RU2759227C2 - ДНК-вакцина против вируса SARS-CoV-2 на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, способ ее получения, штаммы, несущие генотерапевтические ДНК-вектора, способ их получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтических ДНК-векторов - Google Patents

ДНК-вакцина против вируса SARS-CoV-2 на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, способ ее получения, штаммы, несущие генотерапевтические ДНК-вектора, способ их получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтических ДНК-векторов Download PDF

Info

Publication number
RU2759227C2
RU2759227C2 RU2020113297A RU2020113297A RU2759227C2 RU 2759227 C2 RU2759227 C2 RU 2759227C2 RU 2020113297 A RU2020113297 A RU 2020113297A RU 2020113297 A RU2020113297 A RU 2020113297A RU 2759227 C2 RU2759227 C2 RU 2759227C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
dna
gene therapy
cov
gene
sars
Prior art date
Application number
RU2020113297A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2020113297A (ru
RU2020113297A3 (ru
Inventor
Антон Гамолски
Original Assignee
Генетик Диагностикс Энд Терапи 21 Лтд
Общество с ограниченной ответственностью «РЕКОМБИТЕХ»
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Генетик Диагностикс Энд Терапи 21 Лтд, Общество с ограниченной ответственностью «РЕКОМБИТЕХ» filed Critical Генетик Диагностикс Энд Терапи 21 Лтд
Priority to RU2020113297A priority Critical patent/RU2759227C2/ru
Priority to PCT/RU2021/000148 priority patent/WO2021206587A1/en
Publication of RU2020113297A publication Critical patent/RU2020113297A/ru
Publication of RU2020113297A3 publication Critical patent/RU2020113297A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2759227C2 publication Critical patent/RU2759227C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Abstract

Изобретение относится к генной инженерии. Описана ДНК-вакцина против вируса SARS-CoV-2 на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, состоящая из композиции генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 соответственно, причем генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-S имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID №1, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-M имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID №2, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-N имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID №3, при этом каждая из нуклеотидных последовательностей SEQ ID №1, SEQ ID №2 и SEQ ID №3 клонирована в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12. Также представлен способ получения указанной вакцины и способ её производства в промышленных масштабах. Изобретение расширяет арсенал средств для иммунизации человека против вируса SARS-CoV-2. 4 н. и 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 11 пр.

Description

Область техники
Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в биотехнологии, медицине в качестве ДНК-вакцины для иммунизации человека против вируса SARS-CoV-2.
Уровень техники
По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), на долю инфекционных заболеваний приходится 25% от общего количества смертей на планете ежегодно. Надежда в области предупреждения и терапии инфекционных, а также уже и многих других (онкологических, аутоиммунных) заболеваний возлагается на новые разработки генетической профилактики с помощью ДНК-вакцин. Генетическая профилактика, как и генетическая терапия является важнейшей составляющей частью современной молекулярной медицины.
В зависимости от методов получения вакцин, их разделяют на типы:
• живые аттенуированные вакцины (ЖАВ) (полиомиелит, корь, краснуха, грипп, эпидемический паротит, ветряная оспа, туберкулез, ротавирусная инфекция)
• инактивированные вакцины (ИВ) (грипп, брюшной тиф, клещевой энцефалит, бешенство, гепатит А, менингококковая инфекция и др.)
• вакцины, содержащие очищенные компоненты микроорганизмов (анатоксины, токсоиды. Пример: коклюш, дифтерия, столбняк)
•рекомбинантные вакцины, содержащие компоненты микроорганизмов, полученные методом генной инженерии, в том числе и ДНК-вакцины (рекомбинантная вакцина против гепатита В).
Рекомбинантная вакцина на основе ДНК (также ДНК-вакцина, генная вакцина, вакцина на основе нуклеиновых кислот) — генно-инженерная конструкция, в том числе, на основе двуцепочечной плазмиды (плазмидного вектора, ДНК-вектора, генотерапевтического ДНК-вектора), несущая последовательность ДНК, кодирующую иммуногенный белок патогенного микроорганизма (или ДНК опухолевого антигена) и регуляторные генетические элементы, обеспечивающие экспрессию кодируемого белка в клетке. Плазмиды нарабатываются с помощью процедуры клонирования в культуре бактериальных клеток (E. coli), очищаются от примесей и других бактериальных ДНК (Anderson R. J.; Schneider J. Plasmid DNA and viral vector-based vaccines for the treatment of cancer (англ.) // Vaccine (англ.)русск. : journal. - Elsevier, 2007. - Vol. 25. - P. 24-34. - doi:10.1016/j.vaccine.2007.05.030). После введения очищенной конструкции в клетку, закодированный в ДНК белок (или опухолевый антиген) экспрессируется и взывает реакцию иммунной системы на патоген или раковую клетку, несущую данный антиген. При этом плазмиды, содержащие соответствующий ген, не встраиваются в ДНК хромосом человека, то есть не обладают мутагенным эффектом. Одно из преимуществ подхода состоит в том, что генетическая иммунизация может обеспечивать не только выработку антител (гуморальный иммунитет), но и специфический цитотоксичный ответ (клеточный иммунитет) (Ferraro B.; Matthew P. Morrow, Natalie A. Hutnick; Others. Clinical Applications of DNA Vaccines: Current Progress (англ.) // Clin Infect Dis. (англ.)русск. : journal. - 2011. - Vol. 53, no. 3. - P. 296-302. - doi:10.1093/cid/cir334), что ранее было достижимо только с помощью живых вакцин. Активация цитотоксических Т-клеток без введения живого патогена является важнейшей отличительной чертой ДНК-вакцин.
Несомненным преимуществом ДНК-вакцин является экспрессия вирусных агентов в их нативной форме. При иммунизации вирусными белками, в процессе их производственного получения и очистки может произойти изменение трехмерной конфигурации белка (нарушение фолдинга), что снизит эффективность иммунизации.
ДНК-вакцины значительно превосходят живые аттенуированные вакцины или некоторые рекомбинантные вакцины на основе живых вирусных векторов по безопасности, так как в организме нарабатывается лишь отдельный специфический белок, обладающий свойствами антигена, но самостоятельно не способный вызвать заболевание.
В качестве других преимуществ ДНК-вакцин можно перечислить следующие: экспрессированный антиген можно избирательно направлять на путь HLA-I или HLA-II; обеспечение долговременной экспрессии антигена; простота изготовления и низкая цена производства; нетребовательность к условиям хранения; могут применяться как для профилактики, так и для лечения; потенциально эффективны против широкого спектра болезней: бактериальных, вирусных, аутоиммунных и онкологических заболеваний.
Особенно остро стоит вопрос об использовании ДНК-вакцин для профилактики вирусных заболеваний, вызывающих эпидемии, даже пандемии, поражающие огромное число людей. Ярким примером возбудителя такого заболевания является коронавирус SARS-CoV-2 (GenBank MN908947.3),обнаруженный в Китае в конце 2019 года и вызвавший пандемию. Вакцин для профилактики подобного коронавируса, в том числе, вызвавшего эпидемию в 2003 г. (SARS) до сих пор не существует.
При создании ДНК-вакцины против вируса SARS-CoV-2следует учитывать, что наиболее вероятными кандидатами в качестве антигенов являются иммуногенные эпитопы белков S, M, N, Е вируса SARS-CoV-2 (Zhang J, Zeng H, Gu J, Li H, Zheng L, Zou Q. Progress and Prospects on Vaccine Development against SARS-CoV-2. Vaccines (Basel). 2020 Mar 29;8(2). pii: E153. doi: 10.3390/vaccines8020153).
Белок S (spike protein; белок, образующий «шипы») является наиболее перспективным для создания вакцин, в том числе, ДНК-вакцин. Во-первых, этот белок экспонирован на поверхности вируса и напрямую распознается иммунной системой. Во-вторых, он связывается с рецептором АСЕ2 (ангиотензин-превращающий фермент 2 человека) на поверхности клетки для последующего проникновения (Lan, J.; Ge, J.; Yu, J.; Shan, S.; Zhou, H.; Fan, S.; Zhang, Q.; Shi, X.;Wang, Q.; Zhang, L.; et al. Crystal structure of the 2019-nCoV spike receptor-binding domain bound with the ACE2 receptor. BioRxiv 2020).Показано, что фрагменты белка S также обладают иммуногенными свойствами (Zhu, X.; Liu, Q.; Du, L.; Lu, L.; Jiang, S. Receptor-binding domain as a target for developing SARS vaccines.
J. Thorac. Dis. 2013, 5 (Suppl. 2), S142–S148).
Белок М (memrane protein, мембранный белок) – гликопротеин, ответственный за сборку вируса, является наиболее представленным белком на поверхности вирусной частицы (Neuman, B.W.; Kiss, G.; Kunding, A.H.; Bhella, D.; Baksh, M.F.; Connelly, S.; Droese, B.; Klaus, J.P.; Makino, S.; Sawicki, S.G.; et al. A structural analysis of M protein in coronavirus assembly and morphology. J. Struct. Biol. 2011, 174, 11–22).
Белок N (nucleocapsid protein, нуклеокапсидный белок) – высокоантигенный белок, связан с геномной РНК и играет роль в процессах репликации и транскрипции вирусной РНК (McBride, R.; van Zyl, M.; Fielding, B.C. The coronavirus nucleocapsid is a multifunctional protein. Viruses 2014, 6, 2991–3018).
Белок Е (envelope protein, белок оболочки) – основной фактор вирулентности вируса SARS-CoV-2, играет важную роль в морфогенезе и сборке вирусных частиц (Nieto-Torres, J.L.; DeDiego, M.L.; Verdia-Baguena, C.; Jimenez-Guardeno, J.M.; Regla-Nava, J.A.; Fernandez-Delgado, R.; Castano-Rodriguez, C.; Alcaraz, A.; Torres, J.; Aguilella, V.M.; et al. Severe acute respiratory syndrome coronavirus envelope protein ion channel activity promotes virus fitness and pathogenesis. PLoS Pathog. 2014, 10, e1004077.).
Однако при составлении композиции из генотерапевтических ДНК-векторов, входящих в ДНК-вакцину, целесообразно ограничиться тремя ДНК-векторами, кодирующими иммуногенные эпитопы белков вируса, т.к. формирование композиции из большего количества ДНК-векторов, может быть ограничено дозой вводимой вакцины, что приводит к недостаточному для формирования полноценного иммунного ответа уровню экспрессии каждого антигена.
Таким образом, предшествующий уровень техники свидетельствует о том, что ДНК-вакцины обладают потенциалом для масштабного вакцинирования населения, в частности против SARS-CoV-2. Этим обусловлено создание врамках данного патента ДНК-вакцины в виде композиции генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2.
Анализ подходов для создания ДНК-вакцин подразумевает возможность использования различных генотерапевтических векторов.
Генотерапевтические векторы разделяют на вирусные, клеточные и ДНК-векторы (Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal Products EMA/CAT/80183/2014). В последнее время в генной терапии всё большее внимание уделяется разработке невирусных систем доставки генетического материала, среди которых лидируют плазмидные векторы. Плазмидные векторы лишены недостатков, присущих клеточным и вирусным векторам. В клетке-мишени они существуют в эписомальной форме, не интегрируют в геном, производство их достаточно дешево, отсутствие иммунного ответа и побочных реакций на введение плазмидного вектора делают их удобным инструментом генной терапии и генетической профилактики (ДНК-вакцины) (Li L, Petrovsky N. // Expert Rev Vaccines. 2016;15(3):313-29).
Тем не менее, ограничениями для использования плазмидных векторов для генной терапии и ДНК-вакцинации являются: 1) наличие генов устойчивости к антибиотикам для наработки в бактериальных штаммах, 2) наличие различных регуляторных элементов, представленных последовательностями вирусных геномов 3) размер терапевтического плазмидного вектора, определяющий эффективность проникновения вектора в клетку-мишень.
Известно, что Европейское агентство по лекарственным средствам считает необходимым избегать введения маркеров антибиотикорезистентности в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии (Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011 EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies). Данная рекомендация связана, в первую очередь, с потенциальной опасностью проникновения ДНК-вектора или горизонтального переноса генов антибиотикорезистентности в клетки бактерий, представленных в организме в составе нормальной или оппортунистической микрофлоры. Помимо этого, наличие генов антибиотикорезистентности значительно увеличивает размер ДНК-вектора, что приводит к снижению эффективности его проникновения в эукариотические клетки.
Необходимо отметить, что гены антибиотикорезистентности также вносят принципиальный вклад в способ получения ДНК-векторов. В случае наличия генов антибиотикорезистентности штаммы для наработки ДНК-векторов обычно культивируются в среде, содержащей селективный антибиотик, что создает риск наличия следовых количеств антибиотика в недостаточно очищенных препаратах ДНК-векторов. Таким образом, получение ДНК-векторов для генной терапии, в которых отсутствуют гены антибиотикорезистентности, связано с получением штаммов, обладающих такой отличительной особенностью как способность к стабильной амплификации целевых ДНК-векторов в среде без содержания антибиотиков.
Кроме того, Европейское Медицинское Агентство рекомендует избегать наличия в составе терапевтических плазмидных векторов регуляторных элементов для повышения экспрессии целевых генов (промоторов, энхансеров, посттрансляционных регуляторных элементов), являющихся нуклеотидными последовательностями геномов различных вирусов (Draft Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products,http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/05/WC500187020.pdf).Данные последовательности, хотя и могут увеличивать уровень экспрессии целевого трансгена, однако создают риск рекомбинации с генетическим материалом вирусов дикого типа и интеграции в геном эукариотической клетки. Более того, целесообразность гиперэкспрессии того или иного гена в целях терапии или вакцинации остается нерешенным вопросом.
Также, существенным моментом является размер терапевтического вектора. Известно, что современные плазмидные векторы зачастую перегружены нефункциональными участками, серьезно увеличивающими размер вектора (Mairhofer J, Grabherr R. // Mol Biotechnol. 2008.39(2):97-104). Например, ген устойчивости к ампициллину в векторах серии pBR322, как правило, состоит из не менее чем 1000 п.н., что составляет более 20% от размера самого вектора. При этом наблюдается обратная зависимость между размером вектора и его способностью проникать в эукариотические клетки – ДНК-векторы с небольшим размером эффективней проникают в клетки человека и животных. Так, например, в серии экспериментов по трансфекции клеток HELA ДНК-векторами с размером от 383 до 4548 п.н. было показано, что разница в эффективности проникновения может достигать двух порядков (отличаться в 100 раз) (Hornstein BD etal. // PLoS ONE. 2016;11(12): e0167537.).
Таким образом при выборе ДНК-вектора в целях безопасности и наибольшей эффективности следует отдавать предпочтение тем конструкциям, в которых не содержатся гены устойчивости к антибиотикам, последовательности вирусного происхождения и размер которых позволяет эффективно проникать в эукариотические клетки. Штамм для получения такого ДНК-вектора в количествах, достаточных для целей генной терапии, должен обеспечивать возможность стабильной амплификации ДНК-вектора с использованием питательных сред, не содержащих антибиотики.
Примером использования ДНК-векторов для иммунизации является способ получения плазмидных векторов для ДНК-вакцинации с целью получения протективного иммунного ответа против вируса гриппа по патенту US10363302. Векторы представляют собой плазмиды, несущие последовательности, кодирующие гены гемагглютинина и нейраменидазы вируса гриппа под контролем различных регуляторных элементов. Недостатком данного изобретения является наличие в составе ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой последовательности вирусных геномов и генов антибиотикорезистентности.
Примером использования рекомбинантных ДНК-векторов для ДНК-вакцинации также является способ получения рекомбинантного вектора для генетической иммунизации по патенту US 9550998 В2. Вектор представляет собой суперскрученный плазмидный ДНК-вектор и предназначен для экспрессии клонированных генов в клетках животных и человека. Вектор состоит из ориджина репликации, регуляторных элементов, включающих промотор и энхансер цитомегаловируса человека, регуляторные элементы из Т-лимфотропного вируса человека.
Накопление вектора проводят в специальном штамме E. coli без использования антибиотиков за счет антисенс-комплементации гена sacB, введенного в штамм посредством бактериофага. Недостатком данного изобретения является наличие в составе ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой последовательности вирусных геномов.
Прототипами настоящего изобретения являются следующие заявки/ патенты.
В патенте US10548971 описаны плазмидные векторы в качестве вакцины против коронавируса MERS-CoV - возбудителя ближневосточного респираторного синдрома (Middle East Respiratory Syndrome coronavirus). Гены, кодирующие последовательности белка S (Spike, белок, образующий «шипы») были клонированы в составе плазмидного вектора pVAX1 (Life Technologies, США). Недостатком данного изобретения является наличие в составе вектора последовательностей вирусного происхождения и генов антибиотикорезистентности.
В патенте RU2678756 описан генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, способ его получения, штамм Escherichia coli SCS110-AF, способ его получения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, способ его получения. Недостатком данного изобретения является значительный размер векторной части, что может негативно отразиться на эффективности доставки ДНК-вектора в клетки.
В патенте RU 2332457описаны плазмидные векторы, включающие один, два или более генов pgsB, pgsC и pgsA, кодирующих комплекс синтетазы поли-гамма-глутаминовой кислоты, и находящийся с ними в одной рамке считывания ген, кодирующий белок-антиген шипов (S) или белок-антиген нуклеокапсида (N) коронавируса SARS (Severe acute respiratory syndrome coronavirus, коронавирус, вызывающий тяжелый респираторный синдром). Недостатком данного изобретения является неопределенность целей использования данного изобретения и неопределенные требования к безопасности используемых векторов.
В патенте RU 2383621 описывается ДНК-вектор для генетической иммунизации, состоящий из нескольких транскрипционных единиц и включающий в себя последовательности, кодирующие гены М, Е, S коронавируса SARS.Недостатком данного изобретения является наличие в составе ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой последовательности вирусных геномов и генов антибиотикорезистентности Существенным недостатком данного решения является использование антигенов вируса другого вида семейства коронавирусов.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является конструирование ДНК-вакцины против вируса SARS-CoV-2 в виде композиции генотерапевтических ДНК-векторов на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, сочетающей в себе следующие свойства:
I) Эффективность генотерапевтических ДНК-векторов для повышения уровня экспрессии целевых генов в эукариотических клетках, входящих в ДНК-вакцину и ДНК-вакцины.
II) Возможность безопасного применения для генетической терапии и вакцинации человека за счет отсутствия в составе генотерапевтических ДНК-векторов регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов.
III) Возможность безопасного применения для генетической терапии и вакцинации человека за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов антибиотикорезистентности.
IV) Технологичность получения и возможность наработки ДНК-вакцины в промышленных масштабах.
Эффективность ДНК-вакцины по пункту I обеспечивается за счет включения в ее состав оптимального количества генотерапевтических ДНК-векторов на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущих последовательности, кодирующие наиболее иммуногенные эпитопы белков вируса SARS-CoV-2. Данный подход является предпочтительным, т.к. при конструировании одного генотерапевтического ДНК-вектора в который клонировано несколько последовательностей, кодирующих иммуногенные эпитопы белков вируса SARS-CoV-2 возможно снижение уровня экспрессии целевых генов, кодирующих вирусные антигены, из-за увеличения размера генотерапевтического вектора, приводящее к снижению эффективности проникновения ДНК-вектора в клетки организма.
Пункты II и III предусмотрены в данном техническом решении в соответствии с рекомендациями государственных регуляторов к лекарственным средствам для генной терапии, в частности, Европейского Агентства по лекарственным средствам касательно отказа от введения маркеров антибиотикорезистентности в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии (Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011, EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies) и касательно отказа от введения в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии элементов вирусных геномов (Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products / 23 March 2015, EMA/CAT/80183/2014, Committee for Advanced Therapies).
Задачей изобретения также является конструирование штаммов, несущих генотерапевтические ДНК-вектора, для наработки и производства в промышленных масштабах этих генотерапевтических ДНК-векторов и ДНК-вакцины.
Поставленная задача решается за счет того, что создана ДНК-вакцина в виде композиции генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2, при этом генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-Sс нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1 содержит последовательность кодирующую иммуногенный эпитоп белка S вируса SARS-CoV-2, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-Mс нуклеотидной последовательностью SEQ ID №2 содержит последовательность кодирующую иммуногенный эпитоп белка M вируса SARS-CoV-2, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-Nс нуклеотидной последовательностью SEQ ID №3 содержит последовательность кодирующую иммуногенный эпитоп белка N вируса SARS-CoV-2, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12.
Каждый из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, входящих в ДНК-вакцину: GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N за счет ограниченного размера векторной части GDTT1.8NAS12, не превышающей 2600 п.н., обладает способностью эффективно проникать в клетки человека и животных и экспрессировать клонированный в него целевой белок S вируса SARS-CoV-2,целевой белок M вируса SARS-CoV-2 и целевой белок N вируса SARS-CoV-2.
В составе каждого из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, входящих в ДНК-вакцину: GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, в качестве структурных элементов используются нуклеотидные последовательности, которые не являются генами антибиотикорезистентности, и регуляторными элементами вирусных геномов, обеспечивая возможность его безопасного применения для генетической терапии и вакцинации человека.
Создан также способ получения ДНК-вакцины в виде композиции генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2, заключающийся в том, что каждый из генотерапевтических ДНК-векторов: GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N получают следующим образом: последовательности кодирующие иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 клонируют в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 и получают генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-S, SEQ ID №1, GDTT1.8NAS12-M, SEQ ID №2 и GDTT1.8NAS12-N, SEQ ID №3, соответственно, при этом последовательности кодирующих иммуногенных эпитопов белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 получают путем ферментативного синтеза из химически синтезированных олигонуклеотидов с последующим проведением ПЦР-амплификации с использованием созданных олигонуклеотидов и расщеплением продукта амплификации соответствующими эндонуклеазами рестрикции, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводят по сайтам рестрикции BamHI и EcoRI, причем селекцию проводят без антибиотиков,
при этом при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-S, SEQ ID №1 для проведения ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды
CoVgS1_Eu AGGATCCACCATGGTTAATCTTACAACCAGAACTC
CoVgS1-CTCAGGTACCGTCGACACGTGCCCGCCGAGGAGA,
а расщепление продукта амплификации и клонирование последовательности, кодирующей иммуногенный эпитоп белка S вируса SARS-CoV-2 в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI,
причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-M, SEQ ID №2 для проведения ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды
CoVgM_Eu AGGATCCACCATGGCAGATTCCAACGGTACTATTAC
CoVgM-CTCGAATTCTTAGTCGACCTGTACAAGCAAAGCAATATTGTC,
а расщепление продукта амплификации и клонирование последовательности, кодирующей иммуногенный эпитоп белка M вируса SARS-CoV-2 в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI,
причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-N, SEQ ID №3 для проведения ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды
CoVgN_Eu AGGATCCACCATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCA
CoVgN-C ATAGAATTCTTAGTCGACGGCCTGAGTTGAGTCAGCAC,
а расщепление продукта амплификации и клонирование последовательности, кодирующей иммуногенный эпитоп белка N вируса SARS-CoV-2 в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI,
затем для получения ДНК-вакцины полученные ранее генотерапевтические ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N смешивают в заданной пропорции, исходя из возможного концентрационного содержания каждого ДНК-вектора в ДНК-вакцине в диапазоне от 1% до 98% по массе, определяемого по результатам доклинических и клинических исследований.
Создан способ использования ДНК-вакцины в виде композиции генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2, заключающийся во введении в органы и ткани пациента ДНК-вакцины в виде композиции генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 исходя из возможного концентрационного содержания каждого ДНК-вектора в ДНК-вакцине в диапазоне от от 1% до 98% по массе, определяемого по результатам доклинических и клинических исследований, сочетанно с транспортной системой или во введении в органы и ткани пациента аутологичных клеток этого пациента, сочетанно трансфицированных генотерапевтическми ДНК-векторами GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, исходя из возможного концентрационного содержания каждого ДНК-вектора в композиции в диапазоне от от 1% до 98% по массе, определяемого по результатам доклинических и клинических исследований, для вакцинации человека против вируса SARS-CoV-2.
Создан способ производства в промышленных масштабах ДНК-вакцины в виде композиции генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2, заключающийся в том, что генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-S, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-M, и генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-N, получают путем того, что засевают в колбу с приготовленной средой затравочную культуру, выбранную из штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-S, штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-M и штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-N, затем инкубируют затравочную среду в шейкере-инкубаторе и переносят ее в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт, многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами, затем полученные генотерапевтические ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N смешивают в заданной пропорции, исходя из возможного концентрационного содержания каждого ДНК-вектора в ДНК-вакцине в диапазоне от 1% до 98% по массе, определяемого по результатам доклинических и клинических исследований, лиофилизируют, укупоривают и маркируют.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 приведены схемы генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S1, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2, которые представляют собой кольцевую двуцепочечную молекулу ДНК, способную к автономной репликации в клетках бактерии Escherichia coli.
На фиг.1 приведены схемы, соответствующие:
A - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-S,
B - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-M,
C - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-N.
На схемах отмечены следующие структурные элементы вектора:
 EF1a pr - промоторная область гена человеческого фактора элонгации EF1A с собственным энхансером, содержащимся в первом интроне гена. Служит для обеспечения высокого уровня транскрипции рекомбинантного гена в большинстве тканей человека;
рамка считывания последовательности, соответствующей фрагменту гена, кодирующего белок SSARS-CoV-2 (фиг. 1A), или фрагменту гена, кодирующего белок MSARS-CoV-2 (фиг. 1B), или фрагменту гена, кодирующего белок NSARS-CoV-2 (фиг. 1C) соответственно;
hGH TA – терминатор транскрипции;
pUCori  – ориджин репликации, служащий для автономной репликации с однонуклеотидной заменой для повышения копийности плазмиды в клетках большинства штаммов Escherichia coli;
RNAout – регуляторный элемент РНК-out транспозона Tn 10, обеспечивающий возможность положительной селекции без использования антибиотиков при использовании штамма Eshcerichia coli JM110NAS.
Отмечены уникальные сайты рестрикции.
На фиг.2 показаны графики накопления ампликонов кДНК фрагментов генов, кодирующих белки S, M, N вируса SARS-CoV-2 в первичной культуре клеток эпителия бронхов человека (Human Bronchial Epithelial Cells (HBEpC), Cell Applications, Inc., Кат.№502-05a) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток композицией генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.
На фиг.2 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:
1 – кДНК фрагмента гена, кодирующего белок S вируса SARS-CoV-2в первичной культуре клеток эпителия бронхов человека HBEpC до трансфекции композицией генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N;
2 – кДНК фрагмента гена, кодирующего белок M вируса SARS-CoV-2 в первичной культуре клеток эпителия бронхов человека HBEpC до трансфекции композицией генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N;
3 – кДНК фрагмента гена, кодирующего белок N вируса SARS-CoV-2 в первичной культуре клеток эпителия бронхов человека HBEpC до трансфекции композицией генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N;
4 – кДНК фрагмента гена, кодирующего белок S вируса SARS-CoV-2 в первичной культуре клеток эпителия бронхов человека HBEpC после трансфекции композицией генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N;
5 – кДНК фрагмента гена, кодирующего белок M вируса SARS-CoV-2 в первичной культуре клеток эпителия бронхов человека HBEpC после трансфекции композицией генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N;
6 – кДНК фрагмента гена, кодирующего белок N вируса SARS-CoV-2 в первичной культуре клеток эпителия бронхов человека HBEpC после трансфекции композицией генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N;
7–кДНК гена B2M в первичной культуре клеток эпителия бронхов человека HBEpC до трансфекции композицией генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N;
8–кДНК гена B2M в первичной культуре клеток эпителия бронхов человека HBEpC после трансфекции композицией генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N.
В качестве референтного гена использовали ген B2M человека (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.
На фиг.3 показана диаграмма концентрации фрагментов белков S, M, N вируса SARS-CoV-2в клеточном лизате первичной культуры клеток фибробластов легких человека (ATCС PCS-201-020) после трансфекции этих клеток композицией ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-Nс целью оценки функциональной активности ДНК-векторов, то есть экспрессии на уровне белка, по изменению количества фрагментов белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 в лизате клеток.
На фиг.3 отмечены следующие элементы:
культура А – первичная культура клеток фибробластов легких человека, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);
культура B - первичная культура клеток фибробластов легких человека, трансфицированных ДНК-вектором GDTT1.8NAS12;
культура C – первичная культура клеток фибробластов легких человека, трансфицированных композицией ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N.
На фиг. 4 показана диаграмма концентраций фрагментов белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 в мышечной ткани крыс линии Wistar трех групп после инъекционного введения композиции генотерапевтических векторов: GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N с целью оценки функциональной активности ДНК-векторов и демонстрации способа применения композиции генотерапевтических ДНК-векторов и ДНК-вакцины.
На фиг.4 отмечены следующие элементы:
КI – фрагменты мышечной ткани крыс группы I в зоне введения композиции генотерапевтических ДНК векторов: GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N;
КII – фрагменты мышечной ткани крыс группы II в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
КIII – фрагменты мышечной ткани крыс группы III (интактные).
На фиг.5 показана диаграмма концентраций фрагментов белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 в коже трех групп мышей линии C57BL/6 после инъекционного введения культуры незрелых дендритных клеток JAWSII (ATCC CRL-11904), сочетанно трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, кодирующими иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 с целью оценки функциональной активности ДНК-векторов, ДНК-вакцины и демонстрации способа применения в виде введения млекопитающему его аутологичных клеток, сочетанно трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами.
На фиг.5 отмечены следующие элементы:
MI – фрагменты кожи мышей группы I в зоне введения культуры незрелых дендритных клеток JAWSII, сочетанно трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N;
MII – фрагменты кожи мышей группы II в зоне введения культуры незрелых дендритных клеток JAWSII, трансфицированных генотерапевтическим ДНК вектором GDTT1.8NAS12 (плацебо);
MIII – фрагменты кожи мышей группы III (интактные).
Реализация изобретения
На основе ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. созданы генотерапевтические ДНК-векторы, кодирующие иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2. При этом способ получения каждого генотерапевтического ДНК-вектора, заключается в том, что в полилинкер генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 клонируют последовательности, кодирующие иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2, полученные путем ферментативного синтезаиз химически синтезированных олигонуклеотидов с последующей амплификацией. Известно, что способность ДНК-векторов проникать в эукариотические клетки обусловлена, главным образом, размером вектора. При этом ДНК-вектора с наименьшим размером обладают более высокой проникающей способностью. Таким образом, предпочтительным является отсутствие в составе вектора элементов, которые не несут функциональной нагрузки, но при этом увеличивают размер ДНК-вектора. Данные особенности ДНК-векторов были учтены при получении генотерапевтического ДНК-векторов на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, кодирующие иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2, путем отсутствия в составе вектора крупных нефункциональных последовательностей и генов антибиотикорезистентности, что позволило, помимо технологических преимуществ и преимуществ в плане безопасности применения, значительно уменьшить размер полученного генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, кодирующие иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2. Таким образом, способность проникать в эукариотические клетки полученного генотерапевтического ДНК-вектора обусловлена его небольшими размерами.
Каждый из генотерапевтических ДНК-векторов: ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N получали следующим образом: последовательности, кодирующие иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 клонировали в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 и получали генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-S,SEQ ID №1, GDTT1.8NAS12-M, SEQ ID №2 и GDTT1.8NAS12-N, SEQ ID №3 соответственно. Последовательность, кодирующую иммуногенный эпитоп белка S вируса SARS-CoV-2 размером 2022 п.н., последовательность, кодирующую иммуногенный эпитоп белка M вируса SARS-CoV-2 размером 675 п.н. и последовательность, кодирующую иммуногенный эпитоп белка N вируса SARS-CoV-2 размером 1266 п.н. получали путем ферментативного синтеза из химически синтезированных олигонуклеотидов с последующей амплификацией. Амплификацию проводили с использованием созданных для этого методом химического синтеза олигонуклеотидов. Расщепление продукта амплификации специфическими эндонуклеазами рестрикции проводили с учетом оптимальной процедуры дальнейшего клонирования, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводили по сайтам рестрикции BamHI, EcoRI, расположенными в полилинкере вектора GDTT1.8NAS12. Выбор сайтов рестрикции проводили таким образом, чтобы клонированный фрагмент попадал в рамку считывания экспрессионной кассеты вектора GDTT1.8NAS12, при этом белок-кодирующая последовательность не содержала сайты рестрикции для выбранных эндонуклеаз. При этом специалистам в данной области техники понятно, что методическая реализация получения генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N может варьировать в рамках выбора известных методов молекулярного клонирования генов, при этом эти способы подпадают под объем настоящего изобретения. Так, например, могут быть использованы различные последовательности олигонуклеотидов для амплификации генов, различные эндонуклеазы рестрикции или такие лабораторные техники как безлигазное клонирование генов.
Генотерапевтические ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N обладают нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1,SEQ ID №2 и SEQ ID №3 соответственно. При этом специалистам в данной области техники известно свойство вырожденности генетического кода, из которого следует, что под объем настоящего изобретения также подпадают варианты нуклеотидных последовательностей, отличающихся инсерцией, делецией или заменой нуклеотидов, которые не приводят к изменению полипептидной последовательности, кодируемой целевым геном, и/или не приводят к потере функциональной активности регуляторных элементов вектора GDTT1.8NAS12. При этом специалистам в данной области техники известно явление генетического полиморфизма, из которого следует, что под объем настоящего изобретения также подпадают варианты нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2, которые при этом кодируют различные варианты аминокислотных последовательностей белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 не отличающихся от приведенных по своей функциональной активности.
Способность проникать в эукариотические клетки и проявлять функциональную активность, то есть способность экспрессировать целевой ген, полученных генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N подтверждают путем сочетанного введения в эукариотические клетки полученных ДНК-векторов и последующим анализом экспрессии специфической мРНК и/или белкового продукта целевого гена. Наличие специфической мРНК в клетках, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N свидетельствует как о способности полученного вектора проникать в эукариотические клетки, так и о его способности экспрессировать мРНК целевого гена. При этом, как известно специалистам в данной области техники, наличие мРНК гена является обязательным условием, но не доказательством трансляции белка, кодируемого целевым геном. Поэтому для подтверждения свойства генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N экспрессировать целевой ген на уровне белка в эукариотических клетках, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор, проводили анализ концентрации белков, кодируемых целевыми генами, с использованием иммунологических методов. Наличие фрагментов белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 подтверждает эффективность экспрессии целевых генов в эукариотических клетках с помощью генотерапевтических ДНК-векторов на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2.
Таким образом, для подтверждения эффективности экспрессии созданных генотерапевтических ДНК-векторов кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2,использовали следующие методы:
А) ПЦР в реальном времени - изменение накопления ампликонов кДНК целевых генов в клетках человека, после трансфекции различных клеточных линий человека генотерапевтическим ДНК-векторами;
B) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в клетках человека, после трансфекции различных клеточных линий человека генотерапевтическими ДНК-векторами;
C) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в биоптатах тканей животного, после введения в эти ткани генотерапевтических ДНК-векторов;
D) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в биоптатах тканей животного, после введения в эти ткани культуры аутологичных клеток этого животного, сочетанно трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами.
Способность проникать в эукариотические клетки и проявлять функциональную активность, то есть способность экспрессировать целевой ген, полученных генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N подтверждают путем сочетанного введения в эукариотические клетки и ткани в различных пропорциях от 1% до 98% по массе друг к другу этих ДНК-векторов. При этом, как известно специалистам в данной области техники соотношения генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N в ДНК-вакцине может варьироваться в диапазоне, определяемом по результатам доклинических и клинических исследований, и любые концентрационные соотношения содержания каждого ДНК-вектора по отношению друг к другу (от 1% до 98% по массе) в ДНК-вакцине, определяемые по результатам доклинических и клинических исследований, подпадают под объем настоящего изобретения.
Для подтверждения реализуемости способа применения созданных генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2, выполняли:
А) сочетанную трансфекцию генотерапевтическими ДНК-векторами различных клеточных линий человека;
B) введение в ткани животного композиции генотерапевтических ДНК-векторов;
С) введение в ткани животного культуры аутологичных клеток этого животного, сочетанно трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами.
Указанные способы применения характеризуются отсутствием потенциальных рисков для генетической терапии и вакцинации человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов, и за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов устойчивости к антибиотикам, что подтверждается отсутствием участков, гомологичных вирусным геномам и генам антибиотикорезистентности в нуклеотидных последовательностях генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N (SEQ ID №1, SEQ ID №2 и SEQ ID №3 соответственно).
Как известно специалистам в данной области техники, гены антибиотикорезистентности в составе генотерапевтических ДНК-векторов используются с целью получения этих векторов в препаративных количествах путем наращивания бактериальной биомассы в питательной среде, содержащей селективный антибиотик. В рамках настоящего изобретения в целях возможности безопасного применения генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, использование селективных питательных сред, содержащих антибиотик, не представляется возможным. В качестве технологического решения для получения генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 для возможности масштабирования до промышленных масштабов получения генотерапевтических векторов предлагается способ получения штаммов для наработки указанных генотерапевтических векторов на основе бактерии Escherichia coli JM110-NAS. Способ получения штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-S, штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-M и штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-N, заключается в получении компетентных клеток штамма Escherichia coli JM110-NAS с введением в эти клетки генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-S, ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-M и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-N соответственно с помощью методов трансформации (электропорации), общеизвестных специалистам в данной области техники. Полученный штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-S, штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-M и штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-N соответственно обеспечивают возможность использования сред без содержания антибиотиков.
Для подтверждения получения штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-S, штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-M и штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-N проводили трансформацию, селекцию и последующее наращивание с выделением плазмидной ДНК.
Для подтверждения технологичности получения и возможности масштабирования до промышленного производства генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-S, кодирующего иммуногенный эпитоп белка S вируса SARS-CoV-2, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-M, кодирующего иммуногенный эпитоп белка M вируса SARS-CoV-2, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-N, кодирующего иммуногенный эпитоп белка N вируса SARS-CoV-2 выполняли ферментацию в промышленном масштабе штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-S или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-M или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-N, каждый из которых содержит генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, кодирующий иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2.
Способ масштабирования получения бактериальной массы до промышленных масштабов для выделения генотерапевтического ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 заключается в том, что затравочную культуру штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-S, штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-M и штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-N инкубируют в объеме питательной среды без содержания антибиотика обеспечивающим подходящую динамику накопления биомассы, по достижению достаточного количества биомассы в логарифмической фазе роста, бактериальную культуру переносят в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы роста, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-S, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-M и генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-N,многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами. При этом специалистам в данной области техники понятно, что условия культивирования штаммов, состав питательных сред (за исключением содержания антибиотиков), используемое оборудование, методы очистки ДНК могут варьировать в рамках стандартных операционных процедур в зависимости от отдельно взятой производственной линии, но известные подходы к масштабированию, промышленному получению и очистке ДНК-векторов с использованием штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-S, штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-M и штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-N подпадают под объем настоящего изобретения.
Описанное раскрытие изобретения подтверждается примерами реализации настоящего изобретения.
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1.
Получение генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-S, несущего последовательность, кодирующую иммуногенный эпитоп белка S вируса SARS-CoV-2.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-S конструировали клонированием последовательности, кодирующей иммуногенный эпитоп белка S вируса SARS-CoV-2 размером 2022 п.н. в ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. по сайтам рестрикции BamHI и EcoRI. Последовательность, кодирующую иммуногенный эпитоп белка S вируса SARS-CoV-2 размером2022 п.н. получали путем ферментативного синтеза из химически синтезированных олигонуклеотидов с последующим проведением ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:
CoVgS1_Eu AGGATCCACCATGGTTAATCTTACAACCAGAACTC
CoVgS1-CTCAGGTACCGTCGACACGTGCCCGCCGAGGAGA
икоммерческогонабора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США).
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 конструировали объединением шести фрагментов ДНК, полученных из разных источников:
(а) ориджин репликации получали путем ПЦР-амплификации участка коммерческой плазмиды pUC19 с использованием олигонуклеотидов UCori-Bam, UCori-Nco (перечень последовательностей, (1) -(2));
(б) терминатор транскрипции hGH-TA получали путем ПЦР-амплификации участка геномной ДНК человека с использованием олигонуклеотидов hGH-F и hGH-R (перечень последовательностей, (3) и (4));
(в) регуляторный участок транспозона Tn10 РНК-out получали путем синтеза из олигонуклеотидов RO-F, RO-R, RO-1, RO-2, RO-3 (перечень последовательностей, (5) -(9));
(г) ген устойчивости к канамицину получали путем ПЦР-амплификации участка коммерческой плазмиды pET-28 человека с использованием олигонуклеотидов Kan-F и Kan-R (перечень последовательностей, (10) и (11));
(д) полилинкер получали кинированием и отжигом четырех синтетических олигонуклеотидов MCS1, MCS2, MCS3 и MCS4 (перечень последовательностей, (12) - (15));
(е) промоторно-регуляторный участок человеческого гена фактора элонгации EF1а с собственным энхансером получали путем ПЦР-амплификации участка геномной ДНК человека с использованием олигонуклеотидов EF1-Xho и EF1-R (перечень последовательностей, (16) - (17)).
ПЦР-амплификацию проводили с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) в соответствии с инструкцией производителя. Фрагменты (а), (б), (в) и (г) имели перекрывающиеся области для возможности их объединения с последующей ПЦР-амплификацией. Объединяли фрагменты (а), (б), (в) и (г) с использованием олигонуклеотидов hGH-F и Kan-R (список последовательностей, (3) и (11)). Далее, полученные фрагменты ДНК объединялись путем рестрикции с последующим лигированием по сайтам BamHI и NcoI. В результате получали вектор, пока еще не содержащий полилинкер. Для его введения проводили расщепление плазмиды эндонуклеазами рестрикции по сайтам BamHI и EcoRI с последующим лигированием с фрагментом (д). В результате получали промежуточный вектор размером 2408 п.н, несущий ген устойчивости к канамицину, пока еще не содержащий промоторно-регуляторный участок гена фактора элонгации EF1а с собственным энхансером. Полученный вектор расщепляли эндонуклеазами рестрикции по сайтам SalI и BamHI с последующим лигированием с фрагментом (е). В результате получали вектор размером 3608 п.н., несущий ген устойчивости к канамицину и промоторно-регуляторный участок гена фактора элонгации EF1а с собственным энхансером. Далее ген устойчивости к канамицину выщепляли по сайтам рестрикции SpeI, после чего оставшийся фрагмент лигировали сам на себя. Таким образом, получали генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н., который является рекомбинантным, с возможностью селекции без антибиотиков. Расщепление продукта амплификации последовательности, кодирующей иммуногенный эпитоп белка S вируса SARS-CoV-2 и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI (New England Biolabs, США).
В результате получали ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-S размером 4560 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1 и общей структурой изображенной на фиг.1A.
Пример 2.
Получение генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-M, несущего последовательность, кодирующую иммуногенный эпитоп белка M вируса SARS-CoV-2.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-M конструировали клонированием последовательности, кодирующей иммуногенный эпитоп белка M вируса SARS-CoV-2 размером 675 п.н. в ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. по сайтам рестрикции BamHI и EcoRI. Последовательность, кодирующую иммуногенный эпитоп белка M вируса SARS-CoV-2 размером 675 п.н. получали путем ферментативного синтеза из химически синтезированных олигонуклеотидов с последующим проведением ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:
CoVgM_Eu AGGATCCACCATGGCAGATTCCAACGGTACTATTAC
CoVgM-CCTCGAATTCTTAGTCGACCTGTACAAGCAAAGCAATATTGTC
и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI (New England Biolabs, США).
В результате получали ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-M размером 3213 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №2 и общей структурой изображенной на фиг.1B.
При этом генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 конструировали по примеру 1.
Пример 3
Получение ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-N, несущего последовательность, кодирующую иммуногенный эпитоп белка N вируса SARS-CoV-2.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-N конструировали клонированием последовательности, кодирующей иммуногенный эпитоп белка N вируса SARS-CoV-2 размером 1266 п.н. в ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. по сайтам рестрикции BamHI и EcoRI. Последовательность, кодирующую иммуногенный эпитоп белка N вируса SARS-CoV-2 размером 1266 п.н. получали путем ферментативного синтеза из химически синтезированных олигонуклеотидов с последующим проведением ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:
CoVgN_Eu AGGATCCACCATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCA
CoVgN-C ATAGAATTCTTAGTCGACGGCCTGAGTTGAGTCAGCAC
и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI (New England Biolabs, США).
В результате получали ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-N размером3804п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №3 и общей структурой изображенной на фиг.1C.
При этом генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 конструировали по примеру 1.
Пример 4.
Получение ДНК-вакцины для вакцинации человека против вируса SARS-CoV-2.
Получали растворы генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-N, GDTT1.8NAS12-М в 0.9% растворе NaCl. ДНК-вакцину получали путем смешивания в заданном концентрационном соотношении друг к другу, исходя из возможного концентрационного содержания каждого ДНК-вектора в ДНК-вакцине в диапазоне от 1% до 98% по массе, определяемого по результатам доклинических и клинических исследований, растворов генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-N, GDTT1.8NAS12-М. Измерение концентрации генотерапевтических ДНК-векторов проводили спектрофотометрически с использованием спектрофотометра NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, США) при длине волны 260 нм.
Пример 5.
Подтверждение способности генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, входящих в ДНК-вакцину для вакцинации человека против вируса SARS-CoV-2, проникать в эукариотические клетки и подтверждение их функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевых последовательностей. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтических ДНК-векторов, входящих в ДНК-вакцину и ДНК-вакцины.
Оценивали изменения накопления мРНК фрагментов генов, кодирующих белки S, M, N вируса SARS-CoV-2 в первичной культуре клеток эпителия бронхов человека (Human Bronchial Epithelial Cells (HBEpC), Cell Applications, Inc., Кат.№502-05a)через 48 часов после их сочетанной трансфекции генотерапевтическими ДНК-векторами GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, входящими в ДНК-вакцину для вакцинации человека против вируса SARS-CoV-2. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.
Первичную культуру клеток эпителия бронхов человека выращивали в стандартных условиях (37°С, 5% СО2) с использованием набора для приготовления питательной среды GROWTH MEDIUM KIT (Cell Applications, Inc., Кат.№511K-500) и набора SUBCULTURE REAGENT KIT (Cell Applications, Inc., Кат.№090K). В процессе культивирования каждые 48 ч происходила смена ростовой среды.
Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×104 клеток/лунку. Трансфекцию генотерапевтическими ДНК-векторами GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, входящими в ДНК-вакцину для вакцинации человека против вируса SARS-CoV-2, проводили с использованием Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, США) согласно рекомендациям производителя. В пробирке №1 к 25 мкл среды Opti-MEM (Gibco, США) добавляли 1 мкл раствора композиции ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N в пропорции в пропорции по массе 50%:35%:15%(концентрация 500 нг/мкл) и 1 мкл реагента Р3000. Аккуратно перемешивали легким встряхиванием. В пробирке №2 к 25 мкл среды Opti-MEM (Gibco, США) добавляли 1 мкл раствора Lipofectamin 3000. Аккуратно перемешивали легким встряхиванием. Добавляли содержимое пробирки №1 к содержимому пробирки №2, инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Полученный раствор по каплям добавляли к клеткам в объеме 40 мкл.
В качестве контроля использовали первичную культуру клеток эпителия бронхов человека трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим целевой вставки (кДНК фрагментов генов, кодирующих белки S, M, N вируса SARS-CoV-2 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставки целевых фрагментов генов на фигурах не показано). Подготовку контрольного вектора GDTT1.8NAS12 для трансфекции проводили как описано выше.
Суммарную РНК из первичной культуры эпителия бронхов человека выделяли с использованием Trizol Reagent (Invitrogen, США) согласно рекомендациям производителя. В лунку с клетками добавляли 1 мл Trizol Reagent и гомогенизировали с последующим прогреванием в течении 5 мин при 65°С. Далее образец центрифугировали при 14 000g в течении 10 мин и снова прогревали в течении 10 мин при 65°С. Далее добавляли 200 мкл хлороформа, плавно перемешивали и центрифугировали при 14 000g в течение 10 мин. Затем отбирали водную фазу, добавляли к ней 1/10 объема 3М ацетата натрия, рН 5.2 и равный объем изопропилового спирта. Инкубировали образец при -20°С в течение 10 мин с последующим центрифугированием при 14 000g в течении 10 мин. Осадок промывали 1 мл 70% этилового спирта, высушивали на воздухе и растворяли в 10 мкл воды, свободной от РНКаз. Определение уровня экспрессии мРНК фрагментов генов, кодирующих белки S, M, N вируса SARS-CoV-2 после трансфекции проводили путем оценки динамики накопления ампликонов кДНК методом ПЦР в режиме реального времени.
Для получения и амплификации кДНК фрагмента гена, кодирующего белок S, использовали олигонуклеотиды:
S1_SF TTCAGGTTGGACAGCTGGTG
S1_SRGAGGGTCAAGTGCACAGTCT.
Длина продукта амплификации – 122 п.н.
Для получения и амплификации кДНК фрагмента гена, кодирующего белок М, использовали олигонуклеотиды
M_SF TCTTCTCAACGTGCCACTCC
M_SR CCTTGATGTCACAGCGTCCT.
Длина продукта амплификации - 134 п.н.
Для получения и амплификации кДНК фрагмента гена, кодирующего белок N, использовали олигонуклеотиды
N_SF: GCAGTCAAGCCTCTTCTCGT
N_SR: CAAGCAGCAGCAAAGCAAGA.
Длина продукта амплификации –138 п.н.
Реакцию обратной транскрипции и ПЦР-амплификацию проводили с помощью набора реагентов SYBR GreenQuantitect RT–PCR Kit (Qiagen, США) для ПЦР в режиме реального времени. Реакцию проводили в объеме 20 мкл, содержащих: 25 мкл QuantiTect SYBR Green RT-PCR MasterMix, 2,5 мM хлорида магния, по 0,5 мкМ каждого праймера, 5 мкл РНК. Реакцию осуществляли на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США) при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С - 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94оС - 15 сек, отжиг праймеров 60°C - 30 сек и элонгацию 72°С - 30 сек. В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК фрагментов генов, кодирующих белки S, M, N вируса SARS-CoV-2. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество динамику накопления ампликонов кДНК фрагментов генов, кодирующих белки S, M, N вируса SARS-CoV-2 оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 2.
Из фигуры 2 следует, что в результате трансфекции первичной культуры эпителия бронхов человека генотерапевтическими ДНК-векторами GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, входящими в состав ДНК-вакцины уровень специфической мРНК фрагментов генов, кодирующих белки S, M, N вируса SARS-CoV-2вырос многократно, что подтверждает способность ДНК-векторов проникать в эукариотические клетки и экспрессировать белки S, M, N вируса SARS-CoV-2 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтических ДНК-векторов, входящих в ДНК-вакцину и ДНК-вакцины.
Пример 6.
Подтверждение способности генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, входящих в ДНК-вакцину для вакцинации человека против вируса SARS-CoV-2, проникать в эукариотические клетки и подтверждение их функциональной активности на уровне продукции белков S, Mи N вируса SARS-CoV-2. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтических ДНК-векторов, входящих в ДНК-вакцину и ДНК-вакцины.
Оценивали изменение количества белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 в лизате первичной культуры клеток фибробластов легких человека после их трансфекции генотерапевтическими ДНК-векторами GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, входящими в ДНК-вакцину для вакцинации человека против вируса SARS-CoV-2.
Клеточную культуру фибробластов легких человека выращивали Fibroblast Basal Medium (ATCC PCS-201-030) с использованием набора Fibroblast Growth Kit-Low serum (ATCC PCS-201-041).
Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×104 клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий целевой кДНК (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N в пропорции по массе50%:35%:15%(С). Приготовление комплекса ДНК/дендример проводили по методике производителя (QIAGEN, SuperFect Transfection Reagent Handbook, 2002) с некоторыми изменениями. Для трансфекции клеток в одной лунке 24-луночного планшета к 1 мкг ДНК-вектора, растворенного в буфере ТЕ, добавляли культуральную среду до конечного объема 60 мкл, затем добавляли 5 мкл SuperFect Transfection Reagent и осторожно перемешивали пятикратным пипетированием. Комплекс инкубировали при комнатной температуре в течении 10-15 мин. Далее отбирали из лунок культуральную среду, лунки промывали 1 мл буфера PBS. К образовавшемуся комплексу добавляли 350 мкл среды, содержащей 10 мкг/мл гентамицина, осторожно перемешивали и добавляли к клеткам. Клетки инкубировали с комплексом 2-3 часа при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2.
Затем осторожно удаляли среду, промывали клеточный монослой 1 мл буфера PBS. Затем добавляли среду, содержащую 10 мкг/мл гентамицина, и инкубировали 24-48 часов при 37°С в атмосфере 5% СО2.
После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCl, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя специфические антитела к белку S (Abcam, Kat. № ab272504), M (Rockland, США, Кат. № 100-401-A55), N (BioVision, Кат. №А2061) с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белков S (SARS-CoV-2 Nucleocapsid (2019-nCoV/Coronavirus) Recombinant Protein, MyBioSource, Inc, США, Кат.№ MMBS5316490), M (SARS-CoV-2 M (2019-nCoV/Coronavirus) Recombinant Protein), N (SARS-CoV-2 NP (2019-nCoV/Coronavirus) Recombinant Protein MyBioSource, Inc, США, Кат.№ MBS569943) вируса SARS-CoV-2. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 3.
Из фигуры 3 следует, что трансфекция первичной культуры клеток фибробластов легких человека (ATCС PCS-201-020) композицией генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, входящих в ДНК-вакцину приводит к экспрессии белков S, M, N вируса SARS-CoV-2, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать последовательности, кодирующие иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтических ДНК-векторов, входящих в ДНК-вакцину и ДНК-вакцины.
Пример 7.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа сочетанного применения генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 для повышения уровня экспрессии белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 в тканях млекопитающих.
Оценивали изменение количества белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 в мышечной ткани при сочетанном введении композиции генотерапевтических векторов. Исследование проводили на лабораторных животных – 30 самцах крысы линии Wistar 8-ми месячного возраста массой 240–290 г. Из животных сформировали 3 группы (по 10 животных в группе). Животным I группы в икроножную мышцу вводили композицию генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, животным II группы в икроножную мышцу вводили ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 (плацебо), III группа животных – интактные. В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Композицию генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N в пропорции по массе 40%:25%:35% растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генетической конструкции готовили комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI в соответствии с рекомендациями производителя.
Объем внутримышечно вводимого раствора составлял 0,1 мл с суммарным количеством ДНК 25 мкг. Введение раствора осуществляли с помощью инсулинового шприца. Через двое суток после процедуры крыс декапитировали.
Образцы отбирали на 2 сутки после введения генотерапевтических ДНК-векторов. В качестве биологического материала использовали биопсийный материал из участков икроножной мышцы животных в зоне введения композиции трех генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 (группа животных I), ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо) -(группа животных II), и из участков икроножной мышцы интактных животных (группа животных III). Каждый биопсийный образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Из всех образцов отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевых белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 по примеру 6.
Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 4.
Из фигуры 4 следует, что в биопсийных образцах животных целевой группы I, которым вводилась композиция генотерапевтических векторов: GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N,детектировано наличие белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 по сравнению с аналогичными показателями группы животных II (плацебо) и III (интактные) у которых данные белки не детектировались. Полученные результаты свидетельствуют о способности ДНК-векторов in vivo проникать в эукариотические клетки животных и экспрессировать последовательности, кодирующие иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2, что свидетельствует об эффективности сочетанного применения генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, входящих в ДНК-вакцину.
Представленные результаты подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтических ДНК-векторов, входящих в ДНК-вакцину и ДНК-вакцины.
Пример 8.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа сочетанного применения генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 для повышения уровня экспрессии белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 в тканях млекопитающих путем введения аутологичных дендритных клеток, трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N.
Для подтверждения эффективности и реализуемости способа сочетанного применения генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 оценивали изменения количества белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 в коже мыши при введении в кожу животного культуры аутологичных незрелых дендритных клеток, трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N.
Исследование проводили на лабораторных животных – 30 мышах линии C57BL/6. Из животных сформировали 3 группы (по 10 животных в группе). Мышам I группы в кожу спины вводили культуру незрелых дендритных клеток JAWSII (ATCC CRL-11904), сочетанно трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, кодирующими иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2.
Животным II группы в кожу спины вводили плацебо, представляющее собой культуру незрелых дендритных клеток JAWSII, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим ген последовательности иммуногенных эпитопов белков S, M, N вируса SARS-CoV-2.
III группа животных – интактные.
Незрелые дендритные клетки мышей JAWSII (ATCC CRL-11904) культивировали в среде МЕМ (модификация альфа, Sigma, США), содержащей рибонуклеозиды, дезоксирибонуклеозиды, 4мМ – L-глутамин, 1 мМ пирувата натрия, 5 нг/мл GM-CSF , 20% эмбриональной сыворотки коров (Gibco).
Трансфекцию осуществляли с помощью трансфицирующего агента TransIT-TKO transfection reagent (Mirus Bio, WI). Перед трансфекцией клетки аккуратно снимали с подложки с помощью пластикового шпателя и ресуспендировали в среде DMEM (Gibco). Клетки рассеивали в чашку Петри диаметром 6 см в количестве 107 клеток/чашку в объеме 2 мл и инкубировали в течении 30 мин при 37 0С в атмосфере 5% CO2. Аккуратно перемешивали раствор ДНК, представляющий собой композицию генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N в пропорции по массе 40%:30%:30% и трансфицирующий реагент. 750 мкл среды DMEM добавляли в пробирку объемом 1.5 мл, затем в среду добавляли 20 мкл трансфицирующего реагента TransIT-TKOreagent, аккуратно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре 5 мин. Затем к смеси по каплям добавляли 14 мкг ДНК (по 8 мкг каждого ДНК-вектора) и аккуратно перемешивали переворачиванием пробирки. Инкубировали при комнатной температуре 5 мин и добавляли к клеткам. Клетки инкубировали в течении 4 часов при 37°С в атмосфере 5% CO2, а затем добавляли 2 мл среды для культивирования.
Клетки культивировали 72 часа, снимали с подложки с помощью пластикового шпателя, центрифугировали при 3000g 10 мин, ресуспендировали в 100 мкл и затем вводили мышам линии C57BL/6 в кожу спины с использованием инсулинового шприца.
Через 48 часов после введения клеток мышей декапитировали.
Взятие биоматериала осуществляли из участков кожи спины в зоне введения культуры незрелых дендритных клеток JAWSII, сочетанно трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, кодирующими иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 (группа животных I), в зоне введения плацебо, представляющего собой культуру незрелых дендритных клеток JAWSII, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим ген последовательности иммуногенных эпитопов белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 (группа животных II), а также из участков кожи спины интактных животных, не подвергавшихся никаким манипуляциям (группа животных III). Каждый образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевых белков как это описано в примере 6. Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг.5.
Из фигуры 5 следует, что в биопсийных образцах животных целевой группы I, которым вводилась культура незрелых дендритных клеток JAWSII, сочетанно трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, кодирующими иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2, детектировали наличие белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 по сравнению с аналогичными показателями количества белков в биоптате группы животных II (плацебо) и III (интактные) у которых данные белки не детектировались. Полученные результаты свидетельствуют о способности ДНК-векторов проникать в эукариотические клетки животных и экспрессировать последовательности, кодирующие иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2.Полученные результаты свидетельствуют об эффективности сочетанного применения генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N в составе ДНК-вакцины и подтверждает реализуемость способа применения в виде введения трансфицированных этими генотерапевтическими ДНК-векторами аутологичных клеток млекопитающих в ткани млекопитающих для повышения уровня белков-антигенов в тканях этих млекопитающих.
Пример 9.
Штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-S, штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-M и штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-N, несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-Nи способ их получения.
Конструирование штаммов для наработки в промышленных масштабах генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2,а именно штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-S, штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-M и штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-N, соответственно для их наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков заключается в получении электрокомпетентных клеток штамма Escherichia coli JM110-NAS с проведением электропорации этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-S, ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-M и ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-N, после чего клетки высеваются на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы, а также 10 мкг/мл хлорамфеникола. При этом штамм Escherichia coli JM110-NAS для наработки генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 или генотерапевтических ДНК-векторов на его основе с возможностью положительной селекции без использования антибиотиков получали путем конструирования линейного фрагмента ДНК, содержащего регуляторный элемент RNA-in транспозона Tn10 для селекции без применения антибиотиков размером 64 п.н., ген левансахаразы sacB, продукт которого обеспечивает селекцию на сахарозо-содержащей среде размером 1422 п.н., ген устойчивости к хлорамфениколу catR, необходимый для отбора клонов штамма, в которых прошла гомологичная рекомбинация размером 763 п.н. и две гомологичные последовательности, обеспечивающие процесс гомологичной рекомбинации в области гена recA с одновременной его инактивацией размером 329 п.н. и 233 п.н., после чего проводили трансформацию клеток Escherichia coli путем электропорации и отбирали клоны, выжившие на среде, содержащей 10мкг/мл хлорамфеникола.
Пример 10.
Способ масштабирования получения генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 до промышленного масштаба.
Для подтверждения технологичности получения и возможности производства в промышленных масштабах генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S (SEQ ID №1), GDTT1.8NAS12-M (SEQ ID №2) и GDTT1.8NAS12-N (SEQ ID №3), проводили масштабную ферментацию штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-S, штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-Mи штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-N, каждый из которых содержит генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, кодирующий иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2. Каждый штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-S, Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-M и Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-N получали на основе штамма Escherichia coli JM110-NAS (Genetic Diagnostics and Therapy 21 Ltd, Великобритания) по примеру 9путем электропорации компетентных клеток этого штамма генотерапевтическими ДНК-векторами GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, кодирующими иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2с последующим высевом трансформированных клеток на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы и отбором отдельных клонов.
Ферментацию полученного штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-S, несущего генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-S проводили в ферментере объемом 10 л с последующим выделением генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-S.
Для ферментации штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-S готовили среду, содержащую на 10 л: 100 г триптон, 50 г дрожжевой экстракт (Becton Dickinson, США), доводили водой до 8800 мл и автоклавировали при 121°С 20 мин, затем добавляли 1200 мл 50% (вес/объем) сахарозы. Далее засевали в колбу затравочную культуру штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-S в объеме 100 мл. Инкубировали в шейкере-инкубаторе 16 ч при 30°С. Переносили затравочную культуру в ферментер Techfors S (Infors HT, Швейцария), растили до достижения стационарной фазы. Контроль осуществляли измерением оптической плотности культуры при длине волны 600 нм. Клетки осаждали центрифугированием 30 мин при 5000-10000 g. Супернатант удаляли, клеточную массу ресуспендировали в 10% по объему фосфатно-солевого буфера. Повторно центрифугировали 30 мин при 5000-10000g. Супернатант удаляли, к клеточной массе добавляли раствор 20 мМ TrisCl, 1 мМ ЭДТА, 200 г/л сахароза, рН 8,0 в объеме 1000 мл, тщательно перемешивали до образования гомогенной суспензии. Добавляли раствор яичного лизоцима до конечной концентрации 100мкг/мл. Инкубировали 20 мин на льду при бережном перемешивании. Далее, добавляли 2500 мл раствора 0,2 М NaOH, 10 г/л додецилсульфат натрия, инкубировали 10 мин на льду при бережном перемешивании, затем добавляли 3500 мл раствора 3M ацетат натрия, 2М уксусная кислота, рН 5-5,5, инкубировали 10 мин на льду при бережном перемешивании. Полученный образец центрифугировали 20-30 мин при 15000 g или более. Раствор аккуратно декантировали, от остатков осадка избавлялись фильтрацией через грубый фильтр (фильтровальную бумагу). Добавляли РНКазу А (Sigma, США) до конечной концентрации 20 нг/мл, инкубировали ночь 16 ч при комнатной температуре. Раствор центрифугировали 20-30 мин при 15000g, затем фильтровали через мембранный фильтр с порами 0,45 мкм (Millipore, США). Далее проводили ультрафильтрацию через мембрану размером отсечения 100кДа (Millipore, США) и разбавляли до начального объема буфером 25 мМ TrisCl, pH 7.0. Операцию повторяли три – четыре раза. Наносили раствор, на колонку с 250 мл сорбента DEAE sepharose HP (GE, США), уравновешенную раствором 25 мМ TrisCl, pH 7.0. После нанесения образца колонку промывали тремя объемами этого же раствора, а затем проводили элюцию генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-S линейным градиентом от раствора 25 мМ TrisCl, pH 7.0 до раствора 25 мМ TrisCl, pH 7.0, 1М NaCl в объеме пяти объемов колонки. Контроль элюции осуществляли по оптической плотности сходящего раствора при 260 нм. Хроматографические фракции, содержащие генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-S, объединяли и проводили гель-фильтрацию на сорбенте Superdex 200 (GE, США). Колонку уравновешивали фосфатно-солевым буфером. Контроль элюции осуществляли по оптической плотности сходящего раствора при 260 нм, фракции анализировали электрофорезом в агарозном геле. Фракции, содержащие генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-S объединяли и хранили при -20°С. Для оценки воспроизводимости техпроцесса обозначенные технологические операции повторяли пятикратно. Все технологические операции для штаммов Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-M, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-N проводили аналогичным образом.
Воспроизводимость техпроцесса и количественные характеристики выхода конечного продукта подтверждают технологичность получения и возможность производства в промышленных масштабах генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S,GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N.
Пример 11.
Способ масштабирования получения ДНК-вакцины в виде композиции генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 до промышленного масштаба.
Для подтверждения технологичности получения и возможности производства в промышленных масштабах ДНК-вакцины проводили смешивание генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, для чего растворы генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-N, GDTT1.8NAS12-М,разбавляли 0.9% раствором NaCl до концентрации 1 мг/мл, затем растворы генотерапевтических ДНК-векторов смешивали в магнитной мешалке MR Hei-Tec (Heidolph, Германия) при 50 об/мин в течение 10 мин в заданном соотношении друг к другу, исходя из возможного концентрационного содержания каждого ДНК-вектора в ДНК-вакцине в диапазоне от 1% до 98% по массе, определяемого по результатам доклинических и клинических исследований. Измерение концентрации генотерапевтических ДНК-векторов проводили спектрофотометрически с использованием спектрофотометра NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, США) при длине волны 260 нм. Готовую композицию генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N фасовали в стерильные флаконы, лиофилизировали в установке для лиофилизации Labconco FreeZone Triad до установления уровня остаточной влаги в продукте не более 3%, укупоривали и маркировали.
Для оценки воспроизводимости техпроцесса обозначенные технологические операции повторяли пятикратно. Воспроизводимость техпроцесса и количественные характеристики выхода конечного продукта подтверждают технологичность получения и возможность производства в промышленных масштабах ДНК-вакцины.
Таким образом, созданная ДНК-вакцина в виде композиции генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 может быть использована для вакцинации человека против вируса SARS-CoV-2.
Задача, поставленная в данном изобретении, решена, а именно: конструирование ДНК-вакцины в виде композиции генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2, каждый из которых сочетает в себе следующие свойства:
I) Эффективность экспрессии фрагментов белков-антигенов в эукариотических клетках за счет полученных генотерапевтических векторов с минимальным размером;
II) Возможность безопасного применения для генетической терапии и вакцинации человека за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов и генов антибиотикорезистентности;
III) Технологичность получения и возможность наработки в штаммах в промышленных масштабах;
IV) Также решена задача по конструированию штаммов, несущих эти генотерапевтические ДНК-вектора для производства этих генотерапевтических ДНК-векторов.
Это подтверждается примерами:
для п. I – пример 1, 2, 3, 4, 5; 6; 7; 8, 9
для п. II – пример 1, 2, 3, 4, 5; 6; 7; 8, 9
для п. III и п. IV – пример 10,11.
Промышленная применимость:
Все представленные выше примеры подтверждают промышленную применимость ДНК-вакцины в виде композиции генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 для вакцинации человека против вируса SARS-CoV-2, штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-S, штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-M и штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-N,несущих генотерапевтические ДНК-вектора, способа получения генотерапевтических ДНК-вектора, способа производства в промышленных масштабах генотерапевтических ДНК-векторов.
Перечень сокращений
GDTT1.8NAS12 – вектор генотерапевтический, не содержащий последовательностей вирусных геномов и маркеров антибиотико-резистентности
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота
п.н. – пар нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
мл – миллилитр, мкл – микролитр
куб. мм – кубический миллиметр
л - литр
мкг - микрограмм
мг - миллиграмм
г - грамм
мкМ - микромоль
мМ – миллимоль
мин – минута
сек - секунда
об/мин - обороты в минуту
нм - нанометр
см - сантиметр
мВт - милливатт
о.е. ф - относительная единица флуоресценции
РВС – фосфатно-солевой буфер
MERS – ближневосточный респираторный синдром
SARS – тяжелый острый респираторный синдром
SARS-CoV-2 – (коронавирус 2, вызывающий тяжелый острый респираторный синдром).
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>ГЕНЕТИК ДИАГНОСТИКС ЭНД ТЕРАПИ 21 ЛТД (GENETIC DIAGNOSTICS AND
THERAPY 21 LTD),
Общество с ограниченной ответственностью «РЕКОМБИТЕХ»
<120>ДНК-вакцина против вируса SARS-CoV-2 на основе генотерапевтического
ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, способ ее получения, штаммы,
несущие генотерапевтические ДНК-вектора, способ их получения,
способ производства в промышленных масштабах генотерапевтических
ДНК-векторов.
<160>20
<170>BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211>4560
<212>DNA
<213>Viruses
<400> 1
ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccagggac cgtaaaaagg 60
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 120
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 180
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 240
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 300
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 360
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 420
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 480
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc 540
tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 600
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 660
ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacct cgaccgtgag gctccggtgc ccgtcagtgg 720
gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc 780
ggtgcctaga gaaagtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc 840
ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt 900
tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct 960
ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta cttccacgcc cctggctgca 1020
gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg tgggagagtt cgaggccttg 1080
cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctgggc gctggggccg 1140
ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc 1200
catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa 1260
tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc 1320
ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat 1380
cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg 1440
tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag 1500
atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga 1560
gcgggcgggt gagtcacccg cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc 1620
atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct cgagcttttg 1680
gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc cccacactga 1740
gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct tggaatttgc 1800
cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt 1860
tcttccattt caggtgtcgt gaaaactacc cctaaaagcc aggatccacc atggttaatc 1920
ttacaaccag aactcaatta ccccctgcat acactaattc tttcacacgt ggtgtttatt 1980
accctgacaa agttttcaga tcctcagttt tacattcaac tcaggacttg ttcttacctt 2040
tcttttccaa tgttacttgg ttccatgcta tacatgtctc tgggaccaat ggtactaaga 2100
ggtttgataa ccctgtccta ccatttaatg atggtgttta ttttgcttcc actgagaagt 2160
ctaacataat aagaggctgg atttttggta ctactttaga ttcgaagacc cagtccctac 2220
ttattgttaa taacgctact aatgttgtta ttaaagtctg tgaatttcaa ttttgtaatg 2280
atccattttt gggtgtttat taccacaaaa acaacaaaag ttggatggaa agtgagttca 2340
gagtttattc tagtgcgaat aattgcactt ttgaatatgt ctctcagcct tttcttatgg 2400
accttgaagg aaaacagggt aatttcaaaa atcttaggga atttgtgttt aagaatattg 2460
atggttattt taaaatatat tctaagcaca cgcctattaa tttagtgcgt gatctccctc 2520
agggtttttc ggctttagaa ccattggtag atttgccaat aggtattaac atcactaggt 2580
ttcaaacttt acttgcttta catagaagtt atttgactcc tggtgattct tcttcaggtt 2640
ggacagctgg tgctgcagct tattatgtgg gttatcttca acctaggact tttctattaa 2700
aatataatga aaatggaacc attacagatg ctgtagactg tgcacttgac cctctctcag 2760
aaacaaagtg tacgttgaaa tccttcactg tagaaaaagg aatctatcaa acttctaact 2820
ttagagtcca accaacagaa tctattgtta gatttcctaa tattacaaac ttgtgccctt 2880
ttggtgaagt ttttaacgcc accagatttg catctgttta tgcttggaac aggaagagaa 2940
tcagcaactg tgttgctgat tattctgtcc tatataattc cgcatcattt tccactttta 3000
agtgttatgg agtgtctcct actaaattaa atgatctctg ctttactaat gtctatgcag 3060
attcatttgt aattagaggt gatgaagtca gacaaatcgc tccagggcaa actggaaaga 3120
ttgctgatta taattataaa ttaccagatg attttacagg ctgcgttata gcttggaatt 3180
ctaacaatct tgattctaag gttggtggta attataatta cctgtataga ttgtttagga 3240
agtctaatct caaacctttt gagagagata tttcaactga aatctatcag gccggtagca 3300
caccttgtaa tggtgttgaa ggttttaatt gttactttcc tttacaatca tatggtttcc 3360
aacccactaa tggtgttggt taccaaccat acagagtagt agtactttct tttgaacttc 3420
tacatgcacc agcaactgtt tgtggaccta aaaagtctac taatttggtt aaaaacaaat 3480
gtgtcaattt caacttcaat ggtttaacag gcacaggtgt tcttactgag tctaacaaaa 3540
agtttctgcc tttccaacaa tttggcagag acattgctga cactactgat gctgtccgtg 3600
atccacagac acttgagatt cttgacatta caccatgttc ttttggtggt gtcagtgtta 3660
taacaccagg aacaaatact tctaaccagg ttgctgttct ttatcaggat gttaactgca 3720
cagaagtccc tgttgctatt catgcagatc aacttactcc tacttggcgt gtttattcta 3780
caggttctaa tgtttttcaa acacgtgcag gctgtttaat aggggctgaa catgtcaaca 3840
actcatatga gtgtgacata cccattggtg caggtatatg cgctagttat cagactcaga 3900
ctaattctcc tcggcgggca cgtgtcgact aagaattccc tgtgacccct ccccagtgcc 3960
tctcctggcc ctggaagttg ccactccagt gcccaccagc cttgtcctaa taaaattaag 4020
ttgcatcatt ttgtctgact aggtgtcctt ctataatatt atggggtgga ggggggtggt 4080
atggagcaag gggcaagttg ggaagacaac ctgtagggcc tgcggggtct attgggaacc 4140
aagctggagt gcagtggcac aatcttggct cactgcaatc tccgcctcct gggttcaagc 4200
gattctcctg cctcagcctc ccgagttgtt gggattccag gcatgcatga ccaggctcag 4260
ctaatttttg tttttttggt agagacgggg tttcaccata ttggccaggc tggtctccaa 4320
ctcctaatct caggtgatct acccaccttg gcctcccaaa ttgctgggat tacaggcgtg 4380
aaccactgct cccttccctg tccttacgcg tagaattggt aaagagagtc gtgtaaaata 4440
tcgagttcgc acatcttgtt gtctgattat tgatttttgg cgaaaccatt tgatcatatg 4500
acaagatgtg tatctacctt aacttaatga ttttgataaa aatcattaac tagtccatgg 4560
<210>2
<211>3213
<212>DNA
<213> Viruses
<400> 2
ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccagggac cgtaaaaagg 60
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 120
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 180
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 240
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 300
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 360
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 420
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 480
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc 540
tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 600
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 660
ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacct cgaccgtgag gctccggtgc ccgtcagtgg 720
gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc 780
ggtgcctaga gaaagtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc 840
ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt 900
tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct 960
ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta cttccacgcc cctggctgca 1020
gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg tgggagagtt cgaggccttg 1080
cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctgggc gctggggccg 1140
ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc 1200
catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa 1260
tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc 1320
ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat 1380
cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg 1440
tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag 1500
atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga 1560
gcgggcgggt gagtcacccg cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc 1620
atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct cgagcttttg 1680
gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc cccacactga 1740
gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct tggaatttgc 1800
cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt 1860
tcttccattt caggtgtcgt gaaaactacc cctaaaagcc aggatccacc atggcagatt 1920
ccaacggtac tattaccgtt gaagagctta aaaagctcct tgaacaatgg aacctagtaa 1980
taggtttcct attccttaca tggatttgtc ttctacaatt tgcctatgcc aacaggaata 2040
ggtttttgta tataattaag ttaattttcc tctggctgtt atggccagta actttagctt 2100
gttttgtgct tgctgctgtt tacagaataa attggatcac cggtggaatt gctatcgcaa 2160
tggcttgtct tgtaggcttg atgtggctca gctacttcat tgcttctttc agactgtttg 2220
cgcgtacgcg ttccatgtgg tcattcaatc cagaaactaa cattcttctc aacgtgccac 2280
tccatggcac tattctgacc agaccgcttc tagaaagtga actcgtaatc ggagctgtga 2340
tccttcgtgg acatcttcgt attgctggac accatctagg acgctgtgac atcaaggacc 2400
tgcctaaaga aatcactgtt gctacatcac gaacgctttc ttattacaaa ttgggagctt 2460
cgcagcgtgt agcaggtgac tcaggttttg ctgcatacag tcgctacagg attggcaact 2520
ataaattaaa cacagaccat tccagtagca gtgacaatat tgctttgctt gtacaggtcg 2580
actaagaatt ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gccctggaag ttgccactcc 2640
agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc attttgtctg actaggtgtc 2700
cttctataat attatggggt ggaggggggt ggtatggagc aaggggcaag ttgggaagac 2760
aacctgtagg gcctgcgggg tctattggga accaagctgg agtgcagtgg cacaatcttg 2820
gctcactgca atctccgcct cctgggttca agcgattctc ctgcctcagc ctcccgagtt 2880
gttgggattc caggcatgca tgaccaggct cagctaattt ttgttttttt ggtagagacg 2940
gggtttcacc atattggcca ggctggtctc caactcctaa tctcaggtga tctacccacc 3000
ttggcctccc aaattgctgg gattacaggc gtgaaccact gctcccttcc ctgtccttac 3060
gcgtagaatt ggtaaagaga gtcgtgtaaa atatcgagtt cgcacatctt gttgtctgat 3120
tattgatttt tggcgaaacc atttgatcat atgacaagat gtgtatctac cttaacttaa 3180
tgattttgat aaaaatcatt aactagtcca tgg 3213
<210>3
<211>3804
<212>DNA
<213> Viruses
<400>3
ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccagggac cgtaaaaagg 60
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 120
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 180
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 240
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 300
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 360
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 420
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 480
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc 540
tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 600
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 660
ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacct cgaccgtgag gctccggtgc ccgtcagtgg 720
gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc 780
ggtgcctaga gaaagtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc 840
ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt 900
tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct 960
ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta cttccacgcc cctggctgca 1020
gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg tgggagagtt cgaggccttg 1080
cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctgggc gctggggccg 1140
ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc 1200
catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa 1260
tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc 1320
ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat 1380
cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg 1440
tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag 1500
atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga 1560
gcgggcgggt gagtcacccg cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc 1620
atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct cgagcttttg 1680
gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc cccacactga 1740
gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct tggaatttgc 1800
cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt 1860
tcttccattt caggtgtcgt gaaaactacc cctaaaagcc aggatccacc atgtctgata 1920
atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc tcagattcaa 1980
ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt cggccccaag 2040
gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc aaggaagacc 2100
ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca gatgaccaaa 2160
ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa atgaaagatc 2220
tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga cttccctatg 2280
gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat acaccaaaag 2340
atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa cttcctcaag 2400
gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt caagcctctt 2460
ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc agcagtaggg 2520
gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct ttgctgctgc 2580
ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa caacaaggcc 2640
aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa aaacgtactg 2700
ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa caaacccaag 2760
gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat tggccgcaaa 2820
ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt ggcatggaag 2880
tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat gacaaagatc 2940
caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac aaaacattcc 3000
caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa gccttaccgc 3060
agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg gatgatttct 3120
ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggccgtc gactaagaat 3180
tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc cagtgcccac 3240
cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat cattttgtct gactaggtgt ccttctataa 3300
tattatgggg tggagggggg tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga caacctgtag 3360
ggcctgcggg gtctattggg aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt ggctcactgc 3420
aatctccgcc tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt tgttgggatt 3480
ccaggcatgc atgaccaggc tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac ggggtttcac 3540
catattggcc aggctggtct ccaactccta atctcaggtg atctacccac cttggcctcc 3600
caaattgctg ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc cctgtcctta cgcgtagaat 3660
tggtaaagag agtcgtgtaa aatatcgagt tcgcacatct tgttgtctga ttattgattt 3720
ttggcgaaac catttgatca tatgacaaga tgtgtatcta ccttaactta atgattttga 3780
taaaaatcat taactagtcc atgg 3804
<210> 4
<211>42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Олигонуклеотид UCori-Bam
<400> 4
ggatccagat ctactcgagg tagaaaagat caaaggatct tc 42
<210>5
<211>31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Олигонуклеотид UCori-Nco
<400>5
agtccatgga taacgcagga aagaacatgt g 31
<210>6
<211>31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Олигонуклеотид hGH-F
<400>6
aggatccgaa ttccctgtga cccctcccca g 31
<210>7
<211>40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Олигонуклеотид hGH-R
<400>7
ctctttacca attctacgcg taaggacagg gaagggagca 40
<210>8
<211>40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Олигонуклеотид RO-F
<400>8
cttccctgtc cttacgcgta gaattggtaa agagagtcgt 40
<210>9
<211>41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Олигонуклеотид RO-R
<400>9
ccgtagaaaa ctagttaatg atttttatca aaatcattaag 41
<210>10
<211>49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Олигонуклеотид RO-1
<400>10
gaattggtaa agagagtcgt gtaaaatatc gagttcgcac atcttgttg 49
<210>11
<211>47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Олигонуклеотид RO-2
<400>11
gatttttggc gaaaccattt gatcatatga caagatgtgt atctacc 47
<210>12
<211>47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Олигонуклеотид RO-3
<400>12
atgattttta tcaaaatcat taagttaagg tagatacaca tcttgtc 47
<210>13
<211>34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Олигонуклеотид Kan-F
<400>13
aaatcattaa ctagttttct acggggtctg acgc 34
<210>14
<211>33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Олигонуклеотид Kan-R
<400>14
cagccatgga ctagtggtgg cacttttcgg gga 33
<210>15
<211>30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Олигонуклеотид MCS1
<400>15
gatccgatat cgtcgacaag cttggtacct 30
<210>16
<211>20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Олигонуклеотид MCS2
<400>16
caagcttgtc gacgatatcg 20
<210>17
<211>32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Олигонуклеотид MCS3
<400>17
ccggagcggc cgctctagag ctagcgacgt cg 32
<210>18
<211>42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Олигонуклеотид MCS4
<400>18
aattcgacgt cgctagctct agagcggccg ctccggaggt ac 42
<210>19
<211>25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Олигонуклеотид EF1-Xho
<400>19
atctcgagcg tgaggctccg gtgcc 25
<210>20
<211>29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Олигонуклеотид EF1-R
<400>20
tcggatcctg gcttttaggg gtagttttc 29
<---

Claims (17)

1. ДНК-вакцина против вируса SARS-CoV-2 на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, состоящая из композиции генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 соответственно, причем генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-S имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID №1, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-M имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID №2, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-N имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID №3, при этом каждая из нуклеотидных последовательностей SEQ ID №1, SEQ ID №2 и SEQ ID №3 клонирована в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12.
2. ДНК-вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она обладает способностью эффективно проникать в клетки человека и животных и экспрессировать целевой белок S, М и N вируса SARS-CoV-2, клонированный в составляющие её композицию генотерапевтические векторы GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N соответственно, за счет ограниченного размера векторной части GDTT1.8NAS12, не превышающей 2600 п.н., на основе которой ДНК-вакцина создана.
3. ДНК-вакцина по п.1, отличающаяся тем, что в составе ДНК-вакцины в качестве структурных элементов используют нуклеотидные последовательности SEQ ID №1, SEQ ID №2, SEQ ID №3, которые не являются генами антибиотикорезистентности, и регуляторными элементами вирусных геномов, обеспечивая возможность ее безопасного применения для генетической терапии и вакцинации человека.
4. Способ получения ДНК-вакцины по п.1, заключающийся в том, что сначала получают генотерапевтические ДНК-векторы GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, затем полученные генотерапевтические ДНК-векторы GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N смешивают в заданной пропорции, с получением композиции, при этом содержание каждого ДНК-вектора в ДНК-вакцине должно быть от 1% до 98% по массе, определяемого по результатам доклинических и клинических исследований, совместно с транспортной системой или без нее, при этом каждый из генотерапевтических ДНК-векторов, из которых состоит ДНК-вакцина в виде композиции: генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N получают следующим образом: последовательности, кодирующие иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 клонируют в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 и получают генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-S, SEQ ID №1, GDTT1.8NAS12-M, SEQ ID №2 и GDTT1.8NAS12-N, SEQ ID №3, соответственно, при этом последовательности кодирующих иммуногенных эпитопов белков S, M, N вируса SARS-CoV-2 получают путем ферментативного синтеза из химически синтезированных олигонуклеотидов с последующим проведением ПЦР-амплификации с использованием созданных олигонуклеотидов и расщеплением продукта амплификации соответствующими эндонуклеазами рестрикции, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводят по сайтам рестрикции BamHI и EcoRI, а селекцию проводят без антибиотиков, при этом при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-S, SEQ ID №1 для ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды:
CoVgS1_EuAGGATCCACCATGGTTAATCTTACAACCAGAACTC
CoVgS1-CTCAGGTACCGTCGACACGTGCCCGCCGAGGAGA,
а расщепление продукта амплификации и клонирование последовательности, кодирующей иммуногенный эпитоп белка S вируса SARS-CoV-2 в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI,
причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-M, SEQ ID №2 для ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды:
CoVgM_Eu AGGATCCACCATGGCAGATTCCAACGGTACTATTAC
CoVgM-CTCGAATTCTTAGTCGACCTGTACAAGCAAAGCAATATTGTC,
а расщепление продукта амплификации и клонирование последовательности, кодирующей иммуногенный эпитоп белка M вируса SARS-CoV-2 в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI,
причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-N, SEQ ID №3 для проведения ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды
CoVgN_Eu AGGATCCACCATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCA
CoVgN-C ATAGAATTCTTAGTCGACGGCCTGAGTTGAGTCAGCAC,
а расщепление продукта амплификации и клонирование последовательности, кодирующей иммуногенный эпитоп белка N вируса SARS-CoV-2 в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI.
5. Способ использования ДНК-вакцины по п.1 для проведения вакцинации, заключающийся во введении в органы и ткани пациента ДНК-вакцины в виде композиции генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N, кодирующих иммуногенные эпитопы белков S, M, N вируса SARS-CoV-2, при этом содержание каждого ДНК-вектора в ДНК-вакцине должно быть не менее 1%, но не более 98% по массе, определяемого по результатам доклинических и клинических исследований, совместно с транспортной системой или без нее, или во введении в органы и ткани пациента аутологичных клеток этого пациента, сочетанно трансфицированных ДНК-вакциной, содержащей генотерапевтические ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N.
6. Способ производства в промышленных масштабах ДНК-вакцины против вируса SARS-CoV-2 по п.1, на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, состоящей из генотерапевтических ДНК-векторов: GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N в виде композиции, заключающийся в том, что генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-S, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-M и генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-N получают путем того, что засевают в колбу с приготовленной средой затравочную культуру, выбранную из штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-S, штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-M и штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-N, затем инкубируют затравочную среду в шейкере-инкубаторе и переносят ее в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт, многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами, затем полученные генотерапевтические ДНК-векторы GDTT1.8NAS12-S, GDTT1.8NAS12-M и GDTT1.8NAS12-N смешивают в заданной пропорции исходя из возможного концентрационного содержания каждого ДНК-вектора в ДНК-вакцине в диапазоне от 1% до 98% по массе, определяемого по результатам доклинических и клинических исследований, лиофилизируют, укупоривают и маркируют.
RU2020113297A 2020-04-10 2020-04-10 ДНК-вакцина против вируса SARS-CoV-2 на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, способ ее получения, штаммы, несущие генотерапевтические ДНК-вектора, способ их получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтических ДНК-векторов RU2759227C2 (ru)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020113297A RU2759227C2 (ru) 2020-04-10 2020-04-10 ДНК-вакцина против вируса SARS-CoV-2 на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, способ ее получения, штаммы, несущие генотерапевтические ДНК-вектора, способ их получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтических ДНК-векторов
PCT/RU2021/000148 WO2021206587A1 (en) 2020-04-10 2021-04-07 Sars-cov-2 dna vaccine based on gene therapy dna vector gdtt1.8nas12

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020113297A RU2759227C2 (ru) 2020-04-10 2020-04-10 ДНК-вакцина против вируса SARS-CoV-2 на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, способ ее получения, штаммы, несущие генотерапевтические ДНК-вектора, способ их получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтических ДНК-векторов

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2020113297A RU2020113297A (ru) 2021-10-11
RU2020113297A3 RU2020113297A3 (ru) 2021-10-11
RU2759227C2 true RU2759227C2 (ru) 2021-11-11

Family

ID=78023685

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020113297A RU2759227C2 (ru) 2020-04-10 2020-04-10 ДНК-вакцина против вируса SARS-CoV-2 на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, способ ее получения, штаммы, несущие генотерапевтические ДНК-вектора, способ их получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтических ДНК-векторов

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2759227C2 (ru)
WO (1) WO2021206587A1 (ru)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113755421B (zh) * 2021-09-28 2024-04-12 梦芊细胞因子有限公司 一种用于covid-19的口服性疫苗及抗体加强剂
EP4316513A1 (en) * 2022-08-02 2024-02-07 Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) New dna sars-cov-2 vaccine

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2712838C1 (ru) * 2018-09-04 2020-01-31 Генетик Диагностик Энд Терапи 21 Лтд Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, способ его получения, штамм Escherichia coli JM110-NAS, способ его получения, штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12, несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7094410B2 (en) * 2002-03-02 2006-08-22 The Scripps Research Institute DNA vaccine against proliferating endothelial cells and methods of use thereof
US8080642B2 (en) * 2003-05-16 2011-12-20 Vical Incorporated Severe acute respiratory syndrome DNA compositions and methods of use
CN101100680B (zh) * 2007-06-15 2010-07-21 中国科学院武汉病毒研究所 高效表达sars冠状病毒s蛋白的重组杆状病毒及构建

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2712838C1 (ru) * 2018-09-04 2020-01-31 Генетик Диагностик Энд Терапи 21 Лтд Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, способ его получения, штамм Escherichia coli JM110-NAS, способ его получения, штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12, несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANURODH SHANKAR AGRAWAL и др., Immunization with inactivated Middle East Respiratory Syndrome coronavirus vaccine leads to lung immunopathology on challenge with live virus // Human Vaccines & Immunotherapeutics,2016-06-07,Т. 12( 9), стр. 2351-2356. *
DARRELL RICKE и др., Medical Countermeasures Analysis of 2019-nCoV and Vaccine Risks for Antibody-Dependent Enhancement (ADE) // SSRN Electronic Journal, March 2020. *
HIU-LAN и др. Mechanism of antibody-dependent enhancement in severe acute respiratory syndrome coronavirus infection, 2012, рефера. *
JIE LI и др., Immunogenicity and Protection Efficacy of Monomeric and Trimeric Recombinant SARS Coronavirus Spike Protein Subunit Vaccine Candidates, VIRAL IMMUNOLOGY, Volume 26, Number 2, 2013, р.126-132. *
LI LIU и др., Anti-spike IgG causes severe acute lung injury by skewing macrophage responses during acute SARS-CoV infection // JCI Insight, 2019-02-21,Т. 4 (4). *
M. BOLLES и др., A Double-Inactivated Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Vaccine Provides Incomplete Protection in Mice and Induces Increased Eosinophilic Proinflammatory Pulmonary Response upon Challenge // Journal of Virology, 2011-09-21, Т. 85(23), стр. 12201-12215. *
MING S YIP и др., Antibody-dependent Infection of Human Macrophages by Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus, Virol J. 2014; 11: 82. *
MING S YIP и др., Investigation of Antibody-Dependent Enhancement (ADE) of SARS coronavirus infection and its role in pathogenesis of SARS, BMC Proceedings 2011, 5(Suppl 1):P80. *
WLADEK MINOR и др., Faculty Opinions recommendation of Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science 367, 1260-1263 (2020) 13 March 2020. *
А.А. ЯРИЛИН, Иммунология, размещенному на https://studfile.net/preview/1823558/14.02.2015, стр.715,716. *
А.А. ЯРИЛИН, Иммунология, размещенному на https://studfile.net/preview/1823558/14.02.2015, стр.715,716. WLADEK MINOR и др., Faculty Opinions recommendation of Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science 367, 1260-1263 (2020) 13 March 2020. DARRELL RICKE и др., Medical Countermeasures Analysis of 2019-nCoV and Vaccine Risks for Antibody-Dependent Enhancement (ADE) // SSRN Electronic Journal, March 2020. HIU-LAN и др. Mechanism of antibody-dependent enhancement in severe acute respiratory syndrome coronavirus infection, 2012, рефера. MING S YIP и др., Investigation of Antibody-Dependent Enhancement (ADE) of SARS coronavirus infection and its role in pathogenesis of SARS, BMC Proceedings 2011, 5(Suppl 1):P80. MING S YIP и др., Antibody-dependent Infection of Human Macrophages by Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus, Virol J. 2014; 11: 82. LI LIU и др., Anti-spike IgG causes severe acute lung injury by skewing macrophage responses during acute S *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021206587A1 (en) 2021-10-14
RU2020113297A (ru) 2021-10-11
RU2020113297A3 (ru) 2021-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20180108590A (ko) 항-tcr-복합체 항체 또는 단편을 암호화하는 바이러스
KR20190063468A (ko) 변형된 줄기세포 기억 t 세포, 이의 제조 방법 및 사용 방법
RU2759227C2 (ru) ДНК-вакцина против вируса SARS-CoV-2 на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, способ ее получения, штаммы, несущие генотерапевтические ДНК-вектора, способ их получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтических ДНК-векторов
KR20160102024A (ko) 아데노바이러스 및 상응하는 플라스미드의 제조 방법
CA2985087A1 (en) Cancer vaccine comprising mrna encoding a m-like-protein
KR20230066000A (ko) 면역자극성 박테리아-기초 백신, 치료제, 및 rna 전달 플랫폼
JP2017520252A (ja) 非構造タンパク質断片から構成されるデングウイルスのキメラポリエピトープ及びデングウイルス感染症に対する免疫原性組成物におけるその使用
JP2022539417A (ja) Ｈｉｖ抗原及びｍｈｃ複合体
CN108474005A (zh) 转位子系统、试剂盒及其用途
EP4192496A2 (en) Multiepitope vaccine cassettes
WO2019214110A1 (zh) 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的马尔堡病毒病疫苗
US10799579B2 (en) Methods for enhancing antigen-specific immune responses
WO2022233287A1 (zh) 一种疫苗试剂和接种方法
JP2017510276A (ja) 非天然発生のブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ｐｒｒｓｖ）及び使用する方法
US20240035003A1 (en) Methods of producing adenovirus
CN115715198A (zh) 新型的基于沙门氏菌的冠状病毒疫苗
KR102402971B1 (ko) 말라리아 원충의 메로조이트 표면 단백질-9을 포함하는 바이러스-유사입자 및 이를 이용한 백신
RU2733429C1 (ru) Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген HFE для повышения уровня экспрессии этого целевого гена, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HFE несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора
CN114181973A (zh) 一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因及其制备方法
US9388428B2 (en) Compositions and methods related to viruses of the genus Negevirus
CN113166771A (zh) 基因治疗dna载体gdtt1.8nas12及用于获得它的方法
RU2794133C1 (ru) ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-VEGFA для повышения уровня экспрессии целевого гена VEGFA, способ его получения и применения
RU2793809C1 (ru) ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HIF1α для повышения уровня экспрессии целевого гена HIF1α и способ применения
RU2714763C1 (ru) Генотерапевтический ДНК-вектор для таргетной генной терапии, способ его получения (варианты), штамм для его производства, способ его получения
CN114703229B (zh) 一种基于人源细胞的表面展示技术及靶向hbv受体的多肽及其应用