CN116162638A - 细菌中水平转移基因激活介导的基因串联重复的诱导方法 - Google Patents
细菌中水平转移基因激活介导的基因串联重复的诱导方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116162638A CN116162638A CN202310148743.2A CN202310148743A CN116162638A CN 116162638 A CN116162638 A CN 116162638A CN 202310148743 A CN202310148743 A CN 202310148743A CN 116162638 A CN116162638 A CN 116162638A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- recombinant
- gene
- cells
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 17
- 230000004913 activation Effects 0.000 title abstract description 9
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 title abstract description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 title abstract description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 title description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 58
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 35
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 27
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 62
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 29
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 24
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 22
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 10
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 9
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 7
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 4
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 18
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 18
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical group N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 17
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 14
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 11
- 101150038738 ble gene Proteins 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 8
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 8
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 6
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 description 5
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 5
- 101100381793 Bacillus subtilis (strain 168) bioK gene Proteins 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 101150076754 bioA gene Proteins 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 3
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 3
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 101150003509 tag gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- 108020004513 Bacterial RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001872 Spider silk Polymers 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 229960001931 ampicillin sodium Drugs 0.000 description 1
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000004545 gene duplication Effects 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 1
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了细菌中水平转移基因激活介导的基因串联重复的诱导方法。本发明公开的方法包括:将抗性基因表达盒分为上游部分与下游部分,依次连接下游部分、目的DNA与上游部分,得到重组DNA片段;将重组DNA片段导入细胞中,得到重组细胞;在含有抗性基因对应的抗性物质的培养体系中培养重组细胞,筛选即得到发生基因串联重复的重组细胞。实验证明,本发明的方法可以增加细胞中目的DNA拷贝数,无论对于质粒DNA还是基因组DNA序列,都可对其快速诱导出多拷贝串联重复,且本发明的方法不受细胞种类的限制,在生物细胞中应用具有广泛性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中,细菌中水平转移基因激活介导的基因串联重复的诱导方法。
背景技术
DNA多拷贝串联重复是指以一段DNA序列为重复单元,首尾相接并多次串联形成的多拷贝重复序列。细菌中构建DNA多拷贝串联重复用途十分广泛,在现代生物技术开发及生命科学基础研究中发挥重要作用,例如,表达调控中通过增加目标基因拷贝数提高其表达量、高重复序列蛋白质(蛛丝蛋白等)中通过重复单元数目调控蛋白性能、进化研究中的DNA多拷贝重复(作为生命进化的基础与动力)的机制及意义等。
现有的DNA多拷贝串联重复技术分为体外构建和体内构建,体外构建技术主要有非对称粘性末端互补构建法、同尾酶构建法、PCR扩增串联法、随机定向串联法等。体外技术大多是利用PCR扩增或酶切连接等体外方式,人为构建逐渐增加目标序列拷贝数,然后将这些序列逐一转入目标宿主来获得不同拷贝数的串联重复序列转化子。这些方法存在操作难度大、耗时长、限制酶选择难、多聚体体外构建不稳定等问题。体内构建技术包括Cre/loxP介导的多拷贝整合技术、基于单倍剂量不足的基因扩增技术(HapAmp)和化学诱导的染色体进化技术(CIChE)等。现有体内技术通常利用重复单元中适应性基因(抗生素抗性基因)的剂量效应调控重复单元拷贝数,同时需要DNA重组酶(Cre、RecA)、特异性DNA序列位点(loxP)、自主复制序列(ARS)等相关元件。这些方法往往依赖经典的同源重组系统,且需要通过后续敲除重组酶的操作来维持既得拷贝数的稳定性。
DNA多拷贝扩增事件作为分子进化的一部分,在实验室中也有发生。2019年发表于NAR的研究论文表明,研究人员利用实验进化策略研究水平转移基因的表达激活机制时发现细菌受体以自发且快速的DNA多拷贝串联重复进化事件作为激活外源基因的机制,且多拷贝串联重复的形成机制显著区别于现有的体内构建技术。同时实验进化出的基因拷贝数和基因表达量具有丰富的多态性和强正相关性。
发明内容
鉴于体内构建策略的巨大优势和存在的实际问题,本发明的目标是提供一种不添加任何同源重组及DNA扩增相关的功能元件、不依赖宿主内源RecA同源重组系统且无需后续敲除重组系统操作的机制新颖、操作更加简单快速、效果更加稳定高效的细菌体内的串联重复诱导方法。
为解决上述技术问题,本发明首先提供了增加细胞中目的DNA拷贝数的方法,所述方法包括:
1)将抗性基因表达盒分为上游部分与下游部分,依次连接所述下游部分、目的DNA与所述上游部分,得到重组DNA片段;
2)将所述重组DNA片段导入细胞中,得到重组细胞;
3)在含有所述抗性基因对应的抗性物质的培养体系中培养所述重组细胞,筛选得到所述目的DNA拷贝数增加的重组细胞,实现细胞中目的DNA拷贝数的增加。
本发明还提供了提高细胞中目的基因表达量的方法,所述方法包括:
1)将抗性基因表达盒分为上游部分与下游部分,依次连接所述下游部分、目的基因表达盒与所述上游部分,得到重组DNA片段;
2)将所述重组DNA片段导入细胞中,得到重组细胞;
3)在含有所述抗性基因对应的抗性物质的培养体系中培养所述重组细胞,筛选所述目的基因表达盒拷贝数增加的重组细胞,即得到细胞中目的基因表达量提高的重组细胞,实现细胞中目的基因表达量的提高。
上文中,所述抗性基因表达盒是指能够在宿主细胞中使抗性基因得到表达的DNA,该DNA不但可包括启动所述抗性基因转录的启动子,还可包括终止所述抗性基因转录的终止子。
所述目的基因表达盒是指能够在宿主细胞中使目的基因得到表达的DNA,该DNA不但可包括启动所述目的基因转录的启动子,还可包括终止所述目的基因转录的终止子。
在本发明的一个实施例中,所述目的基因为GFP基因。
在本发明的一个实施例中,所述目的基因为mCherry基因。
所述重组DNA片段在任何宿主细胞中均不能使抗性基因得到表达。
所述抗性基因可使表达所述抗性基因的宿主细胞能够在含有所述抗性物质的环境(或体系)中存活、生长和/或繁殖。
上述方法中,将所述重组DNA片段导入细胞中可通过将所述重组DNA片段利用载体导入所述细胞中或插入至所述细胞的基因组上实现。
上述方法中,所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述方法中,所述抗性物质可为抗生素。
在本发明的一个实施例中,所述抗性基因为ble基因,所述抗性物质为博莱霉素。
上述方法中,所述细胞可为原核细胞或真核细胞。
进一步,所述原核细胞可为细菌;所述真核细胞为酵母、真菌、动物细胞或植物细胞。
上述方法中,所述细菌可为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌等工业常用菌。
利用所述增加细胞中目的DNA拷贝数的方法得到的重组细胞,也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种产品,所述产品含有所述重组DNA片段。
所述产品在增加细胞中目的DNA拷贝数或提高细胞中目的基因表达量中的应用,也属于本发明的保护范围。
实验证明,本发明的增加细胞中目的DNA拷贝数的方法可以增加细胞中目的DNA拷贝数,无论对于质粒DNA还是基因组DNA序列,都可对其快速诱导出多拷贝串联重复,且本发明的方法不受细胞种类的限制,在生物细胞中应用具有广泛性。
与现有体内DNA多拷贝串联重复构建方法相比,本发明不包含任何现有技术必需的功能元件,如DNA重组酶(Cre)、特异性DNA序列位点(loxP)、自主复制序列(ARS)等,不依赖内源的RecA系统,无需后期敲除来稳定既得拷贝数,仅包含必需的筛选标签基因来辅助筛选鉴定串联重复。本发明方法整个过程仅需进行一次常规的重复单元序列的转化,因其自发且快速进化的构建机制,无需额外分子实验操作,仅需对转化子进行摇瓶培养及平板筛选,即可通过鉴定得到具有目标拷贝数的DNA串联重复,工作量极少,且整个实验周期仅约为3天。故本发明无论载体构建还是操作体系都十分简单快速。
实验结果还显示利用本发明的增加细胞中目的DNA拷贝数的方法,所得重组细胞中目的DNA拷贝数(10+)和重复序列总长度(15kb+)未见明显上限,目的基因的表达量可以显著提高,并在后期多代连续培养中拷贝数保持稳定。拷贝数的稳定性也支持本发明的方法在细胞基因表达调控方面具有很好的应用价值。
附图说明
图1细菌中水平转移基因激活介导的基因串联重复(HATD)的诱导方法示意图及流程图。
A.HATD工作机制示意图。在原始菌株(Or)中,质粒或基因组中的抗生素标记物ble表达盒被分为两部分,ble表达盒的上半部分(Ub)含有启动子,位于目标基因(GOI)的下游,ble表达盒的下半部分(Lb)位于上游,因此ble在Or中不能表达。在进化菌株(Ev)中,HATD进化事件形成ble完整表达盒(Cb),实现ble的功能性激活,利用抗生素可以对其进行筛选,通过增加抗生素浓度筛选出高拷贝菌株(Hc)。zeocin:博莱霉素。
B.HATD快速诱导流程图。用25mg/L博莱霉素从原始菌株(Or)培养基中筛选进化菌株(Ev),用200mg/L博莱霉素平板诱导高拷贝菌株(Hc)。进化菌株(Ev)和高拷贝菌株(Hc)由PCR和限制性内切酶分析鉴定。
图2利用HATD诱导大肠杆菌质粒序列的多拷贝串联重复。
A.大肠杆菌质粒序列的串联重复载体pOr1的目标片段示意图。Pb1,ble的启动子;Tb1,ble的终止子;PG1,GFP的启动子;TG1,GFP的终止子。
B.大肠杆菌质粒序列串联重复的鉴定。左图:在筛选标签ble基因的上下游设计Ev1引物对检测进化菌Ev1,PCR扩增出完整的筛选标签ble基因。右图:使用位于载体中重复单元以外的酶切位点KpnI和AscI对原始菌株Or1和进化菌Ev1的质粒进行双酶切,酶切后的载体骨架长度为2.7kb,重复单元长度为1.6kb。1~6分别表示不同单克隆Ev1-1~Ev1-6。
C.大肠杆菌质粒序列高拷贝串联重复的鉴定。左图:使用位于重复单元以外的酶切位点KpnI和AscI对高拷贝菌Hc1的质粒进行双酶切检测,1~5分别表示不同单克隆Hc1-1~Hc1-5。右图:使用位于重复单元内部唯一的酶切位点SmaI对高拷贝菌Hc1的质粒进行单酶切检测,即能检测到重复单元长度(1.6kb)和出发质粒长度(4.3kb)的两条DNA片段,1~3分别表示不同单克隆Hc1-1~Hc1-3。
D.高拷贝串联重复菌株Hc1-3的稳定性检测。将高拷贝串联重复菌株Hc1-3分别在博莱霉素抗生素浓度0mg/L、25mg/L和200mg/L条件下摇瓶培养以1:100的比例连续继代5次,分别提取第1、3、5次的菌液质粒进行KpnI和AscI双酶切检测。
E.大肠杆菌质粒序列的不同拷贝数菌株的GFP表达量检测。使用流式细胞仪检测不同拷贝数菌株的单细胞的GFP荧光强度。
图3利用HATD诱导大肠杆菌基因组整合序列的多拷贝串联重复。
A.大肠杆菌基因组序列的串联重复载体pOr2,重复单元插入基因组lac位点。Pb2,ble的启动子;Tb2,ble的终止子;PG2,GFP的启动子;TG2,GFP的终止子。
B.大肠杆菌基因组串联重复的鉴定。在筛选标签ble基因的上下游设计Ev2引物对检测进化菌Ev2,PCR扩增出完整的筛选标签ble基因。1~6分别表示不同单克隆Ev2-1~Ev2-6。
C.大肠杆菌基因组序列高拷贝串联重复的鉴定。左图:qPCR检测拷贝数变化,1~6分别表示不同单克隆Hc2-1~Hc2-6。右图:使用位于重复单元内部的载体唯一的酶切位点SmaI和串联重复片段外部的HindⅢ对不同拷贝数菌株Hc2的基因组双酶切并进行Southernblot检测,1、2、4、5表示不同单克隆Hc2-1、Hc2-2、Hc2-4、Hc2-5。
D.左图:高拷贝串联重复菌株Hc2-6的稳定性检测。将高拷贝串联重复菌株Hc2-6分别在博莱霉素浓度0mg/L、25mg/L条件下以1:100比例连续继代培养5次,分别提取第1、3、5次的基因组进行qPCR检测。右图:qRT-PCR检测不同拷贝数菌株GFP mRNA表达量。
图4利用HATD诱导枯草芽孢杆菌质粒序列的多拷贝串联重复。
A.枯草芽孢杆菌质粒序列的串联重复载体pOr3。Pb3,ble的启动子;Tb3,ble的终止子。B.枯草芽孢杆菌质粒序列串联重复的鉴定。在筛选标签ble基因的上下游设计Ev3引物对检测进化菌Ev3,PCR扩增出完整的筛选标签ble基因。1~6分别表示不同单克隆Ev3-1~Ev3-6。
C.qPCR检测进化菌株Hc3拷贝数。1~6分别表示不同单克隆Hc3-1~Hc3-6。
图5利用HATD诱导RecA缺陷型大肠杆菌DH5α的质粒序列的多拷贝串联重复。
A.大肠杆菌质粒序列Or4菌株串联重复的鉴定。检测方法同Or1菌株。1~6分别表示不同单克隆Ev4-1~Ev4-6。
B.大肠杆菌质粒序列Or4菌株高拷贝串联重复的鉴定。qPCR检测Hc4菌株的拷贝数。1~6分别表示不同单克隆Hc4-1~Hc4-6。
具体实施方式
本发明通过将筛选标签基因拆分成上、下两半部分,分别置于目标基因序列的下游和上游,构成重复单元(图1),确保只有发生目标的串联重复时才能正确表达筛选标签基因,通过抗性筛选,就能筛选得到具有预期DNA串联重复的目标菌株(图1)。基于技术原理,该方法被命名为水平转移基因激活介导的串联重复方法[Horizontally-transferred-gene-Activation-mediated Tandem Duplication(HATD)]。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。下述实施例中,如无特殊说明,序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸,末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
大肠杆菌K-12MG1655感受态细胞(ZC1040-2):北京庄盟国际生物基因科技有限公司;大肠杆菌DH5α感受态细胞(TSC-C01):北京擎科生物科技有限公司;枯草芽孢杆菌BS168菌株(JZ050-1):丰晖生物;pOr1载体由金唯智公司合成;pHP13载体(1-4130):北京泰合通生物科技有限公司;T载体pCloneEZ-Blunt(C5861-50):中美泰和生物技术公司。
LB液体培养基:NaCl 10g/L,蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,分装后121℃高压灭菌20min,室温储存。LB固体培养基:琼脂15g/L,NaCl 10g/L,蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,分装后121℃高压灭菌20min,室温储存。
低盐LB液体培养基:NaCl 5g/L,蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,pH7.5,分装后121℃高压灭菌20min,室温储存。
低盐LB固体培养基:琼脂15g/L,NaCl 5g/L,蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,pH7.5,分装后121℃高压灭菌20min,室温储存。
博莱霉素:北京华威锐科化工有限公司;氨苄青霉素钠(即氨苄青霉素):北京志超伟业生物技术有限公司;硫酸卡那霉素:上海麦克林生化科技股份有限公司;壮观霉素:北京华威锐科化工有限公司;质粒小提试剂盒(DP103)、细菌基因组DNA提取试剂盒和细菌RNA提取试剂盒:TIANGEN公司;M-MLV反转录试剂盒:北京欣生科科技有限公司;通用型高灵敏度染料法定量PCR检测试剂盒:奥百瑞(天津)生物科技有限责任公司;限制性内切酶KpnI和AscI:NEB公司;限制性内切酶SmaI和HindⅢ:Thermo Fisher Scientific公司;PBS缓冲液干粉:北京索莱宝科技有限公司。
实施例1、不同拷贝数的重复序列突变体的获得
1、构建包含一个重复单元的进化起始菌株
为了实现大肠杆菌质粒序列的串联重复,构建pOr1载体(图2中A,pOr1载体的序列为序列表中序列1),重复单元由拆分的抗性筛选基因ble和目标基因GFP组成,ble的启动子Pb1和终止子Tb1为弱启动子PJ23116和配套终止子TJ23116(来源于数据库Registry ofStandard Biological Parts,http://parts.igem.org/Part:BBa_J23119),以pUC 57载体为骨架交由公司合成后分别导入到大肠杆菌K-12MG1655菌株和DH5α菌株中,即获得用于大肠杆菌质粒序列串联重复进化的起始菌株Or1和Or4。
序列1中,第422-1988位为重复单元1,第422-922位为ble表达盒的下游部分(Lb),第923-1900位为GFP表达盒,第1901-1988位为ble表达盒的上游部分(Ub)。
序列1的第794-922位所示为ble表达盒终止子(T b1);第923-1131位所示为GFP表达盒启动子(PG1),第1132-1854所示为GFP基因,第1855-1900位所示为GFP表达盒终止子(TG1);第1901-1988位所示为ble表达盒启动子(Pb1)。
为了实现大肠杆菌基因组序列的串联重复,以pCloneEZ-Blunt载体为骨架构建pOr2载体(图3中A,pOr2载体的序列为序列表中序列2),具体的,ble启动子更换为Prrn(LiZ,Bock R.Rapid functional activation of a horizontally transferred eukaryoticgene in a bacterial genome in the absence of selection.Nucleic AcidsRes.2019Jul 9;47(12):6351-6359),重复单元2的两端分别添加150bp的基因组插入位点lac的同源序列,使用λRed重组系统可将重复单元2插入到含有重组质粒的E.coli strainK-12MG1655的基因组中,即获得用于大肠杆菌基因组序列串联重复的进化起始菌株Or2。
序列2中,第551-2184位为重复单元2;第84-233位为lac的同源序列(lacI);第923-1051位所示为ble表达盒终止子(T b2);第1052-1260位所示为GFP表达盒启动子(PG2),第1261-1983位所示为GFP基因,第1984-2029位所示为GFP表达盒终止子(T G2);第2036-2184位所示为ble表达盒启动子(Pb2),第3218-3367位为lac的同源序列(lacZ)。
菌株Or2:以pOr2载体为模板扩增得到pOr2载体中目标片段(即序列2的第84-3367位所示的DNA片段),所用引物为lac同源引物对(表1)。将所得目标片段以电转方法转化到感受态细胞中,于30℃含有卡那霉素抗生素平板上进行培养,通过PCR验证及测序,即可获得用于大肠杆菌基因组序列串联重复的进化起始菌株Or2,该菌株的位点lac中插入了重复单元2,PCR验证所用引物为lac基因组引物对(表1)。
为了实现枯草芽孢杆菌质粒序列的串联重复,以pHP13载体为骨架构建pOr3载体(图4中A,pOr3载体的序列为序列表中序列3),其载体骨架包含两个复制子和抗性筛选标签壮观霉素,具体的,目标基因GFP替换为mCherry,ble启动子替换为Psp110,并使用配套终止子(Zhao,Xueming et al.,Construction,Model-Based Analysis,and Characterizationof a Promoter Library for Fine-Tuned Gene Expression in Bacillus subtilis[J]ACS Synthetic Biology.2018.7(7):1785-1797),构建完成的pOr3载体导入到枯草芽孢杆菌BS168感受态细胞,获得用于枯草芽孢杆菌质粒序列串联重复的进化起始菌株Or3。
序列3中,第3262-4890位为重复单元3;第3634-3682位所示为ble表达盒终止子(Tb3);第3683-4087位所示为mCherry表达盒启动子(PG3),第4088-4804位所示为mCherry基因,第4805-4838位所示为mCherry表达盒终止子(T G3);第4839-4890位所示为ble表达盒启动子(Pb3)。
2、利用实验进化手段,诱导起始菌株发生快速、精准的串联重复
将大肠杆菌进化起始菌株Or1(重复序列单元位于质粒)接种于30mL的LB液体培养基(含氨苄青霉素100mg/L)中,进行24h的摇瓶培养(180rpm,37℃),每8mL的菌液涂布于1个进化筛选低盐LB固体培养基(培养皿直径15cm,含氨苄青霉素100mg/L,博莱霉素25mg/L)上进行筛选,将长起来的单克隆转移到LB固体培养基(含氨苄青霉素100mg/L,博莱霉素25mg/L)进行复筛,使用Ev1引物对(表1)对通过复筛的克隆进行PCR扩增并进行电泳检测,结果表明起始菌株Or1按着预期重组方式发生了一次串联重复,进而使抗性筛选基因ble获得启动子而表达并克服抗性筛选压力,所得到的进化菌株即为Ev1。同时,对进化菌株Ev1提取质粒并利用KpnI和AscI进行双酶切检测,也证明了重复单元预期重组发生了一次串联重复(部分单克隆Ev1-1~Ev1-6的鉴定如图2中B所示)。
按照上述方法,将大肠杆菌进化起始菌株Or1分别替换为大肠杆菌进化起始菌株Or2(重复序列单元位于细菌基因组)、枯草芽孢杆菌进化起始菌株Or3(重复序列单元位于枯草芽孢杆菌质粒)和大肠杆菌DH5α进化起始菌株Or4(重复序列单元位于细菌质粒),其中培养条件随菌株抗性标签基因作出相应调整,依次获得进化菌株Ev2、Ev3、Ev4。菌株Ev2的获得过程中,摇瓶培养不添加抗生素,筛选与复筛用抗生素及浓度为博莱霉素25mg/L。菌株Ev3的获得过程中,摇瓶培养所用抗生素及浓度为壮观霉素150mg/L,筛选与复筛用抗生素及浓度为壮观霉素150mg/L、博莱霉素25mg/L。菌株Ev4的获得过程中,摇瓶培养所用抗生素及浓度为氨苄青霉素100mg/L,筛选与复筛用抗生素及浓度为氨苄青霉素100mg/L、博莱霉素25mg/L。
利用Ev2引物对(表1),PCR鉴定进化菌株Ev2(部分单克隆Ev2-1~Ev2-6的鉴定如图3中B所示),结果显示重复单元2发生了一次串联重复,测序也证实了该结果。利用Ev3引物对(表1),PCR鉴定进化菌株Ev3(部分单克隆Ev3-1~Ev3-6的鉴定如图4中B所示),结果显示重复单元3发生了一次串联重复,测序也证实了该结果。利用Ev1引物对(表1),PCR鉴定进化菌株Ev4(部分单克隆Ev4-1~Ev4-6的鉴定如图5中A所示),结果显示重复单元1发生了一次串联重复,测序也证实了该结果。
3、提高筛选压力,诱导更高拷贝数的串联重复进化菌株
为获得包含更高拷贝数的串联重复菌株,通过提高筛选压力诱导获得目的菌株。
将步骤2得到的串联重复菌株Ev1-1(即步骤2得到的进化菌株Ev1的一个单克隆)在含氨苄青霉素100mg/L、博莱霉素200mg/L的低盐LB固体培养基上划线培养,对长出的单克隆进行摇菌提取质粒,利用在串联重复片段之外的两个酶切位点KpnI和AscI对质粒进行双酶切检测。部分单克隆Hc1-1~Hc1-5的鉴定如图2中C所示,结果显示,长出的单克隆包含高拷贝数的串联重复单元1,且克隆间的拷贝数具有多态性,并可以得到超过10+的拷贝数和重复序列总长度为15kb+的多拷贝串联重复菌株,且未见明显上限(图2中C左图)。同时,在串联重复片段内部选择唯一酶切位点SmaI进行检测,结果表明重复单元是按着预期方式进行多拷贝串联重复(图2中C右图)。说明,该步骤诱导出了更高拷贝数的串联重复进化菌株Hc1。
将步骤2得到的串联重复菌株Ev2-1(即步骤2得到的进化菌株Ev2的一个单克隆)在含卡那霉素50mg/L、博莱霉素200mg/L的低盐LB固体培养基上划线培养,对长出的单克隆摇菌进行基因组提取,以基因组为模板进行qPCR检测,以ble基因作为目的基因和bioA作为内参基因。部分单克隆Hc2-1~Hc2-6的鉴定如图3中C所示,结果表明可以获得拷贝数为17个拷贝的菌株(图3中C左图)。qPCR所用目的基因引物对为ble引物对(表1);内参基因引物对为bioA引物对(表1)。同时,在串联重复片段内部选择唯一酶切位点SmaI和重复片段外的HindⅢ进行southern blot检测,结果表明重复单元是按着预期方式进行多拷贝串联重复(图3中C右图)。说明,该步骤诱导出了更高拷贝数的串联重复进化菌株Hc2。
将步骤2得到的串联重复菌株Ev3-1(即步骤2得到的进化菌株Ev3的一个单克隆)在含壮观霉素150mg/L、博莱霉素200mg/L的低盐LB固体培养基上进行稀释涂布平板,对长出的单克隆摇菌进行qPCR检测,以ble基因作为目的基因和pOr3质粒上的抗性标签Spe作为内参基因。部分单克隆Hc3-1~Hc3-6的鉴定如图4中C所示,结果表明可以获得拷贝数为7个拷贝的菌株(图4中C)。qPCR所用目的基因引物对为ble引物对(表1);内参基因引物对为spec引物对(表1)。说明,该步骤诱导出了更高拷贝数的串联重复进化菌株Hc3。
将步骤2得到的串联重复菌株Ev4(即步骤2得到的进化菌株Ev4的一个单克隆)在含氨苄青霉素100mg/L、博莱霉素200mg/L的低盐LB固体培养基上划线培养,对长出的单克隆进行摇菌做qPCR鉴定,以ble基因作为目的基因和bioA作为内参基因。部分单克隆Hc4-1~Hc4-6的鉴定如图5中B所示,结果表明可以获得拷贝数为多拷贝的菌株。qPCR所用目的基因引物对为ble引物对(表1);内参基因引物对为bioA引物对(表1)。说明,同样的方法可以对RecA缺陷型大肠杆菌诱导出了高拷贝数的串联重复进化菌株Hc4(图5中B)。
上面各结果表明本发明的串联机制不依赖RecA。
4、评估多拷贝串联重复进化菌株的拷贝数稳定性及表达调控能力
在获得多拷贝串联重复菌株Hc1后,对菌株的多拷贝的稳定性和目标基因表达量进行检测。
为了验证Or1进化菌株中高拷贝串联重复菌株的稳定性,选择了一个高拷贝的串联重复菌株Hc1-3,分别添加博莱霉素0mg/L、25mg/L和200mg/L时进行摇瓶培养,以1:100的比例接种连续传代5次,分别提取传代第1次、第3次和第5次的菌液质粒并进行双酶切检测。结果表明,在常规抗生素浓度下,高拷贝串联重复菌株在连续传代后仍可保持拷贝数的稳定性(图2中D)。
利用与上述相同传代方法对Or2进化菌株中高拷贝菌株Hc2-6的拷贝数稳定性进行检测,分别添加博莱霉素0mg/L和25mg/L。分别提取传代第1次、第3次和第5次的菌液基因组DNA并进行qPCR检测。结果表明,无筛选压力的条件下,在连续继代培养后,拷贝数可保持稳定(图3中D左图)。
使用流式细胞仪MoFloTMXDP对Or1进化菌株中不同拷贝数的GFP荧光强度进行检测,对待检测菌株进行适量PBS稀释,其检测的平均值表示单个细胞的GFP荧光强度。结果表明随着菌株的重复单元拷贝数增多,其目标基因的表达量升高(图2中E)。使用实时荧光定量PCR仪ABI 7500 FAST对Or2进化菌株中不同拷贝数的GFP mRNA表达量进行检测,结果表明高拷贝菌株的目标基因表达量也随之升高(图3中D右图)。荧光定量PCR所用目的基因引物对为GFP引物对(表1);内参基因引物对为GAPDH引物对(表1)。
基因串联重复是基因组进化研究的一个重点,也是基因表达调控和生物合成途径优化的常用策略。通过调控目的基因的拷贝数,控制目标重组蛋白的表达量或协调合成途径基因的表达来提升产品产量。同时,相比于现有的体内和体外的多拷贝串联重复,本发明的方法具有快速简单、高效稳定等优势,在基础研究及工业化应用方面具有很好的潜力。
所用引物如表1所示。
表1、引物序列
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。
序列表
序列1(pOr1载体的完整序列,下划线为重复单元1,Tb1-PG1-GFP基因-TG1-Pb1):
序列2(pOr2载体的完整序列,下划线为重复单元2,lacI--Tb2-PG2-GFP基因-TG2-Pb2—lacZ):
序列3(pOr3载体的完整序列,下划线为重复单元3,Tb3-PG3-mCherry基因-TG3-Pb3):
Claims (10)
1.增加细胞中目的DNA拷贝数的方法,包括:
1)将抗性基因表达盒分为上游部分与下游部分,依次连接所述下游部分、目的DNA与所述上游部分,得到重组DNA片段;
2)将所述重组DNA片段导入细胞中,得到重组细胞;
3)在含有所述抗性基因对应的抗性物质的培养体系中培养所述重组细胞,筛选得到所述目的DNA拷贝数增加的重组细胞,实现细胞中目的DNA拷贝数的增加。
2.提高细胞中目的基因表达量的方法,包括:
1)将抗性基因表达盒分为上游部分与下游部分,依次连接所述下游部分、目的基因表达盒与所述上游部分,得到重组DNA片段;
2)将所述重组DNA片段导入细胞中,得到重组细胞;
3)在含有所述抗性基因对应的抗性物质的培养体系中培养所述重组细胞,筛选所述目的基因表达盒拷贝数增加的重组细胞,即得到细胞中目的基因表达量提高的重组细胞,实现细胞中目的基因表达量的提高。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:将所述重组DNA片段导入细胞中通过将所述重组DNA片段利用载体导入所述细胞中或插入至所述细胞的基因组上实现。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法,其特征在于:所述载体为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于:所述抗性物质为抗生素。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法,其特征在于:所述细胞为原核细胞或真核细胞;
进一步,所述原核细胞为细菌;所述真核细胞为酵母、真菌、动物细胞或植物细胞。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述细菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒状杆菌。
8.利用权利要求1-7中任一所述方法得到的重组细胞。
9.一种产品,含有权利要求1-7中任一所述重组DNA片段。
10.权利要求9所述产品在增加细胞中目的DNA拷贝数或提高细胞中目的基因表达量中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310148743.2A CN116162638A (zh) | 2023-02-22 | 2023-02-22 | 细菌中水平转移基因激活介导的基因串联重复的诱导方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310148743.2A CN116162638A (zh) | 2023-02-22 | 2023-02-22 | 细菌中水平转移基因激活介导的基因串联重复的诱导方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116162638A true CN116162638A (zh) | 2023-05-26 |
Family
ID=86421625
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310148743.2A Pending CN116162638A (zh) | 2023-02-22 | 2023-02-22 | 细菌中水平转移基因激活介导的基因串联重复的诱导方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116162638A (zh) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111065738A (zh) * | 2017-08-25 | 2020-04-24 | 细胞基因治疗有限公司 | 基因疗法DNA载体VTvaf17、生成方法;大肠杆菌菌株SCS110-AF、生成方法;携带基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17、生成方法 |
CN112080493A (zh) * | 2020-09-07 | 2020-12-15 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 制备串联重复dna的方法及相关生物材料与应用 |
-
2023
- 2023-02-22 CN CN202310148743.2A patent/CN116162638A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111065738A (zh) * | 2017-08-25 | 2020-04-24 | 细胞基因治疗有限公司 | 基因疗法DNA载体VTvaf17、生成方法;大肠杆菌菌株SCS110-AF、生成方法;携带基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17、生成方法 |
CN112080493A (zh) * | 2020-09-07 | 2020-12-15 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 制备串联重复dna的方法及相关生物材料与应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
FILIP HUSNIK AND JOHN P. MCCUTCHEON: "Functional horizontal gene transfer from bacteria to eukaryotes", 《NATURE REVIEWS》, 27 November 2017 (2017-11-27), pages 1 - 13 * |
ZHICHAO LI AND RALPH BOCK: "Rapid functional activation of a horizontally transferred eukaryotic gene in a bacterial genome in the absence of selection", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》, vol. 47, no. 12, 20 May 2019 (2019-05-20), pages 6351 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4303597B2 (ja) | Tn5結合Cre/loxP切除システムによる最小化ゲノムを含む新規菌株の構築 | |
US20190241899A1 (en) | Methods of Crispr Mediated Genome Modulation in V. Natriegens | |
US20200291395A1 (en) | Novel crispr-associated transposon systems and components | |
CN102703424B (zh) | 一种重组工程介导的大肠杆菌基因组点突变的方法 | |
CN112410365B (zh) | 伯克氏菌同源重组系统及其应用 | |
CN111849852A (zh) | 一种高光学纯l-乳酸工程菌的构建方法 | |
EP1924693A1 (en) | Hybrid portable origin of replication plasmids | |
US11078458B2 (en) | Genome-wide rationally-designed mutations leading to enhanced lysine production in E. coli | |
WO2023065725A1 (zh) | 一种基于双链dna重组工程的细菌基因组多重编辑方法及其应用 | |
CN116162638A (zh) | 细菌中水平转移基因激活介导的基因串联重复的诱导方法 | |
US20210317402A1 (en) | Genome-wide rationally-designed mutations leading to enhanced lysine production in e. coli | |
CN106544313B (zh) | 一种缺失sahn基因的大肠杆菌MG1655菌株及构建方法和应用 | |
CN111850050B (zh) | 一种基因编辑工具及其制备方法与多轮基因编辑的方法 | |
CN115772533A (zh) | 一种细菌连续进化系统、正交易错dna聚合酶及连续进化方法 | |
CN116218890A (zh) | 基因串联表达盒、多位点基因编辑系统及应用 | |
CN113667687A (zh) | 基于ai-2分子响应的启动元件及其构建的大肠杆菌动态调控系统和方法 | |
CN113249400A (zh) | 一种在细菌染色体中快速多拷贝整合目的基因的方法 | |
CN107287198A (zh) | 苯丙氨酸衰减子突变体和解决反馈阻遏的苯丙氨酸操纵子以及它们的应用 | |
AU5496600A (en) | Novel vectors for improving cloning and expression in low copy number plasmids | |
CN115976058B (zh) | 毒素基因及其在重组和/或基因编辑的工程菌构建中的应用 | |
CN114574516B (zh) | 一种基于CRISPR/Cas9的酵母基因组稳定整合方法 | |
EP3960862A1 (en) | Rna-aptamer-sensors | |
CN112708620B (zh) | 一种毕赤酵母中IPTG诱导的tRNA元件及其构建方法和应用 | |
CN115216476A (zh) | 一种基于必需基因快速优化大肠杆菌启动子的方法 | |
WO2022242464A1 (zh) | 一种新型crispr相关转座酶 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |