからＬＢＡＦ寒天培地上に出し、３０℃で一晩インキュベートした。各株の１つのコロニーを、１リットルのバッフル付き振盪フラスコ中の３ｍｌのＴＢＡＦブロス内に播種し、３０℃にて２５０ｒｐｍで１６時間インキュベートした。翌日、１リットルのバッフル付き振盪フラスコ中の１００ｍｌのＴＢＡＦブロスをＯＤ６００＝０．０５まで播種し、ＯＤ６００約０．６になるまで３０℃にて２５０ｒｐｍで４～６時間インキュベートした。この目標ＯＤ６００で、滅菌した５０％グリセロール５０ｍｌを各培養物に加え、混合し、７００μｌを１ｍｌのＦｌｕｉｄＸ管に分注し、－８０℃で保存した。各ロットの１つの管を解凍し、希釈液をＬＢＡＦ寒天培地上に播種し、３０℃にて一晩インキュベートすることにより生存率を決定した。
コンピテント細胞バンクを作成するために、株３及び株４をグリセロールストックからＬＢＡＦ寒天培地上に出し、３０℃にて一晩インキュベートした。各株の１つのコロニーを、１リットルのバッフル付き振盪フラスコ中の１００ｍｌのアニマルフリーＳＯＢブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ、ｃａｔ＃Ｓ２６１５）内に播種し、１８℃にて２５０ｒｐｍで３０時間インキュベートした。目標ＯＤ６００約０．２が達成されたとき、細胞を回収し、洗浄し、滅菌ＦｌｕｉｄＸ管に分注した（管あたり５０μｌ）。
形質転換効率は、プラスミド１（配列番号１９）１０ｎｇを５０μｌのコンピテント細胞（ｎ＝２）内に４２℃で３０秒間、形質転換し、続いて４℃で２分間保持したときに得られた平均形質転換効率により決定した。０．９５ｍｌのＳＯＣを細胞に添加し、次いでバイアルを３０℃にて２５０ｒｐｍで１時間インキュベートした後、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢＡＦ寒天上に播種した。
培養純度は、各コンピテント細胞株、株３及び株４の７５μＬを１×トリプシンソイ寒天（ＴＳＡ）プレート上及び１×サブローデキストロース寒天（ＳＤＡ）プレート上の両方に広げ、ＴＳＡを３０℃で、ＳＤＡを２２℃で３～５日間インキュベートし、その後、微生物の任意の偶発的な増殖についてプレートを目視で検査することによって決定した。７６時間のインキュベーション後、すべてのプレートに目に見える汚染物質の増殖はなかった。
結果
株２、株３及び株４の構築
株１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ΔｅｎｄＡ ΔｒｅｃＡ）を親株として使用して、図３に示すように株２、株３及び株４を作成した。ゲノムに対するすべての必要な遺伝子改変は、方法のセクションに記載されているとおりに実行され、ＰＣＲによって確認した。すべての最終株は、カナマイシン感受性、カルベニシリン感受性及びスクロース非感受性であることが確認された。更に、新しい遺伝子型を確認するために作製されたＰＣＲ産物を、サンガー配列決定した。すべての株は、変更されたゲノム遺伝子座で正しい意図したＤＮＡ配列を有していることが確認された。
ＥｃｏＫＩ制限系を削除すると、形質転換効率が向上する－株２
野生型Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２株（株１の親など）は、独自のＥｃｏＫＩ制限部位（複数可）で非メチル化ＤＮＡを分解する天然の制限エンドヌクレアーゼ系（ＥｃｏＫＩ）を有している。株１のＥｃｏＫＩ制限系の除去に成功し、株２を得た。完了したら、３つのＥｃｏＫＩ部位が含まれているメチル化及び非メチル化プラスミドで株１ならび株２の形質転換を試みることによって、所望の表現型が得られたことを確認した。メチル化プラスミドの株１への形質転換は細菌の菌叢をもたらすが、同じ非メチル化プラスミドが株１に形質転換されると、コロニーは得られず、ＥｃｏＫＩ系が形質転換効率に対して深刻な悪影響を及ぼす可能性が示された。株１とは対照的に、ＥｃｏＫＩが除去されているため、株２は、メチル化プラスミドまたは非メチル化プラスミドのいずれでも同様の形質転換効率を示す。これにより、株２及びその子孫は、細胞バンキングワークフロー及び前臨床ＤＮＡなどのよりスループットの高いクローニングプラットフォームでの使用が可能になる。株２してのＰＶＵは、メチル化欠損宿主（対照株など）からのプラスミドＤＮＡ、またはｇＢｌｏｃｋもしくはＰＣＲ産物（非メチル化ＤＮＡ断片）を用いてクローン化したＤＮＡを受け入れることができる。
株１でのＰｒｓＡ＊の過剰発現は、振盪フラスコ中のプラスミド収量を増加させる
遺伝子標的は、プラスミドＤＮＡ収量の増加をもたらす過剰発現について同定された。それぞれが図５のＡ～Ｃに示されるように固有のコドン最適化遺伝子を担持している、単一コピーの過剰発現プラスミドのパネルは、プラスミド１（配列番号１９）を保有する株１を宿主として使用して試験し、試験した遺伝子のいずれかを合成的に過剰発現させ、代表的な製造用プラスミドのコピー数を増加させ得るかを決定した。図５のＡ～Ｃに示されるように、増殖及びプラスミドＤＮＡ収量が試験され、ｐｒｓＡ＊の過剰発現は、プラスミドＤＮＡ収量（図５のＡ～Ｃ）及びコピー数（図６）を著しく増加させた。このバリアント酵素は、ＡＤＰによるフィードバック抑制を除去する変異を保有し、そのため、プリン及びピリミジン合成の代謝産物であるＰＲＰＰを提供する重要なステップを調節解除する。このｐｒｓＡバリアントを安定して発現するプラスミドを含まない株を作成するために、株２の生産時に作成した株１Δ（ｍｒｒ－ｈｓｄＲＭＳ－ｓｙｍＥ－ｍｃｒＢＣ）：：ｋａｎ－ｓａｃＢ中間株を用いて、ＥｃｏＫＩ系の代わりに構成的発現カセットを組み込んだ。得られた株である株３は、ゲノムからｐｒｓＡ＊の構成的発現に置き換えたそのＥｃｏＫＩ制限をコードする遺伝子座を有する株１の子孫である。株１及びＮＥＢ安定型と比較した株３の増殖及びプラスミド生産性を、振盪フラスコでアッセイした。ｐｒｓＡ＊が単一コピープラスミドから発現された場合に観察されたものと同様に、プラスミドＤＮＡ収量は、その親である株１と比較して株３で著しく増加した（図７のＡ～Ｂ）。
ｐｕｒＲの不活性化及びｐｒｓＡ＊の過剰発現は、振盪フラスコでのプラスミド収量を更に改善する
株３から転写リプレッサーＰｕｒＲ（図１のＡ～Ｂ）を除去することによって、ヌクレオチド生合成のための酵素をコードする３２つの遺伝子の抑制を解除することが目的であった。ＰｕｒＲがグアニン及びヒポキサンチン（プリン合成経路の生成物）と結合したときに起こる構造変化は、酵素がそのレギュロンのプロモーターに結合するのを可能にし、転写抑制をもたらす。得られたｐｕｒＲを欠く株である株４は、ヌクレオチド合成に関して、その親株である株３よりも高い炭素フラックス能力を有する。株１、株３及び株４で行ったフラスコ実験は、最新の株についてより高いプラスミドＤＮＡ収量を実際に示した（図８のＡ～Ｂ）（株１＜株３＜株４）。試験したすべての株は良好に増殖し、同様の最終培養密度を生成した。
株３及び株４は、Ａｍｂｒ２５０バイオリアクターで株１と比較して、より高いプラスミドＤＮＡ収量を示す
図９のＡは、ｐＤＮＡ生産の動態プロファイルを示す。２２時間ＥＦＴで生産されたｐＤＮＡの統計分析を図９のＢに示す。図９のＢは、株３が９５％の信頼区間で統計的に株１よりも高いことを示している（２つの株は、統計値を比較するための対照ダネット検定を使用して比較された）。両方の株は、同等のバイオマスを生産した。したがって、株３について、バイオマス１グラムあたりの生産されたｐＤＮＡ（ｍｇ／Ｌ）として計算される比生産性（ＷＣＷｇ／Ｌとして測定）は、株１よりも高かった（最大約１．２×高い）（図１０）。株４及び株１のｐＤＮＡ生産性を比較した発酵結果（図１１のＡ～Ｂ）は、株４が、ＥＦＴ１６時間後のすべての時点で、株１より多くのｐＤＮＡを生産することを示した。株４及び株１の両方の株は、同等のバイオマスを生産した。したがって、バイオマス１グラムあたりの生産されたｐＤＮＡ（ｍｇ／Ｌ）として計算される株４の比生産性（ＷＣＷｇ／Ｌとして測定）は、株１よりも著しく高かった（最大約１．８×高い）（図１２）。要約すると、株３及び株４の両方は、Ａｍｂｒ２５０バイオリアクターで、親である株１に対して特異的プラスミドＤＮＡ生産性が著しく高いことを示し、最も生産性が高い株は株４であった（株１＜株３＜株４）。
株４は、環状プラスミドで形質転換した場合、ＮＥＢ安定型と比較して改善されたポリＡテール安定性を示す
株４が所望の長さの仕様（９５～１０５ｂｐ）内でポリＡテールを維持していることを確認するために、高品質のポリＡテールを含む２つの異なるプラスミドを株４及び比較としてＮＥＢ安定型に形質転換した。各形質転換から９６つのコロニーを増殖させた後、プラスミドＤＮＡ を単離し、ポリＡテールを配列決定した。この実験で作製されたサンガー配列決定データを分析するために、テール（長さと純度の仕様内にあるテール）を通過する可能性が高いクローンを決定するためのアルゴリズムが使用された。以下に示すように、株４から採取したクローンは、ＮＥＢ安定型と比較して、ポリＡテールを通過する可能性が著しく高かった。
Figure 2023528484000005
株４は、何世代もの増殖にわたってポリＡテールの安定性を維持する
形質転換後のポリＡテールの維持に加えて、株４の長期のポリＡ安定性は、ＮＥＢ安定型と比較して特徴付けられた。株４について、約６９世代後に、ポリＡテールの３～５塩基対の欠失が観察された（表５、図１３のＡ～Ｃ）。これらの結果は、ＮＥＢ安定型及び株１で歴史的に得られた結果と類似し、株４、株１及びＮＥＢ安定型に同等の長期テール安定性があることを示している。重要なことに、６９世代の増殖後にテールの不均一性は観察されなかった。３０リットルまたは３００Ｌの発酵スケールでの大規模ｐＤＮＡ生産プロセスにおける約５０世代の増殖（図１３のＣ）、これらのデータは、ｐＤＮＡ生産のための宿主としての株４の使用を支持する。
Figure 2023528484000006
大規模プラスミドＤＮＡのための株４の増殖プロファイル
示されたプラスミドを保有する株４及び株１を振盪フラスコ内に播種し、株１と比較してその増殖プロファイルを評価した。図１４に示すように、株４は、より長い増殖遅延を示したが、その差はわずかである。
株３及び株４のコンピテント細胞バンクの作製
株３及び株４は、ＬＢＡＦブロス中で無菌条件下にてコロニーから増殖させ、各株を９６つの１ｍｌのＦｌｕｉｄＸ管（１ロット）に充填し、保存した＠－８０℃。更に、方法のセクションで説明されているように、各株について多くの化学的コンピテント細胞が作成された。これらのロットは、マイトマイシンＣ誘導アッセイを使用してファージの存在についてＱＣ試験され、株の純度を確認するために試験された。ファージは検出されず、試験した各ロットの純度が確認された（表６）。得られた形質転換効率は使用に十分であり、株１を使用して得られたものと同等であった。
Figure 2023528484000007
結論
ハイスループットクローニングプロセスで使用するためのクローニング効率が向上し、プラスミドＤＮＡ収量が改善したＥ．ｃｏｌｉの新しい株が作成された。株１からＥｃｏＫＩ制限系が除去され、それによって、非メチル化ＤＮＡ（例えば、ｇＢｌｏｃｋ、ＰＣＲ産物及びＮＥＢ安定型から単離された環状プラスミド）による効率的な形質転換が可能になった。次に、ヌクレオチド生合成経路の増加をもたらす、いくつかの追加のゲノム改変が導入された。最終的な株である株４は、ＮＥＢ安定型から単離された非メチル化プラスミドＤＮＡ、または合成またはＰＣＲ遺伝子断片を使用したギブソンアセンブリ反応からのＤＮＡを容易に受け入れる。本明細書に示されるように、株４はまた、振盪フラスコ及び大規模ＧＭＰ発酵プロセスを模倣するＡｍｂｒ２５０バイオリアクターにおいて、親株である株１と比較して著しく高いプラスミドＤＮＡ生産性（１．８×～２×）を示す。株４の更なる特性評価はまた、株は、形質転換事象でＮＥＢ安定型と比較して改善されたポリＡテール安定性を示し、多くの世代の増殖にわたってポリＡテールの純度を維持することも示している。
実施例２：プラスミド複製機構への突然変異は、プラスミド生産及び複製効率に影響を及ぼす。
対照プラスミドＰＬ＿００７９８４（配列番号１９）のｐＵＣ複製起点（配列番号１６）にプラスミド力価を増加させる目的で変異を加えた。ｐＵＣ型の複製起点の操作されたセグメントは、二本鎖ＤＮＡ断片（ＩＤＴ ｇＢｌｏｃｋ）として合成された。親プラスミドをＢｓｓＨＩＩ及びＡｐａＬＩで消化し、ＧｉｂｓｏｎアセンブリによってｇＢｌｏｃｋｓをプラスミド内にクローン化した。新しいバリアントプラスミドは配列が確認された。作成及び試験された突然変異は、部分的なＲＮＡＩＩ／Ｉの特定の配列の導入によって作成され、本明細書では配列番号１～１５として示されている。
複製は、ｍｇ／リットルのｐＤＮＡとしてプラスミド生産の測定によって評価された。改変９（Ｏｒｉ１０、配列番号１０）は、ＲＮＡＩＩ転写領域の初期の欠失を含む。改変９及び改変１０（それぞれ配列番号１０～１１）は、力価の著しい増加を示した（それぞれ５６％／６０％増加、図１８のＡ）。改変９及び改変１０（それぞれ配列番号１０～１１）を含む株はまた、生産性の改善を示した。図１８のＢに示すように、改変９及び改変１０（それぞれ配列番号１０～１１）は、親プラスミド（プラスミド１、配列番号１９）より湿潤細胞重量１ｇあたりのｐＤＮＡの重量が大きかった。
Figure 2023528484000008
Figure 2023528484000009
Figure 2023528484000010
Figure 2023528484000011
Figure 2023528484000012
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Figure 2023528484000028
Figure 2023528484000029
Figure 2023528484000030
本明細書に引用されるすべての参考文献は、完全に参照により組み込まれている。このように、本発明の少なくとも１つの実施形態のいくつかの態様を説明してきたが、当業者には様々な変更、修正及び改良が容易に想起されることを理解されたい。そのような変更、修正及び改良は、本開示の一部であることが意図され、本発明の趣旨及び範囲内であることが意図されている。したがって、前述の説明及び図面は単なる例である。
他の実施形態
実施形態１．定常期誘導プロモーター及びプライモソーム集合部位（ＰＡＳ）を含む操作された核酸ベクター。
実施形態２．ＲＮＡＩＩ上に重要なステムループ、ＳＬ４の形成を引き起こす点変異を更に含む、実施形態１に記載の操作された核酸ベクター。
実施形態３．ＲＮＡＩＩの天然プロモーターは破壊されている、実施形態１または２に記載の操作された核酸ベクター。
実施形態４．ＲＮＡＩＩの天然プロモーターは欠失している、実施形態１または２に記載の操作された核酸ベクター。
実施形態５．前記定常期誘導プロモーターはＰ（ｏｓｍＹ）である、実施形態１または実施形態２～４のいずれか１つに記載の操作された核酸ベクター。
実施形態６．前記Ｐ（ｏｓｍＹ）は配列番号２７の配列を有する、実施形態５に記載の操作された核酸ベクター。
実施形態７．前記ＰＡＳは配列番号２８の配列を有する、実施形態１～６のいずれか１つに記載の操作された核酸ベクター。
実施形態８．前記ＳＬ４は配列番号２９の配列を有する、実施形態２または実施形態３～７のいずれか１つに記載の操作された核酸ベクター。
実施形態９．前記ベクターはプラスミド１（＋ＰＡＳ＋Ｐ（ｏｓｍＹ））である、実施形態８に記載の操作された核酸ベクター。
実施形態１０．前記ベクターはプラスミド２（＋ＰＡＳ＋Ｐ（ｏｓｍＹ）＋ＳＬ４）である、実施形態８または実施形態９に記載の操作された核酸ベクター。
実施形態１１．前記ベクターは、配列番号１９に対して少なくとも７０％の配列同一性の配列を有する、実施形態１に記載の操作された核酸ベクター。
実施形態１２．前記ベクターは、配列番号２０に対して少なくとも７０％の配列同一性の配列を有する、実施形態１に記載の操作された核酸ベクター。
実施形態１３．以下の５’から３’への配置：（ａ）複製起点、（ｂ）プロモーター、（ｃ）抗生物質耐性遺伝子を含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の操作された核酸ベクター。
実施形態１４．目的のｍＲＮＡをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を更に含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の操作された核酸ベクター。
実施形態１５．遺伝子型：｜＜ｒｅｐＡ｜ｏｒｉ＿ｔｓ｜＜ｒｅｃＡ｜＜ｂｌａ｜＜ｔｅｔＲ｜＜Ｐ（ｔｅｔＲ）｜Ｐ（ｔｅｔ）＞｜ｇａｍｍａ＞｜ｂｅｔａ＞｜ｅｘｏ＞｜ａ＞｜を含む、組換えプラスミド。
実施形態１６．配列番号１９に対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列を含む、組換えプラスミド。
実施形態１７．配列番号２０に対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列を含む、組換えプラスミド。
実施形態１８．実施形態１～１７のいずれか１つに記載の操作された核酸ベクターを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を実施する方法。
実施形態１９．ｐｒｓＡバリアントを含む核酸。
実施形態２０．前記核酸は、ｐｒｓＡ＊（配列番号２３）に対して７０％～９９％の配列同一性を有する、実施形態１９に記載の核酸。
実施形態２１．前記核酸は、ｐｒｓＡ＊（配列番号２３）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、実施形態１９に記載の核酸。
実施形態２２．前記核酸は、ｐｒｓＡ＊（配列番号２３）に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有する、実施形態１９に記載の核酸。
実施形態２３．前記核酸は、ｐｒｓＡ＊（配列番号２４）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする、実施形態１９に記載の核酸。
実施形態２４．前記核酸は、配列番号２３に対して１００％の配列同一性を有するか、または配列番号２４に対して１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする、実施形態１９に記載の核酸。
実施形態２５．ｐｒｓＡバリアントを含む遺伝子改変微生物であって、前記遺伝子改変微生物は、リプレッサー遺伝子ｐｕｒＲが破壊されているゲノムを有する、前記遺伝子改変微生物。
実施形態２６．前記ｐｒｓＡバリアントは、ｐｒｓＡに対して７０％～９９％の配列同一性を有する、実施形態２５に記載の遺伝子改変微生物。
実施形態２７．前記ｐｒｓＡバリアントは、ｐｒｓＡ＊（配列番号２３）に対して９０％の配列同一性を有する、実施形態２５に記載の遺伝子改変微生物。
実施形態２８．前記ｐｒｓＡバリアントは、配列番号２３の配列を含む、実施形態２５に記載の遺伝子改変微生物。
実施形態２９．前記ｐｕｒＲは欠失している、実施形態２５～２８のいずれか１つに記載の遺伝子改変微生物。
実施形態３０．前記ｐｕｒＲは、配列番号２５の配列を含む、実施形態２９に記載の遺伝子改変微生物。
実施形態３１．ＥｃｏＫＩ制限系はゲノムから欠失している、実施形態２５～３０のいずれか１つに記載の遺伝子改変微生物。
実施形態３２．ｅｎｄＡはゲノムから欠失している、実施形態２５～３１のいずれか１つに記載の遺伝子改変微生物。
実施形態３３．ｒｅｃＡはゲノムから欠失している、実施形態２５～３２のいずれか１つに記載の遺伝子改変微生物。
実施形態３４．前記遺伝子改変微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の組換え株である、実施形態２５～３３のいずれか１つに記載の遺伝子改変微生物。
実施形態３５．少なくとも以下の遺伝子欠失：ｅｎｄＡ（ΔｅｎｄＡ）及びｒｅｃＡ（ΔｒｅｃＡ）を有するＥ．ｃｏｌｉゲノムを含む、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の組換え株。
実施形態３６．前記Ｅ．ｃｏｌｉはＭＧ１６５５に由来する、実施形態３５に記載の組換え株。
実施形態３７．前記Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、ＭＧ１６５５に関して少なくとも以下の遺伝子欠失：ｅｎｄＡ（ΔｅｎｄＡ）及びｒｅｃＡ（ΔｒｅｃＡ）を含むＭＧ１６５５ゲノムの核酸配列を含む、実施形態３５または実施形態３６に記載の組換え株。
実施形態３８．前記Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、ＭＧ１６５５ゲノムと少なくとも９５％の配列同一性の核酸配列を含む、実施形態３５または実施形態３６～３７のいずれか１つに記載の組換え株。
実施形態３９．ＥｃｏＫＩ制限系は、前記Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムから欠失している、実施形態３５～３８のいずれか１つに記載の組換え株。
実施形態４０．前記Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、ＭＧ１６５５ゲノムと少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態３９に記載の組換え株。
実施形態４１．前記Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、前記Ｅ．ｃｏｌｉゲノムが前記ＭＧ１６５５ゲノムに関して前記ＥｃｏＫＩ制限系欠失を含むＭＧ１６５５ゲノムの核酸配列を含む、核酸配列を含む、実施形態３９または実施形態４０に記載の組換え株。
実施形態４２．前記Ｅ．ｃｏｌｉはｐｒｓＡバリアントを含む、実施形態３５～４１のいずれか１つに記載の組換え株。
実施形態４３．前記Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、ＭＧ１６５５ゲノムと少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態４２に記載の組換え株。
実施形態４４．前記Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、配列番号２３の核酸配列を含む、実施形態４３に記載の組換え株。
実施形態４５．ｐｕｒＲ配列は、前記Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムから欠失している、実施形態３５～４４のいずれか１つに記載の組換え株。
実施形態４６．前記Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、ＭＧ１６５５ゲノムと少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態４５に記載の組換え株。
実施形態４７．前記Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、前記ＭＧ１６５５ゲノムに関して欠失した配列番号２５の核酸配列を有する、実施形態４６に記載の組換え株。
実施形態４８．前記Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは更に、ｍｒｒ、ｈｓｄＲ、ｈｓｄＭ、ｈｓｄＳ、ｓｙｍＥ及びｍｃｒＢＣを含む群から選択される遺伝子欠失のうちの少なくとも１つを含む、実施形態３５～４７のいずれか１つに記載の組換え株。
実施形態４９．前記Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、ＭＧ株またはＫＳ株に由来する、実施形態３５～４８のいずれか１つに記載の組換え株。
実施形態５０．株３を含む、遺伝子改変微生物。
実施形態５１．株４を含む、遺伝子改変微生物。
実施形態５２．配列番号２１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態５３．配列番号２１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態５４．配列番号２１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態５５．配列番号２１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態５６．配列番号２１を有する核酸を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態５７．配列番号２２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態５８．配列番号２２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態５９．配列番号２２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態６０．配列番号２２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態６１．配列番号２２を有する核酸を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態６２．配列番号１～１５のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態６３．配列番号１～１５のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態６４．配列番号１～１５のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態６５．配列番号１～１５のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態６６．配列番号１～１５のいずれか１つに対して少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態６７．配列番号１～１５のいずれか１つの核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態６８．配列番号１０に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態６９．配列番号１１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態７０．配列番号１０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態７１．配列番号１１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態７２．配列番号１０に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態７３．配列番号１１に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態７４．配列番号１０の核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
実施形態７５．配列番号１１の核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
本明細書に明確に記載された実施形態に加えて、本開示に開示されたすべての特徴は、任意の組み合わせ（例えば、並べ替え、組み合わせ）で組み合わせることができることを理解されたい。本開示に開示される各要素は、同じ、同等または同様の目的を果たす代替の特徴に置き換えられてもよい。したがって、別途明確に示されない限り、開示される各特徴は、一般的な一連の同等または同様の特徴の一例にすぎない。
上述の説明から、当業者であれば、本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、その趣旨及び範囲を逸脱しない範囲で、種々の用途及び状況に適合するように、本発明に様々な変更及び修正を行うことができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。

Claims (75)

  1. 定常期誘導プロモーター及びプライモソーム集合部位（ＰＡＳ）を含む操作された核酸ベクター。
  2. ＲＮＡＩＩ上に重要なステムループ、ＳＬ４の形成を引き起こす点変異を更に含む、請求項１に記載の操作された核酸ベクター。
  3. ＲＮＡＩＩの天然プロモーターは破壊されている、請求項１または２に記載の操作された核酸ベクター。
  4. ＲＮＡＩＩの天然プロモーターは欠失している、請求項１または２に記載の操作された核酸ベクター。
  5. 前記定常期誘導プロモーターはＰ（ｏｓｍＹ）である、請求項１または請求項２～４のいずれか一項に記載の操作された核酸ベクター。
  6. 前記Ｐ（ｏｓｍＹ）は配列番号２７の配列を有する、請求項５に記載の操作された核酸ベクター。
  7. 前記ＰＡＳは配列番号２８の配列を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の操作された核酸ベクター。
  8. 前記ＳＬ４は配列番号２９の配列を有する、請求項２または請求項３～７のいずれか一項に記載の操作された核酸ベクター。
  9. 前記ベクターはプラスミド１（＋ＰＡＳ＋Ｐ（ｏｓｍＹ））である、請求項８に記載の操作された核酸ベクター。
  10. 前記ベクターはプラスミド２（＋ＰＡＳ＋Ｐ（ｏｓｍＹ）＋ＳＬ４）である、請求項８または請求項９に記載の操作された核酸ベクター。
  11. 前記ベクターは、配列番号１９に対して少なくとも７０％の配列同一性の配列を有する、請求項１に記載の操作された核酸ベクター。
  12. 前記ベクターは、配列番号２０に対して少なくとも７０％の配列同一性の配列を有する、請求項１に記載の操作された核酸ベクター。
  13. 以下の５’から３’への配置：
    （ａ）複製起点、
    （ｂ）プロモーター及び
    （ｃ）抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の操作された核酸ベクター。
  14. 目的のｍＲＮＡをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を更に含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の操作された核酸ベクター。
  15. 遺伝子型：｜＜ｒｅｐＡ｜ｏｒｉ＿ｔｓ｜＜ｒｅｃＡ｜＜ｂｌａ｜＜ｔｅｔＲ｜＜Ｐ（ｔｅｔＲ）｜Ｐ（ｔｅｔ）＞｜ｇａｍｍａ＞｜ｂｅｔａ＞｜ｅｘｏ＞｜ａ＞｜を含む、組換えプラスミド。
  16. 配列番号１９に対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列を含む、組換えプラスミド。
  17. 配列番号２０に対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列を含む、組換えプラスミド。
  18. 請求項１～１７のいずれか一項に記載の操作された核酸ベクターを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を実施する方法。
  19. ｐｒｓＡバリアントを含む核酸。
  20. 前記核酸は、ｐｒｓＡ＊（配列番号２３）に対して７０％～９９％の配列同一性を有する、請求項１９に記載の核酸。
  21. 前記核酸は、ｐｒｓＡ＊（配列番号２３）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１９に記載の核酸。
  22. 前記核酸は、ｐｒｓＡ＊（配列番号２３）に対して少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有する、請求項１９に記載の核酸。
  23. 前記核酸は、ｐｒｓＡ＊（配列番号２４）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１９に記載の核酸。
  24. 前記核酸は、配列番号２３に対して１００％の配列同一性を有するか、または配列番号２４に対して１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１９に記載の核酸。
  25. ｐｒｓＡバリアントを含む遺伝子改変微生物であって、前記微生物は、リプレッサー遺伝子ｐｕｒＲが破壊されているゲノムを有する、前記遺伝子改変微生物。
  26. 前記ｐｒｓＡバリアントは、ｐｒｓＡに対して７０％～９９％の配列同一性を有する、請求項２５に記載の遺伝子改変微生物。
  27. 前記ｐｒｓＡバリアントは、ｐｒｓＡ＊（配列番号２３）に対して９０％の配列同一性を有する、請求項２５に記載の遺伝子改変微生物。
  28. 前記ｐｒｓＡバリアントは、配列番号２３の配列を含む、請求項２５に記載の遺伝子改変微生物。
  29. 前記ｐｕｒＲは欠失している、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
  30. 前記ｐｕｒＲは、配列番号２５の配列を含む、請求項２９に記載の遺伝子改変微生物。
  31. ＥｃｏＫＩ制限系は前記ゲノムから欠失している、請求項２５～３０のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
  32. ｅｎｄＡは前記ゲノムから欠失している、請求項２５～３１のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
  33. ｒｅｃＡは前記ゲノムから欠失している、請求項２５～３２のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
  34. 前記遺伝子改変微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の組換え株である、請求項２５～３３のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
  35. 少なくとも以下の遺伝子欠失：ｅｎｄＡ（ΔｅｎｄＡ）及びｒｅｃＡ（ΔｒｅｃＡ）を有するＥ．ｃｏｌｉゲノムを含む、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の組換え株。
  36. 前記Ｅ．ｃｏｌｉはＭＧ１６５５に由来する、請求項３５に記載の組換え株。
  37. 前記Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、ＭＧ１６５５ゲノムに関して少なくとも以下の遺伝子欠失：ｅｎｄＡ（ΔｅｎｄＡ）及びｒｅｃＡ（ΔｒｅｃＡ）を含む前記ＭＧ１６５５ゲノムの核酸配列を含む、請求項３５または請求項３６に記載の組換え株。
  38. 前記Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、ＭＧ１６５５ゲノムと少なくとも９５％の配列同一性の核酸配列を含む、請求項３５または請求項３６～３７のいずれか一項に記載の組換え株。
  39. ＥｃｏＫＩ制限系は、前記Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムから欠失している、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の組換え株。
  40. 前記Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、ＭＧ１６５５ゲノムと少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項３９に記載の組換え株。
  41. 前記Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、前記Ｅ．ｃｏｌｉゲノムがＭＧ１６５５ゲノムに関してＥｃｏＫＩ制限系欠失を含む前記ＭＧ１６５５ゲノムの核酸配列を含む、核酸配列を含む、請求項３９または請求項４０に記載の組換え株。
  42. 前記Ｅ．ｃｏｌｉはｐｒｓＡバリアントを含む、請求項３５～４１のいずれか一項に記載の組換え株。
  43. 前記Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、ＭＧ１６５５ゲノムと少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項４２に記載の組換え株。
  44. 前記Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、配列番号２３の核酸配列を含む、請求項４３に記載の組換え株。
  45. ｐｕｒＲ配列は、前記Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムから欠失している、請求項３５～４４のいずれか一項に記載の組換え株。
  46. 前記Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、ＭＧ１６５５ゲノムと少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項４５に記載の組換え株。
  47. 前記Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、前記ＭＧ１６５５ゲノムに関して欠失した配列番号２５の核酸配列を有する、請求項４６に記載の組換え株。
  48. 前記Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは更に、ｍｒｒ、ｈｓｄＲ、ｈｓｄＭ、ｈｓｄＳ、ｓｙｍＥ及びｍｃｒＢＣを含む群から選択される遺伝子欠失のうちの少なくとも１つを含む、請求項３５～４７のいずれか一項に記載の組換え株。
  49. 前記Ｅ．ｃｏｌｉゲノムは、ＭＧ株またはＫＳ株に由来する、請求項３５～４８のいずれか一項に記載の組換え株。
  50. 株３を含む、遺伝子改変微生物。
  51. 株４を含む、遺伝子改変微生物。
  52. 配列番号２１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸を含む、操作された核酸ベクター。
  53. 配列番号２１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸を含む、操作された核酸ベクター。
  54. 配列番号２１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸を含む、操作された核酸ベクター。
  55. 配列番号２１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸を含む、操作された核酸ベクター。
  56. 配列番号２１を有する核酸を含む、操作された核酸ベクター。
  57. 配列番号２２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸を含む、操作された核酸ベクター。
  58. 配列番号２２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸を含む、操作された核酸ベクター。
  59. 配列番号２２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸を含む、操作された核酸ベクター。
  60. 配列番号２２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸を含む、操作された核酸ベクター。
  61. 配列番号２２を有する核酸を含む、操作された核酸ベクター。
  62. 配列番号１～１５のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
  63. 配列番号１～１５のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
  64. 配列番号１～１５のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
  65. 配列番号１～１５のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
  66. 配列番号１～１５のいずれか１つに対して少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
  67. 配列番号１～１５のいずれか１つの核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
  68. 配列番号１０に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
  69. 配列番号１１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
  70. 配列番号１０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
  71. 配列番号１１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
  72. 配列番号１０に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
  73. 配列番号１１に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
  74. 配列番号１０の核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
  75. 配列番号１１の核酸配列を含む、操作された核酸ベクター。
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