RU2733429C1 - Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген HFE для повышения уровня экспрессии этого целевого гена, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора - Google Patents

Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген HFE для повышения уровня экспрессии этого целевого гена, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора Download PDF

Info

Publication number
RU2733429C1
RU2733429C1 RU2019145031A RU2019145031A RU2733429C1 RU 2733429 C1 RU2733429 C1 RU 2733429C1 RU 2019145031 A RU2019145031 A RU 2019145031A RU 2019145031 A RU2019145031 A RU 2019145031A RU 2733429 C1 RU2733429 C1 RU 2733429C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
gene
hfe
dna vector
therapeutic dna
target
Prior art date
Application number
RU2019145031A
Other languages
English (en)
Inventor
Антон Гамолски
Original Assignee
Генетик Диагностикс Энд Терапи 21 Лтд
Общество с ограниченной ответственностью «РЕКОМБИТЕХ»
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Генетик Диагностикс Энд Терапи 21 Лтд, Общество с ограниченной ответственностью «РЕКОМБИТЕХ» filed Critical Генетик Диагностикс Энд Терапи 21 Лтд
Priority to RU2019145031A priority Critical patent/RU2733429C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2733429C1 publication Critical patent/RU2733429C1/ru
Priority to PCT/RU2021/000074 priority patent/WO2021137742A1/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и представляет собой генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением функций белка HFE, ответственного за регуляцию обмена железа в организме человека, для терапии заболеваний связанных с нарушением экспрессии гена HFE, в том числе, обусловленных недостаточностью экспрессии гена HFE и/или наличием мутаций в гене HFE, в том числе при гемахроматозе, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена HFE, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с получением генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1. Созданный генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE обладает способностью эффективно проникать в клетки человека и животных и экспрессировать клонированный в него целевой ген HFE. 8 н.п. ф-лы, 7 ил., 9 пр.

Description

Область техники
Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве для создания препаратов генной терапии.
Уровень техники
Генная терапия - это современный медицинский подход, направленный на лечение наследственных и приобретенных заболеваний путем введения нового генетического материала в клетки пациента с целью компенсации или подавления функции мутантного гена и/или исправления генетического дефекта. Конечным продуктом экспрессии гена может являться молекула РНК или белка. Однако осуществление большей части физиологических процессов в организме связано с функциональной активностью белковых молекул, тогда как молекулы РНК являются либо промежуточным продуктом в синтезе белков, либо осуществляют регуляторные функции. Таким образом, целью генной терапии является, в большинстве случаев, введение в организм генов, обеспечивающих транскрипцию и последующую трансляцию белковых молекул, кодируемых этими генами. В рамках описания настоящего изобретения под экспрессией гена подразумевается продукция белковой молекулы, аминокислотная последовательность которой кодируется этим геном.
Ген HFE играют ключевую роль в ряде процессов в организме человека и животных. Ген HFE кодирует белок HFE, который участвует в регуляции обмена железа в организме человека. Мутации в гене HFE являются главной причиной развития наследственного заболевания - гемохроматоза, который проявляется в избыточном накоплении железа во внутренних органах и кожных покровах.
Белок HFE состоит из нескольких доменов: сигнального пептида; внеклеточной области, которая связывается с рецептором трансферрина; домена, сходного по структуре с молекулой иммуноглобулина; трансмембранного домена, который фиксирует белок в клеточной мембране и короткого цитоплазматического участка. Белок HFE находится в клетках печени, кишечника и иммунной системы. Главная функция этого белка - регуляция метаболизма железа в организме (Feder et al., 1996).
Для блокирования транспорта железа в клетку, белок HFE связывается с рецептором трансферрина 1 (TFR1), препятствуя дальнейшему взаимодействию рецептора с белком трансферрином (TF), который является транспортером атомов железа (Feder et al., 1998). Белок HFE регулирует выработку гормона гепсидина. Гепсидин синтезируется в печени и отвечает за усвоение железа из пищи и высвобождение его из депо в организме. Когда белок HFE не связан с рецептором TFR1, он является ключевым звеном каскада, запускающего экспрессию гепсидина (Nemeth et al., 2006).
Показана связь низких концентраций функционального белка HFE с различными неблагоприятными состояниями человека. Так наследственный гемохроматоз (гемохроматоз I типа), встречающийся с частотой 1,5-3:1000 населения, обусловлен в 95% случаев мутациями в гене HFE, локализованном в 6-й хромосоме: C282Y и H63D. Гемахроматоз I типа является заболеванием, симптомы которого проявляются в накоплении железа в паренхиматозных органах (преимущественно в печени, поджелудочной железе, сердце и суставах) с сопутствующим их повреждением за счет образования свободных радикалов (Barton et al., 2006).
Классической триадой заболевания считают цирроз печени, сахарный диабет и нарушение пигментации кожи, развивающиеся у людей среднего возраста, преимущественно мужчин. Заболевание печени является наиболее распространенным осложнением и может прогрессировать до цирроза, у 20-30% пациентов с циррозом развивается гепатоцеллюлярная карцинома. Заболевание печени является наиболее распространенной причиной смерти. Кардиомиопатия с сердечной недостаточностью является второй по распространенности причиной смерти больных. Гиперпигментация (бронзовый диабет) является общей, как и симптоматическая артропатия.
Таким образом, генотерапевтическое повышение экспрессии функционального гена HFE обладает потенциалом для коррекции различных состояний человека и животных.
Анализ подходов для повышения экспрессии целевых генов подразумевает возможность использования различных генотерапевтических векторов.
Генотерапевтические векторы разделяют на вирусные, клеточные и ДНК-векторы (Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal Products EMA/CAT/80183/2014). В последнее время в генной терапии все большее внимание уделяется разработке невирусных систем доставки генетического материала, среди которых лидируют плазмидные векторы. Плазмидные векторы лишены недостатков, присущих клеточным и вирусным векторам. В клетке-мишени они существуют в эписомальной форме, не интегрируют в геном, производство их достаточно дешево, отсутствие иммунного ответа и побочных реакций на введение плазмидного вектора делают их удобным инструментом генной терапии и генетической профилактики (ДНК-вакцины) (Li L, Petrovsky N. // Expert Rev Vaccines. 2016;15(3):313-29).
Тем не менее, ограничениями для использования плазмидных векторов для генной терапии являются: 1) наличие генов устойчивости к антибиотикам для наработки в бактериальных штаммах, 2) наличие различных регуляторных элементов, представленных последовательностями вирусных геномов 3) размер терапевтического плазмидного вектора, определяющий эффективность проникновения вектора в клетку-мишень.
Известно, что Европейское агентство по лекарственным средствам считает необходимым избегать введения маркеров антибиотикорезистентности в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии (Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011 EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies). Данная рекомендация связана, в первую очередь, с потенциальной опасностью проникновения ДНК-вектора или горизонтального переноса генов антибиотикорезистентности в клетки бактерий, представленных в организме в составе нормальной или оппортунистической микрофлоры. Помимо этого, наличие генов антибиотикорезистентности значительно увеличивает размер ДНК-вектора, что приводит к снижению эффективности его проникновения в эукариотические клетки.
Необходимо отметить, что гены антибиотикорезистентности также вносят принципиальный вклад в способ получения ДНК-векторов. В случае наличия генов антибиотикорезистентности штаммы для наработки ДНК-векторов обычно культивируются в среде, содержащей селективный антибиотик, что создает риск наличия следовых количеств антибиотика в недостаточно очищенных препаратах ДНК-векторов. Таким образом, получение ДНК-векторов для генной терапии, в которых отсутствуют гены антибиотикорезистентности, связано с получением штаммов, обладающих такой отличительной особенностью как способность к стабильной амплификации целевых ДНК-векторов в среде без содержания антибиотиков.
Кроме того, Европейское Медицинское Агентство рекомендует избегать наличия в составе терапевтических плазмидных векторов регуляторных элементов для повышения экспрессии целевых генов (промоторов, энхансеров, посттрансляционных регуляторных элементов), являющихся нуклеотидными последовательностями геномов различных вирусов (Draft Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products,http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/05/WC500187020.pdf). Данные последовательности, хотя и могут увеличивать уровень экспрессии целевого трансгена, однако создают риск рекомбинации с генетическим материалом вирусов дикого типа и интеграции в геном эукариотической клетки. Более того, целесообразность гиперэкспрессии того или иного гена в целях терапии остается нерешенным вопросом.
Также, существенным моментом является размер терапевтического вектора. Известно, что современные плазмидные векторы зачастую перегружены нефункциональными участками, серьезно увеличивающими размер вектора (Mairhofer J, Grabherr R. // Mol Biotechnol. 2008.39(2):97-104). Например, ген устойчивости к ампициллину в векторах серии pBR322, как правило, состоит из не менее чем 1000 п.н., что составляет более 20% от размера самого вектора. При этом наблюдается обратная зависимость между размером вектора и его способностью проникать в эукариотические клетки - ДНК-векторы с небольшим размером эффективней проникаю в клетки человека и животных. Так, например, в серии экспериментов по трансфекции клеток HELA ДНК-векторами с размером от 383 до 4548 п.н. было показано, что разница в эффективности проникновения может достигать двух порядков (отличаться в 100 раз) (Hornstein BD et al. // PLoS ONE. 2016;11(12): e0167537.).
Таким образом, при выборе ДНК-вектора в целях безопасности и наибольшей эффективности следует отдавать предпочтение тем конструкциям, в которых не содержатся гены устойчивости к антибиотикам, последовательности вирусного происхождения и размер которых позволяет эффективно проникать в эукариотические клетки. Штамм для получения такого ДНК-вектора в количествах, достаточных для целей генной терапии, должен обеспечивать возможность стабильной амплификации ДНК-вектора с использованием питательных сред, не содержащих антибиотики.
Примером использования рекомбинантных ДНК-векторов для генной терапии является способ получения рекомбинантного вектора для генетической иммунизации по патенту US 9550998 В2. Вектор представляет собой суперскрученный плазмидный ДНК-вектор и предназначен для экспрессии клонированных генов в клетках животных и человека. Вектор состоит из ориджина репликации, регуляторных элементов, включающих промотор и энхансер цитомегаловируса человека, регуляторные элементы из Т-лимфотропного вируса человека.
Накопление вектора проводят в специальном штамме E. coli без использования антибиотиков за счет антисенс-комплементации гена sacB, введенного в штамм посредством бактериофага. Недостатком данного изобретения является наличие в составе ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой последовательности вирусных геномов.
Прототипами настоящего изобретения в части использования генотерапевтических подходов для повышения уровня экспрессии гена HFE являются следующие заявки.
В патенте RU2678756 описан генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, способ его получения, штамм Escherichia coli SCS110-AF, способ его получения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, способ его получения. Недостатком данного изобретения является значительный размер векторной части, что может негативно отразиться на эффективности доставки ДНК-вектора в клетки.
Известен способ получения ДНК-вектора, экспрессирующего ген HFE. Были получены векторы на основе плазмиды pcDNA3.1 и с помощью липофекции введены в клетки линии HeLa (Gross CN, Irrinki A, Feder JN, Enns CA. Co-trafficking of HFE, a nonclassical major histocompatibility complex class I protein, with the transferrin receptor implies a role in intracellular iron regulation. J Biol Chem. 1998 273(34):22068-74). Ограничением использования данного ДНК - вектора для генетической терапии является наличие в его составе регуляторных элементов, представляющих собой последовательности вирусных геномов.
Известен патент (US 7,078,513 B1) в котором описана экспрессия гена HFE в гетерологичных и гомологичных системах. В патенте приводятся примеры получения аденовирусных и ретровирусных векторов для in vivo генетической терапии. Недостатком аденовирусных векторов является ограниченная по времени экспрессия целевого гена и индукция иммунного ответа на повторные введения векторов. Недостатками ретровирусных векторов является потенциальная возможность индукции канцерогенеза.
Известно решение по патентной заявке US 20190076551, в которой описывается способ лечения наследственного гемохроматоза с использованием технологии геномного редактирования. Описан способ введения в клетки экспрессирующих конструкций, кодирующих гены нуклеазы и направляющих РНК для внесения двуцепочечных разрывов в ген HFE с целью восстановления его функции. Недостатком данного способа является наличие потенциальных «офф-таргет» эффектов, то есть внесение разрывов в различные нецелевые последовательности ДНК в геноме, обусловленные неспецифической работой фермента.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является конструирование генотерапевтического ДНК-вектора для повышения уровня экспрессии гена HFE в организме человека и животных, сочетающих в себе следующие свойства:
I) Эффективность генотерапевтического ДНК-вектора для повышения уровня экспрессии целевых генов в эукариотических клетках.
II) Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов.
III) Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов антибиотикорезистентности.
IV) Технологичность получения и возможность наработки генотерапевтического ДНК-вектора в промышленных масштабах.
Пункты II и III предусмотрены в данном техническом решении в соответствии с рекомендациями государственных регуляторов к лекарственным средствам для генной терапии, в частности, Европейского Агентства по лекарственным средствам касательно отказа от введения маркеров антибиотикорезистентности в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии (Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011, EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies) и касательно отказа от введения в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии элементов вирусных геномов (Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products / 23 March 2015, EMA/CAT/80183/2014, Committee for Advanced Therapies).
Задачей изобретения также является конструирование штамма, несущего этот генотерапевтический ДНК-вектор, для наработки и производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора.
Поставленная задача решается за счет того, что создан генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением функций белка HFE, ответственного за регуляцию обмена железа в организме человека, для терапии заболеваний связанных с нарушением экспрессии гена HFE, в том числе, обусловленных недостаточностью экспрессии гена HFE и/или наличием мутаций в гене HFE, в том числе при гемахроматозе, при этом генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE содержит кодирующую часть целевого гена HFE, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1.
Созданный генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- HFE за счет ограниченного размера векторной части GDTT1.8NAS12, не превышающей 2600 п.н., обладает способностью эффективно проникать в клетки человека и животных и экспрессировать клонированный в него целевой ген HFE.
В составе созданного генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- HFE в качестве структурных элементов используются нуклеотидные последовательности, которые не являются генами антибиотикорезистентности, вирусными генами и регуляторными элементами вирусных геномов, обеспечивая возможность его безопасного применения для генетической терапии человека и животных.
Создан также способ получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген HFE, заключающийся в том, что генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE получают следующим образом: кодирующую часть целевого гена HFE клонируют в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 и получают генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE SEQ ID №1, при этом кодирующую часть целевого гена HFE получают путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани здорового человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации с использованием созданных олигонуклеотидов и расщеплением продукта амплификации соответствующими эндонуклеазами рестрикции, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводят по сайтам рестрикции SalI и KpnI, , причем селекцию проводят без антибиотиков,
при этом при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE, SEQID №1 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды:
HFE-up TTTGTCGACCACCATGGGCCCGCGAGCCAGGCCGG,
HFE-lo AATGGTACCTCACTCACGTTCAGCTAAGACGTAGTGC,
а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена HFE в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции SalI и KpnI.
Создан способ использования генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген HFE для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением функций белка HFE, ответственного за регуляцию обмена железа в организме человека, для терапии заболеваний связанных с нарушением экспрессии гена HFE, в том числе, обусловленных недостаточностью экспрессии гена HFE и/или наличием мутаций в гене HFE, в том числе при гемахроматозе, заключающийся в трансфекции выбранным генотерапевтическим ДНК-вектором, несущим целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 клеток органов и тканей пациента или животного, и/или во введении в органы и ткани пациента или животного аутологичных клеток этого пациента или животного, трансфицированных выбранным генотерапевтическим ДНК-вектором, несущим целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 и/или во введении в органы и ткани пациента или животного выбранного генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, или в сочетании обозначенных способов.
Создан способ получения штамма для производства генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением функций белка HFE, ответственного за регуляцию обмена железа в организме человека, для терапии заболеваний связанных с нарушением экспрессии гена HFE, в том числе, обусловленных недостаточностью экспрессии гена HFE и/или наличием мутаций в гене HFE, в том числе при гемахроматозе, заключающийся в получении электрокомпетентных клеток штамма Escherichiacoli JM 110-NAS с последующим проведением электропорации этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE, после чего клетки высеивают на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы, а также 10 мкг/мл хлорамфеникола с получением в результате штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE.
Заявлен штамм Escherichiacoli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE, несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- HFE, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением функций белка HFE, ответственного за регуляцию обмена железа в организме человека, для терапии заболеваний связанных с нарушением экспрессии гена HFE, в том числе, обусловленных недостаточностью экспрессии гена HFE и/или наличием мутаций в гене HFE, в том числе при гемахроматозе.
Создан способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген HFE для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением функций белка HFE, ответственного за регуляцию обмена железа в организме человека, для терапии заболеваний связанных с нарушением экспрессии гена HFE, в том числе, обусловленных недостаточностью экспрессии гена HFE и/или наличием мутаций в гене HFE, в том числе при гемахроматозе, заключающийся в том, что генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE получают путем того, что засевают в колбу с приготовленной средой затравочную культуру штамма Escherichiacoli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE, затем инкубируют затравочную среду в шейкере-инкубаторе и переносят ее в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт, многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами.
Краткое описание чертежей
На фиг.1
приведена схема генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген HFE, который представляет собой кольцевую двуцепочечную молекулу ДНК, способную к автономной репликации в клетках бактерии Escherichia coli.
На фиг.1 приведены схема ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE.
На схемах отмечены следующие структурные элементы вектора:
EF1a pr - промоторная область гена человеческого фактора элонгации EF1A с собственным энхансером, содержащимся в первом интроне гена. Служит для обеспечения высокого уровня транскрипции рекомбинантного гена в большинстве тканей человека;
Рамка считывания целевого гена, соответствующая кодирующей части гена HFE.
hGH TA - терминатор транскрипции;
pUCori - ориджин репликации, служащий для автономной репликации с однонуклеотидной заменой для повышения копийности плазмиды в клетках большинства штаммов Escherichia coli;
RNAout - регуляторный элемент РНК-out транспозона Tn 10, обеспечивающий возможность положительной селекции без использования антибиотиков при использовании штамма Eshcerichia coli JM110NAS.
Отмечены уникальные сайты рестрикции.
На фиг.2
показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно, гена HFE, в культуре клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека Hep G2 (ATCC HB-8065) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.
На фиг.2 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:
1 - кДНК гена HFE в культуре клеток Hep G2 до трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE;
2 - кДНК гена HFE в культуре клеток Hep G2 после трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE;
3 - кДНК гена B2M в культуре клеток Hep G2 до трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE;
4 - кДНК гена B2M в культуре клеток Hep G2 после трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE.
В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин), приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.
На фиг.3
показана диаграмма концентрации белка HFE в клеточном лизате культуры клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека Hep G2 (ATCC HB-8065) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии на уровне белка, по изменению количества белка HFE в лизате клеток.
На фиг.3 отмечены следующие элементы:
культура А - культура Hep G2, трансфицированная водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);
культура B - культура Hep G2, трансфицированных ДНК-вектором GDTT1.8NAS12;
культура C - культура Hep G2, трансфицированных ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE.
На фиг. 4
показана диаграмма концентрации белка HFE в биоптатах кожи трех пациентов после введения в кожу этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген HFE.
На фиг.4 отмечены следующие элементы:
П1I - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-HFE;
П1II - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
П1III - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка;
П2I - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-HFE;
П2II - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
П2III - биоптат кожи пациента П2 из интактного участка;
П3I - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-HFE;
П3II - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
П3III - биоптат кожи пациента П3 из интактного участка.
На фиг. 5
показана диаграмма концентрации белка HFE в биоптатах кожи человека после введения в кожу культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE с целью демонстрации способа применения путем введения аутологичных клеток, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE.
На фиг.5 отмечены следующие элементы:
П1С - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения культуры аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE;
П1B - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12;
П1А - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка.
На фиг. 6
показана диаграмма концентрации белка HFE человека, в ткани печени трех крыс линии Wistar после внутривенного введения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE с целью демонстрации способа применения смеси генотерапевтических ДНК-векторов.
На фиг.6 отмечены следующие элементы:
К1I - образец ткани печени крысы К1 при введении генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-HFE;
К1II - образец ткани печени крысы К1 при введении генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
К1III - образец ткани печени контрольного интактного органа (печени) крысы К1;
К2I - образец ткани печени крысы К2 привведении генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-HFE;
К2II - образец ткани печени крысы К2 при введении генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
К2III - образец ткани печени контрольного интактного органа (печени) крысы К2;
К3I - образец ткани печени крысы К3 при введении генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-HFE;
К3II - образец ткани печени крысы К3 при введении генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
К3III - образец ткани печени контрольного интактного органа (печени) крысы К3.
На фиг. 7
показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена HFE в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC) быка до и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE с целью демонстрации способа применения путем введения генотерапевтического ДНК-вектора животным.
На фиг.7 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:
1 - кДНК гена HFE в клетках PBMC быка до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE;
2 - кДНК гена HFE в клетках PBMC быка после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12 HFE;
3 - кДНК гена ACT в клетках PBMC быка до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE;
4 - кДНК гена ACT в клетках PBMC быка после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE.
В качестве референтного гена использовали ген актина быка/ коровы (АСТ), приведенного в базе данных GenBank под номером AH001130.2.
Реализация изобретения
На основе ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. создан генотерапевтический ДНК-вектор, несущий целевой ген человека, предназначенные для повышения уровня экспрессии этого целевого гена в тканях человека и животных. При этом способ получения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген заключается в том, что в полилинкер генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 клонируют белок-кодирующую последовательность целевого гена HFE (кодирует белок HFE) человека. Известно, что способность ДНК-векторов проникать в эукариотические клетки обусловлена, главным образом, размером вектора. При этом ДНК-векторы с наименьшим размером обладают более высокой проникающей способностью. Таким образом, предпочтительным является отсутствие в составе вектора элементов, которые не несут функциональной нагрузки, но при этом увеличивают размер ДНК-вектора. Данные особенности ДНК-векторов были учтены при получении генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген HFE путем отсутствия в составе вектора крупных нефункциональных последовательностей и генов антибиотикорезистентности, что позволило, помимо технологических преимуществ и преимуществ в плане безопасности применения, значительно уменьшить размер полученного генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген HFE. Таким образом, способность проникать в эукариотические клетки полученного генотерапевтического ДНК-вектора обусловлена его небольшими размерами.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE получали следующим образом: кодирующую часть целевого гена HFE клонировали в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 и получали генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE, SEQ ID №1. Кодирующую часть гена HFE размером 1051 п.н., получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани здорового человека. Для получения первой цепи кДНК гена HFE человека использовали реакцию обратной транскрипции. Амплификацию проводили с использованием созданных для этого методом химического синтеза олигонуклеотидов. Расщепление продукта амплификации специфическими эндонуклеазами рестрикции проводили с учетом оптимальной процедуры дальнейшего клонирования, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводили по сайтам рестрикции KpnI и SalI, расположенными в полилинкере вектора GDTT1.8NAS12. Выбор сайтов рестрикции проводили таким образом, чтобы клонированный фрагмент попадал в рамку считывания экспрессионной кассеты вектора GDTT1.8NAS12, при этом белок-кодирующая последовательность не содержала сайты рестрикции для выбранных эндонуклеаз. При этом специалистам в данной области техники понятно, что методическая реализация получения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE может варьировать в рамках выбора известных методов молекулярного клонирования генов, при этом эти способы подпадают под объем настоящего изобретения. Так, например, могут быть использованы различные последовательности олигонуклеотидов для амплификации гена HFE, различные эндонуклеазы рестрикции или такие лабораторные техники как безлигазное клонирование генов.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE обладает нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1. При этом специалистам в данной области техники известно свойство вырожденности генетического кода, из которого следует, что под объем настоящего изобретения также подпадают варианты нуклеотидных последовательностей, отличающихся инсерцией, делецией или заменой нуклеотидов, которые не приводят к изменению полипептидной последовательности, кодируемой целевым геном, и/или не приводят к потере функциональной активности регуляторных элементов вектора GDTT1.8NAS12. При этом специалистам в данной области техники известно явление генетического полиморфизма, из которого следует, что под объем настоящего изобретения также подпадают варианты нуклеотидных последовательностей гена HFE, которые при этом кодируют различные варианты аминокислотных последовательностей белка HFE, не отличающихся от приведенных по своей функциональной активности при физиологических условиях.
Способность проникать в эукариотические клетки и функциональную активность, то есть способность экспрессировать целевой ген, полученного генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE подтверждают путем введения в эукариотические клетки полученного вектора и последующим анализом экспрессии специфической мРНК и/или белкового продукта целевого гена. Наличие специфической мРНК в клетках, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE, свидетельствует как о способности полученного вектора проникать в эукариотические клетки, так и о его способности экспрессировать мРНК целевого гена. При этом, как известно специалистам в данной области техники, наличие мРНК гена является обязательным условием, но не доказательством трансляции белка, кодируемого целевым геном. Поэтому для подтверждения свойства генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE экспрессировать целевой ген на уровне белка в эукариотических клетках, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор, проводят анализ концентрации белка, кодируемого целевым геном, с использованием иммунологических методов. Наличие белка HFE подтверждает эффективность экспрессии целевых генов в эукариотических клетках и возможность повышения уровня концентрации белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген HFE. Таким образом для подтверждения эффективности экспрессии созданного генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE, несущего целевой ген, а именно, ген HFE, использовали следующие методы:
А) ПЦР в реальном времени - изменение накопления ампликонов кДНК целевого гена в лизате клеток человека и животного, после трансфекции различных клеточных линий человека и животного генотерапевтическим ДНК-вектором;
B) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевого белка в лизате клеток человека, после трансфекции различных клеточных линий человека генотерапевтическим ДНК-вектором;
C) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевого белка в супернатанте биоптатов тканей человека и животного, после введения в эти ткани генотерапевтического ДНК-вектора;
D) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в супернатанте биоптатов тканей человека, после введения в эти ткани аутологичных клеток этого человека, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором.
Для подтверждения реализуемости способа применения созданного генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE, несущего целевой ген, а именно, ген HFE, выполняли:
А) трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором различных клеточных линий человека и животного;
B) введение генотерапевтического ДНК-вектора в различные ткани человека и животного;
С) введение в ткани животного генотерапевтического ДНК-вектора;
D) введение в ткани человека аутологичных клеток, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором.
Указанные способы применения характеризуются отсутствием потенциальных рисков для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов, и за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов устойчивости к антибиотикам, что подтверждается отсутствием участков, гомологичных вирусным геномам и генам антибиотикорезистентности в нуклеотидных последовательностях генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE (SEQ ID №1).
Как известно специалистам в данной области техники, гены антибиотикорезистентности в составе генотерапевтических ДНК-векторов используются с целью получения этих векторов в препаративных количествах путем наращивания бактериальной биомассы в питательной среде, содержащей селективный антибиотик. В рамках настоящего изобретения в целях возможности безопасного применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген HFE, использование селективных питательных сред, содержащих антибиотик, не представляется возможным. В качестве технологического решения для получения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген HFE для возможности масштабирования до промышленных масштабов получения генотерапевтических векторов предлагается способ получения штаммов для наработки указанных генотерапевтических векторов на основе бактерии Escherichia coli JM110-NAS. Способ получения штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE заключается в получении компетентных клеток штамма Escherichia coli JM110-NAS с введением в эти клетки генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE с помощью методов трансформации (электропорации), общеизвестных специалистам в данной области техники. Полученный штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE используется для наработки генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE с возможностью использования сред без содержания антибиотиков.
Для подтверждения получения штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE проводили трансформацию, селекцию и последующее наращивание с выделением плазмидной ДНК.
Для подтверждения технологичности получения и возможности масштабирования до промышленного производства генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE, несущего целевой ген, а именно, ген HFE выполняли ферментацию в промышленном масштабе штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE, который содержит генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген, а именно HFE.
Способ масштабирования получения бактериальной массы до промышленных масштабов для выделения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген HFE заключается в том, что затравочную культуру штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE инкубируют в объеме питательной среды без содержания антибиотика обеспечивающим подходящую динамику накопления биомассы, по достижению достаточного количества биомассы в логарифмической фазе роста, бактериальную культуру переносят в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы роста, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE, многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами. При этом специалистам в данной области техники понятно, что условия культивирования штаммов, состав питательных сред (за исключением содержания антибиотиков), используемое оборудование, методы очистки ДНК могут варьировать в рамках стандартных операционных процедур в зависимости от отдельно взятой производственной линии, но известные подходы к масштабированию, промышленному получению и очистке ДНК-векторов с использованием штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE подпадают под объем настоящего изобретения.
Описанное раскрытие изобретения подтверждается примерами реализации настоящего изобретения.
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1.
Получение генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE, несущего целевой ген HFE.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE конструировали клонированием кодирующей части гена HFE размером 1051 п.н. в ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. по сайтам рестрикции SalI и KpnI. Кодирующую часть гена HFE размером 1051 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани здорового человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:
HFE-up TTTGTCGACCACCATGGGCCCGCGAGCCAGGCCGG,
HFE-lo AATGGTACCTCACTCACGTTCAGCTAAGACGTAGTGC и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США).
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 конструировали объединением шести фрагментов ДНК, полученных из разных источников:
(а) ориджин репликации получали путем ПЦР-амплификации участка коммерческой плазмиды pUC19 с использованием олигонуклеотидов UCori-Bam, UCori-Nco (перечень последовательностей, (1) -(2));
(б) терминатор транскрипции hGH-TA получали путем ПЦР-амплификации участка геномной ДНК человека с использованием олигонуклеотидов hGH-F и hGH-R (перечень последовательностей, (3) и (4));
(в) регуляторный участок транспозона Tn10 РНК-out получали путем синтеза из олигонуклеотидов RO-F, RO-R, RO-1, RO-2, RO-3 (перечень последовательностей, (5) -(9));
(г) ген устойчивости к канамицину получали путем ПЦР-амплификации участка коммерческой плазмиды pET-28 человека с использованием олигонуклеотидов Kan-F и Kan-R (перечень последовательностей, (10) и (11));
(д) полилинкер получали кинированием и отжигом четырех синтетических олигонуклеотидов MCS1, MCS2, MCS3 и MCS4 (перечень последовательностей, (12) - (15));
(е) промоторно-регуляторный участок человеческого гена фактора элонгации EF1а с собственным энхансером получали путем ПЦР-амплификации участка геномной ДНК человека с использованием олигонуклеотидов EF1-Xho и EF1-R (перечень последовательностей, (16) - (17)).
ПЦР-амплификацию проводили с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) в соответствии с инструкцией производителя. Фрагменты (б), (в) и (г) имели перекрывающиеся области для возможности их объединения с последующей ПЦР-амплификацией. Объединяли фрагменты (б), (в) и (г) с использованием олигонуклеотидов hGH-F и Kan-R (список последовательностей, (3) и (11)). Далее, полученные фрагменты ДНК объединялись путем рестрикции с последующим лигированием по сайтам BamHI и NcoI. В результате получали вектор, пока еще не содержащий полилинкер. Для его введения проводили расщепление плазмиды эндонуклеазами рестрикции по сайтам BamHI и EcoRI с последующим лигированием с фрагментом (д). В результате получали промежуточный вектор размером 2408 п.н, несущий ген устойчивости к канамицину, пока еще не содержащий промоторно-регуляторный участок гена фактора элонгации EF1а с собственным энхансером. Полученный вектор расщепляли эндонуклеазами рестрикции по сайтам SalI и BamHI с последующим лигированием с фрагментом (е). В результате получали вектор размером 3608 п.н., несущий ген устойчивости к канамицину и промоторно-регуляторный участок гена гена фактора элонгации EF1а с собственным энхансером. Далее ген устойчивости к канамицину выщепляли по сайтам рестрикции SpeI, после чего оставшийся фрагмент лигировали сам на себя. Таким образом, получали генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н., который является рекомбинантным, с возможностью селекции без антибиотиков и возможностью экспрессии клонированных в него целевых генов в большинстве типов тканей человека и животных.
Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена HFE и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 проводили эндонуклеазами рестрикции SalI и KpnI (New England Biolabs, США).
В результате получали ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE размером 3604 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1 и общей структурой изображенной на фиг.1.
Пример 2.
Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE, несущего целевой ген HFE проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.
Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена HFE, в культуре клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека Hep G2 (ATCC HB-8065) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE, несущим ген HFE человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.
Клеточную культуру Hep G2 выращивали в стандартных условиях (37 °С, 5% СО2) в культуральной среде DMEM с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров (Gibco). В процессе культивирования каждые 48 ч происходила смена ростовой среды.
Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×104 клеток/лунку. Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE, экспрессирующим ген HFE человека, проводили с использованием Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США) согласно рекомендациям производителя. В пробирке №1 к 25 мкл среды Opti-MEM (Gibco, США) добавляли 1 мкл раствора ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE (концентрация 500 нг/мкл) и 1 мкл реагента Р3000. Аккуратно перемешивали легким встряхиванием. В пробирке №2 к 25 мкл среды Opti-MEM (Gibco, США) добавляли 1 мкл раствора Lipofectamin 3000. Аккуратно перемешивали легким встряхиванием. Добавляли содержимое пробирки №1 к содержимому пробирки №2, инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Полученный раствор по каплям добавляли к клеткам в объеме 40 мкл.
В качестве контроля использовали клетки Hep G2, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена (кДНК гена HFE до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано. Подготовку контрольного вектора GDTT1.8NAS12 для трансфекции проводили как описано выше.
Суммарную РНК из клеток Hep G2 выделяли с использованием Trizol Reagent (Invitrogen, США) согласно рекомендациям производителя. В лунку с клетками добавляли 1 мл Trizol Reagent и гомогенизировали с последующим прогреванием в течении 5 мин при 65 °С. Далее образец центрифугировали при 14 000g в течении 10 мин и снова прогревали в течении 10 мин при 65 0С. Далее добавляли 200 мкл хлороформа, плавно перемешивали и центрифугировали при 14 000g в течении 10 мин. Затем отбирали водную фазу, добавляли к ней 1/10 объема 3М ацетата натрия, рН 5.2 и равный объем изопропилового спирта. Инкубировали образец при -20 °С в течении 10 мин с последующим центрифугированием при 14 000g в течении 10 мин. Осадок промывали 1 мл 70% этилового спирта, высушивали на воздухе и растворяли в 10 мкл воды, свободной от РНКаз. Определение уровня экспрессии мРНК гена HFE после трансфекции проводили путем оценки динамики накопления ампликонов кДНК методом ПЦР в режиме реального времени. Для получения и амплификации кДНК, специфичной для гена HFE человека, использовали олигонуклеотиды HFE_SF и HFE_SR:
HFE_SF TGATCATGAGAGTCGCCGTG,
HFE_SR TTTCACAGCCCAGGATGACC.
Длина продукта амплификации - 194 п.н.
Реакцию обратной транскрипции и ПЦР-амплификацию проводили с помощью набора реагентов SYBR GreenQuantitect RT-PCR Kit (Qiagen, США) для ПЦР в режиме реального времени. Реакцию проводили в объеме 20 мкл, содержащих: 25 мкл QuantiTect SYBR Green RT-PCR MasterMix, 2,5 мM хлорида магния, по 0,5 мкМ каждого праймера, 5 мкл РНК. Реакцию осуществляли на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США) при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С - 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°C - 30 сек и элонгацию 72°С - 30 сек. В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов HFE и B2M. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество динамику накопления ампликонов кДНК генов HFE и B2M оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 2.
Из фигуры 2 следует, что в результате трансфекции культуры клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека Hep G2 (ATCC HB-8065) генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE, уровень специфической мРНК гена HFE человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген HFE на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE для повышения уровня экспрессии гена HFE в эукариотических клетках.
Пример 3.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE, несущего ген HFE, для повышения экспрессии белка HFE в клетках млекопитающих.
Оценивали изменение количества белка HFE в лизате культуры клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека Hep G2 (ATCC HB-8065) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE, несущим ген HFE человека.
Клеточную культуру гепатоцеллюлярной карциномы человека Hep G2 человека выращивали по Примеру 2.
Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×104 клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена HFE (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE, несущий ген HFE человека (С). Приготовление комплекса ДНК/дендример проводили по методике производителя (QIAGEN, SuperFect Transfection Reagent Handbook, 2002) с некоторыми изменениями. Для трансфекции клеток в одной лунке 24-луночного планшета к 1 мкг ДНК-вектора, растворенного в буфере ТЕ, добавляли культуральную среду до конечного объема 60 мкл, затем добавляли 5 мкл SuperFect Transfection Reagent и осторожно перемешивали пятикратным пипетированием. Комплекс инкубировали при комнатной температуре в течении 10-15 мин. Далее отбирали из лунок культуральную среду, лунки промывали 1 мл буфера PBS. К образовавшемуся комплексу добавляли 350 мкл среды, содержащей 10 мкг/мл гентамицина, осторожно перемешивали и добавляли к клеткам. Клетки инкубировали с комплексом 2-3 часа при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2.
Затем осторожно удаляли среду, промывали клеточный монослой 1 мл буфера PBS. Затем добавляли среду, содержащую 10 мкг/мл гентамицина, и инкубировали 24-48 часов при 37°С в атмосфере 5% СО2.
После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCl, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка HFE проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор HFE ELISA Kit (Hemochromatosis) (ABIN815944, https://www.antibodies-online.com/kit/815944/Hemochromatosis+HFE+ELISA+Kit/) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка HFE, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 78 пг/мл, диапазон измерения - от 78 пг/мл до 5000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 3.
Из фигуры 3 следует, что трансфекция клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека Hep G2 генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE приводит к увеличению количества белка HFE по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген HFE на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE для повышения уровня экспрессии HFE в эукариотических клетках.
Пример 4.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE, несущего ген HFE, для повышения экспрессии белка HFE в тканях человека.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE, несущего целевой ген, а именно, ген HFE и реализуемости способа его применения оценивали изменения количества белка HFE в коже человека при введении в кожу человека генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE, несущего ген человека HFE.
С целью анализа изменения количества белка HFE трем пациентам вводили в кожу предплечья генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE, несущий ген HFE и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена HFE.
Пациент 1, мужчина 63 года, (П1); пациент 2, женщина 64 года , П2); пациент 3, мужчина, 69 лет года, (П3). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE, который содержит кДНК гена HFE и генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, используемый в качестве плацебо, который не содержит кДНК гена HFE, каждый из которых растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генетической конструкции готовили комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI в соответствии с рекомендациями производителя.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 (плацебо) и генотерапевтический ДНК вектор GDTT1.8NAS12-HFE, несущий ген HFE вводили в количестве 1 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо) и генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-HFE, несущего ген HFE - 0,5 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагались на участке предплечья на расстоянии 8-10 см друг от друга.
Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения генетических конструкций генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациентов в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-HFE, несущего ген HFE (I), генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо) (II), а также из интактных участков кожи (III), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Количественное определение белка HFE проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа как это описано в примере 3.
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка HFE, входящим в состав набора. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 4.
Из фигуры 4 следует, что в коже всех трех пациентов в области введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12- HFE, несущего целевой ген HFE человека, произошло увеличение количества белка HFE в сравнении с количеством белка HFE в области введения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо), не содержащего ген HFE человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при внутрикожном введении генотерапевтического ДНК-вектора в ткани человека.
Пример 5.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE, несущего ген HFE и реализуемости способа его применения для повышения уровня экспрессии белка HFE в тканях человека путем введения аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE, несущего ген HFE и реализуемости способа его применения оценивали изменения количества белка HFE в коже человека при введении в кожу пациента культуры аутологичных фибробластов этого пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE.
Пациенту вводили в кожу предплечья соответствующую культуру аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE, несущим ген HFE, и параллельно вводили плацебо, представляющее собой культуру аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим ген HFE.
Первичную культуру фибробластов человека выделяли из биоптатов кожи пациента. Используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия) брали образец биоптата кожи из зоны, защищенной от действия ультрафиолета, а именно за ушной раковиной или с боковой внутренней поверхности в зоне локтевого сустава, размером около 10 кв. мм, массой - около 11 мг. Кожу пациента предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Культивирование первичной культуры клеток осуществляли при 37°С в атмосфере, содержащей 5 % СО2 в среде DMEM с 10 % фетальной телячьей сывороткой и ампициллином 100 Ед/мл. Пересев культуры и смену культуральной среды осуществляли каждые 2 дня. Общая продолжительность роста культуры не превышала 25-30 дней. Из культуры клеток отбирали аликвоту, содержащую 5×104 клеток. Культуру фибробластов пациента трансфицировали генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE, несущим ген HFE или плацебо - вектор GDTT1.8NAS12, не несущий целевой ген HFE.
Трансфекцию осуществляли с помощью катионного полимера полиэтиленимина JETPEI (Polyplus Transfection, Франция), согласно инструкции фирмы-производителя. Клетки культивировали 72 часа и затем вводили пациенту. Введение пациенту культуры аутологичных фибробластов этого пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE, и плацебо, представляющее собой культуру аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, осуществляли туннельным методом в область предплечья иглой 30G длиной 13 мм на глубину около 3 мм. Концентрация модифицированных аутологичных фибробластов в вводимой суспензии составляла примерно 5 млн клеток на 1 мл суспензии, количество вводимых клеток не превышало 15 млн. Очаги введения культуры аутологичных фибробластов располагались на расстоянии 8-10 см друг от друга.
Биопсийные образцы отбирали на 4-е сутки после введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE, несущим целевой ген, а именно, ген HFE и плацебо. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациента в зоне введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE, несущим целевой ген, а именно, ген HFE (C), культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим целевой ген HFE (плацебо) (B), а также из участков интактной кожи (A), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу в зоне отбора биоптата пациентов предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка как это описано в примере 3 (количественное определение белка HFE).
Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 5.
Из фигуры 5 следует, что в коже пациента в области введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE, несущим ген HFE, произошло увеличение количества белка HFE в сравнении с количеством белка HFE в области введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим ген HFE (плацебо), что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE и подтверждает реализуемость способа его применения для повышения уровня экспрессии HFE в тканях человека, в частности при введении аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE.
Пример 6.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE, несущего ген HFE для повышения уровня экспрессии белка HFE в тканях млекопитающих.
Оценивали изменение количества белка HFE в ткани печени крысы при внутривенном введении генотерапевтического вектора GDTT1.8NAS12-HFE. Исследование проводили на 9 лабораторных животных - самцах крысы линии Wistar 8 месячного возраста массой 240-290 г., распределенных на три группы группы: группа животных I, которым вводился генотерапевтический ДНК-вектор, несущий ген HFE, группа животных II, которым вводился генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 не несущий ген HFE (плацебо), а также группа животных III, не подвергавшимся никаким манипуляциям. В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Эквимолярную смесь генотерапевтических ДНК-векторов растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генетической конструкции готовили комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI в соответствии с рекомендациями производителя.
Объем вводимого раствора составлял 1 мл с суммарным количеством ДНК 500 мкг. Введение раствора осуществляли болюсным способом в хвостовую вену. Через 2 суток после процедуры крыс декапитировали.
Взятие биопсийного материала осуществляли из печени (50 мг образца) группы животных I, которым вводился генотерапевтический ДНК-вектор, несущий ген HFE (образцы 1-I, 2-I, 3-I), из печени группы животных II, которым вводился генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 не несущий ген HFE (плацебо) (образцы 1-II, 2-II, 3-II), а также из печени группы животных III, не подвергавшимся никаким манипуляциям (образцы 1-III, 2-III, 3-III). Каждый образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка как это описано в примере 3 (количественное определение белка HFE). Графический материал, полученный в результате анализа, представлены на фиг. 6.
Из фигуры 6 следует, что в образцах печени группы животных, которым вводился генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE, несущий целевой ген HFE, определено значительно большее количество белка HFE, по сравнению с образцами печени группы животных, которым вводилось плацебо и образцами печени группы интактных животных. Полученные результаты свидетельствуют об эффективности применения генотерапевтического ДНК-вектора и подтверждает реализуемость способа применения для повышения уровня экспрессии целевого белка в тканях млекопитающих.
Пример 7.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE, несущего ген HFE и реализуемости способа его применения для повышения уровня экспрессии белка HFE в клетках млекопитающих.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE, несущего ген HFE оценивали изменение накопления мРНК целевого гена HFE в мононуклеарных клетках периферической крови быка через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- HFE, несущим ген HFE человека.
Мононуклеарные клетки периферической крови быка выделяли из 50 мл венозной крови животного путем центрифугирования в градиенте раствора фиколла 1,077 (Панэко, Р052п) и культивировали в среде RPMI Media 1640 (GIBCO®, 11875-085) с добавлением 10 % лошадиной сыворотки Horse Serum (ATCC® 30-2040™) в стандартных условиях. Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE, несущим ген HFE человека и ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим ген HFE человека (контроль), выделение РНК, реакцию обратной транскрипции, ПЦР амплификации и анализ данных проводили как описано в примере 2. В качестве референтного гена использовали ген актина быка/ коровы (АСТ), приведенного в базе данных GenBank под номером AH001130.2. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности генов HFE и АСТ. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов HFE и ACT, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1. (Bio-Rad, USA).
Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 7.
Из фигуры 7 следует, что в результате трансфекции мононуклеарных клеток периферической крови быка генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE, уровень специфической мРНК гена HFE человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген HFE на уровне мРНК. Представленные результаты подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE для повышения уровня экспрессии гена HFE в клетках млекопитающих.
Пример 8.
Штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, и способ его получения.
Конструирование штамма для наработки в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген HFE, а именно Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE, с возможностью селекции без использования антибиотиков заключается в получении электрокомпетентных клеток штамма Escherichia coli JM110-NAS с проведением электропорации этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE, после чего клетки высеваются на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы, а также 10 мкг/мл хлорамфеникола. При этом штамм Escherichia coli JM110-NAS для наработки генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 или генотерапевтических ДНК-векторов на его основе с возможностью положительной селекции без использования антибиотиков получали путем конструирования линейного фрагмента ДНК, содержащего регуляторный элемент RNA-in транспозона Tn10 для селекции без применения антибиотиков размером 64 п.н., ген левансахаразы sacB, продукт которого обеспечивает селекцию на сахарозо-содержащей среде размером 1422 п.н., ген устойчивости к хлорамфениколу catR, необходимый для отбора клонов штамма, в которых прошла гомологичная рекомбинация размером 763 п.н. и две гомологичные последовательности, обеспечивающие процесс гомологичной рекомбинации в области гена recA с одновременной его инактивацией размером 329 п.н. и 233 п.н., после чего проводили трансформацию клеток Escherichia coli путем электропорации и отбирали клоны, выжившие на среде, содержащей 10 мкг/мл хлорамфеникола.
Полученный штамм для наработки был внесен в коллекции Национального биоресурсного центра - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (НБЦ ВКПМ), РФ и NCIMB Patent Deposit Service, UK с присвоением регистрационных номеров:
штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE - регистрационный № ВКПМ В-13538, дата депонирования 27.11.2019; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB - 43522, дата депонирования 28.11.2019.
Пример 9.
Способ масштабирования получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген HFE до промышленного масштаба.
Для подтверждения технологичности получения и возможности производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE (SEQ ID №1) проводили масштабную ферментацию штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE, который содержит генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген, а именно HFE. Штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE получали на базе штамма Escherichia coli JM110-NAS (Genetic Diagnostics and Therapy 21 Ltd, Великобритания) по примеру 8 путем электропорации компетентных клеток этого штамма генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE, несущим целевой ген HFE с последующим высевом трансформированных клеток на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы и отбором отдельных клонов.
Ферментацию полученного штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE, несущего генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE проводили в ферментере объемом 10 л с последующим выделением генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE.
Для ферментации штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE готовили среду, содержащую на 10 л: 100 г триптон, 50 г дрожжевой экстракт (Becton Dickinson, США), доводили водой до 8800 мл и автоклавировали при 121 0С 20 мин, затем добавляли 1200 мл 50% (вес/объем) сахарозы. Далее засевали в колбу затравочную культуру штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE в объеме 100 мл. Инкубировали в шейкере-инкубаторе 16 ч при 30°С. Переносили затравочную культуру в ферментер Techfors S (Infors HT, Швейцария), растили до достижения стационарной фазы. Контроль осуществляли измерением оптической плотности культуры при длине волны 600 нм. Клетки осаждали центрифугированием 30 мин при 5000-10000 g. Супернатант удаляли, клеточную массу ресуспендировали в 10% по объему фосфатно-солевого буфера. Повторно центрифугировали 30 мин при 5000-10000g. Супернатант удаляли, к клеточной массе добавляли раствор 20 мМ TrisCl, 1 мМ ЭДТА, 200 г/л сахароза, рН 8,0 в объеме 1000 мл, тщательно перемешивали до образования гомогенной суспензии. Добавляли раствор яичного лизоцима до конечной концентрации 100мкг/мл. Инкубировали 20 мин на льду при бережном перемешивании. Далее, добавляли 2500 мл раствора 0,2 М NaOH, 10 г/л додецилсульфат натрия, инкубировали 10 мин на льду при бережном перемешивании, затем добавляли 3500 мл раствора 3M ацетат натрия, 2М уксусная кислота, рН 5-5,5, инкубировали 10 мин на льду при бережном перемешивании. Полученный образец центрифугировали 20-30 мин при 15000 g или более. Раствор аккуратно декантировали, от остатков осадка избавлялись фильтрацией через грубый фильтр (фильтровальную бумагу). Добавляли РНКазу А (Sigma, США) до конечной концентрации 20 нг/мл, инкубировали ночь 16 ч при комнатной температуре. Раствор центрифугировали 20-30 мин при 15000g, затем фильтровали через мембранный фильтр с порами 0,45 мкм (Millipore, США). Далее проводили ультрафильтрацию через мембрану размером отсечения 100кДа (Millipore, США) и разбавляли до начального объема буфером 25 мМ TrisCl, pH 7.0. Операцию повторяли три - четыре раза. Наносили раствор, на колонку с 250 мл сорбента DEAE sepharose HP (GE, США), уравновешенную раствором 25 мМ TrisCl, pH 7.0. После нанесения образца колонку промывали тремя объемами этого же раствора, а затем проводили элюцию генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE линейным градиентом от раствора 25 мМ TrisCl, pH 7.0 до раствора 25 мМ TrisCl, pH 7.0, 1М NaCl в объеме пяти объемов колонки. Контроль элюции осуществляли по оптической плотности сходящего раствора при 260 нм. Хроматографические фракции, содержащие генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE, объединяли и проводили гель-фильтрацию на сорбенте Superdex 200 (GE, США). Колонку уравновешивали фосфатно-солевым буфером. Контроль элюции осуществляли по оптической плотности сходящего раствора при 260 нм, фракции анализировали электрофорезом в агарозном геле. Фракции, содержащие генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE объединяли и хранили при -20°С. Для оценки воспроизводимости техпроцесса обозначенные технологические операции повторяли пятикратно.
Воспроизводимость техпроцесса и количественные характеристики выхода конечного продукта подтверждают технологичность получения и возможность производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE.
Таким образом, созданный генотерапевтический ДНК-вектор с целевым геном может быть использован для введения в клетки организма животных и человека, характеризующихся сниженной или недостаточной экспрессией функционального белка, кодируемого данным геном, или наличием мутаций в целевом гене, приводящим к экспрессии нефункционального белка, обеспечивая таким образом достижение терапевтического эффекта.
Задача, поставленная в данном изобретении, решена, а именно: конструирование генотерапевтического ДНК-вектора для повышения уровня экспрессии гена HFE, сочетающего в себе следующие свойства:
I) Эффективность повышения экспрессии целевого гена в эукариотических клетках за счет полученных генотерапевтических векторов с минимальным размером;
II) Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов и генов антибиотикорезистентности;
III) Технологичность получения и возможность наработки в штаммах в промышленных масштабах;
IV) Также решена задача по конструированию штамма, несущего этот генотерапевтический ДНК-вектор для производства этого генотерапевтического ДНК-вектора.
Это подтверждается примерами:
для п. I - пример 1, 2, 3, 4, 5; 6; 7;
для п. II - пример 1, 2, 3, 4, 5; 6;7;
для п. III и п. IV - пример 8, 9.
Промышленная применимость:
Все представленные выше примеры подтверждают промышленную применимость предлагаемого генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген HFE для повышения уровня экспрессии этого целевого гена, штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE, несущего генотерапевтический ДНК-вектор, способа получения генотерапевтического ДНК-вектора, способа производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора.
Перечень сокращений
GDTT1.8NAS12 - вектор генотерапевтический, не содержащий последовательностей вирусных геномов и маркеров антибиотико-резистентности (vector therapeutic virus-antibiotic-free)
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота
п.н. - пар нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
мл - миллилитр, мкл - микролитр
куб. мм - кубический миллиметр
л - литр
мкг - микрограмм
мг - миллиграмм
г - грамм
мкМ - микромоль
мМ - миллимоль
мин - минута
сек - секунда
об/мин - обороты в минуту
нм - нанометр
см - сантиметр
мВт - милливатт
о.е. ф-относительная единица флуоресценции
РВС - фосфатно-солевой буфер
PBMC - мононуклеарные клетки периферической крови
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ГЕНЕТИК ДИАГНОСТИКС ЭНД ТЕРАПИ 21 ЛТД (GENETIC DIAGNOSTICS AND THERAPY 21 LTD), Общество с ограниченной ответственностью «РЕКОМБИТЕХ»
<120> Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген HFE для повышения уровня экспрессии этого целевого гена, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора.
<160> 1
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 3604
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 1
ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccagggac cgtaaaaagg 60
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 120
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 180
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 240
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 300
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 360
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 420
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 480
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc 540
tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 600
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 660
ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacct cgaccgtgag gctccggtgc ccgtcagtgg 720
gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc 780
ggtgcctaga gaaagtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc 840
ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt 900
tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct 960
ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta cttccacgcc cctggctgca 1020
gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg tgggagagtt cgaggccttg 1080
cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctgggc gctggggccg 1140
ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc 1200
catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa 1260
tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc 1320
ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat 1380
cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg 1440
tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag 1500
atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga 1560
gcgggcgggt gagtcacccg cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc 1620
atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct cgagcttttg 1680
gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc cccacactga 1740
gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct tggaatttgc 1800
cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt 1860
tcttccattt caggtgtcgt gaaaactacc cctaaaagcc aggatccgat atcgtcgacc 1920
accatgggcc cgcgagccag gccggcgctt ctcctcctga tgcttttgca gaccgcggtc 1980
ctgcaggggc gcttgctgcg ttcacactct ctgcactacc tcttcatggg tgcctcagag 2040
caggaccttg gtctttcctt gtttgaagct ttgggctacg tggatgacca gctgttcgtg 2100
ttctatgatc atgagagtcg ccgtgtggag ccccgaactc catgggtttc cagtagaatt 2160
tcaagccaga tgtggctgca gctgagtcag agtctgaaag ggtgggatca catgttcact 2220
gttgacttct ggactattat ggaaaatcac aaccacagca aggagtccca caccctgcag 2280
gtcatcctgg gctgtgaaat gcaagaagac aacagtactg agggctactg gaagtacggg 2340
tatgatgggc aggaccacct tgaattctgc cctgacacac tggattggag agcagcagaa 2400
cccagggcct ggcccaccaa gctggagtgg gaaaggcaca agattcgggc caggcagaac 2460
agggcctacc tggagaggga ctgccctgca cagctgcagc agttgctgga gctggggaga 2520
ggtgttttgg accaacaagt gcctcctttg gtgaaggtga cacatcatgt gacctcttca 2580
gtgaccactc tacggtgtcg ggccttgaac tactaccccc agaacatcac catgaagtgg 2640
ctgaaggata agcagccaat ggatgccaag gagttcgaac ctaaagacgt attgcccaat 2700
ggggatggga cctaccaggg ctggataacc ttggctgtac cccctgggga agagcagaga 2760
tatacgtgcc aggtggagca cccaggcctg gatcagcccc tcattgtgat ctgggagccc 2820
tcaccgtctg gcaccctagt cattggagtc atcagtggaa ttgctgtttt tgtcgtcatc 2880
ttgttcattg gaattttgtt cataatatta aggaagaggc agggttcaag aggagccatg 2940
gggcactacg tcttagctga acgtgagtga ggtaccgaat tccctgtgac ccctccccag 3000
tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat 3060
taagttgcat cattttgtct gactaggtgt ccttctataa tattatgggg tggagggggg 3120
tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg 3180
aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc 3240
aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc 3300
tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac ggggtttcac catattggcc aggctggtct 3360
ccaactccta atctcaggtg atctacccac cttggcctcc caaattgctg ggattacagg 3420
cgtgaaccac tgctcccttc cctgtcctta cgcgtagaat tggtaaagag agtcgtgtaa 3480
aatatcgagt tcgcacatct tgttgtctga ttattgattt ttggcgaaac catttgatca 3540
tatgacaaga tgtgtatcta ccttaactta atgattttga taaaaatcat taactagtcc 3600
atgg 3604
Перечень последовательностей олигонулеотидов:
(1) Олигонуклеотид UCori-Bam GGATCCAGATCTACTCGAGGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTC
(2) Олигонуклеотид UCori-Nco AGTCCATGGATAACGCAGGAAAGAACATGTG
(3) Олигонуклеотид hGH-F AGGATCCGAATTCCCTGTGACCCCTCCCCAG
(4) Олигонуклеотид hGH-R CTCTTTACCAATTCTACGCGTAAGGACAGGGAAGGGAGCA
(5) Олигонуклеотид RO-F CTTCCCTGTCCTTACGCGTAGAATTGGTAAAGAGAGTCGT
(6) Олигонуклеотид RO-R CCGTAGAAAACTAGTTAATGATTTTTATCAAAATCATTAAG
(7) Олигонуклеотид RO-1 GAATTGGTAAAGAGAGTCGTGTAAAATATCGAGTTCGCACATCTTGTTG
(8) Олигонуклеотид RO-2 GATTTTTGGCGAAACCATTTGATCATATGACAAGATGTGTATCTACC
9) Олигонуклеотид RO-3 ATGATTTTTATCAAAATCATTAAGTTAAGGTAGATACACATCTTGTC
(10) Олигонуклеотид Kan-F AAATCATTAACTAGTTTTCTACGGGGTCTGACGC
(11) Олигонуклеотид Kan-R CAGCCATGGACTAGTGGTGGCACTTTTCGGGGA
(12) Олигонуклеотид MCS1 GATCCGATATCGTCGACAAGCTTGGTACCT
(13) Олигонуклеотид MCS2 CAAGCTTGTCGACGATATCG
(14) Олигонуклеотид MCS3 CCGGAGCGGCCGCTCTAGAGCTAGCGACGTCG
(15) Олигонуклеотид MCS4 AATTCGACGTCGCTAGCTCTAGAGCGGCCGCTCCGGAGGTAC
(16) Олигонуклеотид EF1-Xho ATCTCGAGCGTGAGGCTCCGGTGCC
(17) Олигонуклеотид EF1-R TCGGATCCTGGCTTTTAGGGGTAGTTTTC
<---

Claims (12)

1. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением функций белка HFE, ответственного за регуляцию обмена железа в организме человека, для терапии заболеваний связанных с нарушением экспрессии гена HFE, в том числе, обусловленных недостаточностью экспрессии гена HFE и/или наличием мутаций в гене HFE, в том числе при гемахроматозе, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена HFE, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с получением генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1.
2. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген HFE по п.1, отличающийся тем, что созданный генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE по п.1 за счет ограниченного размера векторной части GDTT1.8NAS12, не превышающей 2600 п.н., обладает способностью эффективно проникать в клетки человека и животных и экспрессировать клонированный в него целевой ген HFE.
3. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген HFE по п.1, отличающийся тем, что в составе созданного генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HFE по п.1 в качестве структурных элементов используют нуклеотидные последовательности, которые не являются генами антибиотикорезистентности, вирусными генами и регуляторными элементами вирусных геномов, обеспечивая возможность его безопасного применения для генетической терапии человека и животных.
4. Способ получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген HFE по п.1, заключающийся в том, что генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE получают следующим образом: кодирующую часть целевого гена HFE клонируют в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 и получают генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE, SEQ ID №1, при этом кодирующую часть целевого гена HFE получают путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации с использованием созданных олигонуклеотидов и расщеплением продукта амплификации соответствующими эндонуклеазами рестрикции, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводят по сайтам рестрикции SalI и KpnI, причем селекцию проводят без антибиотиков,
при этом при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 HFE, SEQID №1 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды
HFE-up TTTGTCGACCACCATGGGCCCGCGAGCCAGGCCGG
HFE-lo AATGGTACCTCACTCACGTTCAGCTAAGACGTAGTGC,
а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена HFE в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции SalI и KpnI.
5. Способ использования генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген HFE по п.1 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением функций белка HFE, ответственного за регуляцию обмена железа в организме человека, для терапии заболеваний, связанных с нарушением экспрессии гена HFE, в том числе, обусловленных недостаточностью экспрессии гена HFE и/или наличием мутаций в гене HFE, в том числе при гемахроматозе, заключающийся в трансфекции выбранным генотерапевтическим ДНК-вектором, несущим целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, клеток органов и тканей пациента или животного, и/или во введении в органы и ткани пациента или животного аутологичных клеток этого пациента или животного, трансфицированных выбранным генотерапевтическим ДНК-вектором, несущим целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 и/или во введении в органы и ткани пациента или животного выбранного генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, или в сочетании обозначенных способов.
6. Способ получения штамма для производства генотерапевтического ДНК-вектора по п.1 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением функций белка HFE, ответственного за регуляцию обмена железа в организме человека, для терапии заболеваний связанных с нарушением экспрессии гена HFE, в том числе, обусловленных недостаточностью экспрессии гена HFE и/или наличием мутаций в гене HFE, в том числе при гемахроматозе, заключающийся в получении электрокомпетентных клеток штамма Escherichiacoli JM110-NAS с последующим проведением электропорации этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HFE, после чего клетки высеивают на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы, а также 10 мкг/мл хлорамфеникола с получением в результате штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE.
7. Штамм Escherichiacoli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE, полученный способом по п.6, несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением функций белка HFE, ответственного за регуляцию обмена железа в организме человека, для терапии заболеваний связанных с нарушением экспрессии гена HFE, в том числе, обусловленных недостаточностью экспрессии гена HFE и/или наличием мутаций в гене HFE, в том числе при гемахроматозе.
8. Способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген HFE по п.1 для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением функций белка HFE, ответственного за регуляцию обмена железа в организме человека, для терапии заболеваний связанных с нарушением экспрессии гена HFE, в том числе, обусловленных недостаточностью экспрессии гена HFE и/или наличием мутаций в гене HFE, в том числе при гемахроматозе, заключающийся в том, что генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HFE получают путем того, что засевают в колбу с приготовленной средой затравочную культуру штамма Escherichiacoli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE, затем инкубируют затравочную среду в шейкере-инкубаторе и переносят ее в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт, многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами.
RU2019145031A 2019-12-30 2019-12-30 Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген HFE для повышения уровня экспрессии этого целевого гена, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора RU2733429C1 (ru)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019145031A RU2733429C1 (ru) 2019-12-30 2019-12-30 Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген HFE для повышения уровня экспрессии этого целевого гена, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора
PCT/RU2021/000074 WO2021137742A1 (ru) 2019-12-30 2021-02-20 Генотерапевтический днк-вектор

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019145031A RU2733429C1 (ru) 2019-12-30 2019-12-30 Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген HFE для повышения уровня экспрессии этого целевого гена, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2733429C1 true RU2733429C1 (ru) 2020-10-01

Family

ID=72926878

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019145031A RU2733429C1 (ru) 2019-12-30 2019-12-30 Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген HFE для повышения уровня экспрессии этого целевого гена, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2733429C1 (ru)
WO (1) WO2021137742A1 (ru)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7078513B1 (en) * 1996-04-04 2006-07-18 Bio-Rad Laboratories, Inc. Plasmids comprising nucleic acids from the hereditary hemochromatosis gene
RU2678756C1 (ru) * 2017-08-25 2019-01-31 Селл энд Джин Терапи Лтд Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, способ его получения, штамм Escherichia coli SCS110-AF, способ его получения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, способ его получения
US20190076551A1 (en) * 2016-03-16 2019-03-14 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hereditary haemochromatosis

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7078513B1 (en) * 1996-04-04 2006-07-18 Bio-Rad Laboratories, Inc. Plasmids comprising nucleic acids from the hereditary hemochromatosis gene
US20190076551A1 (en) * 2016-03-16 2019-03-14 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hereditary haemochromatosis
RU2678756C1 (ru) * 2017-08-25 2019-01-31 Селл энд Джин Терапи Лтд Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, способ его получения, штамм Escherichia coli SCS110-AF, способ его получения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, способ его получения

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021137742A1 (ru) 2021-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11634727B2 (en) Recombinant nucleic acid molecule of transcriptional circular RNA and its application in protein expression
AU2015243922B2 (en) Production of engineered T-cells by sleeping beauty transposon coupled with methotrexate selection
US11046975B2 (en) Bicistronic expression vector for antibody expression and method for producing antibody using same
AU770119B2 (en) Methods for making recombinant cells
MX2011000535A (es) Nuevos elementos reguladores.
EP3083676A1 (en) Novel eukaryotic cells and methods for recombinantly expressing a product of interest
IL292351A (en) Methods for producing chimeric antigen receptor t cells
KR20220097984A (ko) 키메라 항원 수용체를 발현하는 t 세포를 제조하기 위한 제조 방법
TW201231650A (en) Process for production of protein
US20220041999A1 (en) Methods to enrich genetically engineered t cells
WO2020139152A1 (en) Gene therapy dna vector and its application
RU2733429C1 (ru) Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген HFE для повышения уровня экспрессии этого целевого гена, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора
CN107429248A (zh) 非编码rna用于细胞培养和选择的方法及组合物
Kurtti et al. Transgene expression and silencing in a tick cell line: a model system for functional tick genomics
RU2793971C1 (ru) ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANGPT1 для повышения уровня экспрессии целевого гена ANGPT1, способ его получения и применения
RU2794133C1 (ru) ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-VEGFA для повышения уровня экспрессии целевого гена VEGFA, способ его получения и применения
RU2793809C1 (ru) ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HIF1α для повышения уровня экспрессии целевого гена HIF1α и способ применения
RU2774352C2 (ru) ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-ANG для повышения уровня экспрессии целевого гена ANG в организме человека и животных, способ его применения
WO2018150345A1 (en) An expression vector
CN113166771A (zh) 基因治疗dna载体gdtt1.8nas12及用于获得它的方法
WO2022243320A1 (en) Method for producing a biomolecule by a cell
JP2023515501A (ja) 強化された発現系及びその使用方法
RU2714763C1 (ru) Генотерапевтический ДНК-вектор для таргетной генной терапии, способ его получения (варианты), штамм для его производства, способ его получения
US11618904B2 (en) Promoter with an enriched Cytosine-Guanine dinucleotide region, vectors, cellular lines, method for producing recombinant protein
CN112996914A (zh) 基于载体VTvaf17的基因治疗