CN111065738A - 基因疗法DNA载体VTvaf17、生成方法；大肠杆菌菌株SCS110-AF、生成方法；携带基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17、生成方法 - Google Patents

基因疗法DNA载体VTvaf17、生成方法；大肠杆菌菌株SCS110-AF、生成方法；携带基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17、生成方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及遗传工程，并且可用于生物技术、医学和农业。本发明需要构建3165bp基因疗法DNA载体VTvaf17，用于含有核苷酸序列SEQ ID No.1的动物和人细胞的遗传修饰。构建3165bp基因疗法DNA载体VTvaf17的方法包括首先构建4182bp载体，然后通过SpeI限制性位点将它切割，并且将剩余的片段与其自身连接，该4182bp载体含有具有内在增强子的人延伸因子EF1A的1188bp启动子区、具有限制性内切核酸酶BamHI、EcoRV、Sail、HindIII、KpnI、EcoRI的位点的35bp多接头、466bp转录终止子和人生长因子的多腺苷酸化序列、允许无抗生素的阳性选择的转座子Tn10的136bp调节元件RNA‑OUT、具有单核苷酸取代以增加大多数大肠杆菌菌株细胞中的载体生成的用于自主复制的1299bp复制起点、1010bp卡那霉素抗性基因。可以通过获得大肠杆菌菌株SCS110‑AF以生成基因疗法DNA载体VTvaf17或允许无抗生素阳性选择的基于其的基因疗法DNA载体实现规定的目的。获得大肠杆菌菌株SCS110‑AF以生成基因疗法DNA载体VTvaf17或基于其的基因疗法DNA载体的方法包括构建64bp的线性DNA片段，然后通过电穿孔转化大肠杆菌细胞，并挑选出在含10μg/ml氯霉素的培养基中存活的克隆，该线性DNA片段含有允许无抗生素的阳性选择的转座子Tn10的调节元件RNA‑IN、1422bp果聚糖蔗糖酶基因sacB(其产物确保在含蔗糖的培养基中进行选择)、挑出发生同源重组的菌株克隆需要的763bp氯霉素抗性基因catR、确保与基因失活同时的基因recA区域中的同源重组的两个同源序列329bp和233bp。还构建了携带基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17(在俄罗斯国家工业微生物保藏中心，以编号B‑12990，国际保藏机构编号NCIMB 42801登记)，用于允许无抗生素的选择的其进一步开发。获得携带基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110‑AFA/Tvaf17(在俄罗斯国家工业微生物保藏中心，以编号B‑12990，国际保藏机构编号NCIMB 42801登记)的方法包括制备大肠杆菌菌株SCS110‑AF的电感受态细胞，并且用基因疗法DNA载体VTvaf17对这些细胞进行电穿孔。之后，将细胞倒入具有含有选择性培养基的琼脂板(培养皿)中，所述选择性培养基含有酵母浸膏、蛋白胨、6％蔗糖和10μg/ml氯霉素。

Description

基因疗法DNA载体VTvaf17、生成方法；大肠杆菌菌株SCS110- AF、生成方法；携带基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株 SCS110-AF/VTvaf17、生成方法
发明领域
本发明涉及遗传工程，并且可以用于生物技术、医学和农业中以制造基因疗法产品。即，可以将生成的含有靶基因的基因疗法DNA载体递送到经历该基因表达减少或不足的人和动物的细胞，从而确保期望的治疗效果。
发明背景
基因疗法是一种医学创新方法，目的是通过将新的遗传材料递送到患者细胞中来补偿或抑制突变体基因的功能和/或治疗遗传病症来治疗遗传性和获得性疾病。
遗传材料(基因疗法载体)的转运蛋白分为病毒和非病毒载体。最有效的病毒载体包括逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒、痘病毒和腺病毒(Lukashev AN,Zamyatnin AA Jr.Viral Vectors for Gene Therapy:Current State and ClinicalPerspectives.Biochemistry(Mosc).2016.81:700-708.)。遗传材料的非病毒递送主要涉及携带治疗基因并与各种载体(如脂质、阳离子聚合物、树状聚合物、多肽和纳米颗粒)结合的质粒(Mintzer MA,Simanek EE.Nonviral vectors for gene delivery.ChemRev.2009.109:259-302)。
尽管就速度和效率而言，病毒天然几乎是将重组DNA递送到细胞中的理想试剂，但病毒递送系统的使用仍存在一些实际限制。这些包括制造挑战、缺乏选择性、免疫应答、潜在的致癌风险以及转导后的炎症。这些中的一些问题尚未解决。这就是为何最近的基因疗法越来越重视非病毒基因递送系统的开发。
质粒是自主复制的染色体外环状DNA。质粒可含有对抗生素、重金属离子的抗性的基因，以及控制某些有机化合物分解代谢的基因(Lipps G.(editor).(2008).Plasmids:Current Research and Future Trends.Caister Academic Press.ISBN 978-1-904455-35-6)。作为移动的遗传元件，质粒能够通过接合从一个细菌细胞传递到另一个细菌细胞，从而促进水平基因转移。
质粒没有病毒载体固有的限制。在靶细胞中，它们以附加体的形式在没有整合到基因组中的情况下存在，而产生它们是非常便宜的，并且没有由质粒施用引起的免疫应答或副作用，这使它们成为用于基因疗法(治疗基因的转移)和遗传疾病的预防(DNA疫苗接种)的便捷工具(Li L,Petrovsky N.Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccineimmunogenicity.Expert Rev Vaccines.2016；15(3):313-29)。
除了成为基因疗法中有希望的递送手段外，质粒长期以来在专门研究分子生物学和其他生物技术的实验室中发挥作用，并已成功应用于分子克隆和重组蛋白的开发(Russell,David W.；Sambrook,Joseph(2001),Molecular cloning:a laboratorymanual.Cold Spring Harbor,N.Y；Cold Spring Harbor Laboratory)。
尽管基因疗法的前景明显，但使用质粒作为治疗剂的关键限制在于它们包含：i)用于在携带菌株中开发构建体的对抗生素的抗性的基因，ii)由病毒基因组序列代表的各种调节元件。另一个限制是治疗性质粒的大小，其决定了载体递送至靶细胞的效率。
众所周知，在过去的几年中，整个世界都在见证传染源对抗微生物药物的抗性日益增强。抗生素抗性的形成是对抗生素的自然生物学应答，其引起选择性压力，从而促进了微生物抗性菌株的选择、存活和生长。对抗生素的抗性具有重要的社会和经济意义，并且认为对国家安全构成威胁(MacPherson D.W.,Gushulak B.D.,Baine W.B.,Bala S.,GubbinsP.O.,Holtom P.,Segarra-Newnham M.2009.Population mobility,globalization,andantimicrobial drug resistance.Emerg Infect Dis 15:1727-1732)。正是质粒确保微群体内部基因(包括抗生素抗性基因)的水平转移，这给予它们以选择优势。因此，对当今抗生素具有抗性的人传染源的生长归因于水平基因转移(Ramirez MS,Traglia GM,Lin DL,Tran T,Tolmasky ME.Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance and Virulence inGram-Negatives:the Klebsiella pneumoniae Paradigm.MicrobiolSpectr.2014(5)。
出于此原因，欧洲药品管理局认为有必要避免对用于基因疗法的新近工程化的质粒添加抗生素抗性标志物基因(开发期间基因疗法药物品的设计修改的反思文章(Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal productsduring development)/2011年12月14日先进疗法EMA/CAT/GTWP/44236/2009委员会)。
使用治疗性质粒载体的另一个更重要限制是它们含有增加靶基因的表达的调节元件(启动子、增强子、翻译后调节元件)，它们主要由各种病毒的基因组的核苷酸序列代表(关于基因疗法药物产品的质量、非临床和临床方面的指南草案，http:// www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/05/ WC500187020.pdf)。
用于基因疗法的现有质粒载体的另一个缺点是它们的大小(长度)。已知质粒的长度越大，其穿透靶细胞的效率越低。现有质粒通常具有大大增加其长度的不必要的非功能性位点(Mairhofer J,Grabherr R.Rational vector design for efficient non-viralgene delivery:challenges facing the use of plasmid DNA.Mol Biotechnol.2008.39(2):97-104)。
已知在不使用抗生素的情况下在大肠杆菌菌株中积累质粒的方法(CranenburghRM,Hanak JA,Williams SG,Sherratt DJ.Escherichia coli strains that allowantibiotic-free plasmid selection and maintenance by repressortitration.Nucleic Acids Res.2001.29(5):E26)。构建了大肠杆菌的DH1lacdapD和DH1lacP2dapD菌株，其中由Lac启动子控制编码参与L-赖氨酸的生物合成的酶2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-二羧酸-N-琥珀酰转移酶的基因dapD。在不存在诱导剂IPTG(异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)的情况下，对这些菌株进行裂解。然而，含有lac操纵子的多拷贝质粒pORT的施用诱导基因dapD的表达，因此，可以挑选出并复制转化的克隆。然而，这些菌株以转化的低水平和不稳定性为特征。
此外，已知用于构建大肠杆菌菌株以在无抗生素的质粒选择系统中开发质粒的方法(Mairhofer J,Pfaffenzeller I,Merz D,Grabherr R.A novel antibiotic freeplasmid selection system:advances in safe and efficient DNAtherapy.Biotechnol J.2008.3(1):83-89)。以如下的方式修饰所选的细菌菌株(例如DG5α，JM109，MG1655)，以使质粒复制抑制剂RNA I可以通过形成RNA/反义RNA的双链体抑制细菌活性所必需的基因(例如，murA，编码UDP-N-乙酰葡糖胺-1-羧乙烯基转移酶，其参与细菌细胞壁肽聚糖的生物合成)的翻译。murA基因受阻遏蛋白tetR的控制，并且仅在构建的携带RNA I的质粒存在下表达。然而，已经发现添加IPTG将导致产生不含靶质粒载体的大肠杆菌菌落。选择抑制的机制仍然未知。
同样，已知用于构建最小长度的载体的方法。工程化改造小的超螺旋DNA分子，该分子没有所有原核核苷酸序列，并且仅包含复制起点和抗生素抗性基因(所谓的“微环”)。使用噬菌体
Figure BDA0002391621880000041
通过整合酶介导的分子内整合产生载体(Chen ZY,He CY,Ehrhardt A,Kay MA.Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistentand high-level transgene expression in vivo.Mol Ther.2003.8(3):495-500)。此类质粒载体的缺点包括其生成的复杂性和不可能以工业规模构建它们。
在专利申请号US 2011152377/10中报道了一项发明，该专利描述了没有对抗生素的抗性的表达构建体的制备，该表达构建体包含编码阻遏蛋白的多核苷酸。所述阻遏蛋白的表达调节整合到大肠杆菌基因组区域中的毒性基因产物的表达。然而，与基于阻遏蛋白的使用的其他任何选择方法一样，该方法以不稳定且低效的转化为特征。
专利号US9644211描述了用于产生最小长度的载体(“微环”)的方法。该载体不含原核生物，并且在培养的大肠杆菌菌株中由parA介导的重组产生。这种产生最短载体的方法的缺点是不可能在工业规模上使用它。
就使用重组DNA载体进行基因疗法而言，本发明的原型是生成用于基因免疫的重组载体的方法(专利号US 9550998)。质粒载体是超螺旋质粒DNA载体，其用于在人和动物细胞中表达克隆的基因。载体包含复制起点、包含人巨细胞病毒启动子和增强子的调节元件和来自人T细胞亲淋巴病毒的调节序列。
通过依靠噬菌体对菌株施用的基因sacB的反义补偿在无抗生素的专用大肠杆菌菌株中积累载体。该DNA载体在基因疗法中的使用受到病毒基因组调节序列的限制。
发明概述
本发明的目的是构建用于人和动物细胞遗传修饰的基因疗法DNA载体，该载体将合理地组合以下项：
I)由于基因疗法DNA载体中不存在抗生素抗性基因而在人和动物的基因疗法中的安全使用的可能性；
II)确保对靶细胞的有效基因递送的长度；
III)调节元件的存在，所述调节元件确保靶基因的有效表达，而不以病毒基因组的核苷酸序列代表；
IV)工业规模的可生产性和可构建性。
第I项是至关重要的，并且本文符合国家监管机构对基因疗法药物的要求，尤其是欧洲药物管理局的要求提供以避免将抗生素抗性标志物基因添加到基因疗法的新近工程化质粒(开发期间基因疗法药物品的设计修改的反思文章(Reflection paper on designmodifications of gene therapy medicinal products during development)/2011年12月14日先进疗法EMA/CAT/GTWP/44236/2009委员会)。
通过首先构建含有核苷酸序列SEQ ID No.1的用于动物和人细胞的遗传修饰的3165bp基因疗法DNA载体VTvaf17来实现特定目的。构建3165bp基因疗法DNA载体VTvaf17的方法包括：首先构建在下一阶段的4182bp载体，然后通过SpeI限制性位点将它切割，并且将剩余的片段与其自身连接，该4182bp载体含有具有内在增强子的人延伸因子EF1A的1188bp启动子区、具有限制性内切核酸酶BamHI、EcoRV、SaII、HindIII、KpnI、EcoRI的位点的35bp多接头、人生长因子的466bp转录终止子和多腺苷酸化序列、允许无抗生素的阳性选择的转座子Tn10的136bp调节元件RNA-OUT、具有单核苷酸取代以增加大多数大肠杆菌菌株细胞中的载体生成的用于自主复制的1299bp复制起点、1010bp卡那霉素抗性基因。通过获得用于生成基因疗法DNA载体VTvaf17或允许无抗生素的阳性选择的基于其的基因疗法DNA载体的大肠杆菌菌株SCS110-AF来实现规定的目的。获得用于生成基因疗法DNA载体VTvaf17或基于其的基因疗法DNA载体的大肠杆菌SCS 110-AF菌株的方法包括构建64bp的线性DNA片段，然后通过电穿孔转化大肠杆菌细胞，并挑选出在含10μg/ml氯霉素的培养基中存活的克隆，该线性DNA片段含有允许无抗生素的阳性选择的转座子Tn10的调节元件RNA-IN、1422bp果聚糖蔗糖酶基因sacB(其产物确保在含蔗糖的培养基中进行选择)、挑出发生同源重组的菌株克隆需要的763bp氯霉素抗性基因catR、确保与基因失活同时的基因recA区域中的同源重组的两个同源序列329bp和233bp。还构建了携带基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17(在俄罗斯国家工业微生物保藏中心以编号B-12990，国际保藏机构编号NCIMB 42801登记)，用于允许无抗生素的选择的其进一步开发。获得携带基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110-AFA/Tvaf17(在俄罗斯国家工业微生物保藏中心以编号B-12990，国际保藏机构编号NCIMB 42801登记)的方法包括制备大肠杆菌菌株SCS110-AF的电感受态细胞，并且用基因疗法DNA载体VTvaf17对这些细胞进行电穿孔。之后，将细胞倒入具有含有选择性培养基的琼脂板(培养皿)中，所述选择性培养基含有酵母浸膏、蛋白胨、6％蔗糖和10μg/ml氯霉素。
附图简述
在附图中解释了本发明的实质，其中
图1
显示了基因疗法DNA载体VTvaf17的结构，该载体是能够在大肠杆菌细胞中自主复制的3165bp环状双链DNA分子。
图1标记了载体的以下结构元件：
(1)EF1a(1至1188bp)——具有在基因的第一个内含子中含有的内在增强子的人延伸因子EF1A的启动子区域。它确保了重组基因在大多数人组织中的有效转录。
(2)MCS(1208至1243bp)——含有限制性酶BamHI、EcoRV、SaII、HindIII、KpnI和EcoRI序列并允许克隆靶治疗基因的多接头(多个克隆位点)。
(3)hGH-TA(1244至1710bp)——人生长因子基因的转录终止子和聚腺苷酸化序列。
(4)RNA-out(1717至1853bp)——转座子Tn 10的调节元件RNA-OUT，在使用大肠杆菌SCS 110菌株的情况中允许无抗生素的阳性选择。
(5)ori(1866至3165bp)——用于自主复制的复制起点，其具有单核苷酸取代以增加大多数大肠杆菌菌株细胞中质粒的产生。
图2
显示了用于生成大肠杆菌SCS 110菌株的大肠杆菌基因recA区域中同源重组的DNA片段的结构。
线性片段由盒组成，所述盒携带用于无抗生素选择的转座子Tn10调节元件RNA-IN(64bp)、果聚糖蔗糖酶基因sacB(其产物确保在含蔗糖的培养基中进行选择)(1422bp)、和挑选出发生同源重组的菌株克隆需要的氯霉素抗性基因catR(763bp)。该盒的侧翼有两个同源臂，它们确保与基因失活同时的基因recA区域中的重组过程(左臂和右臂分别为329-bp和233-bp)。
图3
显示了用质粒载体pEFGP-C1(Clontech)和DNA载体VTvaf17-eGFP(А)转染细胞后48小时HEK-293细胞培养物的荧光显微成像，以及用质粒载体pEFGP-C1(Clontech)和DNA载体VTvaf17-eGFP(B)转染细胞后48小时从HEK-293细胞中提取的蛋白质发出的荧光图，以比较用质粒载体pEFGP-C1(Clontech)和DNA载体VTvaf17-eGFP转染细胞后48小时在HEK-293细胞中的靶基因产物，例如绿色荧光蛋白(GFP)的积累水平。
图4
显示了用携带人弹性蛋白基因编码区的DNA载体VTvaf17-ELN转染这些细胞前和转染后48小时的角质形成细胞HaCaT中弹性蛋白基因mRNA的积累模式，以分析用携带人弹性蛋白基因编码区的DNA载体VTvaf17-ELN转染这些细胞前和转染后48小时的角质形成细胞HaCaT中靶基因mRNA，例如弹性蛋白基因mRNA的积累。
图5
显示了将携带人弹性蛋白基因编码区的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN注射到这些患者的皮肤中后这些患者的皮肤活组织检查样品中的弹性蛋白蛋白浓度图，以分析对人皮肤施用携带靶基因，例如人弹性蛋白基因的基因疗法DNA载体VTvaf17后人皮肤中弹性蛋白蛋白浓度的变化。
图6
显示了用DNA载体VTvaf17和携带绿色荧光蛋白编码区的DNA载体VTvaf17-eGFP转染细胞后48小时的牛肾细胞MDBK中绿色荧光蛋白(GFP)浓度变化的图，以比较用DNA载体VTvaf17和携带绿色荧光蛋白编码区的DNA载体VTvaf17-eGFP转染细胞后48小时的牛肾细胞MDBK中靶基因产物，例如绿色荧光蛋白(GFP)的积累水平。
本发明的实施方案
在以下实施例中解释本发明的实质。
实施例1。
基因疗法DNA载体VTvaf17的生成，该载体含有具有内在增强子的人延伸因子基因EF1A的启动子、多接头、人生长因子的转录终止子和聚腺苷酸化序列、转座子Tn10的调节元件RNA-OUT和具有单核苷酸取代以增加质粒产生的复制起点。
通过整合6个源自不同来源的DNA片段构建基因疗法DNA载体VTvaf17：
(a)通过使用寡核苷酸Ori-F、Ori-R、Ori-M1和Ori-M2(序列表，(1)-(4))对商品化质粒pBR322的区域进行PCR扩增产生复制起点；
(b)通过使用寡核苷酸EF1-F和EF1-R(序列表，(5)和(6))对人基因组DNA的位点进行PCR扩增产生启动子区域EF1α；
(c)通过使用寡核苷酸hGH-F和hGH-R(序列表，(7)和(8))对人基因组DNA的位点进行PCR扩增产生转录终止子hGH-TA；
(d)从寡核苷酸RO-F、RO-R、RO-1、RO-2和RO-3(序列表，(9)-(13))合成转座子Tn10的调节位点RNA-OUT；
(e)通过使用寡核苷酸Kan-F和Kan-R(序列表，(14)和(15))对商品化质粒pET-28的位点进行PCR扩增产生卡那霉素抗性基因；
(f)通过退火两个合成的寡核苷酸MCS1和MCS2(序列表，(15)和(16))产生多接头。
使用商品化试剂盒
Figure BDA0002391621880000081
高保真性DNA聚合酶(New England Biolabs)按照制造商的说明进行PCR扩增。片段具有重叠区域，允许它们与随后的PCR扩增合并。使用寡核苷酸Ori-F和EF1-R(序列列表(1)和(6))整合片段(a)和(b)，并使用寡核苷酸hGH-F和Kan-R(序列表，(7)和(15))整合片段(c)、(d)和(e)。之后，通过限制整合产生的位点，随后通过位点BamHI和NcoI连接。这导致质粒仍然缺乏多接头。为了引入它，通过位点BamHI和EcoRI切割质粒，然后与片段(f)连接。因此，构建携带侧翼有SpeI限制性位点的卡那霉素抗性基因的4182bp载体。然后，通过SpeI限制性位点切割该位点，并且将剩余片段与其自身连接。这产生3165bp的基因疗法DNA载体VTvaf17，其是重组的并且允许无抗生素的选择(SEQ IDNo.1)。
实施例2。
为了证明DNA载体VTvaf17的效率，将靶基因，例如将绿色荧光蛋白(GFP)基因克隆到多接头。
基因疗法DNA载体VTvaf17-eGFP的生成，该载体携带编码靶基因的位点，例如编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因。通过使用寡核苷酸MVGFP-F和MVGFP-R(序列表，(30)和(31))对商品化质粒pEGFP-C1(Clontech)进行PCR扩增来产生绿色荧光蛋白基因的编码区。通过限制性内切核酸酶BamHI和EcoRI切割产生的PCR片段，并与携带卡那霉素抗性基因并通过相同的酶切割的4182bp DNA载体连接。进而，如实施例1中所述，从产生的载体中除去卡那霉素抗性基因。这产生3874bp的DNA载体VTvaf17-eGFP，允许无抗生素的选择。
实施例3。
为了证明DNA载体VTvaf17的效率，将靶基因，例如人弹性蛋白编码基因克隆到多接头。
DNA载体VTvaf17-ELN的生成，该载体携带编码靶基因的区域，例如人弹性蛋白编码基因。通过从患者的皮肤活组织检查样品中提取总RNA并随后进行逆转录和PCR扩增产生弹性蛋白基因的长2175bp的编码区(SEQ ID No.2)。使用皮肤活组织检查设备Epitheasy3.5(Medax SRL)从前臂区域的完整皮肤中取样材料。患者的皮肤预先用无菌盐水冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。活组织检查样品的大小约2х2х2mm，并且重量多达20mg。将样品置于1ml Trizol试剂(ThermoFisher Scientific)中，匀浆并在65℃加热5分钟。将样品以14000g离心10分钟，然后以65℃再次加热10分钟。然后加入200μl氯仿，将混合物轻轻搅拌并以14000g离心10分钟。然后分离出水相，并与1/10体积的3М乙酸钠pH5.2和等体积的异丙醇混合。将样品在-20℃温育10分钟，然后以14000g离心10分钟。将包装的细胞在1ml的70％乙醇中冲洗，风干并溶于10μl无RNA酶的水中。为了合成人弹性蛋白基因cDNA的第一条链，使用Mint逆转录酶(Evrogen，俄罗斯)。将4μl的Mint缓冲液、2μl二硫苏糖醇、2μl的dNTP混合物、2μl的每种寡核苷酸ELN-F和ELN-R(序列表，(32)和(33))和2μl的Mint逆转录酶添加至6μl的总RNA中，并将混合物在42℃温育2小时。合成的cDNA用作使用寡核苷酸ELN-F和ELN-R(序列表，(32)和(33))的PCR扩增的基质，所述PCR扩增在94℃进行3分钟；30个循环：在94℃下持续20秒，在60℃下持续20秒和在72°С下持续60秒，最终延伸在72℃下持续5分钟。通过限制性内切核酸酶BamHI和EcoRI切割产生的PCR片段，并与携带卡那霉素抗性基因的4182bp载体连接，并通过相同的酶切割。进而，如实施例1中所述，从产生的载体中除去卡那霉素抗性基因。这产生了5322bp的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN，其携带编码弹性蛋白基因的区域并允许无抗生素的选择。
实施例4。
工程化改造大肠杆菌菌株SCS 110-AF，其用于生成基因疗法DNA载体VTvaf17和基于其的基因疗法载体。
用于工程化改造基因疗法DNA载体VTvaf17和基于其的基因疗法载体的大肠杆菌菌株SCS 110-AF通过对其染色体，特别是基因recA区域施用线性片段进行同源重组而产生，该线性片段含有允许无抗生素的阳性选择的转座子Tn10的调节元件RNA-IN(64bp)、果聚糖蔗糖酶基因sacB(其产物确保在含蔗糖的培养基内进行选择)(1422bp)、挑出发生同源重组的菌株克隆需要的氯霉素抗性基因catR(763bp)、和确保与基因失活同时的基因recA区域中的同源重组的两个同源序列(同源臂)(左臂和右臂分别为329bp和233bp)。
为了合成左和右同源臂，使用大肠杆菌SCS 110(Agilent Technologies)的基因组DNA作为基质，对基因recA的片段进行PCR扩增。为了合成左同源臂，使用引物LHA-F和LHA-R(序列表，(18)和(19))，而为了合成右同源臂，使用引物RHA-F和RHA-R(序列表，序列表，(28)和(29))。用合成寡核苷酸IN-F、IN-1、IN-2、IN-R(序列表，(20)、(21)、(22)、(23))对RNA-IN片段加尾。通过使用基因组DNA枯草芽孢杆菌168HT作为基质，并且使用SacB-F和SacB-R作为引物(序列表，(24)和(25))进行PCR扩增产生sacB基因。为了合成基因catR，使用大肠杆菌菌株BL21 pLysS作为基质，并且使用CatR-F和CatR-R(序列表，(26)和(27))作为引物进行PCR扩增。将PCR产物LHA(左同源臂)、SacB和RHA(右同源臂)在94℃扩增3分钟；30个循环：在94°С下持续20秒，在60°С下持续20秒，在72°С下持续60秒，最终延伸在72°С下持续5分钟。使用寡核苷酸IN-F、IN-1、IN-2、IN-R(序列表，(20)、(21)、(22)、(23))将PCR产物RNA-IN在94℃下合成3分钟；30个循环：在94°С持续10秒，在60°С持续10秒，在72°С持续10秒来组装片段。为此，使用10μM引物IN-F和IN-R，以及5μM的引物IN-1和IN-2。使用商品化试剂盒
Figure BDA0002391621880000101
高保真性DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific)按照制造商的说明进行PCR扩增。
通过整合5个PCR产物合成用于同源重组的线性片段。所有5个产物具有重叠的区域，以便随后组装成单一片段。将所有片段以10ng的等分试样在50μl体积中混合。在不添加引物的情况下将PCR产物在94°С衍生3分钟；10个循环：在94°С下持续30秒，在60°С下持续30秒和在72°С下持续2分钟。然后添加引物LHA-F，RHA-R(序列表，(18)，(19))，并再进行25个PCR循环：94°С持续30秒，60°С持续30秒和72°С持续2分钟，最终延伸在72°С持续5分钟。这产生具有以下结构的长2811bp的PCR片段：LHA-RNA-IN-SacB-CatR-RHA。使用DNA洗脱试剂盒(俄罗斯BioSilica)根据制造商的说明从琼脂糖凝胶中制备性回收该片段。
为了合成大肠杆菌SCS 110-AF菌株，制备电感受态细胞。为此，使用大肠杆菌SCS110菌株(Agilent Technologies)的单菌落感染10ml LB肉汤，并将细胞在定轨摇动器中以150rpm和37℃培养过夜。次日，将1/20再分配到100ml LB肉汤中，并在定轨摇动器上以150rpm和37℃培养，以达到OD600＝0.5。达到所需的光密度后，将细胞冷却至0℃，并以4000g离心10分钟。然后，除去培养基，并用100ml冰冷的双蒸馏水冲洗细胞两次以除去残留的培养基，然后用20ml的10％甘油冲洗。之后，将细胞重悬于1ml的10％甘油中并用于转化。
通过使用Gene Pulser Xcell(美国Bio-Rad)以2kV，200Ohm，25μF在1mm皿中进行电穿孔用产生的线性片段进行转化。脉冲持续时间为4.9ms至5.1ms。之后，将细胞在30℃的培养箱摇动器中在SOC培养基中培养2.5小时。然后将细胞倒入含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板(培养皿)中。将细胞在30℃下培养48小时。在含有酵母浸膏(yeastrel)、蛋白胨、6％蔗糖和10μg/ml氯霉素的选择性培养基中测试挑出的克隆的存活。所得菌株的基因型为recArpsL(Strr)thr leu endA thi-1lacYgalKgalTaratonAtsx dam dcm supE44Δ(lac-proAB)[F′traD36 proABlacIq ZΔM15]ChmRsacB+。
实施例5。
构建携带基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17(在俄罗斯国家工业微生物保藏中心以编号В-12990，国际保藏机构编号NCIMB 42801登记)，用于其进一步开发。
为了制备大肠杆菌SCS110-AF菌株的电感受态细胞，使用单菌落感染10ml LB肉汤，并将细胞在定轨摇动器中以150rpm和37℃培养过夜。次日，将1/20再分配到100ml LB肉汤中，并在定轨摇动器上以150rpm和37℃培养，以达到OD600＝0.5。达到所需的光密度后，将细胞冷却至0℃，并以4000g离心10分钟。然后除去培养基，并用100ml冰冷的双蒸馏水冲洗细胞两次以除去残留的培养基，然后用20ml的10％甘油冲洗。之后，将细胞重悬于1ml的10％甘油中，并用于通过电穿孔进行转化。使用Gene Pulser Xcell(Bio-Rad,美国)在1mm皿中以2kV，200Ohm，25μF进行电穿孔。脉冲的持续时间为4.9ms至5.1ms，并且使用1-10ng的载体。之后，将细胞在30℃的培养箱摇动器中在SOC培养基中培养2.5小时。然后将细胞倒入含有选择性培养基的琼脂板(培养皿)中，该选择性培养基包含酵母浸膏、蛋白胨、6％蔗糖和10μg/ml氯霉素。该程序产生携带基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17(在俄罗斯国家工业微生物保藏中心以编号В-12990，国际保存机构编号NCIMB42801登记)。48小时后，用单菌落感染10ml含有酵母浸膏、蛋白胨、6％蔗糖和10μg/ml氯霉素的液体选择培养基，并将该培养基在定轨摇动器中以150rpm和37°С培养过夜。次日，将细胞沉淀，并使用GeneJET质粒微量制备试剂盒(Thermo Fisher Scientific)按照生产商的说明通过碱裂解法提取DNA载体。
实施例6。
为了证明基因疗法DNA载体VTvaf17的效率，将靶基因，例如绿色荧光蛋白(GFP)编码基因克隆到多接头。
用质粒载体pEFGP-C1(Clontech)和基因疗法DNA载体VTvaf17-eGFP转染后48小时比较HEK-293细胞中靶基因，例如绿色荧光蛋白(GFP)的积累水平。
为了测量HEK-293细胞(用腺病毒5DNA转化的人胚胎肾细胞，ATCC CRL-1573)中绿色荧光蛋白(GFP)的积累水平，用质粒载体pEFGP-C1(Clontech)和基因疗法DNA载体VTvaf17-eGFP转染细胞。
以5％CО2覆盖，370С将细胞在含有10％胎牛血清(ThermoFisher Scientific，美国)、4.5g/l葡萄糖和10μg/ml庆大霉素的DMEM培养基(ThermoFisher Scientific，美国)中培养。为了达到90％汇合，在转染程序前24小时将细胞以每孔4*104个细胞的量接种到24孔板中。使用Lipofectamine 3000(ThermoFisher Scientific，美国)作为转染试剂。在试管1中，将1μl质粒载体pEFGP-C1和基因疗法DNA载体VTvaf17-eGFP(各500ng/μl)溶液和1μl试剂Р3000添加到25μl培养基Opti-MEM(Gibco)中。通过轻轻摇动将制备物混合。在试管2中，将1μl的Lipofectamine 3000溶液添加到25μl的培养基Opti-MEM(Gibco)。通过轻轻摇动将制备物混合。将来自试管1的内容物添加到试管2的内容物中，并将混合物在室温下温育5分钟。将所得溶液以40μl的体积滴加到细胞中。
48小时后，使用具有485/535nm滤光片组的Olympus ix53荧光显微镜(日本)记录结果(图3А)。这些结果证明与用质粒载体pEFGP-C1(Clontech)转染相同细胞相反，用基因疗法DNA载体VTvaf17-eGFP转染HEK-293细胞引起绿色荧光蛋白积累的显著增加。
通过测量从转染的细胞系中提取的蛋白质的荧光来记录结果。为此，通过移液从孔中冲洗细胞，并以6000rpm沉淀10分钟，冲洗两次，然后将包装的细胞重悬于1ml磷酸钠缓冲液中。在三个冷冻/融化循环中以-70 0C裂解细胞。然后将裂解的细胞匀浆以13000g沉淀15分钟。将上清液转移到96孔培养板(Grainer Bio-one)中，每个样品一式四份，然后使用Fluoroskan Ascent微孔板荧光计(Labsystems)测量GFP的相对荧光(吸收455nm/发射538nm)。根据样品中总蛋白浓度对结果值进行标准化，该总蛋白浓度通过Bradford蛋白测定法进行测量。为此，将考马斯亮蓝R-250用作染料。用水将每个重复在96孔板的孔(每个样品4个重复)中稀释100倍，然后加入染料。之后，使用Multiskan Ascent(Thermo)在620nm下测量所有样品的光密度。将所得值与用用一系列从20-2.5μg/ml的连续稀释液得到的针对牛血清白蛋白(Bio-Rad)构建的校准曲线进行比较。使用以下公式进行计算：
∑蛋白质含量(μg)＝{[x]-σ}÷k*M，
其中[x]是每个样品的四个重复的OD620平均值，σ——均值偏差，k是BSA校准曲线的斜率系数，М是样品的稀释倍数。
根据从细胞中提取的蛋白质的总浓度值，使用以下公式对样品中的GFP荧光进行标准化：
OEn＝[OE]÷∑蛋白质含量(mg)
其中
[ОЕ]是每个样品的四次重复的平均值，以相对荧光单位(RFU)计。
结果显示在图3B中，并且证明了与用质粒载体pEFGP-C1(Clontech)转染相同细胞相反，用基因疗法DNA载体VTvaf17-eGFP转染HEK-293细胞使绿色荧光蛋白的积累水平倍增。
实施例7。
为了证明基因疗法DNA载体VTvaf17的效率，将靶基因，例如弹性蛋白编码基因克隆到多接头。
分析用携带人弹性蛋白基因编码区的DNA载体VTvaf17-ELN转染这些细胞后48小时，在角质形成细胞HaCaT中靶基因，例如弹性蛋白基因的mRNA积累的变化。
以5％的CО2覆盖37℃将HaCaT细胞(永生化人角质形成细胞，ThermoFisherScientific，美国)在含有10％胎牛血清(ThermoFisher Scientific，美国)、4.5g/l葡萄糖和2mM谷氨酰胺的DMEM培养基(ThermoFisher Scientific，美国)中培养。为了达到90％汇合，在转染程序之前24小时，将细胞以每孔5*104个细胞的数量接种到24孔板中。使用Lipofectamine 3000(ThermoFisher Scientific，美国)作为转染试剂。按照实施例6中描述的方法，用表达人弹性蛋白基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN转染细胞。将用基因疗法DNA载体VTvaf17转染的HaCaT细胞作为参考。根据实施例3中所述的程序从转染的细胞中提取总RNA并构建第一条cDNA链。为了测量转染后弹性蛋白基因mRNA的表达水平，使用实时PCR(SYBR Green Real Time PCR)。为了扩增人弹性蛋白cDNA，使用寡核苷酸EL1F和EL1R(参见序列表，(34)，(35))。扩增产物的长度是227bp。Beta-2微球蛋白(B2M)用作参考基因。
使用QuantiTect SYBR Green RT-PCR试剂盒(美国，Qiagen)或另一种实时PCR试剂盒，在20μl含有25μl QuantiTect SYBR Green RT-PCR主混合物、2.5mM氯化镁、0.5μM每种引物和5μl总RNA的扩增混合物中进行PCR扩增。为了进行扩增，在以下条件下使用CFX96反应模块(Bio-Rad，美国)：1个循环，在42℃逆转录30分钟，在98℃变性15分钟，然后进行40个循环，包括在94℃变性15s，在60℃下引物退火30s，在72℃下延伸30s。阳性对照包括对以含有基因ELN和B2M的cDNA序列的已知浓度的质粒代表的基质从PCR得到的扩增子。阴性对照包括去离子水。使用Bio-Rad CFX Manager 2.1软件进行PCR产物，即通过扩增得到的ELN和B2M基因cDNA的实时定量。
为了证明在用携带编码弹性蛋白基因的区域的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN转染人角质形成细胞后这些细胞中ELN基因表达的增加，图3显示了与以下对应的PCR产物的积累的图：
1-用基因疗法载体VTvaf17转染后的ELN基因的cDNA；
2-用携带弹性蛋白基因编码区的基因疗法载体VTvaf17-ELN转染后的ELN基因的cDNA；
3-用基因疗法载体VTvaf17转染后的B2M基因cDNA；
4-用携带弹性蛋白基因编码区的基因疗法载体VTvaf17-ELN转染后的B2M基因的cDNA。
从该图可以看出，用携带靶基因，例如人弹性蛋白基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN转染引起人弹性蛋白基因特异性cDNA的水平大量上升。
实施例8。
为了证明基因疗法DNA载体VTvaf17的效率，该靶基因例如是弹性蛋白编码基因被克隆到多接头上。
测量了在人体皮肤中注射带有靶标基因例如人类弹性蛋白基因的治疗DNA载体VTvaf17后，人皮肤中弹性蛋白蛋白浓度的变化。
为了分析弹性蛋白蛋白浓度的变化，将携带编码弹性蛋白基因的区域的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN注射到三名特征为可见的年龄特异性变化的患者的前臂皮肤中，同时引入安慰剂，该安慰剂是缺乏ELN基因cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17。患者1，女性，56岁龄，衰老，特征为细纹(P1)；患者2，女性，67岁龄，衰老，特征为变形或深沟(P2)；患者3，男性，60岁龄，衰老，特征为变形(P3)。
用30G针使用隧道法对于每种遗传构建体以1mg的数量将基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)和携带编码弹性蛋白基因的区域的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN注射到3mm的深度。对于每个遗传构建体，基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)和携带编码弹性蛋白基因的区域的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN的注射溶液的体积为0.3ml。每个遗传构建体的引入点以5至10cm的间隔定位。
在引入基因疗法DNA载体后的第二天采集活组织检查样品。使用皮肤活组织检查设备Epitheasy 3.5(Medax SRL)，在引入携带编码弹性蛋白基因的区域的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN(I)，基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)(II)的区域从患者皮肤，以及从完整的皮肤(III)中采集活组织检查样本。患者的皮肤初步用无菌盐水冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。活组织检查样品的大小为约2х2х2mm，并且重量多达10mg。将样品置于含有50mM的Tris-HCl，pH 7.6，100mM NaCl，1mM的EDTA和1mM的苯基甲基磺酰氟的缓冲溶液中，并且均质化以获得均质化的悬浮液。然后将悬浮液以14,000g离心10分钟。收集上清液并用于测定靶蛋白。
使用针对弹性蛋白(ELN)的酶联免疫吸附测定试剂盒(SEN337Hu，Cloud-CloneCorp.，美国)通过酶联免疫吸附测定法对患者皮肤活组织检查样品中的弹性蛋白进行定量。
从试剂盒中，使用吸附到微孔板孔的针对弹性蛋白的高特异性抗体。将100μl每种稀释的参考样品和测试样品添加至孔，并在37℃下温育2小时。然后添加100μl试剂А，将板用粘合带覆盖并在37℃下温育1小时。然后，将孔用350μl洗涤缓冲液冲洗3次，并加入100μl试剂В，随后在37℃下温育30分钟。温育后，将孔用350μl洗涤缓冲液洗涤5次，添加90μl底物溶液，并在37℃下温育20-25分钟。通过添加50μl抑制剂去除缓冲液终止反应，并使用全自动生化分析仪和酶联法测定法ChemWell(Awareness Technology Inc.，美国)在450nm处测量光密度。为了测量浓度的数值，使用具有已知浓度的弹性蛋白的来自试剂盒的参考样品构建校准曲线。R-3.0.2用于结果的统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。
与缺乏编码人弹性蛋白基因的区域的基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的引入区域中弹性蛋白的浓度相比，三位患者中每位患者的皮肤在引入携带靶基因，例如人弹性蛋白基因的基因疗法DNA载体VTvaf17的区域表明弹性蛋白的浓度增加。患者P1、P2和P3的皮肤中弹性蛋白浓度的所得值在图5中显示。
实施例9。
为了证明基因疗法DNA载体VTvaf17的效率，将牛肾细胞MDBK中的靶基因，例如绿色荧光蛋白(GFP)编码基因克隆到多接头。
比较用基因疗法DNA载体VTvaf17-eGFP转染细胞后48小时牛肾细胞MDBK中的靶基因，例如绿色荧光蛋白(GFP)的积累水平。
为了量化MDBK细胞(牛肾细胞，ATCC CLL-22)中绿色荧光蛋白(GFP)的积累水平，用基因疗法DNA载体VTvaf17-eGFP转染细胞。
以5％CO2覆盖37℃将细胞在含有10％胎牛血清(ThermoFisher Scientific，美国)、1g/l葡萄糖和2mM谷氨酰胺的MEM培养基(ThermoFisher Scientific，美国)中培养。为了达到90％汇合，在转染程序前24小时将细胞以每孔3*104个细胞的数量接种到24孔板中。使用Lipofectamine 3000(ThermoFisher Scientific，美国)作为转染试剂。根据实施例6中所述的程序进行转染。将不含绿色荧光蛋白基因的重组基因疗法载体VTvaf17用作参考。如实施例6所述，通过测量从转染的细胞系提取的蛋白质的荧光来记录结果。
结果显示在图6中，并且使我们得出结论，用携带绿色荧光蛋白基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-eGFP转染牛肾细胞系MDBK导致与缺乏绿色荧光蛋白基因的基因疗法载体VTvaf17转染相同细胞比较更高的绿色荧光蛋白的积累水平。
实施例10。
为了证明在工业规模上基因疗法DNA载体VTvaf17的可生产性和可构建性，进行携带基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠埃希氏菌菌株SCS110-AF/VTvaf17(在俄罗斯国家工业微生物保藏中心以编号В-12990，国际保藏机构号NCIMB 42801登记)的大规模发酵。
在10-l生物反应器/发酵罐中进行携带基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌SCS110-AF/VTvaf17菌株的发酵，随后提取基因疗法DNA载体VTvaf17。
对于大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17的发酵，制备含有(每10l体积)100g胰蛋白胨、50g酵母浸膏(Becton Dickinson)的培养基，然后用水将培养基稀释至8800ml，并在121℃高压灭菌20分钟，然后添加1200ml 50％(重量比体积)的蔗糖。之后，将大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17的种子培养物以100ml的体积接种到培养瓶中。将培养物在培养箱摇动器中于30℃温育16小时。将种子培养物转移至Techfors S生物反应器(Infors HT，瑞士)，并培养至稳定相。通过在600nm下测量培养物的光密度来控制该过程。将细胞以5000-10000g沉淀30分钟。去除上清液，并将细胞团粒重悬于10％(按体积计)的磷酸盐缓冲盐水中。将细胞再次以5000-10000g离心30分钟。除去上清液，将20mM Tris-HCl，1mM EDTA，200g/l蔗糖，pH 8.0的溶液以1000ml的体积添加到细胞团粒中，并将混合物充分搅拌成均质化的悬浮液。然后，添加蛋溶菌酶溶液至终浓度100μg/ml。在轻轻搅拌的情况下将混合物在冰上温育20分钟。然后，添加2500ml的0.2М的NaOH，10g/l的十二烷基硫酸钠(SDS)，在冰上在轻轻搅拌的情况下将混合物温育10分钟，然后添加3500ml的3M乙酸钠，2М乙酸，рH 5-5.5，并且在轻轻搅拌的情况下将混合物在冰上温育10分钟。将所得样品以15000g或更大的值离心20-30分钟。轻轻倒出溶液，并通过粗滤器(滤纸)除去残留的沉淀物。然后，添加RNA酶A(Sigma)至终浓度20μg/ml，并将该溶液在室温下温育过夜16小时。然后将溶液以15000g离心20-30分钟，然后通过0.45μm膜滤器(Millipore)。然后用100kDa的膜(Millipore)进行超滤，并用25mM Tris-HCl，pH 7.0的缓冲溶液将混合物稀释至初始体积。将此操作进行三到四次。将溶液应用到用25mM Tris-HCl，pH 7.0平衡的具有250ml DEAE Sepharose HP(GE，美国)的柱。应用样品后，用三个体积的相同溶液洗涤柱，然后使用25mM Tris-HCl(pH7.0)的线性梯度将基因疗法DNA载体VTvaf17洗脱5倍柱体积，以获得25mM Tris-HCl，pH7.0，1МNaCl的溶液。通过在260nm测量流出溶液的光密度来控制洗脱过程。将含有基因疗法DNA载体VTvaf17的层析级分连接在一起，并使用Superdex 200(GE，美国)进行凝胶过滤。用磷酸盐缓冲盐水平衡柱。通过在260nm测量流出溶液的光密度来控制洗脱过程，并通过琼脂糖凝胶电泳分析级分。将含有基因疗法DNA载体VTvaf17的层析级分连接在一起，并保持于-20℃。该产率足以大规模生产基因疗法DNA载体VTvaf17。
因此，已实现本发明的目的，特别是构建用于人和动物细胞遗传修饰的基因疗法DNA载体，其将合理地组合：
I)由于基因疗法DNA载体中不存在抗生素抗性基因而在人和动物的基因疗法中的安全使用的可能性；
II)确保对靶细胞的有效基因递送的长度；
III)调节元件的存在，所述调节元件确保靶基因的有效表达，而不以病毒基因组的核苷酸序列代表；
IV)工业规模的可生产性和可构建性，
并得到所附实施例的支持：对于I项——实施例1；对于II项——实施例1、6、7、8、9；对于III项——实施例1、6、7、8、9；对于IV项——实施例5、10。
工业适用性
以上列出的所有实施例均支持以下各项的工业实用性：所提出的基因疗法DNA载体VTvaf17及其生产方法、用于构建DNA载体VTvaf17以及基于其的携带靶基因的基因疗法DNA载体的遗传修饰的菌株大肠杆菌SCS110-AF、以及生产大肠杆菌菌株SCS110-AF的方法、用于构建它的携带基因疗法DNA载体VTvaf17的经遗传修饰的菌株大肠杆菌SCS110-AF/VTvaf17(在俄罗斯国家工业微生物保藏中心以编号В-12990，国际保藏机构号NCIMB42801登记)、以及生产大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17的方法。
序列表寡核苷酸：
(1)寡核苷酸ORI-F AGTCCATGGCTGCCTCGCGCGTTTCG
(2)寡核苷酸ORI-R AGCCTCACGGGAGTCAGGCAACTATG
(3)寡核苷酸Ori-M1 CTACACTAGAAGAACAGTATTTG
(4)寡核苷酸Ori-M2 CAAATACTGTTCTTCTAGTGTAG
(5)寡核苷酸EF1-F CCTGACTCCCGTGAGGCTCCGGTGCC
(6)寡核苷酸EF1-R TCGGATCCTGGCTTTTAGGGGTAGTTTTC
(7)寡核苷酸hGH-F AGGATCCGAATTCCCTGTGACCCCTCCCCAG
(8)寡核苷酸hGH-R CTCTTTACCAATTCTACGCGTAAGGACAGGGAAGGGAGCA
(9)寡核苷酸RO-F CTTCCCTGTCCTTACGCGTAGAATTGGTAAAGAGAGTCGT
(10)寡核苷酸RO-R CCGTAGAAAACTAGTTAATGATTTTTATCAAAATCATTAAG
(11)寡核苷酸RO-1 GAATTGGTAAAGAGAGTCGTGTAAAATATCGAGTTCGCACATCTTGTTG
(12)寡核苷酸RO-2 GATTTTTGGCGAAACCATTTGATCATATGACAAGATGTGTATCTACC
(13)寡核苷酸RO-3 ATGATTTTTATCAAAATCATTAAGTTAAGGTAGATACACATCTTGTC
(14)寡核苷酸Kan-F AAATCATTAACTAGTTTTCTACGGGGTCTGACGC
(15)寡核苷酸Kan-R CAGCCATGGACTAGTGGTGGCACTTTTCGGGGA
(16)寡核苷酸MCS1 GATCCGATATCGTCGACAAGCTTGGTACCG
(17)寡核苷酸MCS2 AATTCGGTACCAAGCTTGTCGACGATATCG
(18)寡核苷酸LHA-F 5’-gctgacgctgcaggtgatc
(19)寡核苷酸LHA-R 5’-gacaagatgtgtgtctaccgcttcaggttacccgccag
(20)寡核苷酸IN-F 5’-ctggcgggtaacctgaagcggtagacacacatcttgtc
(21)寡核苷酸IN-1 5’-atttttggcgaaaccattctatcatatgacaagatgtgtgtc
(22)寡核苷酸IN-2 5’-atatgatagaatggtttcgccaaaaatcaataatcagacaac
(23)寡核苷酸IN-R 5’-caaactttttgatgttcatcttgttgtctgattattg
(24)寡核苷酸SacB-F 5’-caataatcagacaacaagatgaacatcaaaaagtttg
(25)寡核苷酸SacB-R 5’-cttacgtgccgatcattatttgttaactgttaattgtc
(26)寡核苷酸CatR-F 5’-caattaacagttaacaaataatgatcggcacgtaagagg
(27)寡核苷酸CatR-R 5’-cgagacgaacagaggcgtagttacgccccgccctgccac
(28)寡核苷酸RHA-F 5’-tggcagggcggggcgtaactacgcctctgttcgtctcga
(29)寡核苷酸RHA-R 5’-ctcagcagcaactcacgtac
(30)寡核苷酸MVGFP-F 5’-GGATCCatggtgagcaagggcgaggagct
(31)寡核苷酸MVGFP-R 5’-GAATCCtcacaaattttgtaatccagag
(32)寡核苷酸ELN-F 5’-GGATCCATGGCGGGTCTGACGG
(33)寡核苷酸ELN-R 5’-GAATCCtcattttctcttccggccac
(34)寡核苷酸EL1F 5’-GAGTCCTCCTGCTCCTGCTGTCCAT
(35)寡核苷酸EL1R 5’-AAAGGTAACTGCGGGGAAGGCG
缩写列表
VTvaf17–基因疗法载体，其不含病毒基因组的序列和抗生素抗性标志物(载体治疗性无病毒无抗生素)
DNA–脱氧核糖核酸
cDNA–互补脱氧核糖核酸
RNA–核糖核酸
mRNA–信使核糖核酸
bp–碱基对
PCR–聚合酶链式反应
ml–毫升,μl–微升
l–升
μg–微克
mg–毫克
g–克
μmol–微摩尔
mM–毫摩尔
min–分钟
s–秒
rpm–每分钟转
nm–纳米
cm–厘米
mW-毫瓦
RFU–相对荧光单位
PBS–磷酸缓冲盐水
序列表
<110> 细胞基因治疗有限公司, 普罗里夫涅创新技术有限责任公司
<120> 基因疗法DNA载体VTvaf17、生成方法；大肠杆菌菌株SCS110-AF、生成方法；携带基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17、生成方法
<160> 2
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 3165
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaaa gtggcgcggg gtaaactggg 120
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240
gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300
gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360
agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420
gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480
ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540
tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600
tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660
ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720
ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780
tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840
aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900
gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960
cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020
tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080
ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140
cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta 1200
aaagccagga tccgatatcg tcgacaagct tggtaccgaa ttccctgtga cccctcccca 1260
gtgcctctcc tggccctgga agttgccact ccagtgccca ccagccttgt cctaataaaa 1320
ttaagttgca tcattttgtc tgactaggtg tccttctata atattatggg gtggaggggg 1380
gtggtatgga gcaaggggca agttgggaag acaacctgta gggcctgcgg ggtctattgg 1440
gaaccaagct ggagtgcagt ggcacaatct tggctcactg caatctccgc ctcctgggtt 1500
caagcgattc tcctgcctca gcctcccgag ttgttgggat tccaggcatg catgaccagg 1560
ctcagctaat ttttgttttt ttggtagaga cggggtttca ccatattggc caggctggtc 1620
tccaactcct aatctcaggt gatctaccca ccttggcctc ccaaattgct gggattacag 1680
gcgtgaacca ctgctccctt ccctgtcctt acgcgtagaa ttggtaaaga gagtcgtgta 1740
aaatatcgag ttcgcacatc ttgttgtctg attattgatt tttggcgaaa ccatttgatc 1800
atatgacaag atgtgtatct accttaactt aatgattttg ataaaaatca ttaactagtc 1860
catggctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg 1920
gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg 1980
tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga 2040
gtgtatactg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatgc 2100
ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt 2160
cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 2220
caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 2280
caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 2340
ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 2400
cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 2460
ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 2520
tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 2580
gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 2640
ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 2700
ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 2760
gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 2820
aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 2880
tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 2940
ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 3000
tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 3060
aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 3120
tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actcc 3165
<210> 2
<211> 2175
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
atggcgggtc tgacggcggc ggccccgcgg cccggagtcc tcctgctcct gctgtccatc 60
ctccacccct ctcggcctgg aggggtccct ggggccattc ctggtggagt tcctggagga 120
gtcttttatc caggggctgg tctcggagcc cttggaggag gagcgctggg gcctggaggc 180
aaacctctta agccagttcc cggagggctt gcgggtgctg gccttggggc agggctcggc 240
gccttccccg cagttacctt tccgggggct ctggtgcctg gtggagtggc tgacgctgct 300
gcagcctata aagctgctaa ggctggcgct gggcttggtg gtgtcccagg agttggtggc 360
ttaggagtgt ctgcaggtgc ggtggttcct cagcctggag ccggagtgaa gcctgggaaa 420
gtgccgggtg tggggctgcc aggtgtatac ccaggtggcg tgctcccagg agctcggttc 480
cccggtgtgg gggtgctccc tggagttccc actggagcag gagttaagcc caaggctcca 540
ggtgtaggtg gagcttttgc tggaatccca ggagttggac cctttggggg accgcaacct 600
ggagtcccac tggggtatcc catcaaggcc cccaagctgc ctggtggcta tggactgccc 660
tacaccacag ggaaactgcc ctatggctat gggcccggag gagtggctgg tgcagcgggc 720
aaggctggtt acccaacagg gacaggggtt ggcccccagg cagcagcagc agcggcagct 780
aaagcagcag caaagttcgg tgctggagca gccggagtcc tccctggtgt tggaggggct 840
ggtgttcctg gcgtgcctgg ggcaattcct ggaattggag gcatcgcagg cgttgggact 900
ccagctgcag ctgcagctgc agcagcagcc gctaaggcag ccaagtatgg agctgctgca 960
ggcttagtgc ctggtgggcc aggctttggc ccgggagtag ttggtgtccc aggagctggc 1020
gttccaggtg ttggtgtccc aggagctggg attccagttg tcccaggtgc tgggatccca 1080
ggtgctgcgg ttccaggggt tgtgtcacca gaagcagctg ctaaggcagc tgcaaaggca 1140
gccaaatacg gggccaggcc cggagtcgga gttggaggca ttcctactta cggggttgga 1200
gctgggggct ttcccggctt tggtgtcgga gtcggaggta tccctggagt cgcaggtgtc 1260
cctggtgtcg gaggtgttcc cggagtcgga ggtgtcccgg gagttggcat ttcccccgaa 1320
gctcaggcag cagctgccgc caaggctgcc aagtacggag tggggacccc agcagctgca 1380
gctgctaaag cagccgccaa agccgcccag tttgggttag ttcctggtgt cggcgtggct 1440
cctggagttg gcgtggctcc tggtgtcggt gtggctcctg gagttggctt ggctcctgga 1500
gttggcgtgg ctcctggagt tggtgtggct cctggcgttg gcgtggctcc cggcattggc 1560
cctggtggag ttgcagctgc agcaaaatcc gctgccaagg tggctgccaa agcccagctc 1620
cgagctgcag ctgggcttgg tgctggcatc cctggacttg gagttggtgt cggcgtccct 1680
ggacttggag ttggtgctgg tgttcctgga cttggagttg gtgctggtgt tcctggcttc 1740
ggggcagtac ctggagccct ggctgccgct aaagcagcca aatatggagc agcagtgcct 1800
ggggtccttg gagggctcgg ggctctcggt ggagtaggca tcccaggcgg tgtggtggga 1860
gccggacccg ccgccgccgc tgccgcagcc aaagctgctg ccaaagccgc ccagtttggc 1920
ctagtgggag ccgctgggct cggaggactc ggagtcggag ggcttggagt tccaggtgtt 1980
gggggccttg gaggtatacc tccagctgca gccgctaaag cagctaaata cggtgctgct 2040
ggccttggag gtgtcctagg gggtgccggg cagttcccac ttggaggagt ggcagcaaga 2100
cctggcttcg gattgtctcc cattttccca ggtggggcct gcctggggaa agcttgtggc 2160
cggaagagaa aatga 2175

Claims (6)

1.用于动物和人细胞的遗传修饰的3165bp基因疗法DNA载体VTvaf17，其含有核苷酸序列SEQ ID No.1。
2.构建3165bp基因疗法DNA载体VTvaf17的方法，该方法包括首先构建4182bp载体，然后通过SpeI限制性位点将它切割，并且将剩余的片段与其自身连接，该4182bp载体含有具有内在增强子的人延伸因子EF1A的1188bp启动子区、具有限制性内切核酸酶BamHI、EcoRV、SaII、HindIII、KpnI、EcoRI的位点的35bp多接头、人生长因子的466bp转录终止子和多腺苷酸化序列、允许无抗生素的阳性选择的转座子Tn10的136bp调节元件RNA-OUT、具有单核苷酸取代以增加大多数大肠杆菌菌株细胞中的载体生成的用于自主复制的1299bp复制起点、1010bp卡那霉素抗性基因。
3.大肠杆菌菌株SCS110-AF，其用于生成基因疗法DNA载体VTvaf17或允许无抗生素的阳性选择的基于它的基因疗法DNA载体。
4.获得大肠杆菌菌株SCS110-AF以生成基因疗法DNA载体VTvaf17或基于它的基因疗法DNA载体的方法，该方法包括构建64bp的线性DNA片段，然后通过电穿孔转化大肠杆菌细胞，并挑选出在含10μg/ml氯霉素的培养基中存活的克隆，该线性DNA片段含有允许无抗生素的阳性选择的转座子Tn10的调节元件RNA-IN、1422bp果聚糖蔗糖酶基因sacB、挑出发生同源重组的菌株克隆需要的763bp氯霉素抗性基因catR和确保与基因失活同时的基因recA区域中的同源重组的两个同源序列329bp和233bp，所述1422bp果聚糖蔗糖酶基因sacB的产物确保在含蔗糖的培养基内的选择。
5.大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17(在俄罗斯国家工业微生物保藏中心以编号B-12990，国际保存机构编号NCIMB 42801登记)，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17以用于允许无抗生素的选择的其进一步生成。
6.获得携带基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110-AFA/Tvaf17(在俄罗斯国家工业微生物保藏中心以编号B-12990，国际保藏机构编号NCIMB 42801登记)的方法，其包括制备大肠杆菌菌株SCS110-AF的电感受态细胞，并且用基因疗法DNA载体VTvaf17对这些细胞进行电穿孔，之后，将细胞倒入具有含有选择性培养基的琼脂板(培养皿)中，所述选择性培养基含有酵母浸膏、蛋白胨、6％蔗糖和10μg/ml氯霉素。
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