CN115715198A

CN115715198A - 新型的基于沙门氏菌的冠状病毒疫苗

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Publication number: CN115715198A
Application number: CN202180024934.7A
Authority: CN
Inventors: 海因茨·卢本奥; 马克·曼苏尔
Original assignee: Nec Orkmnet
Current assignee: Nec Orkmnet
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2021-03-31
Publication date: 2023-02-24
Also published as: EP4126022A1; KR20220161444A; AU2021250442A1; WO2021198376A1; US20230137174A1; CA3170674A1; JP2023519562A

Abstract

本发明涉及一种DNA疫苗，其包含伤寒沙门氏菌Ty21a菌株，所述伤寒沙门氏菌Ty21a菌株包含DNA分子，所述DNA分子包含编码至少COVID‑19冠状病毒(SARS‑CoV‑2)刺突(S)蛋白或其一部分的真核表达盒。特别地，本发明涉及所述DNA疫苗用于预防和/或治疗冠状病毒疾病COVID‑19或SARS‑CoV‑2感染。

Description

新型的基于沙门氏菌的冠状病毒疫苗

技术领域

本发明涉及一种DNA疫苗，其包含伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)Ty21a菌株，所述伤寒沙门氏菌Ty21a菌株包含DNA分子，所述DNA分子包含编码至少COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分的真核表达盒。特别地，本发明涉及所述DNA疫苗用于预防和/或治疗冠状病毒疾病COVID-19或SARS-CoV-2感染的用途。

背景技术

近年来，全球公共卫生部门报告了多例急性呼吸综合征病例。科学家很快确定了一种新型冠状病毒是主要病原体。这种疾病现在被称为冠状病毒疾病COVID-19，致病病毒被称为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。这是一种新的冠状病毒毒株，以前没有在人类中发现。

这种疾病的爆发和聚集在亚洲、欧洲、澳大利亚、非洲和美洲都有被观察到。

WHO在其第一次紧急会议中评估COVID-19的死亡率约为4％。尽管死亡率似乎因国家而异，并且由于未报告病例的数量未知而可能不准确，但SARS-CoV-2(最初称为新型冠状病毒2019-nCoV)的传播已经成为一个世界性的话题，迫切需要针对COVID-19的治疗和/或疫苗接种，以阻止该病毒的进一步传播。

冠状病毒是属于冠状病毒科的正义单链RNA病毒。这些病毒大多感染动物，包括鸟类和哺乳动物。在人类中，冠状病毒通常会导致轻微的呼吸道感染。两种高致病性人类冠状病毒，即严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)，导致了高发病率和高死亡率的全球流行。这两种地方性流行病都是由冠状病毒科中属于β冠状病毒属的人畜共患冠状病毒引起的。

与SARS-CoV和MERS-CoV一样，新型SARS-CoV-2属于β冠状病毒属。如Zhou et al.(Cell Discovery(2020)6:14)所报道的，SARS-CoV-2与SARS-CoV具有最高核苷酸序列同一性(79.7％)。具体来说，SARS-CoV-2的包膜蛋白和核衣壳蛋白是两个进化上保守的区域，与SARS-CoV相比，序列同一性分别为96％和89.6％。据报道，刺突蛋白在SARS-CoV-2和SARS-CoV之间表现出最低的序列保守性(序列同一性为77％)，而SARS-CoV-2的刺突蛋白与MERS-CoV的刺突蛋白只有31.9％的序列同一性。

与SARS-CoV相关的各种报告表明了体液和细胞介导的免疫反应的保护作用。S蛋白是最暴露的蛋白，并且在小鼠模型中，针对SARS-CoV S蛋白的抗体反应已经显示出保护免于SARS-CoV感染。虽然有效的抗体反应可能是短暂的。相比之下，T细胞反应已被证明能提供针对SARS-CoV的长期保护。因此，能够引发体液以及细胞介导的免疫反应的疫苗是最有前景的。

一些国家和国际研究小组正在致力于开发预防和治疗2019-nCoV/SARS-CoV-2的疫苗，但有效的疫苗尚不可用。因此，仍然迫切需要可以在短时间内开发和批准的有效的治疗和/或预防疫苗。

发明内容

鉴于目前对新型冠状病毒的理解以及由SARS-CoV-2引起的世界性流行，本发明的一个目的是提供用于预防和/或治疗冠状病毒疾病COVID-19或SARS-CoV-2感染的新型口服DNA疫苗。根据本发明的DNA疫苗包含伤寒沙门氏菌Ty21a菌株，所述伤寒沙门氏菌Ty21a菌株包含DNA分子，所述DNA分子包含编码至少COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分的真核表达盒。该疫苗基于活减毒伤寒沙门氏菌菌株，称为伤寒沙门氏菌Ty21a，其作为编码免疫原性抗原的DNA分子在宿主细胞中表达的载体和佐剂。包含编码抗原的DNA分子的这种基于沙门氏菌的载体可以在短时间内大规模开发和生产，并且如果需要，可以适应病毒中发生的潜在突变。

此外，用作载体的活减毒伤寒沙门氏菌Ty21a菌株是Typhoral

的活性成分，Typhoral

也称为

(由Crucell在瑞士的公司Berna Biotech有限责任公司制造)，这是唯一获得许可的抗伤寒热的口服活疫苗。这种疫苗已经被广泛测试，并已被证明在患者毒性以及向第三方传播方面是安全的(Wahdan et al.,J.Infectious Diseases1982,145:292-295)。该疫苗已在40多个国家获得许可，并已用于数百万人的抗伤寒热预防性疫苗接种中，包括数千名儿童。它拥有空前的安全记录。因此，本发明的DNA疫苗中使用的载体适合于在短时间内获得批准和产品上市。

因此，根据本发明的DNA疫苗具有多个优点，使得它特别适合于提供针对COVID-19和/或SARS-CoV-2感染的有效疫苗的挑战。

本文提供了一种DNA疫苗，其包含伤寒沙门氏菌Ty21a菌株，所述伤寒沙门氏菌Ty21a菌株包含DNA分子，所述DNA分子包含编码至少COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分的真核表达盒。在某些实施方案中，COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分包含(a)SARS-CoV-2全长S蛋白；(b)SARS-CoV-2 S蛋白胞外域；(c)SARS-CoV-2 S蛋白亚基S1；(d)SARS-CoV-2 S蛋白受体结合结构域(RBD)；(d)SARS-CoV-2 S蛋白的至少3个免疫显性表位。

在一个实施方案中，COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白是SARS-CoV-2全长S蛋白。SARS-CoV-2全长S蛋白可以包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。SARS-CoV-2全长S蛋白也可能是SARS-CoV-2的变体的全长S蛋白，如谱系B.1.1.7、B.1.351或B.1.1.28(重命名为P.1)。SARS-CoV-2全长S蛋白也可能是SARS-CoV-2全长S蛋白的融合前稳定形式，如包含两个或多个稳定突变。在一个实施方案中，SARS-CoV-2全长S蛋白的融合前稳定形式包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中氨基酸位置K986和V987突变为脯氨酸的两个稳定突变。

在某些实施方案中，COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分包含SARS-CoV-2 S蛋白胞外结构域。SARS-CoV-2 S蛋白胞外结构域具有SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-1208的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-1208具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。SARS-CoV-2 S蛋白胞外结构域也可以是SARS-CoV-2的变体的S蛋白胞外结构域，如谱系B.1.1.7、B.1.351或P.1。SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分还可以包含SARS-CoV-2 S蛋白胞外结构域的融合前稳定形式，其包含两个或多个稳定突变。在一个实施方案中，SARS-CoV-2 S蛋白胞外结构域的融合前稳定形式包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基1至1208的氨基酸序列中氨基酸位置K986和V987突变为脯氨酸的两个稳定突变。

在某些实施方案中，SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，包含两个稳定突变K986P和V987P。在某些替代实施方案中，SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-1208的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-1208具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，包含两个稳定突变K986P和V987P。

在某些实施方案中，COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分包含SARS-CoV-2 S蛋白亚基S1。SARS-CoV-2蛋白亚基S1可以包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-681的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-681具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。SARS-CoV-2 S蛋白亚基S1也可以是SARS-CoV-2的变体的S蛋白亚基S1，如谱系B.1.1.7、B.1.351或P.1。

在某些实施方案中，COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分包含SARS-CoV-2 S蛋白受体结合结构域(RBD)。SARS-CoV-2蛋白RBD可以包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基319-541的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1的氨基酸残基319-541具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。SARS-CoV-2 S蛋白RBD也可以是SARS-CoV-2的变体的S蛋白RBD，如谱系B.1.1.7、B.1.351或P.1。

根据本发明的DNA疫苗可以包含DNA分子，所述DNA分子编码SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分并且任选地进一步编码另一种SARS-CoV-2蛋白或其一部分，优选SARS-CoV-2 N蛋白。在某些实施方案中，真核表达盒编码SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分，并进一步编码另一种SARS-CoV-2蛋白或其一部分，如SARS-CoV-2 N蛋白或其一部分。

根据本发明的DNA疫苗可以进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，DNA疫苗是口服剂型，如肠溶包衣胶囊、冻干粉或混悬液。根据本发明的DNA疫苗可以进一步包含一种或多种佐剂。

本文还提供了根据本发明的DNA疫苗用于治疗和/或预防冠状病毒疾病COVID-19或SARS-CoV-2感染。

本文还提供了一种用于治疗和/或预防冠状病毒疾病COVID-19或SARS-CoV-2感染的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用根据本发明的DNA疫苗。在优选的实施方案中，口服施用DNA疫苗。在某些实施方案中，单剂量的DNA疫苗包含约1×10⁶至约1×10⁹菌落形成单位(CFU)的伤寒沙门氏菌Ty21a菌株，和/或DNA疫苗在一周内施用2至4次用于初始免疫，任选地随后是至少一次增强剂量。在一个实施方案中，DNA疫苗在第一周内施用2至4次，随后是一次或多次单剂量增强，每次至少在2周后，优选每次至少在4周后。

附图说明

图1：SARS-CoV-2刺突蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，氨基酸残基1-1208标记为下划线，残基K986、V987、R682G、R683S和R685S标记为粗体。

图2：pVAX10.SCV-1的质粒图谱。

图3：用于克隆到pVAX10中的SARS-CoV-2构建体，其中X表示该结构域的存在，顺序从N端(左)到C端(右)。使用以下缩写；S FL(全长S蛋白，SEQ ID NO:1；*表示信号结构域(SEQ ID NO:1的Met1-SER12)被恒定链的信号结构域(SEQ ID NO:15的Met1-Arg29)替换)，S ecto：(S蛋白胞外结构域)，S1(S蛋白S1亚基)，RBD(受体结合域)，T4三聚体(T4纤蛋白三聚化基序)，3C3d(包含三个C3d蛋白拷贝的增强子序列)，2A(2A肽，如T2a或P2a)，Ubi.(泛素)，N(N蛋白)，S2(S蛋白S2亚基)和SV40DTS(SV40DNA核靶向序列)。

图4：VXM-SCV-3在健康小鼠中引发的免疫反应。分析接种疫苗的小鼠的血清中抗SARS-CoV刺突蛋白的抗体(参见实施例5)。测定背景位于400终点滴度，如虚线直线所示。

图5：VXM-SCV-30在健康小鼠中引发的免疫反应。分析接种疫苗的小鼠的血清中抗SARS-CoV刺突蛋白的抗体(参见实施例6)。测定背景位于400终点滴度，如直线所示。

图6：VXM-SCV-42在健康小鼠中引发的免疫反应。分析接种疫苗的小鼠的血清中抗SARS-CoV刺突蛋白的抗体(参见实施例7)。测定背景位于400终点滴度，如虚线直线所示。

图7：VXM-SCV-53在健康小鼠中引发的免疫反应。分析接种疫苗的小鼠的血清中抗SARS-CoV刺突蛋白的抗体(参见实施例8)。测定背景位于400终点滴度，如虚线直线所示。

具体实施方式

本文提供了一种DNA疫苗，其包含伤寒沙门氏菌Ty21a菌株，所述伤寒沙门氏菌Ty21a菌株包含DNA分子，所述DNA分子包含编码至少COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分的真核表达盒。

根据本发明，伤寒沙门氏菌Ty21a菌株起到DNA分子的细菌载体的作用，用于将所述DNA分子递送到靶细胞中，所述DNA分子包含编码至少COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分的真核表达盒。因此，DNA分子被递送到宿主细胞，并且S蛋白或其一部分被宿主细胞表达。伤寒沙门氏菌Ty21a菌株是减毒伤寒沙门氏菌株，根据本发明的DNA疫苗包括活减毒伤寒沙门氏菌Ty21a菌株。

在本发明的语境中，术语“减毒”是指与不具有减毒突变的亲本细菌菌株相比毒性降低的细菌菌株。优选地，减毒细菌菌株丧失了其毒力，但保留了其诱导保护性免疫的能力。减毒可通过删除各种基因，包括毒力、调节和代谢基因来实现。减毒细菌可以天然存在，或者可以在实验室中人工生产，例如通过使其适应新的培养基或细胞培养物，或者可以通过重组DNA技术来生产它们。施用约10¹¹CFU的本发明的沙门氏菌减毒株在优选地小于5％，更优选小于1％，最优选小于1‰受试者中引起沙门氏菌病。

术语“包含”(comprises)或“包含”(comprising)意指“包括但不限于”。该术语旨在是开放式的，旨在具体说明任何记载的特征、元件、整体、步骤或组分的存在，但并不排除一种或多种其他特征、元件、整体、步骤、组分或其组的存在或添加。因此，术语“包含”包括更限制性的术语“由......组成”和“基本上由......组成”。在一个实施方案中，术语“包含”可以单独地由术语“由......组成”代替。关于序列，术语“具有……的氨基酸序列”和“包含……的氨基酸序列”可互换使用，并且包括实施方案“由……的氨基酸序列组成”。本文使用的术语“一”可以包括复数，因此包括但不限于“一”。

本文所用术语“SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分”或“另一种SARS-CoV-2蛋白或其一部分”是指SARS-CoV-2 S蛋白或其免疫原性部分或另一种SARS-CoV-2蛋白及其免疫原性部分。蛋白质的免疫原性部分可包含免疫原性蛋白质的一个或多个结构域。然而，本发明还包括：免疫原性部分仅包含结构域的免疫原性部分，例如受体结合结构域或胞外结构域。本文所用术语“免疫原性”是指引起免疫应答如B细胞和/或T细胞应答的蛋白质部分。

包含至少一种真核表达盒的DNA分子也可以称为重组DNA分子，即工程化DNA构建体，优选地由不同来源的DNA片段组成。DNA分子可以是线性核酸或环状核酸。优选地，DNA分子是质粒，更优选地是表达质粒。质粒可以通过将编码至少SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分的开放阅读框引入质粒的真核表达盒中来产生。包含真核表达盒的质粒也可以称为真核表达质粒。

在本发明的语境中，术语“表达盒”是指包含至少一个开放阅读框(ORF)的核酸单位，所述开放阅读框在控制其表达的调节序列的控制下。优选地，表达盒还包含转录终止信号。表达盒可以优选地介导所包含的开放阅读框(其编码至少SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分)在靶细胞中的转录。真核表达盒通常包含启动子、至少一个开放阅读框和转录终止信号，其允许在真核靶细胞中表达。

冠状病毒是属于冠状病毒科的正义单链RNA病毒。这些病毒大多感染动物，包括鸟类和哺乳动物。在人类中，冠状病毒通常会导致轻微的呼吸道感染。自2003年以来，两种高致病性人类冠状病毒，包括严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)，导致了高发病率和高死亡率的全球流行。这两种地方性流行病都是由冠状病毒科中属于β冠状病毒属的人畜共患冠状病毒引起的。

与SARS-CoV和MERS-CoV一样，新型冠状病毒SARS-CoV-2属于β冠状病毒属。SARS-CoV-2的基因组约有30千碱基，编码多种结构和非结构蛋白。结构蛋白包括刺突(S)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白。如Zhou et al.(Cell Discovery(2020)6:14)所报道的，SARS-CoV-2与SARS-CoV具有最高核苷酸序列同一性(79.7％)。具体来说，SARS-CoV-2的包膜蛋白和核衣壳蛋白是两个进化上保守的区域，与SARS-CoV相比，序列同一性分别为96％和89.6％。据报道，刺突蛋白在SARS-CoV-2和SARS-CoV之间表现出最低的序列保守性(序列同一性为77％)，而SARS-CoV-2的刺突蛋白与MERS-CoV的刺突蛋白只有31.9％的序列同一性。预测了SARS-CoV-2的几种非结构蛋白，这些蛋白由开放阅读框ORF 1ab、ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF 7a、ORF7b、ORF8、ORF9a、ORF9b、和ORF10编码(Srinivasan etal.Viruses(2020)12:360)。与此同时，确定了SARS-CoV-2的几种变体，例如，在英国首次报告的SARS-CoV-2谱系B.1.1.7，在南非首次报告的B.1.351谱系，以及在巴西首次报告的B.1.1.28亚目，该亚目被更名为P.1(Galloway et al.,MMWR Morb Mortal WklyRep.2021Jan 22；70(3):95–99)。根据Galloway等人的报告，这些变体携带一系列遗传突变，包括在S蛋白受体结合结构域中，该结构域对于结合宿主细胞血管紧张素转换酶-2(ACE-2)受体以促进病毒进入是必不可少的。看起来这些变体传播得更有效率。

与SARS-CoV相关的各种报告表明了体液和细胞介导的免疫反应的保护作用。S蛋白是最暴露的蛋白，并且在小鼠模型中，针对SARS-CoV S蛋白的抗体反应已经显示出保护免于SARS-CoV感染。虽然有效的抗体反应可能是短暂的。相比之下，T细胞反应可提供长期保护。此外，多项研究表明，会产生针对SARS-CoV的N蛋白的抗体，通过延伸至SARS-CoV-2，N蛋白被认为是一种高免疫原性且在感染期间大量表达的蛋白。此外，在结构蛋白中，据报告T细胞对S和N蛋白的应答是最主要和最持久的(Ahmed et al.Viruses(2020)12:254)。沙门氏菌的减毒菌株——伤寒沙门氏菌Ty21a——属于肠道沙门氏菌。肠道沙门氏菌的减毒衍生物是将外源抗原递送至哺乳动物免疫系统的有吸引力的载体，因为肠道沙门氏菌菌株可能通过免疫的粘膜途径(即经口或经鼻)递送，其与肠胃外施用相比提供了简单和安全的优点。此外，沙门氏菌菌株在全身和粘膜隔室的水平均能够引发强烈的体液和细胞免疫应答。批量制备的成本低，并且活菌疫苗制剂非常稳定。减毒可通过删除各种基因，包括毒力、调节和代谢基因来实现。

已证明，几种通过aro突变而减毒的鼠伤寒沙门氏菌菌株在动物模型中是安全有效的外源抗原递送载体。

减毒伤寒沙门氏菌Ty21a菌株已被证明在以下方面是安全有效的：作为针对伤寒的疫苗和作为用于人类疫苗接种(主要是用于针对肿瘤抗原和/或基质抗原的疫苗接种)的异源抗原的递送载体。

活减毒伤寒沙门氏菌Ty21a菌株是Typhoral

的活性成分，Typhoral

也称为

(由Crucell在瑞士的公司Berna Biotech有限责任公司制造)。它是目前唯一获得许可的抗伤寒热口服活疫苗。这种疫苗已经被广泛测试，并已被证明在患者毒性以及向第三方传播方面是安全的(Wahdan et al.,J.Infectious Diseases 1982,145:292-295)。该疫苗已在40多个国家获得许可，并已用于数百万人的抗伤寒热预防性疫苗接种中，包括数千名儿童。Typhoral

的销售许可证编号为PL 15747/0001，日期为1996年12月16日。一个剂量的疫苗含有至少2×10⁹个活伤寒沙门氏菌Ty21a菌落形成单位和至少5×10⁹个失活的伤寒沙门氏菌Ty21a细胞。

这种耐受性良好的、活体口服抗伤寒热疫苗是通过对野生型毒性细菌分离株伤寒沙门氏菌Ty2的化学诱变衍生的，并且含有galE基因功能缺失性突变，导致其不能代谢半乳糖。减毒细菌菌株也不能将硫酸盐还原成硫化物，从而将其与野生型伤寒沙门氏菌Ty2菌株区分开来。关于其血清学特征，伤寒沙门氏菌Ty21a菌株含有O9-抗原(其是细菌外膜的多糖)并且缺乏O5-抗原(其是鼠伤寒沙门氏菌的特征性成分)。该血清学特征支持将相应的测试包括在一组对批量释放的鉴定测试中的基本原理。

SARS-CoV-2 S蛋白是一种糖蛋白，每个三聚体有66个N-连接糖基化位点。该蛋白还包含残基S673、T678和S686处的O-连接聚糖。此外，S蛋白包含两个功能结构域：受体结合结构域，和第二个结构域，所述第二个结构域包含介导病毒和细胞膜融合的序列。S糖蛋白必须被细胞蛋白酶裂解，才能暴露融合序列，因此是细胞进入所必需的。SARS-CoV-2的S糖蛋白的蛋白质序列显示，由于插入了序列PRRA，在残基681-687处存在弗林蛋白酶裂解序列(PRRARS|V)。由于呼吸道中存在丰富的弗林蛋白酶蛋白酶，因此SARS-CoV-2 S糖蛋白有可能在离开上皮细胞时被裂解，从而有效感染其他细胞。

用于本发明的DNA疫苗的表达盒是真核表达盒。在本发明的语境中，术语“真核表达盒”是指允许真核细胞中开放阅读框表达的表达盒。已证明，诱导足够的免疫应答所需的外源抗原的量对细菌可能是有毒性的，并可能导致细胞死亡、过度减毒或外源抗原表达缺失。使用在细菌载体中不表达而仅在靶细胞中表达的真核表达盒可以克服这一毒性问题，并且所表达的蛋白通常呈现出真核糖基化模式。

真核表达盒包含能够控制开放阅读框在真核细胞中表达的调控序列，优选为启动子和聚腺苷酸化信号。本发明沙门氏菌减毒株所包含的重组DNA分子所包括的启动子和聚腺苷酸化信号优选选择为在待免疫的受试者的细胞内起作用。合适的启动子，特别是用于生产人类DNA疫苗的实例包括但不限于来自巨细胞病毒(CMV)的启动子，如强CMV立即早期启动子；猿猴病毒40(SV40)；小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)；人类免疫缺陷病毒(HIV)，如HIV长末端重复(LTR)启动子；莫洛尼病毒；爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)；以及来自劳氏肉瘤病毒(RSV)；由CMV早期增强子元件、鸡β-肌动蛋白基因的启动子、第一外显子和第一内含子，以及兔β珠蛋白基因的剪接受体组成的合成CAG启动子；以及来自人类基因如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人类金属硫蛋白的启动子。在一个具体实施方案中，所述真核表达盒含有CMV启动子。在本发明的语境中，术语“CMV启动子”是指强立即早期巨细胞病毒启动子。

合适的聚腺苷酸化信号，特别是用于生产人类DNA疫苗的聚腺苷酸化信号的实例包括但不限于牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化位点、SV40聚腺苷酸化信号和LTR聚腺苷酸化信号。在一个具体实施方案中，本发明沙门氏菌减毒株所包含的重组DNA分子所包括的真核表达盒包含BGH聚腺苷酸化位点。

除了表达异源SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分所需的调节元件，如启动子和多腺苷酸化信号，其他元件也可包括在重组DNA分子中。这种其他元件包括增强子。增强子可以是例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸的增强子和病毒增强子如来自CMV、RSV和EBV的增强子。

在本发明的语境中，使用对于哺乳动物表达，特别是对于人类表达，而进行密码子优化的编码SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分(以及任选的其它SARS-CoV-2蛋白或其一部分，如SARS-CoV-2 N蛋白或其一部分)的基因(或开放阅读框)通常是有利的。因此，在某些实施方案中，真核表达盒包含至少密码子优化的编码COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分的序列。

由根据本发明的DNA疫苗编码的COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分包括但不限于(a)SARS-CoV-2全长S蛋白；(b)SARS-CoV-2 S蛋白胞外域；(c)SARS-CoV-2蛋白亚基S1；(d)SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)；(e)SARS-CoV-2 S蛋白的至少3个免疫显性表位。

在某些实施方案中，COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白是SARS-CoV-2全长S蛋白。SARS-CoV-2全长S蛋白可以包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，SARS-CoV-2全长S蛋白具有与SEQ ID NO:1具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，SARS-CoV-2全长S蛋白具有与SEQ ID NO:1具有至少98％至100％序列同一性的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白是由SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列组成的新型冠状病毒全长S蛋白。SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有GenBank注册号MN_908947，已由Wu等人发表(Nature 2020,579:265-269)。在一个具体的实施方案中，SARS-CoV-2全长S蛋白也可能是SARS-CoV-2的变体的全长S蛋白，如谱系B.1.1.7、B.1.351或P.1。

我们比较了GenBank中可获得的SARS-CoV-2的不同S蛋白序列，将下列GenBank登录号(蛋白-id)的序列进行了比对：MN_908947(QHD434616.1)、MN_988668(QHQ62107.1)、NC_045512(YP_009724390.1)、MN_938384.1(QHN73795.1)、MN_975262.1(QHN73810.1)、MN_985325.1(QHQ60594.1)、MN_988713.1(QHQ62877.1)、MN_994467.1(QHQ71963.1)、MN_994468.1(QHQ71973.1)、和MN997409.1(QHQ82464.1)，并没有发现任何差异。然而，以前曾报告过SARS-CoV-2 S蛋白的微小变异。例如，Wrapp等人(Science,2020,367:1260-1263)描述了临床分离株中的以下取代F32I、H49Y、S247R、N354D、D364Y、V367F、D614G、V1129L和E1262G。此外，Wang等人(J.Med.Virol.March 13,2020:1-8)报道了取代H49Y和V860Q。同一作者对已公开的SARS-CoV-2序列的进一步同源性分析显示，S蛋白的核苷酸同源性为99.82％至100％，S蛋白的氨基酸同源性为99.53％至100％。已鉴定的变体B.1.1.7、B.1.351和P.1带有几个突变。B.1.1.7变体S蛋白具有69-70HV和144Y缺失以及以下突变：N501Y、A570D、D614G、P681H、T761I、S982A、D1118H。变体B.1.351在S蛋白中携带以下突变：K417N、E484K、N501Y、D614G和A701V。P.1变体在S蛋白中带有L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y和T1027I突变(Galloway et al.,MMWR MorbMortal Wkly Rep.2021Jan 22；70(3):95–99.)。然而，随着时间的推移，可能会出现或鉴定出另外的取代或变体。

SARS-CoV-2全长S蛋白也可能是SARS-CoV-2全长S蛋白的融合前稳定形式，如包含两个或多个稳定突变。在某些实施方案中，SARS-CoV-2全长S蛋白的融合前稳定形式包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中氨基酸位置K986和V987突变为脯氨酸的两个稳定突变。

Wrapp等人已经描述了SARS-CoV-2 S蛋白的融合前稳定形式(Science,2020,367:1260-1263)，方法是使用以前证明对其他β冠状病毒S蛋白有效的稳定策略，通过在C端S2融合机构(machinery)中在残基986和987处添加两个稳定的脯氨酸突变。此外，Wrapp等人(Science,2020,367:1260-1263)描述了682-685残基处弗林蛋白酶裂解位点中的“GSAS”突变，取代了该位置的RRAR序列。这两种突变都稳定了蛋白质，从而阻止了融合。这不仅可以提高S蛋白的稳定性和表达，还可以通过防止细胞融合来提高安全性。在某些实施方案中，SARS-CoV-2全长S蛋白的融合前稳定形式包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中氨基酸位置K986和V987突变为脯氨酸的两个稳定突变；和/或对应于SEQ ID NO:1的残基681-687的弗林蛋白酶裂解序列(PRRARS|V)的突变，例如R682G、R683S和R685S突变。优选地，SARS-CoV-2全长S蛋白具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；还包含两个稳定突变K986P和V987P；或弗林蛋白酶裂解序列突变R682G、R683S和R685S，或者两个稳定突变K986P和V987P以及弗林蛋白酶裂解序列突变R682G、R683S和R685S。或者，也可以缺失弗林蛋白酶裂解序列的氨基酸，如氨基酸680-683。因此，在一个实施方案中，SARS-CoV-2全长S蛋白具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，还包含弗林蛋白酶裂解序列中的缺失，例如包含氨基酸S680-R683或由其组成的缺失。也可以使用导致S蛋白融合前稳定形式的其他氨基酸取代或氨基酸缺失。

在某些实施方案中，COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分包含SARS-CoV-2 S蛋白胞外结构域。术语“胞外结构域”是指跨膜蛋白SARS-CoV-2 S蛋白的胞外部分，即缺乏跨膜结构域和胞质结构域。胞外结构域包括含有受体结合域的膜远端亚基S1和膜近端亚基S2。SARS-CoV-2 S蛋白胞外结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-1208的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-1208具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。然而，本文所用的SARS-CoV-2 S蛋白胞外结构域可以是至少对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基1至1208的序列，或可以稍长一些，例如直到SEQ ID NO:1的N-末端1213个氨基酸残基，或与SEQ ID NO:1的氨基酸残基1至1213具有至少95％序列同一性的序列。在一个优选的实施方案中，SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分包含SARS-CoV-2 S蛋白胞外结构域，具有与SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-1208的序列具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，SARS-CoV-2 S蛋白胞外结构域具有与SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-1208具有至少98％至100％序列同一性的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分是SARS-CoV-2 S蛋白胞外结构域，所述SARS-CoV-2 S蛋白胞外结构域具有或由以下组成：SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-1208的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-1208具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在另一个具体实施方案中，SARS-CoV-2 S蛋白胞外结构域也可以是SARS-CoV-2的变体的S蛋白胞外结构域，如谱系B.1.1.7、B.1.351或P.1。

SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分还可以包含SARS-CoV-2 S蛋白胞外结构域的融合前稳定形式，其包含两个或多个稳定突变。在一个实施方案中，SARS-CoV-2 S蛋白胞外结构域的融合前稳定形式包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基1至1208的氨基酸序列中氨基酸位置K986和V987突变为脯氨酸的两个稳定突变。

在某些实施方案中，SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-1208的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-1208具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，还包含两个稳定突变K986P和V987P。

在某些实施方案中，SARS-CoV-2 S蛋白胞外结构域的融合前稳定形式包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-1208的氨基酸序列中氨基酸位置K986和V987突变为脯氨酸的两个稳定突变，和/或对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-1208的氨基酸序列的残基681-687的弗林蛋白酶裂解序列(PRRARS|V)的突变，例如R682G、R683S和R685S突变。优选地，SARS-CoV-2 S蛋白胞外结构域具有SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-1208的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-1208的氨基酸序列具有至少95％序列同一性且包含两个稳定突变K986P和V987P；或弗林蛋白酶裂解序列突变R682G、R683S和R685S，或两个稳定突变K986P和V987P以及弗林蛋白酶裂解序列突变R682G、R683S和R685S的氨基酸序列。或者，也可以缺失弗林蛋白酶裂解序列的氨基酸，如氨基酸680-683。因此，在一个实施方案中，SARS-CoV-2全长S蛋白具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，包含弗林蛋白酶裂解序列中的缺失，例如包含氨基酸S680-R683或由其组成的缺失。也可以使用导致S蛋白胞外结构域融合前稳定形式的其他氨基酸取代或氨基酸缺失。

SARS-CoV-2胞外结构域可以进一步包括用于稳定和/或改善表达和/或改善分泌的融合结构域。融合结构域也可以是三聚化结构域，如C-末端T4 fibritin三聚化基序。噬菌体T4 fibritin的三聚化结构域，称为“foldon”，具有与fibritin蛋白的氨基酸残基aa457-483相对应的氨基酸序列GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO:10)。

编码SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分的序列优选包含编码信号肽的信号序列。SARS-CoV-2 S蛋白的信号肽具有例如对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-15的氨基酸序列：MFVFLVLLPLVSSQC(SEQ ID NO:3)，或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少80％序列同一性，优选至少90％序列同一性的等同功能信号肽。在一个实施方案中，SARS-CoV-2 S蛋白的信号肽是恒定链的信号肽，其中在优选的实施方案中，SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-12被SEQ ID NO:15的氨基酸残基1-29取代。

在某些实施方案中，COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分包含SARS-CoV-2 S蛋白亚基S1。SARS-CoV-2 S蛋白亚基S1包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-681的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-681具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分包含SARS-CoV-2 S蛋白亚基S1，具有与SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-681的序列具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，SARS-CoV-2 S蛋白亚基S1具有与SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-681具有至少98％至100％序列同一性的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分是SARS-CoV-2 S蛋白亚基S1，所述SARS-CoV-2 S蛋白亚基S1具有或由以下组成：SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-681的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-681具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在另一个具体实施方案中，SARS-CoV-2 S蛋白亚基S1也可以是SARS-CoV-2的变体的S蛋白亚基S1，如谱系B.1.1.7、B.1.351或P.1。

在某些实施方案中，COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分包含SARS-CoV-2 S蛋白受体结合结构域(RBD)。SARS-CoV-2 S蛋白RBD包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基319-541的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1的氨基酸残基319-541具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分包含SARS-CoV-2 S蛋白RBD，具有与SEQ ID NO:1的氨基酸残基319-541的序列具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白RBD具有与SEQ ID NO:1的氨基酸残基319-541具有至少98％至100％序列同一性的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分是SARS-CoV-2 S蛋白RBD，所述SARS-CoV-2 S蛋白RBD具有或由以下组成：SEQ ID NO:1的氨基酸残基319-541的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1的氨基酸残基319-541具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在另一个具体实施方案中，SARS-CoV-2 S蛋白RBD也可以是SARS-CoV-2的变体的S蛋白RBD，如谱系B.1.1.7、B.1.351或P.1。

使用SARS-CoV-2全长S蛋白、SARS-CoV-2 S蛋白胞外结构域、SARS-CoV-2蛋白亚基S1或SARS-CoV-2 RBD的一个优点是，它提供了多克隆体液免疫应答(包括中和抗体应答)，保持对突变SARS-CoV-2的效力，并且体液以及细胞免疫应答不受MHC限制，因此仅限于某些HLA类型的患者。

在本发明的语境中，术语“与……具有至少95％序列同一性”是指在参考序列的氨基酸序列和/或编码氨基酸序列的核酸序列方面可能不同的蛋白质，参考序列的氨基酸序列例如是SEQ ID NO:1的氨基酸序列或SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-1208、氨基酸残基1-681或氨基酸残基319-541的氨基酸序列(也称为其相应部分)。S蛋白或其一部分可以是天然来源的，例如具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的SARS-CoV-2 S蛋白的突变形式或变体，或工程蛋白，例如工程糖蛋白衍生物，其已经通过引入位点定向突变或克隆进行了修饰，或其组合。已知密码子的使用在物种之间是不同的。因此，当在靶细胞中表达外源蛋白时，使核酸序列适应靶细胞的密码子使用可能是必要的或至少是有帮助的。用于设计和构建给定蛋白的衍生物的方法是本领域技术人员所熟知的。使核酸序列适应靶细胞的密码子使用也称为密码子优化。

与SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其相应部分具有至少约95％序列同一性的S蛋白或其一部分可含有一个或多个突变，包括一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代。根据本发明的教导，所述缺失、添加和/或取代的氨基酸可以是连续的氨基酸，或者可以散布在S蛋白的氨基酸序列或其与SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其相应部分具有至少约95％序列同一性的部分的长度上。根据本发明的教导，只要与SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其相应部分的氨基酸序列同一性至少约95％，则可以添加、删除和/或取代任何数目的氨基酸。在特定实施方案中，S蛋白或其一部分的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其相应部分的序列同一性为至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或优选至少99％。所有百分比均与SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其相应部分(如氨基酸残基1-1208、氨基酸残基1-681或氨基酸残基329-541)相关。用于测定序列一致性包括比较亲本蛋白与其相对于亲本序列具有缺失、添加和/或取代的衍生物的方法和算法，是本领域普通技术人员公知的。在DNA水平上，由于遗传密码的简并性和任选的密码子优化，编码与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的S蛋白或其一部分的核酸序列可能在更大程度上不同。

根据本发明，在某些实施方案中，DNA疫苗可包含伤寒沙门氏菌Ty21a菌株，所述菌株包含DNA分子，所述DNA分子包含真核表达盒，所述真核表达盒从N-末端到C-末端编码至少SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分和增强子序列，例如补体肽序列，更优选补体蛋白C3d(SEQID NO:4)的三个拷贝，优选地三个C3d中的每一个被GS接头分隔(3C3d；SEQ ID NO:5)。已描述了此类序列可增强体液免疫应答，特别是引发更强的抗体应答。在SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分包含SARS-CoV-2 S蛋白胞外结构域、SARS-CoV-2 S蛋白亚基S1或SARS-CoV-2 S蛋白RBD的情况下，真核表达盒可进一步编码三聚体结构域，例如C-末端T4 fibritin三聚体基序(SEQ ID NO:10)，优选与SARS-CoV-2 S蛋白部分融合。因此，在某些实施方案中，DNA疫苗可能还包含伤寒沙门氏菌Ty21a菌株，该菌株包含含有真核表达盒的DNA分子，该真核表达盒从N-末端到C-末端编码至少SARS-CoV-2蛋白或其一部分(包括SARS-CoV-2 S蛋白胞外结构域、SARS-CoV-2 S蛋白S1亚基或SARS-CoV-2 S蛋白RBD，优选SARS-CoV-2 S蛋白胞外结构域)、三聚化结构域和任选的增强子序列，如补体肽序列。

示例性的增强子序列，例如泛素肽序列或补体肽序列以分别促进抗原在MHC I类或II类分子中的呈递，在本领域中是已知的。在B16肿瘤攻击模型中，由鼠伤寒沙门氏菌递送给鼠的编码MHC I类抗原和泛素肽的质粒载体已经显示出增强的抗原特异性T细胞应答和肿瘤控制(Xiang et al,PNAS,2000)。报告显示，通过包含三个拷贝的补体蛋白C3d的肽可增强对DNA载体编码的B细胞表位的抗体应答，其中补体蛋白C3d与B细胞和滤泡树突细胞上发现的CR2(CD21)受体结合，以增强抗原特异性B细胞活化(Moveseyan,J Neuroimmunol,2008；Yang,Virus Res,2010；Hou,Virology J,2019)。因此，为了增强B细胞反应，可以在编码SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分的序列的C-端添加补体肽序列，如补体蛋白C3d(KFLTTAKDKNRWEDPGKQLYNVEATSYA；SEQ ID NO:4)的三个拷贝。优选地，三个28个氨基酸的肽通过GS接头分离，例如GS(G₄S)₂GS，如SEQ ID NO:5(3C3d)中所示。此外，为了改善包含编码至少SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分的真核表达盒的DNA分子(例如质粒)从细胞质的导入核中，DNA分子可以进一步包含DNA核靶向序列，例如SV40 DNA核靶向序列(DTS；SEQ ID NO:16)的一个或多个拷贝，优选DTS的两个或更多个拷贝。

根据本发明的DNA疫苗可以进一步编码另一种SARS-CoV-2蛋白或其一部分，优选SARS-CoV-2 N蛋白或其一部分。在优选的实施方案中，SARS-CoV-2 N蛋白或其一部分包含SEQ ID NO:8的序列或其一部分，或与SEQ ID NO:8或其相应部分具有至少95％序列同一性的序列。优选地，SARS-CoV-2 N蛋白或其一部分具有与SEQ ID NO:8的序列具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，SARS-CoV-2N蛋白或其一部分具有与SEQ ID NO:8的序列或其相应部分具有至少98％至100％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，SARS-CoV-2 N蛋白或其一部分也可以具有SARS-CoV-2的变体的氨基酸序列，例如谱系B.1.1.7、B.1.351或P.1。

另一种SARS-CoV 2蛋白或其一部分可以由另一种DNA疫苗表达，所述另一种DNA疫苗包含伤寒沙门氏菌Ty21a菌株，所述伤寒沙门氏菌Ty21a菌株包含DNA分子，所述DNA分子包含编码除刺突(S)蛋白或其一部分之外的至少一种COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)的真核表达盒。两种DNA疫苗可联合给药，以诱导针对SARS-CoV-2 S蛋白和另一种SARS-CoV-2蛋白的免疫应答。或者，所述另一种SARS-CoV 2蛋白或其一部分可通过还包含编码所述另一种SARS-CoV-2蛋白的第二种DNA分子的本发明的DNA疫苗表达。因此，DNA疫苗包含伤寒沙门氏菌Ty21a菌株，所述伤寒沙门氏菌Ty21a菌株包含第一DNA分子，所述第一DNA分子包含编码至少COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)蛋白刺突(S)蛋白或其一部分的真核表达盒；和第二DNA分子，所述第二DNA分子包含编码除刺突(S)蛋白或其一部分之外的至少一种COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)蛋白的真核表达盒。优选地，第一和第二DNA分子是质粒，优选表达质粒。更优选地，质粒具有相同的载体骨架，例如pVAX10骨架。还预期另一种SARS-CoV-2蛋白或其一部分由相同的DNA分子表达，该DNA分子包含编码SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分的第一表达盒和编码另一种SARS-CoV-2蛋白或其一部分的第二表达盒。所有这些实施方案可以与前述实施方案自由组合，特别是进一步限定编码至少SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分的表达盒任选包含增强子序列和/或三聚化结构域。

还预期DNA分子包含编码SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分和另一种SARS-CoV-2蛋白或其一部分的真核表达盒。因此，在某些实施方案中，DNA疫苗包含伤寒沙门氏菌Ty21a菌株，所述伤寒沙门氏菌Ty21a菌株包含DNA分子，所述DNA分子包含真核表达盒，所述真核表达盒编码至少COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分，和另一种COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)蛋白(结构或非结构)。优选地，SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分是N-末端表达的，而另一种SARS-CoV-2蛋白或其一部分是C-末端表达的。以下实施方案可以与前述实施方案自由组合，特别是进一步限定编码至少SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分的表达盒任选包含增强子序列和/或三聚化结构域。在一个优选的实施方案中，DNA疫苗包含伤寒沙门氏菌Ty21a菌株，所述伤寒沙门氏菌Ty21a菌株包含DNA分子，所述DNA分子包含真核表达盒，所述真核表达盒编码至少COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分，和COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白或其一部分。SARS-CoV-2 N蛋白或其一部分可包含SEQ ID NO:8的序列或其一部分，或与SEQ ID NO:8或其相应部分具有至少95％序列同一性的序列。优选地，SARS-CoV-2 N蛋白或其一部分具有与SEQ ID NO:8的序列具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，SARS-CoV-2 N蛋白或其一部分具有与SEQ ID NO:8的序列或其相应部分具有至少98％至100％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，SARS-CoV-2 N蛋白或其一部分也可以具有SARS-CoV-2的变体的氨基酸序列，例如谱系B.1.1.7、B.1.351或P.1。SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分可通过2A自裂解肽(2A肽)或内部核糖体进入位点(IRES)，优选2A肽，与另一种SARS-CoV-2蛋白连接。2A肽的实例有氨基酸序列为GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:6)的P2a或氨基酸序列为GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:7)的T2a。

根据本发明，DNA疫苗可包含伤寒沙门氏菌Ty21a菌株，该菌株包含含有真核表达盒的DNA分子，该真核表达盒从N-末端到C-末端编码至少SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分、2A肽或IRES序列和另一种SARS-CoV-2蛋白或其一部分，优选SARS-CoV-2 N蛋白或其一部分。另一种SARS-CoV-2蛋白或其一部分之后还可以跟随SARS-CoV-2蛋白亚基S2，特别是如果SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分是SARS-CoV-2蛋白亚基S1。在某些实施方案中，SARS-CoV-2蛋白亚基S2包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基686-1208或与SEQ ID NO:1的氨基酸残基686-1208具有至少95％同一性的序列。在一个实施方案中，亚基S2包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基686-1273或与SEQ ID NO:1的氨基酸残基686-1273具有至少95％同一性的序列。

另一种SARS-CoV-2蛋白或其一部分可以进一步以增强子序列，例如泛素序列，为前导。泛素在小鼠和人之间是保守的，其氨基酸序列为MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRG(SEQ ID NO:9)。不受理论束缚，N-末端泛素序列可增强T细胞对抗原的反应。因此，还考虑了一种DNA疫苗，该DNA疫苗包含伤寒沙门氏菌Ty21a菌株，该菌株包含含有真核表达盒的DNA分子，该真核表达盒从N-末端到C-末端编码至少SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分、2A肽或IRES序列、泛素序列和另一种SARS-CoV-2蛋白或其一部分，优选SARS-CoV-2 N蛋白或其一部分，任选地随后是SARS-CoV-2蛋白S2亚基。

N蛋白被认为主要引发T细胞应答。在B16肿瘤攻击模型中，由鼠伤寒沙门氏菌递送给鼠的编码MHC I类抗原和泛素肽的质粒载体已经显示出增强的抗原特异性T细胞应答和肿瘤控制(Xiang et al,PNAS,2000)。因此，T细胞增强序列可以与另一种SARS-CoV-2蛋白或其一部分，如SARS-CoV-2 N蛋白或其一部分融合，优选N-末端融合。

术语“2A自裂解肽”、“2A裂解位点”或“2A肽”在本文中用作同义词，指一类18-22个氨基酸长的肽，其可诱导细胞中重组蛋白的裂解。2A肽最初发现于病毒的病毒基因组的2A区域，并已被用作在一个表达盒中表达多肽的工具。2A肽介导的裂解发生在翻译后，裂解由2A肽C端脯氨酸(P)和甘氨酸(G)之间的肽键断裂触发。编码2A肽接头的序列是本领域已知的，例如在SEQ ID NO:6或7中提供的。

如本文所用，术语“内部核糖体进入位点”，缩写为IRES，是一种RNA元件，它允许以非帽依赖性方式启动翻译，因此在包含IRES序列的mRNA中的翻译也在IRES序列处启动。

在另一个实施方案中，DNA疫苗包含伤寒沙门氏菌Ty21a菌株，所述伤寒沙门氏菌Ty21a菌株包含DNA分子，所述DNA分子包含真核表达盒，所述真核表达盒编码至少COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分，其中，COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分包含SARS-CoV-2 S蛋白的至少3个免疫显性表位。在一个实施方案中，表达盒编码SARS-CoV-2 S蛋白的至少3个免疫显性表位和增强子序列，例如如上所述的补体肽序列。

本文使用的术语“SARS-CoV-2 S蛋白的至少3个免疫显性表位”是指一个多肽或多于一个多肽，其一起包含SARS-CoV-2 S蛋白的3个或更多个免疫显性表位。SARS-CoV-2 S蛋白的三个或更多个免疫显性表位是同一多肽的一部分还是不同多肽并不影响。因此，SARS-CoV-2 S蛋白的三个或更多个免疫显性表位可以表达为一个多肽或一个以上多肽。在一个实施方案中，真核表达盒编码至少一个多肽，该多肽包含SARS-CoV-2 S蛋白的至少3个免疫显性表位。包含在所述至少一个或多个多肽中的免疫显性表位是3个或更多、5个或更多、10个或更多、20个或更多、30个或更多、50个或更多、或甚至50个以上的免疫显性表位。在本文所用的伤寒沙门氏菌Ty21a菌株的语境中，编码SARS-CoV-2 S蛋白的至少3个免疫显性表位的真核表达盒可编码一个多肽，该多肽包含至多50个免疫显性表位或甚至更多，例如至多300个。在I类或II类MHC(在人HLA中)上以肽形式呈递的抗原，对于MHC II而言通常为11至30个氨基酸长度(CD4抗原)，对于MHC I而言则为8至10个氨基酸长度(CD8抗原)。因此，所述至少一个多肽中包含的免疫显性表位的优选范围是3至300、5至300、10至300、20至300或50至300个免疫显性表位。因此，该多肽可以进一步包含来自SARS-CoV-2的其他结构蛋白的免疫显性表位，例如E蛋白、M蛋白或N蛋白，优选N-蛋白。待由真核表达盒表达或待包含在至少一个多肽中的SARS-CoV-2 S蛋白的免疫优势表位的优选范围是3至25、3至20或5至15。包含融合的免疫优势表位的每个多肽都在抗原呈递细胞内被水解裂解成表位，并通过HLA呈递以引发T细胞应答。

鉴于SARS-CoV-2的S蛋白与SARS-CoV之间的密切遗传相似性(76％)，可以使用预先存在的SARS-CoV免疫学研究来预测SARS-CoV-2T和B表位(Ahmed et al,Viruses,2020)。T和B细胞表位也可以使用生物信息学方法和经过验证的算法来预测，以识别与各种HLA分子的MHC I类和II类蛋白结合的氨基酸基序(Grifoni et al,Cell,2020)。免疫表位数据库和分析资源(IEDB)、NetMHCPan和NetMHCIIPan等公共资源可用于生成推定的T和B细胞表位。使用这些方法，可以设计多表位疫苗以包含富含表位的S蛋白部分。特别值得关注的一个区域是S蛋白的受体结合基序(RBM)，该基序与人靶细胞上的血管紧张素转换酶2(ACE2)受体相互作用，促进病毒进入。抗SARS-CoV的RBM的抗体是中和性的，但是SRS-CoV和SARS-CoC-2的RBM只有50％的共有同一性，并且抗体不会交叉中和(Ju et al,BioRxiv,2020–提交；Walls et al,Cell,2020)。

根据本发明，SARS-CoV-2 S蛋白的至少3个免疫显性表位可以包含CD8 T细胞抗原和/或CD4 T细胞抗原。优选地，SARS-CoV-2 S的至少3个免疫显性表位包括CD8 T细胞抗原和CD4 T细胞抗原。

免疫显性表位通常是具有8至30个氨基酸，优选8至20个，更优选8至12个氨基酸的肽。

对于包含SARS-CoV-2 S蛋白的免疫显性表位的疫苗，如果疫苗靶向S蛋白的多个免疫显性表位，优选另外靶向甚至其它结构蛋白，如N蛋白，是有益的，因为这降低了由于S蛋白突变导致免疫逃避的风险。

或者，在某些实施方案中，DNA疫苗包含伤寒沙门氏菌Ty21a菌株，该菌株包含含有真核表达盒的DNA分子，该真核表达盒从N-末端到C-末端编码SARS-CoV-2 S蛋白的至少三个免疫显性表位和任选的增强子序列、2A肽或IRES序列、任选的泛素序列和另一种SARS-CoV-2蛋白或其一部分，优选SARS-CoV-2 N蛋白或其一部分。SARS-CoV-2 N蛋白的部分可以是SARS-CoV-2N蛋白的至少三个免疫显性表位。

作为至少SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分的载体(例如SARS-CoV-2 S蛋白的3个免疫优势表位、全长S蛋白、S蛋白胞外结构域、S蛋白亚基S1或S蛋白RBD)，包含伤寒沙门氏菌Ty21a的本发明的DNA疫苗的优点是已建立的质量控制测定，质粒的个体差异仅在编码抗原的插入片段中，无需扩增，由于口服施用，无需关于无菌测试的要求。此外，适合转化的表达质粒以及作为载体的伤寒沙门氏菌Ty21a菌株允许插入大片段，例如全长S蛋白或大量免疫显性表位。它还允许进一步引入另一种SARS-CoV-2蛋白或其一部分，例如通过2A肽或IRES序列与SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分连接的SARS-CoV-2 N蛋白或其一部分。

SARS-CoV-2 S蛋白(或任选的N蛋白)的免疫显性表位可以以一串珠子(beads)的形式(表达为一种或多种多肽)插入质粒中，任选地被接头分隔。。接头可以是但不限于GS接头、2A裂解位点或IRES序列。由于生产快速并且仅需要有限的质量控制，生产包含含有编码SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分的至少一个真核表达盒的DNA分子的伤寒沙门氏菌Ty21a菌株的时间较短，且可以例如在鉴定抗原(包括免疫显性表位或新的临床分离物或突变体)后的15天内，优选在14天或更短时间内实现。过夜发酵足够，并且由于细菌的高产量而无须扩大规模，在1L培养物中的净产量在10¹¹个菌落形成单位(CFU)的范围内。这能够缩短制造时间并降低制造成本。此外，研究显示该药物产品稳定至少三年。因此，这种DNA疫苗适合于快速开发和生产有效的SARS-CoV-2预防和/或治疗性疫苗，用于大量有此需要的受试者。此外，它易于储存，不需要经过医疗培训的人员进行管理。

可以使用接头将编码至少SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分的DNA序列与编码另一种SARS-CoV-2蛋白或其一部分的DNA序列分开，接头可以是但不限于GS接头、2A裂解位点或IRES序列。

用于检测蛋白质中的免疫显性表位并可靠地预测或确定与自体人白细胞抗原(HLA)分子高亲和力结合的那些肽的方法是本领域已知的。然后选择经预测可能与患者自体HLA-A或HLA-B蛋白结合或在人群中占优势的肽。这可以通过例如离体干扰素γ酶联免疫斑点(ELISPOT)来确认。

在某些实施方案中，DNA分子或包含至少一种真核表达盒的DNA分子包含抗生素抗性基因(例如卡那霉素抗生素抗性基因)、ori(例如pMB1 ori或pUC)和强启动子(例如CMV启动子)。在具体实施方案中，DNA分子或包含至少一种真核表达盒的DNA分子是质粒，例如基于或衍生自市售pVAX1^TM表达质粒(Invitrogen，San Diego，California)的质粒。

可以通过用pBR322的低拷贝pMB1复制起点取代高拷贝pUC复制起点来改造该表达载体。进行低拷贝修饰是为了降低代谢负担并使构建体更稳定。将产生的表达载体骨架命名为pVAX10。

表达载体也可设计为含有增强子，如泛素或补体，以促进MHC类或II类分子中抗原的呈递。在B16肿瘤攻击模型中，由鼠伤寒沙门氏菌递送给鼠的编码MHC I类抗原和泛素的质粒载体已经显示出增强的抗原特异性T细胞应答和肿瘤控制(Xiang et al,PNAS,2000)。报告显示，通过包含补体蛋白C3d(SEQ ID NO:4)的三个拷贝可增强对DNA载体编码的B细胞表位的抗体应答，其中补体蛋白C3d与B细胞和滤泡树突细胞上发现的CR2(CD21)受体结合，以增强抗原特异性B细胞活化(Moveseyan,J Neuroimmunol,2008；Yang,Virus Res,2010；Hou,Virology J,2019)。

已经采用了多种方法，使用单个质粒载体促进多个基因的翻译，包括在肽基因序列之间插入内部核糖体进入位点(IRES)(Ma et al,Hum Vaccin Immunother,2013)或2A肽(Liu et al,Scientific Reports,2017)。

在具体实施方案中，表达质粒包含SEQ ID NO:2的DNA分子(载体主链pVAX10)，其与表达载体pVAX10的序列相关，但不包含位于限制性酶切位点NheI和XhoI之间的多克隆位点部分。在一个实施方案中，表达质粒包含SEQ ID NO:2的核酸序列和编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其一部分或与SEQ ID NO:1或其一部分具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的序列。

通过NheI/XhoI将编码SARS-CoV-2 S蛋白的ORF(具有编码SEQ ID NO:1的核酸序列)插入到表达载体骨架中，得到表达质粒。表达质粒pVAX10.SCV-1示意图如图2。

根据本发明的DNA疫苗可以是药物组合物的形式。因此，在某些实施方案中，DNA疫苗包含伤寒沙门氏菌Ty21a菌株，所述伤寒沙门氏菌Ty21a菌株包含DNA分子，所述DNA分子包含真核表达盒，所述真核表达盒编码至少COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分，还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，所述DNA疫苗是口服剂型。本发明的DNA疫苗可以是溶液、悬浮液的形式或任何其它适合预期口服使用的形式。替代剂型为肠溶胶囊或冻干粉。通常，根据本发明的DNA疫苗以饮用溶液的形式提供，优选以悬浮液的形式提供，更优选以水悬浮液的形式提供。该实施方案的患者依从性有所改善，并且使得可以进行快速、可行且实惠的大规模疫苗接种，尤其是在贫瘠地域。

本发明还提供了包含根据本发明的DNA疫苗的药物组合物。

在本发明的语境中，术语“赋形剂”是指与药物的活性成分一起制剂的天然或合成物质。合适的赋形剂包括溶剂、抗粘剂、粘合剂、包衣、崩解剂、调味剂、着色剂、润滑剂、助流剂、吸收剂、防腐剂和甜味剂。

在本发明的语境中，术语“药学上可接受的”是指，当施用于哺乳动物(例如人)时，生理上可耐受的并且通常不产生不利反应的药物组合物(例如DNA疫苗)的分子物质和其他成分。术语“药学上可接受的”也可以指由联邦或州政府的管理机构批准的，或在美国药典或其他公认的药典中列出的，用于哺乳动物，更具体地说，用于人类。

在某些实施方案中，本发明的DNA疫苗或药物组合物是肠溶胶囊、冻干粉或混悬液的形式。合适的悬浮液包括至少在一定程度上中和胃酸的手段，即使胃液的pH值接近pH值7。因此，在某些实施方案中，悬浮液是缓冲悬浮液，所述缓冲悬浮液通过使本发明的沙门氏菌减毒株悬浮在合适的缓冲液中而获得，优选地，悬浮在将胃酸至少中和至某一程度的缓冲液中而获得，优选地，悬浮在含有2.6g碳酸氢钠、1.7g L-抗坏血酸酸、0.2g乳糖一水合物和100ml饮用水的缓冲液中而获得。

在某些实施方案中，本发明药物组合物的DNA疫苗还包含一种或多种佐剂。

在本发明的语境中，术语“佐剂”是指改变活性成分，即根据本发明的沙门氏菌的减毒株的作用的试剂。佐剂可以增强对抗原的免疫应答，从而使抗原的给药量最小化。

在本发明的语境中，术语“疫苗”是指在施用后能够在受试者中诱导免疫应答的药剂。优选地，疫苗可以预防、改善或治疗疾病。根据本发明的疫苗包含伤寒沙门氏菌Ty21a的减毒活菌株。根据本发明的疫苗是DNA疫苗，并因此还包含至少一个拷贝的DNA分子，所述DNA分子包含真核表达盒，所述真核表达盒编码至少COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分。

本文所用的术语“DNA疫苗”或“DNA疫苗接种”是指通过递送含有编码抗原(例如SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分，寻求针对该抗原的免疫反应以靶向有需要的患者的细胞)的DNA序列的遗传工程化的线性DNA或优选质粒，来保护免受或治疗疾病或感染的疫苗。因此，抗原由靶细胞产生并诱导免疫应答。DNA疫苗与常规疫苗相比具有潜在优势，包括能够诱导更广泛的免疫应答类型，如体液和/或细胞介导的免疫应答。质粒可通过几种方法递送至组织，包括使用盐水注射、基因枪、脂质体或通过载体，如细菌和病毒载体。根据本发明的DNA疫苗包含伤寒沙门氏菌Ty21a菌株作为用于递送DNA分子的载体，所述DNA分子包含编码至少COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分的真核表达盒。优选地，由活减毒伤寒沙门氏菌Ty21a菌株递送的DNA分子是质粒。

根据本发明的活减毒沙门氏菌株稳定地携带编码至少COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分的DNA分子。它可用作口服递送该DNA分子的载体。在本发明的语境中，这种包含编码异源抗原如SARS-CoV-2 S蛋白或其一部分的DNA分子的递送载体被称为DNA疫苗。

基因免疫可能优于常规疫苗接种。靶DNA可以在相当长的一段时间内被检测到，从而充当抗原的储库。一些质粒中的序列基序，如GpC岛，是免疫刺激性的，并且可以作为由LPS和其他细菌组分引起的免疫刺激所促进的佐剂。

活减毒沙门氏菌载体(例如，伤寒沙门氏菌Ty21a)在原位产生它们自己的免疫调节因子如脂多糖(LPS)，这可能与其他形式的施用(例如微胶囊化)相比构成优势。此外，根据本发明的粘膜DNA疫苗使用冠状病毒的天然进入位点，这可能被证明是有益的。粘膜疫苗接种具有淋巴内作用模式。注入本发明的减毒疫苗后，肠道派伊尔结中的巨噬细胞和其他细胞被修饰的细菌侵入。细菌被这些吞噬细胞摄取。由于它们的减毒突变，伤寒沙门氏菌Ty21菌株细菌不能保持在这些吞噬细胞中，而是在这个时间点死亡。DNA分子从细菌和内体中释放出来，然后通过特定的转运系统或通过内体渗漏(endosomal leakage)转移到吞噬免疫细胞的胞质溶胶中。最后，重组DNA分子进入细胞核，在那里被转录，导致吞噬细胞内大量的SARS-CoV-2 S蛋白表达。被感染的细胞经历细胞凋亡，装载S蛋白质抗原，并被肠道免疫系统摄取和加工。细菌感染的危险信号在此过程中充当强力佐剂，导致在全身和粘膜隔室水平上产生强烈的抗原特异性CD8+T细胞和抗体应答。淋巴内粘膜疫苗接种途径特别适用于大规模疫苗接种，以及使用粘膜进入途径的病原体，如冠状病毒。

含真核质粒的沙门氏菌疫苗可对质粒编码的抗原产生B细胞应答。在用含有编码抗原李斯特菌溶血素或ActA的pCMVb真核表达载体的鼠伤寒沙门氏菌口服免疫的小鼠中，免疫后4周可在血清中检测到抗原特异性抗体(Darji et al,Cell,1997；Darji et al,FEMS Immunol Med Microbiol,2000)。

疫苗株伤寒沙门氏菌Ty21a具有无与伦比的安全性记录。没有可获得的数据表明伤寒沙门氏菌Ty21a能够系统性地进入血液。因此，活减毒伤寒沙门氏菌Ty21a疫苗菌株能够在肠道中特异性靶向免疫系统，同时安全且耐受性良好。相比之下，基于腺病毒的DNA疫苗可能具有病毒非预期复制的内在风险。此外，针对腺病毒的预先存在的免疫被证明限制了疫苗在人类中的效力。

本文还提供了根据本发明的DNA疫苗用于治疗和/或预防冠状病毒疾病COVID-19或SARS-CoV-2感染。本文还提供了一种用于治疗和/或预防冠状病毒疾病COVID-19或SARS-CoV-2感染的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用根据本发明的DNA疫苗。

如果发生类似由组胺、白三烯或细胞因子介导的过敏反应的不良事件，则可使用针对发热、过敏反应、血压不稳定、支气管痉挛和呼吸困难的治疗选项。在发生不期望的源自T细胞的自我攻击的情况下，治疗选项来源于干细胞移植后应用的急性和慢性移植物抗宿主病的标准处理方案。提出环孢菌素和糖皮质激素作为治疗选项。

在不太可能的全身性伤寒沙门氏菌Ty21a型感染的情况下，推荐适当的抗生素治疗，例如使用氟喹诺酮类(fluoroquinolones)，包括环丙沙星(ciprofloxacin)或氧氟沙星(ofloxacin)。胃肠道的细菌感染使用相应的药剂例如利福昔明(rifaximin)来进行治疗。

在优选的实施方案中，根据本发明的DNA疫苗被口服施用，所述DNA疫苗包含伤寒沙门氏菌Ty21a菌株，所述伤寒沙门氏菌Ty21a菌株包含DNA分子，所述DNA分子包含编码至少COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分的真核表达盒。经口施用比肠胃外施用更简单、更安全、更舒适。尽管本发明的DNA疫苗也可以通过任何其它合适的途径施用，但优选口服途径。优选地，向受试者施用治疗有效剂量，并且该剂量可以取决于具体的应用，特别是DNA疫苗是用于治疗还是预防用途、受试者的体重、年龄、性别和健康状态、施用方式和制剂等。根据需要，施用可以是单次或多次。

本发明的DNA疫苗可以以溶液、悬浮液、冻干剂、肠溶衣胶囊或任何其它合适的形式提供。根据本发明的沙门氏菌减毒株通常被配制成饮用溶液。该实施方案的患者依从性有所改善。优选地，所述饮用溶液包含将胃酸至少中和至某一程度，即，使胃液的pH接近pH7的手段。优选地，所述饮用溶液是包含本发明沙门氏菌减毒株的缓冲悬浮液。在一个具体实施方案中，所述缓冲悬浮液通过使根据本发明的沙门氏菌减毒株悬浮在合适的缓冲液中而获得，所述合适的缓冲液优选含有2.6g碳酸氢钠、1.7g L-抗坏血酸、0.2g乳糖一水合物和100ml的饮用水。

在特定实施方案中，COVID-19或SARS-CoV-2感染的治疗和/或预防可以进一步包括施用另外的SARS-CoV-2疫苗或抗SARS-CoV-2治疗。COVID-19和/或SARS-CoV-2感染的治疗和/或预防可以进一步包括DNA疫苗，该DNA疫苗包含伤寒沙门氏菌Ty21a菌株，该菌株包含DNA分子，该DNA分子包含真核表达盒，该真核表达盒编码至少另一种SARS-CoV 2蛋白或其一部分，例如COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白或核衣壳(N)蛋白或其一部分，优选SARS-CoV-2 N蛋白质或其一部分。两种DNA疫苗可以联合给药，也可以随后给药，优选两种DNA疫苗联合给药。

在某些实施方案中，COVID-19和/或SARS-CoV-2感染的治疗和/或预防包括针对SARS-CoV-2的初始/加强疫苗接种。在本发明的语境中，术语“初始/加强疫苗接种”是指一种免疫方案，其包括用初始疫苗接种并随后用至少一次强化疫苗接种使受试者免疫。在优选的实施方案中，初始疫苗和增强疫苗是相同的；即初始/增强疫苗接种代表同源的初始/增强疫苗接种。特别地，根据本发明的DNA疫苗作为初始疫苗并作为增强疫苗施用。在其它实施方案中，初始疫苗和增强疫苗代表针对相同病原体的不同类型的疫苗；即初始/增强疫苗接种代表异源初始/增强疫苗接种。在某些实施方案中，根据本发明的DNA疫苗可以作为初始疫苗施用，并且另一种SARS-CoV-2疫苗作为增强疫苗施用。在特定的其它实施方案中，另一种β冠状病毒疫苗作为初始疫苗施用，并且根据本发明的减毒沙门氏菌株作为增强疫苗施用。初始/增强疫苗接种可能比单独接种单次初始疫苗接种引起更好的免疫应答。通过初始/增强疫苗接种可以改善初始T细胞应答、抗体应答和/或延长免疫应答。

在某些实施方案中，根据本发明的初始和增强DNA疫苗的施用发生在连续八周内，更特别地发生在连续三至六周内。初始疫苗和增强疫苗可以通过相同的途径或通过不同的途径施用。优选地，根据本发明的初始和增强DNA疫苗通过相同的途径施用，更优选地，初始和增强DNA疫苗口服施用。此外，根据本发明的DNA疫苗可以以相同或不同的剂量施用一次或多次。本领域技术人员有能力优化初始/增加疫苗接种方案，包括优化疫苗施用的时间和剂量。

在特定实施方案中，单剂量的DNA疫苗包含约10⁵至约10¹¹或约1×10⁶至约1×10¹⁰，更优选约1×10⁶至约1×10⁹，约1×10⁶至约1×10⁸，或约1×10⁶至约1×10⁷菌落形成单位(CFU)的本发明伤寒沙门氏菌Ty21a菌株。在一个实施方案中，单剂量DNA疫苗包含约1×10⁶至约1×10⁹菌落形成单位(CFU)的伤寒沙门氏菌Ty21a菌株。施用低剂量的这种活减毒细菌DNA疫苗可以将排泄风险最小化并从而减少传播给第三方的风险。此前已显示，在1x10⁹CFU以下检测不到排泄。

在这一背景下，术语“约”或“近”意指给定值或范围的3倍以内，或者2倍以内，包括1.5倍以内。

在某些实施方案中，COVID-19或SARS-CoV-2感染的治疗和/或预防包括多次施用根据本发明的DNA疫苗。DNA疫苗施用的单剂量可以相同或不同，优选单剂量相同并且包含约1×10⁶至约1×10⁹菌落形成单位(CFU)的伤寒沙门氏菌Ty21a菌株。具体地，COVID-19或SARS-CoV-2感染的治疗和/或预防包括1、2、3、4、5或6次根据本发明的DNA疫苗的施用。优选地，COVID-19或SARS-CoV-2感染的治疗和/或预防包括在一周内施用DNA疫苗2至4次以进行初始免疫(作为初始疫苗接种)，任选地随后施用一次或多次单剂量加强。在某些实施方案中，将在第一周内施用2至4次DNA疫苗(作为初始疫苗接种)，然后进行一次或多次单剂量加强免疫，每次至少在2周后(作为加强疫苗接种)，即，在第一周进行初始疫苗接种，在第三周或更晚进行单剂量加强疫苗接种，任选地在至少2周后再进行一次(或多次)单剂量加强疫苗接种。在另一个实施方案中，将在第一周内施用2至4次DNA疫苗(作为初始疫苗接种)，然后进行一次或多次单剂量加强免疫，每次至少在4周后(作为加强疫苗接种)，即，在第一周进行初始疫苗接种，在第三五或更晚进行单剂量加强疫苗接种，任选地在至少4周后再进行一次(或多次)单剂量加强疫苗接种。

实施例

实施例1：重组质粒pVAX10.SCV-1的制备

将编码SARS-CoV-2 S蛋白(1273aa，SEQ ID NO:1)的DNA克隆到衍生自pVAX10.VR2-1(WO 2013/091898)的pVAX10骨架中。S蛋白DNA片段通过双链基因合成产生，其中寡核苷酸使用热稳定的连接酶连接在一起。将获得的连接产物通过PCR扩增。扩增后，体外合成的S蛋白DNA片段通过NheI/XhoI克隆到pVAX10骨架中(重组质粒pVAX10.VR2-1的VEGFR-2编码区替换为S蛋白编码区)。为了进行质量控制，在转化到大肠杆菌中后，对整个质粒进行测序并与相应的参考序列比对，以显示其证明无错误。得到的质粒命名为pVAX10.SCV-1(图2)。其他合适的构建体如图3所示。

实施例2：用重组质粒pVAX10.SCV-1转化减毒沙门氏菌菌株

用质粒pVAX10.SCV-1转化伤寒沙门氏菌Ty 21a。转化通过电穿孔进行。

感受态沙门氏菌细胞的制备：

将伤寒沙门氏菌Ty21a的甘油培养物接种到LB平板(不含动物成分的[ACF]大豆蛋白胨)上。将平板在37℃培养过夜。使用一个菌落进行过夜-液体-预培养。接种有一个菌落的3ml LB培养基(ACF大豆蛋白胨)在37℃和180rpm下培养过夜。为了制备感受态细胞，向2x300ml的LB培养基(ACF大豆蛋白胨)中接种3ml过夜培养物，并在37℃和180rpm下培养，直至OD₆₀₀约为0.5。然后将培养物置于冰上10分钟。随后，将细菌在3000xg、4℃下离心10分钟，并将各沉淀重新悬浮在500mL冰冷的H₂O_dest中。再次离心后，将细菌沉淀在10％冰冷的甘油中洗涤两次。将沉淀一起放入2ml的10％甘油中，最后在干冰上以50μL的等分试样冷冻。使用的甘油不含任何动物成分(Sigma Aldrich，G5150)。

感受态沙门氏菌细胞的转化：

对于每个转化反应，取50μl等分的感受态伤寒沙门氏菌Ty21a细胞在冰上解冻10分钟。加入3-5μL质粒DNA pVAX10.SCV-1后，将混合物在冰上培养5分钟。随后，将混合物转移到预冷却的比色皿(1mm厚)中。在12.5kV/cm进行电脉冲。然后立即向细胞中加入1ml LB培养基(ACF大豆蛋白胨)，将细胞移入2ml Eppendorf管中，并在37℃下振荡1小时。在台式离心机上进行短时间离心(16600rcf，20s)后，将细菌沉淀重新悬浮在200μl不含抗生素的LB(ACF大豆蛋白胨)培养基中。使用Drigalski刮刀将混合物涂抹在含有卡那霉素(浓度＝25μg/ml或50μg/ml)的LB平板(ACF大豆蛋白胨)上。将平板在37℃培养过夜。

重组沙门氏菌克隆的质粒制备：

将重组伤寒沙门氏菌Ty21a菌株的三个克隆在3ml含卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基(ACF大豆蛋白胨)中于37℃培养过夜。然后通过离心(16600rcf，30s)使细菌培养物沉淀。使用来自Macherey-Nagel的核蛋白质粒试剂盒进行质粒分离。用50μl水从硅胶柱上洗脱质粒DNA。取5μl洗出液用于琼脂糖凝胶电泳以进行对照。

为了长期储存，制备阳性克隆的1ml甘油培养物。为此，将172μl甘油(无动物成分)加入到在1ml低螺旋微管中的对数生长的3ml培养物的828μl培养基中。将样本储存在-70℃下，直至再次使用。

从沙门氏菌分离的重组质粒DNA的全序列测定：

用重组沙门氏菌(携带pVAX10.SCV-1的伤寒沙门氏菌Ty21a)的一个菌落接种3ml的液体LB-Kan培养基(ACF大豆蛋白胨)，并在37℃和180rpm下培养过夜。过夜培养物通过在台式离心机(Biofuge pico，Heraeus)上以1300rpm离心30s沉淀。使用来自Macherey-Nagel的核蛋白质粒试剂盒进行质粒分离。在碱裂解和沉淀高分子量基因组DNA和细胞组分后，将质粒DNA加载到带有二氧化硅膜的柱上。洗涤步骤后，用50μl无菌水从柱中洗脱质粒并测序。然后通过克隆特异性比对将序列与各自的参考序列进行比较，即将每个沙门氏菌克隆的质粒序列与参考序列逐一比对，以检查所有序列是否与各自的参考序列一致。将重组沙门氏菌菌株命名为VXM-SCV-1(携带质粒pVAX10.SCV-1的伤寒沙门氏菌Ty21a)。

实施例3：大规模生产VXM-SCV-1

如WO 2013/091898中所述进行细菌发酵。下游处理包括渗滤、稀释和填充。一次100L发酵产生约5升1-10x10¹⁰CFU/ml的疫苗。将疫苗进一步稀释成合适的等分试样，并在-70℃下储存。这些等分试样可在干冰上运输。在现场，将等分试样稀释到应用缓冲液中，以产生即用型疫苗(100ml饮用溶液，散装制备)。

实施例4：临床前研究设计—评估健康小鼠中由VXM-SCV-1引发的免疫应答

使用抗体ELISA法评估健康C57Bl/6、BALBc或CD1小鼠中针对SARS-CoV-2的免疫应答。将小鼠接种含质粒pVAX10.SCV-1(10⁸-10⁹CFU/剂)的鼠伤寒沙门氏菌。如上关于伤寒沙门氏菌Ty21a所述，制备含质粒pVAX10.SCV-1的鼠伤寒沙门氏菌。作为阴性对照，研究设置中包括载体对照组(10⁸-10¹⁰CFU/剂量鼠伤寒沙门氏菌，不含表达质粒)，以区分所需的免疫效应与沙门氏菌空载体引起的任何非特异性背景刺激。在一个或多个接种后时间点进行免疫监测。

1.动物饲养

接收时为6周龄的健康雌性小鼠，在开始手术前在无特定病原体(SPF)动物护理单元中观察7天。将动物饲养在温度(23±2℃)、湿度(45±10％)、光周期(12h光/12h暗)和空气交换受控条件下的房间中。动物饲养在SPF条件下。持续监控室温和湿度。空气处理系统编程设定为14次换气/小时，无再循环。新鲜的室外空气通过一系列过滤器，然后均匀地扩散到每个房间。在实验室内保持正压(20±4Pa)，以防止啮齿动物菌落内的病原体污染或传播。将动物关在聚碳酸酯笼(Techniplast，Limonest，France)中，笼中设备齐全，可提供食物和水。使用的标准面积笼为800cm²，每个笼中最多10只小鼠(来自同一组)。动物用垫料为无菌玉米芯垫料(参考：LAB COB 12，SERLAB，Cergy-Pontoise，France)，每周更换两次。动物性食品购自DIETEX(Saint-Gratien,France)。使用辐照过的RM1作为无菌对照颗粒。食物由配有橡胶塞和吸管的水瓶随意提供。水瓶采用无菌过滤灭菌，每周更换两次。在D0，使用Vivo

软件(Biosystemes，Couternon，France)根据小鼠的个体体重将小鼠分为2组。两组(随后分别分为第1至5组和第6至10组)的平均体重差异无统计学意义(方差分析)。

2.检测小鼠中的抗体应答

将BALBc和CD1小鼠分为6组，每组8只。第1-3组小鼠接受载体对照给药，第4-6组小鼠接受含质粒pVAX10.SCV-1的鼠伤寒沙门氏菌给药。将两种鼠伤寒沙门氏菌菌株解冻，并在30min内给药，使用后将工作溶液丢弃。治疗剂量为每次给药100μl中的10⁸CFU。通过容积为0.1ml的插管经口强饲(经口per os，PO)沙门氏菌菌株。无论动物组如何，每只动物在给药前都要接受给药前应用缓冲液以中和胃中的酸(100μl/只动物/次应用)。通过将2.6g碳酸氢钠、1.7g L-抗坏血酸、0.2g乳糖一水合物溶于100ml饮用水来制备该缓冲液，并在鼠伤寒沙门氏菌菌株使用前30min内使用。治疗方案如下：

第1组(n＝8)和第4组(n＝8)的小鼠每两周以10⁸CFU接受相应鼠伤寒沙门氏菌的3次PO给药(Q2WKx3)。

第2组(n＝8)和第5组(n＝8)的小鼠每两天以10⁸CFU接受相应鼠伤寒沙门氏菌的每日PO给药，连续四次(Q2Dx4)。

第3组(n＝8)和第6组(n＝8)的小鼠每两天以10⁸CFU接受相应鼠伤寒沙门氏菌的每日PO给药，连续四次(Q2Dx4)，然后每两周接受两次增强剂给药(Q2WKx2)。

每天记录动物的活力和行为，每周测量两次体重。在研究的第3、4、8、12、16、20、24和28周采集血清，并在-20℃储存，直至分析。在研究结束时对所有终止的动物进行尸检(心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏和胃肠道的肉眼检查)。

简言之，在4℃，将96孔EIA板用1微克/毫升的N或S蛋白表位或重组全N或S蛋白的碳酸钠缓冲液(pH 9.5)包被过夜。第二天，用100毫摩尔tris缓冲盐水/Tween(TBST)洗涤板，并在37℃用3％明胶封闭1小时。用TBST彻底清洗板，然后将血清添加到每个板的最上面一行，并用TBST在每个柱上制备1：1稀释液。在每个平板上，均包括一个不含血清的阴性对照柱。将平板在4℃培养过夜。为了显色，将平板用TBST洗涤，并用1：1000稀释的与碱性磷酸酶结合的蛋白G(Calbiochem，USA)在37℃培养1小时。使用ELISA平板读取器测量OD405。抗体终点滴度测定为：使OD405比阴性对照的平均值OD405高1个标准差所需的稀释度的倒数。

3.检测C57BL6或BALBc小鼠中的T细胞应答

将BALBc和C57BL6小鼠分为6组，每组12只。第1-3组小鼠接受载体对照给药，第4-6组小鼠接受含质粒pVAX10.SCV-1的鼠伤寒沙门氏菌给药。将两种鼠伤寒沙门氏菌菌株解冻，并在30min内给药，使用后将工作溶液丢弃。治疗剂量为每次给药100μl中的10⁸CFU。通过容积为0.1ml的插管经口强饲(经口per os，PO)沙门氏菌菌株。无论动物组如何，每只动物在给药前都要接受给药前应用缓冲液以中和胃中的酸(100μl/只动物/次应用)。通过将2.6g碳酸氢钠、1.7g L-抗坏血酸、0.2g乳糖一水合物溶于100ml饮用水来制备该缓冲液，并在鼠伤寒沙门氏菌菌株使用前30min内使用。治疗方案如下：

第1组(n＝12)和第4组(n＝12)的小鼠每两周以10⁸CFU接受相应鼠伤寒沙门氏菌的3次PO给药(Q2WKx3)。

第2组(n＝12)和第5组(n＝12)的小鼠每两天以10⁸CFU接受相应鼠伤寒沙门氏菌的每日PO给药，连续四次(Q2Dx4)。

第3组(n＝12)和第6组(n＝12)的小鼠每两天以10⁸CFU接受相应鼠伤寒沙门氏菌的每日PO给药，连续四次(Q2Dx4)，然后每两周接受两次增强剂给药(Q2WKx2)。

每天记录动物的活力和行为，每周测量两次体重。每组中三分之一的小鼠(n＝4)在第14天被处以安乐死，三分之一的小鼠(n＝4)在第28天被处以安乐死，其余三分之一的小鼠(n＝4)在第56天被处以安乐死。终止时，采集脾脏和血液样本。将血液加工成血清，储存在-20℃，直至分析。将脾脏加工成单细胞悬液。通过IFN-γELISPOT评估脾细胞制剂中疫苗的免疫原性。简言之，将脾细胞加载到预包被有抗IFN-γ的ELISPOT平板的孔中(0.1ml中500,000个细胞)。将N或S蛋白的肽表位以10微克/毫升的剂量一式两份加入孔中。将平板在37℃培养18小时。第二天，使用AEC试剂盒(Sigma，USA)使板显色，并使用免疫斑点板读取器(Cellular Technologies Ltd,USA)计数单个IFN-γ分泌细胞。采用ELISA法检测血清样本中的抗体。简言之，在4℃，将96孔EIA板用1微克/毫升的N或S蛋白表位或重组全N或S蛋白的碳酸钠缓冲液(pH 9.5)包被过夜。第二天，用100毫摩尔tris缓冲盐水/Tween(TBST)洗涤板，并在37℃下用3％明胶封闭1小时。用TBST彻底清洗板，然后将血清添加到每个板的最上面一行，并用TBST在每个柱上制备1：1稀释液。在每个平板上，均包括一个不含血清的阴性对照柱。将平板在4℃下培养过夜。为了显色，将平板用TBST洗涤，并用1：1000稀释的与碱性磷酸酶结合的蛋白G(Calbiochem，USA)在37℃下培养1小时。使用ELISA平板读取器测量OD405。抗体终点滴度测定为：使OD405比阴性对照的平均值OD405高1个标准差所需的稀释度的倒数。

4.抗原表达分析

通过将质粒pVAX10.SCV-1转染到鼠3T3和人293T细胞中进行抗原表达分析。在感染后24小时和48小时，收获细胞并裂解。将获得的全细胞裂解物通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析，然后在PVDF膜上进行Western blotting。RNA的表达也将通过RT/PCR进行确认。

实施例5：临床前研究-评估健康小鼠中由VXM-SCV-3引发的免疫应答

pVAX10-SCV-3质粒(插入SCV-3；SEQ ID NO:11)编码SARS-CoV-2刺突蛋白(SEQ IDNO:1)，其中去除了弗林蛋白酶结构域(氨基酸残基680-683)和SARS-CoV-2 N蛋白(SEQ IDNO:8)(登记号YP_009724397)。抗原通过2A自裂解肽序列(SEQ ID NO:7)分离，所述2A自裂解肽序列衍生自Thosea asigna病毒的衣壳蛋白前体(见图3)。

采用电穿孔法制备含pVAX10-SCV-3的鼠伤寒沙门氏菌SL7207疫苗。将感受态细菌与100-500ng质粒DNA在冰上培养，然后在GenePulsar II中以2.5千伏电压电穿孔。细菌在SOC培养基中于37摄氏度在摇板上培养1小时，然后将100uL置于含50ug/mL卡那霉素的TSB琼脂平板上，于37摄氏度过夜。将单个菌落扩增，并在-80摄氏度的25％甘油中冷冻。

从Charles River Laboratories(St Constant，PQ，Canada)购买了4-6周龄的无病原体雌性BALBc小鼠，并根据机构指南将其饲养，食物和水随意喂食。

用SL-SCV-3疫苗治疗一组10只小鼠。对于每一个治疗，通过口腔喂食用100微升剂量的给药缓冲液(310毫摩尔碳酸氢钠、100毫摩尔L-抗坏血酸、5毫摩尔乳糖一水合物)对小鼠进行预处理，然后以1.5-2×10e9 CFU/毫升的剂量接受在给药缓冲液中的100微升剂量的疫苗。在第0、2、5、7、21和35天对小鼠进行治疗。在研究前(免疫前)然后在第2、4、6和8周对小鼠放血。

通过酶联免疫吸附试验(ELISA)评估疫苗效力，ELISA是一种检测免疫动物血清中抗原特异性抗体水平的方法。简言之，在4摄氏度，将96孔EIA板用抗原SARS-CoV-2刺突蛋白(ACROBiosystems)包被过夜，在37摄氏度用2％牛血清白蛋白封闭1小时，然后在4摄氏度用血清系列稀释液培养过夜，通常从1/200的稀释液开始。然后向每个孔中加入1/5000稀释度的第二试剂(山羊抗小鼠IgG(H+L)过氧化物酶，Jackson ImmunoResearch)，并在37摄氏度培养1小时。彻底清洗板，向孔中加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺底物(Life Technologies)保持5-10分钟，加入0.16N H₂SO₄终止反应。使用微量滴定板读取器(Cytation5，Biotek)测量每孔在450纳米处的吸光度。按照Frey A.et al(Journal of Immunological Methods,1998,221:35-41)所述计算终点滴度。计算出的滴度代表最高稀释度，在该稀释度下，与来自天真、未免疫对照小鼠的血清样本相比，在来自免疫小鼠的血清样本中观察到具有统计学意义的吸光度增加。

在接种了SL-SCV-3的10只小鼠中，有2只小鼠产生的抗体应答大于检测背景值1/400。一只小鼠在第4周达到峰值抗体滴度1/800，一只小鼠在第6周达到并保持峰值抗体滴度1/3200(见图4)。这证明了靶向刺突蛋白的基于沙门氏菌的SARS-CoV2疫苗构建体能够产生针对刺突蛋白的抗原特异性免疫应答，即产生体液免疫应答。

实施例6：临床前研究-评估健康小鼠中由VXM-SCV-30引发的免疫应答

pVAX10-SCV-30质粒(插入SCV-30；SEQ ID NO:12)编码SARS-CoV-2刺突蛋白的RBD结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸319-541)，随后是鼠C3d的三个重复序列(3C3d；SEQ ID NO:17；KFLNTAKDRNRWEEPDQQLYNVEATSYA)，然后是衍生自Thosea asigna病毒的衣壳蛋白前体的2A自裂解肽序列(SEQ ID NO:7)，随后是泛素(SEQ ID NO:9)，其与SARS-CoV-2 N蛋白(SEQ ID NO:8)融合(登记号YP_009724397)(见图3)。

如实施例5所述，用pVAX10-SCV-30制备鼠伤寒沙门氏菌SL7207疫苗。

用SL-SCV-30疫苗治疗一组10只小鼠。对于每一个治疗，通过口腔喂食用100微升剂量的给药缓冲液(310毫摩尔碳酸氢钠、100毫摩尔L-抗坏血酸、5毫摩尔乳糖一水合物)对小鼠进行预处理，然后以1.5-2×10e9 CFU/毫升的剂量接受在给药缓冲液中的100微升剂量的疫苗。在第0、2、5、7、21和35天对小鼠进行治疗。在研究前(免疫前)然后在第3、4、6和12周对小鼠放血。

如实施例5所述，分析血清中针对SARS-CoV-2刺突蛋白的抗体。

在接种了SL-SCV-30的10只小鼠中，一只小鼠产生的抗体应答大于检测背景1/400，并在第3周达到1/3200(见图5)。这证明了靶向刺突蛋白的RBD结构域的基于沙门氏菌的SARS-CoV2疫苗构建体能够产生针对刺突蛋白的抗原特异性免疫应答。

实施例7：临床前研究-评估健康小鼠中由VXM-SCV-42引发的免疫应答

pVAX10-SCV-42质粒(插入SCV-42；SEQ ID NO:13)编码SARS-CoV-2刺突蛋白的S1结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸1-681)，随后是鼠C3d(SEQ ID NO:17)的三个重复序列(3C3d，SEQ ID NO:18)，然后是衍生自Thosea asigna病毒的衣壳蛋白前体的2A自裂解肽序列(SEQ ID NO:7)，随后是泛素(SEQ ID NO:9)，其与SARS-CoV-2 N蛋白(SEQ ID NO:8)、另一个2A自裂解肽序列和SARS-CoV-2刺突蛋白的S2结构域(SEQ ID NO:1的Ser686-Thr1273)融合(见图3)。

如实施例5所述，用pVAX10-SCV-42制备鼠伤寒沙门氏菌SL7207疫苗。

用SL-SCV-42疫苗治疗一组10只小鼠。对于每一个治疗，通过口腔喂食用100微升剂量的给药缓冲液(310毫摩尔碳酸氢钠、100毫摩尔L-抗坏血酸、5毫摩尔乳糖一水合物)对小鼠进行预处理，然后以1.5-2×10e9 CFU/毫升的剂量接受在给药缓冲液中的100微升剂量的疫苗。在第0、2、5、7、21和35天对小鼠进行治疗。在研究前(免疫前)然后在第2、4、6和8周对小鼠放血。

如实施例5所述，分析血清中针对SARS-CoV-2刺突蛋白的抗体。

在接种了SL-SCV-42的10只小鼠中，2只小鼠产生的抗体应答大于检测背景1/400，并达到1/1600(见图6)。这证明了靶向刺突蛋白的S1和/或S2亚基的基于沙门氏菌的SARS-CoV2疫苗构建体能够产生针对刺突蛋白的抗原特异性免疫应答。

实施例8：临床前研究-评估健康小鼠中由VXM-SCV-53引发的免疫应答

pVAX10-SCV-53质粒(插入SCV-53；SEQ ID NO:14；完整的质粒序列SEQ ID NO:19)编码SARS-CoV-2刺突蛋白(SEQ ID NO:1)，其中去除了弗林蛋白酶结构域(删除了氨基酸残基680-683)，并且其中信号结构域(SEQ ID NO:1的Met1-Ser12)被恒定链的信号结构域(SEQ ID NO:15的Met1-Arg29)替换，然后是衍生自Thosea asigna病毒的衣壳蛋白前体的2A自裂解肽序列(SEQ ID NO:7)，随后是泛素(SEQ ID NO:9)，其与SARS-CoV-2 N蛋白(SEQID NO:8)融合。该质粒还在卡那霉素抗性基因上游的较大SV40 ori增强子序列(SEQ IDNO:20)内包含72个核苷酸的SV40 DNA核靶向序列(DTS)(SEQ ID NO:16)(见图3)。

如实施例5所述，用pVAX10-SCV-53制备鼠伤寒沙门氏菌SL7207疫苗。

用SL-SCV-53疫苗治疗一组10只小鼠。对于每一个治疗，通过口腔喂食用100微升剂量的给药缓冲液(310毫摩尔碳酸氢钠、100毫摩尔L-抗坏血酸、5毫摩尔乳糖一水合物)对小鼠进行预处理，然后以1.5-2×10e9 CFU/毫升的剂量接受在给药缓冲液中的100微升剂量的疫苗。在第0、2、5、7、21和35天对小鼠进行治疗。在研究前(免疫前)然后在第2、4、6和8周对小鼠放血。

如实施例5所述，分析血清中针对SARS-CoV-2刺突蛋白的抗体。

在接种了SL-SCV-53的10只小鼠中，3只小鼠产生的抗体应答大于检测背景1/400，并达到1/800(见图7)。这证明了靶向信号结构域修饰的刺突蛋白的基于沙门氏菌的SARS-CoV2疫苗构建体能够产生针对刺突蛋白的抗原特异性免疫应答。

实施例9:VXM-SCV-XI期临床试验；研究设计

本I期试验的目的是检查对VXM-SCV-X的安全性、耐受性和免疫应答。该随机、安慰剂对照、双盲剂量递增研究包括45名受试者。受试者在第1、3、5和7天接受四剂VXM-SCV-X或安慰剂。研究中评估了从10⁶CFU到10⁹CFU的VXM-SCV-X剂量。一个独立的数据安全监测委员会(DSMB)参与了剂量增加决策。除了以安全性作为主要终点外，还评估了VXM-SCV-1特异性免疫反应。

目的是检查研究性抗SARS-CoV-2病毒疫苗VXM-SCV-X的安全性、耐受性和免疫应答，并确定VXM-SCV-1的最大耐受剂量(MTD)。MTD定义为：接受VXM-SCV-X治疗的最多6名患者中不到2名患者发生剂量限制性毒性的最高剂量水平(DLT)。

安全性和耐受性的主要终点是根据CTCAE标准的不良事件和严重不良事件。

次要终点包括免疫阳性患者的人数，该次要终点评估测试疫苗引发针对SARS-CoV-2 S蛋白的特异性免疫应答的效力。

VXM-SCV-X是根据良好生产规范(GMP)生产的，并以缓冲溶液形式提供。安慰剂对照组由等渗氯化钠溶液组成。

起始剂量由含有10⁶个菌落形成单位(CFU)的VXM-SCV-X溶液组成。选择此VXM-SCV-X剂量是出于安全原因。为便于比较，一剂

(经许可的伤寒疫苗)含有2×10⁹至6×10⁹CFU的伤寒沙门氏菌Ty21a，相当于大约VXM-SCV-1起始剂量的1000倍。剂量以对数步长递增，这对于活细菌疫苗看起来是合理的。

根据人类首次试验指南，一个剂量组的患者按队列接受治疗。对一名患者进行任意剂量组的第一次VXM-SCV-X给药。每个剂量组的第二个队列由两名接受VXM-SCV-X治疗的患者组成。这种由一名领先者(即，只有一名患者首先接受VXM-SCV-X)交错给药的方式有助于降低风险。

第三组患者(三人接受VXM-SCV-X治疗)包括在所有剂量组中。

口服疫苗固有的环境风险是排泄到环境中以及随后对目标人群以外的人进行疫苗接种的可能性。在接种疫苗期间加上另外三天，所有研究患者均被限制在研究地点。收集并焚烧研究患者的所有粪便。对体液和粪便样本进行了VXM-SCV-X脱落检查。

应用了卫生预防措施，以保护研究人员避免意外摄入。针对研究的这一方面对研究人员进行了专门培训。

此外，在此患者设置中测量特异性T细胞活化和抗体形成。纳入了安慰剂对照，以进一步了解与活性疫苗和背景治疗相关的具体安全性问题。此外，混合安慰剂患者可作为评估特异性免疫活化的可靠对照。

实施例10：VXM-SCV-1特异性T细胞和B细胞应答

通过监测在接种疫苗前、接种中和接种后不同时间点由IFNγELISpot检测的VXM-SCV-X和安慰剂治疗患者外周血中SARS-CoV-2病毒S蛋白特异性T细胞的频率，评估对VXM19的应答。

首先，将T细胞和肽脉冲DC加入到用抗INFγ抗体包被的孔中。培养一段时间后，去除细胞，分泌的INFγ与包被抗体保持结合。然后加入检测抗体以检测结合的INFγ，信号扩增后，最终产量可视为代表单个活化特异性T细胞的“色斑”。

采用ELISA法测定B应答。简言之，在4℃，将96孔EIA板用1微克/毫升的N或S蛋白表位或重组全N或S蛋白的碳酸钠缓冲液(pH 9.5)包被过夜。第二天，用100毫摩尔tris缓冲盐水/Tween(TBST)洗涤板，并在37℃下用3％明胶封闭1小时。用TBST彻底清洗板，然后将血清添加到每个板的最上面一行，并用TBST在每个柱上制备1：1稀释液。在每个平板上，均包括一个不含血清的阴性对照柱。将平板在4℃下培养过夜。为了显色，将平板用TBST洗涤，并用1：1000稀释的与碱性磷酸酶结合的蛋白G(Calbiochem，USA)在37℃下培养1小时。使用ELISA平板读取器测量OD405。抗体终点滴度测定为：使OD405比阴性对照的平均值OD405高1个标准差所需的稀释度的倒数。

实施例11：抗载体免疫性

为了评估对细菌载体的免疫应答，使用两种商业分析试剂盒(伤寒沙门氏菌IgGELISA,Cat.No.ST0936G和伤寒沙门氏菌IgM ELISA,Cat.No.ST084M；Calbiotech.Inc.,10461Austin Dr,Spring Valley,CA 91978,USA)通过ELISA检测抗伤寒沙门氏菌IgG和IgM免疫球蛋白。这些分析属于定性分析。根据前述验证研究580.132.2785，分别按照包装说明书中的描述使用分析，并作为研究计划的一部分进行修改。

两种分析均采用酶联免疫吸附试验技术。校准品、阴性对照、阳性对照和样本均一式两份进行分析。将稀释的患者血清(稀释1:101)加入到包被有纯化抗原的孔中。IgG或IgM特异性抗体(如果存在)与抗原结合。洗去所有未结合的物质，加入酶偶联物以结合抗体-抗原复合物(如果存在)。洗去多余的酶偶联物，加入底物。培养平板以允许酶水解底物。产生的颜色强度与样本中IgG或IgM特异性抗体的量成比例。使用分光光度微量滴定板读取器在450nm处测量颜色强度。临界值计算如下：

校准品OD x校准品因子(CF)。

每次测定的抗体指数是用每份样本的OD值除以临界值确定的。

抗体指数解释：

<0.9 ELISA法未检出伤寒沙门氏菌IgG或IgM抗体

0.9-1.1临界阳性

>1.1 ELISA法检测出伤寒沙门氏菌IgG或IgM抗体

实施例12：疫苗接种时间表

单剂量的VXM19(即10⁶至10⁸CFU)以100ml饮用溶液的形式口服给药。在第1、3、5天和可选的第7天分别接种单剂量疫苗。预计在最后一次疫苗接种后10天左右会出现免疫反应峰值。2至4周后，甚至3至6个月后，可考虑加强治疗。时间表推荐来自于疫苗株Ty21a。

序列表

<110> 万科斯蒙股份有限公司

<120> 新型的基于沙门氏菌的冠状病毒疫苗

<130> 116631P855PC

<150> EP20167405.8

<151> 2020-03-31

<160> 20

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 1273

<212> PRT

<213> 冠状病毒科

<220>

<223> SARS-CoV-2 S 蛋白

<400> 1

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala

675 680 685

Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser

690 695 700

Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile

705 710 715 720

Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val

725 730 735

Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu

740 745 750

Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr

755 760 765

Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln

770 775 780

Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe

785 790 795 800

Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser

805 810 815

Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

820 825 830

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

835 840 845

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

850 855 860

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

865 870 875 880

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

885 890 895

Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr

900 905 910

Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn

915 920 925

Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala

930 935 940

Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn

945 950 955 960

Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

965 970 975

Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln

980 985 990

Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val

995 1000 1005

Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu

1010 1015 1020

Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val

1025 1030 1035 1040

Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala

1045 1050 1055

Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu

1060 1065 1070

Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His

1075 1080 1085

Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val

1090 1095 1100

Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr

1105 1110 1115 1120

Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr

1125 1130 1135

Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu

1140 1145 1150

Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp

1155 1160 1165

Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp

1170 1175 1180

Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu

1185 1190 1195 1200

Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile

1205 1210 1215

Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile

1220 1225 1230

Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys

1235 1240 1245

Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val

1250 1255 1260

Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr

1265 1270

<210> 2

<211> 3500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pVAX10

<400> 2

tgggcttttg ctggcctttt gctcacatgt tcttgactct tcgcgatgta cgggccagat 60

atacgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 120

ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 180

gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 240

caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggactattt acggtaaact gcccacttgg 300

cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 360

ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 420

tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 480

gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 540

gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 600

tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctctctggc 660

taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa tacgactcac tatagggaga 720

cccaagctgg ctagcctcga gtctagaggg cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact 780

gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg 840

gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg 900

agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg 960

gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctac tgggcggttt 1020

tatggacagc aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag gttgggaagc 1080

cctgcaaagt aaactggatg gctttctcgc cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa 1140

gctctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg 1200

caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa 1260

tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg 1320

tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt 1380

ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa 1440

gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc 1500

ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg 1560

ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg 1620

aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg 1680

aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg 1740

gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact 1800

gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg 1860

ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc 1920

ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga attattaacg 1980

cttacaattt cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 2040

tacaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 2100

acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatagca 2160

cgtgctaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct 2220

catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc cccatcagtg 2280

accaaacagg aaaaaaccgc ccttaacatg gcccgcttta tcagaagcca gacattaacg 2340

cttctggaga aactcaacga gctggacgcg gatgaacagg cagacatctg tgaatcgctt 2400

cacgaccacg ctgatgagct ttaccgcagc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 2460

aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 2520

agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg 2580

acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga 2640

ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat 2700

accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 2760

tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 2820

ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 2880

ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 2940

gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 3000

gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 3060

ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 3120

tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 3180

gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 3240

tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 3300

tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 3360

tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 3420

ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 3480

ctcaagaaga tcctttgatc 3500

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 冠状病毒科

<220>

<223> 信号肽 S 蛋白

<400> 3

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys

1 5 10 15

<210> 4

<211> 28

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> C3d的28个氨基酸

<400> 4

Lys Phe Leu Thr Thr Ala Lys Asp Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly

1 5 10 15

Lys Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala

20 25

<210> 5

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3C3d

<400> 5

Lys Phe Leu Thr Thr Ala Lys Asp Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly

1 5 10 15

Lys Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys Phe Leu Thr Thr Ala

35 40 45

Lys Asp Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly Lys Gln Leu Tyr Asn Val

50 55 60

Glu Ala Thr Ser Tyr Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

65 70 75 80

Gly Ser Gly Ser Lys Phe Leu Thr Thr Ala Lys Asp Lys Asn Arg Trp

85 90 95

Glu Asp Pro Gly Lys Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala

100 105 110

<210> 6

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A 肽 P2a

<400> 6

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 7

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A 肽 T2a

<400> 7

Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

1 5 10 15

Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 8

<211> 419

<212> PRT

<213> 冠状病毒科

<220>

<223> N 蛋白 YP_009724397.2

<400> 8

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln

145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala

195 200 205

Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln

225 230 235 240

Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

245 250 255

Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln

260 265 270

Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp

275 280 285

Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile

290 295 300

Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile

305 310 315 320

Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu

340 345 350

Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro

355 360 365

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu

385 390 395 400

Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser

405 410 415

Thr Gln Ala

<210> 9

<211> 75

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<223> 泛素

<400> 9

Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu

1 5 10 15

Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp

20 25 30

Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys

35 40 45

Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu

50 55 60

Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly

65 70 75

<210> 10

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T4 Fibritin foldon三聚化结构域

<400> 10

Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys

1 5 10 15

Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu

20 25

<210> 11

<211> 5154

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SCV-3

<400> 11

gctagcgccg ccaccatgtt cgtcttctta gtgcttctgc cccttgtttc atctcagtgc 60

gtaaatctca ccaccagaac ccagctgcct cccgcctaca cgaactcctt tactaggggg 120

gtatattacc ctgacaaggt attcagatcc tcagtactgc attccacaca ggacctcttc 180

ctccctttct tcagcaatgt aacctggttt cacgccattc atgtctccgg gaccaacggc 240

acgaagaggt ttgacaaccc cgtcctaccc tttaatgacg gtgtgtactt tgcgtcgaca 300

gaaaagagta atatcattcg cggctggatt tttggtacaa ccttagattc taagacgcag 360

tcactcctta tagtgaacaa tgccacaaat gttgttatca aggtgtgtga atttcaattc 420

tgcaatgatc ctttcctggg tgtgtactac cataagaata acaaaagttg gatggaatca 480

gaatttagag tttactcttc agctaacaat tgcactttcg agtatgtttc ccagcctttc 540

ctcatggatc tggaggggaa acaagggaat ttcaaaaatc tgcgcgaatt cgtgttcaaa 600

aatatagatg gatatttcaa gatctacagc aaacacacac ctatcaacct tgttcgagat 660

ctgccccagg gattttctgc cctggaacca ctcgtggacc tgcccatcgg tattaacatc 720

actcgattcc agacactact ggccctccac cggagctacc tgacccctgg ggattcttct 780

agtgggtgga cagcaggcgc agctgcttac tacgtgggct atttgcagcc tcggaccttc 840

ttactgaaat acaatgaaaa tggcaccatc acagatgctg tggactgtgc cttagaccct 900

ctctccgaaa ccaaatgtac ccttaagagc ttcacagtcg aaaaagggat ttaccaaacg 960

tcgaacttca gggtgcagcc cactgagagc atcgtcagat ttcccaatat tacgaacctg 1020

tgtcccttcg gagaagtgtt caacgctact cgatttgcct ctgtgtacgc atggaatcgc 1080

aaaaggatct cgaattgcgt agccgactac tccgttctgt ataattccgc atcctttagc 1140

acttttaaat gctacggggt cagccctact aaactgaacg acctctgctt caccaacgtc 1200

tacgctgatt cttttgtcat ccgtggggat gaagtgaggc agatagcccc aggtcagact 1260

ggaaagatcg cggattataa ttacaaactg ccagacgact tcactggctg cgtgatcgcc 1320

tggaacagta acaacctcga cagcaaagtg ggcggaaact acaactattt atatcgcttg 1380

tttagaaagt ccaacttgaa gccttttgaa agagacattt ctactgagat ttaccaggct 1440

gggtcaacac cctgtaacgg cgtggaaggc tttaactgtt acttcccctt acaaagctat 1500

ggcttccagc caaccaacgg agttgggtat cagccctaca gggtcgtcgt gttgagtttc 1560

gagctcttac atgcacctgc caccgtctgc ggccccaaga agtctacgaa cctggtgaag 1620

aacaagtgtg tcaatttcaa ctttaatgga ctaactggga caggcgtgct gacggagtca 1680

aacaagaaat tcctgccatt tcagcagttt ggtcgggaca ttgcagacac aactgacgcg 1740

gtgcgggacc ctcagacgct tgaaatatta gacataacac cttgtagctt tggcggagtg 1800

tctgtcatca ccccgggaac taacaccagc aaccaggtgg cagtcctata tcaggacgtc 1860

aattgcacgg aggttcccgt ggcaatacac gcggaccaac tcacaccgac ttggagagtg 1920

tattccacag gtagcaacgt ctttcaaact cgggctggtt gcctgattgg cgcagagcac 1980

gtgaacaaca gctatgagtg tgacattccc ataggcgcag ggatttgtgc ttcataccag 2040

actcagacta acgcccgtag tgtagccagc cagtccatca ttgcatacac tatgtcactg 2100

ggagcagaga actctgttgc ctacagtaac aatagtattg ctattccgac gaactttacc 2160

atcagtgtga ctaccgagat cctgccagtc tcgatgacca agacctccgt agattgtacc 2220

atgtatatct gcggggacag caccgagtgc tctaatttgt tgctgcagta tgggtccttc 2280

tgtacgcagt tgaatcgggc cttgacaggc atcgctgtcg agcaggataa aaacactcaa 2340

gaggtctttg cacaggttaa gcagatttat aagacacctc ccataaaaga cttcggtggc 2400

tttaacttct cacaaatctt accagaccca agtaagccaa gtaaacgttc tttcatcgag 2460

gacctcctct ttaataaggt gacccttgct gatgcaggtt tcatcaagca gtacggtgac 2520

tgcctgggag acatagcagc ccgggatttg atctgcgcac agaagttcaa cggactaaca 2580

gtgctcccac ctttgctgac ggatgagatg attgcccagt acacatcagc tctcctggcg 2640

ggcaccatta cctcaggatg gacctttgga gcaggagctg cgctccagat cccgtttgcc 2700

atgcagatgg cctataggtt caacggcata ggcgttacac agaacgtgct gtatgagaat 2760

cagaagctca tcgccaacca gttcaattct gccataggaa aaatccagga ttccctttct 2820

tcaactgcct cagccctcgg gaagctacaa gatgtggtca atcagaacgc tcaggcccta 2880

aatactcttg tgaagcagct gtcgtcaaac tttggggcca tcagcagtgt tctgaacgat 2940

atcctgtcac ggctggatcc accagaggcc gaggtccaga ttgaccgact aattaccggc 3000

aggctgcaat ctcttcagac ttacgtcaca cagcagctga tccgagctgc agaaatcaga 3060

gccagtgcaa acctggctgc aacgaaaatg tcagagtgtg tgcttggaca gtcaaaaaga 3120

gtagactttt gtggcaaggg ataccatttg atgtcctttc cacaatccgc tccgcatgga 3180

gttgtgtttt tgcatgttac ctatgtccct gcccaggaaa agaactttac cacagctccc 3240

gccatatgcc acgatgggaa ggcccacttt ccacgcgagg gagtcttcgt gtctaatggt 3300

actcactggt ttgtgaccca acgcaatttt tacgaacctc aaatcattac cacagacaat 3360

acattcgtat caggtaactg cgatgtcgtg attggaatcg tgaataatac cgtttatgac 3420

ccccttcaac cagaactgga ctcatttaag gaagagctcg acaaatattt caaaaaccac 3480

actagcccgg atgtggattt gggcgatata agcggcatca atgctagtgt ggtgaacatc 3540

cagaaggaga ttgaccggct aaatgaagtg gccaagaacc tgaatgagag cttgattgac 3600

ctccaggagc ttggtaaata cgaacaatat atcaagtggc catggtatat ctggctggga 3660

ttcattgccg gcctgatcgc catcgtgatg gtaacaatca tgctgtgctg catgactagc 3720

tgctgctcct gtctgaaggg ctgttgctct tgtggtagtt gttgtaagtt tgatgaagac 3780

gatagcgagc cagttctcaa aggagtgaag ttgcactaca caggatccgg tgaaggccgt 3840

gggtcccttt taacgtgtgg tgacgtagaa gaaaacccag gcccgctcat gagcgacaat 3900

ggaccacaga atcagcgaaa cgcccccagg attacatttg gcggtcccag tgactcgacc 3960

ggcagtaacc agaatgggga gaggtctggg gcgaggtcta agcagaggag gccacaaggc 4020

ctgccaaata atactgcgag ctggttcaca gcactgacac agcatggcaa agaggatctc 4080

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acaaaggcat acaatgtcac acaagccttc ggtcgcaggg ggccagaaca aacccagggg 4740

aatttcggtg atcaggagct gatacggcag ggaacagact ataagcactg gccgcagatc 4800

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<210> 12

<211> 2619

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SCV-30

<400> 12

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<210> 13

<211> 5787

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SCV-42

<400> 13

gctagcgccg ccaccatgtt cgtgttcttg gtgctcttac cactggtctc ctcacagtgc 60

gtgaacctga caacacgaac ccaactgcca ccagcataca cgaattcttt tacccgaggt 120

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ctcatggacc tggagggcaa acaggggaac ttcaaaaatc ttagagaatt cgtcttcaaa 600

aacatcgatg ggtattttaa gatctacagc aaacataccc ccatcaatct cgtgcgggac 660

cttcctcagg gcttttccgc acttgaacct ctcgtcgacc ttcccatcgg aatcaatatt 720

acaaggttcc agacactact cgcccttcac agatcctacc tgacgccagg cgattcctcc 780

tctggctgga cagcgggagc cgctgcctat tatgtgggct atttgcagcc tcgcacattc 840

ctcttgaaat acaacgagaa tgggaccatt acagatgcag tggactgtgc acttgaccct 900

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tgcccatttg gggaggtttt caatgctacc cgcttcgcct cagtttatgc ttggaacagg 1080

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gaggaaccag atcaacaatt gtataacgtt gaggccacgt cttacgccgg tagtggcggg 2160

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ggtggcggag gctcaggagg agggggatcg gggtctaagt ttctgaacac tgcaaaggac 2340

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cttgacagat taaaccagct ggaaagcaaa atgagtggaa agggccagca gcaacagggc 3420

cagacagtga caaagaagtc agctgcggag gcctccaaga agcccaggca gaaacgcact 3480

gctactaaag cttataatgt cacccaagct ttcgggcgca ggggccccga acaaacacag 3540

ggtaattttg gagatcagga actcattcgt cagggcacgg attataaaca ctggccccag 3600

attgcccagt ttgcaccatc tgccagcgcc ttttttggga tgagtcgcat tggaatggaa 3660

gttactcctt ctggcacctg gctgacatat actggagcca ttaagctgga cgacaaggat 3720

cccaatttca aggaccaagt aatactgctc aataagcaca ttgatgccta caaaaccttt 3780

ccgcccactg agcccaagaa agataagaag aagaaagcag atgagaccca ggctctcccc 3840

cagagacaga agaaacagca gacggttacc ctgctgcctg ccgcggacct ggatgacttt 3900

agcaagcaac ttcagcagtc catgtcgtcc gctgatagta ctcaggccgg gtctggggag 3960

gggcggggca gcctgcttac ttgtggtgat gttgaagaga accctggacc ccttagtgtg 4020

gcatcacaat ctattattgc atataccatg tccctcggcg cggagaacag cgtggcctac 4080

agtaacaact ccatagccat tcctaccaac tttaccatct ctgtcaccac agaaattctc 4140

cccgtgtcca tgaccaagac ctcagtggac tgcactatgt acatttgcgg cgattccacc 4200

gagtgctcca acttgcttct gcagtacgga tcgttctgta cacaattgaa tagagcccta 4260

accggcatcg ctgtcgaaca ggataagaac acccaagaag ttttcgccca ggtgaagcag 4320

atttataaga caccccctat taaggacttc ggaggtttca acttcagcca gatcctgcct 4380

gatccatcca agccttccaa gcggtccttc atcgaggacc ttcttttcaa caaggtcacc 4440

ttagcggacg cagggtttat aaagcaatat ggagattgcc ttggtgatat cgctgcccga 4500

gacctgatct gcgctcagaa atttaatggt ttaacggtgt tgccaccatt attgacagac 4560

gagatgatcg cacagtacac tagtgcgctg ctggctggga caatcacatc tggatggacg 4620

tttggggctg gtgcagccct ccagatccct tttgccatgc aaatggcgta ccgtttcaac 4680

ggcatcggcg tgactcagaa cgtcctatat gagaatcaga agcttattgc taaccagttc 4740

aactccgcta ttggtaagat tcaggacagc ctcagcagca ctgcgtctgc gctgggcaag 4800

ttgcaagacg tggtgaatca gaatgcacag gccttaaaca cactggttaa acaactgtcc 4860

tcgaacttcg gggctatcag ctctgtcctc aatgacatcc tttccagact cgacccaccc 4920

gaggcagaag tccagatcga tcgactgatc acaggcagac tgcagagcct gcagacctat 4980

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aagatgtctg aatgtgtcct gggtcagagc aagcgggtgg atttttgtgg gaaaggctac 5100

cacctaatgt catttccaca gtctgcccct cacggcgtgg tatttttgca cgtaacctac 5160

gtgccagcgc aagagaagaa ctttaccacc gccccagcaa tctgccatga tggaaaggcc 5220

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gtggtaattg ggattgtaaa taacactgtg tatgatcctt tacaaccaga actggattca 5400

tttaaagaag aattggacaa gtactttaag aaccacacta gccccgatgt tgatttagga 5460

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gaagtcgcta aaaatctcaa tgagagtctg attgacttgc aggagctggg caaatacgag 5580

cagtatatca agtggccatg gtacatctgg ttggggttta tagctggtct gatcgctatc 5640

gtgatggtga ctataatgct gtgctgcatg accagctgtt gcagttgcct aaagggatgc 5700

tgttcctgtg gcagctgttg caagtttgat gaagatgatt cagaacccgt ccttaagggg 5760

gttaaattgc actacaccta actcgag 5787

<210> 14

<211> 5427

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SCV-53

<400> 14

gctagcgccg ccaccatgga tgatcagcgc gatctaattt ctaaccatga acaattgccc 60

attttaggca acagacctag agagccagag cgttgctctc gatcgcagtg tgtcaacctg 120

actacccgca cccaactccc accagcttac acaaatagct ttaccagggg tgtctattac 180

cctgataaag tgtttcgtag ctccgtcctc catagcacac aagatttgtt cctgcccttc 240

ttctcgaatg tgacttggtt ccacgccatc catgtgtcag gaacaaacgg aacgaaaagg 300

tttgacaacc cagtgttgcc cttcaatgac ggcgtttact ttgcgagtac cgagaagagc 360

aacattatcc gaggctggat cttcgggaca actctcgaca gcaagactca gtcgttgctc 420

attgttaaca atgcaaccaa cgtggtcatc aaggtgtgtg agttccagtt ctgtaatgat 480

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gtgtattctt ctgcaaataa ctgcacattt gaatatgtta gtcagccttt cctcatggac 600

ttggaaggca agcaggggaa cttcaaaaat ctcagagagt ttgtgtttaa gaatattgat 660

ggttacttca agatctactc caaacacact cctataaacc ttgtgcggga tctacctcaa 720

ggcttctcag cactggagcc tttagttgac ctccccattg gcattaacat tactaggttt 780

caaacacttc tggccctaca ccggagctac cttacccctg gtgattcctc aagtggatgg 840

acagctgggg cagcagctta ctatgtggga tacctgcagc caagaacttt cttgttgaag 900

tacaatgaga acggaaccat cacggatgcc gtggattgtg cattggatcc cttgagtgaa 960

accaaatgta cactcaagtc tttcacagtt gaaaaaggaa tataccaaac ctccaacttc 1020

cgagtgcagc caacagaatc cattgttcgg ttccccaata tcacgaatct ctgcccattt 1080

ggggaggttt ttaatgccac aaggtttgcc tccgtgtatg cctggaacag gaagaggatc 1140

tctaattgtg tagctgacta ctcagtccta tacaactcgg cctctttttc cacttttaag 1200

tgctacggcg ttagtcctac caaacttaac gacctgtgtt ttaccaatgt ttacgcagac 1260

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agcaatctca agccctttga gagggatata agcactgaga tctaccaggc cggtagcact 1500

ccctgcaacg gcgtggaagg attcaactgc tattttcctt tgcaatccta tggttttcag 1560

ccgactaatg gagtgggcta ccaaccctat agggtggttg tcttatcgtt tgagctccta 1620

catgctccag ccacagtgtg cgggccaaag aagtccacca accttgtgaa gaacaaatgc 1680

gtgaacttca acttcaacgg gctcactgga actggggtgc tgacagagtc caacaaaaag 1740

tttctaccct tccaacaatt cggcagggac attgccgata caactgacgc agttcgcgac 1800

cctcagacac ttgagatctt agatataacg ccctgctcct ttggaggcgt ctccgttatt 1860

acccctggca ccaacacaag taaccaggtg gcggtgctct accaggatgt gaactgtaca 1920

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ggatccaatg tcttccagac aagagcagga tgcttgatag gcgccgagca cgtcaacaac 2040

agttatgagt gtgatatccc catcggagct ggcatctgcg catcatatca gacccagacg 2100

aatgcccgtt ctgtagccag ccagtctatc attgcctata ccatgtcact gggagcagaa 2160

aactctgtgg catacagtaa caacagcata gccattccta ccaactttac aatcagtgtc 2220

accaccgaaa tcctgccggt gtccatgact aagaccagcg tggactgtac tatgtacatt 2280

tgcggcgact ctactgagtg ctcaaatctg ctgctacagt atggctcatt ttgcacgcag 2340

ctaaaccggg ccttaactgg cattgctgtg gagcaggaca agaatactca agaggtgttc 2400

gcccaagtta agcagatcta caaaacaccc cccatcaaag actttggtgg ctttaacttc 2460

tctcaaatac ttcccgatcc tagcaagccg tctaagaggt ctttcatcga agatcttttg 2520

tttaacaaag tcaccctggc agatgccggt tttattaagc agtatgggga ctgcctggga 2580

gacatagctg cgagagacct gatctgtgct cagaagttca atggcctgac tgtactccct 2640

ccattgctaa ccgatgagat gatagcacag tacacttctg ccctgctggc tggcacaatc 2700

acctcaggct ggaccttcgg agccggtgcc gccttgcaga tcccattcgc aatgcagatg 2760

gcttaccgat ttaatgggat cggagttacc cagaacgtcc tgtatgagaa ccaaaaattg 2820

attgctaatc agttcaacag cgccatcggc aagatccagg atagcttgtc aagtacagcc 2880

tccgctctgg gaaagctgca ggacgtcgtg aatcagaatg ctcaggcact taacacactc 2940

gtgaaacagc tcagttctaa tttcggagct atttccagtg tccttaatga catcctgtca 3000

cgcctggatc cccctgaagc tgaagtgcag atcgaccgat taattaccgg gcgtctgcag 3060

tctcttcaga cttatgtcac tcagcaatta atcagggcgg ccgaaattcg ggcatccgcc 3120

aacttagcgg ccacaaagat gtcagaatgt gtactgggcc aaagtaaaag agtagatttt 3180

tgtggaaaag gatatcatct gatgtctttc cctcagagcg cccctcatgg ggtcgtattc 3240

ttacacgtga cctatgtccc agcccaggag aagaacttca cgacagctcc cgcgatctgt 3300

catgacggga aagcgcattt ccctcgggag ggagtatttg tttcaaacgg aactcactgg 3360

tttgtcacac agaggaactt ttatgaacct cagataatta caacggataa cacctttgtc 3420

tccggaaatt gtgacgtagt gataggtatt gtaaataata cagtctatga cccattacag 3480

cctgagctcg acagtttcaa agaagaactg gacaaatact tcaagaacca caccagtcca 3540

gatgtggatc tgggagacat ctccggcatc aatgcttctg tggtgaacat ccagaaggaa 3600

attgaccgct tgaatgaagt cgccaaaaac ctgaacgaaa gcttaattga tctgcaggaa 3660

ctggggaaat atgagcagta tataaagtgg ccctggtaca tctggctggg attcattgct 3720

ggtctgatcg cgattgtgat ggtgacgatc atgctgtgtt gcatgacatc ctgttgttct 3780

tgtctgaaag gctgctgctc ctgtggtagc tgctgcaaat ttgatgaaga cgatagcgag 3840

ccggtcctga agggtgttaa gctgcattat actgggagcg gagagggtag ggggtcgttg 3900

ctgacctgcg gagatgttga ggagaatcca ggccccatgc agatctttgt gaaaaccctg 3960

accggtaaga ccatcactct ggaggtggag ccctcggaca ccattgaaaa tgtaaaggcc 4020

aagattcagg acaaggaggg cattccacct gaccagcagc gacttatttt tgcagggaag 4080

cagctggagg atgggcgcac tctgtcggat tataacatac aaaaggagag tacactccac 4140

ctggtgctcc ggctgcgagc catgagcgac aatggacccc aaaaccagag aaacgcaccc 4200

cggatcacat tcggagggcc gtcagattca accggctcca atcaaaacgg agagcggtcc 4260

ggcgcgagaa gcaagcaaag aaggccccag ggtctgccaa acaacactgc atcctggttc 4320

accgcactta ctcagcacgg caaagaagac cttaagttcc ctaggggcca gggggtacct 4380

atcaacacaa actctagccc cgacgaccag ataggctatt atcgccgcgc cactcggcgg 4440

attagaggag gtgatgggaa aatgaaggac ctgtcgccaa gatggtattt ctactacctc 4500

ggaacagggc cagaggcagg cctcccctac ggggccaata aggatggaat tatatgggtg 4560

gctacagagg gtgctctcaa tactcccaaa gaccacatag ggactcggaa tcccgccaac 4620

aatgcagcca tcgtcctgca actacctcaa gggactaccc tgccaaaagg cttctatgct 4680

gagggcagcc gaggaggctc tcaagccagt tcccgttcaa gcagccgcag cagaaattca 4740

agcagaaatt ctacaccggg ttcttcacgt ggtaccagcc cggctaggat ggcgggcaac 4800

ggtggggacg ctgcattggc tcttttactt ttggacagat tgaaccagct ggaatccaaa 4860

atgtctggaa aagggcagca acagcaggga cagactgtga ccaagaaaag tgccgcagag 4920

gccagcaaga aacctcgcca gaagagaacc gctacaaaag cctacaacgt cacccaggca 4980

tttggccggc gcgggccaga acagacacaa gggaattttg gggatcagga gctgataaga 5040

cagggcacag actacaagca ctggccacag atcgctcagt ttgctccaag tgctagtgcc 5100

ttctttggta tgtcccggat agggatggaa gtgactcctt ctggaacatg gctcacctac 5160

accggcgcga ttaaactgga tgacaaggat ccaaatttca aggaccaggt cattctccta 5220

aataagcata tcgatgctta taagacgttc ccacccacag agcccaaaaa agataagaag 5280

aaaaaggcag acgaaaccca agcactgccg cagaggcaga agaagcagca gacagtgacg 5340

ctgctgccag ctgcagacct ggatgacttc tccaaacagc tccagcagtc tatgagttca 5400

gcggattcta ctcaggctta actcgag 5427

<210> 15

<211> 140

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<220>

<223> EDL09808 (恒定链)

<400> 15

Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Leu Pro Ile

1 5 10 15

Leu Gly Asn Arg Pro Arg Glu Pro Glu Arg Cys Ser Arg Gly Ala Leu

20 25 30

Tyr Thr Gly Val Ser Val Leu Val Ala Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala

35 40 45

Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys Leu

50 55 60

Thr Ile Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Ser Leu Arg Met Lys Leu

65 70 75 80

Pro Lys Ser Ala Lys Pro Val Ser Gln Met Arg Met Ala Thr Pro Leu

85 90 95

Leu Met Arg Pro Met Ser Met Asp Asn Met Leu Leu Gly Pro Val Lys

100 105 110

Asn Val Thr Lys Tyr Gly Asn Met Thr Gln Asp His Val Met His Leu

115 120 125

Leu Thr Val Ser Leu Asp Pro Trp Ser Thr Arg Ser

130 135 140

<210> 16

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SV40 DNA nuclear targeting sequence

<400> 16

ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 60

agtcagcaac ca 72

<210> 17

<211> 28

<212> PRT

<213>小家鼠（Mus musculus）

<220>

<223> C3d (衍生自P01027.3)

<400> 17

Lys Phe Leu Asn Thr Ala Lys Asp Arg Asn Arg Trp Glu Glu Pro Asp

1 5 10 15

Gln Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala

20 25

<210> 18

<211> 112

<212> PRT

<213>小家鼠（Mus musculus）

<220>

<223> 3C3d (P01027.3)

<400> 18

Lys Phe Leu Asn Thr Ala Lys Asp Arg Asn Arg Trp Glu Glu Pro Asp

1 5 10 15

Gln Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys Phe Leu Asn Thr Ala

35 40 45

Lys Asp Arg Asn Arg Trp Glu Glu Pro Asp Gln Gln Leu Tyr Asn Val

50 55 60

Glu Ala Thr Ser Tyr Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

65 70 75 80

Gly Ser Gly Ser Lys Phe Leu Asn Thr Ala Lys Asp Arg Asn Arg Trp

85 90 95

Glu Glu Pro Asp Gln Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala

100 105 110

<210> 19

<211> 9284

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pVAX10-SCV-53

<400> 19

tgggcttttg ctggcctttt gctcacatgt tcttgactct tcgcgatgta cgggccagat 60

atacgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 120

ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 180

gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 240

caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggactattt acggtaaact gcccacttgg 300

cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 360

ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 420

tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 480

gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 540

gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 600

tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctctctggc 660

taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa tacgactcac tatagggaga 720

cccaagctgg ctagcgccgc caccatggat gaccagcgcg atctgattag caaccatgaa 780

cagctgccaa ttctgggcaa ccgcccacgc gaacccgaac gctgcagccg cagccagtgc 840

gtgaacctga ccacccgcac ccagctgcca cccgcttata ccaacagctt tacccgcggc 900

gtgtactatc ctgataaagt gtttcgcagc tcagtcctgc atagcaccca ggatctgttt 960

ctgccttttt ttagcaacgt gacctggttt catgcaattc atgtgagcgg caccaacggc 1020

actaaacgct ttgataaccc agtgctgcca ttcaacgatg gcgtgtattt tgccagcacc 1080

gaaaaatcaa acattattcg cggctggatt tttggcacca ccctggatag caaaacccag 1140

agcctgctga ttgtgaacaa cgcaaccaac gtggtgatca aagtgtgcga atttcagttt 1200

tgcaacgatc cctttctggg cgtgtactat cacaaaaaca acaaaagctg gatggaaagc 1260

gaatttcgcg tgtatagcag cgcaaacaac tgcacctttg agtatgtgtc ccagccattt 1320

ctgatggacc tggaaggcaa gcaaggaaac tttaaaaacc tgcgcgaatt tgtgtttaaa 1380

aacattgatg gctattttaa aatttattcc aaacataccc ccattaacct ggtgcgcgat 1440

ctgccccaag gctttagcgc cctggaacct ctggtggatc tgcctattgg tattaacatt 1500

acccgctttc agaccctgct ggctctgcat cgcagctatc tgacccctgg cgatagcagc 1560

agcggctgga ccgccggcgc agcagcttat tatgtgggct atctgcaacc ccgcaccttt 1620

ctgctgaaat acaacgaaaa cggcaccatt accgatgccg tggattgcgc actggatccc 1680

ctgagcgaaa ccaaatgcac cctgaaaagc tttaccgtgg agaaaggcat ttatcagacc 1740

tccaactttc gcgtgcagcc caccgaaagc attgtgcgct ttcctaacat taccaacctg 1800

tgcccttttg gcgaagtgtt taacgcaacc cgctttgcca gcgtgtatgc ttggaaccgc 1860

aaacgcatta gcaactgcgt ggctgattac agcgtgctgt ataacagcgc cagctttagc 1920

acctttaaat gctatggcgt gagcccaacc aagctgaacg atctgtgctt caccaacgtg 1980

tatgcagata gttttgtgat tcgcggcgat gaagtgcgcc agattgctcc tggccagacc 2040

ggtaaaattg ctgattataa ctataaactg ccagatgatt ttaccggctg cgtgattgca 2100

tggaacagca acaacctgga tagcaaagtg ggcggtaact ataactatct gtatcgcctg 2160

tttcgcaaaa gcaacctgaa accttttgaa cgcgatatta gcaccgaaat ttatcaggca 2220

ggtagcaccc catgcaacgg cgtggaaggc tttaactgct attttcctct gcagagctat 2280

ggctttcaac caaccaacgg ggtgggctat caaccatatc gcgtggtggt gctgtctttt 2340

gaactgctgc atgctccagc taccgtgtgc ggccccaaaa aaagcaccaa cctggtgaaa 2400

aacaaatgcg tgaactttaa ctttaacggc ctgacaggca ccggcgtgct gaccgaatca 2460

aacaaaaaat tcctgccctt tcagcagttt ggccgcgata ttgctgatac aaccgatgca 2520

gtgcgcgatc ctcagaccct ggaaattctg gatattaccc cctgcagctt tggcggcgtg 2580

agcgtgataa cccctggcac caacaccagc aaccaggtgg ctgtgctgta tcagggcgtg 2640

aactgcaccg aagtgcccgt ggccattcat gctgatcaac tgacccccac ctggcgagtg 2700

tatagcacag gcagcaacgt gtttcagacc cgcgccggct gcctgattgg cgccgaacat 2760

gtgaacaaca gctatgagtg cgatattcct attggcgctg gcatttgcgc aagctatcag 2820

acccagacca acgcccgcag cgtggccagc cagagcatta ttgcctatac catgagcctg 2880

ggcgcagaaa acagcgtggc ttatagcaac aacagcattg ctataccaac caacttcacc 2940

attagcgtga ccaccgaaat tctgcccgtg agcatgacca aaaccagcgt ggactgcact 3000

atgtatattt gcggcgatag caccgaatgc agcaacctgc tgctgcagta tggcagcttt 3060

tgcacccagc tgaaccgcgc cctgactggc attgcagtgg aacaggataa aaacacccaa 3120

gaagtgtttg cccaggtgaa acagatttac aaaacccccc ctattaaaga ttttggcggc 3180

ttcaacttta gccagatact gccagatcct agcaaaccta gcaaacgcag ctttatcgaa 3240

gatctgctgt ttaacaaagt gaccctggct gatgctggct ttattaaaca gtatggtgat 3300

tgcctgggcg atattgccgc ccgcgatctg atttgcgctc agaaatttaa cggcctgacc 3360

gtgctgcccc ctctgctgac cgatgaaatg attgcacaat acaccagtgc tctgctggct 3420

ggaaccatta cctcaggctg gacttttggc gcaggtgccg ccctgcagat tccatttgcc 3480

atgcagatgg cctatcgctt taacggcatt ggcgtgaccc agaacgtgct gtatgaaaac 3540

cagaaactga ttgccaacca gtttaacagc gctattggca aaatccagga tagcctgagc 3600

agcaccgcca gcgcactggg caaactgcag gatgtggtga accagaacgc tcaggcactg 3660

aacaccctgg tgaaacagct gagcagcaac tttggcgcca ttagcagcgt gctgaacgat 3720

attctgagcc gcctggaccc tccagaagct gaagtgcaga ttgatcgcct gattacaggc 3780

cgcctgcaga gcctgcagac ttatgtgacc cagcagctga ttcgcgccgc tgaaatccgc 3840

gcaagcgcaa acctggctgc caccaaaatg agcgaatgcg tgctgggcca gagcaaaagg 3900

gtggattttt gtggcaaagg ctatcacctg atgagctttc cccagagcgc tccacatggc 3960

gtggtgtttc tgcacgtgac ctatgtgccc gctcaggaaa aaaactttac cacagcccca 4020

gcaatttgcc atgatggcaa agctcatttt ccccgcgaag gcgtgtttgt gagcaacggc 4080

acccattggt ttgtgaccca gcgcaacttt tatgaacctc agattattac caccgataac 4140

acctttgtga gcggcaactg cgatgtggtg attggcattg tgaacaacac cgtgtatgat 4200

cccctgcagc ccgaactgga tagctttaaa gaagagctgg ataaatattt caaaaaccat 4260

accagccccg atgtggacct gggcgatatt agcggcatta acgccagcgt ggtgaacatt 4320

cagaaagaaa ttgatcgcct gaacgaagtg gctaaaaacc tgaacgaaag cctgattgat 4380

ctgcaagaac tggggaaata tgaacagtat attaaatggc cctggtatat ttggctgggc 4440

tttattgctg gcctgattgc cattgtgatg gtgaccatta tgctgtgctg catgaccagc 4500

tgctgtagct gcctgaaagg gtgctgcagc tgcggcagct gctgcaaatt tgacgaagat 4560

gatagcgaac ctgtgctgaa aggcgtcaaa ctgcattata ccggcagcgg cgaaggaagg 4620

gggagcctgc tgacctgtgg cgatgtggaa gagaaccctg gcccactgat gcagattttt 4680

gtgaaaaccc tgacaggcaa gaccatcacc ctggaagtgg aacctagcga taccattgaa 4740

aacgtgaagg caaaaatcca ggataaagaa gggattcctc cagaccaaca gcgcctgatt 4800

tttgccggca aacaactgga agatggccgc acgctgagcg attataacat tcagaaggaa 4860

agcaccctgc atctggtgct gcgcctgcgc ggcgtgatga gcgataacgg ccctcagaac 4920

cagcgcaacg caccacgcat tacctttggc ggtccatcag atagcactgg cagcaaccag 4980

aacggcgaac gcagcggagc ccgcagcaaa caacgccgcc cacagggcct gcctaacaac 5040

accgcaagct ggtttaccgc cctgacccag cacggcaaag aagatctgaa atttccccgc 5100

ggccagggcg tgccaattaa caccaacagc agcccagatg atcagattgg ctattatcgc 5160

agggccaccc gccgcattcg cggaggcgat ggcaaaatga aagatctgag cccacgctgg 5220

tacttttatt atctgggaac cggccccgaa gccggtcttc catatggcgc caacaaagat 5280

ggcatcattt gggtggcaac cgaaggagct ctgaacaccc caaaagatca tattggcacc 5340

cgcaaccccg caaacaacgc tgcaattgtg ctgcagcttc ctcagggcac caccctgcca 5400

aaaggctttt atgccgaagg cagccgcggc ggcagccagg caagctctag gagcagcagc 5460

cgcagccgca acagcagccg gaacagcacc cctggaagca gcaggggcac cagcccagcc 5520

aggatggcag gtaacggcgg cgatgctgcc ctggctctgc tgctgctgga tcgcctgaac 5580

cagctggaaa gcaaaatgag cggcaaaggc cagcagcagc agggccagac cgtgaccaag 5640

aaaagcgcag ccgaagccag caaaaaacca cgccagaaaa gaaccgccac caaagcctat 5700

aacgtgacgc aggcttttgg ccgccgtggc cccgaacaaa cccagggcaa ctttggcgat 5760

caggaactga ttcgccaggg caccgattat aaacattggc cacagattgc ccagtttgct 5820

cctagcgcca gcgctttttt tggtatgagc cgcattggca tggaagtgac cccctctggc 5880

acctggctga cctataccgg cgctattaaa ctggatgata aagatccaaa ctttaaagac 5940

caggtgattc tgctgaacaa acatattgat gcctataaaa cctttccccc aaccgaaccc 6000

aaaaaagata aaaagaaaaa agccgatgaa acccaggccc tgccacagcg ccagaaaaaa 6060

cagcaaaccg tgaccctgct gcctgcagcc gatctggatg atttcagcaa acagctgcaa 6120

cagagcatga gcagcgcaga tagcacgcag gcttaactcg agtctagagg gcccgtttaa 6180

acccgctgat cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc 6240

cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag 6300

gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag 6360

gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct 6420

atggcttcta ctgggcggtt ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc 6480

cctctggtaa ggttgggaag ccctgcaaag ttaacaaatg agctgattta acaaaaattt 6540

aacgcgaatt aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc 6600

cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt 6660

ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca 6720

tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc 6780

cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tctgcctctg 6840

agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagctcc 6900

cgggagcttg tatatccatt ttcggatctg atcaagagac aggatgagga tcgtttcgca 6960

tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg 7020

gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag 7080

cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc 7140

aagacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc 7200

tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg 7260

atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc 7320

ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca 7380

tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag 7440

agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgagc atgcccgacg 7500

gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg 7560

gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca 7620

tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc 7680

tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg 7740

acgagttctt ctgaattatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt ctccttacgc 7800

atctgtgcgg tatttcacac cgcatacagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac 7860

ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc 7920

ctgataaatg cttcaataat agcacgtgct aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 7980

ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 8040

ctgagcgtca gacccccatc agtgaccaaa caggaaaaaa ccgcccttaa catggcccgc 8100

tttatcagaa gccagacatt aacgcttctg gagaaactca acgagctgga cgcggatgaa 8160

caggcagaca tctgtgaatc gcttcacgac cacgctgatg agctttaccg cagctgcctc 8220

gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca 8280

gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt 8340

ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc 8400

ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac 8460

cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 8520

actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 8580

tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 8640

aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 8700

ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 8760

aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 8820

cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 8880

cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 8940

aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 9000

cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 9060

ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 9120

ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttgtta 9180

gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 9240

agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatc 9284

<210> 20

<211> 281

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SV40 ori 启动子序列

<400> 20

tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 60

tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa 120

gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca 180

tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt 240

ttatttatgc agaggccgag gccgcctctg cctctgagct a 281

Claims

1.一种DNA疫苗，其包含伤寒沙门氏菌Ty21a菌株，所述伤寒沙门氏菌Ty21a菌株包含DNA分子，所述DNA分子包含编码至少COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分的真核表达盒。

2.根据权利要求1所述的DNA疫苗，其中所述COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分包括：

(a)SARS-CoV-2全长S蛋白；

(b)SARS-CoV-2S蛋白胞外结构域；

(c)SARS-CoV-2S蛋白亚基S1；

(d)SARS-CoV-2S蛋白受体结合结构域(RBD)；或者

(e)SARS-CoV-2S蛋白的至少3个免疫显性表位。

3.根据权利要求2所述的DNA疫苗，其中所述COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白是SARS-CoV-2全长S蛋白，任选地，其中所述SARS-CoV-2全长S蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

4.根据权利要求2所述的DNA疫苗，其中所述COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分包含SARS-CoV-2S蛋白胞外结构域，任选地，其中所述SARS-CoV-2S蛋白胞外结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-1208的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-1208具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

5.根据权利要求2所述的DNA疫苗，其中所述COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分包含SARS-CoV-2S蛋白亚基S1，任选地，其中所述SARS-CoV-2蛋白亚基S1包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-681的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-681具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

6.根据权利要求2所述的DNA疫苗，其中所述COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突(S)蛋白或其一部分包含SARS-CoV-2S蛋白受体结合结构域(RBD)，任选地，其中所述SARS-CoV-2蛋白RBD包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基319-541的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1的氨基酸残基319-541具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

7.根据权利要求2所述的DNA疫苗，其中所述SARS-CoV-2S蛋白或其一部分是包含对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中氨基酸位置K986和V987突变为脯氨酸的两个稳定突变的SARS-CoV-2全长S蛋白或SARS-CoV-2S蛋白胞外结构域的融合前稳定形式；优选地，其中所述SARS-CoV-2S蛋白或其一部分包含

(a)SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，包含两个稳定突变K986P和V987P；或者

(b)SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-1208的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-1208具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，包含两个稳定突变K986P和V987P。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的DNA疫苗，其中所述真核表达盒还编码另一种SARS-CoV-2蛋白或其一部分。

9.根据权利要求8所述的DNA疫苗，其中所述另一种SARS-CoV-2蛋白是SARS-CoV-2N蛋白。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的DNA疫苗，还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的DNA疫苗，其中所述疫苗是口服剂型。

12.根据权利要求11所述的DNA疫苗，其中所述口服剂型是肠溶胶囊、冻干粉或混悬剂。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的DNA疫苗，还包含一种或多种佐剂。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的DNA疫苗，用于治疗和/或预防冠状病毒病COVID-19或SARS-CoV-2感染。

15.根据权利要求14使用的DNA疫苗，其中，所述DNA疫苗是口服施用的。

16.根据权利要求14或15使用的所述DNA疫苗，其中

(a)单剂量的DNA疫苗包含约10⁶至约10⁹个菌落形成单位(CFU)的伤寒沙门氏菌Ty21a菌株，和/或

(b)所述DNA疫苗在一周内施用2至4次，用于初始免疫，任选地随后进行一次或多次单剂量增强。

17.根据权利要求16使用的所述DNA疫苗，其中所述DNA疫苗在第一周内施用2至4次，随后进行一次或多次单剂量增强，每次至少在2周后。