JP2023519562A - サルモネラに基づく新規コロナウイルスワクチン - Google Patents

サルモネラに基づく新規コロナウイルスワクチン Download PDF

Info

Publication number
JP2023519562A
JP2023519562A JP2022556158A JP2022556158A JP2023519562A JP 2023519562 A JP2023519562 A JP 2023519562A JP 2022556158 A JP2022556158 A JP 2022556158A JP 2022556158 A JP2022556158 A JP 2022556158A JP 2023519562 A JP2023519562 A JP 2023519562A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cov
sars
protein
amino acid
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022556158A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2021198376A5 (ja
Inventor
ルベナウ ハインツ
マンスール マーク
Original Assignee
エンエーセー オンコイミュニティ アクスイェ セルスカプ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by エンエーセー オンコイミュニティ アクスイェ セルスカプ filed Critical エンエーセー オンコイミュニティ アクスイェ セルスカプ
Publication of JP2023519562A publication Critical patent/JP2023519562A/ja
Publication of JPWO2021198376A5 publication Critical patent/JPWO2021198376A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部をコードする真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌（Salmonella typhi）Ty21a株を含むDNAワクチンに関する。特に本発明は、コロナウイルス疾患2019（COVID-19）またはSARS-CoV-2感染症の予防および／または治療に使用するためのDNAワクチンに関する。

Description

本発明は、COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部をコードする真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌(Salmonella typhi)Ty21a株を含むDNAワクチンに関する。特に本発明は、コロナウイルス疾患2019（COVID-19）またはSARS-CoV-2感染症の予防および／または治療に使用するための前記DNAワクチンに関する。
2019年12月末、中国公衆衛生当局は中国湖北省武漢市において急性呼吸器症候群のいくつかのケースを報告した。中国の科学者は主要な原因媒体として新規なコロナウイルスをただちに特定した。この疾患は現在ではコロナウイルス疾患2019（COVID-19）と呼ばれており、原因ウイルスは重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）と呼ばれる。これはコロナウイルスの新たな株であり、ヒトで以前に同定されたことはない。
武漢における最初のアウトブレイクは急速に広がり、中国の他の地域に影響を及ぼした。すぐに他の数カ国で複数のケースが検出された。この疾患のアウトブレイクとクラスターはそれ以来、アジア、ヨーロッパ、オーストラリア、アフリカ、およびアメリカで観察されている。
WHOはその最初の緊急会合でCOVID-19の致死率が約4％であると見積もった。致死率は国の間で異なっており、報告されていないケースの数が不明のため正確でない可能性があるが、SARS-CoV-2（元々は2019新型コロナウイルス（2019-nCoV）と呼ばれた）の広がりは世界規模のスレッドとなっており、ウイルスのさらなる広がりを阻止するためCOVID-19の治療および／またはCOVID-19に対するワクチン接種が是非とも必要とされている。
コロナウイルスはコロナウイルス科に属する一本鎖プラス鎖RNAウイルスである。これらウイルスは大半が動物（鳥類と哺乳類が含まれる）に感染する。ヒトでは、コロナウイルスは典型的には軽度の呼吸器感染症を引き起こす。2003年以来、2つの高病原性ヒトコロナウイルス、すなわち重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（SARS-CoV）と中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）が高い罹患率と死亡率で世界的に流行した。どちらの流行病も、コロナウイルス科の中のベータコロナウイルス属に属する人畜共通感染コロナウイルスによって起こった。
SARS-CoVおよびMERS-CoVと同様、新たなSARS-CoV-2はベータコロナウイルス属に属する。Zhouら（Cell Discovery (2020) 6:14）によって報告されているように、SARS-CoV-2はSARS-CoVと最大のヌクレオチド配列一致を示す（79.7％）。具体的には、SARS-CoV-2のエンベロープタンパク質とヌクレオカプシドタンパク質は2つの進化的に保存された領域であり、SARS-CoVと比べると配列一致がそれぞれ96％と89.6％である。スパイクタンパク質はSARS-CoV-2とSARS-CoVの間で最低の配列保存（77％の配列一致）を示すことが報告されているのに対し、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質はMERS-CoVのスパイクタンパク質と31.9％しか配列が一致していない。
SARS-CoVに関するさまざまな報告は、液性免疫応答と細胞を媒介とした免疫応答の両方の保護的役割を示唆している。Sタンパク質は最も露出したタンパク質であり、マウスモデルにおいてSARS-CoV Sタンパク質に対する抗体応答はSARS-CoV感染から保護することが示されている。抗体応答は有効だが短期の可能性がある。逆に、T細胞応答はSARS-CoVに対する長期の保護を提供することが示されている。したがって液性免疫応答のほか、細胞を媒介とした免疫応答を誘導することのできるワクチンが非常に有望である。
いくつかの国内研究グループと国際研究グループが2019-nCoV/SARS-CoV-2の予防と治療のためのワクチンを開発する作業を進めているが、有効なワクチンはまだ利用できない。したがって短期間での開発と承認が可能な有効な治療用および／または予防用ワクチンが相変わらず緊急に必要とされている。
新型コロナウイルスに関する現在の理解と、SARS-CoV-2によって発生しているこの世界規模の流行病に鑑み、コロナウイルス疾患2019（COVID-19）またはSARS-CoV-2感染症の予防および／または治療のための新規な経口DNAワクチンを提供することが本発明の1つの目的である。本発明のDNAワクチンは、少なくともCOVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部をコードする真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株を含む。このワクチンは、宿主細胞の中で発現させる免疫原性抗原をコードするDNA分子のための担体およびアジュバントとして機能するチフス菌Ty21aと呼ばれる生弱毒化チフス菌株に基づく。サルモネラに基づいていてその抗原をコードするDNA分子を含むこの担体は短期間で開発して大規模に製造することができ、必要な場合にはウイルスに起こる可能性のある変異に適合させることができる。
さらに、担体として用いられる生弱毒化チフス菌Ty21a株は、腸チフスに対して認可された唯一の生経口ワクチンである（Berna Biotech Ltd.、1つのCrucell Company、スイス国によって製造された）Typhoral L（登録商標）（Vivotif（登録商標）としても知られる）の活性成分である。このワクチンは、患者毒性のほか第三者への伝染に関して大規模に調べられ、安全であることが証明されている（Wahdan et al., J. Infectious Diseases 1982, 145: 292-295）。このワクチンは40カ国超で認可され、腸チフスに対する予防的ワクチン接種のため、何千人もの子どもを含む何百万もの個人に使用されてきた。これは、比類のない安全実績の記録を有する。したがって本発明のDNAワクチンで用いられる担体は、短期間で承認を得て市場に製品を出すのに適している。
したがって本発明のDNAワクチンは、COVID-19および／またはSARS-CoV-2感染症に対する有効なワクチンを提供するという挑戦に特に適したいくつかの利点を有する。
本明細書では、少なくともCOVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部をコードする真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株を含むDNAワクチンが提供される。ある実施形態では、COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部は、（a）SARS-CoV-2完全長Sタンパク質；（b）SARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメイン；（c）SARS-CoV-2 Sタンパク質サブユニットS1；（d）SARS-CoV-2 Sタンパク質受容体結合ドメイン（RBD）；または（d）SARS-CoV-2 Sタンパク質の少なくとも3個の免疫優性エピトープを含む。
一実施形態では、COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質はSARS-CoV-2完全長Sタンパク質である。SARS-CoV-2完全長Sタンパク質は、配列番号1のアミノ酸配列、または配列番号1と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を含むことができる。SARS-CoV-2完全長Sタンパク質として、SARS-CoV-2のバリアント（系統B.1.1.7、B.1.351、またはB.1.1.28（名称変更P.1）など）の完全長Sタンパク質も可能である。SARS-CoV-2完全長Sタンパク質として、SARS-CoV-2完全長Sタンパク質の融合前安定化形態（2つ以上の安定化形態を含むものなど）も可能である。一実施形態では、SARS-CoV-2完全長Sタンパク質の融合前安定化形態は、配列番号1のアミノ酸配列アミノ酸位置K986とV987に対応するプロリンへの2つの安定化変異を含む。
ある実施形態では、COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部はSARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメインを含む。SARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメインは、配列番号1のアミノ酸残基1～1208のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸残基1～1208と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を有する。SARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメインとして、SARS-CoV-2のバリアント（系統 B.1.1.7、B.1.351、またはP.1など）のSタンパク質エクトドメインも可能である。SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部は、SARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメインの融合前安定化形態で2つ以上の安定化変異を含むものも含むことができる。一実施形態では、SARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメインの融合前安定化形態は、配列番号1のアミノ酸残基1～1208のアミノ酸配列のアミノ酸位置K986とV987に対応するプロリンへの2つの安定化変異を含む。
ある実施形態では、SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部は、2つの安定化変異K986PとV987Pを含む配列番号1のアミノ酸配列、または配列番号1と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を有する。ある代わりの実施形態では、SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部は、2つの安定化変異K986PとV987Pを含む配列番号1のアミノ酸残基1～1208のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸残基1～1208と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部はSARS-CoV-2 Sタンパク質サブユニットS1を含む。SARS-CoV-2タンパク質サブユニットS1は、配列番号1のアミノ酸残基1～681のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸残基1～681と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を含むことができる。SARS-CoV-2 Sタンパク質サブユニットS1として、SARS-CoV-2のバリアント（系統B.1.1.7、B.1.351、またはP.1など）のSタンパク質サブユニットS1も可能である。
ある実施形態では、COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部はSARS-CoV-2 Sタンパク質受容体結合ドメイン（RBD）を含む。SARS-CoV-2タンパク質RBDは、配列番号1のアミノ酸残基319～541のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸残基319～541と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を含むことができる。SARS-CoV-2 Sタンパク質RBDとして、SARS-CoV-2のバリアント（系統B.1.1.7、B.1.351、またはP.1など）のSタンパク質RBDも可能である。
本発明のDNAワクチンは、SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部をコードするとともに、場合により別のSARS-CoV-2タンパク質またはその一部（好ましくはSARS-CoV-2 Nタンパク質）をさらにコードするDNA分子を含むことができる。ある実施形態では、真核生物発現カセットは、SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部をコードするとともに、別のSARS-CoV-2タンパク質またはその一部（SARS-CoV-2 Nタンパク質またはその一部など）をさらにコードする。
本発明のDNAワクチンは、医薬として許容可能な1つ以上の賦形剤をさらに含むことができる。ある実施形態では、DNAワクチンは経口剤形（腸溶性コーティングカプセル、凍結乾燥粉末、または懸濁液など）である。本発明のDNAワクチンは1つ以上のアジュバントをさらに含むことができる。
本明細書では、コロナウイルス疾患2019（COVID-19）またはSARS-CoV-2感染症の治療および／または予防に使用するための本発明のDNAワクチンも提供される。
本明細書では、コロナウイルス疾患2019（COVID-19）またはSARS-CoV-2感染症を治療および／または予防する方法として、それを必要とする患者に本発明のDNAワクチンを投与することを含む方法も提供される。好ましい実施形態では、DNAワクチンは経口投与される。ある実施形態では、単回用量のDNAワクチンは、約1×106～約1×109コロニー形成単位（CFU）のチフス菌Ty21a株を含む、および／またはこのDNAワクチンは、プライミングのため1週間に2～4回投与され、場合によりその後に少なくとも1回のブースティング用量が続く。一実施形態では、DNAワクチンは最初の1週間以内に2～4回投与され、1回以上の単回用量ブースティングがそれぞれ少なくとも2週間後（好ましくはそれぞれ少なくとも4週間後）に続く。
図1：SARS-CoV-2スパイクタンパク質のアミノ酸配列（配列番号1）であり、アミノ酸残基1～1208に下線が引かれ、K986、V987、R682G、R683S、R685Sが太字にされている。 図2：pVAX10.SCV-1のプラスミドマップ。 図3：pVAX10にクローニングするためのSARS-CoV-2コンストラクト。Xは、N末端（左）からC末端（右）への順番でドメインの存在を示す、以下の略号を使用する；S FL（完全長Sタンパク質、配列番号1；*は、不変鎖のシグナルドメイン（配列番号15のMet1～Arg29）で置換されたシグナルドメイン（配列番号1のMet1～SER12）を示す）、S ecto：（Sタンパク質エクトドメイン）、S1（Sタンパク質S1サブユニット）、RBD（受容体結合ドメイン）、T4三量体（T4フィブリチン三量体化モチーフ）、3C3d（C3dタンパク質の3つのコピーを含むエンハンサー配列）、2A（2Aペプチド（T2aまたはP2aなど））、Ubi.（ユビキチン）、N（Nタンパク質）、S2（Sタンパク質S2サブユニット）、およびSV40 DTS（SV40 DNA核標的配列）。 図4：健康なマウスにおいてVXM-SCV-3によって誘導される免疫応答。ワクチンを接種したマウスの血清を分析してSARS-CoVスパイクタンパク質に対する抗体を探した（実施例5参照）。アッセイのバックグラウンドは、まっすぐな点線で示されているように400エンドポイント力価の位置にある。 図5：健康なマウスにおいてVXM-SCV-30によって誘導される免疫応答。ワクチンを接種したマウスの血清を分析してSARS-CoVスパイクタンパク質に対する抗体を探した（実施例6参照）。アッセイのバックグラウンドは、まっすぐな点線で示されているように400エンドポイント力価の位置にある。 図6：健康なマウスにおいてVXM-SCV-42によって誘導される免疫応答。ワクチンを接種したマウスの血清を分析してSARS-CoVスパイクタンパク質に対する抗体を探した（実施例7参照）。アッセイのバックグラウンドは、まっすぐな点線で示されているように400エンドポイント力価の位置にある。 図7：健康なマウスにおいてVXM-SCV-53によって誘導される免疫応答。ワクチンを接種したマウスの血清を分析してSARS-CoVスパイクタンパク質に対する抗体を探した（実施例8参照）。アッセイのバックグラウンドは、まっすぐな点線で示されているように400エンドポイント力価の位置にある。
発明の詳細な説明
本明細書では、少なくともCOVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部をコードする真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株を含むDNAワクチンが提供される。
本発明によれば、チフス菌Ty21a株は、少なくともCOVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部をコードする真核生物発現カセットを含むDNA分子の細菌担体として機能し、前記DNA分子を標的細胞の中へと送達する。したがってそのDNA分子は宿主細胞に送達され、Sタンパク質またはその一部が宿主細胞によって発現される。チフス菌Ty21a株は弱毒化チフス菌株であり、本発明のDNAワクチンはその生弱毒化チフス菌株Ty21aを含む。
本発明の文脈では、「弱毒化された」は、弱毒化変異を持たない親細菌株と比べて細菌株の毒力が低下していることを意味する。弱毒化細菌株は、その毒力を喪失しているが、保護免疫を誘導する能力は保持していることが好ましい。弱毒化はさまざまな遺伝子（毒力、調節、および代謝の遺伝子が含まれる）の欠失によって実現することができる。弱毒化された細菌は、自然界に見いだすこと、または実験室で例えば新たな培地または細胞培養物に適合させることによって人工的に作製すること、または組み換えDNA技術によって作製することができる。本発明のサルモネラ弱毒化株を約1011 CFU投与することによって対象で起こるサルモネラ症が5％未満、より好ましくは1％未満、最も好ましくは1‰未満になることが好ましい。
「含む」または「含んでいる」という用語は、「含むが、それに限定されない」を意味する。この用語は非限定的であることが想定されており、記載されている任意の特徴、エレメント、整数、工程、または構成成分の存在を特定しているが、1つ以上の他の特徴、エレメント、整数、工程、構成成分、または群の存在または追加を排除しない。したがって「含んでいる」という用語は、より限定的な表現「からなる」と「本質的にからなる」を含む。一実施形態では、「含んでいる」という用語は、個別に「からなる」という表現で置き換えることができる。配列に関しては、「のアミノ酸配列を有する」と「のアミノ酸を含んでいる」という表現は交換可能に用いられ、「のアミノ酸配列からなる」という実施形態を含む。「1つの」という用語は、本明細書では複数を含むことができるため、「1つ」を含むがそれに限定されない。
「SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部」または「別のSARS-CoV-2タンパク質またはその一部」という用語は、本明細書では、SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその免疫原性部分、または別のSARS-CoV-2 タンパク質とその免疫原性部分を意味する。1つのタンパク質の免疫原性部分はその免疫原性タンパク質の1つ以上のドメインを含むことができる。しかし免疫原性部分が1つのドメイン（受容体結合ドメインまたはエクトドメインなど）の免疫原性部分だけを含む場合も本発明に包含される。「免疫原性」という用語は、本明細書では、タンパク質で免疫応答（B細胞応答および／またはT細胞応答など）を誘導する部分を意味する。
少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子は、組み換えDNA分子、すなわち操作されたDNAコンストラクトと呼ぶこともでき、出所が異なるDNA断片からなることが好ましい。DNA分子として直線状核酸または環状核酸が可能である。DNA分子はプラスミドであることが好ましく、発現プラスミドであることがより好ましい。このプラスミドは、少なくともSARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部をコードするオープンリーディングフレームを1つのプラスミドの真核生物発現カセットに導入することによって生成させることができる。真核生物発現カセットを含むプラスミドは真核生物発現プラスミドと呼ぶこともできる。
本発明の文脈では、「発現カセット」という用語は、少なくとも1つのオープンリーディングフレーム（ORF）を含んでいてその発現を制御する調節配列の制御下にある核酸単位を意味する。発現カセットは転写終止シグナルも含むことが好ましい。発現カセットは、その中に含まれていて少なくともSARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部をコードするオープンリーディングフレームの転写を標的細胞の中で媒介できることが好ましい。真核生物発現カセットは、典型的には、プロモータ、少なくとも1つのオープンリーディングフレーム、および転写終止シグナルを含み、これらが真核生物標的細胞における発現を可能にする。
コロナウイルスはコロナウイルス科に属する一本鎖プラス鎖RNAウイルスである。これらウイルスは大半が動物（鳥類と哺乳類が含まれる）に感染する。ヒトでは、コロナウイルスは典型的には軽度の呼吸器感染症を引き起こす。2003年以来、2つの高病原性ヒトコロナウイルス、すなわち重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（SARS-CoV）と中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）が高い罹患率と死亡率で世界的に流行した。どちらの流行病も、コロナウイルス科の中のベータコロナウイルス属に属する人畜共通感染コロナウイルスによって起こった。
SARS-CoVおよびMERS-CoVと同様、新たなSARS-CoV-2はベータコロナウイルス属に属する。SARS-CoV-2のゲノムは約3万個の塩基を持ち、多くの構造タンパク質と非構造タンパク質をコードしている。構造タンパク質に含まれるのは、スパイク（S）タンパク質、エンベロープ（E）タンパク質、膜（M）タンパク質、およびヌクレオカプシド（N）タンパク質である。Zhouら（Cell Discovery (2020) 6:14）によって報告されているように、SARS-CoV-2はSARS-CoVと最大のヌクレオチド配列一致を示す（79.7％）。具体的には、SARS-CoV-2のエンベロープタンパク質とヌクレオカプシドタンパク質は2つの進化的に保存された領域であり、SARS-CoVと比べると配列一致がそれぞれ96％と89.6％である。スパイクタンパク質はSARS-CoV-2とSARS-CoVの間で最低の配列保存（77％の配列一致）を示すことが報告されているのに対し、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質はMERS-CoVのスパイクタンパク質と31.9％しか配列が一致していない。オープンリーディングフレームORF 1ab、ORF 3a、ORF3b、ORF6、ORF 7a、ORF7b、ORF8、ORF9a、ORF9b、およびORF10によってコードされるいくつかの非構造タンパク質がSARS-CoV-2で予測された（Srinivasan et al. Viruses (2020) 12:360）。その間にSARS-CoV-2のいくつかのバリアントが同定され、例えばSARS-CoV-2の系統B.1.1.7は連合王国で最初に報告され、B.1.351系統は南アフリカで最初に報告され、B.1.1.28サブクレードはブラジルで最初に報告され、P.1と名称が変更された（Galloway et al., MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2021 Jan 22; 70(3): 95-99.）。Gallowayらによれば、これらバリアントは一群の遺伝子変異を持ち、その中にはウイルスの侵入を容易にする宿主細胞アンジオテンシン変換酵素-2（ACE-2）受容体への結合に不可欠なSタンパク質受容体結合ドメインが含まれる。これらのバリアントはより効率的に広がるように見える。
SARS-CoVに関するさまざまな報告は、液性免疫応答と細胞を媒介とする免疫応答の両方の保護的役割を示唆している。Sタンパク質は最も露出したタンパク質であり、マウスモデルにおいてSARS-CoV Sタンパク質に対する抗体応答はSARS-CoV感染から保護することが示されている。抗体応答は有効だが短期である可能性がある。逆に、T細胞応答はSARS-CoVに対する長期の保護を提供することが示されている。それに加え、多数の研究はSARS-CoVのNタンパク質に対して抗体が生成することを示しているため、SARS-CoV-2に拡張することにより、Nタンパク質は免疫原性が大きく、感染中に豊富に発現するタンパク質であると考えられる。さらに、構造タンパク質のうちでSタンパク質とNタンパク質に対するT細胞応答が最も優勢で長く持続することが報告されている（Ahmed et al. Viruses (2020) 12:254）。サルモネラの弱毒化株であるチフス菌Ty21aはサルモネラ・エンテリカ種の1つである。サルモネラ・エンテリカの弱毒化誘導体は異種抗原を哺乳類免疫系に送達するための魅力的な媒体である。というのもS.・エンテリカ株は粘膜経路の免疫化を通じて、すなわち経口または鼻腔を通じて送達できる可能性があるからである。これは非経口投与と比べて簡単で安全であるという利点を提供する。さらに、サルモネラ株は全身区画と粘膜区画両方のレベルで強力な液性免疫応答と細胞免疫応答を誘導する。バッチ調製のコストは低く、生細菌ワクチンの製剤は非常に安定である。弱毒化はさまざまな遺伝子（毒力、調節、および代謝の遺伝子が含まれる）の欠失によって実現することができる。
アロ変異によって弱毒化されたいくつかのチフス菌株は、動物モデルにおいて異種抗原の安全で効果的な送達媒体であることが示されている。
弱毒化されたチフス菌Ty21a株は、腸チフスに対するワクチンとして、そしてヒトにおけるワクチン接種（主に腫瘍抗原および／またはストロマ抗原に対するワクチン接種）のための異種抗原の送達媒体として、安全で効果的であることが示されている。
生弱毒化チフス菌Ty21a株は、（Berna Biotech Ltd.、1つのCrucell Company、スイス国によって製造された）Typhoral L（登録商標）（Vivotif（登録商標）としても知られる）の活性成分である。これは現在のところ腸チフスに対する認可された唯一の生経口ワクチンである。このワクチンは患者毒性のほか第三者への伝染に関して大規模に調べられ、安全であることが証明されている（Wahdan et al., J. Infectious Diseases 1982, 145:292-295）。このワクチンは40カ国超で認可され、腸チフスに対する予防的ワクチン接種のため、何千人もの子どもを含む何百万もの個人に使用されてきた。Typhoral L（登録商標）の販売承認番号は、1996年12月16日付けのPL 15747/0001である。1用量のワクチンは、少なくとも2×109生存チフス菌Ty21aコロニー形成単位と、少なくとも5×109非生存チフス菌Ty21a細胞を含有する。
腸チフスに対する忍容性が良好なこの生経口ワクチンは野生型強毒性細菌単離体チフス菌Ty2の化学的突然変異誘発に由来しており、galE遺伝子の中に機能喪失変異を有するためガラクトースを代謝することができない。この弱毒化細菌株は、硫酸塩を還元して硫化物にすることもできない。この硫化物が、弱毒化細菌株を野生型チフス菌Ty2株と識別する。チフス菌Ty21a株は、その血清学的特徴に関し、この細菌の外膜の多糖であるO9-抗原を含有するが、O5-抗原を欠いており、それが今度はチフス菌の1つの特徴的な構成成分となっている。この血清学的特徴は、バッチ出荷のための一群のアイデンティティ検査にそれぞれの検査を含める根拠を支持する。
SARS-CoV-2 Sタンパク質は、三量体1つにつき66個のN結合型グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。このタンパク質は残基S673、T678、およびS686にO結合型グリカンも含む。さらに、Sタンパク質は、2つの機能的ドメイン、すなわち受容体結合ドメインと、ウイルスの膜と細胞膜の融合を媒介する配列を含有する第2のドメインを含有する。S糖タンパク質は、融合配列の露出を可能にするには細胞プロテアーゼによって切断されねばならないため、細胞への侵入に必要とされる。SARS-CoV-2のタンパク質配列から、配列PRRAの挿入により残基681～687の位置にフーリン切断配列（PRRARS|V）が存在することが明らかになる。フーリンプロテアーゼは呼吸管に豊富であるため、SARS-CoV-2 S糖タンパク質は上皮細胞から出たときに切断されることが可能であり、その帰結として他の細胞に効率的に感染することができる。
本発明のDNAワクチンに関して用いられる発現カセットは真核生物発現カセットである。本発明の文脈では、「真核生物発現カセット」という用語は、真核細胞の中でオープンリーディングフレームの発現を可能にする発現カセットを意味する。十分な免疫応答を誘導するのに必要な異種抗原の量は細菌にとって毒性である可能性があり、細胞死、過剰弱毒化、または異種抗原の発現喪失に至る可能性があることが示されている。細菌プラスミドベクターの中では発現せず、標的細胞の中でだけ発現する真核生物発現カセットを使用するとこの毒性問題を克服できる可能性があり、発現するタンパク質は典型的には真核生物グリコシル化パターンを示す。
真核生物発現カセットは、真核細胞の中でオープンリーディングフレームの発現を制御することのできる調節配列（好ましくはプロモータとポリアデニル化シグナル）を含む。本発明のサルモネラ弱毒化株に含まれる組み換えDNA分子に含まれるプロモータとポリアデニル化シグナルは、免疫化する対象の細胞内で機能するように選択されることが好ましい。特にヒト用DNAワクチンの製造に適したプロモータの非限定的な例に含まれるのは、サイトメガロウイルス（CMV）からのプロモータ（強力なCMV最初期プロモータなど）、シミアンウイルス40（SV40）からのプロモータ、マウス乳腺腫瘍ウイルス（MMTV）からのプロモータ、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）からのプロモータ（HIVの長い末端反復（LTR）プロモータなど）、モロニーウイルスからのプロモータ、エプスタイン・バーウイルス（EBV）からのプロモータ、およびラウス肉腫ウイルス（RSV）からのプロモータ、CMV初期エンハンサーエレメントからなる合成CAGプロモータ、ニワトリベータ-アクチン遺伝子のプロモータ、第1エキソン、および第1イントロン、およびウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプタのほか、ヒト遺伝子（ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、およびヒトメタロチオネインなど）からのプロモータである。特別な一実施形態では、真核生物発現カセットはCMVプロモータを含有する。本発明の文脈では、「CMVプロモータ」という用語は、強力な最初期サイトメガロウイルスプロモータを意味する。
特にヒト用DNAワクチンの製造に適したポリアデニル化シグナルの非限定的な例に含まれるのは、ウシ成長ホルモン（BGH）ポリアデニル化部位、SV40ポリアデニル化シグナル、およびLTRポリアデニル化シグナルである。特別な一実施形態では、本発明のサルモネラ弱毒化株からなる組み換えDNA分子に含まれる真核生物発現カセットはBGHポリアデニル化部位を含む。
異種SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部の発現に必要な調節エレメント（プロモータとポリアデニル化シグナルなど）に加え、他のエレメントも組み換えDNA分子に含めることができる。そのような追加エレメントに含まれるのはエンハンサーである。エンハンサーとして、例えばヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンのエンハンサーと、ウイルスエンハンサー（CMV、RSV、およびEBVからのエンハンサーなど）が可能である。
本発明の文脈では、哺乳類での発現、特にヒトでの発現にコドンが最適化されたSARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部（のほか、オプションのさらなるSARS-CoV-2タンパク質またはその一部（SARS-CoV-2 Nタンパク質またはその一部など））をコードする遺伝子（またはオープンリーディングフレーム）を使用することが一般に有利である。したがってある実施形態では、真核生物発現カセットは、COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部をコードするコドン最適化配列を少なくとも含む。
本発明のDNAワクチンによってコードされるCOVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部の非限定的な例に含まれるのは、（a）SARS-CoV-2 完全長Sタンパク質；（b）SARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメイン；（c）SARS-CoV-2タンパク質サブユニットS1；（d）SARS-CoV-2受容体結合ドメイン（RBD）、または（e）SARS-CoV-2 Sタンパク質の少なくとも3個の免疫優性エピトープである。
ある実施形態では、COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質はSARS-CoV-2完全長Sタンパク質である。SARS-CoV-2完全長Sタンパク質は、配列番号1のアミノ酸配列、または配列番号1と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を含むことができる。好ましい一実施形態では、SARS-CoV-2完全長Sタンパク質は、配列番号1と少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％一致した配列を有するアミノ酸配列を有する。一実施形態では、SARS-CoV-2完全長Sタンパク質は、配列番号1と少なくとも98％～100％一致した配列を有するアミノ酸配列を有する。特別な一実施形態では、COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質は、配列番号1のアミノ酸配列、または配列番号1と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列からなるSARS-CoV-2完全長Sタンパク質である。配列番号1のアミノ酸配列はGenBankアクセッション番号MN_908947を持ち、Wuら（Nature 2020, 579: 265-269）によって公開されている。特別な一実施形態では、SARS-CoV-2完全長Sタンパク質としてSARS-CoV-2のバリアント（系統B.1.1.7、B.1.351、またはP.1など）の完全長Sタンパク質も可能である。
我々は、GenBankで入手できるSARS-CoV-2のさまざまなSタンパク質配列を以下のGenBankアクセッション番号（タンパク質のid）の配列、すなわちMN_908947（QHD434616.1）、MN_988668（QHQ62107.1）、NC_045512（YP_009724390.1）、MN_938384.1（QHN73795.1）、MN_975262.1（QHN73810.1）、MN_985325.1（QHQ60594.1）、MN_988713.1（QHQ62877.1）、MN_994467.1（QHQ71963.1）、MN_994468.1（QHQ71973.1）、およびMN997409.1（QHQ82464.1）とアラインメントさせて比較したが、差は見られなかった。しかしわずかな違いがSARS-CoV-2 Sタンパク質で以前に報告されている。例えば以下の置換がWrappら（Science, 2020, 367: 1260-1263）によって臨床単離体で記載されている：F32I、H49Y、S247R、N354D、D364Y、V367F、D614G、V1129L、およびE1262G。さらに、置換H49YとV860Qが、Wangら（J. Med. Virol. March 13, 2020: 1-8）によって報告されている。同じ著者らによって公開されたSARS-CoV-2配列のさらなる相同性分析から、Sタンパク質のヌクレオチド相同性が99.82％～100％であり、Sタンパク質のアミノ酸相同性が99.53％～100％であることが明らかになった。同定されたバリアントB.1.1.7、B.1.351、およびP.1はいくつかの変異を有する。B.1.1.7バリアントのSタンパク質は、欠失69～70HVおよび144Yと、以下の変異：N501Y、A570D、D614G、P681H、T761I、S982A、D1118Hを有する。バリアントB.1.351は、Sタンパク質の中に以下の変異：K417N、E484K、N501Y、D614G、およびA701Vを有する。P.1バリアントは、L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、およびT1027Iという変異をSタンパク質の中に有する（Galloway et al., MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2021 Jan 22; 70(3): 95-99.）。しかしさらなる置換またはバリアントが時間経過とともに生じるか同定される可能性がある。
SARS-CoV-2完全長Sタンパク質として、SARS-CoV-2完全長Sタンパク質の融合前安定化形態（2つ以上の安定化変異を含むものなど）も可能である。ある実施形態では、SARS-CoV-2完全長Sタンパク質の融合前安定化形態は、配列番号1のアミノ酸配列のアミノ酸位置K986とV987に対応するプロリンへの2つの安定化変異を含む。
他のベータコロナウイルスSタンパク質で有効であることが証明された以前の安定化戦略を利用してC末端S2融合機構の中の残基986と987に2つの安定化プロリン変異を付加することによるSARS-CoV-2 Sタンパク質の融合前安定化形態がWrappらによって記載されている（Science, 2020, 367: 1260-1263）。さらにWrappら（Science, 2020, 367: 1260-1263）は、フーリン切断部位の中の残基682～685の位置の「GSAS」変異をこの位置のRRAR配列の代わりに記載している。これら両方の変異はタンパク質を安定化させるため、融合を阻止する。これはSタンパク質の安定性と発現を改善する可能性があるだけでなく、細胞融合を阻止することにより安全性も改善する可能性がある。ある実施形態では、SARS-CoV-2完全長Sタンパク質の融合前安定化形態は、配列番号1のアミノ酸配列のアミノ酸位置K986とV987に対応するプロリンへの2つの安定化変異、および／または配列番号1の残基681～687に対応するフーリン切断配列（PRRARS|V）の変異（R682G、R683S、およびR685S変異など）を含む。SARS-CoV-2完全長Sタンパク質は、配列番号1のアミノ酸配列、または配列番号1と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を持ち、2つの安定化変異K986PとV987P；またはフーリン切断配列の変異R682G、R683S、およびR685Sをさらに含むか、2つの安定化変異K986PおよびV987Pと、フーリン切断配列の変異R682G、R683S、およびR685Sをさらに含むことが好ましい。あるいはフーリン切断配列のアミノ酸（アミノ酸680～683など）が欠失している可能性がある。したがって一実施形態では、SARS-CoV-2 完全長Sタンパク質は、配列番号1のアミノ酸配列、または配列番号1と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を持ち、フーリン切断配列における欠失（アミノ酸S680～R683を含むかアミノ酸S680～R683からなる欠失など）をさらに含む。Sタンパク質の融合前安定化形態になる他のアミノ酸置換またはアミノ酸欠失も使用することができる。
ある実施形態では、COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部はSARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメインを含む。「エクトドメイン」という用語は、膜貫通タンパク質SARS-CoV-2 Sタンパク質の細胞外部分、すなわち膜貫通ドメインと細胞質ドメインを欠くことを意味する。エクトドメインは、受容体結合ドメインを含む膜遠位サブユニットS1と、膜近位サブユニットS2を含む。SARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメインは、配列番号1のアミノ酸残基1～1208のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸残基1～1208と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を含む。しかし本明細書で用いられるSARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメインとして、少なくとも配列番号1のアミノ酸残基1～1208に対応する配列、またはわずかにより長い例えば配列番号1のN末端1213アミノ酸残基まで、または配列番号1のアミノ酸残基1～1213と少なくとも95％一致した配列を有する配列が可能である。好ましい一実施形態では、SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部は、配列番号1のアミノ酸残基1～1208の配列と少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％一致した配列を有するアミノ酸配列を有するSARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメインを含む。一実施形態では、SARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメインは、配列番号1のアミノ酸残基1～1208と少なくとも98％～100％一致した配列を有するアミノ酸配列を有する。特別な一実施形態では、COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部は、配列番号1のアミノ酸残基1～1208のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸残基1～1208と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を有するか、そのようなアミノ酸配列からなるSARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメインである。さらなる特別な一実施形態では、SARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメインとして、SARS-CoV-2のバリアント（系統B.1.1.7、B.1.351、またはP.1など）のSタンパク質エクトドメインも可能である。
SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部は、SARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメインの融合前安定化形態で2つ以上の安定化変異を含むものも含むことができる。一実施形態では、SARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメインの融合前安定化形態は、配列番号1のアミノ酸残基1～1208のアミノ酸配列の中のアミノ酸位置K986とV987に対応するプロリンへの2つの安定化変異を含む。
ある実施形態では、SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部は、配列番号1のアミノ酸残基1～1208のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸残基1～1208と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を含み、2つの安定化変異K986PとV987Pをさらに含む。
ある実施形態では、SARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメインの融合前安定化形態は、配列番号1のアミノ酸残基1～1208のアミノ酸配列の中のアミノ酸位置K986とV987に対応するプロリンへの2つの安定化変異、および／または配列番号1のアミノ酸残基1～1208のアミノ酸配列の残基681～687に対応するフーリン切断配列（PRRARS|V）の変異（R682G、R683S、およびR685S変異など）を含む。SARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメインは、配列番号1のアミノ酸残基1～1208のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸残基1～1208のアミノ酸配列と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を持ち、2つの安定化変異K986PとV987P；またはフーリン切断配列の変異R682G、R683S、およびR685Sを含むか、2つの安定化変異K986PおよびV987Pと、フーリン切断配列の変異R682G、R683S、およびR685Sを含むことが好ましい。あるいはフーリン切断配列のアミノ酸は、アミノ酸680～683などが欠失していてもよい。したがって一実施形態では、SARS-CoV-2完全長Sタンパク質は、配列番号1のアミノ酸配列、または配列番号1と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を持ち、フーリン切断配列に欠失（アミノ酸S680～R683を含むかアミノ酸S680～R683からなる欠失など）を含む。Sタンパク質エクトドメインの融合前安定化形態が得られる他のアミノ酸置換またはアミノ酸欠失も利用できる。
SARS-CoV-2エクトドメインは、安定化、および／または改善された発現、および／または改善された分泌のため、融合ドメインをさらに含むことができる。融合ドメインとして、三量体化ドメイン（C末端T4フィブリチン三量体化モチーフなど）が可能である。バクテリオファージT4フィブリチンの三量体化ドメイン（「フォールドン」と呼ぶ）は、フィブリチンタンパク質のアミノ酸残基457～483に対応するアミノ酸配列 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL（配列番号10）を有する。
SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部をコードする配列は、シグナル伝達ペプチドをコードするシグナル伝達配列を含むことが好ましい。SARS-CoV-2 Sタンパク質のシグナル伝達ペプチドは、例えば配列番号1のアミノ酸残基1～15に対応するアミノ酸配列：MFVFLVLLPLVSSQC（配列番号3）、または配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％一致した配列を有する同等な機能のシグナル伝達ペプチドを有する。一実施形態では、SARS-CoV-2 Sタンパク質のシグナル伝達ペプチド不変鎖のシグナルペプチド、好ましい一実施形態では配列番号1のアミノ酸残基1～12が配列番号15のアミノ酸残基1～29で置換されている。
ある実施形態では、COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部はSARS-CoV-2 Sタンパク質サブユニットS1を含む。SARS-CoV-2 Sタンパク質サブユニットS1は、配列番号1のアミノ酸残基1～681のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸残基1～681と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部は、配列番号1のアミノ酸残基1～681の配列と少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％一致した配列を有するアミノ酸配列を有するSARS-CoV-2 Sタンパク質サブユニットS1を含む。一実施形態では、SARS-CoV-2 Sタンパク質サブユニットS1は、配列番号1のアミノ酸残基1～681と少なくとも98％～100％一致した配列を有するアミノ酸配列を有する。特別な一実施形態では、COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部は、配列番号1のアミノ酸残基1～681のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸残基1～681と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を有するかそのアミノ酸配列からなるSARS-CoV-2 Sタンパク質サブユニットS1である。さらなる特別な一実施形態では、SARS-CoV-2 Sタンパク質サブユニットS1として、SARS-CoV-2のバリアント（系統B.1.1.7、B.1.351、またはP.1など）のSタンパク質サブユニットS1も可能である。
ある実施形態では、COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部はSARS-CoV-2 Sタンパク質受容体結合ドメイン（RBD）を含む。SARS-CoV-2 Sタンパク質RBDは、配列番号1のアミノ酸残基319～541のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸残基319～541と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部は、配列番号1のアミノ酸残基319～541と少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％一致した配列を有するSARS-CoV-2 Sタンパク質RBDを含む。一実施形態では、SARS-CoV-2 Sタンパク質RBDは、配列番号1のアミノ酸残基319～541と少なくとも98％～100％一致した配列を有するアミノ酸配列を有する。特別な一実施形態では、COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部は、配列番号1のアミノ酸残基319～541のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸残基319～541と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を有するかそのアミノ酸配列からなるSARS-CoV-2 Sタンパク質RBDである。特別な一実施形態では、SARS-CoV-2 Sタンパク質RBDとして、SARS-CoV-2のバリアント（系統B.1.1.7、B.1.351、またはP.1など）のSタンパク質RBDも可能である。
SARS-CoV-2完全長Sタンパク質、SARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメイン、SARS-CoV-2タンパク質サブユニットS1、またはSARS-CoV-2 RBDを使用することの1つの利点は、変異するSARS-CoV-2に対する有効性を維持しつつポリクローナル液性免疫応答（中和する抗体応答を含む）を提供することと、液性免疫応答のほか細胞免疫応答がMHC制限されず、したがってある型のHLAを有する患者に限定されないことである。
本発明の文脈では、「と少なくとも95％一致した配列」という表現は、参照配列のアミノ酸配列（配列番号1のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸残基1～1208、アミノ酸残基1～681、またはアミノ酸残基319～541のアミノ酸配列（その対応する部分も指す）など）および／またはそのアミノ酸配列をコードする核酸配列が異なっている可能性のあるタンパク質に関係する。Sタンパク質またはその一部は天然起源であること（例えば配列番号1のアミノ酸配列を有するSARS-CoV-2のSタンパク質の変異バージョンまたはバリエーション）、または部位指定変異、またはクローニング、またはこれらの組み合わせを導入することによって改変された操作されたタンパク質（例えば操作された糖タンパク質誘導体）であることが可能である。コドンの利用は種の間で異なることが知られている。したがって標的細胞の中で異種Sタンパク質を発現させるとき、核酸配列を標的細胞のコドン利用に適合させることが必要である可能性、または少なくとも助けになる可能性がある。所与のタンパク質の誘導体を設計して構成する方法は当業者に周知である。核酸配列を標的細胞のコドン利用に適合させることはコドン最適化としても知られる。
配列番号1のアミノ酸配列またはその対応する部分と少なくとも約95％一致した配列を共有するSタンパク質またはその一部は、1個以上のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換を含む1つ以上の変異を含有している可能性がある。本発明の教示によれば、前記欠失、付加、および／または置換がなされたアミノ酸は連続したアミノ酸であること、または配列番号1のアミノ酸配列またはその対応部分と少なくとも約95％一致した配列を共有するSタンパク質またはその一部のアミノ酸配列の長さにわたって散在することが可能である。本発明の教示によれば、配列番号1のアミノ酸配列またはその対応部分とのアミノ酸配列の一致が少なくとも約95％である限り、任意の数のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換が可能である。特別な実施形態では、Sタンパク質またはその一部のアミノ酸配列と配列番号1のアミノ酸配列またはその対応部分の配列一致は、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％であり、好ましいのは少なくとも99％である。あらゆる％値は、配列番号1のアミノ酸配列またはその対応部分（アミノ酸残基1～1208、アミノ酸残基1～681、またはアミノ酸残基329～541など）に関係する。配列一致（親タンパク質と、その誘導体で親配列と比べて欠失、付加、および／または置換を有するものの比較を含む）を明らかにする方法とアルゴリズムは当業者に周知である。DNAレベルでは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも約95％一致した配列を共有するSタンパク質またはその一部をコードする核酸配列は、遺伝暗号の縮重と場合によるコドン最適化が理由で異なっている可能性がある。
本発明によれば、DNAワクチンは、ある実施形態では、N末端からC末端まで、少なくともSARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部とエンハンサー配列（補体ペプチド配列など、より好ましくは補体タンパク質C3d（配列番号4）の3つのコピーであり、好ましくはその3つのC3dのそれぞれはGSリンカーによって隔てられている（3C3d；配列番号5））をコードする真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株を含むことができる。このような配列は液性免疫応答を増強すること、特により強い抗体応答を誘導することが記載されている。SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部が、SARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメイン、SARS-CoV-2 Sタンパク質サブユニットS1、またはSARS-CoV-2 Sタンパク質RBDを含む場合には、真核生物発現カセットは、好ましくはSARS-CoV-2 Sタンパク質部分に融合された三量体化ドメイン（C末端T4フィブリチン三量体化モチーフ（配列番号10）など）をさらにコードすることができる。したがってある実施形態では、DNAワクチンは、N末端からC末端まで、SARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメイン、SARS-CoV-2 Sタンパク質サブユニットS1、またはSARS-CoV-2 Sタンパク質RBD（好ましくはSARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメイン）を含むSARS-CoV-2 タンパク質またはその一部、三量体化ドメイン、および場合によりエンハンサー配列（補体ペプチド配列など）を少なくともコードする真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株も含むことができる。
代表的なエンハンサー配列（MHCクラスIまたはIIの分子それぞれにおいて抗原の提示を促進するためのユビキチンペプチド配列または補体ペプチド配列など）は本分野で知られている。MHCクラスI抗原とユビキチンペプチドをコードしていてチフス菌によってマウスに送達されるプラスミドベクターは、B16腫瘍チャレンジモデルにおいて抗原特異的T細胞応答と腫瘍制御を増強することが実証されている（Xiang et al, PNAS, 2000）。DNAベクターによってコードされるB細胞エピトープに対する抗体応答は、B細胞と濾胞樹状細胞の表面に見られるCR2（CD21）受容体に結合して抗原特異的B細胞活性化を増強する補体タンパク質C3dのペプチドの3つのコピーを導入することによって増強されることが示されている（Moveseyan, J Neuroimmunol, 2008；Yang, Virus Res, 2010；Hou, Virology J, 2019）。したがってB細胞応答を増強するため、補体ペプチド配列（補体タンパク質C3d（KFLTTAKDKNRWEDPGKQLYNVEATSYA；配列番号4）の3つのコピーなど）をSARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部をコードする配列のC末端に付加することができる。これら3つの28アミノ酸ペプチドはGSリンカー（配列番号5のGS(G4S)2GSなど）によって隔てられることが好ましい（3C3d）。さらに、少なくとも細胞質からのSARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部をコードする真核生物発現カセットを含むDNA分子（プラスミドなど）の核移行を改善するため、DNA分子はDNA核標的配列（SV40 DNA核標的配列（DTS；配列番号16）の1つ以上のコピー（好ましくはDTSの2つ以上のコピー）など）をさらに含むことができる。
本発明のDNAワクチンは別のSARS-CoV-2タンパク質またはその一部（好ましくはSARS-CoV-2 Nタンパク質またはその一部）をさらにコードすることができる。好ましい実施形態では、SARS-CoV-2 Nタンパク質またはその一部は、配列番号8またはその一部の配列、または配列番号8またはその対応する部分と少なくとも95％一致した配列を有する配列を含む。SARS-CoV-2 Nタンパク質またはその一部は、配列番号8の配列と少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％一致した配列を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。一実施形態では、SARS-CoV-2 Nタンパク質またはその一部は、配列番号8またはその対応する部分の配列と少なくとも98％～100％一致した配列を有するアミノ酸配列を有する。さらなる一実施形態では、SARS-CoV-2 Nタンパク質またはその一部は、SARS-CoV-2のバリアント（系統B.1.1.7、B.1.351、またはP.1など）のアミノ酸配列も有することができる。
別のSARS-CoV 2タンパク質またはその一部は、スパイク（S）タンパク質またはその一部とは異なるCOVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）タンパク質を少なくともコードする真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株を含むさらなるDNAワクチンによって発現させることができる。これら2つのDNAワクチンは、SARS-CoV-2 Sタンパク質と前記別のSARS-CoV-2タンパク質に対する免疫応答を誘導するため同時投与することができる。あるいは別のSARS-CoV 2タンパク質またはその一部は、その別のSARS-CoV-2タンパク質をコードする第2のDNA分子をさらに含む本発明のDNAワクチンによって発現させることができる。したがってDNAワクチンは、少なくともCOVID-19 コロナウイルス（SARS-CoV-2）タンパク質スパイク（S）タンパク質またはその一部をコードする真核生物発現カセットを含む第1のDNA分子と、そのスパイク（S）タンパク質またはその一部とは異なるCOVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）タンパク質を少なくともコードする真核生物発現カセットを含む第2のDNA分子とを含むチフス菌Ty21a株を含む。第1と第2のDNA分子はプラスミドであることが好ましく、発現プラスミドであることが好ましい。プラスミドは同じプラスミドベクター骨格（pVAX10骨格など）を有することがより好ましい。別のSARS-CoV-2タンパク質またはその一部を、SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部をコードする第1の発現カセットと、別のSARS-CoV-2タンパク質またはその一部をコードする第2の発現カセットとを含む同じDNA分子によって発現させることも考えられる。これらすべての実施形態は、前に言及した実施形態と自由に組み合わせることができ、特に、少なくともSARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部をコードしていて場合によりエンハンサー配列および／または三量体化ドメインを含む発現カセットがさらに規定される。
DNA分子は、SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部と、別のSARS-CoV-2タンパク質またはその一部とをコードする真核生物発現カセットを含むことがさらに考えられる。したがってある実施形態では、DNAワクチンは、少なくともCOVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部と、別のCOVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）タンパク質（構造または非構造）とをコードする真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株を含む。SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部はN末端で発現し、別のSARS-CoV-2タンパク質またはその一部はC末端で発現することが好ましい。以下の実施形態は、前に言及した実施形態と自由に組み合わせることができ、特に、少なくともSARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部をコードしていて場合によりエンハンサー配列および／または三量体化ドメインを含む発現カセットがさらに規定される。好ましい一実施形態では、DNAワクチンは、COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部と、COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）Nタンパク質またはその一部とを少なくともコードする真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株を含む。SARS-CoV-2 Nタンパク質またはその一部は、配列番号8またはその一部の配列、または配列番号8またはその対応する部分と少なくとも95％一致した配列を有する配列を含むことができる。SARS-CoV-2 Nタンパク質またはその一部は、配列番号8の配列と少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％一致した配列を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。一実施形態では、SARS-CoV-2 Nタンパク質またはその一部は、配列番号8またはその対応する部分の配列と少なくとも98％～100％一致した配列を有するアミノ酸配列を有する。一実施形態では、SARS-CoV-2 Nタンパク質またはその一部は、SARS-CoV-2のバリアント（系統B.1.1.7、B.1.351、またはP.1など）のアミノ酸配列も有することができる。SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部は、2A自己切断ペプチド（2Aペプチド）または内部リボソーム侵入部位（IRES）を介して、好ましくは2Aペプチドを介して別のSARS-CoV-2タンパク質に連結させることができる。2Aペプチドの例は、GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号6）のアミノ酸配列を有するP2a、またはGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号7）のアミノ酸配列を有するT2aである。
本発明によれば、DNAワクチンは、N末端からC末端まで、SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部、2AペプチドまたはIRES配列、および別のSARS-CoV-2タンパク質またはその一部（好ましくはSARS-CoV-2 Nタンパク質またはその一部）を少なくともコードする真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株を含むことができる。別のSARS-CoV-2タンパク質またはその一部の後には、特にSARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部がSARS-CoV-2タンパク質サブユニットS1である場合には、SARS-CoV-2タンパク質サブユニットS2をさらに続けることができる。ある実施形態では、SARS-CoV-2タンパク質サブユニットS2は、配列番号1のアミノ酸残基686～1208、または配列番号1のアミノ酸残基686～1208と少なくとも95％一致した配列を含む。一実施形態では、サブユニットS2は、配列番号1のアミノ酸残基686～1273、または配列番号1のアミノ酸残基686～1273と少なくとも95％一致した配列を含む。
別のSARS-CoV-2タンパク質またはその一部の前にはさらにエンハンサー配列（ユビキチン配列など）があってもよい。ユビキチンはマウスとヒトの間で保存されており、アミノ酸配列MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDY NIQKESTLHLVLRLRG（配列番号9）を有する。理論に囚われなければ、N末端ユビキチン配列は抗原のT細胞応答を増強する可能性がある。したがって、N末端からC末端まで、SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部、2AペプチドまたはIRES配列、ユビキチン配列、および別のSARS-CoV-2タンパク質またはその一部（好ましくはSARS-CoV-2 Nタンパク質またはその一部）を少なくともコードし、場合によりその後にSARS-CoV-2タンパク質サブユニットS2が続く真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株を含むDNAワクチンも考えられる。
Nタンパク質は主にT細胞応答を誘導すると考えられる。MHCクラスI抗原とユビキチンペプチドをコードしていてチフス菌によってマウスに送達されるプラスミドベクターは、B16腫瘍チャレンジモデルにおいて抗原特異的T細胞応答と腫瘍制御を増強することが実証されている（Xiang et al, PNAS, 2000）。したがってT細胞増強配列は、好ましくはN末端で別のSARS-CoV-2タンパク質またはその一部（SARS-CoV-2 Nタンパク質またはその一部など）に融合させることができる。
「2A自己切断ペプチド」、「2A切断部位」、または「2Aペプチド」という用語は本明細書では同義語として用いられ、細胞内で組み換えタンパク質の切断を誘導できる1つのクラスのアミノ酸18～22個の長さのペプチドを意味する。2Aペプチドは元々はウイルスのウイルスゲノムの2A領域で見いだされ、1つの発現カセットの中でポリペプチドを発現させるためのツールとして採用された。2Aペプチドを媒介とした切断は、2AペプチドのC末端においてプロリン（P）とグリシン（G）の間のペプチド結合が切れることによって翻訳と切断が開始された後に起こる。2Aペプチドリンカーをコードする配列は本分野で知られており、例えば配列番号6または7で与えられる。
「内部リボソーム侵入部位」という用語はIRESと略され、本明細書では、キャップとは独立なやり方での翻訳開始を可能にするRNAエレメントであり、したがってIRES配列を含むmRNAにおける翻訳もIRES配列の位置で開始される。
別の一実施形態では、少なくともCOVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部をコードする真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株を含むDNAワクチン（ただしCOVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部は、SARS-CoV-2 Sタンパク質の少なくとも3個の免疫優性エピトープを含む）。一実施形態では、発現カセットは、SARS-CoV-2 Sタンパク質の少なくとも3個の免疫優性エピトープとエンハンサー配列（上記のような補体ペプチド配列など）をコードする。
「SARS-CoV-2 Sタンパク質の少なくとも3個の免疫優性エピトープ」という表現は、本明細書では、合わせてSARS-CoV-2 Sタンパク質の3個以上の免疫優性エピトープを含む1つのポリペプチドまたは2つ以上のポリペプチドを意味する。SARS-CoV-2 Sタンパク質の3個以上の免疫優性エピトープが同じポリペプチドの一部であるか異なるポリペプチドの一部であるかは重要でない。したがってSARS-CoV-2 Sタンパク質の3個以上の免疫優性エピトープは、1つのポリペプチドとして、または2つ以上のポリペプチドとして発現させることができる。一実施形態では、真核生物発現カセットは、SARS-CoV-2 Sタンパク質の少なくとも3個の免疫優性エピトープを含む少なくとも1つのポリペプチドをコードする。少なくとも1つ以上のポリペプチドの中に含まれる免疫優性エピトープは、3個以上、5個以上、10個以上、20個以上、30個以上、50個以上、または50個超の免疫優性エピトープである。本明細書で用いられるチフス菌Ty21a株の文脈では、SARS-CoV-2 Sタンパク質の少なくとも3個の免疫優性エピトープをコードする真核生物発現カセットは、50個までの免疫優性エピトープ、またはそれよりも多い例えば300個までを含む1つのポリペプチドをコードすることができる。（ヒトHLAの中の）MHCクラスIまたはIIの表面にペプチドとして提示される抗原は、典型的には、MHC IIに関しては長さ11～30個のアミノ酸（CD4抗原）、MHC Iに関しては8～10個のアミノ酸（CD8抗原）である。したがって少なくとも1つのポリペプチドの中に含まれる免疫優性エピトープの好ましい範囲は、3～300個、5～300個、10～300個、20～300個、または50～300個の免疫優性エピトープである。したがってポリペプチドは、SARS-CoV-2の他の構造タンパク質（Eタンパク質、Mタンパク質、またはNタンパク質などであり、好ましくはNタンパク質）からの免疫優性エピトープをさらに含むことができる。真核生物発現カセットによって発現されるか、少なくとも1つのポリペプチドの中に含まれるSARS-CoV-2 Sタンパク質の免疫優性エピトープの好ましい範囲は、3～25個、3～20個、または5～15個である。融合した免疫優性エピトープを含む各ポリペプチドは抗原提示細胞の中でタンパク質分解によってエピトープに切断され、HLAを通じて提示されてT細胞応答を誘導する。
SARS-CoV-2のSタンパク質とSARS-CoVは遺伝子がよく似ているため（76％）、SARS-CoVの既存の免疫学的研究（Ahmed et al, Viruses, 2020）を利用してSARS-CoV-2のTエピトープとBエピトープを予測できる可能性がある。T細胞エピトープとB細胞エピトープは、バイオインフォーマティクスのアプローチを利用し、さまざまなHLA分子のMHCクラスIとクラスIIタンパク質に結合するアミノ酸モチーフを認識するための検証されたアルゴリズムを用いて予測できる可能性もある（Grifoni et al, Cell, 2020）。公開リソース（Immune Epitope Database and Analysis Resource（IEDB）、NetMHCPan、およびNetMHCIIPanなど）を利用して推定T細胞エピトープとB細胞エピトープを生成させることができる。これらのアプローチを利用して、エピトープが豊富なSタンパク質の区画を包含するマルチエピトープワクチンを設計できる可能性がある。特に興味深い1つの領域は、ヒト標的細胞上のアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）受容体と相互作用してウイルスの侵入を容易にするSタンパク質の受容体結合モチーフ（RBM）である。SARS-CoVのRBMに対する抗体は中和抗体だがSRS-CoVとSARS-CoC-2のRBMは50％しか一致せず、これら抗体は交差中和しない（Ju et al, BioRxiv, 2020 - 投稿中；Walls et al, Cell, 2020）。
本発明によれば、SARS-CoV-2 Sタンパク質の少なくとも3個の免疫優性エピトープはCD8 T細胞抗原および／またはCD4 T細胞抗原を含むことができる。SARS-CoV-2 Sの少なくとも3個の免疫優性エピトープはCD8 T細胞抗原とCD4 T細胞抗原を含むことが好ましい。
1個の免疫優性エピトープは、典型的には、8～30個のアミノ酸、好ましくは8～20個、より好ましくは8～12個のアミノ酸を有するペプチドである。
SARS-CoV-2 Sタンパク質の免疫優性エピトープを含むワクチンにとって、そのワクチンがSタンパク質の、好ましくはそれに加えてさらなる構造タンパク質（Nタンパク質など）の多数の免疫優性エピトープさえも標的にする場合に有益である。なぜならそうなるとSタンパク質における変異が理由で免疫を回避するリスクが低下するからである。
あるいはいくつかの実施形態では、DNAワクチンは、N末端からC末端まで、SARS-CoV-2 Sタンパク質の少なくとも3個の免疫優性エピトープと場合によりエンハンサー配列、2AペプチドまたはIRES配列、場合によりユビキチン配列、および別のSARS-CoV-2タンパク質またはその一部（好ましくはSARS-CoV-2 Nタンパク質またはその一部）をコードする真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株を含む。SARS-CoV-2 Nタンパク質の部分として、SARS-CoV-2 Nタンパク質の少なくとも3個の免疫優性エピトープが可能である。
少なくともSARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部（SARS-CoV-2 Sタンパク質、完全長 Sタンパク質、Sタンパク質エクトドメイン、Sタンパク質サブユニットS1、またはSタンパク質RBDの3個の免疫優性エピトープなど）のための担体としてチフス菌Ty21aを含む本発明のDNAワクチンの利点は、確立された品質管理アッセイ、抗原をコードするインサート内だけにおけるプラスミドの個別の違い、増殖の不要性、および経口投与を理由とした無菌試験の不要性である。さらに、形質転換に適した発現プラスミドのほか、担体としてのチフス菌Ty21a株により、大きなインサート（完全長Sタンパク質または多数の免疫優性エピトープなど）が可能になる。さらに、2AペプチドまたはIRES配列を介してSARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部に連結される別のSARS-CoV-2タンパク質またはその一部（SARS-CoV-2 Nタンパク質またはその一部など）の導入が可能になる。
SARS-CoV-2 Sタンパク質（または場合によりNタンパク質も）の免疫優性エピトープは、（1つ以上のポリペプチドとして発現する）場合によりリンカーによって隔てられた紐状のビーズとしてプラスミドの中に挿入することができる。リンカーとしてGSリンカー、2A切断部位、またはIRES配列が可能だが、これらに限定されない。生成が速く、品質管理の必要性が限定されているため、SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部をコードする少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株を生成させるための時間は短く、抗原（免疫優性エピトープまたは新たな臨床単離体または変異体を含む）を同定してから例えば15日以内、好ましくは14日以内以下で実現することができる。一晩の培養で十分であり、細菌の収率が高くて正味の収率が1 Lの培養物の中で1011コロニー形成単位（CFU）の範囲であるためアップスケーリングは必要ない。そのため、短い製造時間のほか、低い製造コストが可能になる。さらに、この薬製品は少なくとも3年間安定であることが示された。したがってこのDNAワクチンは、有効なSARS-CoV-2予防用および／または治療用ワクチンを、それを必要とする多数の対象で使用するために迅速に開発して製造するのに適している。さらに、これは保管が容易であり、投与するのに訓練された医療スタッフを必要としない。
少なくともSARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部をコードするDNA配列は、リンカー（GSリンカー、2A切断部位、またはIRES配列が可能だがこれらに限定されない）を用いて別のSARS-CoV-2タンパク質またはその一部をコードするDNA配列から隔てることができる。
タンパク質の中の免疫優性エピトープを検出し、自家ヒト白血球抗原（HLA）分子に高親和性で結合するペプチドを信頼性よく予測して明らかにする方法は本分野で知られている。その後、患者の自家HLA-AまたはHLA-Bタンパク質に結合する可能性が大きいと予測されるペプチド、または集団内で優勢なペプチドが選択される。これは、例えば生体外インターフェロンγ酵素結合immunospot（ELISPOT）によって確認することができる。
ある実施形態では、DNA分子、または少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子は、抗生剤耐性遺伝子（カナマイシン抗生剤耐性遺伝子など）、ori（pMB1 oriまたはpUCなど）、および強力なプロモータ（CMVプロモータなど）を含む。特別な一実施形態では、DNA分子、または少なくとも1つの真核生物発現カセットを含むDNA分子は、プラスミド（市販のpVAX1（商標）発現プラスミド（Invitrogen、サン・ディエゴ、カリフォルニア州）に基づくか由来するプラスミドなど）である。
この発現プラスミドベクターは、高コピーのpUC複製起点をpBR322の低コピーのpMB1複製起点で置き換えることによって改変することができる。低コピー改変は、代謝負荷を減らし、コンストラクトをより安定にするためになされた。生成した発現プラスミドベクター骨格をpVAX10と名づけた。
発現ベクターは、MHCクラスIまたはII分子における抗原の提示を促進するためエンハンサー（ユビキチンまたは補体など）を含有する設計にすることもできる。MHCクラスI抗原とユビキチンペプチドをコードしていてチフス菌によってマウスに送達されるプラスミドベクターは、B16腫瘍チャレンジモデルにおいて抗原特異的T細胞応答と腫瘍制御を増強することが実証されている（Xiang et al, PNAS, 2000）。DNAベクターによってコードされるB細胞エピトープに対する抗体応答は、B細胞と濾胞樹状細胞の表面に見られるCR2（CD21）受容体に結合して抗原特異的B細胞活性化を増強する補体タンパク質C3d（配列番号4）の3つのコピーを含めることによって増強されることが示されている（Moveseyan, J Neuroimmunol, 2008；Yang, Virus Res, 2010；Hou, Virology J, 2019）。
単一のプラスミドベクターを用いて多数の遺伝子の翻訳を容易にするのにいくつかの方法（内部リボソーム侵入部位（IRES）（Ma et al, Hum Vaccin Immunother, 2013）または2Aペプチド（Liu et al, Scientific Reports, 2017）をペプチド遺伝子配列の間に挿入することが含まれる）が利用されてきた。
特別な実施形態では、発現プラスミドは配列番号2のDNA分子（ベクター骨格pVAX10）を含んでおり、これは制限部位NheIとXhoIの間に位置する多重クローニング部位の部分がない発現ベクターpVAX10の配列と相関している。一実施形態では、発現プラスミドは、配列番号2の核酸配列と、配列番号1またはその一部のアミノ酸配列、または配列番号1またはその一部と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列をコードする配列を含む。
配列番号1をコードする核酸配列を有するORFをコードするSARS-CoV-2 Sタンパク質をNheI/XhoIを通じてこの発現ベクター骨格に挿入すると、発現プラスミドが生成した。この発現プラスミドpVAX10.SCV-1は、図2に模式図が示されている。
本発明のDNAワクチンは医薬組成物の形態にすることができる。したがってある実施形態では、少なくともCOVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部をコードする真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株を含むDNAワクチンは、医薬として許容可能な1つ以上の賦形剤をさらに含む。ある実施形態では、DNAワクチンは経口剤形である。本発明のDNAワクチンは、溶液、懸濁液の形態、または想定される経口での利用に適した他の任意の形態にすることができる。代わりの剤形は、腸溶性コーティングカプセルまたは凍結乾燥粉末である。典型的には、本発明のDNAワクチンは、飲料溶液として、好ましくは懸濁液として、より好ましくは水性懸濁液として提供される。この実施形態は、改善された患者のコンプライアンスという利点を提供し、迅速で実現可能で手頃な大規模ワクチン接種プログラムを特に貧しい地域で可能にする。
本発明により、本発明のDNAワクチンを含む医薬組成物も提供される。
本発明の文脈では、「賦形剤」という用語は、医薬の活性成分とともに製剤化される天然または合成の物質を意味する。適切な賦形剤に含まれるのは、溶媒、付着防止剤、結合剤、コーティング、崩壊剤、香料、着色剤、潤滑剤、流動促進剤、吸着剤、保存剤、および甘味剤である。
本発明の文脈では、「医薬として許容可能な」という表現は、生理学的に忍容可能で典型的には哺乳類（例えばヒト）に投与されたときに望まない反応を生じさせない分子化合物と医薬組成物の他の成分を意味する。「医薬として許容可能な」という表現は、連邦または州政府の規制当局によって承認されていること、またはアメリカ薬局方か、哺乳類、より厳密にはヒトで使用するための他の一般に認められている薬局方に掲載されていることも意味することができる。
ある実施形態では、本発明のDNAワクチンまたは医薬組成物は、腸溶性コーティングカプセル、凍結乾燥粉末、または懸濁液の形態である。適切な懸濁液は、胃酸を少なくともある程度中和する手段、すなわち胃酸のpHをpH 7に近づける手段を含む。したがってある実施形態では、懸濁液は、本発明のサルモネラの弱毒化株を適切なバッファに、好ましくは胃酸を少なくともある程度中和するバッファに、好ましくは2.6 gの炭酸水素ナトリウム、1.7 gのL-アスコルビン酸、0.2 gのラクトース一水和物、および100 mlの飲料水を含有するバッファに懸濁させることによって得られる緩衝化懸濁液である。
ある実施形態では、本発明の医薬組成物のDNAワクチンは1つ以上のアジュバントをさらに含む。
本発明の文脈では、「アジュバント」という用語は、活性剤、すなわち本発明のサルモネラの弱毒化株の効果を変化させる薬剤を意味する。アジュバントは抗原に対する免疫応答を増強することができ、そのことによって投与される抗原の量を最少にすることが可能になる。
本発明の文脈では、「ワクチン」という用語は、投与されると対象で免疫応答を誘導することのできる薬剤を意味する。ワクチンは疾患を予防、改善、または治療できることが好ましい。本発明のワクチンはチフス菌の生弱毒化株であるチフス菌Ty21aを含む。本発明のワクチンはDNAワクチンであり、したがって少なくともCOVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部をコードする真核生物発現カセットを含むDNA分子の少なくとも1つのコピーをさらに含む。
「DNAワクチン」または「DNAワクチン接種」という用語は、本明細書では、免疫応答をさせようとする抗原（SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部など）をコードする遺伝子操作された直線状DNAを、好ましくはそのDNA配列を含有するプラスミドを、それを必要とする患者の標的細胞に送達することにより疾患または感染症から保護するか、疾患または感染症を治療するためのワクチンを意味する。したがって抗原は標的細胞によって産生されて免疫応答を誘導する。DNAワクチンは従来のワクチンと比べて潜在的な利点を持ち、利点には、より広いタイプの免疫応答（液性免疫応答および／または細胞を媒介とした免疫応答など）を誘導する能力が含まれる。プラスミドはいくつかの方法（生理食塩水中の注射液、遺伝子銃、リポソームの使用、または担体（細菌ベクターとウイルスベクターなど）によることが含まれる）で組織に送達することができる。本発明のDNAワクチンは、少なくともCOVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部をコードする真核生物発現カセットを含むDNA分子を送達するための担体としてのチフス菌Ty21a株を含む。生弱毒化チフス菌Ty21a株によって送達されるDNA分子はプラスミドであることが好ましい。
本発明の生弱毒化サルモネラ株は少なくともCOVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部をコードするDNA分子を安定に担持する。これは、このDNA分子を経口送達するための媒体として使用できる。異種抗原（SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部など）をコードするDNA分子を含むこのような送達プラスミドベクターを本発明の文脈ではDNAワクチンと呼ぶ。
遺伝子免疫化（genetic immunization）は従来のワクチン接種よりも有利である可能性がある。標的DNAはかなりの期間にわたって検出できるため、抗原のデポとして機能する。いくつかのプラスミドの中の配列モチーフ（GpC島など）は免疫刺激性であり、LPSと他の細菌構成成分に起因する免疫刺激によって促進されるアジュバントとして機能することができる。
生弱毒化サルモネラプラスミドベクター（チフス菌Ty21aなど）はそれ自身の免疫調節因子（リポ多糖（LPS）など）をその場で産生し、それが他の投与形態（マイクロカプセル化など）と比べた利点を構成する可能性がある。さらに、本発明の粘膜DNAワクチンはコロナウイルスの天然侵入部位を利用しており、それが有益であると証明される可能性がある。粘膜ワクチン接種はリンパ内作用モードを有する。本発明の弱毒化ワクチンが取り込まれた後、改変された細菌が腸のパイエル板の中のマクロファージと他の細胞に侵入する。細菌はこれら食細胞に取り込まれる。チフス菌Ty21株の細菌はその弱毒化変異が理由でこれら食細胞の中で生き延びることができず、この時点で死ぬ。DNA分子が細菌とエンドソームから放出され、その後特別な輸送系を通じて、またはエンドソーム漏出によって食免疫細胞のサイトゾルに移される。最終的に組み換えDNA分子は核に入り、その場所で転写され、食細胞の中でSARS-CoV-2 Sタンパク質が大量に発現するに至る。感染された細胞はアポトーシスを起こし、Sタンパク質抗原がロードされ、腸の免疫系によって取り込まれて処理される。細菌感染の危険シグナルはこのプロセスにおいて強力なアジュバントとして機能し、全身区画と粘膜区画の両方のレベルでの強力な抗原特異的CD8+ T細胞応答と抗体応答に至る。リンパ内粘膜ワクチン接種経路は、大規模ワクチン接種と、粘膜経路の侵入を利用する病原体（コロナウイルスなど）で特に有用である。
真核生物プラスミドを含有するサルモネラワクチンは、このプラスミドによってコードされる抗原に対するB細胞応答を生じさせることができる。抗原であるリステリオリシンまたはActAをコードするpCMVb真核生物発現ベクターを含有するチフス菌で経口免疫化したマウスでは、抗原特異的抗体を免疫化の4週間後までに血清中で検出することができた（Darji et al, Cell, 1997；Darji et al, FEMS Immunol Med Microbiol, 2000）。
ワクチン株チフス菌Ty21aは比類のない安全実績の記録を有する。チフス菌Ty21aが全身血流に入りうることを示す入手可能なデータは存在しない。したがって生弱毒化チフス菌Ty21aワクチン株により、安全かつ忍容性が良好でありつつ、腸の免疫系を特異的に標的とすることが可能になる。逆に、アデノウイルスに基づくDNAワクチンは予期しないウイルス複製という固有のリスクを有する可能性がある。それに加え、アデノウイルスに対する既存の免疫はヒトでワクチンの有効性を制限することが示された。
本明細書では、コロナウイルス疾患2019（COVID-19）またはSARS-CoV-2感染症の治療および／または予防に使用するための本発明のDNAワクチンも提供される。本明細書では、コロナウイルス疾患2019（COVID-19）またはSARS-CoV-2感染症を治療および／または予防する方法として、本発明のDNAワクチンを、それを必要とする患者に投与することを含む方法も提供される。
ヒスタミン、ロイコトリエン、またはサイトカインによって媒介される過敏反応に似た有害事象が発生した場合には、発熱、アナフィラキシー、血圧不安定性、気管支痙攣、および呼吸困難に関する治療の選択肢を利用できる。望まないT細胞由来の自己攻撃の場合の治療の選択肢は、幹細胞移植の後の急性と慢性の移植片対宿主病において適用される標準治療スキームに由来する。シクロスポリンとグルココルチコイドが治療の選択肢として提案される。
全身性チフス菌Ty21aタイプの感染症というありそうもない場合には、例えばフルオロキノロン系（シプロフロキサシンまたはオフロキサシンが含まれる）を用いた適切な抗生剤療法が推奨される。胃腸管の細菌感染はそれぞれの薬剤（リファキシミンなど）で治療すべきである。
好ましい実施形態では、少なくともCOVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部をコードする真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株を含む本発明のDNAワクチンは経口投与される。経口投与は非経口投与よりも簡単で、安全で、より快適である。本発明のDNAワクチンは適切な他の任意の経路で投与することもできるが、経口経路が好ましい。治療に有効な用量が対象に投与されることが好ましいが、この用量は具体的な用途（特にDNAワクチンが治療用であるか予防用であるか、対象の体重、年齢、性別、および健康状態、投与様式、および製剤など）に依存する可能性がある。投与は必要に応じて単回または複数回にすることができる。
本発明のDNAワクチンは、溶液、懸濁液、凍結乾燥物、腸溶性コーティングカプセル、または適切な他の任意の形態で提供することができる。典型的には、本発明のサルモネラの弱毒化株は飲料溶液として製剤化される。この実施形態は改善された患者のコンプライアンスを提供する。飲料溶液は胃酸を少なくともある程度中和する手段、すなわち胃酸のpHをpH 7に近づける手段を含むことが好ましい。飲料溶液は本発明のサルモネラの弱毒化株を含む緩衝化懸濁液であることが好ましい。特別な一実施形態では、緩衝化懸濁液は本発明のサルモネラの弱毒化株を、好ましくは2.6 gの炭酸水素ナトリウム、1.7 gのL-アスコルビン酸、0.2 gのラクトース一水和物、および100 mlの飲料水を含有する適切なバッファに懸濁させることによって得られる。
特別な実施形態では、COVID-19またはSARS-CoV-2感染症の治療および／または予防は、さらなるSARS-CoV-2ワクチンまたは抗SARS-CoV-2治療の投与をさらに含むことができる。COVID-19および／またはSARS-CoV-2感染症の治療および／または予防は、少なくとも別のSARS-CoV 2タンパク質またはその一部（COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）エンベロープ（E）タンパク質、膜（M）タンパク質、またはヌクレオカプシド（N）タンパク質、またはその一部など、好ましくはSARS-CoV-2 Nタンパク質またはその一部）をコードする真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌Ty21a株を含むDNAワクチンをさらに含むことができる。これら2つのDNAワクチンは同時に投与すること、または順番に投与することができるが、2つのDNAワクチンを同時に投与することが好ましい。
ある実施形態では、COVID-19および／またはSARS-CoV-2感染症の治療および／または予防は、SARS-CoV-2に対するプライム／ブーストワクチン接種を含む。本発明の文脈では、「プライム／ブーストワクチン接種」という用語は、プライムワクチン接種とその後の少なくとも1回のブーストワクチン接種で対象を免疫化することを含む免疫化計画を意味する。好ましい実施形態では、プライムワクチンとブーストワクチンは同じである；すなわちプライム／ブーストワクチン接種は同種プライム／ブーストワクチン接種である。特に、本発明のDNAワクチンはプライムワクチンおよびブーストワクチンとして投与される。他の実施形態では、プライムワクチンとブーストワクチンは同じ病原体に対する異なるタイプのワクチンである；すなわちプライム／ブーストワクチン接種は異種プライム／ブーストワクチン接種である。ある実施形態では、本発明のDNAワクチンはプライムワクチンとして投与することができ、さらなるSARS-CoV-2ワクチンはブーストワクチンとして投与される。特別な他の実施形態では、さらなるベータコロナウイルスワクチンがプライムワクチンとして投与され、本発明の弱毒化サルモネラ株はブーストワクチンとして投与される。プライム／ブーストワクチン接種は単回のプライムワクチン接種だけを用いたワクチン接種よりも優れた免疫応答を誘導できる可能性がある。改善された初期T細胞応答、抗体応答、および／または免疫応答の長期持続をプライム／ブーストワクチン接種によって実現できる可能性がある。
ある実施形態では、本発明のプライムとブーストのDNAワクチンの投与は、連続した8週間以内、さらに特定すれば連続した3～6週間以内になされる。プライムワクチンとブーストワクチンは同じ経路または異なる経路で投与することができる。本発明のプライムとブーストのDNAワクチンは同じ経路で投与されることが好ましく、より好ましくはプライムとブーストのDNAワクチンは経口投与される。また、本発明のDNAワクチンは同じ用量または異なる用量で1回または数回投与することができる。プライム／ブーストワクチン接種計画を最適化すること（ワクチン投与のタイミングと用量の最適化が含まれる）は当業者の能力の範囲内である。
特別な実施形態では、単回用量のDNAワクチンは本発明のチフス菌Ty21a株を約105～約1011または約1×106～約1×1010、より好ましくは約1×106～約1×109、約1×106～約1×108、または約1×106～約1×107コロニー形成単位（CFU）で含む。一実施形態では、単回用量のDNAワクチンはチフス菌Ty21a株を約1×106～約1×109コロニー形成単位（CFU）で含む。低用量のこの生弱毒化細菌DNAワクチンの投与は、排出のリスク、したがって第三者への伝染のリスクを最少にする。1×109 CFU未満では排出をまったく検出できないことが以前に示されている。
この文脈において、「約」または「大まかに」という用語は、所与の値または範囲の3倍以内、あるいは2倍以内（1.5倍以内が含まれる）を意味する。
ある実施形態では、COVID-19またはSARS-CoV-2感染症の治療および／または予防は本発明のDNAワクチンの多数回投与を含む。DNAワクチン投与の単回用量は同じでも異なっていてもよいが、単回用量は同じであってチフス菌Ty21a株を約1×106～約1×109コロニー形成単位（CFU）で含むことが好ましい。特にCOVID-19またはSARS-CoV-2感染症の治療および／または治療は、本発明のDNAワクチンの1、2、3、4、5、または6回の投与を含む。COVID-19またはSARS-CoV-2感染症の治療および／または治療は、プライミングのため（プライムワクチン接種として）DNAワクチンを1週間に2～4回投与し、場合によりその後に1回以上の単回用量ブースティングを実施することを含むことが好ましい。ある実施形態では、DNAワクチンを（プライムワクチン接種として）最初の1週間以内に2～4回投与した後、（ブーストワクチン接種として）1回以上の単回用量ブースティングをそれぞれ少なくとも2週間後に実施する。すなわち最初の週のプライムワクチン接種と3週目以降の単回用量ブーストワクチン接種、場合によりそれに続けて少なくとも2週間後に1回（またはより多数回）のさらなる単回用量ブーストワクチン接種を実施する。代わりの一実施形態では、DNAワクチンを（プライムワクチン接種として）最初の1週間以内に2～4回投与した後、（ブーストワクチン接種として）1回以上の単回用量ブースティングをそれぞれ少なくとも4週間後に実施する。すなわち最初の週のプライムワクチン接種と5週目以降の単回用量ブーストワクチン接種、場合によりそれに続けて少なくとも4週間後に1回（またはより多数回）のさらなる単回用量ブーストワクチン接種を実施する。
実施例1：組み換えプラスミドpVAX10.SCV-1の調製
SARS-CoV-2 Sタンパク質（1273個のアミノ酸、配列番号1）をコードするDNAをpVAX10.VR2-1に由来するpVAX10骨格にクローニングする（WO 2013/091898）。Sタンパク質DNA断片を二本鎖遺伝子合成によって生成させるが、そのとき耐熱リガーゼを用いてオリゴヌクレオチドを互いに連結させる。得られた連結産物をPCRによって増幅する。増幅後、そのインビトロで合成されたSタンパク質DNA断片を、NheI/XhoIを通じてpVAX10骨格にクローニングする（組み換えプラスミドpVAX10.VR2-1のVEGFR-2コード領域がSタンパク質コード領域で置き換えられる）。品質管理のため、大腸菌に入れて形質転換した後にプラスミド全体をシークエンシングし、それぞれの参照配列とアラインメントし、エラーがないことを確かめる。得られたプラスミドをpVAX10.SCV-1と名づける（図2）。他の適切なコンストラクトは図3に示されている。
実施例2：組み換えプラスミドpVAX10.SCV-1を用いた弱毒化サルモネラ株の形質転換
チフス菌Ty21aをプラスミドpVAX10.SCV-1で形質転換する。形質転換は電気穿孔によって実施する。
コンピテントサルモネラ細胞の調製：
チフス菌Ty21aのグリセロール培養物をLBプレート（動物成分なしの[ACF]ダイズペプトン）に接種した。プレートを37℃で一晩インキュベートした。1つのコロニーを一晩-液体-予備培養に使用した。1つのコロニーを接種された3 mlのLB培地（ACFダイズペプトン）を37℃で180 rpmにて一晩インキュベートした。コンピテント細胞を調製するため、2×300 mlのLB培地（ACFダイズペプトン）に3 mlの一晩培養物を接種し、37℃で180 rpmにてOD600が約0.5になるまでインキュベートした。次いでこれら培養物を氷の上に10分間置いた。その後、この細菌を4℃にて3000×gで10分間遠心分離し、各ペレットを500 mLの氷冷H2Odestの中に再懸濁させた。新たな遠心分離工程の後、細菌ペレットを10％の氷冷グリセロールで2回洗浄した。両方のペレットを2 mlの10％グリセロールの中にまとめて入れ、最終的にドライアイス上で凍結させて50 μLの複数のアリコートにした。使用したグリセロールは動物成分をまったく含有していなかった（Sigma Aldrich、G5150）。
コンピテントサルモネラ細胞の形質転換：
それぞれの形質転換反応のため、コンピテントチフス菌Ty21a細胞の1つの50 μlのアリコートを氷上で10分間解凍する。3～5 μLのプラスミドDNA pVAX10.SCV-1を添加した後、この混合物を氷上で5分間インキュベートする。その後、この混合物をあらかじめ冷やしておいたキュベット（厚み1 mm）に移した。電気パルスを12.5 kV/cmで印加する。その直後、1 mlのLB培地（ACFダイズペプトン）を細胞に添加し、その細胞を2 mlのエッペンドルフ管に移し、37°Cで1時間震盪する。ベンチ遠心分離機上での短い遠心分離工程（16600 rcf、20秒間）の後、細菌ペレットを200 μlのLB（ACFダイズペプトン）無抗生剤培地の中に再懸濁させる。この混合物を、Drigalskiスパチュラを用い、カナマイシン（濃度＝25 μg/mlまたは50 μg/ml）を含有するLBプレート（ACFダイズペプトン）に塗布する。プレートを37℃で一晩インキュベートする。
組み換えサルモネラクローンのプラスミド調製：
組み換えチフス菌Ty21a株の3つのクローンを、カナマイシン（50 μg/ml）を含有する3 mlのLB培地（ACFダイズペプトン）の中で37℃にて一晩インキュベートする。次いでこの細菌培養物を遠心分離（16600 rcf、30秒間）によってペレット化する。Macherey-NagelからのNucleoSpinプラスミドキットを用いてプラスミドの単離を実施する。50 μlの水を用いてプラスミドDNAをシリカゲルカラムから溶離させる。5 μlの溶離液をアガロースゲル電気泳動において対照として使用する。
長期にわたって保管するため、陽性クローンのグリセロール培養物を1 ml作製する。この目的で、1 low mlのスクリューマイクロチューブの中で172 μlのグリセロール（動物成分なし）を対数増殖期の3 mlの培養物の培地828 μlに添加する。サンプルは、あとで使用するまで-70℃で保管する。
サルモネラから単離された組み換えプラスミドDNAの完全なシークエンシング：
3 mlの液体LB-Kan培地（ACFダイズペプトン）に組み換えサルモネラ（チフス菌Ty21aを有するpVAX10.SCV-1）の1つのコロニーを接種し、37℃で180 rpmにて一晩インキュベートする。この一晩培養物をベンチ遠心分離機（Biofuge pico, Heraeus）上で1300 rpmにて30秒間遠心分離することによりペレット化する。Macherey-NagelからのNucleoSpinプラスミドキットを用いてプラスミドの単離を実施する。アルカリ溶解させ、高分子量ゲノムDNAおよび細胞構成成分を沈降させた後、プラスミドDNAを、シリカ膜を有するカラムにロードする。洗浄工程の後、50 μlの減菌水を用いてプラスミドをカラムから溶離させ、シークエンシングする。次いで配列を、クローン特異的アラインメントによってそれぞれの参照配列と比較する。すなわち各サルモネラクローンのプラスミド配列を1つずつ参照配列とアラインメントさせ、すべての配列がそれぞれの参照配列と揃っているかをチェックする。この組み換えサルモネラ株をVXM-SCV-1（チフス菌Ty21aを有するプラスミドpVAX10.SCV-1）と名づける。
実施例3：VXM-SCV-1の大規模製造
WO2013/091898に記載されているようにして細菌発酵を実施する。下流プロセシングは、透析、希釈、および充填からなる。1回の100 l発酵ランによって1～10×1010 CFU/mlのワクチンが大まかに5リットル生成する。ワクチンを適切なアリコートの中でさらに希釈し、-70℃で保管する。アリコートはドライアイスに載せて輸送することができる。現場でアリコートを適用バッファの中に希釈し、すぐに使用できるワクチンにする（100 mlの飲料溶液、バルクで調製）。
実施例4：臨床前研究の設計 - 健康なマウスにおいてVXM-SCV-1によって誘導される免疫応答の評価
健康なC57Bl/6マウス、BALBcマウス、またはCD1マウスにおけるSARS-CoV-2に対する免疫応答を抗体ELISAによって評価する。マウスにプラスミドpVAX10.SCV-1を含有するチフス菌（108-109 CFU／用量）をワクチン接種する。プラスミドpVAX10.SCV-1を含有するチフス菌は、チフス菌Ty21aに関して上に記載したようにして調製する。陰性対照としてプラスミドベクター対照群（発現プラスミドを含まない1用量のチフス菌につき108～1010 CFU）を研究設定に含め、望む免疫効果を、サルモネラなしのプラスミドベクターによって起こるあらゆる非特異的バックグラウンド刺激から識別する。免疫モニタリングをワクチン接種後の1つ以上の時点で実施する。
1．動物の飼育管理
受け入れ時に6週齢の健康な雌のマウスを、手続きを開始する前に特定の病原体なし（SPF）動物飼育ユニットにおいて7日間観察する。動物は、温度（23±2℃）、湿度（45±10％）、光周期（12時間の明／12時間の暗）、および換気という制御された条件下の部屋に維持する。動物をSPF条件に維持する。室温と湿度を連続的にモニタする。空気処理システムを14回換気／時にプログラムし、再循環はさせない。一連のフィルタを通じて新鮮な外気を通した後、各部屋に均等に流す。正圧（20±4 Pa）を実験室内で維持して齧歯類コロニー内における汚染または病原体の広がりを阻止する。動物は、餌と水を提供する装備のあるポリカーボネート製ケージ（Techniplast、リモネスト、フランス国）に収容する。使用した標準的な面積のケージは800 cm2であり、最大でケージ1つにつき（同じ群からの）10匹のマウスである。動物の寝床は無菌のトウモロコシ穂軸寝床（ref：LAB COB 12、SERLAB、セルジー-ポントワーズ、フランス国）であり、週に2回交換する。動物の餌はDIETEX（サン-グラティアン、フランス国）から購入する。照射処理されたRM1を殺菌制御された顆粒として使用する。餌は、ゴム製ストッパとシッパーチューブを備える水のボトルから自由に提供される。水のボトルは無菌濾過によって殺菌し、週に2回交換する。0日目、Vivo manager（登録商標）ソフトウエア（Biosystemes、クテルノン、フランス国）を使用し、マウスを個々の体重に従って2つの群に分配する。2つの群の平均体重（その後それぞれ群1～5と群6～10に分割する）は統計的に差がない（分散の分析）。
2．マウスにおける抗体応答の検出
BALBcマウスとCD1マウスを8匹の6つの群に分割する。群1～3のマウスはプラスミドベクター対照の投与を受け、群4～6のマウスはプラスミドpVAX10.SCV-1を含有するチフス菌の投与を受ける。両方のチフス菌株を解凍し、30分以内に投与し、作業溶液は使用後に廃棄する。処置用量は、1回の投与につき100 μl 中に108 CFUである。サルモネラ株は、体積が0.1 mlのカニューレを通じた強制経口投与（経口、PO）によって投与する。動物の群に関係なく、各動物は投与前に胃の酸を中和するため投与前適用バッファを受ける（100 μl／動物／適用）。このバッファは、2.6 gの炭酸水素ナトリウム、1.7 gのL-アスコルビン酸、0.2 gのラクトース一水和物を100 mlの飲料水に溶かすことによって作製し、チフス菌株を適用する前に30分以内に適用する。処置スケジュールは以下の通りである：
群1（n＝8）と群4（n＝8）のマウスは、それぞれ108 CFUのチフス菌の3回のPO投与を2週間ごとに受ける（Q2WK×3）
群2（n＝8）と群5（n＝8）のマウスは、それぞれ108 CFUのチフス菌の毎日のPO投与を、2日ごとに4回連続して受ける（Q2D×4）。
群3（n＝8）と群6（n＝8）のマウスは、それぞれ108 CFUのチフス菌の毎日のPO投与を2日ごとに4回連続して受け（Q2D×4）、次いで2回のブースタを2週間ごとに受ける（Q2WK×2）。
動物の生死と行動を毎日記録し、体重を週に2回測定する。血清を研究の3、4、8、12、16、20、24、および28週目に回収し、分析まで-20℃で保管する。研究終了時、処置したすべての動物で剖検（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、および胃腸管の巨視的検査）を実施する。
簡単に述べると、96ウエルのEIAプレートを、炭酸ナトリウムバッファ（pH 9.5）1ミリリットルにつき1マイクログラム含まれるNまたはSタンパク質エピトープ、または組み換え全NまたはSタンパク質で4℃にて一晩被覆する。翌日、プレートを100ミリモルのトリス-緩衝化生理食塩水／Tween（登録商標）（TBST）で洗浄し、37℃にて3％ゼラチンで1時間ブロックする。プレートをTBSTで徹底的に洗浄した後、血清を各プレートの最上行に添加し、TBSTを用いて各カラムの下方に向かって1：1希釈液を調製する。各プレートには、血清なしの陰性対照カラムが含まれる。プレートを4℃で一晩インキュベートする。現像するため、プレートをTBSTで洗浄し、アルカリホスファターゼに結合したタンパク質G（Calbiochem、アメリカ合衆国）の1：1000希釈液とともに37℃で1時間インキュベートする。OD405をELISAプレートリーダーで測定する。抗体エンドポイント力価は、陰性対照の平均OD405よりも1標準偏差大きいOD405を与えるのに必要な希釈度の逆数として求める。
3．C57BL6マウスまたはBALBcマウスにおけるT細胞応答の検出
BALBcマウスとC57BL6マウスを12匹の6つの群に分割する。群1～3のマウスはプラスミドベクター対照の投与を受け、群4～6のマウスはプラスミドpVAX10.SCV-1を含有するチフス菌の投与を受ける。両方のチフス菌株を解凍して30分以内に投与し、作業溶液は使用後に廃棄する。処置用量は1回の投与につき100 μl 中に108 CFUである。サルモネラ株は、体積が0.1 mlのカニューレを通じた強制経口投与（経口、PO）によって投与する。動物の群に関係なく、各動物は投与前に胃の酸を中和するため投与前適用バッファを受ける（100 μl／動物／適用）。このバッファは、2.6 gの炭酸水素ナトリウム、1.7 gのL-アスコルビン酸、0.2 gのラクトース一水和物を100 mlの飲料水に溶かすことによって作製し、チフス菌株を適用する前に30分以内に適用する。処置スケジュールは以下の通りである：
群1（n＝12）と群4（n＝12）のマウスは、それぞれ108 CFUのチフス菌の3回のPO投与を2週間ごとに受ける（Q2WK×3）
群2（n＝12）と群5（n＝12）のマウスは、それぞれ108 CFUのチフス菌の毎日のPO投与を、2日ごとに4回連続して受ける（Q2D×4）。
群3（n＝12）と群6（n＝12）のマウスは、それぞれ108 CFUのチフス菌の毎日のPO投与を2日ごとに4回連続して受け（Q2D×4）、次いで2回のブースタを2週間ごとに受ける（Q2WK×2）。
動物の生死と行動を毎日記録し、体重を週に2回測定する。各群の1/3のマウス（n＝4）を14日目に安楽死させ、1/3（n＝4）を28日目に安楽死させ、残る1/3のマウス（n＝4）を56日目に安楽死させた。終了時に脾臓と血液サンプルを回収した。血液を処理して血清を取得し、分析まで-20℃で保管した。脾臓を処理して単一細胞懸濁液にした。脾臓細胞調製物においてワクチンの免疫原性をIFN-ガンマELISPOTによって評価した。簡単に述べると、脾臓細胞を、抗IFN-ガンマ（0.1 mlの中に500,000個の細胞）であらかじめ被覆したELISPOTプレートのウエルにロードした。NまたはSタンパク質からのペプチドエピトープを1ミリリットル当たり10マイクログラムで二連のウエルに添加した。プレートを37℃で18時間インキュベートした。翌日、AECキット（Sigma、アメリカ合衆国）でプレートを現像し、Immunospotプレートリーダー（Cellular Technologies Ltd、アメリカ合衆国）を用いて個々のIFN-ガンマ分泌細胞を数えた。血清サンプル中の抗体をELISAによって検出した。簡単に述べると、96ウエルのEIAプレートを、炭酸ナトリウムバッファ（pH 9.5）1ミリリットルにつき1マイクログラム含まれるNまたはSタンパク質エピトープ、または組み換え全NまたはSタンパク質で4℃にて一晩被覆した。翌日、プレートを100ミリモルのトリス-緩衝化生理食塩水／Tween（登録商標）（TBST）で洗浄し、37℃にて3％ゼラチンで1時間ブロックした。プレートをTBSTで徹底的に洗浄した後、血清を各プレートの最上行に添加し、TBSTを用いて各カラムの下方に向かって1：1希釈液を調製した。各プレートには、血清なしの陰性対照カラムが含まれていた。プレートを4℃で一晩インキュベートした。現像するため、プレートをTBSTで洗浄し、アルカリホスファターゼに結合したタンパク質G（Calbiochem、アメリカ合衆国）の1：1000希釈液とともに37℃で1時間インキュベートした。OD405をELISAプレートリーダーで測定した。抗体エンドポイント力価は、陰性対照の平均OD405よりも1標準偏差大きいOD405を与えるのに必要な希釈度の逆数として求めた。
4．抗原発現分析
プラスミドpVAX10.SCV-1をマウス3T3細胞とヒト293T細胞にトランスフェクトすることによって抗原発現分析を実施する。感染後24時間と48時間の時点で細胞を回収し、溶解させる。得られた全細胞ライセートをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって分析した後、PVDF膜上のウエスタンブロッティングによって分析する。RNAの発現もRT/PCRによって確認する。
実施例5：臨床前研究 - 健康なマウスにおいてVXM-SCV-3によって誘導される免疫応答の評価
pVAX10-SCV-3プラスミド（インサートSCV-3；配列番号11）は、フーリンドメイン（アミノ酸残基680～683）が除去されたSARS-CoV-2スパイクタンパク質（配列番号1）と、SARS-CoV-2 Nタンパク質（配列番号8）をコードする（アクセッション番号YP_009724397）。これらの抗原は、Thosea asignaウイルスのカプシドタンパク質前駆体に由来する2A自己切断ペプチド配列（配列番号7）によって隔てられる（図3参照）。
pVAX10-SCV-3を含有するチフス菌SL7207ワクチンを電気穿孔によって調製した。コンピテント細菌を氷の上で100～500 ngのプラスミドDNAとともにインキュベートした後、GenePulsar IIの中で2.5キロボルトにて電気穿孔した。細菌をシェイカープレート上のSOC培地の中で37℃にて1時間インキュベートした後、100 uLをTSB寒天プレートに50 ug/mLのカナマイシンとともに37℃にて一晩播種した。個々のコロニーを増殖させ、25％グリセロールの中で-80℃にて凍結させた。
病原体のない雌の4～6週齢のBALBcマウスをCharles River Laboratories（サン・コンスタン、ケベック州、カナダ国）から購入し、施設ガイドラインに従って餌と水を自由に摂取できる状態で収容した。
10匹のマウスの群をSL-SCV-3ワクチンで処置した。各処置のため、マウスを100マイクロリットルの用量の投与バッファ（310ミリモルの炭酸水素ナトリウム、100ミリモルのL-アスコルビン酸、5ミリモルのラクトース一水和物）の強制経口投与によってあらかじめ処置した後、1ミリリットル当たり1.5～2×109 CFUの用量のワクチンを含む投与バッファを100マイクロリットル投与した。マウスを0、2、5、7、21、および35日目に処置した。マウスを研究前（免疫前）とその後は2、4、6、および8週目に出血させた。
ワクチンの効果を、免疫化された動物の血清における抗原特異的抗体レベルの検出を可能にする方法である酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって評価した。簡単に述べると、96ウエルのEIAプレートを4℃にて抗原であるSARS-CoV-2スパイクタンパク質（ACROBiosystems）で一晩被覆し、2％ウシ血清アルブミンを用いて37℃で1時間ブロックした後、典型的には1/200の希釈度から開始する血清の段階希釈物とともに4℃で一晩インキュベートした。次いで二次試薬（ヤギ抗マウスIgG（H+L）ペルオキシダーゼ、Jackson ImmunoResearch）を各ウエルに1/5000の希釈度で添加し、37℃で1時間インキュベートした。プレートを徹底的に洗浄し、3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン基質（Life Technologies）をウエルに5～10分間添加し、0.16NのH2SO4を添加することによって反応を停止させた。各ウエルの450ナノメートルでの吸光度を微量滴定プレートリーダー（Cytation5、Biotek）を用いて測定した。エンドポイント力価は、Frey A.ら（Journal of Immunological Methods, 1998, 221:35-41）に記載されているようにして計算した。計算された力価は、最大希釈度を表わしており、最大希釈度では、免疫化マウスからの血清サンプルで、ナイーブな非免疫化対照マウスからの血清サンプルと比べて吸光度の統計的に有意な増加が観察される。
SL-SCV-3ワクチンを接種した10匹のマウスのうちの2匹のマウスがアッセイバックグラウンドである1/400よりも大きい抗体応答を生じさせた。1匹のマウスがピーク抗体力価である1/800を4週目までに達成し、1匹のマウスがピーク抗体力価である1/3200を6週目までに達成して維持した（図4参照）。これは、スパイクタンパク質を標的とするサルモネラに基づくSARS-CoV2ワクチンコンストラクトがスパイクタンパク質に対する抗原特異的免疫応答を生じさせること、すなわち液性免疫応答を生じさせることができることを実証している。
実施例6：臨床前研究 - 健康なマウスにおいてVXM-SCV-30によって誘導される免疫応答の評価
pVAX10-SCV-30プラスミド（インサートSCV-30；配列番号12）は、スパイクタンパク質のSARS-CoV-2 RBDドメイン（配列番号1のアミノ酸319～541）、それに続くマウスC3dの3つの反復（3C3d；配列番号17；KFLNTAKDRNRWEEPDQQLYNVEATSYA）、次いでThosea asignaウイルスのカプシドタンパク質前駆体に由来する2A自己切断ペプチド配列（配列番号7）、それに続くSARS-CoV-2 Nタンパク質（配列番号8）に融合されたユビキチン（配列番号9）をコードする（アクセッション番号YP_009724397）（図3参照）。
pVAX10-SCV-30を用いて実施例5に記載されているようにしてチフス菌SL7207ワクチンを調製した。
病原体のない雌の4～6週齢のBALBcマウスをCharles River Laboratories（サン・コンスタン、ケベック州、カナダ国）から購入し、施設ガイドラインに従って餌と水を自由に摂取できる状態で収容した。
10匹のマウスの群をSL-SCV-30ワクチンで処置した。各処置のため、マウスを100マイクロリットルの用量の投与バッファ（310ミリモルの炭酸水素ナトリウム、100ミリモルのL-アスコルビン酸、5ミリモルのラクトース一水和物）の強制経口投与によってあらかじめ処置した後、1ミリリットル当たり1.5～2×109 CFUの用量のワクチンを含む投与バッファを100マイクロリットル投与した。マウスを0、2、5、7、21、および35日目に処置した。マウスを研究前（免疫前）とその後は3、4、6、および12週目に出血させた。
血清を実施例5に記載されているようにして分析し、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する抗体を探した。
SL-SCV-30ワクチンを接種した10匹のマウスのうちの1匹のマウスがアッセイバックグラウンドである1/400よりも大きい抗体応答を生じさせ、3週目までに1/3200に達した（図5参照）。これは、スパイクタンパク質のRBDドメインを標的とするサルモネラに基づくSARS-CoV2ワクチンコンストラクトがスパイクタンパク質に対する抗原特異的免疫応答を生じさせることを実証している。
実施例7：臨床前研究 - 健康なマウスにおいてVXM-SCV-42によって誘導される免疫応答の評価
pVAX10-SCV-42プラスミド（インサートSCV-42；配列番号13）は、スパイクタンパク質のSARS-CoV-2 S1ドメイン（配列番号1のアミノ酸1～681）、それに続くマウスC3dの3つの反復（配列番号17；3C3d、配列番号18）、次いでThosea asignaウイルスのカプシドタンパク質前駆体に由来する2A自己切断ペプチド配列（配列番号7）、それに続くSARS-CoV-2 Nタンパク質（配列番号8）に融合したユビキチン（配列番号9）別の2A自己切断ペプチド配列、およびスパイクタンパク質のSARS-CoV-2 S2ドメイン（配列番号1のSer686～Thr1273）をコードする（図3参照）。
pVAX10-SCV-42を用いて実施例5に記載されているようにしてチフス菌SL7207ワクチンを調製した。
病原体のない雌の4～6週齢のBALBcマウスをCharles River Laboratories（サン・コンスタン、ケベック州、カナダ国）から購入し、施設ガイドラインに従って餌と水を自由に摂取できる状態で収容した。
10匹のマウスの群をSL-SCV-42ワクチンで処置した。各処置のため、マウスを100マイクロリットルの用量の投与バッファ（310ミリモルの炭酸水素ナトリウム、100ミリモルのL-アスコルビン酸、5ミリモルのラクトース一水和物）の強制経口投与によってあらかじめ処置した後、1ミリリットル当たり1.5～2×109 CFUの用量のワクチンを含む投与バッファを100マイクロリットル投与した。マウスを0、2、5、7、21、および35日目に処置した。マウスを研究前（免疫前）とその後は2、4、6、および8週目に出血させた。
血清を実施例5に記載されているようにして分析し、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する抗体を探した。
SL-SCV-42ワクチンを接種した10匹のマウスのうちの2匹のマウスがアッセイバックグラウンドである1/400よりも大きい抗体応答を生じさせ、3週目までに1/1600に達した（図6参照）。これは、スパイクタンパク質のS1および／またはS2サブユニットを標的とするサルモネラに基づくSARS-CoV2ワクチンコンストラクトがスパイクタンパク質に対する抗原特異的免疫応答を生じさせることを実証している。
実施例8：臨床前試験 - 健康なマウスにおいてVXM-SCV-53によって誘導される免疫応答の評価
pVAX10-SCV-53プラスミド（インサートSCV-53；配列番号14；全プラスミド配列は配列番号19）は、フーリンドメインが除去された（アミノ酸残基680～683欠失）SARS-CoV-2スパイクタンパク質（配列番号1）（ただしその中のシグナルドメイン（配列番号1のMet1～Ser12）は不変鎖のシグナルドメイン（配列番号15のMet1～Arg29）で置き換えられている）、それに続くThosea asignaウイルスのカプシドタンパク質前駆体に由来する2A自己切断ペプチド配列（配列番号7）、それに続くSARS-CoV-2 Nタンパク質（配列番号8）に融合したユビキチン（配列番号9）をコードする。このプラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子の上流にあるより大きなSV40 oriエンハンサー配列（配列番号20）の中に72ヌクレオチドSV40 DNA核標的配列（DTS）（配列番号16）も含有する（図3参照）。
pVAX10-SCV-53を用いて実施例5に記載されているようにしてチフス菌SL7207ワクチンを調製した。
病原体のない雌の4～6週齢のBALBcマウスをCharles River Laboratories（サン・コンスタン、ケベック州、カナダ国）から購入し、施設ガイドラインに従って餌と水を自由に摂取できる状態で収容した。
10匹のマウスの群をSL-SCV-53ワクチンで処置した。各処置のため、マウスを100マイクロリットルの用量の投与バッファ（310ミリモルの炭酸水素ナトリウム、100ミリモルのL-アスコルビン酸、5ミリモルのラクトース一水和物）の強制経口投与によってあらかじめ処置した後、1ミリリットル当たり1.5～2×109 CFUの用量のワクチンを含む投与バッファを100マイクロリットル投与した。マウスを0、2、5、7、21、および35日目に処置した。マウスを研究前（免疫前）とその後は2、4、6、および8週目に出血させた。
血清を実施例5に記載されているようにして分析し、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する抗体を探した。
SL-SCV-53ワクチンを接種した10匹のマウスのうちの3匹のマウスがアッセイバックグラウンドである1/400よりも大きい抗体応答を生じさせ、1/800に達した（図7参照）。これは、シグナルドメイン改変スパイクタンパク質を標的とするサルモネラに基づくSARS-CoV2ワクチンコンストラクトがスパイクタンパク質に対する抗原特異的免疫応答を生じさせることを実証している。
実施例9：VXM-SCV-X第I相臨床試験；研究設計
この第I相試験の目的は、VXM-SCV-Xに対する安全性、忍容性、および免疫応答を調べることである。この無作為化プラセボ対照二重盲検用量漸増試験には45人の対象が含まれる。対象はVXM-SCV-Xまたはプラセボの4回の投与を1、3、5、および7日目に受ける。106 CFUから109 CFUまでの用量のVXM-SCV-Xをこの試験で評価する。独立なデータ安全性モニタリング委員会（DSMB）が用量漸増の決定に関与する。主要エンドポイントとしての安全性に加え、VXM-SCV-1特異的免疫応答を評価する。
目的は、調べる抗SARS-CoV-2ウイルスワクチンVXM-SCV-Xに対する安全性と忍容性、および免疫応答を調べることのほか、VXM-SCV-1の最大耐性量（MTD）を特定することである。MTDは、VXM-SCV-X治療下の6人までの患者の2人未満が用量制限毒性（DLT）を経験する最高用量レベルと定義される。
安全性と忍容性に関する主要エンドポイントは、CTCAE基準による有害事象と深刻な有害事象である。
副次的エンドポイントは、実験ワクチンがSARS-CoV-2 Sタンパク質に対する特異的免疫応答を誘導する有効性を評価することであり、免疫陽性患者の数を含む。
VXM-SCV-Xは適正製造基準（GMP）に従って製造され、緩衝化溶液で与えられる。プラセボ対照は等張性塩化ナトリウム溶液で構成した。
開始用量は106コロニー形成単位（CFU）のVXM-SCV-Xを含有する溶液からなる。このVXM-SCV-X用量は安全性を理由として選択された。比較のため、腸チフスに対して認可されたワクチンであるTyphoral（登録商標）の単回用量は、VXM-SCV-1開始用量の大まかに千倍に相当する2×109～6×109 CFUのチフス菌Ty21aを含有する。この用量は対数ステップで増量されるが、それは生細菌ワクチンに関して正当化されると思われる。
ヒト初回投与試験に関するガイドラインに従い、単回用量群の患者を複数のコホートで治療した。任意用量群でのVXM-SCV-Xの最初の投与は、1人の患者に対してなされる。各用量群の第2のコホートはVXM-SCV-Xを受ける2人の患者からなる。1人の先行者でのこの時差投与、すなわち1人の患者だけがVXM-SCV-Xを最初に受けることが、リスク軽減に役立つ。
第3のコホートの患者（VXM-SCV-Xを受ける3人がすべての投与群に含まれる。
経口ワクチンに固有の環境リスクは、環境への排出の可能性と、標的集団以外の人へのその後のワクチン接種である。すべての研究患者が、ワクチン接種日とその後の3日間の期間にわたって研究場所に閉じ込められる。研究患者のすべての糞便が回収されて焼却される。体液と糞便のサンプルがVXM-SCV-X排出に関して調査される。
衛生上の注意が、研究員を偶発的な取り込みから保護するため適用される。研究員は研究のこの側面のため特別に訓練される。
それに加え、特異的T細胞活性化と抗体形成をこの患者設定で測定する。活性ワクチンとバックグラウンド処置に関係する特定の安全性問題に関するさらなる知識を得るため、プラセボ対照が含まれる。それに加え、プールしたプラセボ患者は、特異的免疫活性化を評価するための妥当な比較因子として機能する。
実施例10：VXM-SCV-1特異的なT細胞応答とB細胞応答
ワクチンの接種前、接種中、および接種後の異なる時点で、VXM-SCV-Xとプラセボで処置した患者の末梢血においてIFNγ ELISpotによって検出するSARS-CoV-2ウイルスSタンパク質特異的T細胞の頻度をモニタすることにより、VXM19に対する応答を評価する。
最初に、T細胞とペプチドパルスDCを、抗INFγ抗体で被覆したウエルに添加する。インキュベーション期間の後、分泌されたINFγが被覆抗体に結合した状態で細胞を取り出す。次いで検出抗体を添加して結合したINFγを検出し、単回の増幅をすると、最終収率を、単一の活性化された特異的T細胞を表わす「色彩スポット」として見ることができる。
B細胞応答をELISAによって測定する。簡単に述べると、96ウエルのEIAプレートを、炭酸ナトリウムバッファ（pH 9.5）1ミリリットルにつき1マイクログラム含まれるNまたはSタンパク質エピトープ、または組み換え全NまたはSタンパク質で4℃にて一晩被覆する。翌日、プレートを100ミリモルのトリス-緩衝化生理食塩水／Tween（登録商標）（TBST）で洗浄し、37℃にて3％ゼラチンで1時間ブロックする。プレートをTBSTで徹底的に洗浄した後、血清を各プレートの最上行に添加し、TBSTを用いて各カラムの下方に向かって1：1希釈液を調製する。各プレートには、血清なしの陰性対照カラムが含まれる。プレートを4℃で一晩インキュベートする。現像するため、プレートをTBSTで洗浄し、アルカリホスファターゼに結合したタンパク質G（Calbiochem、アメリカ合衆国）の1：1000希釈液とともに37℃で1時間インキュベートする。OD405をELISAプレートリーダーで測定する。抗体エンドポイント力価は、陰性対照の平均OD405よりも1標準偏差大きいOD405を与えるのに必要な希釈度の逆数として求める。
実施例11：抗担体免疫
細菌媒体に対する免疫応答を評価するため、抗チフス菌の免疫グロブリンIgGとIgMを、2つの市販のアッセイキット（チフス菌IgG ELISA、カタログ番号ST0936Gと、チフス菌IgM ELISA、カタログ番号ST084M；Calbiotech. Inc.、10461オースチンDr、スプリング・ヴァレー、CA 91978、アメリカ合衆国）を用いてELISAによって検出する。これらのアッセイは定性的アッセイである。これらのアッセイは、パッケージ挿入物にそれぞれ記載されているようにして使用するApp. I/I）が、前述の検証研究580.132.2785に従う研究計画の一部として改変する。
両方のアッセイで酵素結合免疫吸着アッセイ技術を利用する。キャリブレータ、陰性対照、陽性対照、およびサンプルを二連で分析する。希釈した患者の血清（希釈度1：101）を、精製した抗原で被覆したウエルに添加する。IgGまたはIgMに対する特異的な抗体が、存在する場合には抗原に結合する。結合しなかった全材料を洗浄して除去し、酵素複合体を添加して抗体-抗原複合体（存在する場合）に結合させる。過剰な酵素を洗浄して除去し、基質を添加する。プレートをインキュベートして酵素による基質の加水分解が可能になるようにする。生じる色の強度は、サンプル中のIgGまたはIgMに特異的な抗体の量に比例する。色の強度は分光測光微量滴定プレートリーダーを用いて450 nmで測定する。カットオフは以下のように計算する：
キャリブレータのOD×キャリブレータ因子（CF）。
各測定の抗体指数は各サンプルのOD値をカットオフ値で割ることによって求まる。
抗体指数の解釈：
＜0.9 チフス菌のIgGまたはIgMに対する抗体をELISAによって検出できない
0.9～1.1 境界陽性
＞1.1 チフス菌のIgGまたはIgMに対する抗体をELISAによって検出できる
実施例12：ワクチン接種スケジュール
単回用量、すなわち106～108 CFUのVXM19を経口で100 mlの飲料溶液として投与する。単回用量のワクチン接種はそれぞれ1、3、5日目と、場合により7日目になされる。ピーク免疫応答は最後のワクチン接種からほぼ10日後に起こることが期待される。ブースティングは、2～4週間後に、それどころか3～6ヶ月後にさえ考えることができる。スケジュールの推奨はワクチン株Ty21aから導出される。

Claims (17)

  1. 少なくともCOVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部をコードする真核生物発現カセットを含むDNA分子を含むチフス菌（Salmonella typhi）Ty21a株を含むDNAワクチン。
  2. 前記COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部が、
    （a）SARS-CoV-2完全長Sタンパク質；
    （b）SARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメイン；
    （c）SARS-CoV-2 Sタンパク質サブユニットS1；
    （d）SARS-CoV-2 Sタンパク質受容体結合ドメイン（RBD）；または
    （e）SARS-CoV-2 Sタンパク質の少なくとも3個の免疫優性エピトープを含む、請求項1に記載のDNAワクチン。
  3. 前記COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質がSARS-CoV-2完全長Sタンパク質であり、場合により前記SARS-CoV-2完全長Sタンパク質が、配列番号1のアミノ酸配列、または配列番号1と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項2に記載のDNAワクチン。
  4. 前記COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部が前記SARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメインを含み、場合により前記SARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメインが、配列番号1のアミノ酸残基1～1208のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸残基1～1208と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項2に記載のDNAワクチン。
  5. 前記COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部が前記SARS-CoV-2 Sタンパク質サブユニットS1を含み、場合により前記SARS-CoV-2 Sタンパク質サブユニットS1が、配列番号1のアミノ酸残基1～681のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸残基1～681と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項2に記載のDNAワクチン。
  6. 前記COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部が前記SARS-CoV-2 Sタンパク質受容体結合ドメイン（RBD）を含み、場合により前記SARS-CoV-2 RBDが、配列番号1のアミノ酸残基319～541のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸残基319～541と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項2に記載のDNAワクチン。
  7. 前記COVID-19コロナウイルス（SARS-CoV-2）スパイク（S）タンパク質またはその一部が、配列番号1のアミノ酸配列のアミノ酸位置K986とV987に対応するプロリンへの2つの安定化変異を含む、SARS-CoV-2完全長Sタンパク質またはSARS-CoV-2 Sタンパク質エクトドメインの融合前安定化形態であり、好ましくは前記SARS-CoV-2 Sタンパク質またはその一部が、
    （a）2つの安定化変異K986PとV987Pを含む、配列番号1のアミノ酸配列、または配列番号1と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列；または
    （b）2つの安定化変異K986PとV987Pを含む、配列番号1のアミノ酸残基1～1208のアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸残基1～1208と少なくとも95％一致した配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項2に記載のDNAワクチン。
  8. 前記真核生物発現カセットが別のSARS-CoV-2タンパク質またはその一部をさらにコードする、請求項1～7のいずれか1項に記載のDNAワクチン。
  9. 前記別のSARS-CoV-2タンパク質がSARS-CoV-2 Nタンパク質である、請求項8に記載のDNAワクチン。
  10. 医薬として許容可能な1つ以上の賦形剤をさらに含む、請求項1～9のいずれか1項に記載のDNAワクチン。
  11. 経口剤形である、請求項1～10のいずれか1項に記載のDNAワクチン。
  12. 前記経口剤形が、腸溶性コーティングカプセル、凍結乾燥粉末、または懸濁液である、請求項11に記載のDNAワクチン。
  13. 1つ以上のアジュバントをさらに含む、請求項1～12のいずれか1項に記載のDNAワクチン。
  14. コロナウイルス疾患2019（COVID-19）またはSARS-CoV-2感染症の治療および／または予防に使用するための、請求項1～13のいずれか1項に記載のDNAワクチン。
  15. 経口投与される、請求項14に記載の使用のためのDNAワクチン。
  16. （a）単回用量のDNAワクチンがチフス菌（Salmonella typhi）Ty21a株を約106～109コロニー形成単位（CFU）で含む、および／または
    （b）前記DNAワクチンがプライミングのため1週間に2～4回投与され、場合によりその後に1回以上の単回用量ブースティングが続く、請求項14または15に記載の使用のためのDNAワクチン。
  17. 最初の1週間以内に2～4回投与され、その後は1回以上の単回用量ブースティングがそれぞれ少なくとも2週間後に続く、請求項16に記載の使用のためのDNAワクチン。
JP2022556158A 2020-03-31 2021-03-31 サルモネラに基づく新規コロナウイルスワクチン Pending JP2023519562A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20167405 2020-03-31
EP20167405.8 2020-03-31
PCT/EP2021/058513 WO2021198376A1 (en) 2020-03-31 2021-03-31 Novel salmonella-based coronavirus vaccine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023519562A true JP2023519562A (ja) 2023-05-11
JPWO2021198376A5 JPWO2021198376A5 (ja) 2024-04-08

Family

ID=70110247

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022556158A Pending JP2023519562A (ja) 2020-03-31 2021-03-31 サルモネラに基づく新規コロナウイルスワクチン

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230137174A1 (ja)
EP (1) EP4126022A1 (ja)
JP (1) JP2023519562A (ja)
KR (1) KR20220161444A (ja)
CN (1) CN115715198A (ja)
AU (1) AU2021250442A1 (ja)
CA (1) CA3170674A1 (ja)
WO (1) WO2021198376A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UY39378A (es) * 2020-08-14 2022-01-31 Univ Wuerzburg J Maximilians Vacuna de salmonella para el tratamiento de coronavirus

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060240515A1 (en) * 2003-07-21 2006-10-26 Dimitrov Dimiter S Soluble fragments of the SARS-CoV spike glycoprotein
JP6251179B2 (ja) 2011-12-22 2017-12-20 バクシム アクチェンゲゼルシャフト 弱毒化サルモネラ株を高収量で生産する方法
WO2020237246A1 (en) * 2019-05-23 2020-11-26 University Of Maryland, Baltimore Live attenuated non-transmissible vaccines
US10973908B1 (en) * 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220161444A (ko) 2022-12-06
AU2021250442A1 (en) 2022-11-10
CN115715198A (zh) 2023-02-24
EP4126022A1 (en) 2023-02-08
WO2021198376A1 (en) 2021-10-07
US20230137174A1 (en) 2023-05-04
CA3170674A1 (en) 2021-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2020063370A2 (zh) 免疫组合物及其制备方法与应用
US10836809B2 (en) Mosaic chimeric viral vaccine particle
CN113666990A (zh) 一种诱导广谱抗冠状病毒的t细胞疫苗免疫原及其应用
US20230330214A1 (en) Improved dna vaccine for sars-cov-2
WO2022003119A1 (en) Cross-reactive coronavirus vaccine
JP4653934B2 (ja) バクテリオファージによって仲介される免疫化方法
WO2023023940A1 (zh) 一种诱导广谱抗冠状病毒的t细胞疫苗免疫原及其应用
US20230174588A1 (en) A vaccine against sars-cov-2 and preparation thereof
US20230137174A1 (en) Novel salmonella-based coronavirus vaccine
Agterberg et al. Outer membrane protein PhoE as a carrier for the exposure of foreign antigenic determinants at the bacterial cell surface
US20180153976A1 (en) Novel cmv pp65 targeting dna vaccine for cancer immunotherapy
US20230414742A1 (en) Novel vaccine for preventing and treating merkel cell carcinoma
WO2023010176A1 (en) Vaccine construct and uses thereof
US20220211839A1 (en) Feline leukemia virus vaccine
JP4535874B2 (ja) 肝炎に対するバクテリオファージを介する免疫
KR102646366B1 (ko) 바이러스 유사 입자를 이용한 돼지 유행성 설사병 바이러스 백신 및 이의 제조방법
US20240181041A1 (en) Adenovirus SARS-CoV-2 Vaccine
KR20240019213A (ko) 코로나바이러스를 위한 바이러스 유사 입자 백신

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240327

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20240327