KR20220161444A - 새로운 살모넬라-기반의 코로나바이러스 백신 - Google Patents
새로운 살모넬라-기반의 코로나바이러스 백신 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20220161444A KR20220161444A KR1020227037910A KR20227037910A KR20220161444A KR 20220161444 A KR20220161444 A KR 20220161444A KR 1020227037910 A KR1020227037910 A KR 1020227037910A KR 20227037910 A KR20227037910 A KR 20227037910A KR 20220161444 A KR20220161444 A KR 20220161444A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cov
- sars
- protein
- amino acid
- seq
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 적어도 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 포함하는 DNA 분자를 포함하는 살모넬라 티피 Ty21a 균주를 포함하는 DNA 백신에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 코로나바이러스 질환 2019 (COVID-19) 또는 SARS-CoV-2 감염을 예방 및/또는 치료하는데 이용하기 위한 DNA 백신에 관한 것이다.
Description
본 발명은 적어도 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 가진 DNA 분자를 함유한 살모넬라 티피 (Salmonella typhi) Ty21a 균주를 포함하는 DNA 백신에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 코로나바이러스 질환 2019 (COVID-19) 또는 SARS-CoV-2 감염을 예방 및/또는 치료하는데 이용하기 위한 상기한 DNA 백신에 관한 것이다.
2019년 12월 말 중국 공중 보건 당국은 중국 후베이성 우한시에서 급성 호흡 증후군의 여러 중증 사례들을 보고하였다. 중국 과학자들은 곧 신종 코로나바이러스를 주요 원인 물질로 동정하였다. 이 질환은 현재 코로나바이러스 질환 2019 (COVID-19)으로 지칭되고 있으며, 원인 물질은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)로 언급된다. 이는 인간에서 이전에 파악된 적 없는 코로나바이러스의 새로운 균주이다.
우한에서 초기 발병이 급속도로 전파되어, 중국의 다른 지역에서도 발생하였다. 다른 여러 국가들에서도 사례들이 곧 검출되었다. 이후 아시아, 유럽, 호주, 아프리카 및 아메리카에서도 질환 발병 및 클러스터가 관찰되었다.
WHO는 1차 긴급 회의에서 COVID-19 치사율을 약 4%로 추정하였다. 치사율은 국가에 따라 차이가 있는 것으로 보이며, 보고되지 않은 사례 건수가 파악되지 않아 정확하지 않을 수 있으며, SARS-CoV-2 (본래 2019 새로운 코로나바이러스 (2019-nCoV)로 지칭됨)의 전파는 전세계적으로 위협이 되었으며, 바이러스의 추가적인 전파를 막기 위해 COVID-19에 대한 치료 및/또는 백신 접종이 절실히 요구되고 있다.
코로나바이러스는 (+) 코로나비리대 과에 속하는 센스 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 이 바이러스는 대부분 조류 및 포유류 등의 동물을 감염시킨다. 인간에서, 코로나바이러스는 전형적으로 경미한 호흡기 감염을 유발한다. 2003년 이후로, 고 병원성인 인간 코로나바이러스 2종, 즉 중증 급성 호흡 증후군 코로나바이러스 (SARS-CoV)와 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 (MERS-CoV)는 이환율 및 사망율이 높은 전세계 유행을 발생시켰다. 이들 2종의 지역 유행병은 코로나비리대의 베타코로나바이러스 속에 속하는 인수공통 감염성 코로나바이러스에 의해 유발되었다.
SARS-CoV 및 MERS-CoV와 마찬가지로, 신종 SARS-CoV-2는 베타코로나바이러스 속에 속한다. Zhou et al. (Cell Discovery (2020) 6:14)에서 발표된 바와 같이, SARS-CoV-2는 SARS-CoV와 가장 높은 뉴클레오티드 서열 동일성을 공유한다 (79.7%). 특히, SARS-CoV-2의 외막 및 뉴클레오캡시드 단백질은 진화적으로 보존된 영역으로, SARS-CoV에 대한 서열 동일성이 각각 96% 및 89.6%이다. 스파이크 단백질은 SARS-CoV-2와 SARS-CoV 간에 서열 보존성이 가장 낮은 것으로 발표되어 있으며 (서열 동일성 77%), SARS-CoV-2의 스파이크 단백질은 MERS-CoV의 스파이크 단백질에 대한 서열 동일성은 31.9%에 불과하다.
SARS-CoV와 관련한 다양한 보고서들은 체액성 및 세포-매개 면역 반응 둘다의 보호 역할을 제안하고 있다. S 단백질은 대부분 노출된 단백질로, SARS-CoV S 단백질에 대한 항체 반응이 마우스 모델에서 SARS-CoV 감염으로 보호하는 것으로 입증되었다. 그러나 효과적인 항체 반응은 수명이 짧을 수 있다. 이와는 대조적으로, T 세포 반응은 SARS-CoV에 대해 장기간의 보호를 제공하는 것으로 입증되었다. 즉, 체액성 및 세포-매개 면역 반응을 일으킬 수 있는 백신이 가장 유망하다.
여러 국내 및 국제 연구 그룹들이 2019-nCoV/SARS-CoV-2를 예방하고 치료하기 위한 백신 개발에 대해 몰두하고 있지만, 효과적인 백신은 아직까지 이용가능하지 않다. 따라서, 단기간에 개발 및 승인될 수 있는 효과적인 치료학적 및/또는 예방학적 백신이 절실하게 요구되고 있다.
새로운 코로나 바이러스 및 SARS-CoV-2에 의해 유발된 전세계 유행병에 대한 현재의 이해를 고려해, 본 발명의 과제는 코로나바이러스 질환 2019 (COVID-19) 또는 SARS-CoV-2 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 새로운 경구 DNA 백신을 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 DNA 백신은 적어도 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 포함하는 DNA 분자를 포함하는 살모넬라 티피 Ty21a 균주를 포함한다. 이 백신은 숙주 세포에서 발현시키기 위한 면역원성 항원을 코딩하는 DNA 분자에 대한 담체 및 보강제로서 작용하는 살모넬라 티피 Ty21a로서 지칭되는 약독화된 살모넬라 티피 생 균주를 기반으로 한다. 항원을 코딩하는 DNA 분자를 포함하는 이 살모넬라-기반의 담체는 단기간에 대규모로 개발 및 생산할 수 있으며, 필요에 따라 바이러스에서 발생하는 잠재적인 돌연변이에 대응할 수 있다.
아울러, 담체로서 사용되는 약독화된 살모넬라 티피 Ty21a 생균주는 Typhoral L®의 활성 성분으로서, 또한 Vivotif® (제조사: Berna Biotech Ltd., a Crucell Company, Switzerland)로도 알려져 있으며, 장티푸스에 대해 유일하게 허가된 경구 생 백신이다. 이 백신은 환자 독성뿐 아니라 제3자 전파와 관련해 안전한 것으로 입증되어 있다 (Wahdan et al., J. Infectious Diseases 1982, 145:292-295). 이 백신은 40개국 이상에서 허가받았으며, 수천명의 어린이를 비롯한 수백만명의 개체들에 장티푸스에 대한 예방학적 백신 접종으로 사용되어 왔다. 이는 비할데 없는 안전성 실적을 가지고 있다. 본 발명의 DNA 백신에 사용되는 담체는 따라서 단기간에 승인 및 제품 시판하기에 적합하다.
본 발명에 따른 DNA 백신은 따라서 COVID-19 및/또는 SARS-CoV-2 감염에 대한 효과적인 백신을 제공하는 문제에 특히 적합할 수 있는 여러가지 이점을 가진다.
본 발명은 적어도 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 포함하는 DNA 분자를 포함하는 살모넬라 티피 Ty21a 균주를 포함하는 DNA 백신을 제공한다. 특정 구현예에서, COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부는 (a) SARS-CoV-2 전장 S 단백질; (b) SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인; (c) SARS-CoV-2 S 단백질 서브유닛 S1; (d) SARS-CoV-2 S 단백질 수용체 결합 도메인 (RBD); 또는 (d) SARS-CoV-2 S 단백질의 면역-우세 에피토프 (immune-dominant epitope) 적어도 3개를 포함한다.
일 구현예에서, COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질은 SARS-CoV-2 전장 S 단백질이다. SARS-CoV-2 전장 S 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함할 수 있다. SARS-CoV-2 전장 S 단백질은 또한 계통 B.1.1.7, B.1.351 또는 B.1.1.28 (P.1으로 명칭 변경) 등의 SARS-CoV-2의 변이체의 전장 S 단백질일 수 있다. SARS-CoV-2 전장 S 단백질은 또한 2 이상의 안정화 돌연변이를 포함하는 등의, SARS-CoV-2 전장 S 단백질의 융합 전-안정화된 형태 (prefusion-stabilized form)일 수 있다. 일 구현예에서, SARS-CoV-2 전장 S 단백질의 융합 전-안정화된 형태는 서열번호 1의 K986 및 V987 위치의 아미노산에 대응하는 프롤린으로의 안정화 돌연변이 2개를 포함한다.
특정 구현예에서, COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부는 SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인을 포함한다. SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인은 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열, 또는 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들과 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 가진다. SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인은 계통 B.1.1.7, B.1.351 또는 P.1과 같은 SARS-CoV-2의 변이체의 S 단백질 엑토도메인일 수 있다. SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부는 안정화 돌연변이를 2개 이상 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인의 융합 전-안정화된 형태를 또한 포함할 수 있다. 일 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인의 융합 전-안정화된 형태는 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열에서 K986 및 V987 위치의 아미노산에 대응하는 프롤린으로의 안정화 돌연변이 2개를 포함한다.
특정 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부는, 안정화 돌연변이 2종 K986P 및 V987P를 포함하는, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과의 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 가진다. 일부 대안적인 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부는, 안정화 돌연변이 2종 K986P 및 V987P를 포함하는, 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들과 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부는 SARS-CoV-2 S 단백질 서브유닛 S1을 포함한다. SARS-CoV-2 단백질 서브유닛 S1은 서열번호 1의 1-681번 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 1-681번 아미노산 잔기들과 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. SARS-CoV-2 S 단백질 서브유닛 S1은 또한 계통 B.1.1.7, B.1.351 또는 P.1과 같은 SARS-CoV-2의 변이체의 S 단백질 서브유닛 S1일 수 있다.
특정 구현예에서, COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부는 SARS-CoV-2 S 단백질 수용체 결합 도메인 (RBD)을 포함한다. SARS-CoV-2 단백질 RBD는 서열번호 1의 319-541번 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 319-541번 아미노산 잔기들과 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. SARS-CoV-2 S 단백질 RBD는 계통 B.1.1.7, B.1.351 또는 P.1과 같은 SARS-CoV-2의 변이체의 S 단백질 RBD일 수 있다.
본 발명에 따른 DNA 백신은 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부를 코딩하며, 선택적으로 다른 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 일부, 바람직하게는 SARS-CoV-2 N 단백질을 추가로 코딩하는, DNA 분자를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 진핵생물 발현 카세트는 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부를 코딩하며, 다른 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 일부, 예를 들어 SARS-CoV-2 N 단백질 또는 이의 일부를 추가로 코딩한다.
본 발명에 따른 DNA 백신은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, DNA 백신은 경구 투약 형태, 예를 들어 장용 코팅 캡슐제, 동결건조된 분말 또는 현탁제이다. 본 발명에 따른 DNA 백신은 하나 이상의 보강제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 코로나바이러스 질환 2019 (COVID-19) 또는 SARS-CoV-2 감염의 치료 및/또는 예방하는데 이용하기 위한 본 발명에 따른 DNA 백신을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 DNA 백신을 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 코로나바이러스 질환 2019 (COVID-19) 또는 SARS-CoV-2 감염을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, DNA 백신은 경구 투여된다. 특정 구현예에서, DNA 백신의 1회 용량은 살모넬라 티피 Ty21a 균주를 약 1 x 106 내지 약 1 x 109 콜로니 형성 단위 (CFU)로 포함하거나, 및/또는 DNA 백신은 감작화 첫주 1주일간 2-4회 투여한 다음 선택적으로 하나 이상의 부스팅 용량으로 투여되기 위한 것이다. 일 구현예에서, DNA 백신은 첫주 동안 2-4회 투여된 다음 각각 적어도 2주 후, 바람직하게는 각각 적어도 4주 후 단일 용량 부스팅을 1회 이상으로 투여하기 위한 것이다.
도 1: 아미노산 잔기들 1-1208이 밑줄 표시되고; 잔기 K986, V987, R682G, R683S 및 R685S가 진하게 표시된, SARS-CoV-2 스파이크 단백질 (서열번호 1)의 아미노산 서열.
도 2: pVAX10.SCV-1의 플라스미드 지도.
도 3: pVAX10에 클로닝하기 위한 SARS-CoV-2 구조체로서, X는 N-말단 (좌)에서 C-말단 (우) 순서의 도메인 존재를 나타낸다. 다음과 같은 약어가 사용된다; S FL (전장 S 단백질, 서열번호 1; *는 불변 체인 (서열번호 15의 Met1-Arg29)의 것으로 치환된 신호 도메인 (서열번호 1의 Met1-SER12), S ecto: (S 단백질 엑토도메인), S1 (S 단백질 S1 서브유닛), RBD (수용체 결합 도메인), T4 삼량체 (T4 피브리틴 삼량체화 모티프), 3C3d (C3d 단백질의 카피를 3개 포함하는 인핸서 서열), 2A (2A 펩타이드, 예를 들어 T2a 또는 P2a), Ubi. (유비퀴틴), N (N 단백질), S2 (S 단백질 S2 서브유닛) 및 SV40 DTS (SV40 DNA 핵 표적화 서열).
도 4: 건강한 마우스에서 VXM-SCV-3에 의해 유발된 면역 반응. 백신 접종된 마우스의 혈청에서 SARS-CoV 스파이크 단백질에 대한 항체를 분석하였다 (실시예 5 참조). 분석 백그라운드는 점선 직선으로 표시된 400 엔드포인트 역가이다.
도 5: 건강한 마우스에서 VXM-SCV-30에 의해 유발된 면역 반응. 백신 접종된 마우스의 혈청에서 SARS-CoV 스파이크 단백질에 대한 항체를 분석하였다 (실시예 6 참조). 분석 백그라운드는 점선 직선으로 표시된 400 엔드포인트 역가이다.
도 6: 건강한 마우스에서 VXM-SCV-42에 의해 유발된 면역 반응. 백신 접종된 마우스의 혈청에서 SARS-CoV 스파이크 단백질에 대한 항체를 분석하였다 (실시예 7 참조). 분석 백그라운드는 점선 직선으로 표시된 400 엔드포인트 역가이다.
도 7: 건강한 마우스에서 VXM-SCV-53에 의해 유발된 면역 반응. 백신 접종된 마우스의 혈청에서 SARS-CoV 스파이크 단백질에 대한 항체를 분석하였다 (실시예 8 참조). 분석 백그라운드는 점선 직선으로 표시된 400 엔드포인트 역가이다.
도 2: pVAX10.SCV-1의 플라스미드 지도.
도 3: pVAX10에 클로닝하기 위한 SARS-CoV-2 구조체로서, X는 N-말단 (좌)에서 C-말단 (우) 순서의 도메인 존재를 나타낸다. 다음과 같은 약어가 사용된다; S FL (전장 S 단백질, 서열번호 1; *는 불변 체인 (서열번호 15의 Met1-Arg29)의 것으로 치환된 신호 도메인 (서열번호 1의 Met1-SER12), S ecto: (S 단백질 엑토도메인), S1 (S 단백질 S1 서브유닛), RBD (수용체 결합 도메인), T4 삼량체 (T4 피브리틴 삼량체화 모티프), 3C3d (C3d 단백질의 카피를 3개 포함하는 인핸서 서열), 2A (2A 펩타이드, 예를 들어 T2a 또는 P2a), Ubi. (유비퀴틴), N (N 단백질), S2 (S 단백질 S2 서브유닛) 및 SV40 DTS (SV40 DNA 핵 표적화 서열).
도 4: 건강한 마우스에서 VXM-SCV-3에 의해 유발된 면역 반응. 백신 접종된 마우스의 혈청에서 SARS-CoV 스파이크 단백질에 대한 항체를 분석하였다 (실시예 5 참조). 분석 백그라운드는 점선 직선으로 표시된 400 엔드포인트 역가이다.
도 5: 건강한 마우스에서 VXM-SCV-30에 의해 유발된 면역 반응. 백신 접종된 마우스의 혈청에서 SARS-CoV 스파이크 단백질에 대한 항체를 분석하였다 (실시예 6 참조). 분석 백그라운드는 점선 직선으로 표시된 400 엔드포인트 역가이다.
도 6: 건강한 마우스에서 VXM-SCV-42에 의해 유발된 면역 반응. 백신 접종된 마우스의 혈청에서 SARS-CoV 스파이크 단백질에 대한 항체를 분석하였다 (실시예 7 참조). 분석 백그라운드는 점선 직선으로 표시된 400 엔드포인트 역가이다.
도 7: 건강한 마우스에서 VXM-SCV-53에 의해 유발된 면역 반응. 백신 접종된 마우스의 혈청에서 SARS-CoV 스파이크 단백질에 대한 항체를 분석하였다 (실시예 8 참조). 분석 백그라운드는 점선 직선으로 표시된 400 엔드포인트 역가이다.
본 발명은 적어도 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 포함하는 DNA 분자를 포함하는 살모넬라 티피 Ty21a 균주를 포함하는 DNA 백신을 제공한다.
본 발명에서, 살모넬라 티피 Ty21a 균주는 DNA 분자를 표적 세포로 전달하기 위한, 적어도 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 포함하는 DNA 분자의 박테리아 담체로서 기능한다. 따라서, DNA 분자는 숙주 세포에 전달되기 위한 것이며, S 단백질 또는 이의 일부는 숙주 세포에 의해 발현된다. 균주 살모넬라 티피 Ty21a는 약독화된 살모넬라 티피 균주이며, 본 발명에 따른 DNA 백신은 살아있는 살모넬라 티피 균주 살모넬라 티피 Ty21a를 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "약독화"는 약독화 돌연변이가 없는 박테리아 모 균주와 비교해 병독성이 저하된 박테리아 균주를 지칭한다. 약독화 박테리아 균주는 바람직하게는 자신의 병독성은 상실하지만 보호 면역 (protective immunity)을 유도하는 능력은 유지한다. 약독화는 병독성, 조절성 및 대사 유전자 등의 다양한 유전자들의 결손을 동반할 수 있다. 약독화 박테리아는 자연적으로 발견할 수 있거나, 또는 실험실에서, 예를 들어 새로운 배지 또는 세포 배양 조건에 적응시킴으로써 인공적으로 구축할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 기법에 의해 구축할 수 있다. 본 발명에 따른 살모넬라 약독화 균주를 약 1011 CFU로 투여시, 바람직하게는, 개체의 5% 미만에서, 더 바람직하게는 1% 미만에서, 가장 바람직하게는 1‰ 미만에서 살모넬라증을 유발한다.
용어 "포함한다" 또는 "포함하는"은 "를 포함하나 이로 제한되지 않는" 것을 의미한다. 이 용어는 열린 의미이며, 임의의 언급된 특징, 요소, 정수, 단계 또는 성분의 존재를 명시하기 위한 것이나, 하나 이상의 다른 특징, 요소, 정수, 단계, 성분 또는 이들의 군의 존재 또는 추가를 배제하는 것은 아니다. 따라서, 용어 "포함하는"은 보다 한정적인 용어 "로 이루어지는" 및 "로 필수적으로 이루어지는"을 망라한다. 일 구현예에서, 용어 "포함하는"은 용어 "로 이루어지는"으로 개별적으로 치환될 수 있다. 서열과 관련하여, 용어 "의 아미노산 서열을 가진" 및 "의 아미노산을 포함하는"은 상호 호환적으로 사용되며, "의 아미노산 서열로 이루어진" 구현예를 포함한다. 본원에서 용어 "부정관사 (a)"는 복수형을 포괄할 수 있으며, 그래서 "하나"를 포함하지만 이로 제한되는 것은 아니다.
본원에서, 용어 "SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부" 또는 "다른 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 일부"는 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 면역원성 영역 또는 다른 SARS-CoV-2 단백질 및 이의 면역원성 영역을 지칭한다. 단백질의 면역원성 영역은 면역원성 단백질의 하나 이상의 도메인(들)을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명에서는, 면역원성 영역은 수용체 결합 도메인 또는 엑토도메인과 같은 도메인의 면역원성 부분만을 포함하는 것으로, 포함된다. 본원에서, 용어 "면역원성"은 B 세포 및/또는 T 세포와 같이 면역 반응을 유발하는 단백질의 부분을 지칭한다.
하나 이상의 진핵생물 발현 카세트를 포함하는 DNA 분자는 또한 재조합 DNA 분자로서, 즉 바람직하게는 여러가지 기원의 DNA 조각들로 구성된, 조작된 DNA 구조체를 지칭할 수 있다. DNA 분자는 선형 핵산 또는 원형 핵산일 수 있다. 바람직하게는, DNA 분자는 플라스미드, 더 바람직하게는 발현 플라스미드이다. 플라스미드는 적어도 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 플라스미드의 진핵생물 발현 카세트에 도입함으로써 구축할 수 있다. 진핵생물 발현 카세트를 포함하는 플라스미드는 또한 진핵생물 발현 플라스미드로 지칭될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "발현 카세트"는 발현을 제어하는 조절 서열의 통제 하에 하나 이상의 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 핵산 유닛을 지칭한다. 바람직하게는, 발현 카세트는 또한 전사 종결 신호를 포함한다. 발현 카세트는 바람직하게는 표적 세포에서 적어도 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 함유된 오픈 리딩 프레임의 전사를 매개할 수 있다. 진핵생물 발현 카세트는 전형적으로 진핵생물 표적 세포에서 발현을 허용하는, 프로모터, 하나 이상의 오픈 리딩 프레임 및 전사 종결 신호를 포함한다.
코로나바이러스는 코로나비리대 과에 속하는 (+) 센스 단일 가닥 DNA 바이러스이다. 이들 바이러스는 대부분 조류 및 포유류 등의 동물을 감염시킨다. 인간에서, 코로나바이러스는 전형적으로 경미한 호흡기 감염을 유발한다. 2003년 이래로, 병원성이 높은 인간 코로나바이러스 2종, 즉 중증 급성 호흡 증후군 코로나바이러스 (SARS-CoV)와 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 (MERS-CoV)가 이환율 및 사망율이 높은 전세계 유행을 일으켰다. 이들 2종의 지역 유행병은 코로나비리대의 베타코로나바이러스 속에 속하는 인수공통 감염성 코로나바이러스에 의해 유발되었다.
SARS-CoV 및 MERS-CoV와 마찬가지로, 새로운 SARS-CoV-2는 베타코로나바이러스 속에 속한다. SARS-CoV-2의 게놈은 약 30 킬로베이스이고, 복수의 구조 단백질과 비-구조 단백질을 코딩한다. 구조 단백질은 스파이크 (S) 단백질, 외막 (E) 단백질, 막 (M) 단백질, 및 뉴클레오캡시드 (N) 단백질을 포함한다. Zhou et al. (Cell Discovery (2020) 6:14)에서 보고된 바와 같이, SARS-CoV-2는 SARS-CoV와 가장 높은 뉴클레오티드 서열 동일성을 공유한다 (79.7%). 특히, SARS-CoV-2의 외막 및 뉴클레오캡시드 단백질은 진화적으로 보존된 영역으로, SARS-CoV에 대한 서열 동일성은 각각 96% 및 89.6%이다. 스파이크 단백질은 SARS-CoV-2와 SARS-CoV 간에 서열 보존성이 가장 낮은 것으로 발표되었으며 (서열 동일성 77%), SARS-CoV-2의 스파이크 단백질은 MERS-CoV의 스파이크 단백질에 대한 서열 동일성이 31.9%에 불과하다. 몇몇 비-구조 단백질들이 SARS-CoV-2에서 예측되었으며, 이는 오픈 리딩 프레임 ORF 1ab, ORF 3a, ORF3b, ORF6, ORF 7a, ORF7b, ORF8, ORF9a, ORF9b 및 ORF10에 의해 코딩된다 (Srinivasan et al. Viruses (2020) 12:360). 한편, SARS-CoV-2의 변이체 수종이 동정되었다: 예를 들어, 영국에서 최초로 보고된 SARS-CoV-2 계열 B.1.1.7, 남아프리카에서 최초로 보고된 B.1.351 계열 및 브라질에서 최초로 보고된 B.1.1.28 하위군 (subclade), P.1으로 명칭 변경됨 (Galloway et al., MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2021 Jan 22; 70(3): 95-99). Galloway 등에 따르면, 이들 변이체는, 바이러스 유입을 촉진하기 위해 숙주 세포 안지오텐신-변환 효소-2 (ACE-2) 수용체에 결합하는데 필수적인 S 단백질 수용체-결합 도메인 등에서 유전자 돌연변이 일군을 가진다. 이들 변이체는 더 효과적으로 전파하는 것으로 보인다.
SARS-CoV와 관련한 다양한 보고들은 체액성 및 세포-매개 면역 반응의 보호 역할을 제안한다. S 단백질은 대부분 노출된 단백질로서, SARS-CoV S 단백질에 대한 항체 반응이 마우스 모델에서 SARS-CoV 감염으로부터 보호하는 것으로 입증되어 있다. 그러나 효과적인 항체 반응은 수명이 짧을 수 있다. 이와는 대조적으로, T 세포 반응은 장기간의 보호를 제공하는 것으로 입증되어 있다. 아울러, 여러 연구들에서, SARS-CoV의 N 단백질에 대한 항체들이 구축되었고, SARS-CoV-2까지 확장되었으며, N 단백질은 감염 중에 발현되는 고 면역원성의 풍부한 단백질인 것으로 입증되어 있다. 나아가, 구조 단백질들 중, S 단백질 및 N 단백질에 대한 T 세포 반응이 가장 우세하고 장기간 지속되는 것으로 보고되어 있다 (Ahmed et al. Viruses (2020) 12:254). 살모넬라, 살모넬라 티피 Ty21a의 약독화 균주는 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica) 종의 것이다. 살모넬라 엔테리카의 약독화 변이체는, 살모넬라 엔테리카 균주가 비경구 투여와 비교해 간단하고 안전한 이점을 제공하는 점막 면역화 경로, 즉 경구 또는 코를 통해 전달할 가능성이 있어, 포유류 면역 시스템에 이종의 (heterologous) 항원을 전달하기 위한 매력적인 비히클이다. 아울러, 살모넬라 균주는 전신 및 점막 구역 둘다에서 강력한 체액성 및 세포성 면역 반응을 유발한다. 배치 제조 비용이 저렴하고, 박테리아 생균 백신은 제형이 매우 안정적이다. 약독화는 병독성, 조절 및 대사 유전자 등의 다양한 유전자의 결손에 의해 달성할 수 있다.
aro 돌연변이에 의해 약독화된 살모넬라 티피무리움 균주 수종이 동물 모델에서 이종의 항원에 대한 안전하고 효과적인 전달 비히클인 것으로 입증되어 있다.
약독화된 균주 살모넬라 티피 Ty21a는 장티푸스에 대한 백신으로서, 그리고 주로 종양 항원 및/또는 기질 항원에 대한 백신 접종에서, 인간 백신 접종을 위한 이종의 항원들에 대한 전달 비히클로서 안전하고 효과적인 것으로 입증되어 있다.
약독화된 살모넬라 티피 Ty21a 생균주는 Vivotif® (제조사: Berna Biotech Ltd., a Crucell Company, Switzerland)로도 알려진 Typhoral L®의 활성 성분이다. 이는 현재 유일하게 허가된 장티푸스 경구 생 백신이다. 이 백신은 광범위하게 조사되었으며, 환자 독성뿐 아니라 제3자 전파와 관련해 안전한 것으로 입증되어 있다 (Wahdan et al., J. Infectious Diseases 1982, 145:292-295). 이 백신은 40개국 이상에서 허가되었으며, 장티푸스 예방 백신용으로 어린이 수천명을 비롯한 수백만명들에 사용된 바 있다. Typhoral L®의 판매 허가 번호는 1996년 12월 16일 PL 15747/0001이다. 백신의 1회 용량은 생존가능한 살모넬라 티피 Ty21a를 적어도 2x109 콜로니 형성 단위로, 그리고 비-생존성 살모넬라 티피 Ty21a 세포를 적어도 5x109개 함유한다.
이러한 장티푸스에 대해 잘-용인되는 경구 생 백신은 야생형의 병독성 박테리아 분리주 살모넬라 티피 Ty2의 화학적 돌연변이 유발을 통해 파생된 것으로, 갈락토스 대사 불능을 유발하는 galE 유전자의 기능 상실 돌연변이를 가지고 있다. 이 약독화 박테리아 균주는 또한 설페이트를 설파이드로 환원하지 못하며, 이런 점에서 야생형 살모넬라 티피 Th2 균주와 구별된다. 살모넬라 티피 Ty21a 균주는, 혈청학적 특징과 관련하여, 박테리아의 외막 다당류인 09-항원을 가지고 있지만 살모넬라 티피무리움의 특징적인 성분인 05-항원은 결핍되어 있다. 이러한 혈청학적 특징은 배치 출하를 위한 동일성 검사 (identity test) 패널의 각 검사를 포함하여야 하는 이유를 뒷받침해준다.
SARS-CoV-2 S 단백질은 삼량체 당 N-연결된 당화 부위 66개를 가지고 있는 당단백질이다. 이 단백질은 또한 잔기 S673, T678 및 S686에 O-연결된 글리칸을 포함한다. 아울러, S 단백질은 2개의 기능성 도메인을 가지고 있다: 수용체 결합 도메인, 및 바이러스와 세포 막의 융합을 매개하는 서열을 가진 제2 도메인. S 당단백질은 세포 프로테아제에 의해 절단되어 융합 서열을 노출시킬 수 있어야 하며, 그래서 세포 유입에 필수적이다. SARS-CoV-2의 S 당단백질의 단백질 서열에서, 서열 PRRA의 삽입으로 인해 잔기 681-687 위치에서 푸린 절단 서열 (PRRARS|V)가 드러난다. 푸린 프로테아제는 호흡기에 풍부하므로, SARS-CoV-2 S 당단백질은 상피 세포로부터 배출시 절단되며, 궁극적으로 다른 세포를 효율적으로 감염시킬 수 있다.
본 발명에 따른 DNA 백신용으로 사용되는 발현 카세트는 진핵생물 발현 카세트이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "진핵생물 발현 카세트"는 진핵생물 세포에서 오픈 리딩 프레임의 발현을 허용하는 발현 카세트를 지칭한다. 적절한 면역 반응을 유도하기 위해 필요한 이종의 항원의 양이 박테리아에 독성일 수 있으며, 세포 사멸, 과도한 약독화 또는 이종의 항원의 발현 감소를 야기할 수 있는 것으로 입증되어 있다. 박테리아 벡터에서 발현되지 않고 표적 세포에서만 발현되는 진핵생물 발현 카세트를 이용해, 이러한 독성 문제를 극복할 수 있으며, 발현된 단백질은 전형적으로 진핵생물의 당화 패턴을 가진다.
진핵생물 발현 카세트는 진핵생물 세포에서 오픈 리딩 프레임의 발현을 제어할 수 있는 조절 서열, 바람직하게는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 본 발명의 살모넬라의 약독화 균주에 포함되는 재조합 DNA 분자에 함유되는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호는 바람직하게는 면역화 대상 세포 안에서 기능성인 것으로 선택된다. 적절한 프로모터, 특히 인간 DNA 백신을 제조하기에 적절한 프로모터에 대한 예로는, 비-제한적으로, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 유래 프로모터, 예를 들어 강력한 CMV 최초기 (immediate early) 프로모터, 유인원 바이러스 40 (SV40) 유래 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 유래 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 유래 프로모터, 예를 들어 HIV 긴 말단 반복체 (LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스 (Moloney virus) 유래 프로모터, 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 유래 프로모터 및 라우스 육종 바이러스 (RSV) 유래 프로모터, CMV 초기 인핸서 인자, 프로모터, 닭 β-액틴 유전자의 제1 엑손과 제1 인트론, 및 토끼 베타 글로빈 유전자의 스플라이싱 어셉터로 구성된 합성 CAG 프로모터, 뿐만 아니라 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 및 인간 메탈로티오네인과 같은 인간 유전자 유래 프로모터가 있다. 특정 구현예에서, 진핵생물 발현 카세트는 CMV 프로모터를 함유한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "CMV 프로모터"는 강력한 최초기 사이토메갈로바이러스 프로모터를 지칭한다.
적절한, 특히 인간 DNA 백신을 제조하는데 적절한 폴리아데닐화 신호에 대한 예로는, 비-제한적으로, 보바인 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 부위, SV40 폴리아데닐화 신호 및 LTR 폴리아데닐화 신호가 있다. 일 특정 구현예에서, 본 발명의 살모넬라 약독화 균주에 포함되는 재조합 DNA 분자에 함유된 진핵생물 발현 카세트는 BGH 폴리아데닐화 부위를 포함한다.
프로모터 및 폴리아데닐화 신호와 마찬가지로 이종의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부를 발현시키는데 필요한 조절 요소들 외에도, 다른 요소들 역시 진핵생물 발현 카세트에 함유될 수 있다. 이러한 부가적인 요소로는 인핸서를 포함한다. 인핸서는, 예를 들어, 인간 액틴의 인핸서, 인간 미오신의 인핸서, 인간 헤모글로빈의 인핸서, 인간 근육 크레아틴의 인핸서, 및 CMV, RSV 및 EBV로부터 유래하는 것 등의 바이러스 인핸서일 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 일반적으로, 포유류 발현, 특히 인간 발현을 위해 코돈-최적화된, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부 (뿐만 아니라 선택적인, 추가의 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 일부, 예를 들어 SARS-CoV-2 N 단백질 또는 이의 일부)를 코딩하는 유전자 (또는 오픈 리딩 프레임)를 이용하는 것이 유리하다. 따라서, 특정 구현예에서, 진핵생물 발현 카세트는 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 코돈-최적화된 서열을 적어도 포함한다.
본 발명에 따른 DNA 백신에 의해 코딩되는 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부는, (a) SARS-CoV-2 전장 S 단백질; (b) SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인; (c) SARS-CoV-2 단백질 서브유닛 S1; (d) SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인 (RBD); 또는 (e) SARS-CoV-2 S 단백질의 면역-우세 에피토프 적어도 3개를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
특정 구현예에서, COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질은 SARS-CoV-2 전장 S 단백질이다. SARS-CoV-2 전장 S 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과의 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, SARS-CoV-2 전장 S 단백질은 서열번호 1과의 서열 동일성이 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%인 아미노산 서열을 가진다. 일 구현예에서, SARS-CoV-2 전장 S 단백질은 서열번호 1과의 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 가진다. 특정 구현예에서, COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과의 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열로 이루어진 SARS-CoV-2 전장 S 단백질이다. 서열번호 1의 아미노산 서열은 GenBank 등재 번호 MN_908947이며, Wu et al. (Nature 2020, 579: 265-269)에 의해 발표되었다. 특정 구현예에서, SARS-CoV-2 전장 S 단백질은 또한 계통 B.1.1.7, B.1.351 또는 P.1과 같은 SARS-CoV-2의 변이체의 전장 S 단백질일 수 있다.
본 발명자들은 GenBank에서 이용가능한 SARS-CoV-2의 여러가지 S 단백질 서열들을 GenBank 등재 번호들 (단백질-id)의 서열을 정렬하여 비교하였으며: MN_908947 (QHD434616.1), MN_988668 (QHQ62107.1), NC_045512 (YP_009724390.1), MN_938384.1 (QHN73795.1), MN_975262.1 (QHN73810.1), MN_985325.1 (QHQ60594.1), MN_988713.1 (QHQ62877.1), MN_994467.1 (QHQ71963.1), MN_994468.1 (QHQ71973.1), 및 MN997409.1 (QHQ82464.1), 차이는 발견되지 않았다. 그러나, SARS-CoV-2 S 단백질에서 약간의 변형이 기존에 보고된 바 있다. 예를 들어, 다음과 같은 치환들, F32I, H49Y, S247R, N354D, D364Y, V367F, D614G, V1129L 및 E1262G가 Wrapp et al. (Science, 2020, 367: 1260-1263)에서 임상 분리주에서 언급되었다. 아울러, 치환 H49Y 및 V860Q는 Wang et al. (J. Med. Virol. March 13, 2020: 1-8)에서 언급되었다. 동일 저자에 의해 공개된 SARS-CoV-2 서열에 대한 추가적인 상동성 분석에서, S 단백질의 뉴클레오티드 상동성 99.82% 내지 100%, S 단백질의 아미노산 상동성 99.53% 내지 100%가 확인되었다. 동정된 변이체 B.1.1.7, B.1.351 및 P.1은 돌연변이 몇개를 가지고 있다. B.1.1.7 변이체 S 단백질은 69-70 HV 및 144 Y가 결손되어 있고 돌연변이 N501Y, A570D, D614G, P681H, T761I, S982A, D1118H를 가지고 있다. 변이체 B.1.351은 S 단백질에 돌연변이 K417N, E484K, N501Y, D614G 및 A701V를 가지고 있다. P.1 변이체는 S 단백질에 돌연변이 L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y 및 T1027I를 가지고 있다 (Galloway et al., MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2021 Jan 22; 70(3): 95-99). 그러나, 추가적인 치환 또는 변형 역시 경시적으로 발생할 수 있거나, 또는 경시적으로 동정될 수 있다.
SARS-CoV-2 전장 S 단백질은 또한 2 이상의 안정화 돌연변이를 포함하는 등의, SARS-CoV-2 전장 S 단백질의 융합 전-안정화된 형태일 수 있다. 특정 구현예에서, SARS-CoV-2 전장 S 단백질의 융합 전-안정화된 형태는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 K986 및 V987 아미노산 위치에 대응되는 프롤린으로의 안정화 돌연변이 2종을 포함한다.
SARS-CoV-2 S 단백질의 융합 전-안정화된 형태는, C-말단 S2 융합 장치에서 986 및 987 잔기에 2개의 안정화 돌연변이 프롤린을 다른 베타코르나바이러스 S 단백질에서 효과적인 것으로 입증된 기존의 안정화 전략을 이용해 부가함으로써, Wrapp et al. (Science, 2020, 367: 1260-1263)에서 언급된 바 있다. 아울러, Wrapp et al. (Science, 2020, 367: 1260-1263)은, 682-685 잔기 위치에서, 이 위치에서 RRAR 서열을 치환하는, 푸린 절단부 내 "GSAS" 돌연변이를 언급하고 있다. 이들 돌연변이는 단백질을 안정화하여, 융합을 방지한다. 이는 S 단백질의 안정성 및 발현을 개선할 뿐 아니라 세포 융합을 방지함으로써 안전성을 개선할 수 있다. 특정 구현예에서, SARS-CoV-2 전장 S 단백질의 융합 전-안정화된 형태는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 K986 및 V987 아미노산 위치에 대응되는 프롤린으로의 안정화 돌연변이 2개를 포함한다. 및/또는 서열번호 1의 681-687 잔기들에 대응되는 푸린 절단 서열 (PRRARS|V)의 돌연변이, 예를 들어 R682G, R683S 및 R685S 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는, SARS-CoV-2 전장 S 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과의 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 가지며, 추가적으로 안정화 돌연변이 2종 K986P 및 V987P를 포함하거나; 또는 푸린 절단 돌연변이 R682G, R683S 및 R685S를 포함하거나, 또는 안정화 돌연변이 2종 K986P 및 V987P 및 푸린 절단 서열 돌연변이 R682G, R683S 및 R685S를 포함한다. 대안적으로, 푸린 절단 서열의 아미노산은 아미노산 680-683과 같이 결손될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, SARS-CoV-2 전장 S 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과의 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 가지며, 추가적으로 아미노산 S680-R683을 포함하거나 또는 이로 이루어진 결손 등의 푸린 절단 서열에 결손을 포함한다. S 단백질의 융합 전-안정화된 형태를 야기하는 다른 아미노산 치환 또는 아미노산 결손 역시 채택할 수 있다.
특정 구현예에서, COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부는 SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인을 포함한다. 용어 "엑토도메인"은 막관통 단백질 SARS-CoV-2 S 단백질의 세포외 영역을 지칭하며, 즉 막관통 도메인 및 세포질 도메인이 결손되어 있다. 엑토도메인은 수용체 결합 도메인을 포함하는 막 원위 서브유닛 S1과 막 근접 서브유닛 S2를 포함한다. SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인은 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들과 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 포함한다. 그러나, 본원에서, SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인은 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들에 적어도 대응되는 서열일 수 있거나, 또는 서열번호 1의 최대 N-말단 1213번 아미노산 잔기까지 약간 더 길 수도 있거나, 또는 서열번호 1의 1-1213 아미노산 잔기들과 적어도 95%의 서열 동일성을 가진 서열일 수 있다. 바람직한 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부는 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들과 서열 동일성이 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%인 아미노산 서열을 가진 SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인을 포함한다. 일 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인은 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들과 서열 동일성이 적어도 98% 내지 100%인 아미노산 서열을 가진다. 특정 구현예에서, COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부는 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들과 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 가지거나 또는 이로 이루어진 SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인이다. 추가적인 특정 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인은 또한 계통 B.1.1.7, B.1.351 또는 P.1과 같은 SARS-CoV-2의 변이체의 S 단백질 엑토도메인일 수 있다.
SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부는 또한 안정화 돌연변이 2개를 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인의 융합 전-안정화된 형태를 또한 포함할 수 있다. 일 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인의 융합 전-안정화된 형태는 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열에서 K986 및 V987 위치의 아미노산에 대응하는 프롤린으로의 안정화 돌연변이 2개를 포함한다.
특정 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부는 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들과 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 추가적으로 안정화 돌연변이 2종 K986P 및 V987P를 포함한다.
특정 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인의 융합 전-안정화된 형태는 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열에서 K986 및 V987 위치의 아미노산에 대응하는 프롤린으로의 안정화 돌연변이 2개 및/또는 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들로 된 아미노산 서열의 681-687 잔기들에 해당하는 푸린 절단 서열 (PRRARS|V)의 돌연변이, 예를 들어 R682G, R683S 및 R685S 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는, SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인은, 안정화 돌연변이 2종 K986P 및 V987P; 또는 푸린 절단 서열 돌연변이 R682G, R683S 및 R685S, 또는 안정화 돌연변이 2종 K986P 및 V987P와 푸린 절단 서열 돌연변이 R682G, R683S 및 R685S를 포함하는, 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들로 된 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진다. 대안적으로, 푸린 절단 서열의 아미노산은 아미노산 680-683과 같이 결손될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, SARS-CoV-2 전장 S 단백질은, 아미노산 S680-R683을 포함하거나 또는 이로 이루어진 결손과 같은 푸린 절단 서열 내 결손을 포함하는, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과의 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 가진다. S 단백질 엑토도메인의 융합 전-안정화된 형태를 야기하는 기타 아미노산 치환 또는 아미노산 결손 역시 채택할 수 있다.
SARS-CoV-2 엑토도메인은 안정화 및/또는 발현 개선 및/또는 분비 개선을 위해 융합 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 융합 도메인은 또한 C-말단 T4 피브리틴 삼량체화 모티프와 같은 삼량체화 도메인일 수 있다. "foldon"으로 지칭되는 박테리오파지 T4 피브리틴의 삼량체화 도메인은 피브리틴 단백질의 aa 457-483 아미노산 잔기에 해당하는 아미노산 서열 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (서열번호 10)을 가진다.
SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 서열은, 바람직하게는, 신호전달 펩타이드를 코딩하는 신호전달 서열을 포함한다. SARS-CoV-2 S 단백질의 신호전달 펩타이드는, 예를 들어, 서열번호 1의 1-15 아미노산 잔기들에 대응되는 아미노산 서열: MFVFLVLLPLVSSQC (서열번호 3) 또는 서열번호 3의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 동등한 기능성의 신호 전달 펩타이드를 가진다. 일 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질의 신호 전달 펩타이드는 불변 체인의 신호 펩타이드이며, 바람직한 구현예에서 서열번호 1의 1-12 아미노산 잔기들은 서열번호 15의 1-29 아미노산 잔기들로 치환된다.
특정 구현예에서, COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부는 SARS-CoV-2 S 단백질 서브유닛 S1을 포함한다. SARS-CoV-2 S 단백질 서브유닛 S1은 서열번호 1의 1-681번 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 1-681번 아미노산 잔기들과 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부는 서열번호 1의 1-681 아미노산 잔기들로 된 서열과 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진 SARS-CoV-2 S 단백질 서브유닛 S1을 포함한다. 일 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질 서브유닛 S1은 서열번호 1의 1-681 아미노산 잔기들에 대해 적어도 98% 내지 100%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진다. 특정 구현예에서, COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부는 서열번호 1의 1-681번 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 1-681번 아미노산 잔기들과 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 가지거나 또는 이로 이루어진, SARS-CoV-2 S 단백질 서브유닛 S1이다. 추가적인 특정 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질 서브유닛 S1은 계통 B.1.1.7, B.1.351 또는 P.1과 같은 SARS-CoV-2의 변이체의 S 단백질 서브유닛 S1일 수 있다.
특정 구현예에서, COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부는 SARS-CoV-2 S 단백질 수용체 결합 도메인 (RBD)을 포함한다. SARS-CoV-2 S 단백질 RBD는 서열번호 1의 319-541번 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 319-541번 아미노산 잔기들과 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부는 서열번호 1의 319-541 아미노산 잔기들로 된 서열에 대해 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진 SARS-CoV-2 S 단백질 RBD를 포함한다. 일 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질 RBD는 서열번호 1의 319-541 아미노산 잔기들에 대해 적어도 98% 내지 100%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진다. 특정 구현예에서, COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부는, 서열번호 1의 319-541번 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 319-541번 아미노산 잔기들과 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 가지거나 또는 이로 이루어진, SARS-CoV-2 S 단백질 RBD이다. 특정 구현예에서, SARS-CoV-2 S 단백질 RBD는 또한 계통 B.1.1.7, B.1.351 또는 P.1과 같은 SARS-CoV-2의 변이체의 S 단백질 RBD일 수 있다.
SARS-CoV-2 전장 S 단백질, SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인, SARS-CoV-2 단백질 서브유닛 S1 또는 SARS-CoV-2 RBD를 이용하는 한가지 이점은, SARS-CoV-2 돌연변이에 비해 우수한 효능을 유지하는 다클론 체액성 면역 반응 (중화 항체 반응 등)을 제공할 뿐 아니라 세포성 면역 반응이 MHC 제한되지 않으며 그래서 특정 HLA 타입을 가진 환자로 제한되지 않는다는 것이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "와 적어도 95%의 서열 동일성"은 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들로 된 아미노산 서열, 서열번호 1의 1-681번 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 319-541번 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열 (또한, 이의 대응되는 영역으로도 언급됨)을 코딩하는, 아미노산 서열 및/또는 핵산 서열에 차이가 있을 수 있는, 단백질을 지칭한다. S 단백질 또는 이의 일부는 천연 기원일 수 있으며, 예를 들어 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 SARS-CoV-2의 S 단백질의 돌연변이 버전 또는 변이체, 또는 부위 특이적인 돌연변이 또는 클로닝 또는 이들의 조합의 도입에 의해 변형된 조작된 단백질, 예를 들어 조작된 당단백질 유도체일 수 있다. 코돈 용법은 종에 따라 다른 것으로 알려져 있다. 따라서, 이종의 단백질을 표적 세포에서 발현할 경우, 핵산 서열을 표적 세포의 코돈 용법에 맞게 조정하는 것이 필수적이거나 또는 적어도 유익할 수 있다. 주어진 단백질에 대한 유도체를 설계 및 구축하는 방법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다. 핵산 서열을 표적 세포의 코돈 용법에 맞게 조정하는 것은 코돈-최적화로도 알려져 있다.
서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 대응되는 부분에 대해 적어도 약 95%의 서열 동일성을 공유한, S 단백질 또는 이의 일부는, 하나 이상의 아미노산의 부가, 결손 및/또는 치환을 포함하는 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 본 발명의 교시 내용에 따라, 이러한 결손, 부가 및/또는 치환된 아미노산은 연속적인 아미노산일 수 있거나, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 대응되는 부분에 대해 적어도 약 95%의 서열 동일성을 공유한, S 단백질 또는 이의 일부의 아미노산 길이에 따라 산재되어 있을 수 있다. 본 발명의 교시 내용에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 대응되는 부분에 대한 아미노산 서열 동일성이 적어도 약 95%인 한, 임의 개수의 아미노산이 부가, 결손 및/또는 치환될 수 있다. 특정 구현예에서, S 단백질 또는 이의 일부의, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 대응되는 부분에 대한 서열 동일성은, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 바람직하게는 적어도 99%이다. 모든 %는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 대응되는 부분 (예, 1-1208 아미노산 잔기, 1-681 아미노산 잔기 또는 329-541 아미노산 잔기)과 연관되어 있다. 부모 단백질, 및 부모 서열에 대해 결손, 부가 및/또는 치환을 가진 이의 유도체를 비교하는 것을 포함하는, 서열 동일성을 결정하기 위한 방법 및 알고리즘은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다. DNA 수준에서, 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 약 95%의 서열 동일성을 공유한 S 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 핵산 서열은, 유전자 코돈의 축중 및 선택적인 코돈-최적화로 인해, 좀더 큰폭으로 다를 수 있다.
본 발명에서, DNA 백신은, 특정 구현예에서, N-말단에서 C-말단 방향으로 적어도 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부 및 인핸서 서열, 예를 들어 보체 펩타이드 서열, 더 바람직하게는 3 카피의 보체 단백질 C3d (서열번호 4), 바람직하게는 GS 링커에 의해 분리되어 있는 C3d 3개 각각 (3C3d; 서열번호 5)을 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 가진 DNA 분자를 함유한 살모넬라 티피 Ty21a 균주를 포함할 수 있다. 이러한 서열은 체액성 면역 반응을 강화하는 것으로, 특히 더 강한 항체 반응을 유도하는 것으로 언급되어 있다. SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부가 SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인, SARS-CoV-2 S 단백질 서브유닛 S1 또는 SARS-CoV-2 S 단백질 RBD를 포함하는 경우, 진핵생물 발현 카세트는, 바람직하게는 SARS-CoV-2 S 단백질 영역에 융합된, C-말단 T4 피브리틴 삼량체화 모티프 (서열번호 10)와 같은 삼량체화 도메인을 추가로 코딩할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, DNA 백신은, N-말단에서 C-말단 방향으로 SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인, SARS-CoV-2 S 단백질 서브유닛 S1 또는 SARS-CoV-2 S 단백질 RBD (바람직하게는 SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인), 삼량체화 도메인 및 선택적으로 인핸서 서열, 예를 들어 보체 펩타이드 서열을 포함하는 적어도 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 가진, DNA 분자를 함유한 살모넬라 티피 Ty21a 균주를 또한 포함할 수 있다.
유비퀴틴 펩타이드 서열 또는 MHC 클래스 I 또는 II 분자에서 항원 제시를 촉진하기 위한 보체 펩타이드 서열과 같은 예시적인 인핸서 서열들이 각각 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 살모넬라 티피무리움에 의해 전달되는 유비퀴틴 펩타이드 및 MHC 클래스 I 항원을 코딩하는 플라스미드 벡터는 항원-특이적인 T 세포 반응 및 종양 제어를 B16 종양 챌린지 모델에서 강화하는 것으로 입증된 바 있다 (Xiang et al, PNAS, 2000). DNA 벡터에 의해 코딩된 B 세포 에피토프에 대한 항체 반응은, B 세포 및 여포 수지상 세포 상에서 발견되는 CR2 (CD21) 수용체에 결합하여 항원-특이적인 B 세포 활성화를 강화하는, 보체 단백질 C3d의 펩타이드 3 카피를 도입함으로써, 강화될 수 있는 것으로 입증되어 있다 (Moveseyan, J Neuroimmunol, 2008; Yang, Virus Res, 2010; Hou, Virology J, 2019). 따라서, B 세포 반응을 강화하기 위해, 보체 단백질 C3d (KFLTTAKDKNRWEDPGKQLYNVEATSYA; 서열번호 4)의 3 카피 등의 보체 펩타이드 서열을 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 서열에 C-말단에서 추가할 수 있다. 바람직하게는, 28 아미노산 펩타이드 3개는 서열번호 5 (3C3d)에서와 같이 GS(G4S)2GS 등의 GS 링커에 의해 분리되어 있다. 나아가, 적어도 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 포함하는 DNA 분자 (예, 플라스미드)를 세포질에서 핵으로의 도입을 개선하기 위해, DNA 분자는, SV40 DNA 핵 표적화 서열 (DTS; 서열번호 16) 1카피 이상, 바람직하게는 DTS 2카피 이상과 같이, DNA 핵 표적화 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 DNA 백신은 다른 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 일부, 바람직하게는 SARS-CoV-2 N 단백질 또는 이의 일부를 추가로 코딩할 수 있다. 바람직한 구현예에서, SARS-CoV-2 N 단백질 또는 이의 일부는 서열번호 8 또는 이의 일부의 서열 또는 서열번호 8 또는 이의 대응되는 부분에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 바람직하게는, SARS-CoV-2 N 단백질 또는 이의 일부는 서열번호 8의 서열에 대해 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진다. 일 구현예에서, SARS-CoV-2 N 단백질 또는 이의 일부는 서열번호 8 또는 이의 대응되는 부분의 서열에 대해 적어도 98% 내지 100%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진다. 추가적인 구현예에서, SARS-CoV-2 N 단백질 또는 이의 일부는 또한 계통 B.1.1.7, B.1.351 또는 P.1과 같은 SARS-CoV-2의 변이체의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
다른 SARS-CoV 2 단백질 또는 이의 일부는 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부 이외의 다른 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 단백질을 적어도 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 가진 DNA 분자를 함유한 살모넬라 티피 Ty21a 균주를 포함하는 추가의 DNA 백신에 의해 발현될 수 있다. DNA 백신 2종은 SARS-CoV-2 S 단백질 및 다른 SARS-CoV-2 단백질에 대해 면역 반응을 유발하기 위해 공동-투여할 수 있다. 대안적으로, 다른 SARS-CoV 2 단백질 또는 이의 일부는 다른 SARS-CoV-2 단백질을 코딩하는 제2 DNA 분자를 추가로 포함하는 본 발명에 따른 DNA 백신에 의해 발현될 수 있다. 따라서, DNA 백신은 적어도 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 단백질 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 포함하는 제1 DNA 분자, 및 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부 이외의 다른 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 단백질을 적어도 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 가진 제2 DNA 분자를 함유한, 살모넬라 티피 Ty21a 균주를 포함한다. 바람직하게는, 제1 DNA 분자 및 제2 DNA 분자는 플라스미드, 바람직하게는 발현 플라스미드이다. 더 바람직하게는, 플라스미드는 pVAX10 백본과 동일한 벡터 백본을 가진다. 또한, 다른 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 일부가, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 제1 발현 카세트 및 다른 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 제2 발현 카세트를 포함하는 동일한 DNA 분자에 의해, 발현되는 것 역시 고려된다. 이들 구현예들 모두, 앞서, 특히 추가로 정의되는, 인핸서 서열 및/또는 삼량체화 도메인을 선택적으로 포함하는 적어도 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 발현 카세트를 참조하는 구현예들과 자유롭게 조합될 수 있다.
DNA 분자가 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부; 및 다른 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 포함하는 것 역시 추가로 고려된다. 따라서, 특정 구현예에서, DNA 백신은, 적어도 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부; 및 다른 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 단백질 (구조 또는 비-구조)을 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 가진 DNA 분자를 함유한 살모넬라 티피 Ty21a 균주를 포함한다. 바람직하게는, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부는 N-말단에서 발현되며, 다른 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 일부는 C-말단에서 발현된다. 하기 구현예들은, 앞서, 특히 추가적으로 정의되는, 인핸서 서열 및/또는 삼량체화 도메인을 선택적으로 포함하는 적어도 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 발현 카세트에 대한 구현예들과 자유롭게 조합될 수 있다. 바람직한 구현예에서, DNA 백신은 적어도 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부; 및 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) N 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 포함하는 DNA 분자를 함유한 살모넬라 티피 Ty21a 균주를 포함한다. SARS-CoV-2 N 단백질 또는 이의 일부는, 서열번호 8 또는 이의 일부의 서열, 또는 서열번호 8 또는 이의 대응되는 부분에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, SARS-CoV-2 N 단백질 또는 이의 일부는 서열번호 8의 서열에 대해 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진다. 일 구현예에서, SARS-CoV-2 N 단백질 또는 이의 일부는 서열번호 8 또는 이의 대응되는 부분에 대해 적어도 98% 내지 100%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진다. 일 구현예에서, SARS-CoV-2 N 단백질 또는 이의 일부는 또한 계통 B.1.1.7, B.1.351 또는 P.1과 같은 SARS-CoV-2의 변이체의 아미노산 서열을 가질 수 있다. SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부는 2A 자기-절단 펩타이드 (2A 펩타이드) 또는 내부 리보솜 도입부 (IRES), 바람직하게는 2A 펩타이드를 통해 다른 SARS-CoV-2 단백질에 연결될 수 있다. 2A 펩타이드의 예는 아미노산 서열 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (서열번호 6)을 가진 P2a 또는 아미노산 서열 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (서열번호 7)을 가진 T2a이다.
본 발명에서, DNA 백신은 N-말단에서 C-말단 방향으로 적어도 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부; 2A 펩타이드 또는 IRES 서열; 및 다른 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 일부, 바람직하게는 SARS-CoV-2 N 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 가진 DNA 분자를 함유한 살모넬라 티피 Ty21a 균주를 포함할 수 있다. 다른 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 일부는, 특히 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부가 SARS-CoV-2 단백질 서브유닛 S1인 경우에, 그 다음으로 SARS-CoV-2 단백질 서브유닛 S2가 추가로 있을 수 있다. 특정 구현예에서, SARS-CoV-2 단백질 서브유닛 S2는 서열번호 1의 686-1208 아미노산 잔기, 또는 서열번호 1의 686-1208번 아미노산 잔기들에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 서브유닛 S2는 서열번호 1의 686-1273 아미노산 잔기들을 포함하거나, 또는 서열번호 1의 686-1273 아미노산 잔기들에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.
다른 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 일부는, 유비퀴틴 서열과 같은 인핸서 서열이 추가로 앞에 놓일 수 있다. 유비퀴틴은 마우스와 인간 간에 보존되어 있으며, 아미노산 서열 MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRG (서열번호 9)을 가진다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, N-말단 유비퀴틴 서열은 항원의 T 세포 반응을 강화할 수 있다. 따라서, N-말단에서 C-말단 방향으로 적어도 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부, 2A 펩타이드 또는 IRES 서열, 유비퀴틴 서열 및 다른 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 일부, 바람직하게는 SARS-CoV-2 N 단백질 또는 이의 일부, 선택적으로 그 다음에 위치한 SARS-CoV-2 단백질 서브유닛 S2를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 가진 DNA 분자를 함유한 살모넬라 티피 Ty21a 균주를 포함하는 DNA 백신도 고려된다.
N 단백질은 주로 T 세포 반응을 유발하는 것으로 간주된다. 살모넬라 티피무리움에 의해 뮤라인으로 전달되는 유비퀴틴 펩타이드 및 MHC 클래스 I 항원을 코딩하는 플라스미드 벡터는 B16 종양 챌린지 모델에서 종양 제어 및 항원-특이적인 T 세포 반응을 강화하는 것으로 입증되어 있다 (Xiang et al, PNAS, 2000). 따라서, T 세포 강화 서열은, 바람직하게는 N-말단에서, SARS-CoV-2 N 단백질 또는 이의 일부와 같은 다른 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 일부와 융합될 수 있다.
용어 "2A 자기-절단 펩타이드", "2A 절단부" 또는 "2A 펩타이드"는 본원에서 동의어로 사용되며, 세포에서 재조합 단백질의 절단을 유도할 수 있는 18-22 aa-길이의 펩타이드 클래스를 지칭한다. 2A 펩타이드는 본래 바이러스의 게놈 내 2A 영역에서 발견되었으며, 하나의 발현 카세트로 폴리펩타이드를 발현시키기 위한 도구로서 개조된 바 있다. 2A-펩타이드-매개 절단은, 번역 및 절단이 2A 펩타이드의 C-말단에서 프롤린 (P)과 글리신 (G) 사이의 펩타이드 결합을 파괴함으로써 촉발된 후 발생한다. 2A 펩타이드 링커를 코딩하는 서열은, 서열번호 6 또는 7에서 제공되는 바와 같이, 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
본원에서, IRES로 약칭되는 용어 "내부 리보솜 도입부"는 캡-독립적인 방식으로 번역 개시를 허용하여, IRES 서열을 포함하는 mRNA의 번역을 IRES 서열에서 개시되게 하는, RNA 인자이다.
다른 구현예에서, DNA 백신은, 적어도 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 포함하며, COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부는 SARS-CoV-2 S 단백질의 면역-우세 에피토프를 적어도 3개 포함한다. 일 구현예에서, 발현 카세트는 SARS-CoV-2 S 단백질의 면역-우세 에피토프 적어도 3개 및 인핸서 서열, 예를 들어 전술한 보체 펩타이드 서열을 코딩한다.
본원에서, 용어 "SARS-CoV-2 S 단백질의 면역-우세 에피토프 적어도 3개"는 SARS-CoV-2 S 단백질의 면역-우세 에피토프 3개 이상을 함께 포함하는, 폴리펩타이드 하나 또는 2 이상의 폴리펩타이드를 지칭한다. SARS-CoV-2 S 단백질의 3개 이상의 면역-우세 에피토프가 동일한 또는 서로 다른 폴리펩타이드의 일부인지는 무관하다. 따라서, SARS-CoV-2 S 단백질의 3개 이상의 면역-우세 에피토프는 하나의 폴리펩타이드로서, 또는 2 이상의 폴리펩타이드로서 발현될 수 있다. 일 구현예에서, 진핵생물 발현 카세트는 SARS-CoV-2 S 단백질의 면역-우세 에피토프 적어도 3개를 포함하는 하나의 폴리펩타이드를 코딩한다. 적어도 하나 이상의 폴리펩타이드(들) 내에 포함되는 면역-우세 에피토프는 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 50개 이상 또는 그보다 많은 수이다. 본원에서, 살모넬라 티피 Ty21a 균주 맥락에서, SARS-CoV-2 S 단백질의 면역-우세 에피토프 적어도 3개를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트는, 면역-우세 에피토프를 최대 50개, 또는 더 많이, 예를 들어 최대 300개 포함하는 하나의 폴리펩타이드를 코딩할 수 있다. MHC 클래스 I 또는 II (인간의 경우 HLA)에서 펩타이드로서 제시되는 항원은 전형적으로 MHC II (CD4 항원)의 경우 아미노산 11-30개 길이이고, MHC I (CD8 항원)의 경우 아미노산 8-10개 길이이다. 따라서, 하나 이상의 폴리펩타이드 내에 함유될 면역-우세 에피토프에 대한 바람직한 범위는 면역-우세 에피토프 3 내지 300, 5 내지 300, 10 내지 300, 20 내지 300 또는 50 내지 300개이다. 즉, 폴리펩타이드는 E 단백질, M 단백질 또는 N 단백질, 바람직하게는 N-단백질의 구조 단백질과 같은 SARS-CoV-2의 다른 구조 단백질로부터 유래한 면역-우세 에피토프를 추가로 포함할 수 있다. 진핵생물 발현 카세트에 의해 발현될 또는 하나 이상의 폴리펩타이드 안에 함유될 SARS-CoV-2 S 단백질의 면역-우세 에피토프에 대한 바람직한 범위는 3 내지 25, 3 내지 20 또는 5 내지 15개이다. 융합된 면역-우세 에피토프를 포함하는 각 폴리펩타이드는 항원 제시 세포에서 에피토프로 단백질 분해에 의해 절단되며, HLA를 통해 제시되어 T 세포 반응을 유발한다.
SARS-CoV-2의 S 단백질과 SARS-CoV 간의 밀접한 유전자 유사성 (76%)을 감안하면, SARS-CoV-2 T 에피토프와 B 에피토프는 SARS-CoV에 대한 기존 면역학적 연구를 이용해 예측할 수 있다 (Ahmed et al, Viruses, 2020). T 및 B 세포 에피토프는 또한 다양한 HLA 분자의 MHC 클래스 I 및 클래스 II 단백질에 결합하는 아미노산 모티프를 인지하기 위해, 검증된 알고리즘을 이용한 생물정보학적 방식을 이용해 예측할 수도 있다 (Grifoni et al, Cell, 2020). 면역 에피토프 데이터베이스 및 분석 리소스 (IEDB), NetMHCPan 및 NetMHCIIPan과 같은 공개 자료를 이용해 추정의 T 및 B 세포 에피토프들을 구축할 수 있다. 이러한 방식을 이용해, 에피토프에 풍부한 S 단백질의 섹션들을 망라하도록 멀티-에피토프 백신을 설계할 수 있다. 특히 흥미로운 영역 하나는 인간 표적 세포 상에서 안지오텐신-변환 효소 2 (ACE2) 수용체와 상호작용하여 바이러스 유입을 촉진하는 S 단백질의 수용체 결합 모티프 (RBM)이다. SARS-CoV의 RBM에 대한 항체는 중화성이지만, SRS-CoV 및 ARS-CoC-2의 RBM은 50%의 동일성을 공유할 뿐 항체는 교차-중화하지 않는다 (Ju et al, BioRxiv, 2020 - submitted; Walls et al, Cell, 2020).
본 발명에서, SARS-CoV-2 S 단백질의 면역-우세 에피토프 적어도 3개는 CD8 T 세포 항원 및/또는 CD4 T 세포 항원을 포함한다. 바람직하게는, SARS-CoV-2 S의 면역-우세 에피토프 적어도 3개는 CD8 T 세포 항원과 CD4 T 세포 항원을 포함한다.
면역-우세 에피토프는 전형적으로 아미노산 8-30, 바람직하게는 8-20, 더 바람직하게는 8-12개로 된 펩타이드이다.
SARS-CoV-2 S 단백질의 면역-우세 에피토프를 포함하는 백신의 경우, 만일 백신이 S 단백질의, 바람직하게는 추가적으로 심지어 추가적인 구조 단백질, 예를 들어 N 단백질의 복수의 면역-우세 에피토프를 표적화하는 경우에, 이는 S 단백질에서의 돌연변이로 인해 면역-침입 위험을 감소시키므로, 유리하다.
대안적으로, 특정 구현예에서, DNA 백신은, N-말단에서 C-말단 방향으로 SARS-CoV-2 S 단백질의 면역-우세 에피토프 3개, 선택적으로 인핸서 서열, 2A 펩타이드 또는 IRES 서열, 선택적인 유비퀴틴 서열 및 다른 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 일부, 바람직하게는 SARS-CoV-2 N 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 가진 DNA 분자를 함유한 살모넬라 티피 Ty21a 균주를 포함한다. SARS-CoV-2 N 단백질의 일부는 SARS-CoV-2 N 단백질의 면역-우세 에피토프 3개 이상일 수 있다.
살모넬라 티피 Ty21a를, 적어도 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부 (예, SARS-CoV-2 S 단백질의 면역-우세 에피토프 3개, 전장 S 단백질, S 단백질 엑토도메인, S 단백질 서브유닛 S1 또는 S 단백질 RBD)에 대한 담체로서 포함하는 본 발명에 따른 DNA 백신의 이점은, 확립된 정성 관리 분석, 항원을 코딩하는 삽입체에서의 플라스미드 개별 차이, 증폭 필요성 없음 및 경구 투여로 인한 무균 검사와 관련한 요건 부재이다. 아울러, 형질감염뿐 아니라 담체로서 살모넬라 티피 Ty21a 균주에 적합한 발현 플라스미드는 전장 S 단백질 또는 많은 수의 면역-우세 에피토프 등의 큰 삽입체를 허용한다. 2A 펩타이드 또는 IRES 서열을 통해 SARS-CoV-2 N 단백질 또는 이의 일부와 같은 다른 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 일부를 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부에 추가로 도입하는 것도 허용된다.
SARS-CoV-2 S 단백질 (또는 선택적으로 N 단백질)의 면역-우세 에피토프는 링커에 의해 선택적으로 분리된 (하나 이상의 폴리펩타이드로서 발현된) 비드 스트링으로서 플라스미드로 삽입될 수 있다. 링커는 GS 링커, 2A 절단부 또는 IRES 서열일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 빠른 구축 및 제한된 정성 관리 필요성으로 인해, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 하나 이상의 진핵생물 발현 카세트를 가진 DNA 분자를 함유한 살모넬라 티피 Ty21a 균주는 구축 시간이 짧고, 예를 들어 면역-우세 에피토프 또는 새로운 임상 분리주 또는 돌연변이주 등의 항원 동정 후 15일 이내, 바람직하게는 14일 이내에 달성할 수 있다. 밤새 발효로도 충분하며, 박테리아의 고수율 및 배양물 1 L 당 1011 콜로니 형성 단위 (CFU) 범위의 순 수율로 인해 규모 확장이 필요하지 않다. 이는 짧은 제조 시간뿐 아니라 낮은 제조 비용을 허용한다. 아울러, 약물 제품은 적어도 3년간 안정적인 것으로 밝혀져 있다. 따라서, 이 DNA 백신은 필요한 많은 수의 개체에 사용하기 위한 효과적인 SARS-CoV-2 예방학적 및/또는 치료학적 백신을 신속하게 개발 및 생산하는데 적합하다. 아울러, 이는 보관하기 쉽고, 투여를 위한 의학적으로 훈련된 인력을 필요로 하지 않는다.
적어도 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 DNA 서열은 다른 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 DNA와, 비-제한적으로 GS 링커, 2A 절단부 또는 IRES 서열일 수 있는 링커의 사용을 통해 분리되어 있을 수 있다.
단백질에서 면역-우세 에피토프를 검출하는 방법 및 자가 인간 백혈구 항원 (HLA) 분자의 고-친화성 결합성을 가진 펩타이드를 신뢰성있는 예측 또는 결정하는 방법들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 이후, 환자의 자가 HLA-A 또는 HLA-B 단백질에 결합할 가능성이 있는 것으로 예측되거나 또는 집단에서 지배적인, 펩타이드를 선택한다. 이는, 예를 들어, 생체외 인터페론 γ 효소-연계된 이뮤노스팟 (ELISPOT)에 의해 검증할 수도 있다.
특정 구현예에서, DNA 분자 또는 하나 이상의 진핵생물 발현 카세트를 포함하는 DNA 분자는, 카나마이신 항생제 내성 유전자와 같은 항생제 내성 유전자, pMB1 ori 또는 pUC와 같은 ori, 및 CMV 프로모터와 같은 강한 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, DNA 분자 또는 하나 이상의 진핵생물 발현 카세트를 포함하는 DNA 분자는 플라스미드, 예를 들어, 상업적으로 입수가능한 pVAX1TM 발현 플라스미드 (Invitrogen, San Diego, California)를 기반으로 하거나 또는 이로부터 파생되는 플라스미드이다.
이러한 발현 벡터는 고 카피 pUC 복제 오리진을 pBR322의 저 카피 pMB1 복제 오리진으로 치환함으로써 변형할 수도 있다. 저 카피 변형은 대사 부담을 줄이고 구조체를 더 안정적이게 하기 위해 행해진다. 구축된 발현 벡터 백본은 pVAX10으로 명명하였다.
발현 벡터는 또한 MHC 클래스 I 또는 II 분자에서 항원 제시를 촉진하기 위해 유비퀴틴 또는 보체와 같은 인핸서를 함유하도록 설계될 수 있다. 뮤라인으로 살모넬라 티피무리움에 의해 전달되는 유비퀴틴 및 MHC 클래스 I 항원을 코딩하는 플라스미드 벡터는 B16 종양 챌린지 모델에서 종양 제어 및 항원-특이적인 T 세포 반응을 강화하는 것으로 입증되어 있다 (Xiang et al, PNAS, 2000). DNA 벡터에 의해 코딩된 B 세포 에티포트에 대한 항체 반응은, B 세포 및 여포 수지상 세포 상에서 발견되는 CR2 (CD21) 수용체에 결합하여 항원-특이적인 B 세포 활성화를 강화하는, 보체 단백질 C3d의 펩타이드 3 카피를 도입함으로써, 강화될 수 있는 것으로 입증되어 있다 (Moveseyan, J Neuroimmunol, 2008; Yang, Virus Res, 2010; Hou, Virology J, 2019).
몇가지 방법들을 이용해, 펩타이드 유전자 서열 사이에 내부 리보솜 도입부 (IRES)(Ma et al, Hum Vaccin Immunother, 2013) 또는 2A 펩타이드 펩타이드 (Liu et al, Scientific Reports, 2017) 삽입을 비롯하여, 단일 플라스미드 벡터를 이용해 복수의 유전자의 번역을 촉진한 바 있다.
특정 구현예에서, 발현 플라스미드는 발현 벡터 pVAX10의 서열과 연관성이 있는, 서열번호 2 (벡터 백본 pVAX10)의 DNA 분자를 포함하되, 제한효소 부위 NheI 및 XhoI 사이에 위치한 다중 클로닝 부위의 부분은 결핍되어 있다. 일 구현예에서, 발현 플라스미드는 서열번호 2의 핵산 서열 및 서열번호 1 또는 이의 일부의 아미노산 서열 또는 서열번호 1 또는 이의 일부와 적어도 95%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함한다.
서열번호 1을 코딩하는 핵산 서열을 가진 SARS-CoV-2 S 단백질 코딩 ORF를 발현 벡터 백본에 NheI/XhoI을 통해 삽입하여, 발현 플라스미드를 제조하였다. 발현 플라스미드 pVAX10.SCV-1은 도 2에 개략적으로 도시한다.
본 발명에 따른 DNA 백신은 약학적 조성물의 형태일 수 있다. 이에, 특정 구현예에서, 적어도 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 가진 DNA 분자를 함유한 살모넬라 티피 Ty21a 균주를 포함하는 DNA 백신은, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, DNA 백신은 경구 투약 형태이다. 본 발명의 DNA 백신은 용액, 현탁제 또는 의도한 경구 용도에 적합한 임의의 기타 형태일 수 있다. 대안적인 투약 형태는 장용 코팅된 캡슐제 또는 동결건조된 분말이다. 전형적으로, 본 발명에 따른 DNA 백신은 음용 용액으로, 바람직하게는 현탁액으로, 더 바람직하게는 수성 현탁액으로서 제공된다. 이러한 구현예는 환자 순응성이 개선되는 이점을 제공하며, 신속하고, 실현가능하며, 저렴한 대량 백신 접종 프로그램을 특히 열악한 지역에서 허용한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 DNA 백신을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "부형제"는 약제의 활성 성분 이외에 제형화되는 천연 또는 합성 물질을 지칭한다. 적절한 부형제로는 용매, 부착방지제, 결합제, 코팅제, 붕해제, 향제, 착색제, 윤활제, 활택제, 흡착제, 보존제 및 감미제 등이 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 생리학적으로 용인가능하며, 전형적으로 포유류 (예, 인간)에 투여시 원치않은 반응을 발생시키지 않는, DNA 백신과 같은 약학적 조성물의 분자 물질 및 기타 성분을 지칭한다. 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 또한 미국 약전 또는 그외 일반적으로 인정되는 약전에 포유류, 특히 인간 용도로 열거되거나 또는 연방 또는 주 정부의 관리 기관으로부터 허가된 것을 의미할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 DNA 백신 또는 약학적 조성물은 장용 코팅 캡슐제, 동결건조 산제 또는 현탁제 형태이다. 적절한 현탁제는 위산을 특정 정도로 중화하는, 즉 위액의 pH를 pH 7에 가깝게 만드는 수단을 포함한다. 따라서, 특정 구현예에서, 현탁제는, 본 발명에 따른 살모넬라의 약독화 균주를 적절한 완충제, 바람직하게는 위산을 적어도 특정 정도로 중화하는 완충제, 바람직하게는 소듐 하이드로겐 카보네이트 2.6 g, L-아스코르브산 1.7 g, 락토스 일수화물 0.2 g 및 음용수 100 ml을 함유한 완충제에 현탁함으로써 수득되는, 완충화된 현탁물이다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 DNA 백신은 하나 이상의 보강제를 추가로 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "보강제"는 활성 성분, 즉 본 발명에 따른 살모넬라의 약독화 균주의 효과를 변형시키는 물질을 지칭한다. 보강제는 항원에 대한 면역 반응을 부스팅하여, 투여되는 항원의 양을 최소화할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "백신"은 면역화시 개체에서 면역 반응을 유도할 수 있는 물질을 지칭한다. 백신은 바람직하게는 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다. 본 발명에 있어서 백신은 살모넬라 티피, 살모넬라 티피 Ty21a의 약독화된 생 균주를 포함한다. 본 발명에서 백신은 DNA 백신이며, 그래서 적어도 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 포함하는 DNA 분자를 한 카피 이상 추가로 포함한다.
본원에서 용어 "DNA 백신" 또는 "DNA 백신 접종"은, 필요한 환자의 표적 세포에 대해 면역 반응을 달성하고자 하는 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부과 같은 항원(들)을 코딩하는 DNA 서열을 함유한 유전자 조작된 선형 DNA 또는 바람직하게는 플라스미드(들)를 전달함으로써 질환 또는 감염을 예방 또는 치료하기 위한 백신을 지칭한다. 따라서, 항원은 표적 세포에 의해 생산되며, 면역 반응을 유도한다. DNA 백신은 체액성 및/또는 세포-매개 면역 반응과 같은 더 광범위한 범위의 면역 반응 타입을 유도하는 능력 등의 기존의 백신에 비해 잠재적인 이점을 가진다. 플라스미드는, 식염수 중의 주사 이용, 유전자 총, 리포좀 또는 박테리아 및 바이러스 벡터와 같은 담체를 통해서 등의 여러가지 방법에 의해 조직으로 전달할 수 있다. 본 발명에 따른 DNA 백신은 적어도 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 포함하는 DNA 분자를 전달하기 위한 담체로서 살모넬라 티피 Ty21a 균주를 포함한다. 바람직하게는, 약독화된 살아있는 살모넬라 티피 Ty21a 균주에 의해 전달되는 DNA 분자는 플라스미드이다.
본 발명에 따른 살아있는 약독화된 살모넬라 균주는 적어도 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 DNA 분자를 안정적으로 운반한다. 이는 DNA 분자를 경구 전달하기 위한 비히클로서 이용할 수 있다. SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부와 같은 이종의 항원을 코딩하는 DNA 분자를 포함하는 전달 벡터는 본 발명의 맥락에서 DNA 백신으로 지칭된다.
유전자 면역화는 통례적인 예방 백신보다 유리할 수 있다. 표적 DNA가 상당 기간 동안 검출될 수 있어, 항원의 저장소 (depot)로서 작용할 수 있다. 일부 플라스미드에서 CpG 아일랜드와 같은 서열 모티프는 면역자극성이며, LPS 및 기타 박테리아 구성성분으로 인한 면역자극을 통해 추가되는 보강제로서 기능할 수 있다.
살모넬라 티피 Ty21a와 같은 살아있는 약독화된 살모넬라 벡터는 미세캡슐화와 같은 다른 투여 형태를 능가하는 이점을 달성할 수 있는, 지질다당류 (LPS)와 같은 자신의 면역조절 인자를 인 시추로 생산한다. 아울러, 본 발명에 따른 점막 DNA 백신은 유익한 것으로 입증될 수 있는, 코로나바이러스의 천연적인 도입부를 이용한다. 점막 백신 접종은 림프내 (intra-lymphatic) 작용 방식을 가진다. 본 발명에 따른 약독화 백신을 투여한 후, 변형된 박테리아가 대식세포 및 장의 페이에르 판 (Peyer's patch) 내 기타 세포에 침입하게 된다. 박테리아는 이들 식세포 세포에 의해 흡수된다. 박테리아 살모넬라 티피 Ty21 균주는 이의 약독화 돌연변이로 인해, 이러한 식세포 안에서 존속할 수 없으며 이 시점에 사멸한다. DNA 분자가 박테리아 및 엔도솜에서 방출된 다음 특이적인 수송 시스템 또는 엔도솜 누출 (endosomal leakage)을 통해 식세포성 면역 세포의 세포질로 이송된다. 마지막으로, 재조합 DNA 분자는 핵으로 유입되어 전사되며, 식세포 안에서 거대 SARS-CoV-2 S 단백질을 발현하게 된다. S 단백질 항원이 탑재된, 감염된 세포는 세포자살로 이행되며, 흡수되어 장의 면역 시스템을 통해 처리된다. 박테리아 감염의 위험 신호는 이러한 과정에서 강력한 보강제로 작용해, 강력한 표적 항원 특이적인 CD8+ T-세포 및 항체 반응을 전신 및 점막 영역 2가지 수준에서 유발한다. 림프내 점막 백신 접종 경로는 특히 대규모 백신 접종에 유용하며, 코로나바이러스와 같이 점막 도입 경로를 이용하는 병원체에 유용하다.
진핵생물 플라스미드를 포함하는 살모넬라 백신은 이 플라스미드에 의해 코딩된 항원에 대해 B 세포 반응을 발생시킬 수 있다. 항원 리스테리오라이신 또는 ActA를 코딩하는 pCMVb 진핵생물 발현 벡터를 함유한 살모넬라 티피무리움을 경구 투여하여 면역화한 마우스에서, 항원-특이적인 항체는 면역화 후 4주까지 혈액 혈청에서 검출가능하였다 (Darji et al, Cell, 1997; Darji et al, FEMS Immunol Med Microbiol, 2000).
백신 균주 살모넬라 티피 Ty21a는 유례없는 안전성 실적을 가지고 있다. 살모넬라 티피 Ty21a가 전신 혈류로 들어갈 가능성이 있음을 보여주는 이용가능한 데이터는 없는 실정이다. 따라서, 살아있는 약독화된 살모넬라 티피 Ty21a 백신 균주는 장내 면역 시스템을 특이적으로 표적화할 수 있으며, 동시에 장에서 안전하고 잘-용인된다. 이와는 대조적으로, 아데노바이러스-기반의 DNA 백신은 본질적으로 의도치 않은 바이러스 복제 위험성을 가지고 있을 수 있다. 아울러, 아데노바이러스에 대한 기존에 존재하는 면역성이 인간에서 백신 효능을 제한하는 것으로 입증되어 있다.
또한, 본 발명은 코로나바이러스 질환 2019 (COVID-19) 또는 SARS-CoV-2 감염의 치료 및/또는 예방에 이용하기 위한 본 발명에 따른 DNA 백신을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 DNA 백신을 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 코로나바이러스 질환 2019 (COVID-19) 또는 SARS-CoV-2 감염을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
히스타민, 루코트리엔 또는 사이토카인에 의해 매개되는 과민 반응과 유사한 이상 사례가 발생한다면, 발열, 아나필락시스, 혈압 불안정, 기관지경련 및 호흡곤란에 대한 치료 옵션을 이용할 수 있다. 원치않은 T-세포 유래 자가-응집 사례에 대해서는, 치료 옵션은 줄기 세포 이식 후 적용되는 급성 및 만성 이식 편대 숙주 질환의 표준 치료 계획으로부터 비롯한다. 치료 옵션으로서 사이클로스포린 및 글루코코르티코이드가 제안된다.
드문 사례인 전신 살모넬라 티피 Ty21a 타입의 감염의 경우, 적절한 항생제 요법이 권고되며, 예를 들어 시프로플록사신 또는 오플록삭신 등의 플루오로퀴놀론을 이용한 요법이 권고된다. 위장관의 박테리아 감염은 리팍시민과 같은 관련 물질로 치료해야 한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 적어도 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 가진 DNA 분자를 함유한 살모넬라 티피 Ty21a 균주를 포함하는 DNA 백신은, 경구로 투여된다. 경구 투여는 비경구 투여보다 더 간단하고, 안전하며, 더 편안하다. 본 발명의 DNA 백신은 또한 임의의 다른 적절한 경로를 통해 투여할 수도 있지만, 경구 경로가 바람직하다. 바람직하게는, 치료학적 유효량으로 개체에 투여되며, 이 용량은 구체적인 용도, 특히 DNA 백신이 치료학적 또는 예방학적 용도인지, 개체의 체중, 나이, 성별 및 건강 상태, 투여 방식 및 제형 등에 따라 결정될 수 있다. 투여는 필요에 따라 1회 또는 수회일 수 있다.
본 발명에 따른 DNA 백신은 용액, 현탁물, 동결건조물, 장용 코팅 캡슐제 또는 임의의 다른 적절한 형태로 제공될 수 있다. 전형적으로, 본 발명에 따른 살모넬라의 약독화 균주는 음용 용액으로 제형화된다. 이 구현예는 환자 순응도를 개선하는 이점을 제공한다. 바람직하게는, 음용 용액은 위산을 적어도 특정 정도로 중화하는, 즉 위액의 pH를 pH 7에 가깝게 만드는 수단을 포함한다. 바람직하게는, 음용 용액은 본 발명에 따른 살모넬라의 약독화 균주를 포함하는 완충화된 현탁물이다. 특정 구현예에서, 완충화된 현탁물은 본 발명에 따른 살모넬라의 약독화 균주를 적정 완충제, 바람직하게는 소듐 하이드로겐 카보네이트 2.6 g, L-아스코르브산 1.7 g, 락토스 일수화물 0.2 g 및 음용수 100 ml을 함유한 적정 완충제에 현탁함으로써 수득된다.
특정 구현예에서, COVID-19 또는 SARS-CoV-2 감염의 예방 및/또는 치료는 추가의 SARS-CoV-2 백신 또는 항-SARS-CoV-2 치료제의 투여를 추가로 포함할 수 있다. COVID-19 및/또는 SARS-CoV-2 감염의 치료 및/또는 예방은 적어도 다른 SARS-CoV 2 단백질 또는 이의 일부, 예를 들어 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 외막 (E) 단백질, 막 (M) 단백질 또는 뉴클레오캡시드 (N) 단백질 또는 이의 일부, 바람직하게는 SARS-CoV-2 N 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 가진 DNA 분자를 함유한 살모넬라 티피 Ty21a 균주를 포함하는 DNA 백신을 추가로 포함할 수 있다. DNA 백신 2종은 공동-투여하거나 또는 후속적으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 DNA 백신 2종은 공동-투여한다.
특정 구현예에서, COVID-19 및/또는 SARS-CoV-2 감염의 치료 및/또는 예방은 SARS-CoV-2에 대항한 감작/부스트 백신 접종을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "감작/부스트 백신 접종"은, 개체를 감작 백신 접종으로 면역화한 다음 1회 이상의 부스트 백신 접종을 수행하는 것을 포함하는 면역화 요법을 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 감작 백신 및 부스트 백신은 동일하며; 즉, 감작/부스트 백신 접종은 상동적인 (homologous) 감작/부스트 백신 접종이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 DNA 백신은 감작 백신으로서 그리고 부스트 백신으로서 투여된다. 다른 구현예들에서, 감작 백신과 부스트 백신은 동일한 병원체에 대한 서로 다른 타입의 백신이며; 즉, 감작/부스트 백신 접종은 이종적인 감작/부스트 백신 접종이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 DNA 백신은 감작 백신으로서 투여할 수 있으며, 추가의 SARS-CoV-2 백신은 부스트 백신으로서 투여한다. 다른 특정 구현예에서, 추가적인 베타코로나바이러스 백신은 감작 백신으로 투여하고, 본 발명에 따른 약독화된 살모넬라 균주는 부스트 백신으로서 투여한다. 감작/부스트 백신 접종은 감작 백신 접종 단독에 비해 우수한 면역 반응을 유발할 수 있다. 개선된 초기 T 세포 반응, 항체 반응 및/또는 면역 반응의 지속성 (longevity)이 감작/부스트 백신 접종에 의해 달성될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 감작 및 부스트 DNA 백신의 투여는 8주 연속, 특히 3-6주 연속 이루어진다. 감작 백신 및 부스트 백신은 동일한 경로 또는 서로 다른 경로를 통해 투여할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 감작 및 부스트 DNA 백신은 동일한 경로를 통해 투여되며, 더 바람직하게는 감작 및 부스트 DNA 백신은 경구로 투여된다. 또한, 본 발명에 따른 DNA 백신은 동일한 또는 서로 다른 투여량으로 1회 또는 수회 투여할 수 있다. 백신 접종의 시기 및 용량의 최적화 등의 감작/부스트 백신 접종 용법에 대한 최적화는 당해 기술 분야의 당업자의 능력 내이다.
특정 구현예에서, DNA 백신의 1회 용량은 본 발명에 따른 살모넬라 티피 Ty21a 균주를 약 105 내지 약 1011 또는 약 1 x 106 내지 약 1 x 1010, 더 바람직하게는 약 1 x 106 내지 약 1 x 109, 약 1 x 106 내지 약 1 x 108, 또는 약 1 x 106 내지 약 1 x 107 콜로니 형성 단위 (CFU)로 포함한다. 일 구현예에서, DNA 백신의 1회 용량은 살모넬라 티피 Ty21a 균주를 약 1 x 106 내지 약 1 x 109 콜로니 형성 단위 (CFU)로 포함한다. 이러한 살아있는 약독화된 박테리아 DNA 백신의 저 용량 투여는 배출 위험성을 최소화하며, 따라서 제3자로의 전파를 최소화한다. 기존에 1 x 109 CFU 미만에서는 배출이 검출되지 않는 것으로 확인된 바 있다.
이러한 맥락에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위에 대한 1.5배 이내를 비롯하여, 3배 이내, 대안적으로 2배 이내를 의미한다.
특정 구현예에서, COVID-19 또는 SARS-CoV-2 감염의 치료 및/또는 예방은 본 발명에 따른 DNA 백신의 수회 투여를 포함한다. DNA 백신 투여의 단일 용량은 동일하거나 다를 수 있으며, 바람직하게는 단일 용량은 동일하며, 살모넬라 티피 Ty21a 균주를 약 1 x 106 내지 약 1 x 109 콜로니 형성 단위 (CFU)로 포함한다. 특히, COVID-19 또는 SARS-CoV-2 감염의 치료 및/또는 예방은 본 발명에 따른 DNA 백신의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여를 포함한다. 바람직하게는, COVID-19 또는 SARS-CoV-2 감염의 치료 및/또는 예방은 DNA 백신을 감작화를 위해 1주일 동안 2-4회 투여하고 (감작 백신 접종), 선택적으로 이후 단일 용량 부스팅을 1회 이상 투여하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, DNA 백신은 (감작 백신 접종으로서) 첫주에 2-4회 투여한 다음 (부스트 백신 접종으로서) 각각 적어도 2주 후 단일 용량 부스트를 1회 이상으로 투여하며, 즉 첫주에 감작 백신 접종 및 3주 또는 이후에 단일 용량 부스트 백신 접종, 선택적으로, 이후 적어도 2주 후 1회(또는 이상의) 추가적인 단일 용량 부스트 백신 접종이 후속적으로 이루어진다. 대안적인 구현예에서, DNA 백신은 (감작 백신 접종으로서) 첫주에 2-4회 투여한 다음 (부스트 백신 접종으로서) 각각 적어도 4주 후 단일 용량 부스팅을 1회 이상으로 투여하며, 즉 첫주에 감작 백신 접종한 다음 5주 후 단일 용량 부스트 백신 접종하며, 선택적으로 적어도 4주 후 1회 (또는 이상의) 추가적인 단일 용량 부스트 백신 접종으로 이루어진다.
실시예
실시예 1: 재조합 플라스미드 pVAX10.SCV-1의 제조
SARS-CoV-2 S 단백질 (1273 aa, 서열번호 1)을 코딩하는 DNA를 pVAX10.VR2-1 (WO 2013/091898)로부터 유래한 pVAX10 백본에 클로닝하였다. 올리고뉴클레오티드들을 내열성 리가제를 사용해 연결하여, S 단백질 DNA 단편을 이중 가닥 유전자 합성으로 제조하였다. 수득한 결찰 생산물을 PCR에 의해 증폭시켰다. 증폭 후, 시험관내 합성한 S 단백질 DNA 단편을 pVAX10 백본에 NheI/XhoI을 통해 클로닝하였다 (재조합 플라스미드 pVAX10.VR2-1의 VEGFR-2 코딩 영역을 S 단백질 코딩 영역으로 치환). 정성 관리를 위해, 전체 플라스미드를 서열분석하고, E. coli에 형질전환한 후 각각의 참조 서열에 대해 정렬하여, 오류가 없음을 입증하였다. 제조된 플라스미드는 pVAX10.SCV-1 (도 2)으로 명명한다. 그외 적절한 구조체는 도 3에 나타낸다.
실시예 2: 약독화된 살모넬라 균주의 재조합 플라스미드 pVAX10.SCV-1의 형질전환
살모넬라 티피 Ty21a에 플라스미드 pVAX10.SCV-1을 형질전환하였다. 형질전환은 전기천공으로 수행하였다.
컴피턴트 살모넬라 세포의 제조:
살모넬라 티피 Ty21a의 글리세롤 배양물을 LB 플레이트 (동물 성분 비-함유 [ACF] 콩 펩톤)에 접종하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 콜로니 하나를 밤새 액체-예비-배양물로 사용하였다. 콜로니 하나를 접종한 LB 배지 (ACF 콩 펩톤) 3 ml을 37℃에서 180 rpm으로 밤새 인큐베이션하였다. 컴피턴트 세포를 만들기 위해, 밤새 배양물 3 ml을 LB 배지 (ACF 콩 펩톤)에 2 x 300 ml로 접종하고, 37℃ 및 180 rpm에서 OD600 최대 약 0.5가 될 때까지 배양하였다. 그 후, 배양물을 얼음 위에 10분간 두었다. 그 후, 박테리아를 10분간 3000xg에서 4℃에서 원심분리하고, 각 펠릿을 빙랭한 H2Odest 500 mL에 재현탁하였다. 새로운 원심분리 단계 후, 박테리아 펠릿을 10% 빙랭한 글리세롤로 2회 헹구었다. 펠릿 2개를 10% 글리세롤 2 ml에 모두 넣고, 마지막으로 드라이 아이스 상에서 50 ㎕ 분액하여 냉동하였다. 사용한 글리세롤은 임의의 동물 성분을 함유하지 않았다 (Sigma Aldrich, G5150).
컴피턴트 살모넬라 세포의 형질전환:
각 형질전환 반응에서, 컴피턴트 살로넬라 티피 Ty21a 세포 분액 50 ㎕를 얼음 위에서 10분간 해동시켰다. 플라스미드 DNA pVAX10.SCV-1 3-5 ㎕를 첨가한 후, 혼합물을 얼음 위에서 5분간 인큐베이션하였다. 그 후, 혼합물을 예비-냉각한 큐벳 (1 mm 두께)으로 옮겼다. 전기 펄스를 12.5 kV/cm에서 수행하였다. 즉시, LB 배지 (ACF 콩 펩톤) 1 ml을 세포에 첨가한 다음 세포를 2 ml 에펜도르프 시험관으로 이동시켜 1시간 동안 37℃에서 교반하였다. 벤치 원심분리기에서 짧게 원심분리 단계 (16600 rcf, 20 s)를 수행한 후, 박테리아 펠릿을 LB (ACF 콩 펩톤) 항생제-비함유 배지 200 ㎕에 재현탁하였다. 혼합물을 카나마이신 (농도 = 25 ㎍/ml 또는 50 ㎍/ml) 함유 LB 플레이트 (ACF 콩 펩톤) 상에 Drigalski 스파툴러로 도포하였다.
재조합 살모넬라 클론의 플라스미드 준비:
재조합 살모넬라 티피 Ty21a 균주 클론 3개를 카나마이신 (50 ㎍/ml)이 함유된 LB 배지 (ACF 콩 펩톤) 3 ml에서 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 박테리아 배양물을 원심분리 (16600 rcf, 30 s)하여 펠릿화하였다. Macherey-Nagel 사의 NucleoSpin 플라스미드 키트를 사용해 플라스미드를 단리하였다. 플라스미드 DNA를 실리카 겔 컬럼으로부터 물 50 ㎕로 용출시켰다. 용출물 5 ㎕를 컨트롤하기 위해 아가로스 겔에서 전기영동하였다.
장기간 보관하기 위해, 양성 클론의 글리세롤 배양물 1 ml을 만들었다. 이를 위해, 글리세롤 (동물 성분 비-함유) 172 ㎕를 지수 증식 중인 배양물 3 ml의 배지 828 ㎕에 1 ml 소 용량 스크류 마이크로튜브에서 첨가하였다. 샘플은 향후 사용시까지 -70℃에서 보관하였다.
살모넬라로부터 단리한 재조합 플라스미드 DNA에 대한 전체 서열분석:
LB-Kan 액체 배지 (ACF 콩 펩톤) 3 ml에 재조합 살모넬라 (pVAX10.SCV-1을 포함하는 살모넬라 티피 Ty21a) 콜로니 하나를 접종하여, 잠새 37℃에서 180 rpm으로 인큐베이션하였다. 밤새 배양물을 벤치 원심분리기 (Biofuge pico, Heraeus)에서 30초간 1300 rpm으로 원심분리하여 펠릿화하였다. Macherey-Nagel 사의 NucleoSpin 플라스미드 키트를 사용해 플라스미드를 단리하였다. 알칼리 세포용해하고, 고 분자량 게놈 DNA 및 세포 성분을 침강시킨 후, 플라스미드 DNA를 실리카 막이 충진된 컬럼에 주입하였다. 세척 단계 후, 플라스미드를 컬럼으로부터 멸균수 50 ㎕로 용출시켜, 서열분석하였다. 그 후, 서열을 클론 특이 정렬, 즉 각 살모넬라 클론의 플라스미드 서열을 참조 서열과 하나씩 정렬하여 비교함으로써, 모든 서열이 각각의 참조 서열과 일치하는지를 체크하였다. 재조합 살모넬라 균주를 VXM-SCV-1 (플라스미드 pVAX10.SCV-1을 포함하는 살모넬라 티피 Ty21a)로 명명하였다.
실시예 3: VXM-SCV-1의 대규모 생산
WO 2013/091898에 언급된 바와 같이 박테리아 발효를 수행하였다. 하위 공정은 정용여과, 희석 및 충진으로 구성된다. 100 L 발효 1회 운영시 백신은 1-10x1010 CFU/ml로 약 5 L가 생산되었다. 백신을 적절한 분액으로 추가로 희석하여, -70℃에서 보관하였다. 분액은 드라이아이스에서 운송할 수 있다. 한 곳에서, 분액은 적용 완충제로 희석해, 사용 준비된 백신 (음용 용액 100 ml, 벌크 제조)을 구축하였다.
실시예 4: 전임상 실험 설계 - 건강한 마우스에서 VXM-SCV-1에 의해 유발된 면역 반응 평가
건강한 C57Bl/6, BALBc 또는 CD1 마우스에서 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 항체 ELISA에 의해 평가하였다. 마우스에 플라스미드 pVAX10.SCV-1을 함유한 살모넬라 티피무리움 (108-109 CFU/dose)으로 백신 접종하였다. 플라스미드 pVAX10.SCV-1을 함유한 살모넬라 티피무리움을 살모넬라 티피 Ty21a에 대한 전술한 바와 같이 준비하였다. 살모넬라 빈 벡터에 의해 유발되는 임의의 비-특이적인 백그라운드 자극으로부터 요망되는 면역학적 효과를 식별하기 위해, 음성 대조군으로서, 벡터 대조군 (발현 플라스미드를 함유하지 않는 살모넬라 티피무리움 108-1010 CFU/dose)을 본 실험 셋업에 포함시켰다. 백신 접종 시점 하나 이상에서 면역을 모니터링하였다.
1. 동물 유지
수령시 6주령의 건강한 암컷 마우스를 특수-병원체-부재 (specific-pathogen-free, SPF) 동물 관리 시설에서 공정을 개시하기 전에 7일간 관찰하였다. 동물을 온도 (23 ± 2℃), 습도 (45 ± 10%), 광주기 (12 h 명/12 h 야) 및 공기 교체 제어 조건 하에 방에서 유지시켰다. 동물은 SPF 조건 하에 유지시켰다. 실온 및 습도를 계속 모니터링하였다. 공기 관리 시스템은 14 공기 교환/시간으로 프로그래밍하였으며, 재순환하진 않았다. 신선한 실외 공기를 일련의 필터를 통해 통과시킨 후 각 방으로 균일하게 분산시켰다. 설치류 콜로니에서 오염 또는 병원체 확산을 방지하기 위해 실험실에 양압 (20 ± 4 Pa)을 유지하였다. 동물은, 음식물과 물이 제공되도록 설치된 폴리카보네이트 케이지 (Techniplast, Limonest, France)에서 사육하였다. 사용한 표준 케이지 면적은 800 cm2이며, 케이지 당 (동일 군의) 마우스 최대 10마리를 넣었다. 동물 잠자리는 멸균 옥수수 속대 잠자리 (ref: LAB COB 12, SERLAB, Cergy-Pontoise, France)였으며, 주당 2회 교체하였다. 동물 음식물은 DIETEX (Saint-Gratien, France)에서 구입하였다. 방사선 조사한 RM1을 멸균 관리 과립제로 사용하였다. 음식물은 고무 마개와 빨대 관이 장착된 물병으로부터 자유롭게 제공하였다. 물병은 멸균 여과로 멸균 처리하고, 주당 2회로 교체하였다. D0에, 마우스를 개별 체중에 따라 Vivo manager® 소프트웨어 (Biosystemes, Couternon, France)를 사용해 2개의 군으로 나누었다. 2개의 군의 평균 체중 (이들 군은 이후 각각 군 1-5 및 군 6-10으로 나눔)은 통계학적으로 차이가 없다 (분산 분석).
2. 마우스에서 항체 반응 검출
BALBc 및 CD1 마우스를 8마리로 구성된 군 6개로 나누었다. 군 1-3의 마우스에는 벡터 대조군을 투여하고, 군 4-6의 마우스에는 플라스미드 pVAX10.SCV-1을 함유한 살모넬라 티피무리움을 투여하였다. 살모넬라 티피무리움 균주 2종을 해동하여 30분 이내에 투여하였으며, 사용 후 작업 용액은 폐기하였다. 치료 용량은 투여 당 100 ㎕ 중의 108 CFU이었다. 살모넬라 균주는 캐뉼러를 통한 구강 위관 영영법 (per os, PO)으로 0.1 ml을 투여하였다. 동물 군과 무관하게, 각 동물에 투여하기 전 위 산을 중화하기 위해 투여 전 적용 완충제를 투여하였다 (100 ㎕ / 동물 / 적용). 이 완충제는 음용수 100 ml에 소듐 하이드로겐 카보네이트 2.6 g, L-아스코르브산 1.7 g, 락토스 일수화물 0.2 g을 용해하여 제조하였다. 치료 일정은 다음과 같다:
군 1 (n=8) 및 군 4 (n=8)의 마우스에 각 살모넬라 티피무리움을 2주 간격으로 108 CFU를 3회 PO 투여하였다 (Q2WKx3).
군 2 (n=8) 및 군 5 (n=8)의 마우스에는 각 살모넬라 티피무리움을 2일 간격으로 연속 4회 108 CFU로 매일 PO 투여하였다 (Q2Dx4).
군 3 (n=8) 및 군 6 (n=8)의 마우스에는 각 살모넬라 티피무리움을 2일 간격으로 연속 4회 108 CFU로 매일 PO 투여 (Q2Dx4)한 다음 2주 간격으로 부스트 투여하였다 (Q2WKx2).
동물의 생존성 및 거동을 매일 기록하고, 체중을 매주 2회 측정하였다. 혈청을 실험 3주, 4주, 8주, 12주, 16주, 20주, 24주 및 28주에 수집하고, 분석시까지 -20℃에서 보관하였다. 실험 종료시 모든 완료한 동물에서 부검 (심장, 폐, 간, 비장, 신장 및 위장관의 육안 검사)을 실시하였다.
간략하게는, 96웰 EIA 플레이트를 소듐 카보네이트 완충제 (pH 9.5) 중의 N 또는 S 단백질 에피토프 또는 재조합 전체 N 또는 S 단백질을 1 ㎍/ml로 사용해 4℃에서 밤새 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 100 mmol 트리스-완충화된 염수/Tween (TBST)으로 헹군 다음 3% 젤라틴을 처리해 37℃에서 1시간 동안 차단 처리하였다. 플레이트를 TBST로 잘 헹군 다음 각 플레이트의 윗 열에 혈청을 첨가하고, 각 하단 줄에서 TBST로 1:1 희석하였다. 각 플레이트에서, 음성 대조군 컬럼에는 혈청을 넣지 않았다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 현상을 위해, 플레이트를 TBST로 헹군 다음 알칼라인 포스파타제가 접합된 단백질 G (Calbiochem, USA) 1:1000 희석물과 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트 리더로 OD405를 측정하였다. 항체 엔드포인트 역가를 음성 대조군의 평균 OD405 보다 1 표준편차 OD405 높이는데 필요한 희석 배수의 역수로 결정한다.
3. C57BL6 또는 BALBc 마우스에서 T 세포 반응 검출
BALBc 및 C57BL6 마우스를 12마리로 구성된 군 6개로 나누었다. 군 1-3의 마우스에는 벡터 대조군을 투여하고, 군 4-6의 마우스에는 플라스미드 pVAX10.SCV-1을 포함하는 살모넬라 티피무리움을 투여하였다. 2종의 살모넬라 티피무리움 균주를 해동하여 30분 이내에 투여하였으며, 작업 용액은 사용 후 폐기하였다. 치료 용량은 투여 당 100 ㎕ 중의 108 CFU이었다. 살모넬라 균주는 캐뉼러를 통한 구강 위관 영영법 (per os, PO)으로 0.1 ml을 투여하였다. 동물 군과 무관하게, 각 동물에 투여하기 전 위 산을 중화하기 위해 투여 전 적용 완충제를 투여하였다 (100 ㎕ / 동물 / 적용). 이 완충제는 음용수 100 ml에 소듐 하이드로겐 카보네이트 2.6 g, L-아스코르브산 1.7 g, 락토스 일수화물 0.2 g을 용해하여 제조하고, 살모넬라 티피무리움 균주에 적용하기 전 30분 이내에 적용하였다. 치료 일정은 다음과 같다:
군 1 (n=12) 및 군 4 (n=12)의 마우스에 각 살모넬라 티피무리움을 2주 간격으로 108 CFU를 3회 PO 투여하였다 (Q2WKx3).
군 2 (n=12) 및 군 5 (n=12)의 마우스에는 각 살모넬라 티피무리움을 2일 간격으로 연속 4회 108 CFU로 매일 PO 투여하였다 (Q2Dx4).
군 3 (n=12) 및 군 6 (n=12)의 마우스에는 각 살모넬라 티피무리움을 2일 간격으로 연속 4회 108 CFU로 매일 PO 투여 (Q2Dx4)한 다음 2주 간격으로 부스트 투여하였다 (Q2WKx2).
동물의 생존성 및 거동을 매일 기록하고, 체중을 매주 2회 측정하였다. 각 군에서 마우스의 1/3 (n=4)은 14일에 안락사시키고, 1/3(n=4)은 28일에, 나머지 1/3 (n=4)은 56일에 안락사시켰다. 종료 시점에 비장 및 혈액 샘플을 수집하였다. 혈액을 처리해 혈청을 준비하고 이를 분석시까지 -20℃에서 보관하였다. 비장은 단일 세포 현탁물로 가공 처리하였다. 백신의 면역원성을 IFN-γ ELISPOT에 의해 비장세포 준비물에서 평가하였다. 간략하게는, 비장세포를 항-IFN-γ (500,000세포/0.1 ml)로 미리 코팅된 ELISPOT 플레이트의 웰에 투입하였다. N 또는 S 단백질 유래의 펩타이드 에티토프를 웰에 두플리케이트로 10 ㎍/ml로 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 다음날, 플레이트를 AEC 키트 (Sigma, USA)를 사용해 현상하고, Immunospot 플레이트 리더 (Cellular Technologies Ltd, USA)를 사용해 개별 IFN-γ 분비 세포를 계수하였다. 항체를 ELISA에 의해 혈청 샘플에서 검출하였다. 간략하게는, 96웰 EIA 플레이트를 소듐 카보네이트 완충제 (pH 9.5) 중의 N 또는 S 단백질 에피토프 또는 재조합 전체 N 또는 S 단백질을 1 ㎍/ml로 사용해 4℃에서 밤새 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 100 mmol 트리스-완충화된 염수/Tween (TBST)으로 헹군 다음 3% 젤라틴을 처리해 37℃에서 1시간 동안 차단 처리하였다. 플레이트를 TBST로 잘 헹군 다음 각 플레이트의 윗 열에 혈청을 첨가하고, 각 하단 줄에서 TBST로 1:1 희석하였다. 각 플레이트에서, 음성 대조군 컬럼에는 혈청을 넣지 않았다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 현상하기 위해, 플레이트를 TBST로 헹군 다음 알칼라인 포스파타제가 접합된 단백질 G (Calbiochem, USA) 1:1000 희석물과 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트 리더로 OD405를 측정하였다. 항체 엔드포인트 역가는 음성 대조군의 평균 OD405 보다 1 표준편차 OD405 높이는데 필요한 희석 배수의 역수로 결정하였다.
4. 항원 발현 분석
플라스미드 pVAX10.SCV-1을 뮤라인 3T3 및 인간 293T 세포에 형질감염시켜 항원 발현 분석을 수행하였다. 감염 후 24시간 및 48시간 경과시, 세포를 회수하여 세포 용해하였다. 수득한 전체 세포 용해물을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 분석한 다음 PVDF 막에서 웨스턴 블롯팅하였다. RNA 발현은 또한 RT/PCR에 의해 검증할 예정이다.
실시예 5: 전임상 실험 - 건강한 마우스에서 VXM-SCV-3에 의해 유발된 면역 반응 평가
pVAX10-SCV-3 플라스미드 (insert SCV-3; 서열번호 11)는 푸린 도메인 (680-683 아미노산 잔기)이 제거된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 (서열번호 1) 및 SARS-CoV-2 N 단백질 (서열번호 8)(등재 번호 YP_009724397)을 코딩한다. 항원들은 토세아 아시그나 (Thosea asigna) 바이러스의 캡시드 단백질 전구체로부터 유래한 2A 자기-절단 펩타이드 서열 (서열번호 7)에 의해 분리되어 있다 (도 3 참조).
pVAX10-SCV-3를 함유한 살모넬라 티피무리움 SL7207 백신은 전기천공에 의해 준비하였다. 컴피턴트 박테리아를 얼음 위에서 플라스미드 DNA 100-500 ng과 함께 인큐베이션한 다음 GenePulsar II에서 2.5 kV로 전기천공 처리하였다. 박테리아를 SOC 배지에서 1시간 동안 37℃에서 셰이커 플레이트 위에서 인큐베이션한 다음 100 ㎕를 TSB 아가 플레이트에 50 ㎍/ml 카나마이신과 함께 접종하여 밤새 37℃에서 두었다. 각 콜로니를 증폭시키고, 25% 글리세롤 중에 -80℃에서 냉동시켰다.
4-6주령의 병원체-프리, 암컷 BALBc 마우스를 Charles River Laboratories (St Constant, PQ, Canada)에서 구입하여, 기관 지침에 따라 사육하였으며, 물과 음식물은 자유롭게 접근가능하게 하였다.
마우스 10마리로 구성된 군에 SL-SCV-3 백신을 처리하였다. 각 처리에서, 완충제 (310 mmol 소듐 바이카보네이트, 100 mmolL-아스코르브산, 5 mmol 락토스 일수화물) 100 ㎕를 입을 통한 위관 영양법으로 미리 처리한 다음, 투여 완충제 중의 백신 용량 100 ㎕를 1.5-2x10e9 CFU/ml로 투여하였다. 0, 2일, 5일, 7일, 21일 및 35일에 마우스에 처리하였다. 실험 전 (면역 전)에 마우스에서 채혈한 다음 2주, 4주, 6주 및 8주에 채혈하였다.
면역화된 동물의 혈청에서 항원-특이적인 항체 수준을 검출할 수 있는 방법인 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 백신 효능을 평가하였다. 간략하게는, 96웰 EIA 플레이트를 항원 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 (ACROBiosystems)로 밤새 4℃에서 코팅한 다음 2% 소 혈청 알부민으로 1시간 동안 37℃에서 차단 처리하고, 혈청 연속 희석물, 전형적으로 1/200 희석으로 시작한 연속 희석물과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 2차 시약 (염소 항-마우스 IgG (H+L) 퍼옥시다제, Jackson ImmunoResearch)을 각 웰에 1/5000 희석 수준으로 첨가한 다음 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 잘 헹구고, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 기질 (Life Technologies)을 웰에 첨가하여 5-10분간 두었다. 0.16N H2SO4를 첨가해 반응을 중단시켰다. 각 웰의 450 nm에서의 흡광도를 마이크로타이터 플레이트 리더 (Cytation5, Biotek)를 사용해 측정하였다. 엔드포인트 역가를 Frey A. et al (Journal of Immunological Methods, 1998, 221:35-41)에 기술된 바와 같이 계산하였다. 계산한 역가는 나이브, 비-면역화 대조군 마우스의 혈청 샘플과 비교해 면역화된 마우스의 혈청 샘플에서 통계학적으로 유의한 흡광도 증가가 관찰되는 최고 희석 수준을 나타낸다.
SL-SCV-3로 백신 접종한 마우스 10마리 중, 2마리는 1/400 백그라운드 분석에 비해 높은 항체 반응을 나타내었다. 마우스 한마리는 4주까지 1/800의 피크 항체 역가를 달성하였고, 한마리는 6주까지 1/3200의 피크 항체 역가를 달성하여 유지하였다 (도 4 참조). 이는, 스파이크 단백질을 표적화하는 살모넬라-기반의 SARS-CoV2 백신 구조체가 스파이크 단백질에 대해 항원-특이적인 면역 반응을, 즉 체액성 면역 반응을 구축할 수 있음을 입증해준다.
실시예 6: 전임상 실험 - 건강한 마우스에서 VXM-SCV-30에 의해 유발된 면역 반응 평가
pVAX10-SCV-30 플라스미드 (insert SCV-30; 서열번호 12)는, 스파이크 단백질 (서열번호 1의 아미노산 319-541), 뮤라인 C3d 반복체 3개 (3C3d; 서열번호 17; KFLNTAKDRNRWEEPDQQLYNVEATSYA), 토세아 아시그나 바이러스의 캡시드 단백질 전구체로부터 유래한 2A 자기-절단 펩타이드 서열의 SARS-CoV-2 RBD 도메인 (서열번호 7) 및 SARS-CoV-2 N 단백질 (서열번호 8)(등재 번호 YP_009724397)에 융합된 유비퀴틴 (서열번호 9)을 순차적으로 코딩한다 (도 3 참조).
살모넬라 티피무리움 SL7207 백신을 실시예 5에 기술된 바와 같이 pVAX10-SCV-30을 이용해 제조하였다.
4-6주령의 병원체-프리, 암컷 BALBc 마우스를 Charles River Laboratories (St Constant, PQ, Canada)에서 구입하여, 기관 지침에 따라 사육하였으며, 물과 음식물은 자유롭게 접근가능하게 하였다.
마우스 10마리로 구성된 군에 SL-SCV-30 백신을 처리하였다. 각 처리에서, 투여 완충제 (310 mmol 소듐 바이카보네이트, 100 mmol L-아스코르브산, 5 mmol 락토스 일수화물) 100 ㎕를 입을 통한 위관 영양법으로 미리 처리한 다음, 투여 완충제 중의 백신 용량 100 ㎕를 1.5-2x10e9 CFU/ml로 투여하였다. 0, 2일, 5일, 7일, 21일 및 35일에 마우스에 처리하였다. 실험 전 (면역 전)에 마우스에서 채혈한 다음 3주, 4주, 6주 및 12주에 채혈하였다.
혈청에서 실시예 6에 기술된 바와 같이 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 항체를 분석하였다.
SL-SCV-30으로 백신 접종한 마우스 10마리 중, 1마리는 1/400 백그라운드 분석에 비해 높은 항체 반응을 나타내었으며, 3주까지 1/3200에 도달하였다 (도 5참조). 이는, 스파이크 단백질의 RBD 도메인을 표적화하는 살모넬라-기반의 SARS-CoV2 백신 구조체가 스파이크 단백질에 대해 항원-특이적인 면역 반응을 구축할 수 있음을 입증해준다.
실시예 7: 전임상 실험 - 건강한 마우스에서 VXM-SCV-42에 의해 유발되는 면역 반응 평가
pVAX10-SCV-42 플라스미드 (insert SCV-42; 서열번호 13)는 스파이크 단백질의 SARS-CoV-2 S1 도메인 (서열번호 1의 아미노산 1-681), 뮤라인 C3d 반복체 3개 (서열번호 17; 3C3d, 서열번호 18), 토세아 아시그나 바이러스의 캡시드 단백질 전구체로부터 유래한 2A 자기-절단 펩타이드 서열 (서열번호 7), SARS-CoV-2 N 단백질 (서열번호 8)에 융합된 유비퀴틴 (서열번호 9), 다른 2A 자기-절단 펩타이드 서열 및 스파이크 단백질의 SARS-CoV-2 S2 도메인 (서열번호 1의 Ser686-Thr1273)을 코딩한다 (도 3 참조).
살모넬라 티피무리움 SL7207 백신을 실시예 5에 기술된 바와 같이 pVAX10-SCV-42를 이용해 제조하였다.
4-6주령의 병원체-프리, 암컷 BALBc 마우스를 Charles River Laboratories (St Constant, PQ, Canada)에서 구입하여, 기관 지침에 따라 사육하였으며, 물과 음식물은 자유롭게 접근가능하게 하였다.
마우스 10마리로 구성된 군에 SL-SCV-42 백신을 처리하였다. 각 처리에서, 투여 완충제 (310 mmol 소듐 바이카보네이트, 100 mmol L-아스코르브산, 5 mmol 락토스 일수화물) 100 ㎕를 입을 통한 위관 영양법으로 미리 처리한 다음, 투여 완충제 중의 백신 용량 100 ㎕를 1.5-2x10e9 CFU/ml로 투여하였다. 0, 2일, 5일, 7일, 21일 및 35일에 마우스에 처리하였다. 실험 전 (면역 전)에 마우스에서 채혈한 다음 2주, 4주, 6주 및 8주에 채혈하였다.
혈청에서 실시예 5에 기술된 바와 같이 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 항체를 분석하였다.
SL-SCV-42로 백신 접종한 마우스 10마리 중, 2마리는 1/400 백그라운드 분석에 비해 높은 항체 반응을 나타내었으며, 1/1600에 도달하였다 (도 6 참조). 이는, 스파이크 단백질의 S1 및/또는 S2 서브유닛을 표적화하는 살모넬라-기반의 SARS-CoV2 백신 구조체가 스파이크 단백질에 대해 항원-특이적인 면역 반응을 구축할 수 있음을 입증해준다.
실시예 8: 전임상 실험 - 건강한 마우스에서 VXM-SCV-53에 의해 유발되는 면역 반응 평가
pVAX10-SCV-53 플라스미드 (insert SCV-53; 서열번호 14; 전체 플라스미드 서열 서열번호 19)는 푸린 도메인이 제거 (680-683 아미노산 잔기 결손)되고 신호 도메인 (서열번호 1의 Met1-Ser12)이 불변 체인의 신호 도메인 (서열번호 15의 Met1-Arg29)으로 치환된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 (서열번호 1의 아미노산 1-681), 토세아 아시그나 바이러스의 캡시드 단백질 전구체로부터 유래한 2A 자기-절단 펩타이드 서열 (서열번호 7), SARS-CoV-2 N 단백질 (서열번호 8)에 융합된 유비퀴틴 (서열번호 9)를 코딩한다. 또한, 이 플라스미드는 72 뉴클레오티드 SV40 DNA 핵 표적화 서열 (DTS)(서열번호 16)을 카나마이신 내성 유전자의 상류 더 큰 SV40 ori 인핸서 서열 (서열번호 20) 내에 포함한다 (도 3 참조).
살모넬라 티피무리움 SL7207 백신을 실시예 5에 기술된 바와 같이 pVAX10-SCV-53을 이용해 제조하였다.
4-6주령의 병원체-프리, 암컷 BALBc 마우스를 Charles River Laboratories (St Constant, PQ, Canada)에서 구입하여, 기관 지침에 따라 사육하였으며, 물과 음식물은 자유롭게 접근가능하게 하였다.
마우스 10마리로 구성된 군에 SL-SCV-53 백신을 처리하였다. 각 처리에서, 투여 완충제 (310 mmol 소듐 바이카보네이트, 100 mmol L-아스코르브산, 5 mmol 락토스 일수화물) 100 ㎕를 입을 통한 위관 영양법으로 미리 처리한 다음, 투여 완충제 중의 백신 용량 100 ㎕를 1.5-2x10e9 CFU/ml로 투여하였다. 0, 2일, 5일, 7일, 21일 및 35일에 마우스에 처리하였다. 실험 전 (면역 전)에 마우스에서 채혈한 다음 2주, 4주, 6주 및 8에 채혈하였다.
혈청에서 실시예 5에 기술된 바와 같이 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 항체를 분석하였다.
SL-SCV-53으로 백신 접종한 마우스 10마리 중, 3마리는 1/400 백그라운드 분석에 비해 높은 항체 반응을 나타내었으며, 1/800에 도달하였다 (도 7 참조). 이는, 신호 도메인 변형된 스파이크 단백질을 표적화하는 살모넬라-기반의 SARS-CoV2 백신 구조체가 스파이크 단백질에 대해 항원-특이적인 면역 반응을 구축할 수 있음을 입증해준다.
실시예 9: VXM-SCV-X I 상 임상 실험; 실험 설계
I상 실험의 목표는 VXM-SCV-X에 대한 안전성, 관용성 및 면역학적 반응을 조사하고자 하는 것이다. 무작위, 위약-대조군의 이중 맹검 용량-증량 실험은 개체 45명을 포함한다. 개체는 1일, 3일, 5일 및 7일에 VXM-SCV-X를 4가지 용량으로 또는 위약을 투여받는다. VXM-SCV-X 106 CFU에서 최대 109 CFU의 용량을 본 실험에서 평가한다. 독립적인 데이터 안전성 모니터링 위원회 (DSMB)가 용량-증량 결정에 참여한다. 일차 엔드포인트로서 안전성과 더불어, VXM-SCV-1-특이적인 면역 반응을 평가한다.
목표는 항-SARS-CoV-2 바이러스 조사 백신 VXM-SCV-X에 대한 안전성, 관용성 및 면역 반응을 조사하고 아울러 VXM-SCV-1의 최대 허용 용량 (MTD)을 동정하고자 하는 것이다. MTD는 VXM-SCV-X 치료 중인 환자 최대 6명 중 2명 미만이 용량-제한 독성 (DLT)을 경험하는 최고 용량 수준으로서 정의한다.
안전성 및 관용성에 대한 일차 엔드포인트는 CTCAE 기준에 따른 이상 사례 및 중증 이상 사례이다.
SARS-CoV-2 S 단백질에 대해 특이적인 면역 반응을 유도하는 실험 백신의 효과를 분석하는 2차 엔드포인트는 면역 양성 환자의 수를 포함한다.
VXM-SCV-X는 우수 의약품 제조 (GMP)에 따라 제조하고, 완충화된 용액으로 제공된다. 위약 대조군은 등장성 염화나트륨 용액으로 구성된다.
개시 용량은 VXM-SCV-X를 106 콜로니 형성 단위 (CFU)로 포함하는 용액으로 구성된다. 이러한 VXM-SCV-X 용량은 안전성의 이유로 선정되었다. 비교하기 위해, 장티푸스에 대해 허가된 백신인 Typhoral®의 1회 용량은 VXM-SCV-1의 개시 용량의 약 1000배에 해당하는 Ty21a 2x109 내지 6x109 CFU로 살모넬라 티피를 함유한다. 이 용량은 대수 단계로 증량되며, 이는 살아있는 박테리아 백신에 타당한 것으로 보인다.
인간 최초 실험에 대한 지침에 준하여, 용량 군의 환자들은 코호트에서 치료한다. 임의의 용량 군에서 VXM-SCV-X의 1차 투여는 환자 한명에 제공한다. 각 용량 군의 제2 코호트는 VXM-SCV-X를 투여받는 환자 2명으로 구성된다. 선두 주자 1명, 즉 환자 단 1명에게 VXM-SCV-X를 먼저 투여하는 이러한 시차 투여 (staggered administration)는 위험을 줄이는 역할을 한다.
3차 코호트 환자 (3명 VXM-SCV-X 투여)는 모든 용량 군들에 포함된다.
경구 백신의 본질적인 환경적 위험은 환경 배출 가능성과 이로 인한 표적 집단 이외의 사람에 대한 백신 접종이다. 모든 실험 환자들은 백신 접종하는 기간과 추가로 3일 동안 실험 시설에 격리 수용한다. 실험 환자의 대변을 모두 수집해 소각한다. 체액 및 대변 샘플에서 VXM-SCV-X 배출을 조사한다.
연구 인력을 우발적인 노출로부터 보호하기 위한 위생 조치를 적용한다. 연구 인력은 본 실험의 이러한 측면들에 대해 특수 교육을 받는다.
아울러, 특이적인 T 세포 활성화 및 항체 형성을 이러한 환자 설정에서 측정한다. 활성 백신 대 백그라운드 처치와 관련한 특수 안전성 문제에 대한 추가적인 지식을 얻기 위해 위약 대조군을 포함시킨다. 또한, 종합한 위약 환자들은 특이적인 면역 활성화를 평가하기 위한 타당한 비교인자이다.
실시예 10: VXM-SCV-1 특이적인 T 세포 및 B 세포 반응
VXM19에 대한 반응은 백신 접종하기 전, 접종하는 동안 및 백신 접종한 후 여러 시점에 IFNγ ELISpot에 의해 검출한 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질 특이적인 T 세포의 빈도를 VXM-SCV-X 및 위약 처리 환자의 말초혈에서 모니터링하여 평가한다.
먼저, T 세포 및 펩타이드 펄스 처리된 DC를 항-INFγ 항체로 코팅된 웰에 첨가한다. 인큐베이션한 후, 세포는 제거하고, 분비된 INFγ는 코팅된 항체와 결합한 채 남겨진다. 검출 항체를 첨가하여 결합된 INFγ를 검출하고, 신호 증폭 후 최종 수율을 단일 활성화된 및 특이적인 T 세포를 표시하는 "색상 스팟"으로서 볼 수 있다.
B 세포 반응은 ELISA에 의해 측정한다. 간략하게는, 96웰 EIA 플레이트를 소듐 카보네이트 완충제 (pH 9.5) 중의 N 또는 S 단백질 에피토프 또는 재조합 전체 N 또는 S 단백질 1 ㎍/ml로 4℃에서 밤새 코팅한다. 다음날, 플레이트를 100 mmol 트리스-완충화된 염수/ Tween (TBST)으로 헹군 다음 3% 젤라틴으로 37℃에서 1시간 동안 차단 처리한다. 플레이트를 TBST로 잘 헹군 다음 각 플레이트의 윗 열에 혈청을 첨가하고, 각 하단 줄에서 TBST로 1:1 희석하였다. 각 플레이트에서, 음성 대조군 컬럼에는 혈청을 넣지 않았다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 현상하기 위해, 플레이트를 TBST로 헹군 다음 알칼라인 포스파타제가 접합된 단백질 G (Calbiochem, USA) 1:1000 희석물과 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트 리더로 OD405를 측정하였다. 항체 엔드포인트 역가를 음성 대조군의 평균 OD405 보다 1 표준편차 OD405 높이는데 필요한 희석 배수의 역수로 결정한다.
실시예 11: 항-담체 면역
박테리아 비히클에 대한 면역 반응을 평가하기 위해, 항-살모넬라 티피 IgG 및 IgM 면역글로불린을 2가지 시판 분석 키트 (Salmonella typhi IgG ELISA, Cat. No. ST0936G 및 Salmonella typhi IgM ELISA, Cat. No. ST084M; Calbiotech. Inc., 10461 Austin Dr, Spring Valley, CA 91978, USA)를 사용해 ELISA에 의해 검출하였다. 분석은 정성 분석이다. 분석은 각각 App.I/I의 패키지 첨부물에 언급되고, 이전 검증 연구 580.132.2785에 따른 실험 계획의 일부로서 수정된 바에 따라 적용한다.
2가지 분석 모두 효소-연계된 면역흡착 분석 기법을 이용한다. 교정자, 음성 대조군, 양성 대조군 및 샘플은 두플리케이트로 분석한다. 정제한 항원으로 코팅된 웰에 환자의 희석 혈청 (희석 1:101)을 첨가한다. IgG 또는 IgM 특이적인 항체는, 존재하는 경우, 항원에 결합한다. 결합되지 않은 물질들은 모두 세척 제거하고, 효소 접합체를 첨가하여 항체-항원 복합체에 존재하는 경우 결합시킨다. 과잉의 효소 접합체를 세척 제거하고, 기질을 첨가한다. 플레이트는 기질이 효소에 의해 가수분해되도록 인큐베이션한다. 발색 강도는 샘플 내 IgG 또는 IgM 특이 항체의 양에 비례한다. 색 강도는 450 nm에서 분광광도측정의 마이크로타이터 플레이트 리더를 사용해 측정한다. 컷 오프를 다음과 같이 계산한다:
교정자 OD x 교정기 계수 (CF).
각 결정의 항체 지수는 각 샘플의 OD 값을 컷 오프 값으로 나누어 결정한다.
항체 지수 해석:
<0.9
ELIAS에 의한 살모넬라 티피 IgG 또는 IgM에 대한 항체 검출 불가
0.9-1.1
경계 양성
>1.1
ELISA에 의한 살모넬라 티피 IgG 또는 IgM에 대한 항체 검출가능
실시예 12: 백신 접종 일정
VXM19의 단일 용량, 즉 106 내지 108 CFU는 100 ml 음용 용액으로서 경구 투여한다. 단일 용량의 백신 접종은 1일, 3일, 5일, 및 선택적으로 7일에 각각 실시한다. 최대 면역 반응은 마지막 백신 접종 후 약 10일째에 이루어질 것으로 예상된다. 부스팅은 2-4주 후 또는 심지어 3-6개월 후에 고려할 수 있다. 일정 권장 사항은 백신 균주 Ty21a를 참조한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Vaximm AG
<120> NOVEL SALMONELLA-BASED CORONAVIRUS VACCINE
<130> 116631P855PC
<150> EP20167405.8
<151> 2020-03-31
<160> 20
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 1273
<212> PRT
<213> Coronaviridae
<220>
<223> SARS-CoV-2 S Protein
<400> 1
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075 1080 1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090 1095 1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105 1110 1115 1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125 1130 1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140 1145 1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170 1175 1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185 1190 1195 1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1205 1210 1215
Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
1220 1225 1230
Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val
1250 1255 1260
Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 2
<211> 3500
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pVAX10
<400> 2
tgggcttttg ctggcctttt gctcacatgt tcttgactct tcgcgatgta cgggccagat 60
atacgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 120
ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 180
gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 240
caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggactattt acggtaaact gcccacttgg 300
cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 360
ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 420
tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 480
gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 540
gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 600
tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctctctggc 660
taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa tacgactcac tatagggaga 720
cccaagctgg ctagcctcga gtctagaggg cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact 780
gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg 840
gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg 900
agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg 960
gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctac tgggcggttt 1020
tatggacagc aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag gttgggaagc 1080
cctgcaaagt aaactggatg gctttctcgc cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa 1140
gctctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg 1200
caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa 1260
tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg 1320
tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt 1380
ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa 1440
gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc 1500
ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg 1560
ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg 1620
aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg 1680
aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg 1740
gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact 1800
gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg 1860
ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc 1920
ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga attattaacg 1980
cttacaattt cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 2040
tacaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 2100
acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatagca 2160
cgtgctaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct 2220
catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc cccatcagtg 2280
accaaacagg aaaaaaccgc ccttaacatg gcccgcttta tcagaagcca gacattaacg 2340
cttctggaga aactcaacga gctggacgcg gatgaacagg cagacatctg tgaatcgctt 2400
cacgaccacg ctgatgagct ttaccgcagc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 2460
aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 2520
agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg 2580
acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga 2640
ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat 2700
accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 2760
tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 2820
ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 2880
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 2940
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 3000
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 3060
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 3120
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 3180
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 3240
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 3300
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 3360
tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 3420
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 3480
ctcaagaaga tcctttgatc 3500
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> Coronaviridae
<220>
<223> Signal peptide S protein
<400> 3
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys
1 5 10 15
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 28 aa of C3d
<400> 4
Lys Phe Leu Thr Thr Ala Lys Asp Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly
1 5 10 15
Lys Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala
20 25
<210> 5
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3C3d
<400> 5
Lys Phe Leu Thr Thr Ala Lys Asp Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly
1 5 10 15
Lys Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys Phe Leu Thr Thr Ala
35 40 45
Lys Asp Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly Lys Gln Leu Tyr Asn Val
50 55 60
Glu Ala Thr Ser Tyr Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ser Gly Ser Lys Phe Leu Thr Thr Ala Lys Asp Lys Asn Arg Trp
85 90 95
Glu Asp Pro Gly Lys Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala
100 105 110
<210> 6
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2A peptide P2a
<400> 6
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2A peptide T2a
<400> 7
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 8
<211> 419
<212> PRT
<213> Coronaviridae
<220>
<223> N protein YP_009724397.2
<400> 8
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn
180 185 190
Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala
195 200 205
Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
210 215 220
Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln
225 230 235 240
Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
245 250 255
Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln
260 265 270
Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp
275 280 285
Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
290 295 300
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala
325 330 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu
340 345 350
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
355 360 365
Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
405 410 415
Thr Gln Ala
<210> 9
<211> 75
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> ubiquitin
<400> 9
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly
65 70 75
<210> 10
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T4 Fibritin foldon trimerization domain
<400> 10
Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys
1 5 10 15
Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
20 25
<210> 11
<211> 5154
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SCV-3
<400> 11
gctagcgccg ccaccatgtt cgtcttctta gtgcttctgc cccttgtttc atctcagtgc 60
gtaaatctca ccaccagaac ccagctgcct cccgcctaca cgaactcctt tactaggggg 120
gtatattacc ctgacaaggt attcagatcc tcagtactgc attccacaca ggacctcttc 180
ctccctttct tcagcaatgt aacctggttt cacgccattc atgtctccgg gaccaacggc 240
acgaagaggt ttgacaaccc cgtcctaccc tttaatgacg gtgtgtactt tgcgtcgaca 300
gaaaagagta atatcattcg cggctggatt tttggtacaa ccttagattc taagacgcag 360
tcactcctta tagtgaacaa tgccacaaat gttgttatca aggtgtgtga atttcaattc 420
tgcaatgatc ctttcctggg tgtgtactac cataagaata acaaaagttg gatggaatca 480
gaatttagag tttactcttc agctaacaat tgcactttcg agtatgtttc ccagcctttc 540
ctcatggatc tggaggggaa acaagggaat ttcaaaaatc tgcgcgaatt cgtgttcaaa 600
aatatagatg gatatttcaa gatctacagc aaacacacac ctatcaacct tgttcgagat 660
ctgccccagg gattttctgc cctggaacca ctcgtggacc tgcccatcgg tattaacatc 720
actcgattcc agacactact ggccctccac cggagctacc tgacccctgg ggattcttct 780
agtgggtgga cagcaggcgc agctgcttac tacgtgggct atttgcagcc tcggaccttc 840
ttactgaaat acaatgaaaa tggcaccatc acagatgctg tggactgtgc cttagaccct 900
ctctccgaaa ccaaatgtac ccttaagagc ttcacagtcg aaaaagggat ttaccaaacg 960
tcgaacttca gggtgcagcc cactgagagc atcgtcagat ttcccaatat tacgaacctg 1020
tgtcccttcg gagaagtgtt caacgctact cgatttgcct ctgtgtacgc atggaatcgc 1080
aaaaggatct cgaattgcgt agccgactac tccgttctgt ataattccgc atcctttagc 1140
acttttaaat gctacggggt cagccctact aaactgaacg acctctgctt caccaacgtc 1200
tacgctgatt cttttgtcat ccgtggggat gaagtgaggc agatagcccc aggtcagact 1260
ggaaagatcg cggattataa ttacaaactg ccagacgact tcactggctg cgtgatcgcc 1320
tggaacagta acaacctcga cagcaaagtg ggcggaaact acaactattt atatcgcttg 1380
tttagaaagt ccaacttgaa gccttttgaa agagacattt ctactgagat ttaccaggct 1440
gggtcaacac cctgtaacgg cgtggaaggc tttaactgtt acttcccctt acaaagctat 1500
ggcttccagc caaccaacgg agttgggtat cagccctaca gggtcgtcgt gttgagtttc 1560
gagctcttac atgcacctgc caccgtctgc ggccccaaga agtctacgaa cctggtgaag 1620
aacaagtgtg tcaatttcaa ctttaatgga ctaactggga caggcgtgct gacggagtca 1680
aacaagaaat tcctgccatt tcagcagttt ggtcgggaca ttgcagacac aactgacgcg 1740
gtgcgggacc ctcagacgct tgaaatatta gacataacac cttgtagctt tggcggagtg 1800
tctgtcatca ccccgggaac taacaccagc aaccaggtgg cagtcctata tcaggacgtc 1860
aattgcacgg aggttcccgt ggcaatacac gcggaccaac tcacaccgac ttggagagtg 1920
tattccacag gtagcaacgt ctttcaaact cgggctggtt gcctgattgg cgcagagcac 1980
gtgaacaaca gctatgagtg tgacattccc ataggcgcag ggatttgtgc ttcataccag 2040
actcagacta acgcccgtag tgtagccagc cagtccatca ttgcatacac tatgtcactg 2100
ggagcagaga actctgttgc ctacagtaac aatagtattg ctattccgac gaactttacc 2160
atcagtgtga ctaccgagat cctgccagtc tcgatgacca agacctccgt agattgtacc 2220
atgtatatct gcggggacag caccgagtgc tctaatttgt tgctgcagta tgggtccttc 2280
tgtacgcagt tgaatcgggc cttgacaggc atcgctgtcg agcaggataa aaacactcaa 2340
gaggtctttg cacaggttaa gcagatttat aagacacctc ccataaaaga cttcggtggc 2400
tttaacttct cacaaatctt accagaccca agtaagccaa gtaaacgttc tttcatcgag 2460
gacctcctct ttaataaggt gacccttgct gatgcaggtt tcatcaagca gtacggtgac 2520
tgcctgggag acatagcagc ccgggatttg atctgcgcac agaagttcaa cggactaaca 2580
gtgctcccac ctttgctgac ggatgagatg attgcccagt acacatcagc tctcctggcg 2640
ggcaccatta cctcaggatg gacctttgga gcaggagctg cgctccagat cccgtttgcc 2700
atgcagatgg cctataggtt caacggcata ggcgttacac agaacgtgct gtatgagaat 2760
cagaagctca tcgccaacca gttcaattct gccataggaa aaatccagga ttccctttct 2820
tcaactgcct cagccctcgg gaagctacaa gatgtggtca atcagaacgc tcaggcccta 2880
aatactcttg tgaagcagct gtcgtcaaac tttggggcca tcagcagtgt tctgaacgat 2940
atcctgtcac ggctggatcc accagaggcc gaggtccaga ttgaccgact aattaccggc 3000
aggctgcaat ctcttcagac ttacgtcaca cagcagctga tccgagctgc agaaatcaga 3060
gccagtgcaa acctggctgc aacgaaaatg tcagagtgtg tgcttggaca gtcaaaaaga 3120
gtagactttt gtggcaaggg ataccatttg atgtcctttc cacaatccgc tccgcatgga 3180
gttgtgtttt tgcatgttac ctatgtccct gcccaggaaa agaactttac cacagctccc 3240
gccatatgcc acgatgggaa ggcccacttt ccacgcgagg gagtcttcgt gtctaatggt 3300
actcactggt ttgtgaccca acgcaatttt tacgaacctc aaatcattac cacagacaat 3360
acattcgtat caggtaactg cgatgtcgtg attggaatcg tgaataatac cgtttatgac 3420
ccccttcaac cagaactgga ctcatttaag gaagagctcg acaaatattt caaaaaccac 3480
actagcccgg atgtggattt gggcgatata agcggcatca atgctagtgt ggtgaacatc 3540
cagaaggaga ttgaccggct aaatgaagtg gccaagaacc tgaatgagag cttgattgac 3600
ctccaggagc ttggtaaata cgaacaatat atcaagtggc catggtatat ctggctggga 3660
ttcattgccg gcctgatcgc catcgtgatg gtaacaatca tgctgtgctg catgactagc 3720
tgctgctcct gtctgaaggg ctgttgctct tgtggtagtt gttgtaagtt tgatgaagac 3780
gatagcgagc cagttctcaa aggagtgaag ttgcactaca caggatccgg tgaaggccgt 3840
gggtcccttt taacgtgtgg tgacgtagaa gaaaacccag gcccgctcat gagcgacaat 3900
ggaccacaga atcagcgaaa cgcccccagg attacatttg gcggtcccag tgactcgacc 3960
ggcagtaacc agaatgggga gaggtctggg gcgaggtcta agcagaggag gccacaaggc 4020
ctgccaaata atactgcgag ctggttcaca gcactgacac agcatggcaa agaggatctc 4080
aaattcccaa gaggtcaagg cgttccaatc aatactaaca gctctcctga tgatcagatc 4140
ggctactata gacgggccac gcgacgaatt cgcggagggg atggtaagat gaaggatttg 4200
tcaccacgct ggtactttta ttaccttggg acaggacctg aggcagggct tccatacggc 4260
gctaataaag acggcattat ctgggttgcc acagaggggg cactgaatac ccctaaggat 4320
cacatcggca ctagaaaccc tgcgaataac gcagccatag tgctccagtt accacaggga 4380
accacactgc ctaagggttt ctatgctgag gggagcaggg gaggaagtca ggcatcgtcc 4440
agatccagtt ctagatcgcg gaacagcagt cggaattcca ctcctggctc atcaagagga 4500
acctcaccag ccaggatggc agggaacgga ggagacgcag cgctggctct gctcctcctg 4560
gatagactta accaactgga gagcaagatg tccggaaagg gccagcaaca acaaggtcag 4620
accgtgacga agaaatcagc cgccgaagct agtaaaaagc cccggcagaa acggactgct 4680
acaaaggcat acaatgtcac acaagccttc ggtcgcaggg ggccagaaca aacccagggg 4740
aatttcggtg atcaggagct gatacggcag ggaacagact ataagcactg gccgcagatc 4800
gctcagttcg caccctccgc aagcgccttt ttcggcatgt ctcgcatagg aatggaggtg 4860
acgcccagtg gcacatggct aacttataca ggcgccatta aacttgatga caaagacccg 4920
aacttcaagg accaagtcat cttgctgaac aagcatattg atgcttataa gactttccct 4980
cctactgagc cgaaaaagga taaaaaaaag aaagctgacg agacacaggc gcttccccag 5040
cgtcaaaaga aacagcagac agtgacgctg ttgcccgctg ctgatttgga cgatttcagc 5100
aagcaactac agcagtccat gtccagcgct gattccaccc aagcttaact cgag 5154
<210> 12
<211> 2619
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SCV-30
<400> 12
gctagcgccg ccaccatgtt cgtgtttctg gtgttactcc cattggtgtc tagagtgcag 60
ccgaccgaat ccatcgtgcg cttccctaat atcactaatc tgtgcccctt tggggaagtt 120
tttaatgcca ctaggttcgc atctgtgtat gcatggaacc gcaagcgaat tagcaactgc 180
gtcgctgact attcagtact gtataactct gccagtttct ccactttcaa gtgctatggg 240
gtatccccca ccaagctcaa tgacctttgc tttacaaacg tgtacgccga ttcctttgtg 300
attcgaggag atgaagtgag gcagatagcc ccagggcaga ctggaaagat cgccgactac 360
aattacaaac tgccggatga tttcaccggg tgtgtgattg cttggaatag caataatctg 420
gattctaaag tgggaggcaa ctataattac ctatacagac tgttccggaa gtctaaccta 480
aagccatttg aaagagacat ttcaaccgaa atataccaag cgggctctac cccgtgtaat 540
ggcgttgagg gcttcaattg ctatttccct cttcagtcct acgggttcca gcctacaaat 600
ggtgtcggct accagcccta cagggttgtc gtcttaagtt tcgagctgct gcatgcaccc 660
gccaccgtct gtggcccaaa aaagagtact aacttggtaa aaaacaagtg tgtgaacttt 720
ggatccaaat ttcttaacac cgctaaggat cgtaataggt gggaggaacc agatcagcag 780
ctctacaacg ttgaagccac ctcatacgca ggatcgggtg ggggaggaag cggcggcgga 840
ggcagcggct ctaagtttct gaacacagca aaggacagga atcgttggga ggaacctgac 900
cagcagctct acaacgtcga ggcaaccagt tacgcgggta gtggaggggg cgggtctgga 960
ggcggaggaa gcggttccaa gtttctcaac acagctaaag accgcaaccg gtgggaggag 1020
ccggaccagc aattatataa tgtggaggcc acatcgtatg ccgggagtgg cgagggcagg 1080
ggttcactgc tgacttgtgg agatgtggaa gagaacccag ggccactgat gcagatcttt 1140
gtcaagacac ttacaggaaa aaccattacc ctggaggtgg agccaagtga cacaattgag 1200
aacgttaagg caaaaatcca ggacaaggag ggcatccccc ctgaccaaca acgacttata 1260
tttgcaggta agcaactaga agatggccgc acactttcag actacaacat ccaaaaagag 1320
tctacactcc acctggtctt gagattaaga ggaatgtcag acaacgggcc gcaaaaccag 1380
cggaatgctc ccagaatcac tttcgggggg cctagtgact caaccggtag caaccagaac 1440
ggggagcgtt ccggcgccag gtcaaagcag cgtcggcctc agggcctccc caacaacact 1500
gccagctggt tcactgcttt aacccagcat ggtaaagaag acctgaagtt cccccgaggg 1560
cagggtgtac ctattaacac gaacagctct cctgatgatc agatcggcta ttatcgaaga 1620
gccacaagga gaatacgcgg aggcgacggg aaaatgaaag acctctcccc caggtggtac 1680
ttctactatc tgggcacggg gcctgaggcc gggctgccat acggcgcgaa taaagatgga 1740
atcatctggg tagctacgga gggcgcatta aatactccca aggaccatat tggaaccagg 1800
aatccagcta acaatgcagc tattgttttg cagctccccc aggggacaac tctgcccaag 1860
ggattctatg ctgaaggtag ccgtggaggc agtcaggcgt ctagtcggtc ctctagtaga 1920
agccgaaatt ctagccggaa tagcacccca ggttcctctc ggggcacatc acctgctcgg 1980
atggcaggta acgggggaga tgctgccctg gctctcctgc tgttggatag attgaatcag 2040
ttggagtcta agatgtccgg caagggacaa cagcagcaag gtcagacagt cacgaagaaa 2100
agcgcagcgg aggccagcaa gaaacctcgc cagaagagaa cagccaccaa agcctacaat 2160
gtgacccagg ccttcggccg gcgggggccc gaacagactc aaggaaattt tggtgaccag 2220
gaactgatac gacaggggac agattataag cactggcctc aaatcgctca gttcgctcct 2280
tctgccagtg ccttctttgg tatgagcagg atcggcatgg aagttactcc ttccggcacg 2340
tggcttactt acacaggagc catcaaactt gatgacaaag atccaaactt taaggatcaa 2400
gtcatcttac taaataagca cattgatgct tataaaactt tcccacccac cgaaccaaaa 2460
aaggacaaaa aaaaaaaggc cgacgagacc caagctttgc ctcagcgcca gaagaagcag 2520
cagaccgtga cgctcttgcc agcagcagac ctggacgatt tttcgaaaca gcttcagcag 2580
tccatgtcga gcgcggactc aacacaagca taactcgag 2619
<210> 13
<211> 5787
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SCV-42
<400> 13
gctagcgccg ccaccatgtt cgtgttcttg gtgctcttac cactggtctc ctcacagtgc 60
gtgaacctga caacacgaac ccaactgcca ccagcataca cgaattcttt tacccgaggt 120
gtgtattatc ctgacaaagt ctttagaagt tcagtcctcc attccactca agatttgttt 180
ctcccgttct tctcgaatgt gacatggttt catgctattc atgtgtcggg gacaaatggc 240
accaagcggt ttgacaatcc tgtcttacct ttcaatgatg gggtttattt cgcatcaaca 300
gaaaagagca acattatacg gggctggata ttcgggacca ccctggattc caaaacccag 360
tctctgctaa ttgtgaataa cgccacaaat gtagttatca aagtgtgtga gttccagttt 420
tgcaacgatc cattcttggg tgtctactat cacaagaaca ataaatcatg gatggagagc 480
gagtttaggg tctattcttc tgcaaacaac tgtacgttcg agtacgtctc ccagccattc 540
ctcatggacc tggagggcaa acaggggaac ttcaaaaatc ttagagaatt cgtcttcaaa 600
aacatcgatg ggtattttaa gatctacagc aaacataccc ccatcaatct cgtgcgggac 660
cttcctcagg gcttttccgc acttgaacct ctcgtcgacc ttcccatcgg aatcaatatt 720
acaaggttcc agacactact cgcccttcac agatcctacc tgacgccagg cgattcctcc 780
tctggctgga cagcgggagc cgctgcctat tatgtgggct atttgcagcc tcgcacattc 840
ctcttgaaat acaacgagaa tgggaccatt acagatgcag tggactgtgc acttgaccct 900
ctgtctgaga caaagtgtac actgaaatcc ttcacggtgg agaagggtat ctaccagact 960
tctaacttcc gggttcagcc cactgagtcc atagtccggt tcccaaacat aactaaccta 1020
tgcccatttg gggaggtttt caatgctacc cgcttcgcct cagtttatgc ttggaacagg 1080
aagagaatta gcaactgtgt ggccgactat agtgtgctgt acaactccgc cagcttctcc 1140
accttcaaat gctatggtgt gtcacctacc aaactgaatg atctgtgctt tacaaatgtt 1200
tacgctgata gttttgtaat cagaggtgac gaagtaagac agattgcccc cggacaaact 1260
gggaagatcg cggattacaa ttacaaactt cccgacgact ttacgggctg cgtgatcgcc 1320
tggaatagca ataatctgga cagcaaggtg ggcgggaatt ataactacct ctaccgcctc 1380
ttcaggaaaa gtaacctgaa gccctttgaa cgtgatataa gcactgagat ataccaagct 1440
ggcagcacgc cttgtaacgg agtggaagga ttcaactgct acttcccttt acaaagttat 1500
ggcttccagc caaccaacgg ggtgggttat cagccataca gggttgttgt gctaagtttt 1560
gagttattac atgcacctgc tactgtctgc ggcccaaaaa agtccaccaa cctggttaaa 1620
aacaaatgtg tcaattttaa tttcaatggc ctaacaggta cgggtgtctt gactgaaagt 1680
aataaaaaat ttcttccatt tcagcagttt gggagagaca tcgcggacac aaccgatgct 1740
gtgagagatc cgcagacact ggagattttg gacatcaccc cgtgtagctt tggcggtgta 1800
tctgtgataa ctcctgggac taatacaagc aaccaggttg ccgtgctgta tcaagacgtg 1860
aactgcactg aggtccctgt ggcaatccat gctgaccagc tgacgcccac ctggagggtt 1920
tactcgaccg gaagtaatgt attccaaact cgggcaggct gcctcatcgg agcagaacac 1980
gtgaacaact cctatgagtg tgatataccc atcggtgcag gaatttgtgc cagctaccag 2040
acacagacaa acagcccagg gagcaagttc ctgaacacgg ccaaggatcg aaaccggtgg 2100
gaggaaccag atcaacaatt gtataacgtt gaggccacgt cttacgccgg tagtggcggg 2160
ggtgggtcag gcggtggagg aagcggatca aagttcctca atactgcgaa ggacaggaac 2220
cgctgggaag agccggacca gcagttgtac aatgtggaag ccacaagcta tgctggaagt 2280
ggtggcggag gctcaggagg agggggatcg gggtctaagt ttctgaacac tgcaaaggac 2340
agaaataggt gggaggagcc tgaccagcaa ctgtacaacg tggaagcaac aagctacgcc 2400
ggctcagggg agggaagagg gagcctcctg acatgtgggg acgtagagga gaaccccggg 2460
ccgctcatgc aaattttcgt aaagactctg acaggcaaga cgatcacact ggaagtcgag 2520
ccatctgaca ccatcgaaaa tgtaaaagcc aaaatacaag acaaagaagg aattccccca 2580
gaccaacagc gactcatctt tgcaggcaag cagctggagg acggacggac cttgtctgac 2640
tacaatattc agaaggagtc tactttgcat ctggttcttc ggctaagagg catgagtgac 2700
aacggcccac aaaaccaaag gaatgccccg aggatcacct tcggcggacc ctccgatagc 2760
acaggcagta accagaatgg ggaaaggagt ggagccaggt caaaacagcg tcggccacag 2820
ggactgccca acaacaccgc ttcctggttc acagcactga cccagcatgg gaaagaggat 2880
ttgaaattcc ctcgtggtca aggtgtcccc attaacacga actcatcccc tgatgaccag 2940
atcggttact acagaagagc aaccaggagg atacgcggcg gagacggcaa aatgaaggat 3000
ctgtctccgc ggtggtattt ctactacctt ggcaccggcc ctgaggctgg actgccttac 3060
ggagcaaaca aagatggaat tatctgggtg gccaccgagg gtgctctcaa cacgcccaag 3120
gaccacatag gtactcgcaa cccagccaat aatgctgcca tcgtgctgca gctgcctcag 3180
ggaacaacac ttcccaaagg attctatgct gagggcagcc gcggaggctc gcaggcctcg 3240
tccaggtcca gttcaaggtc tcgaaattca tcccggaact ctactccagg ttctagtaga 3300
ggaacaagtc cggcaaggat ggccgggaat ggtggagatg ccgctctggc cctcctacta 3360
cttgacagat taaaccagct ggaaagcaaa atgagtggaa agggccagca gcaacagggc 3420
cagacagtga caaagaagtc agctgcggag gcctccaaga agcccaggca gaaacgcact 3480
gctactaaag cttataatgt cacccaagct ttcgggcgca ggggccccga acaaacacag 3540
ggtaattttg gagatcagga actcattcgt cagggcacgg attataaaca ctggccccag 3600
attgcccagt ttgcaccatc tgccagcgcc ttttttggga tgagtcgcat tggaatggaa 3660
gttactcctt ctggcacctg gctgacatat actggagcca ttaagctgga cgacaaggat 3720
cccaatttca aggaccaagt aatactgctc aataagcaca ttgatgccta caaaaccttt 3780
ccgcccactg agcccaagaa agataagaag aagaaagcag atgagaccca ggctctcccc 3840
cagagacaga agaaacagca gacggttacc ctgctgcctg ccgcggacct ggatgacttt 3900
agcaagcaac ttcagcagtc catgtcgtcc gctgatagta ctcaggccgg gtctggggag 3960
gggcggggca gcctgcttac ttgtggtgat gttgaagaga accctggacc ccttagtgtg 4020
gcatcacaat ctattattgc atataccatg tccctcggcg cggagaacag cgtggcctac 4080
agtaacaact ccatagccat tcctaccaac tttaccatct ctgtcaccac agaaattctc 4140
cccgtgtcca tgaccaagac ctcagtggac tgcactatgt acatttgcgg cgattccacc 4200
gagtgctcca acttgcttct gcagtacgga tcgttctgta cacaattgaa tagagcccta 4260
accggcatcg ctgtcgaaca ggataagaac acccaagaag ttttcgccca ggtgaagcag 4320
atttataaga caccccctat taaggacttc ggaggtttca acttcagcca gatcctgcct 4380
gatccatcca agccttccaa gcggtccttc atcgaggacc ttcttttcaa caaggtcacc 4440
ttagcggacg cagggtttat aaagcaatat ggagattgcc ttggtgatat cgctgcccga 4500
gacctgatct gcgctcagaa atttaatggt ttaacggtgt tgccaccatt attgacagac 4560
gagatgatcg cacagtacac tagtgcgctg ctggctggga caatcacatc tggatggacg 4620
tttggggctg gtgcagccct ccagatccct tttgccatgc aaatggcgta ccgtttcaac 4680
ggcatcggcg tgactcagaa cgtcctatat gagaatcaga agcttattgc taaccagttc 4740
aactccgcta ttggtaagat tcaggacagc ctcagcagca ctgcgtctgc gctgggcaag 4800
ttgcaagacg tggtgaatca gaatgcacag gccttaaaca cactggttaa acaactgtcc 4860
tcgaacttcg gggctatcag ctctgtcctc aatgacatcc tttccagact cgacccaccc 4920
gaggcagaag tccagatcga tcgactgatc acaggcagac tgcagagcct gcagacctat 4980
gtcacccagc agctcatacg agctgctgag atccgagctt ctgcaaacct ggccgcaact 5040
aagatgtctg aatgtgtcct gggtcagagc aagcgggtgg atttttgtgg gaaaggctac 5100
cacctaatgt catttccaca gtctgcccct cacggcgtgg tatttttgca cgtaacctac 5160
gtgccagcgc aagagaagaa ctttaccacc gccccagcaa tctgccatga tggaaaggcc 5220
cacttccccc gtgaaggggt gtttgtatcc aatggaactc actggttcgt gacacagagg 5280
aacttttatg aaccacagat catcacaacc gacaacacct ttgtgtctgg taattgtgac 5340
gtggtaattg ggattgtaaa taacactgtg tatgatcctt tacaaccaga actggattca 5400
tttaaagaag aattggacaa gtactttaag aaccacacta gccccgatgt tgatttagga 5460
gacatctcag gcatcaacgc tagtgtcgta aatattcaga aggagatcga ccgcctgaat 5520
gaagtcgcta aaaatctcaa tgagagtctg attgacttgc aggagctggg caaatacgag 5580
cagtatatca agtggccatg gtacatctgg ttggggttta tagctggtct gatcgctatc 5640
gtgatggtga ctataatgct gtgctgcatg accagctgtt gcagttgcct aaagggatgc 5700
tgttcctgtg gcagctgttg caagtttgat gaagatgatt cagaacccgt ccttaagggg 5760
gttaaattgc actacaccta actcgag 5787
<210> 14
<211> 5427
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SCV-53
<400> 14
gctagcgccg ccaccatgga tgatcagcgc gatctaattt ctaaccatga acaattgccc 60
attttaggca acagacctag agagccagag cgttgctctc gatcgcagtg tgtcaacctg 120
actacccgca cccaactccc accagcttac acaaatagct ttaccagggg tgtctattac 180
cctgataaag tgtttcgtag ctccgtcctc catagcacac aagatttgtt cctgcccttc 240
ttctcgaatg tgacttggtt ccacgccatc catgtgtcag gaacaaacgg aacgaaaagg 300
tttgacaacc cagtgttgcc cttcaatgac ggcgtttact ttgcgagtac cgagaagagc 360
aacattatcc gaggctggat cttcgggaca actctcgaca gcaagactca gtcgttgctc 420
attgttaaca atgcaaccaa cgtggtcatc aaggtgtgtg agttccagtt ctgtaatgat 480
ccgtttctgg gggtttacta ccacaaaaat aataaatctt ggatggagtc agagttccgg 540
gtgtattctt ctgcaaataa ctgcacattt gaatatgtta gtcagccttt cctcatggac 600
ttggaaggca agcaggggaa cttcaaaaat ctcagagagt ttgtgtttaa gaatattgat 660
ggttacttca agatctactc caaacacact cctataaacc ttgtgcggga tctacctcaa 720
ggcttctcag cactggagcc tttagttgac ctccccattg gcattaacat tactaggttt 780
caaacacttc tggccctaca ccggagctac cttacccctg gtgattcctc aagtggatgg 840
acagctgggg cagcagctta ctatgtggga tacctgcagc caagaacttt cttgttgaag 900
tacaatgaga acggaaccat cacggatgcc gtggattgtg cattggatcc cttgagtgaa 960
accaaatgta cactcaagtc tttcacagtt gaaaaaggaa tataccaaac ctccaacttc 1020
cgagtgcagc caacagaatc cattgttcgg ttccccaata tcacgaatct ctgcccattt 1080
ggggaggttt ttaatgccac aaggtttgcc tccgtgtatg cctggaacag gaagaggatc 1140
tctaattgtg tagctgacta ctcagtccta tacaactcgg cctctttttc cacttttaag 1200
tgctacggcg ttagtcctac caaacttaac gacctgtgtt ttaccaatgt ttacgcagac 1260
agctttgtga tccgggggga cgaggttagg cagatagctc ctggtcaaac aggtaagatc 1320
gccgattaca actataaact gcctgacgac ttcacaggct gtgtgatcgc ctggaattcg 1380
aacaacctgg attccaaggt tggcggcaat tacaactacc tgtaccgtct cttcagaaaa 1440
agcaatctca agccctttga gagggatata agcactgaga tctaccaggc cggtagcact 1500
ccctgcaacg gcgtggaagg attcaactgc tattttcctt tgcaatccta tggttttcag 1560
ccgactaatg gagtgggcta ccaaccctat agggtggttg tcttatcgtt tgagctccta 1620
catgctccag ccacagtgtg cgggccaaag aagtccacca accttgtgaa gaacaaatgc 1680
gtgaacttca acttcaacgg gctcactgga actggggtgc tgacagagtc caacaaaaag 1740
tttctaccct tccaacaatt cggcagggac attgccgata caactgacgc agttcgcgac 1800
cctcagacac ttgagatctt agatataacg ccctgctcct ttggaggcgt ctccgttatt 1860
acccctggca ccaacacaag taaccaggtg gcggtgctct accaggatgt gaactgtaca 1920
gaagtacctg tggctatcca cgctgaccaa ctgaccccaa cctggagagt gtacagcacg 1980
ggatccaatg tcttccagac aagagcagga tgcttgatag gcgccgagca cgtcaacaac 2040
agttatgagt gtgatatccc catcggagct ggcatctgcg catcatatca gacccagacg 2100
aatgcccgtt ctgtagccag ccagtctatc attgcctata ccatgtcact gggagcagaa 2160
aactctgtgg catacagtaa caacagcata gccattccta ccaactttac aatcagtgtc 2220
accaccgaaa tcctgccggt gtccatgact aagaccagcg tggactgtac tatgtacatt 2280
tgcggcgact ctactgagtg ctcaaatctg ctgctacagt atggctcatt ttgcacgcag 2340
ctaaaccggg ccttaactgg cattgctgtg gagcaggaca agaatactca agaggtgttc 2400
gcccaagtta agcagatcta caaaacaccc cccatcaaag actttggtgg ctttaacttc 2460
tctcaaatac ttcccgatcc tagcaagccg tctaagaggt ctttcatcga agatcttttg 2520
tttaacaaag tcaccctggc agatgccggt tttattaagc agtatgggga ctgcctggga 2580
gacatagctg cgagagacct gatctgtgct cagaagttca atggcctgac tgtactccct 2640
ccattgctaa ccgatgagat gatagcacag tacacttctg ccctgctggc tggcacaatc 2700
acctcaggct ggaccttcgg agccggtgcc gccttgcaga tcccattcgc aatgcagatg 2760
gcttaccgat ttaatgggat cggagttacc cagaacgtcc tgtatgagaa ccaaaaattg 2820
attgctaatc agttcaacag cgccatcggc aagatccagg atagcttgtc aagtacagcc 2880
tccgctctgg gaaagctgca ggacgtcgtg aatcagaatg ctcaggcact taacacactc 2940
gtgaaacagc tcagttctaa tttcggagct atttccagtg tccttaatga catcctgtca 3000
cgcctggatc cccctgaagc tgaagtgcag atcgaccgat taattaccgg gcgtctgcag 3060
tctcttcaga cttatgtcac tcagcaatta atcagggcgg ccgaaattcg ggcatccgcc 3120
aacttagcgg ccacaaagat gtcagaatgt gtactgggcc aaagtaaaag agtagatttt 3180
tgtggaaaag gatatcatct gatgtctttc cctcagagcg cccctcatgg ggtcgtattc 3240
ttacacgtga cctatgtccc agcccaggag aagaacttca cgacagctcc cgcgatctgt 3300
catgacggga aagcgcattt ccctcgggag ggagtatttg tttcaaacgg aactcactgg 3360
tttgtcacac agaggaactt ttatgaacct cagataatta caacggataa cacctttgtc 3420
tccggaaatt gtgacgtagt gataggtatt gtaaataata cagtctatga cccattacag 3480
cctgagctcg acagtttcaa agaagaactg gacaaatact tcaagaacca caccagtcca 3540
gatgtggatc tgggagacat ctccggcatc aatgcttctg tggtgaacat ccagaaggaa 3600
attgaccgct tgaatgaagt cgccaaaaac ctgaacgaaa gcttaattga tctgcaggaa 3660
ctggggaaat atgagcagta tataaagtgg ccctggtaca tctggctggg attcattgct 3720
ggtctgatcg cgattgtgat ggtgacgatc atgctgtgtt gcatgacatc ctgttgttct 3780
tgtctgaaag gctgctgctc ctgtggtagc tgctgcaaat ttgatgaaga cgatagcgag 3840
ccggtcctga agggtgttaa gctgcattat actgggagcg gagagggtag ggggtcgttg 3900
ctgacctgcg gagatgttga ggagaatcca ggccccatgc agatctttgt gaaaaccctg 3960
accggtaaga ccatcactct ggaggtggag ccctcggaca ccattgaaaa tgtaaaggcc 4020
aagattcagg acaaggaggg cattccacct gaccagcagc gacttatttt tgcagggaag 4080
cagctggagg atgggcgcac tctgtcggat tataacatac aaaaggagag tacactccac 4140
ctggtgctcc ggctgcgagc catgagcgac aatggacccc aaaaccagag aaacgcaccc 4200
cggatcacat tcggagggcc gtcagattca accggctcca atcaaaacgg agagcggtcc 4260
ggcgcgagaa gcaagcaaag aaggccccag ggtctgccaa acaacactgc atcctggttc 4320
accgcactta ctcagcacgg caaagaagac cttaagttcc ctaggggcca gggggtacct 4380
atcaacacaa actctagccc cgacgaccag ataggctatt atcgccgcgc cactcggcgg 4440
attagaggag gtgatgggaa aatgaaggac ctgtcgccaa gatggtattt ctactacctc 4500
ggaacagggc cagaggcagg cctcccctac ggggccaata aggatggaat tatatgggtg 4560
gctacagagg gtgctctcaa tactcccaaa gaccacatag ggactcggaa tcccgccaac 4620
aatgcagcca tcgtcctgca actacctcaa gggactaccc tgccaaaagg cttctatgct 4680
gagggcagcc gaggaggctc tcaagccagt tcccgttcaa gcagccgcag cagaaattca 4740
agcagaaatt ctacaccggg ttcttcacgt ggtaccagcc cggctaggat ggcgggcaac 4800
ggtggggacg ctgcattggc tcttttactt ttggacagat tgaaccagct ggaatccaaa 4860
atgtctggaa aagggcagca acagcaggga cagactgtga ccaagaaaag tgccgcagag 4920
gccagcaaga aacctcgcca gaagagaacc gctacaaaag cctacaacgt cacccaggca 4980
tttggccggc gcgggccaga acagacacaa gggaattttg gggatcagga gctgataaga 5040
cagggcacag actacaagca ctggccacag atcgctcagt ttgctccaag tgctagtgcc 5100
ttctttggta tgtcccggat agggatggaa gtgactcctt ctggaacatg gctcacctac 5160
accggcgcga ttaaactgga tgacaaggat ccaaatttca aggaccaggt cattctccta 5220
aataagcata tcgatgctta taagacgttc ccacccacag agcccaaaaa agataagaag 5280
aaaaaggcag acgaaaccca agcactgccg cagaggcaga agaagcagca gacagtgacg 5340
ctgctgccag ctgcagacct ggatgacttc tccaaacagc tccagcagtc tatgagttca 5400
gcggattcta ctcaggctta actcgag 5427
<210> 15
<211> 140
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> EDL09808 (invariant chain)
<400> 15
Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Leu Pro Ile
1 5 10 15
Leu Gly Asn Arg Pro Arg Glu Pro Glu Arg Cys Ser Arg Gly Ala Leu
20 25 30
Tyr Thr Gly Val Ser Val Leu Val Ala Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala
35 40 45
Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys Leu
50 55 60
Thr Ile Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Ser Leu Arg Met Lys Leu
65 70 75 80
Pro Lys Ser Ala Lys Pro Val Ser Gln Met Arg Met Ala Thr Pro Leu
85 90 95
Leu Met Arg Pro Met Ser Met Asp Asn Met Leu Leu Gly Pro Val Lys
100 105 110
Asn Val Thr Lys Tyr Gly Asn Met Thr Gln Asp His Val Met His Leu
115 120 125
Leu Thr Val Ser Leu Asp Pro Trp Ser Thr Arg Ser
130 135 140
<210> 16
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SV40 DNA nuclear targeting sequence
<400> 16
ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 60
agtcagcaac ca 72
<210> 17
<211> 28
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> C3d (derived from P01027.3)
<400> 17
Lys Phe Leu Asn Thr Ala Lys Asp Arg Asn Arg Trp Glu Glu Pro Asp
1 5 10 15
Gln Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala
20 25
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> 3C3d (P01027.3)
<400> 18
Lys Phe Leu Asn Thr Ala Lys Asp Arg Asn Arg Trp Glu Glu Pro Asp
1 5 10 15
Gln Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Lys Phe Leu Asn Thr Ala
35 40 45
Lys Asp Arg Asn Arg Trp Glu Glu Pro Asp Gln Gln Leu Tyr Asn Val
50 55 60
Glu Ala Thr Ser Tyr Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ser Gly Ser Lys Phe Leu Asn Thr Ala Lys Asp Arg Asn Arg Trp
85 90 95
Glu Glu Pro Asp Gln Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala
100 105 110
<210> 19
<211> 9284
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pVAX10-SCV-53
<400> 19
tgggcttttg ctggcctttt gctcacatgt tcttgactct tcgcgatgta cgggccagat 60
atacgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 120
ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 180
gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 240
caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggactattt acggtaaact gcccacttgg 300
cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 360
ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 420
tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 480
gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 540
gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 600
tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctctctggc 660
taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa tacgactcac tatagggaga 720
cccaagctgg ctagcgccgc caccatggat gaccagcgcg atctgattag caaccatgaa 780
cagctgccaa ttctgggcaa ccgcccacgc gaacccgaac gctgcagccg cagccagtgc 840
gtgaacctga ccacccgcac ccagctgcca cccgcttata ccaacagctt tacccgcggc 900
gtgtactatc ctgataaagt gtttcgcagc tcagtcctgc atagcaccca ggatctgttt 960
ctgccttttt ttagcaacgt gacctggttt catgcaattc atgtgagcgg caccaacggc 1020
actaaacgct ttgataaccc agtgctgcca ttcaacgatg gcgtgtattt tgccagcacc 1080
gaaaaatcaa acattattcg cggctggatt tttggcacca ccctggatag caaaacccag 1140
agcctgctga ttgtgaacaa cgcaaccaac gtggtgatca aagtgtgcga atttcagttt 1200
tgcaacgatc cctttctggg cgtgtactat cacaaaaaca acaaaagctg gatggaaagc 1260
gaatttcgcg tgtatagcag cgcaaacaac tgcacctttg agtatgtgtc ccagccattt 1320
ctgatggacc tggaaggcaa gcaaggaaac tttaaaaacc tgcgcgaatt tgtgtttaaa 1380
aacattgatg gctattttaa aatttattcc aaacataccc ccattaacct ggtgcgcgat 1440
ctgccccaag gctttagcgc cctggaacct ctggtggatc tgcctattgg tattaacatt 1500
acccgctttc agaccctgct ggctctgcat cgcagctatc tgacccctgg cgatagcagc 1560
agcggctgga ccgccggcgc agcagcttat tatgtgggct atctgcaacc ccgcaccttt 1620
ctgctgaaat acaacgaaaa cggcaccatt accgatgccg tggattgcgc actggatccc 1680
ctgagcgaaa ccaaatgcac cctgaaaagc tttaccgtgg agaaaggcat ttatcagacc 1740
tccaactttc gcgtgcagcc caccgaaagc attgtgcgct ttcctaacat taccaacctg 1800
tgcccttttg gcgaagtgtt taacgcaacc cgctttgcca gcgtgtatgc ttggaaccgc 1860
aaacgcatta gcaactgcgt ggctgattac agcgtgctgt ataacagcgc cagctttagc 1920
acctttaaat gctatggcgt gagcccaacc aagctgaacg atctgtgctt caccaacgtg 1980
tatgcagata gttttgtgat tcgcggcgat gaagtgcgcc agattgctcc tggccagacc 2040
ggtaaaattg ctgattataa ctataaactg ccagatgatt ttaccggctg cgtgattgca 2100
tggaacagca acaacctgga tagcaaagtg ggcggtaact ataactatct gtatcgcctg 2160
tttcgcaaaa gcaacctgaa accttttgaa cgcgatatta gcaccgaaat ttatcaggca 2220
ggtagcaccc catgcaacgg cgtggaaggc tttaactgct attttcctct gcagagctat 2280
ggctttcaac caaccaacgg ggtgggctat caaccatatc gcgtggtggt gctgtctttt 2340
gaactgctgc atgctccagc taccgtgtgc ggccccaaaa aaagcaccaa cctggtgaaa 2400
aacaaatgcg tgaactttaa ctttaacggc ctgacaggca ccggcgtgct gaccgaatca 2460
aacaaaaaat tcctgccctt tcagcagttt ggccgcgata ttgctgatac aaccgatgca 2520
gtgcgcgatc ctcagaccct ggaaattctg gatattaccc cctgcagctt tggcggcgtg 2580
agcgtgataa cccctggcac caacaccagc aaccaggtgg ctgtgctgta tcagggcgtg 2640
aactgcaccg aagtgcccgt ggccattcat gctgatcaac tgacccccac ctggcgagtg 2700
tatagcacag gcagcaacgt gtttcagacc cgcgccggct gcctgattgg cgccgaacat 2760
gtgaacaaca gctatgagtg cgatattcct attggcgctg gcatttgcgc aagctatcag 2820
acccagacca acgcccgcag cgtggccagc cagagcatta ttgcctatac catgagcctg 2880
ggcgcagaaa acagcgtggc ttatagcaac aacagcattg ctataccaac caacttcacc 2940
attagcgtga ccaccgaaat tctgcccgtg agcatgacca aaaccagcgt ggactgcact 3000
atgtatattt gcggcgatag caccgaatgc agcaacctgc tgctgcagta tggcagcttt 3060
tgcacccagc tgaaccgcgc cctgactggc attgcagtgg aacaggataa aaacacccaa 3120
gaagtgtttg cccaggtgaa acagatttac aaaacccccc ctattaaaga ttttggcggc 3180
ttcaacttta gccagatact gccagatcct agcaaaccta gcaaacgcag ctttatcgaa 3240
gatctgctgt ttaacaaagt gaccctggct gatgctggct ttattaaaca gtatggtgat 3300
tgcctgggcg atattgccgc ccgcgatctg atttgcgctc agaaatttaa cggcctgacc 3360
gtgctgcccc ctctgctgac cgatgaaatg attgcacaat acaccagtgc tctgctggct 3420
ggaaccatta cctcaggctg gacttttggc gcaggtgccg ccctgcagat tccatttgcc 3480
atgcagatgg cctatcgctt taacggcatt ggcgtgaccc agaacgtgct gtatgaaaac 3540
cagaaactga ttgccaacca gtttaacagc gctattggca aaatccagga tagcctgagc 3600
agcaccgcca gcgcactggg caaactgcag gatgtggtga accagaacgc tcaggcactg 3660
aacaccctgg tgaaacagct gagcagcaac tttggcgcca ttagcagcgt gctgaacgat 3720
attctgagcc gcctggaccc tccagaagct gaagtgcaga ttgatcgcct gattacaggc 3780
cgcctgcaga gcctgcagac ttatgtgacc cagcagctga ttcgcgccgc tgaaatccgc 3840
gcaagcgcaa acctggctgc caccaaaatg agcgaatgcg tgctgggcca gagcaaaagg 3900
gtggattttt gtggcaaagg ctatcacctg atgagctttc cccagagcgc tccacatggc 3960
gtggtgtttc tgcacgtgac ctatgtgccc gctcaggaaa aaaactttac cacagcccca 4020
gcaatttgcc atgatggcaa agctcatttt ccccgcgaag gcgtgtttgt gagcaacggc 4080
acccattggt ttgtgaccca gcgcaacttt tatgaacctc agattattac caccgataac 4140
acctttgtga gcggcaactg cgatgtggtg attggcattg tgaacaacac cgtgtatgat 4200
cccctgcagc ccgaactgga tagctttaaa gaagagctgg ataaatattt caaaaaccat 4260
accagccccg atgtggacct gggcgatatt agcggcatta acgccagcgt ggtgaacatt 4320
cagaaagaaa ttgatcgcct gaacgaagtg gctaaaaacc tgaacgaaag cctgattgat 4380
ctgcaagaac tggggaaata tgaacagtat attaaatggc cctggtatat ttggctgggc 4440
tttattgctg gcctgattgc cattgtgatg gtgaccatta tgctgtgctg catgaccagc 4500
tgctgtagct gcctgaaagg gtgctgcagc tgcggcagct gctgcaaatt tgacgaagat 4560
gatagcgaac ctgtgctgaa aggcgtcaaa ctgcattata ccggcagcgg cgaaggaagg 4620
gggagcctgc tgacctgtgg cgatgtggaa gagaaccctg gcccactgat gcagattttt 4680
gtgaaaaccc tgacaggcaa gaccatcacc ctggaagtgg aacctagcga taccattgaa 4740
aacgtgaagg caaaaatcca ggataaagaa gggattcctc cagaccaaca gcgcctgatt 4800
tttgccggca aacaactgga agatggccgc acgctgagcg attataacat tcagaaggaa 4860
agcaccctgc atctggtgct gcgcctgcgc ggcgtgatga gcgataacgg ccctcagaac 4920
cagcgcaacg caccacgcat tacctttggc ggtccatcag atagcactgg cagcaaccag 4980
aacggcgaac gcagcggagc ccgcagcaaa caacgccgcc cacagggcct gcctaacaac 5040
accgcaagct ggtttaccgc cctgacccag cacggcaaag aagatctgaa atttccccgc 5100
ggccagggcg tgccaattaa caccaacagc agcccagatg atcagattgg ctattatcgc 5160
agggccaccc gccgcattcg cggaggcgat ggcaaaatga aagatctgag cccacgctgg 5220
tacttttatt atctgggaac cggccccgaa gccggtcttc catatggcgc caacaaagat 5280
ggcatcattt gggtggcaac cgaaggagct ctgaacaccc caaaagatca tattggcacc 5340
cgcaaccccg caaacaacgc tgcaattgtg ctgcagcttc ctcagggcac caccctgcca 5400
aaaggctttt atgccgaagg cagccgcggc ggcagccagg caagctctag gagcagcagc 5460
cgcagccgca acagcagccg gaacagcacc cctggaagca gcaggggcac cagcccagcc 5520
aggatggcag gtaacggcgg cgatgctgcc ctggctctgc tgctgctgga tcgcctgaac 5580
cagctggaaa gcaaaatgag cggcaaaggc cagcagcagc agggccagac cgtgaccaag 5640
aaaagcgcag ccgaagccag caaaaaacca cgccagaaaa gaaccgccac caaagcctat 5700
aacgtgacgc aggcttttgg ccgccgtggc cccgaacaaa cccagggcaa ctttggcgat 5760
caggaactga ttcgccaggg caccgattat aaacattggc cacagattgc ccagtttgct 5820
cctagcgcca gcgctttttt tggtatgagc cgcattggca tggaagtgac cccctctggc 5880
acctggctga cctataccgg cgctattaaa ctggatgata aagatccaaa ctttaaagac 5940
caggtgattc tgctgaacaa acatattgat gcctataaaa cctttccccc aaccgaaccc 6000
aaaaaagata aaaagaaaaa agccgatgaa acccaggccc tgccacagcg ccagaaaaaa 6060
cagcaaaccg tgaccctgct gcctgcagcc gatctggatg atttcagcaa acagctgcaa 6120
cagagcatga gcagcgcaga tagcacgcag gcttaactcg agtctagagg gcccgtttaa 6180
acccgctgat cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc 6240
cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag 6300
gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag 6360
gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct 6420
atggcttcta ctgggcggtt ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc 6480
cctctggtaa ggttgggaag ccctgcaaag ttaacaaatg agctgattta acaaaaattt 6540
aacgcgaatt aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc 6600
cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt 6660
ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca 6720
tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc 6780
cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tctgcctctg 6840
agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagctcc 6900
cgggagcttg tatatccatt ttcggatctg atcaagagac aggatgagga tcgtttcgca 6960
tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg 7020
gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag 7080
cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc 7140
aagacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc 7200
tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg 7260
atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc 7320
ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca 7380
tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag 7440
agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgagc atgcccgacg 7500
gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg 7560
gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca 7620
tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc 7680
tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg 7740
acgagttctt ctgaattatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt ctccttacgc 7800
atctgtgcgg tatttcacac cgcatacagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac 7860
ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc 7920
ctgataaatg cttcaataat agcacgtgct aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 7980
ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 8040
ctgagcgtca gacccccatc agtgaccaaa caggaaaaaa ccgcccttaa catggcccgc 8100
tttatcagaa gccagacatt aacgcttctg gagaaactca acgagctgga cgcggatgaa 8160
caggcagaca tctgtgaatc gcttcacgac cacgctgatg agctttaccg cagctgcctc 8220
gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca 8280
gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt 8340
ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc 8400
ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac 8460
cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 8520
actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 8580
tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 8640
aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 8700
ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 8760
aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 8820
cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 8880
cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 8940
aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 9000
cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 9060
ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 9120
ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttgtta 9180
gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 9240
agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatc 9284
<210> 20
<211> 281
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SV40 ori enhancer sequence
<400> 20
tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 60
tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa 120
gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca 180
tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt 240
ttatttatgc agaggccgag gccgcctctg cctctgagct a 281
Claims (17)
- 적어도 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 포함하는 DNA 분자를 포함하는 살모넬라 티피 (Salmonella typhi) Ty21a 균주를 포함하는 DNA 백신.
- 제1항에 있어서, 상기 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부가
(a) SARS-CoV-2 전장 S 단백질;
(b) SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인;
(c) SARS-CoV-2 S 단백질 서브유닛 S1;
(d) SARS-CoV-2 S 단백질 수용체 결합 도메인 (RBD); 또는
(e) SARS-CoV-2 S 단백질의 면역-우세 에피토프 적어도 3개
를 포함하는, DNA 백신. - 제2항에 있어서, 상기 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질이 SARS-CoV-2 전장 S 단백질이며, 선택적으로 SARS-CoV-2 전장 S 단백질이 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과의 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 포함하는, DNA 백신.
- 제2항에 있어서, 상기 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부가 SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인을 포함하고, 선택적으로 상기 SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인이 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들과 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 포함하는, DNA 백신.
- 제2항에 있어서, 상기 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부가 SARS-CoV-2 S 단백질 서브유닛 S1을 포함하고, 선택적으로 상기 SARS-CoV-2 단백질 서브유닛 S1이 서열번호 1의 1-681번 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 1-681번 아미노산 잔기들과 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 포함하는, DNA 백신.
- 제2항에 있어서, 상기 COVID-19 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 일부가 SARS-CoV-2 S 단백질 수용체 결합 도메인 (RBD)을 포함하고, 선택적으로 상기 SARS-CoV-2 단백질 RBD가 서열번호 1의 319-541번 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 319-541번 아미노산 잔기들과 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 포함하는, DNA 백신.
- 제2항에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부가, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 K986 및 V987 아미노산 위치에 대응되는 프롤린으로의 안정화 돌연변이 2개를 포함하는, SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인 또는 SARS-CoV-2 전장 S 단백질의 융합 전-안정화된 형태이고; 바람직하게는, 상기 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 일부가
(a) 안정화 돌연변이 2종 K986P 및 V987P를 포함하는, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1과의 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열; 또는
(b) 안정화 돌연변이 2종 K986P 및 V987P를 포함하는, 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 1-1208번 아미노산 잔기들과 서열 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열을 포함하는, DNA 백신. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진핵생물 발현 카세트가 다른 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 일부를 추가로 코딩하는, DNA 백신.
- 제8항에 있어서, 상기 다른 SARS-CoV-2 단백질이 SARS-CoV-2 N 단백질인, DNA 백신.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함하는, DNA 백신.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신이 경구 투약 형태인, DNA 백신.
- 제11항에 있어서, 상기 경구 투약 형태가 장용 코팅 캡슐제, 동결건조된 분말 또는 현탁제인, DNA 백신.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 보강제를 더 포함하는, DNA 백신.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 코로나바이러스 질환 2019 (COVID-19) 또는 SARS-CoV-2 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한 것인, DNA 백신.
- 제14항에 있어서, 상기 DNA 백신은 경구 투여되는, DNA 백신.
- 제14항 또는 제15항에 있어서,
(a) DNA 백신의 단일 용량이 살모넬라 티피 Ty21a 균주를 약 106 내지 약 109 콜로니 형성 단위 (CFU)로 포함하거나, 및/또는
(b) DNA 백신은 감작화를 위해 1주간 2-4회로 투여하고, 선택적으로 이후에 단일 용량 부스팅을 1회 이상으로 투여하고자 하는 것인, DNA 백신. - 제16항에 있어서, 상기 DNA 백신은 첫주에 2-4회 투여한 다음 각각 적어도 2주 후 단일 용량 부스팅을 1회 이상으로 투여하기 위한 것인, DNA 백신.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP20167405 | 2020-03-31 | ||
EP20167405.8 | 2020-03-31 | ||
PCT/EP2021/058513 WO2021198376A1 (en) | 2020-03-31 | 2021-03-31 | Novel salmonella-based coronavirus vaccine |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20220161444A true KR20220161444A (ko) | 2022-12-06 |
Family
ID=70110247
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020227037910A KR20220161444A (ko) | 2020-03-31 | 2021-03-31 | 새로운 살모넬라-기반의 코로나바이러스 백신 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20230137174A1 (ko) |
EP (1) | EP4126022A1 (ko) |
JP (1) | JP2023519562A (ko) |
KR (1) | KR20220161444A (ko) |
CN (1) | CN115715198A (ko) |
AU (1) | AU2021250442A1 (ko) |
CA (1) | CA3170674A1 (ko) |
WO (1) | WO2021198376A1 (ko) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20220047697A1 (en) * | 2020-08-14 | 2022-02-17 | Julius-Maximilians-Universität Würzburg | Salmonella vaccine for the treatment of coronavirus |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060240515A1 (en) * | 2003-07-21 | 2006-10-26 | Dimitrov Dimiter S | Soluble fragments of the SARS-CoV spike glycoprotein |
SG11201403525PA (en) | 2011-12-22 | 2014-10-30 | Vaximm Ag | Method for producing high yield attenuated salmonella strains |
WO2020237246A1 (en) * | 2019-05-23 | 2020-11-26 | University Of Maryland, Baltimore | Live attenuated non-transmissible vaccines |
US10973908B1 (en) * | 2020-05-14 | 2021-04-13 | David Gordon Bermudes | Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine |
-
2021
- 2021-03-31 CN CN202180024934.7A patent/CN115715198A/zh active Pending
- 2021-03-31 CA CA3170674A patent/CA3170674A1/en active Pending
- 2021-03-31 JP JP2022556158A patent/JP2023519562A/ja active Pending
- 2021-03-31 WO PCT/EP2021/058513 patent/WO2021198376A1/en unknown
- 2021-03-31 KR KR1020227037910A patent/KR20220161444A/ko unknown
- 2021-03-31 US US17/907,619 patent/US20230137174A1/en active Pending
- 2021-03-31 EP EP21714916.0A patent/EP4126022A1/en active Pending
- 2021-03-31 AU AU2021250442A patent/AU2021250442A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP4126022A1 (en) | 2023-02-08 |
AU2021250442A1 (en) | 2022-11-10 |
WO2021198376A1 (en) | 2021-10-07 |
US20230137174A1 (en) | 2023-05-04 |
CA3170674A1 (en) | 2021-10-07 |
JP2023519562A (ja) | 2023-05-11 |
CN115715198A (zh) | 2023-02-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5123343B2 (ja) | Hivcon:hiv免疫原及びその使用 | |
KR102090612B1 (ko) | 췌장암 환자용 dna 백신 | |
US11571471B2 (en) | Recombinant modified vaccinia virus ankara (MVA) equine encephalitis virus vaccine | |
KR20230025670A (ko) | Sars-cov-2 백신 | |
KR20170048396A (ko) | 재조합 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (mva) 필로바이러스 백신 | |
US20220125919A1 (en) | Alphavirus neoantigen vectors and interferon inhibitors | |
US20220265812A1 (en) | Hiv antigens and mhc complexes | |
CA2890061A1 (en) | Conditional replicating viral vectors | |
US20210213122A1 (en) | Immune checkpoint inhibitor co-expression vectors | |
US20230158133A1 (en) | Wt1 targeting dna vaccine for combination therapy | |
KR20220161444A (ko) | 새로운 살모넬라-기반의 코로나바이러스 백신 | |
KR20190125481A (ko) | 암의 면역요법을 위한 신규 pd-l1 표적화 dna 백신 | |
US20180153976A1 (en) | Novel cmv pp65 targeting dna vaccine for cancer immunotherapy | |
US20210213121A1 (en) | Neoantigen targeting dna vaccine for combination therapy | |
KR20190117603A (ko) | 신규 vegfr-2 표적화 면역요법상 접근법 | |
WO2017024084A1 (en) | Immunogenic compositions, antigen screening methods, and methods of generating immune responses | |
US20240181041A1 (en) | Adenovirus SARS-CoV-2 Vaccine | |
US20240075129A1 (en) | Anti COVID-19 Therapies targeting nucleocapsid and spike proteins | |
KR20220128638A (ko) | 항생제와 조합되는 살모넬라-기반의 dna 백신 | |
IL295546A (en) | Neoantigens expressed in ovarian cancer and their uses | |
Steele | Processing and presentation of a Chlamydia trachomatis antigen to CD8+ T cells | |
EA039715B1 (ru) | Филовирусная вакцина на основе рекомбинантного модифицированного вируса осповакцины анкара (mva) |