KR20190063468A - 변형된 줄기세포 기억 t 세포, 이의 제조 방법 및 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 예를 들어 입양 세포 요법으로서, 대상체에게 투여하기 위한 변형된 줄기 기억 T 세포(예를 들어, CAR-T 세포)를 생산하는 방법을 제공한다.
Description
관련 출원
본 출원은 가출원 2016년 9월 30일 출원된 USSN 62/402,707호, 2017년 5월 5일 출원된 USSN 62/502,508호, 2017년 8월 31일 출원된 USSN 62/553,058호 및 2017년 9월 8일 출원된 USSN 62/556,309호의 이익을 청구하며, 이들 각각의 내용은 본원에 그 전문으로 참고로 포함된다.
서열 목록의 포함
"POTH-012_001WO_SeqList.txt"로 명명된 텍스트 파일은 2017년 10월 2일에 생성되었으며 크기가 110KB이며 그 내용은 이로써 그 전문으로 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 분자 생물학, 보다 구체적으로는 변형된 줄기세포 기억 T 세포의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
예를 들어, 입양 세포 요법(adoptive cell therapy)으로서 대상체에게 투여하기 위한 변형된 줄기세포 기억 T 세포의 제조 방법에 대해 당 업계에서 오랫동안 요구를 느껴왔지만 충족되지 않았다. 본 발명은 오랫동안 느껴왔지만 충족되지 않은 요구에 대한 해결책을 제공한다.
발명의 요약
종래의 생물학 제제 및 화학 치료법과 달리, 본 발명의 변형된 T 세포는 항원 인식시 신속하게 재생할 수 있는 능력을 가짐으로써, 잠재적으로 반복 치료의 필요성을 없앨 수 있다. 이를 달성하기 위해, 본 발명의 변형된 T 세포는 초기에 종양 파괴를 유발할 뿐만 아니라 잠재적인 암 재발을 예방하기 위해 생존 가능한 기억 T 세포의 안정한 집단으로서 환자에서 존속되어야 한다. 따라서, 초기 기억 세포, 특히 줄기세포 기억(stem cell memory)(TSCM)을 함유하는 변형된 T 세포 산물뿐만 아니라 항원 비의존적(토닉(tonic)) 신호전달을 통해 T 세포 고갈을 일으키지 않는 항원 수용체 분자의 개발에 집중적으로 노력해왔다. 본 발명의 줄기세포 유사 변형된 T 세포는 최대한의 자가 재생 능력 및 중심 기억(central memory)(TCM), 이펙터 기억(effector memory)(TEM) 및 이펙터 T 세포(TE)를 유도하는 다능성 능력을 나타냄으로써 더 우수한 종양 제거 및 장기적인 CAR-T 생착(engraftment)을 가져온다. 본 발명의 변형된 T 세포는 본 발명의 단백질 스캐폴드를 포함하는 항원 수용체를 발현하는 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 변형된 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR: chimeric antigen receptor)를 발현하는 세포(즉, 본 발명의 CAR-T 세포)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 키메라 항원 수용체(CAR)는 각각이 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있으며, 이는 단쇄 항체(예를 들어, scFv), 항체의 하나 이상의 단편을 포함하는 서열(예를 들어, VHH, CAR과 관련하여 VCAR로서 지칭됨), 항체 모방체 및 Centyrin(CAR와 관련하여 CARTyrin으로 지칭됨)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 변형된 세포는 추가로 게놈 편집을 거칠 수 있다. 예를 들어, 게놈 편집 구조물은 트랜스포존 또는 다른 전달 수단으로 전기 천공 또는 뉴클레오펙션(nucleofection)을 통해 본 발명의 변형된 세포로 도입될 수 있으며, 뒤따른 인큐베이션 단계 중에 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 결과로 생성된 세포는 줄기 유사 표현형을 보유하는 편집된 게놈을 가진 변형된 T 세포이다. 줄기 유사 표현형을 보유하는 편집된 게놈을 가진 이 변형된 T 세포는 세포 요법으로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 본 발명의 변형된 세포는 1차 전기 천공 또는 뉴클레오펙션 및 후속 전기 천공 또는 뉴클레오펙션을 거쳐 게놈 편집 구조물을 도입할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체 또는 치료 단백질을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 트랜스포존 조성물 및 (b) 트랜스포사제 또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포사제 조성물을 1차 인간 T 세포에 도입하여 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 변형된 T 세포가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체 또는 치료 단백질을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 트랜스포존 조성물 및 (b) 트랜스포사제 또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포사제 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 25%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 50%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 60%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 75%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 80%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 85%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 90%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 95%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 세포 표면 마커는 CD62L 및 CD45RA를 포함한다. 특정 실시양태에서, CAR-TSCM의 세포 표면 마커는 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, CAR-TSCM의 세포 표면 마커는 CD45RA, CD95, IL-2Rβ, CR7, 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 2개의 시스 조절 격리 인자(insulator) 요소가 측면에 위치한 항원 수용체 또는 치료 단백질을 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 피기백(piggyBac) 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포존이 피기백 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 피기백TM 또는 슈퍼 피기백TM(SPB: Super piggyBac) 트랜스포사제이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 2개의 시스 조절 격리 인자 요소가 측면에 위치한 항원 수용체 또는 치료 단백질을 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 피기백 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포존이 피기백 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 피기백TM 또는 슈퍼 피기백TM(SPB) 트랜스포사제이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포사제가 슈퍼 피기백TM(SPB) 트랜스포사제인 실시양태에서, 트랜스포사제를 코딩하는 서열은 mRNA 서열이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 피기백™(PB) 트랜스포사제 효소이다. 피기백(PB) 트랜스포사제 효소는 하기와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 하기 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다:
특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4의 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 2개 이상에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4의 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 3개 이상에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4의 서열의 하기 위치 30, 165, 282, 및 538 각각에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4의 서열의 위치 30에서 아미노산 치환은 이소류신(I)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4의 서열의 위치 165에서 아미노산 치환은 글리신(G)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4의 서열의 위치 282에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4의 서열의 위치 538에서 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에서 리신(K)으로의 치환이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제 효소는 위치 30에서 아미노산 치환이 이소류신(I)에서 발린(V)으로의 치환이고, 위치 165에서 아미노산 치환이 글리신(G)에서 세린(S)으로의 치환이고, 위치 282에서 아미노산 치환이 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이고, 위치 538에서 아미노산 치환이 아스파라긴(N)에서 리신(K)으로의 치환인 서열 번호 4의 서열의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제 효소는 하기와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:
트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 서열의 위치 3, 46, 82, 103, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 258, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 486, 503, 552, 570 및 591 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 위치 46, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 485, 503, 552 및 570 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 3에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 아스파라긴(N)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 46에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 46에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 트레오닌(T)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 82에서 아미노산 치환은 이소류신(I)에서 트립토판(W)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 103에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 119에서 아미노산 치환은 아르기닌(R)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 125에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 125에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 177에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 177에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 히스티딘(H)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 180에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 180에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 180에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 185에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 187에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 200에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 트립토판(W)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 207에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 209에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 226에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 235에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 아르기닌(R)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 240에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 241에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 243에서 아미노산 치환은 프롤린(P)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 258에서 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 296에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 트립토판(W)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 296에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 티로신(Y)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 296에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 298에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 298에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 298에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 311에서 아미노산 치환은 프롤린(P)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 311에서 아미노산 치환은 프롤린(P)에서 발린으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 315에서 아미노산 치환은 아르기닌(R)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 319에서 아미노산 치환은 트레오닌(T)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 327에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 아르기닌(R)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 328에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 340에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 340에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 421에서 아미노산 치환은 아스파르트산(D)에서 히스티딘(H)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 436에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 456에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 티로신(Y)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 470에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 485에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 503에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 503에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 552에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 570에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 트레오닌(T)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 591에서 아미노산 치환은 글루타민(Q)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 591에서 아미노산 치환은 글루타민(Q)에서 아르기닌(R)으로의 치환이다.
트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 2, 3, 4, 5, 6개 이상에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 2, 3, 4, 5, 6개 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 103에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 194에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 372에서 아미노산 치환은 아르기닌(R)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 375에서 아미노산 치환은 리신(K)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 450에서 아미노산 치환은 아스파르트산(D)에서 아스파라긴(N)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 509에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 570에서 치환은 아스파라긴(N)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환을 포함할 수 있다. 피기백™ 트랜스포사제 효소가 서열 번호 4의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환을 포함하는 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 서열의 위치 372, 375 및 450에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환, 서열 번호 4의 위치 372에서 아르기닌(R)에서 알라닌(A)으로의 치환, 및 서열 번호 4의 위치 375에서 리신(K)에서 알라닌(A)으로의 치환을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환, 서열 번호 4의 위치 372에서 아르기닌(R)에서 알라닌(A)으로의 치환, 서열 번호 4의 위치 375에서 리신(K)에서 알라닌(A)으로의 치환 및 서열 번호 4의 위치 450에서 아스파르트산(D)에서 아스파라긴(N)으로의 치환을 포함할 수 있다.
본 발명은 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체 또는 치료 단백질을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 트랜스포존 조성물 및 (b) 트랜스포사제 또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포사제 조성물을 1차 인간 T 세포에 도입하여 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 변형된 T 세포가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체 또는 치료 단백질을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 트랜스포존 조성물 및 (b) 트랜스포사제 또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포사제 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 25%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 50%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 60%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 75%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 80%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 85%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 90%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 95%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 세포 표면 마커는 CD62L 및 CD45RA를 포함한다. 특정 실시양태에서, CAR-TSCM의 세포 표면 마커는 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, CAR-TSCM의 세포 표면 마커는 CD45RA, CD95, IL-2Rβ, CR7, 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포존이 슬리핑 뷰티 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 또는 과활성 슬리핑 뷰티 트랜스포사제(SB100X)이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 효소는 하기와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 과활성 슬리핑 뷰티(SB100X) 트랜스포사제 효소는 하기와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
본 발명은 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체 또는 치료 단백질을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 트랜스포존 조성물 및 (b) 트랜스포사제 또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포사제 조성물을 1차 인간 T 세포에 도입하여 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 변형된 T 세포가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 트랜스포존을 포함하는 트랜스포존 조성물 및 (b) 트랜스포사제 또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포사제 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 25%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 50%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 60%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 75%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 80%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 85%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 90%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 95%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 세포 표면 마커는 CD62L 및 CD45RA를 포함한다. 특정 실시양태에서, CAR-TSCM의 세포 표면 마커는 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, CAR-TSCM의 세포 표면 마커는 CD45RA, CD95, IL-2Rβ, CR7, 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 헬레이저(Helraiser) 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포존이 헬레이저 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 헬리트론(Helitron) 트랜스포사제이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제는 헬리트론 트랜스포사제이다. 헬리트론 트랜스포사제는 300 내지 360만 년 전에 활성이 있던 박쥐 게놈의 고대 요소인 헬레이저 트랜스포존을 동원한다. 본 발명의 예시적인 헬레이저 트랜스포존은 Helibat1을 포함하며, 이는 하기를 포함하는 핵산 서열을 포함한다:
다른 트랜스포사제와 달리, 헬리트론 트랜스포사제는 RN아제 H 유사 촉매 도메인을 함유하지 않지만, 대신에 복제 개시 도메인(Rep) 및 DNA 헬리카제 도메인으로 구성된 RepHel 모티프를 포함한다. Rep 도메인은 HUH 슈퍼 패밀리 뉴클레아제의 뉴클레아제 도메인이다.
본 발명의 예시적인 헬리트론 트랜스포사제는 하기를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다:
헬리트론 전위(transposition)에서, 트랜스포존의 3 '말단에 가까운 헤어핀은 종결 인자로서 기능을 한다. 그러나 이 헤어핀은 트랜스포스포사제에 의해 우회되어, 측면 서열의 형질도입을 초래할 수 있다. 또한, 헬레이저 전위는 공유적으로 폐쇄된 원형의 중간체를 생성한다. 또한, 헬리트론 전위는 표적 부위 중복(duplication)이 없을 수 있다. 헬레이저 서열에서, 트랜스포사제는 LTS 및 RTS라고 명명된 좌측 및 우측 말단 서열이 측면에 위치한다. 이들 서열은 보존된 5'-TC/CTAG-3' 모티프로 종결된다. 헤어핀 종결 구조를 형성할 잠재력을 가진 19 bp 회문 염기 서열은 RTS의 11개 뉴클레오티드 상류에 위치하며, 서열 (서열 번호 29)로 이루어진다.
본 발명은 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체 또는 치료 단백질을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 트랜스포존 조성물 및 (b) 트랜스포사제 또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포사제 조성물을 1차 인간 T 세포에 도입하여 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 변형된 T 세포가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 트랜스포존을 포함하는 트랜스포존 조성물 및 (b) 트랜스포사제 또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포사제 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 25%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 50%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 60%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 75%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 80%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 85%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 90%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 95%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 세포 표면 마커는 CD62L 및 CD45RA를 포함한다. 특정 실시양태에서, CAR-TSCM의 세포 표면 마커는 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, CAR-TSCM의 세포 표면 마커는 CD45RA, CD95, IL-2Rβ, CR7, 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 Tol2 트랜스포존이다. 트랜스포존이 Tol2 트랜스포존인 특정 실시양태에서, 트랜스포사제는 Tol2 트랜스포사제이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제는 Tol2 트랜스포사제이다. Tol2 트랜스포존은 메다카 어류의 게놈으로부터 단리 또는 유래될 수 있으며, hAT 패밀리의 트랜스포존과 유사할 수 있다. 본 발명의 예시적인 Tol2 트랜스포존은 약 4.7 킬로베이스를 포함하는 서열에 의해 코딩되고, 4개의 엑손을 함유하는 Tol2 트랜스포사제 코딩 유전자를 함유한다. 본 발명의 예시적인 Tol2 트랜스포사제는 하기를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다:
역전된 반복 서열, 말단 가까운(subterminal) 서열 및 Tol2 트랜스포사제를 포함하는 본 발명의 예시적인 Tol2 트랜스포존은 하기를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다:
본 발명은 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체 또는 치료 단백질을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 트랜스포존 조성물 및 (b) 트랜스포사제 또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포사제 조성물을 1차 인간 T 세포에 도입하여 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 변형된 T 세포가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 트랜스포존을 포함하는 트랜스포존 조성물 및 (b) 트랜스포사제 또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포사제 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 25%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 50%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 60%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 75%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 80%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 85%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 90%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 95%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 세포 표면 마커는 CD45RO, CD95, IL-2Rβ, CCR7, 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 2개의 시스 조절 격리 인자 요소가 측면에 위치한 항원 수용체 또는 치료 단백질을 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 피기백 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포존이 피기백 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 피기백TM 또는 슈퍼 피기백TM(SPB) 트랜스포사제이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 슬리핑 뷰티 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포존이 슬리핑 뷰티 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 또는 과활성 슬리핑 뷰티 트랜스포사제(SB100X)이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 헬레이저 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포존이 헬레이저 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 헬리트론 트랜스포사제이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 Tol2 트랜스포존이다. 트랜스포존이 Tol2 트랜스포존인 특정 실시양태에서, 트랜스포사제는 Tol2 트랜스포사제이다.
본 발명은 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM) 및 다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 포함하는 조성물을 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체 또는 치료 단백질을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 트랜스포존 조성물 및 (b) 트랜스포사제 또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포사제 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 변형된 TSCM 및 다수의 변형된 TCM을 포함하는 조성물을 생산하며, 상기 다수의 변형된 TSCM이 하나 이상의 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2Rβ를 발현하고 상기 다수의 변형된 TCM이 하나 이상의 CD45RO, CD95, IL-2Rβ, CCR7, 및 CD62L을 발현하는 함으로써 다수의 변형된 TSCM 및 다수의 변형된 TCM을 포함하는 조성물을 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 1%, 2%, 5%, 7%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트의 세포를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 1%, 2%, 5%, 7%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트의 세포를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 10%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 90%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 90%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 10%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 20%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 80%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 80%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 20%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 30%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 70%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 70%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 30%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 40%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 60%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 60%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 40%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 50%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 50%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 2개의 시스 조절 격리 인자가 측면에 위치한 항원 수용체 또는 치료 단백질을 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 피기백 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포존이 피기백 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 피기백TM 또는 슈퍼 피기백TM(SPB) 트랜스포사제이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 슬리핑 뷰티 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포존이 슬리핑 뷰티 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 또는 과활성 슬리핑 뷰티 트랜스포사제(SB100X)이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 헬레이저 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포존이 헬레이저 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 헬리트론 트랜스포사제이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 Tol2 트랜스포존이다. 트랜스포존이 Tol2 트랜스포존인 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 트랜스포사제는 Tol2 트랜스포사제이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 임의의 종으로부터 유래 또는 재조합될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 트랜스포존은 합성적일 수 있다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 항원 수용체는 T 세포 수용체이다. 특정 실시양태에서, T 세포 수용체는 자연 발생적이다. 특정 실시양태에서, T 세포 수용체는 자연 발생적이지 않다. 특정 실시양태에서, 특히, T 세포 수용체가 자연 발생적이지 않은 실시양태에서, T 세포 수용체는 야생형 T 세포 수용체와 비교하여 하나 이상의 돌연변이(들)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 특히, T 세포 수용체가 자연 발생적이지 않은 실시양태에서, T 세포 수용체는 재조합 T 세포 수용체이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 특정 실시양태에서, CAR은 CARTyrin이다. 특정 실시양태에서, CAR은 하나 이상의 VHH 서열(들)을 포함한다. 특정 실시양태에서, CAR은 VCAR이다.
방법이 (a) 항원 수용체를 포함하는 트랜스포존을 포함하는 트랜스포존 조성물 및 (b) 트랜스포사제 또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포사제 조성물을 1차 인간 T 세포에 도입하는 단계를 포함하는 것인 실시양태를 포함하여 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 방법은 (c) 치료 단백질을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 제2 트랜스포존 조성물을 제1 인간 T 세포에 도입하여 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 변형된 T 세포가 치료 단백질을 발현할 수 있는 것인 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 치료 단백질은 분비 가능한 단백질이고, 방법은 치료 단백질을 분비할 수 있는 변형된 T 세포를 생산한다. 특정 실시양태에서, (b)의 트랜스포사제 조성물은 (a)의 트랜스포존 및 (c)의 트랜스포존을 전위시킨다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 (d) 트랜스포사제 또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 제2 트랜스포사제 조성물을 1차 인간 T 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 트랜스포사제 조성물은 (c)의 트랜스포존을 전위시킨다. 특정 실시양태에서, (b)의 트랜스포사제 조성물은 (a)의 트랜스포존을 전위시키고 (d)의 트랜스포사제 조성물은 (c)의 트랜스포존을 전위시킨다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 2개의 시스 조절 격리 인자가 측면에 위치한 항원 수용체 또는 치료 단백질을 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 피기백 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포존이 피기백 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 피기백TM 또는 슈퍼 피기백TM(SPB) 트랜스포사제이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 슬리핑 뷰티 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포존이 슬리핑 뷰티 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 또는 과활성 슬리핑 뷰티 트랜스포사제(SB100X)이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 헬레이저 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포존이 헬레이저 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 헬리트론 트랜스포사제이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 Tol2 트랜스포존이다. 트랜스포존이 Tol2 트랜스포존인 특정 실시양태에서, 트랜스포사제는 Tol2 트랜스포사제이다.
본 발명은 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 조성물을 1차 인간 T 세포에 도입하여 변형된 T 세포를 생산하며, 항원 수용체 또는 치료 단백질은 트랜스포존에 포함되지 않은 것인 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 변형된 T 세포를 접촉시켜 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 활성화된 변형된 T 세포가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 항원 수용체 또는 치료 단백질은 트랜스포존에 포함되지 않은 것인 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 다수의 변형된 T 세포를 접촉시켜 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 생산함으로써 다수의 활성화된 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 25%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 50%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 60%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 75%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 80%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 85%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 90%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 95%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 세포 표면 마커는 CD62L 및 CD45RA를 포함한다. 특정 실시양태에서, 활성화된 변형된 TSCM의 세포 표면 마커는 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 활성화된 변형된 TSCM의 세포 표면 마커는 CD45RA, CD95, IL-2Rβ, CR7, 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다.
변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 조성물을 1차 인간 T 세포에 도입하여 변형된 T 세포를 생산하며, 항원 수용체 또는 치료 단백질은 트랜스포존에 포함되지 않은 것인 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 변형된 T 세포를 접촉시켜 활성화된 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, (b)의 T 세포 활성화제 조성물은 항-인간 CD2 단일 특이적 사량체 항체 복합체를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 (c) 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브(Iscove)의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물과 활성화된 변형된 T 세포를 접촉시켜 다수의 증식된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 2%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트는 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 60%는 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트로 포함하는 조성물을 생산하기 위해 다수의 증식된 변형된 T 세포를 농축하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 적어도 60%로 포함하는 조성물을 생산하기 위해 다수의 증식된 변형된 T 세포를 농축하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 농축 단계는 다수의 농축된 변형된 T 세포로부터 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 단리하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 농축 단계는 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물을 단리된 변형된 TSCM과 접촉시켜 다수의 증식된 농축된 변형된 TSCM을 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 니코틴아미드, 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD), 디이소프로필 아디페이트(DIPA), n-부틸-벤젠술폰아미드, 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필) 에스테르, 팔미트산, 리놀레산, 올레산, 스테아르산 히드라지드, 올레아미드, 스테롤 및 알칸 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산 및 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 0.9 mg/kg 내지 90 mg/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 9 mg/kg 농도의 옥탄산, 약 2 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2 mg/kg 농도의 올레산 및 약 1 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 6.4 μmol/kg 내지 640 μmol/kg 농도의 옥탄산, 종점을 포함하여 0.7 μmol/kg 내지 70 μmol/kg 농도의 팔미트산, 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도의 리놀레산, 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도의 올레산, 및 종점을 포함하여 0.25 μmol/kg 내지 25 μmol/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 64 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 리놀레산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.5 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
본 발명은 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 조성물을 1차 인간 T 세포에 도입하여 변형된 T 세포를 생산하며, 항원 수용체 또는 치료 단백질은 트랜스포존에 포함되지 않은 것인 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 변형된 T 세포를 접촉시켜 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 활성화된 변형된 T 세포가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 항원 수용체 또는 치료 단백질은 트랜스포존에 포함되지 않은 것인 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 다수의 변형된 T 세포를 접촉시켜 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 생산함으로써 다수의 활성화된 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 25%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 50%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 60%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 75%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 80%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 85%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 90%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 95%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 활성화된 변형된 TCM의 세포 표면 마커는 CD45RO, CD95, IL-2Rβ, CCR7, 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다.
변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 조성물을 1차 인간 T 세포에 도입하여 변형된 T 세포를 생산하며, 항원 수용체 또는 치료 단백질은 트랜스포존에 포함되지 않은 것인 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 변형된 T 세포를 접촉시켜 활성화된 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, (b)의 T 세포 활성화제 조성물은 항-인간 CD2 단일 특이적 사량체 항체 복합체를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 (c) 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브(Iscove)의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물과 활성화된 변형된 T 세포를 접촉시켜 다수의 증식된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 2%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트는 중심 기억 T 세포(TCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 60%는 줄기 중심 기억 T 세포(TCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 중심 기억 T 세포(TCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트로 포함하는 조성물을 생산하기 위해 다수의 증식된 변형된 T 세포를 농축하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 중심 기억 T 세포(TCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 적어도 60%로 포함하는 조성물을 생산하기 위해 다수의 증식된 변형된 T 세포를 농축하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 농축 단계는 다수의 농축된 변형된 T 세포로부터 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 단리하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 농축 단계는 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물을 단리된 변형된 TCM과 접촉시켜 다수의 증식된 농축된 변형된 TCM을 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 니코틴아미드, 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD), 디이소프로필 아디페이트(DIPA), n-부틸-벤젠술폰아미드, 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필) 에스테르, 팔미트산, 리놀레산, 올레산, 스테아르산 히드라지드, 올레아미드, 스테롤 및 알칸 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산 및 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 0.9 mg/kg 내지 90 mg/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 9 mg/kg 농도의 옥탄산, 약 2 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2 mg/kg 농도의 올레산 및 약 1 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 6.4 μmol/kg 내지 640 μmol/kg 농도의 옥탄산, 종점을 포함하여 0.7 μmol/kg 내지 70 μmol/kg 농도의 팔미트산, 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도의 리놀레산, 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도의 올레산, 및 종점을 포함하여 0.25 μmol/kg 내지 25 μmol/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 64 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 리놀레산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.5 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
본 발명은 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM) 및 다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 포함하는 조성물을 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 항원 수용체 또는 치료 단백질은 트랜스포존에 포함되지 않은 것인 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 다수의 변형된 T 세포를 접촉시켜 다수의 활성화된 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM) 및 다수의 활성화된 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)을 포함하는 조성물을 생성하며, 상기 다수의 활성화된 변형된 TSCM이 하나 이상의 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2Rβ를 발현하고 다수의 활성화된 변형된 TCM이 하나 이상의 CD45RO, CD95, IL-2Rβ, CCR7, 및 CD62L을 발현함으로써 다수의 변형된 TSCM 및 다수의 변형된 TCM을 포함하는 조성물을 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 1%, 2%, 5%, 7%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트의 세포를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 1%, 2%, 5%, 7%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트의 세포를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 10%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 90%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 90%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 10%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 20%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 80%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 80%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 20%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 30%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 70%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 70%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 30%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 40%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 60%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 60%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 40%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 50%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 50%를 포함한다.
다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM) 또는 다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 포함하는 조성물을 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 항원 수용체 또는 치료 단백질은 트랜스포존에 포함되지 않은 것인 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 다수의 변형된 T 세포를 접촉시켜 다수의 활성화된 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM) 및 다수의 활성화된 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 포함하는 조성물을 생산하는 단계를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, (b)의 T 세포 활성화제 조성물은 항-인간 CD2 단일 특이적 사량체 항체 복합체를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 (c) 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물과 다수의 활성화된 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM) 및 다수의 활성화된 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 포함하는 상기 조성물을 접촉시켜 다수의 증식된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 증식된 변형된 TSCM이 하나 이상의 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2Rβ를 발현하고 다수의 증식된 변형된 TCM이 하나 이상의 CD45RO, CD95, IL-2Rβ, CCR7, 및 CD62L을 발현함으로써 다수의 증식된 변형된 TSCM 및 다수의 증식된 변형된 TCM을 포함하는 조성물을 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 농축 단계는 다수의 농축된 변형된 T 세포로부터 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 단리하는 단계 또는 다수의 농축된 변형된 T 세포로부터 중심 기억 T 세포(TSM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 단리하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 농축 단계는 다수의 농축된 변형된 T 세포로부터 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 단리하는 단계 및 다수의 농축된 변형된 T 세포로부터 중심 기억 T 세포(TSM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 단리하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 농축 단계는 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물과 단리된 변형된 TSCM 및 단리된 변형된 TCM을 포함하는 조성물과 접촉시켜 다수의 증식된 농축된 변형된 TSCM 및 다수의 증식된 농축된 변형된 TCM을 포함하는 조성물을 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 니코틴아미드, 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD), 디이소프로필 아디페이트(DIPA), n-부틸-벤젠술폰아미드, 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필) 에스테르, 팔미트산, 리놀레산, 올레산, 스테아르산 히드라지드, 올레아미드, 스테롤 및 알칸 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산 및 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 0.9 mg/kg 내지 90 mg/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 9 mg/kg 농도의 옥탄산, 약 2 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2 mg/kg 농도의 올레산 및 약 1 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 6.4 μmol/kg 내지 640 μmol/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.7 μmol/kg 내지 70 μmol/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 0.25 μmol/kg 내지 25 μmol/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 64 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 리놀레산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.5 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 1%, 2%, 5%, 7%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트의 세포를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 1%, 2%, 5%, 7%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트의 세포를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 10%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 90%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 90%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 10%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 20%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 80%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 80%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 20%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 30%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 70%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 70%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 30%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 40%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 60%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 60%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 40%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 50%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 50%를 포함한다.
활성화된 변형된 TSCM 또는 TCM을 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 항원 수용체 또는 치료 단백질은 트랜스포존에 포함되지 않은 것인 단계, 및 (b) 하나 이상의 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체를 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 다수의 변형된 T 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 포함하는 본 발명의 활성화된 변형된 TSCM 또는 TCM을 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 도입 단계는 상동 재조합을 포함한다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물은 다수의 T 세포 중 적어도 하나의 1차 T 세포의 게놈 서열과 접촉한다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물은 다수의 T 세포 중 1차 T 세포의 일부분의 게놈 서열과 접촉한다. 특정 실시양태에서, 1차 T 세포의 일부분은 다수의 T 세포 중 전체 1차 T 세포 수의 적어도 1%, 2%, 5%, 7%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트이다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물은 다수의 T 세포 중 각각의 1차 T 세포의 게놈 서열과 접촉한다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물은 단일 가닥 절단을 유도한다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물은 이중 가닥 절단을 유도한다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 도입 단계는 공여 서열 조성물을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 공여 서열 조성물은 항원 수용체를 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 공여 서열 조성물은 항원 수용체를 코딩하는 서열, 5 '게놈 서열 및 3' 게놈 서열을 포함하며, 상기 5 '게놈 서열은 게놈 편집 조성물에 의해 유도된 절단 지점에 5'인 1차 T 세포의 게놈 서열과 상동성 또는 동일성을 갖고 상기 3' 게놈 서열은 게놈 편집 조성물에 의해 유도된 절단 지점에 3'인 1차 T 세포의 게놈 서열과 상동성 또는 동일성을 갖는다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물 및 공여 서열 조성물은 게놈 서열과 동시에 또는 순차적으로 접촉된다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물 및 공여 서열 조성물은 게놈 서열과 순차적으로 접촉되고, 게놈 편집 조성물이 우선 제공된다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물은 DAN 결합 도메인을 코딩하는 서열 및 뉴클레아제 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물은 DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 TALEN의 DNA 결합 도메인을 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 ZFN의 DNA 결합 도메인을 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 실시양태에서, 뉴클레아제 도메인은 Cas9 뉴클레아제 또는 이의 서열을 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 실시양태에서, 뉴클레아제 도메인은 불활성 Cas9(서열 번호 33, 위치 10에서 아스파르트산(D)에서 알라닌(A)으로의 치환(D10A) 및 위치 840에서 히스티딘(H)에서 알라닌(A)으로의 치환(H840A)을 포함)를 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 실시양태에서, 뉴클레아제 도메인은 짧은 불활성 Cas9(서열 번호 32, 위치 10에서 아스파르트산(D)에서 알라닌(A)으로의 치환(D10A) 및 위치 540에서 아스파라긴(N)에서 알라닌(A)으로의 치환(N540A)을 포함)를 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 실시양태에서, 뉴클레아제 도메인은 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하거나 추가로 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 실시양태에서, IIS형 엔도뉴클레아제는 AciI, Mn1I, AlwI, BbvI, BccI, BceAI, BsmAI, BsmFI, BspCNI, BsrI, BtsCI, HgaI, HphI, HpyAV, Mbo1I, My1I, PleI, SfaNI, AcuI, BciVI, BfuAI, BmgBI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BseRI, BsgI, BsmI, BspMI, BsrBI, BsrBI, BsrDI, BtgZI, BtsI, EarI, EciI, MmeI, NmeAIII, BbvCI, Bpu10I, BspQI, SapI, BaeI, BsaXI, CspCI, BfiI, MboII, Acc36I, FokI 또는 Clo051을 포함한다. 특정 실시양태에서, IIS형 엔도뉴클레아제는 Clo051을 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 실시양태에서, 뉴클레아제 도메인은 TALEN 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 포함하거나 추가로 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 실시양태에서, 뉴클레아제 도메인은 ZFN 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 포함하거나 추가로 포함한다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물은 게놈 서열 내 절단을 유도하고, 공여 서열 조성물은 1차 T 세포의 내인성 DNA 복구 기전을 사용하여 삽입된다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 공여 서열 조성물의 삽입은 게놈 편집 조성물의 DNA 결합 부위를 제거함으로써 게놈 편집 조성물의 추가 활성을 방지한다.
활성화된 변형된 TSCM 또는 TCM을 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 항원 수용체 또는 치료 단백질은 트랜스포존에 포함되지 않은 것인 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 다수의 변형된 T 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 포함하는 본 발명의 활성화된 변형된 TSCM 또는 TCM을 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 항원 수용체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 RNA 바이러스로부터 단리, 유래 또는 재조합된 하나 이상의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, RNA 바이러스는 단일 가닥 또는 이중 가닥 바이러스이다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 DNA 바이러스로부터 단리, 유래 또는 재조합된 하나 이상의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, DNA 바이러스는 단일 가닥 또는 이중 가닥 바이러스이다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 복제 결함성이다.
활성화된 변형된 TSCM 또는 TCM을 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 항원 수용체 또는 치료 단백질은 트랜스포존에 포함되지 않은 것인 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 다수의 변형된 T 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 포함하는 본 발명의 활성화된 변형된 TSCM 또는 TCM을 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 항원 수용체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스(retrovirus)로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스(lentivirus)로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함한다.
활성화된 변형된 TSCM 또는 TCM을 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 항원 수용체 또는 치료 단백질은 트랜스포존에 포함되지 않은 것인 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 다수의 변형된 T 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 포함하는 본 발명의 활성화된 변형된 TSCM 또는 TCM을 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 항원 수용체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 감마 레트로바이러스로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함한다.
활성화된 변형된 TSCM 또는 TCM을 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 항원 수용체 또는 치료 단백질은 트랜스포존에 포함되지 않은 것인 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 다수의 변형된 T 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 포함하는 본 발명의 활성화된 변형된 TSCM 또는 TCM을 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 항원 수용체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV: adeno-associated virus)로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV는 혈청형 AV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11이다. 특정 실시양태에서, AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11 중 하나 이상으로부터의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11중 하나 이상으로부터 단리, 유래 또는 재조합된 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV는 AAV2로부터 단리, 유래 또는 재조합된 서열을 포함한다. 벡터가 혈액 뇌 장벽(BBB: blood brain barrier)을 가로지르는 것을 포함하는 특정 실시양태에서, AAV는 AAV9로부터 단리, 유래 또는 재조합된 서열을 포함한다. 본 발명의 예시적인 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는 하나의 혈청형의 게놈 및 다른 혈청형의 캡시드(예를 들어, AAV2/5, AAV-DJ 및 AAV-DJ8)를 함유하는 AAV 혼성체 및 자가 상보적 AAV(scAAV: self-complementary AAV)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 예시적인 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는 rAAV-LK03, rAAV-NP59 및 rAAV-NP84를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 활성화된 변형된 TSCM 또는 TCM을 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 핵산 벡터는 항원 수용체를 포함한다. 특정 실시양태에서, DNA 벡터는 항원 수용체를 포함한다. 특정 실시양태에서, mRNA 벡터는 항원 수용체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 핵산 벡터는 플라스미드 또는 미니서클 벡터이다.
본 발명의 활성화된 변형된 TSCM 또는 TCM을 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 나노입자 벡터는 항원 수용체를 포함한다. 나노입자는 예를 들면 국제 특허 공보 WO 2012/094679호, 국제 특허 공보 WO 2016/022805호, 국제 특허 공보 WO/2011/133635호, 국제 특허 공보 WO/2016/090111호, 국제 특허 공보 WO/2017/004498호 WO/2017/004509호, 국제 특허 출원 PCT/US2017/030271호, 미국 특허 제6,835,394호, 미국 특허 제7,217,427호 및 미국 특허 제7,867,512호에 개시된 중합체로 구성될 수 있다.
본 발명의 활성화된 변형된 TSCM 또는 TCM을 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 특정 실시양태에서, 항원 수용체는 T 세포 수용체이다. 특정 실시양태에서, T 세포 수용체는 자연 발생적이다. 특정 실시양태에서, T 세포 수용체는 자연 발생적이지 않다. 특정 실시양태에서, 특히, T 세포 수용체가 자연 발생적이지 않은 실시양태에서, T 세포 수용체는 야생형 T 세포 수용체와 비교하여 하나 이상의 돌연변이(들)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 특히, T 세포 수용체가 자연 발생적이지 않은 실시양태에서, T 세포 수용체는 재조합 T 세포 수용체이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 특정 실시양태에서, CAR은 CARTyrin이다. 특정 실시양태에서, CAR은 하나 이상의 VHH 서열(들)을 포함한다. 특정 실시양태에서, CAR은 VCAR이다.
활성화된 변형된 TSCM 또는 TCM을 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 항원 수용체 또는 치료 단백질은 트랜스포존에 포함되지 않은 것인 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 다수의 변형된 T 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 포함하는 본 발명의 활성화된 변형된 TSCM 또는 TCM을 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 방법은 치료 단백질을 발현할 수 있는 변형된 T 세포를 생산하기 위해 치료 단백질을 포함하는 조성물을 1차 인간 T 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 치료 단백질은 분비 가능한 단백질이고, 방법은 치료 단백질을 분비할 수 있는 변형된 T 세포를 생산한다. 특정 실시양태에서, 도입 단계는 상동 재조합을 포함하고, 공여 서열은 치료 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 수용체를 포함하는 공여 서열은 치료 단백질을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 공여 서열은 항원 수용체를 포함하고, 제2 공여 서열은 치료 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 벡터는 치료 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 특정 실시양태에서, 벡터는 나노입자이다. 특정 실시양태에서, 항원 수용체를 포함하는 벡터는 치료 단백질을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 벡터는 항원 수용체를 포함하고, 제2 벡터 주형은 치료 단백질을 포함한다.
본 발명은 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 조성물을 1차 인간 T 세포에 도입하여 변형된 T 세포를 생산하며, 트랜스포존은 항원 수용체를 포함하는 것인 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 변형된 T 세포를 접촉시켜 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 활성화된 변형된 T 세포가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 트랜스포존은 항원 수용체를 포함하는 것인 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 다수의 변형된 T 세포를 접촉시켜 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 25%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 60%는 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, (b)의 T 세포 활성화제 조성물은 항-인간 CD2 단일 특이적 사량체 항체 복합체를 추가로 포함한다. 본 발명은 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 조성물을 1차 인간 T 세포에 도입하여 CAR-T 세포를 생산하는 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD2 단일 특이적 사량체 항체 복합체 및 활성화 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 CAR-T 세포를 접촉시켜 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 활성화된 CAR-T 세포가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 CAR 발현 줄기 기억 T 세포(TSCM)(CAR-TSCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 다수의 변형된 줄기 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 CAR-T 세포를 생산하는 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD2 단일 특이적 사량체 항체 복합체 및 활성화 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 다수의 CAR-T 세포를 접촉시켜 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 (c) 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물과 활성화된 변형된 T 세포를 접촉시켜 다수의 증식된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 2%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 니코틴아미드, 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD), 디이소프로필 아디페이트(DIPA), n-부틸-벤젠술폰아미드, 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필) 에스테르, 팔미트산, 리놀레산, 올레산, 스테아르산 히드라지드, 올레아미드, 스테롤 및 알칸 중 하나 이상을 포함하거나 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산 및 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 0.9 mg/kg 내지 90 mg/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율(parts per million)). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 9 mg/kg 농도의 옥탄산, 약 2 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2 mg/kg 농도의 올레산 및 약 1 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 9.19 mg/kg 농도의 옥탄산, 1.86 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2.12 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2.13 mg/kg 농도의 올레산, 및 약 1.01 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 9.19 mg/kg 농도의 옥탄산, 1.86 mg/kg 농도의 팔미트산, 2.12 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2.13 mg/kg 농도의 올레산, 및 1.01 mg/kg 농도의 스테롤을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 6.4 μmol/kg 내지 640 μmol/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.7 μmol/kg 내지 70 μmol/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 0.25 μmol/kg 내지 25 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 64 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 리놀레산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.5 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 63.75 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7.27 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.57 μmol/kg 농도의 리놀레산, 약 7.56 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.61 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 63.75 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7.27 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.57 μmol/kg 농도의 리놀레산, 7.56 μmol/kg 농도의 올레산 및 2.61 μmol/kg 농도의 스테롤을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트는 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 60%는 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 특정 실시양태에서, 방법은 (d) 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트로 포함하는 조성물을 생산하기 위해 다수의 증식된 변형된 T 세포를 농축하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 (d) 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 적어도 60%로 포함하는 조성물을 생산하기 위해 다수의 증식된 변형된 T 세포를 농축하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 농축 단계는 다수의 농축된 변형된 T 세포로부터 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 농축 단계는 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물을 단리된 변형된 TSCM과 접촉시켜 다수의 증식된 농축된 변형된 TSCM을 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 니코틴아미드, 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD), 디이소프로필 아디페이트(DIPA), n-부틸-벤젠술폰아미드, 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필) 에스테르, 팔미트산, 리놀레산, 올레산, 스테아르산 히드라지드, 올레아미드, 스테롤 및 알칸 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산 및 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 0.9 mg/kg 내지 90 mg/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 9 mg/kg 농도의 옥탄산, 약 2 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2 mg/kg 농도의 올레산 및 약 1 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 9.19 mg/kg 농도의 옥탄산, 1.86 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2.12 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2.13 mg/kg 농도의 올레산, 및 약 1.01 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 9.19 mg/kg 농도의 옥탄산, 1.86 mg/kg 농도의 팔미트산, 2.12 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2.13 mg/kg 농도의 올레산, 및 1.01 mg/kg 농도의 스테롤을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 6.4 μmol/kg 내지 640 μmol/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.7 μmol/kg 내지 70 μmol/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 0.25 μmol/kg 내지 25 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 64 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 리놀레산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.5 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 63.75 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7.27 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.57 μmol/kg 농도의 리놀레산, 약 7.56 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.61 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 63.75 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7.27 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.57 μmol/kg 농도의 리놀레산, 7.56 μmol/kg 농도의 올레산 및 2.61 μmol/kg 농도의 스테롤을 포함한다.
본 발명은 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 조성물을 1차 인간 T 세포에 도입하여 변형된 T 세포를 생산하며, 트랜스포존은 항원 수용체를 포함하는 것인 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 변형된 T 세포를 접촉시켜 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 활성화된 변형된 T 세포가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 트랜스포존은 항원 수용체를 포함하는 것인 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 다수의 변형된 T 세포를 접촉시켜 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 25%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 60%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, (b)의 T 세포 활성화제 조성물은 항-인간 CD2 단일 특이적 사량체 항체 복합체를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 (c) 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물과 활성화된 변형된 T 세포를 접촉시켜 다수의 증식된 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 2%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 니코틴아미드, 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD), 디이소프로필 아디페이트(DIPA), n-부틸-벤젠술폰아미드, 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필) 에스테르, 팔미트산, 리놀레산, 올레산, 스테아르산 히드라지드, 올레아미드, 스테롤 및 알칸 중 하나 이상을 포함하거나 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산 및 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 0.9 mg/kg 내지 90 mg/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율(parts per million)). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 9 mg/kg 농도의 옥탄산, 약 2 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2 mg/kg 농도의 올레산 및 약 1 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 9.19 mg/kg 농도의 옥탄산, 1.86 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2.12 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2.13 mg/kg 농도의 올레산, 및 약 1.01 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 9.19 mg/kg 농도의 옥탄산, 1.86 mg/kg 농도의 팔미트산, 2.12 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2.13 mg/kg 농도의 올레산, 및 1.01 mg/kg 농도의 스테롤을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 6.4 μmol/kg 내지 640 μmol/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.7 μmol/kg 내지 70 μmol/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 0.25 μmol/kg 내지 25 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 64 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 리놀레산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.5 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 63.75 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7.27 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.57 μmol/kg 농도의 리놀레산, 약 7.56 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.61 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 63.75 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7.27 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.57 μmol/kg 농도의 리놀레산, 7.56 μmol/kg 농도의 올레산 및 2.61 μmol/kg 농도의 스테롤을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트는 중심 기억 T 세포(TCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 60%는 중심 기억 T 세포(TCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 특정 실시양태에서, 방법은 (d) 중심 기억 T 세포(TCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트로 포함하는 조성물을 생산하기 위해 다수의 증식된 변형된 T 세포를 농축하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 (d) 중심 기억 T 세포(TCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 적어도 60%로 포함하는 조성물을 생산하기 위해 다수의 증식된 변형된 T 세포를 농축하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 농축 단계는 다수의 농축된 변형된 T 세포로부터 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 농축 단계는 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물을 단리된 변형된 TCM과 접촉시켜 다수의 증식된 농축된 변형된 TCM을 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 니코틴아미드, 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD), 디이소프로필 아디페이트(DIPA), n-부틸-벤젠술폰아미드, 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필) 에스테르, 팔미트산, 리놀레산, 올레산, 스테아르산 히드라지드, 올레아미드, 스테롤 및 알칸 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산 및 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 0.9 mg/kg 내지 90 mg/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 9 mg/kg 농도의 옥탄산, 약 2 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2 mg/kg 농도의 올레산 및 약 1 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 9.19 mg/kg 농도의 옥탄산, 1.86 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2.12 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2.13 mg/kg 농도의 올레산, 및 약 1.01 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 9.19 mg/kg 농도의 옥탄산, 1.86 mg/kg 농도의 팔미트산, 2.12 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2.13 mg/kg 농도의 올레산, 및 1.01 mg/kg 농도의 스테롤을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 6.4 μmol/kg 내지 640 μmol/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.7 μmol/kg 내지 70 μmol/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 0.25 μmol/kg 내지 25 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 64 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 리놀레산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.5 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 63.75 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7.27 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.57 μmol/kg 농도의 리놀레산, 약 7.56 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.61 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 63.75 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7.27 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.57 μmol/kg 농도의 리놀레산, 7.56 μmol/kg 농도의 올레산 및 2.61 μmol/kg 농도의 스테롤을 포함한다.
본 발명은 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM) 및 다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 포함하는 조성물을 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM) 및 다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 포함하는 조성물을 생산하며, 트랜스포존은 항원 수용체를 포함하는 것인 단계, 및 (b) 상기 조성물과 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물을 접촉시켜 다수의 활성화된 변형된 TSCM 및 다수의 활성화된 변형된 TCM을 포함하는 조성물을 생산하며, 상기 다수의 활성화된 변형된 TSCM이 하나 이상의 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2Rβ를 발현하고 상기 다수의 활성화된 변형된 TCM이 하나 이상의 CD45RO, CD95, IL-2Rβ, CCR7, 및 CD62L을 발현함으로써 다수의 변형된 TSCM 및 다수의 변형된 TCM을 포함하는 조성물을 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, (b)의 T 세포 활성화제 조성물은 항-인간 CD2 단일 특이적 사량체 항체 복합체를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 (c) 상기 조성물과 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물을 접촉시켜 다수의 증식된 변형된 T 세포를 생산하며, 다수의 증식된 변형된 T 세포를 포함하는 조성물의 적어도 2%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 (c) 상기 조성물과 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물을 접촉시켜 다수의 증식된 변형된 T 세포를 생산하며, 다수의 증식된 변형된 T 세포를 포함하는 조성물의 적어도 2%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 니코틴아미드, 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD), 디이소프로필 아디페이트(DIPA), n-부틸-벤젠술폰아미드, 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필) 에스테르, 팔미트산, 리놀레산, 올레산, 스테아르산 히드라지드, 올레아미드, 스테롤 및 알칸 중 하나 이상을 포함하거나 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산 및 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 0.9 mg/kg 내지 90 mg/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 9 mg/kg 농도의 옥탄산, 약 2 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2 mg/kg 농도의 올레산, 및 약 1 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 9.19 mg/kg 농도의 옥탄산, 1.86 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2.12 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2.13 mg/kg 농도의 올레산, 및 약 1.01 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 9.19 mg/kg 농도의 옥탄산, 1.86 mg/kg 농도의 팔미트산, 2.12 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2.13 mg/kg 농도의 올레산, 및 1.01 mg/kg 농도의 스테롤을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 6.4 μmol/kg 내지 640 μmol/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.7 μmol/kg 내지 70 μmol/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 0.25 μmol/kg 내지 25 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 64 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 리놀레산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.5 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 63.75 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7.27 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.57 μmol/kg 농도의 리놀레산, 약 7.56 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.61 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 63.75 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7.27 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.57 μmol/kg 농도의 리놀레산, 7.56 μmol/kg 농도의 올레산 및 2.61 μmol/kg 농도의 스테롤을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 변형된 TSCM 및 다수의 증식된 변형된 TCM을 포함하는 조성물의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트의 세포는 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 변형된 TSCM 및 다수의 증식된 변형된 TCM을 포함하는 조성물의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트의 세포는 중심 기억 T 세포(TCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 특정 실시양태에서, 방법은 (d) 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트로 포함하는 조성물을 생산하기 위해 조성물을 농축하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 (d) 중심 기억 T 세포(TCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트로 포함하는 조성물을 생산하기 위해 조성물을 농축하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 농축 단계는 조성물로부터 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 단리하는 단계 또는 조성물로부터 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 농축 단계는 조성물로부터 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 단리하는 단계 및 조성물로부터 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 농축 단계는 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물과 단리된 변형된 TSCM 및/또는 TCM을 접촉시켜 다수의 증식된 농축된 변형된 TSCM및/또는 TCM을 포함하는 조성물을 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 니코틴아미드, 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD), 디이소프로필 아디페이트(DIPA), n-부틸-벤젠술폰아미드, 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필) 에스테르, 팔미트산, 리놀레산, 올레산, 스테아르산 히드라지드, 올레아미드, 스테롤 및 알칸 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산 및 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 0.9 mg/kg 내지 90 mg/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 9 mg/kg 농도의 옥탄산, 약 2 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2 mg/kg 농도의 올레산 및 약 1 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 9.19 mg/kg 농도의 옥탄산, 1.86 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2.12 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2.13 mg/kg 농도의 올레산, 및 약 1.01 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 9.19 mg/kg 농도의 옥탄산, 1.86 mg/kg 농도의 팔미트산, 2.12 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2.13 mg/kg 농도의 올레산, 및 1.01 mg/kg 농도의 스테롤을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 6.4 μmol/kg 내지 640 μmol/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.7 μmol/kg 내지 70 μmol/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg 농도의 올레산; 종점을 포함하여 0.25 μmol/kg 내지 25 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 64 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 리놀레산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.5 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 63.75 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7.27 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.57 μmol/kg 농도의 리놀레산, 7.56 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.61 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 63.75 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7.27 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.57 μmol/kg 농도의 리놀레산, 7.56 μmol/kg 농도의 올레산 및 2.61 μmol/kg 농도의 스테롤을 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 1%, 2%, 5%, 7%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 1%, 2%, 5%, 7%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 10%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 90%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 90%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 10%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 20%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 80%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 80%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 20%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 30%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 70%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 70%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 30%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 40%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 60%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 60%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 40%를 포함한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 50%를 포함하고 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)는 조성물의 전체 세포 수의 적어도 50%를 포함한다.
방법이 (a) 항원 수용체를 포함하는 조성물을 1차 인간 T 세포에 도입하여 변형된 T 세포를 생산하며, 트랜스포존은 항원 수용체를 포함하는 것인 단계; 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체 및 활성화 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 변형된 T 세포를 접촉시켜 활성화된 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 포함하는 것인 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 방법은 (c) 치료 단백질을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 제2 트랜스포존을 1차 인간 T 세포에 도입하여 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 변형된 T 세포가 치료 단백질을 발현할 수 있는 것인 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 치료 단백질은 분비 가능한 단백질이고, 방법은 치료 단백질을 분비할 수 있는 변형된 T 세포를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 트랜스포사제 조성물을 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 조성물은 (a)의 트랜스포존 및 제2 트랜스포존을 전위시킨다. 특정 실시양태에서, 방법은 제1 트랜스포사제 조성물 및 제2 트랜스포사제 조성물을 도입하는 단계를 포함한다. 방법이 제1 트랜스포사제 조성물 및 제2 트랜스포사제 조성물을 도입하는 단계를 포함하는 것인 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 제1 트랜스포사제 조성물은 (a)의 트랜스존을 전위시키고, 제2 트랜스포사제 조성물은 제2 트랜스포존을 전위시킨다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 2개의 시스 조절 격리 인자가 측면에 위치한 항원 수용체 또는 치료 단백질을 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 피기백 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포존이 피기백 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 피기백TM 또는 슈퍼 피기백TM(SPB) 트랜스포사제이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 슬리핑 뷰티 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포존이 슬리핑 뷰티 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 또는 과활성 슬리핑 뷰티 트랜스포사제(SB100X)이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 헬레이저 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포존이 헬레이저 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 헬리트론 트랜스포사제이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 Tol2 트랜스포존이다. 트랜스포존이 Tol2 트랜스포존인 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 트랜스포사제는 Tol2 트랜스포사제이다.
방법이 (a) 항원 수용체를 포함하는 조성물을 1차 인간 T 세포에 도입하여 변형된 T 세포를 생산하며, 트랜스포존은 항원 수용체를 포함하는 것인 단계; 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 변형된 T 세포를 접촉시켜 활성화된 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 포함하는 것인 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 방법은 치료 단백질을 코딩하는 서열을 1차 인간 T 세포에 도입하여 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 변형된 T 세포가 치료 단백질을 발현할 수 있는 것인 단계를 추가로 포함한다. 치료 단백질을 코딩하는 서열을 도입하는 단계의 특정 실시양태에서, 도입 단계는 상동 재조합을 포함한다. 치료 단백질을 코딩하는 서열을 도입하는 단계의 특정 실시양태에서, 벡터는 치료 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 특정 실시양태에서, 벡터는 나노입자이다,
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 도입 단계는 게놈 편집 구조물을 포함하는 조성물을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 게놈 편집 구조물은 가이드 RNA 및 클러스터된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복서열(clustered regularly interspaced short palindromic repeats; CRISPR) 관련 단백질 9(Cas9) DNA 엔도뉴클레아제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 게놈 편집 구조물은 DNA 결합 도메인 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 게놈 편집 구조물은 융합 단백질을 코딩한다. 특정 실시양태에서, 게놈 편집 구조물은 DNA 결합 도메인 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 코딩하며 여기서 발현된 DNA 결합 도메인과 발현된 IIS형 엔도뉴클레아제는 비공유적으로 결합된다. 게놈 편집 구조물이 DNA 결합 도메인 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 게놈 편집 구조물은 Cas9 엔도뉴클레아제에서 유래된 서열을 포함한다. 게놈 편집 구조물이 DNA 결합 도메인 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 DNA 결합 도메인이다. Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열이 DNA 결합 도메인인 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 불활성 Cas9를 코딩한다. Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열이 DNA 결합 도메인인 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 절두된 Cas9를 코딩한다. 특정 실시양태에서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 위치 10(D10A)에서 아스파르트산(D)에서 알라닌(A)으로의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 위치 840에서 히스티딘(H)에서 알라닌(A)로의 아미노산 치환(H840A)을 포함한다. 특정 실시양태에서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 dCas9(서열 번호 33)를 포함한다. 특정 실시양태에서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 위치 580 위치에서 아스파라긴(N)에서 알라닌(A)으로의 아미노산 치환(N580A)을 포함한다. 특정 실시양태에서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 dSaCas9(서열 번호 32)를 포함한다. 게놈 편집 구조물이 DNA 결합 도메인 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 게놈 편집 구조물은 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN: transcription activator-like effector nuclease)로부터 유래된 서열을 포함한다. 게놈 편집 구조물이 DNA 결합 도메인 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, TALEN으로부터 유래된 서열은 DNA 결합 도메인이다. 특정 실시양태에서, 게놈 편집 구조물은 TALEN을 포함한다. 게놈 편집 구조물이 DNA 결합 도메인 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 게놈 편집 구조물은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN: zinc-finger nuclease)로부터 유래된 서열을 포함한다. 게놈 편집 구조물이 DNA 결합 도메인 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, ZFN으로부터 유래된 서열은 DNA 결합 도메인이다. 특정 실시양태에서, 게놈 편집 구조물은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 트랜스포존은 2개의 시스 조절 격리 인자가 측면에 위치한 항원 수용체 또는 치료 단백질을 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA 트랜스포존이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 도입 단계는 트랜스포사제를 코딩하는 mRNA 서열을 포함하는 조성물을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 피기백 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포존이 피기백 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포사제가 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제인 실시양태에서, 트랜스포사제를 코딩하는 서열은 mRNA 서열이다. 특정 실시양태에서, 피기백 트랜스포사제는 서열 번호 4를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 피기백 트랜스포사제는 과활성 변이체이며 상기 과활성 변이체는 서열 번호 4의 위치 30, 165, 282 및 538 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4의 위치 30에서 아미노산 치환은 이소류신(I)에서 발린(V)으로의 치환(I30V)이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4에서 위치 165에서의 아미노산 치환은 글리신(G)에서 세린(S)으로의 치환(G165S)이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4의 위치 282의 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환(M282V)이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4의 위치 538에서 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에서 리신(K)으로의 치환(N538K)이다. 특정 실시양태에서, 슈퍼 피기백(SPB) 트랜스포사제는 서열 번호 5를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 슬리핑 뷰티 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포존이 슬리핑 뷰티 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 또는 과활성 슬리핑 뷰티 트랜스포사제(SB100X)이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 헬레이저 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포존이 헬레이저 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 헬리트론 트랜스포사제이다. 특정 실시양태에서 서, 트랜스포존이 Tol2 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포존이 Tol2 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 Tol2 트랜스포사제이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포사제를 코딩하는 서열은 mRNA 서열이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 임의의 종으로부터 유래 또는 재조합될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 트랜스포존은 합성일 수 있다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 선별 유전자를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 선별제를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 항원 수용체는 T 세포 수용체이다. 특정 실시양태에서, T 세포 수용체는 자연 발생적이다. 특정 실시양태에서, T 세포 수용체는 자연 발생적이지 않다. 특정 실시양태에서, 특히, T 세포 수용체가 자연 발생적이지 않은 실시양태에서, T 세포 수용체는 야생형 T 세포 수용체와 비교하여 하나 이상의 돌연변이(들)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 특히, T 세포 수용체가 자연 발생적이지 않은 실시양태에서, T 세포 수용체는 재조합 T 세포 수용체이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 특정 실시양태에서, CAR은 CARTyrin이다. 특정 실시양태에서, CAR은 하나 이상의 VHH 서열(들)을 포함한다. 특정 실시양태에서, CAR은 VCAR이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 TSCM의 세포 표면 마커는 CD62L 및 CD45RA를 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 TSCM의 세포 표면 마커는 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 TSCM의 세포 표면 마커는 CD45RA, CD95, IL-2Rβ, CR7 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 변형된 T 세포는 미접촉(naive) T 세포(변형된 TN)를 포함하며 CAR-TN의 세포 표면 마커는 CD45RA, CCR7 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 변형된 T 세포는 중심 기억 T 세포(변형된 TCM)를 포함하며 CAR-TCM의 세포 표면 마커는 CD45RO, CD95, IL-2Rβ, CCR7 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 변형된 T 세포는 이펙터 기억 T 세포(변형된 TEM)를 포함하며 CAR-TEM의 세포 표면 마커는 CD45RO, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 변형된 T 세포는 이펙터 T 세포(변형된 TEFF)를 포함하며 CAR-TEFF의 세포 표면 마커는 CD45RA, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 변형된 T 세포는 중심 기억 T 세포(변형된 TCM)를 포함하고 CAR-TCM의 세포 표면 마커는 CD45RO, CD95, IL-2Rβ, CCR7, 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 변형된 T 세포에서 가장 풍부한 세포는 중심 기억 T 세포(변형된 TCM)이고 CAR-TCM의 세포 표면 마커는 CD45RO, CD95, IL-2Rβ, CCR7, 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다. 다수의 증식된 변형된 T 세포에서 가장 풍부한 세포가 중심 기억 T 세포(변형된 TCM)인 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 변형된 T 세포는 TSCM 세포를 포함하고 TSCM 세포의 세포 마커는 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명은 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 조성물을 1차 인간 T 세포에 도입하여 CAR-T 세포를 생산하는 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD2 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 CAR-T 세포를 접촉시켜 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 활성화된 CAR-T 세포가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 CAR 발현 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 CAR-T 세포를 생산하는 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD2 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 다수의 CAR-T 세포를 접촉시켜 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 25%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 50%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 60%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 75%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 80%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 85%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 90%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 95%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 세포 표면 마커는 CD62L 및 CD45RA를 포함한다. 특정 실시양태에서, 활성화된 CAR TSCM의 세포 표면 마커는 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 활성화된 CAR TSCM의 세포 표면 마커는 CD45RA, CD95, IL-2Rβ, CR7 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명은 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 조성물을 1차 인간 T 세포에 도입하여 CAR-T 세포를 생산하는 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 CAR-T 세포를 접촉시켜 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 활성화된 CAR-T 세포가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 CAR 발현 줄기 기억 T 세포(TSCM)(CAR-TSCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 CAR-T 세포를 생산하는 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 다수의 CAR-T 세포를 접촉시켜 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 25%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 50%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 60%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 75%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 80%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 85%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 90%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 95%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 세포 표면 마커는 CD62L 및 CD45RA를 포함한다. 특정 실시양태에서, 활성화된 CAR TSCM의 세포 표면 마커는 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2R 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 활성화된 CAR TSCM의 세포 표면 마커는 CD45RA, CD95, IL-2Rβ, CR7 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 (c) 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물과 활성화된 CAR-T 세포와 접촉시켜 다수의 증식된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 증식된 CAR-T 세포의 적어도 2%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것(CAR-TSCM)인 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 니코틴아미드, 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD), 디이소프로필 아디페이트(DIPA), n-부틸-벤젠술폰아미드, 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필) 에스테르, 팔미트산, 리놀레산, 올레산, 스테아르산 히드라지드, 올레아미드, 스테롤 및 알칸 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산 및 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 0.9 mg/kg 내지 90 mg/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 9 mg/kg 농도의 옥탄산, 약 2 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2 mg/kg 농도의 올레산 및 약 1 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 9.19 mg/kg 농도의 옥탄산, 1.86 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2.12 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2.13 mg/kg 농도의 올레산, 및 약 1.01 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 9.19 mg/kg 농도의 옥탄산, 1.86 mg/kg 농도의 팔미트산, 2.12 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2.13 mg/kg 농도의 올레산, 및 1.01 mg/kg 농도의 스테롤을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 6.4 μmol/kg 내지 640 μmol/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.7 μmol/kg 내지 70 μmol/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg 농도의 올레산; 종점을 포함하여 0.25 μmol/kg 내지 25 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 64 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 리놀레산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.5 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 63.75 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7.27 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.57 μmol/kg 농도의 리놀레산, 7.56 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.61 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 63.75 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7.27 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.57 μmol/kg 농도의 리놀레산, 7.56 μmol/kg 농도의 올레산 및 2.61 μmol/kg 농도의 스테롤을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 CAR-T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트는 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현한다(CAR-TSCM). 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 CAR-T 세포는 줄기 기억 T 세포(TSCM)(CAR-TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 CAR-T 세포에 대해 농축될 수 있으므로, 농축 단계 후, 방법은 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 CAR-T 세포(CAR-TSCM)의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 중 임의의 퍼센트를 포함하는 농축된 조성물을 생산할 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 표면 마커는 CD62L 및 CD45RA를 포함한다. 특정 실시양태에서, CAR-TSCM의 세포 표면 마커는 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, CAR-TSCM의 세포 표면 마커는 CD45RA, CD95, IL-2Rβ, CR7 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 CAR-T 세포는 미접촉 T 세포(CAR-TN)를 포함하며 CAR-TN의 세포 표면 마커는 CD45RA, CCR7 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 CAR-T 세포는 중심 기억 T 세포(CAR-TCM)를 포함하며 CAR-TCM의 세포 표면 마커는 CD45RO, CD95, IL-2Rβ, CCR7, 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 CAR-T 세포는 이펙터 기억 T 세포(CAR-TEM)를 포함하며 CAR-TEM의 세포 표면 마커는 CD45RO, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 CAR-T 세포는 이펙터 T 세포(CAR-TEFF)를 포함하며 CAR-TEFF의 세포 표면 마커는 CD45RA, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함한다. 추가적인 세포 표면 마커는 문헌[Gattinoni et al. (Nat Med. 2011 Sep 18; 17(10): 1290-7; 그 내용은 그 전문으로 본원에 참고로 포함됨]에 기재되어 있다.
본 발명은 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 조성물을 1차 인간 T 세포에 도입하여 CAR-T 세포를 생산하는 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 CAR-T 세포와 접촉시켜 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 활성화된 CAR-T 세포가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 CAR 발현 줄기 기억 T 세포(TSCM)(CAR-TSCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 CAR-T 세포를 생산하는 단계, 및 (b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 다수의 CAR-T 세포를 접촉시켜 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 25%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 50%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 60%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 75%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 80%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 85%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 90%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 방법은 다수의 활성화된 CAR-T 세포를 생산하며, 상기 다수의 활성화된 CAR-T 세포의 적어도 95%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 활성화된 CAR 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산한다. 특정 실시양태에서, 활성화된 CAR TSCM의 세포 표면 마커는 CD62L 및 CD45RA를 포함한다. 특정 실시양태에서, 활성화된 CAR-TSCM의 세포 표면 마커는 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2R 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 활성화된 CAR TSCM의 세포 표면 마커는 CD45RA, CD95, IL-2Rβ, CR7 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 CAR-T 세포는 미접촉 T 세포(CAR-TN)를 포함하며 CAR-TN의 세포 표면 마커는 CD45RA, CCR7 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 CAR-T 세포는 중심 기억 T 세포(변형된 TCM)를 포함하고 CAR-TCM의 세포 표면 마커는 CD45RO, CD95, IL-2Rβ, CCR7 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 CAR-T 세포는 이펙터 기억 T 세포(변형된 TEM)를 포함하며 CAR-TEM의 세포 표면 마커는 CD45RO, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다수의 증식된 CAR-T 세포는 이펙터 T 세포(변형된 TEFF)를 포함하며 CAR-TEFF의 세포 표면 마커는 CD45RA, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 본 발명의 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 트랜스포존은 2개의 시스 조절 격리 인자가 측면에 위치한 CAR을 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA 트랜스포존일 수 있다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 트랜스포존은 피기백 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 조성물을 도입하는 단계는 트랜스포사제를 코딩하는 mRNA 서열을 포함하는 조성물을 추가로 포함할 수 있다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 트랜스포사제는 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 트랜스포존은 선별 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 트랜스포존이 선별 유전자를 포함하는 경우, 본 발명의 방법의 T 세포 증식 조성물은 본 발명의 활성화된 또는 변형된 T 세포를 동시에 선별하고 증식시키는 선별제를 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 CARTyrin 일 수 있다. 특정 실시양태에서, CAR은 하나 이상의 VHH 서열(들)을 포함한다. 특정 실시양태에서, CAR은 VCAR이다.
본 발명의 변형된 TSCM을 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 도입 단계는 전기 천공 또는 뉴클레오펙션을 포함할 수 있다. 도입 단계가 뉴클레오펙션을 포함하는 경우, 뉴클레오펙션은 (a) 큐벳 내에서 트랜스포존 조성물, 트랜스포사제 조성물, 및 다수의 1차 인간 T 세포를 포함하는 조성물을 접촉시키는 단계; (b) 상기 큐벳에 1회 이상의 전기 펄스를 적용하는 단계, 및 (c) 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물을 포함하는 조성물에서 다수의 1차 인간 T 세포를 포함하는 조성물을 37℃에서 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 니코틴아미드, 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD), 디이소프로필 아디페이트(DIPA), n-부틸-벤젠술폰아미드, 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필) 에스테르, 팔미트산, 리놀레산, 올레산, 스테아르산 히드라지드, 올레아미드, 스테롤 및 알칸 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산 및 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 0.9 mg/kg 내지 90 mg/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 9 mg/kg 농도의 옥탄산, 약 2 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2 mg/kg 농도의 올레산 및 약 1 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 9.19 mg/kg 농도의 옥탄산, 1.86 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2.12 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2.13 mg/kg 농도의 올레산, 및 약 1.01 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 9.19 mg/kg 농도의 옥탄산, 1.86 mg/kg 농도의 팔미트산, 2.12 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2.13 mg/kg 농도의 올레산, 및 1.01 mg/kg 농도의 스테롤을 포함한다(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 6.4 μmol/kg 내지 640 μmol/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.7 μmol/kg 내지 70 μmol/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg 농도의 올레산; 종점을 포함하여 0.25 μmol/kg 내지 25 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 64 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 리놀레산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.5 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 63.75 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7.27 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.57 μmol/kg 농도의 리놀레산, 약 7.56 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.61 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 증식 조성물은 약 63.75 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7.27 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.57 μmol/kg 농도의 리놀레산, 7.56 μmol/kg 농도의 올레산 및 2.61 μmol/kg 농도의 스테롤을 포함한다. 뉴클레오펙션의 특정 실시양태에서, 트랜스포존 조성물은 뉴클레아제 무함유 물을 포함하는 0.5 μg/㎕ 용액이고, 큐벳은 1 μg의 트랜스포존을 생성하도록 2 ㎕의 트랜스포존 조성물을 포함한다. 트랜스포존 조성물은 피기백 트랜스포존을 포함할 수 있다. 트랜스포존 조성물은 슬리핑 뷰티 트랜스포존을 포함할 수 있다. 뉴클레오펙션의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 조성물은 5 ㎍의 트랜스포사제를 포함한다. 트랜스포사제 조성물은 과활성 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제를 포함할 수 있다. 트랜스포사제 조성물은 과활성 슬리핑 뷰티(SB100X) 트랜스포사제를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 헬레이저 트랜스포존을 포함할 수 있고 트랜스포사제 조성물은 헬리트론 트랜스포사제를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 Tol2 트랜스포존을 포함할 수 있고 트랜스포사제 조성물은 Tol2 트랜스포사제를 포함한다.
도입 단계가 뉴클레오펙션 또는 전기 천공을 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 뉴클레오펙션은 큐벳에서 제1 트랜스포존 조성물 및 제1 트랜스포사제 조성물 및 다수의 1차 인간 T 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 도입 단계가 뉴클레오펙션 또는 전기 천공을 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 뉴클레오펙션은 큐벳에서 제1 트랜스포존 조성물, 제2 트랜스포존 조성물, 제1 트랜스포사제 조성물 및 다수의 1차 인간 T 세포를 포함하는 조성물을 접촉시키는 단계를 포함한다. 도입 단계가 뉴클레오펙션 또는 전기 천공을 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 뉴클레오펙션은 큐벳에서 제1 트랜스포존 조성물, 제2 트랜스포존 조성물, 제1 트랜스포사제 조성물, 제2 트랜스포사제 조성물 및 다수의 1차 인간 T 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 트랜스포존은 항원 수용체를 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 트랜스포존은 치료 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 트랜스포존 조성물과 제2 트랜스포존 조성물은 동일하다. 특정 실시양태에서, 제1 트랜스포존 조성물과 제2 트랜스포존 조성물은 동일하지 않다. 특정 실시양태에서, 제1 트랜스포사제는 제1 트랜스포존 조성물 및 제2 트랜스포존 조성물을 동원한다. 특정 실시양태에서, 제1 트랜스포사제는 제1 트랜스포존 조성물을 동원하지만 제2 트랜스포존 조성물을 동원하지 않는다. 특정 실시양태에서, 제2 트랜스포사제는 제2 트랜스포존 조성물을 동원하지만 제1 트랜스포존 조성물을 동원하지 않는다. 특정 실시양태에서, 제1 트랜스포사제는 제1 트랜스포존 조성물을 동원하고 제2 트랜스포사제는 제2 트랜스포존 조성물을 동원한다. 특정 실시양태에서, 제1 트랜스포존 조성물 또는 제2 트랜스포존 조성물은 항원 수용체를 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 트랜스포존 조성물 또는 제2 트랜스포존 조성물은 치료 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 트랜스포존 조성물은 항원 수용체를 코딩하는 서열을 포함하고 제2 트랜스포존 조성물은 치료 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 치료 단백질은 분비 또는 분비 가능한 단백질이다. 도입 단계가 뉴클레오펙션 또는 전기 천공을 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 뉴클레오펙션은 큐벳에서 트랜스포존 조성물, 제1 트랜스포사제 조성물, 제2 트랜스포사제 조성물 및 다수의 1차 인간 T 세포를 포함하는 조성물을 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존 조성물은 항원 수용체를 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존 조성물은 치료 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 도입 단계가 뉴클레오펙션 또는 전기 천공을 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 뉴클레오펙션은 큐벳에서 게놈의 특정 부위에서 상동 재조합을 유도할 수 있는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 상동 재조합을 유도할 수 있는 조성물은 외인성 공여 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 외인성 공여 분자는 항원 수용체를 코딩하는 서열을 포함하고 트랜스포존은 치료 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 외인성 공여 분자는 치료 단백질을 코딩하는 서열을 포함하고, 트랜스포존은 항원 수용체를 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존을 포함하는 조성물, 트랜스포사제를 포함하는 조성물 및 게놈의 특정 부위에서 상동 재조합을 유도할 수 있는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포를 포함하는 조성물과 동시에 접촉시킨다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존을 포함하는 조성물 및 트랜스포사제를 포함하는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포를 포함하는 조성물과 먼저 접촉시키고, 게놈의 특정 부위에서 상동 재조합을 유도할 수 있는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포를 포함하는 조성물과 두 번째로 접촉시킨다. 특정 실시양태에서, 게놈의 특정 부위에서 상동 재조합을 유도할 수 있는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포를 포함하는 조성물과 먼저 접촉시키고, 트랜스포존을 포함하는 조성물 및 트랜스포사제를 포함하는 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포와 두 번째로 접촉시킨다. 본 발명의 변형된 TSCM을 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포를 포함하는 조성물은 1차 인간 T 세포의 세포 생존도 및/또는 줄기 유사 표현형을 유지하거나 향상시키는 완충액을 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충액은 뉴클레오펙션 전에 1차 인간 T 세포의 세포 생존도 및/또는 줄기 유사 표현형을 유지하거나 향상시킨다. 특정 실시양태에서, 완충액은 뉴클레오펙션 중에 1차 인간 T 세포의 세포 생존도 및/또는 줄기 유사 표현형을 유지하거나 향상시킨다. 특정 실시양태에서, 완충액은 뉴클레오펙션 후에 1차 인간 T 세포의 세포 생존도 및/또는 줄기 유사 표현형을 유지하거나 향상시킨다. 특정 실시양태에서, 완충액은 P3 1차 세포 용액(Lonza)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충액은 KCl, MgCl2, ClNa, 글루코오스 및 Ca(NO3)2 중 하나 이상을 임의의 절대 또는 상대 존재량 또는 농도로 포함하고, 경우에 따라 완충액은 HEPES, 트리스(Tris)/ HCl 및 인산 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택된 보충물을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충액은 5 mM KCl, 15 mM MgCl2, 90 mM ClNa, 10 mM 글루오코스 및 0.4 mM Ca(NO3)2를 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충액은 5 mM KCl, 15 mM MgCl2, 90 mM ClNa, 10 mM 글루코스 및 0.4 mM Ca(NO3)2, 및 20 mM HEPES 및 75 mM 트리스/HCl을 포함하는 보충물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충액은 pH 7.2에서 5 mM KCl, 15 mM MgCl2, 90 mM ClNa, 10 mM 글루코스 및 0.4 mM Ca(NO3)2, 및 40 mM Na2HPO4/NaH2PO4를 포함하는 보충물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포를 포함하는 조성물은 100㎕의 완충액 및 5x106 내지 25x106 세포를 포함한다.
본 발명의 변형된 TSCM을 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포를 포함하는 조성물에서 CD14, CD56, 및/또는 CD19를 발현하는 세포를 제거시킨다. 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포를 포함하는 조성물은 100㎕의 완충액 및 5x106 내지 25x106 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 37℃에서 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 인, 옥탄 지방산, 팔미트 지방산, 리놀레 지방산 및 올레산 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 배지는 예를 들어, 아이코브의 변형된 둘베코 배지(IMDM: Icove's Modified Dulbecco's Medium); 서모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific)에서 카탈로그 번호 12440053으로 이용 가능함)에서 볼 수 있는 것보다 10배 높은 양의 인을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 37℃에서 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 하기 원소 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다: 붕소, 나트륨, 마그네슘, 인, 칼륨, 및 칼슘. 특정 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 상응하는 평균 농도로 존재하는 하기 원소 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다: 3.7mg/L의 붕소, 3000mg/L의 나트륨, 18mg/L의 마그네슘, 29mg/L의 인, 15mg/L의 칼륨 및 4mg/L의 칼슘.
본원에서 사용되는 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 37℃에서 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 하기 성분 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다: 옥탄산(CAS No. 124-07-2), 니코틴아미드(CAS No. 98-92-0), 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD)(CAS No. 126-86-3), 디이소프로필 아디페이트(DIPA)(CAS No. 6938-94-9), n-부틸-벤젠술폰아미드(CAS No. 3622-84-2), 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필) 에스테르(CAS No. 84-69-5), 팔미트산(CAS No. 57-10-3), 리놀레산(CAS No. 60-33-3), 올레산(CAS No. 112-80-1), 스테아르산 히드라지드(CAS No. 4130-54-5), 올레아미드(CAS No. 3322-62-1), 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)(CAS No. 57-88-5), 및 알칸(예를 들어, 노나데칸)(CAS No. 629-92-5). 특정 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 상응하는 하기 성분 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다: 옥탄산(CAS No. 124-07-2), 니코틴아미드(CAS No. 98-92-0), 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD)(CAS No. 126-86-3), 디이소프로필 아디페이트(DIPA)(CAS No. 6938-94-9), n-부틸-벤젠술폰아미드(CAS No. 3622-84-2), 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필) 에스테르(CAS No. 84-69-5), 팔미트산(CAS No. 57-10-3), 리놀레산(CAS No. 60-33-3), 올레산(CAS No. 112-80-1), 스테아르산 히드라지드(CAS No. 4130-54-5), 올레아미드(CAS No. 3322-62-1), 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)(CAS No. 57-88-5), 알칸(예를 들어, 노나데칸)(CAS No. 629-92-5), 및 페놀 레드(CAS No. 143-74-8). 특정 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 하기 성분 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다: 옥탄산(CAS No. 124-07-2), 니코틴아미드(CAS No. 98-92-0), 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD)(CAS No. 126-86-3), 디이소프로필 아디페이트(DIPA)(CAS No. 6938-94-9), n-부틸-벤젠술폰아미드(CAS No. 3622-84-2), 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필) 에스테르(CAS No. 84-69-5), 팔미트산(CAS No. 57-10-3), 리놀레산(CAS No. 60-33-3), 올레산(CAS No. 112-80-1), 스테아르산 히드라지드(CAS No. 4130-54-5), 올레아미드(CAS No. 3322-62-1), 페놀 레드(CAS No. 143-74-8) 및 라놀린 알코올.
본원에서 사용되는 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 37℃에서 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 하기 이온 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다: 나트륨, 암모늄, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 염화물, 황산 및 인산.
본원에서 사용되는 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 37℃에서 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 하기 유리 아미노산 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다: 히스티딘, 아스파라긴, 세린, 글루타메이트, 아르기닌, 글리신, 아스파르트산, 글루탐산, 트레오닌, 알라닌, 프롤린, 시스테인, 리신, 티로신, 메티오닌, 발린, 이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 트립토판. 특정 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 상응하는 평균 몰 퍼센트의 하기 유리 아미노산 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다: 히스티딘(약 1%), 아스파라긴(약 0.5%), 세린(약 1.5%), 글루타민(약 67%), 아르기닌(약 1.5%), 글리신(약 1.5%), 아스파르트산(약 1%), 글루탐산(약 2%), 트레오닌(약 2%), 알라닌(약 1%), 프롤린(약 1.5%), 시스테인(약 1.5%), 리신(약 3%), 티로신(약 1.5%), 메티오닌(약 1%), 발린(약 3.5%), 이소류신(약 3%), 류신(약 3.5%), 페닐알라닌(약 1.5%) 및 트립토판(약 0.5%). 특정 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 상응하는 평균 몰 퍼센트의 하기 유리 아미노산 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다: 히스티딘(약 0.78%), 아스파라긴(약 0.4%), 세린(약 1.6%), 글루타민(약 67.01%), 아르기닌(약 1.67%), 글리신(약 1.72%), 아스파르트산(약 1.00%), 글루탐산(약 1.93%), 트레오닌(약 2,38%), 알라닌(약 1.11%), 프롤린(약 1.49%), 시스테인(약 1.65%), 리신(약 2.84%), 티로신(약 1.62%), 메티오닌(약 0.85%), 발린(약 3.45%), 이소류신(약 3.14%), 류신(약 3.3%), 페닐알라닌(약 1.64%) 및 트립토판(약 0.37%)
본원에서 사용되는 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산 및 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 하기 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다; 종점을 포함하여 0.9 mg/kg 내지 90 mg/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg 농도의 스테롤(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 하기 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다: 약 9 mg/kg 농도의 옥탄산, 약 2 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2 mg/kg 농도의 올레산 및 약 1 mg/kg 농도의 스테롤(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 하기 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다: 9.19 mg/kg 농도의 옥탄산, 1.86 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2.12 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2.13 mg/kg의 올레산 및 약 1.01 mg/kg 농도의 스테롤(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 하기 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다: 9.19 mg/kg 농도의 옥탄산, 1.86 mg/kg 농도의 팔미트산, 2.12 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2.13 mg/kg의 올레산 및 1.01 mg/kg 농도의 스테롤(여기서, mg/kg = 백만분율). 특정 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 하기 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다: 종점을 포함하여 6.4 μmol/kg 내지 640 μmol/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.7 μmol/kg 내지 70 μmol/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 0.25 μmol/kg 내지 25 μmol/kg 농도의 스테롤. 특정 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 하기 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다: 약 64 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 리놀레산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.5 μmol/kg 농도의 스테롤. 특정 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 하기 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다: 약 63.75 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7.27 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.57 μmol/kg 농도의 리놀레산, 약 7.56 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.61 μmol/kg 농도의 스테롤. 특정 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 증식 조성물" 또는 "T 세포 증식 조성물"은 하기 중 하나 이상을 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다: 약 63.75 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7.27 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.57 μmol/kg 농도의 리놀레산, 7.56 μmol/kg 농도의 올레산 및 2.61 μmol/kg 농도의 스테롤.
본원에 사용되는 용어 "P3 완충액"은 KCl, MgCl2, ClNa, 글루코오스 및 Ca(NO3)2 중 하나 이상을 임의의 절대 또는 상대 존재량 또는 농도로 포함하고, 경우에 따라 HEPES, 트리스/HCl 및 인산 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택된 보충물을 추가로 포함하는 완충액과 호환적으로 사용될 수 있다. 용어 "P3 완충액"은 5 mM KCl, 15 mM MgCl2, 90 mM ClNa, 10 mM 글루코오스 및 0.4 mM Ca(NO3)2를 포함하고, 경우에 따라 HEPES, 트리스/HCl 및 인산 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택된 보충물을 추가로 포함하는 완충액과 호환적으로 사용될 수 있다. 용어 "P3 완충액"은 5 mM KCl, 15 mM MgCl2, 90 mM ClNa, 10 mM 글루코오스 및 0.4 mM Ca(NO3)2, 및 20 mM HEPES 및 75 mM 트리스/HCl를 포함하는 보충물을 포함하는 완충액과 호환적으로 사용될 수 있다. 용어 "P3 완충액"은 pH 7.2에서 5 mM KCl, 15 mM MgCl2, 90 mM ClNa, 10 mM 글루코오스 0.4 mM Ca(NO3)2, 및 40 mM Na2HPO4/NaH2PO4를 포함하는 보충물을 포함하는 완충액과 호환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "보충된 RPMI-1640 배지" 또는 "T 세포 조건화 배지(TCCM: T-cell conditioned media)"는 물, 태아 소 혈청, HEPES, 피루브산나트륨, 하나 이상의 비필수 아미노산, 페놀 레드 지시약, 질산칼슘, 황산마그네슘, 염화칼륨, 중탄산나트륨, 염화나트륨, 제2인산나트륨(무수), L-알라닐-L-글루타민, L-아르기닌, L-아스파라긴(무수), L-아스파르트산, L-시스테인 2HCl, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, 히드록시-L-프롤린, L-이소류신, L-류신, L-리신 HCl, L-메티오닌, L- 페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 2Na 2H2O, L-발린, D-비오틴, 염화콜린, 엽산, 미오-이노시톨, 니아신아미드, p-아미노벤조산, D-판토텐산(헤미칼슘), 피리독신 HCl, 리보플라빈, 티아민 HCl, 비타민 B12, D-글루코오스, 글루타티온(환원), L-글루타민 및 2-머캅토에탄올 중 하나 이상을 임의의 절대 또는 상대 존재량 또는 농도로 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다. 용어 "보충된 RPMI-1640 배지" 또는 "T 세포 조건화 배지(TCCM)"는 물, 태아 소 혈청, HEPES, 피루브산나트륨, 하나 이상의 비필수 아미노산, 페놀 레드 지시약, 질산칼슘, 황산마그네슘, 염화칼륨, 중탄산나트륨, 염화나트륨, 제2인산나트륨(무수), L-알라닐-L-글루타민, L-아르기닌, L-아스파라긴(무수), L-아스파르트산, L-시스테인 2HCl, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, 히드록시-L-프롤린, L-이소류신, L-류신, L-리신 HCl, L-메티오닌, L- 페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 2Na 2H2O, L-발린, D-비오틴, 염화콜린, 엽산, 미오-이노시톨, 니아신아미드, p-아미노벤조산, D-판토텐산(헤미칼슘), 피리독신 HCl, 리보플라빈, 티아민 HCl, 비타민 B12, D-글루코오스, 글루타티온(환원), L-글루타민 및 2-머캅토에탄올을 임의의 절대 또는 상대 존재량 또는 농도로 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "보충된 AIM-V" 또는 "보충된 AIMV" 배지는 물, 인간 혈청 알부민, 스트렙토마이신 설페이트, 젠타마이신, 태아 소 혈청, HEPES, 피루브산나트륨, 하나 이상의 비필수 아미노산, 페놀 레드 지시약, 질산칼슘, 황산마그네슘, 염화칼륨, 중탄산나트륨, 염화나트륨, 제2인산나트륨(무수), L-알라닐 -L-글루타민, L-아르기닌, L-아스파라긴(무수), L-아스파르트산, L-시스테인 2HCl, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, 히드록시-L-프롤린, L-이소류신, L-류신, L-리신 HCl, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 2Na 2H2O, L-발린, D-비오틴, 염화콜린, 엽산, 미오-이노시톨, 니아신아미드, p-아미노벤조산, D-판토텐산(헤미칼슘), 피리독신 HCl, 리보플라빈, 티아민 HCl, 비타민 B12, D-글루코오스, 글루타티온(환원), L-글루타민 및 2-머캅토에탄올 중 하나 이상을 임의의 절대 또는 상대 존재량 또는 농도로 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다. 용어 "보충된 AIM-V" 또는 "보충된 AIMV" 배지는 물, 인간 혈청 알부민, 스트렙토마이신 설페이트, 젠타마이신, 태아 소 혈청, HEPES, 피루브산나트륨, 하나 이상의 비필수 아미노산, 페놀 레드 지시약, 질산칼슘, 황산마그네슘, 염화칼륨, 중탄산나트륨, 염화나트륨, 제2인산나트륨(무수), L-알라닐 -L-글루타민, L-아르기닌, L-아스파라긴(무수), L-아스파르트산, L-시스테인 2HCl, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, 히드록시-L-프롤린, L-이소류신, L-류신, L-리신 HCl, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 2Na 2H2O, L-발린, D-비오틴, 염화콜린, 엽산, 미오-이노시톨, 니아신아미드, p-아미노벤조산, D-판토텐산(헤미칼슘), 피리독신 HCl, 리보플라빈, 티아민 HCl, 비타민 B12, D-글루코오스, 글루타티온(환원), L-글루타민 및 2-머캅토에탄올을 임의의 절대 또는 상대 존재량 또는 농도로 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "이뮤노컬트(ImmunoCult)™ 배지"는 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, L-글루타민, 페놀 레드, 글리신, L-알라닌, L-아르기닌 히드로클로라이드, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인 2HCl, L-글루탐산, L-글루타민, L-히스티딘 히드로클로라이드 H20, L-이소류신, L-류신, L-리신 히드로클로라이드, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 이나트륨 염, L-발린, 비오틴, 염화콜린, D-칼슘 판토테네이트, 엽산, 니아신아미드, 피리독살 히드로클로라이드, 리보플라빈, 티아민 히드로클로라이드, 비타민 B12, i-이노시톨, 염화칼슘(무수), 황산마그네슘(무수), 염화칼륨, 질산칼륨, 중탄산나트륨, 염화나트륨, 제1인산나트륨, 아셀레늄산나트륨, D-글루코오스, HEPES 및 피루브산나트륨 중 하나 이상을 임의의 절대 또는 상대 존재량 또는 농도로 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다. 용어 "이뮤노컬트™ 배지"는 물, 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, L-글루타민, 페놀 레드, 글리신, L-알라닌, L-아르기닌 히드로클로라이드, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인 2HCl, L-글루탐산, L-글루타민, L-히스티딘 히드로클로라이드 H20, L-이소류신, L-류신, L-리신 히드로클로라이드, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 이나트륨 염, L-발린, 비오틴, 염화콜린, D-칼슘 판토테네이트, 엽산, 니아신아미드, 피리독살 히드로클로라이드, 리보플라빈, 티아민 히드로클로라이드, 비타민 B12, i-이노시톨, 염화칼슘(무수), 황산마그네슘(무수), 염화칼륨, 질산칼륨, 중탄산나트륨, 염화나트륨, 제1인산나트륨, 아셀레늄산나트륨, D-글루코오스, HEPES 및 피루브산나트륨을 임의의 절대 또는 상대 존재량 또는 농도로 포함하는 배지와 호환적으로 사용될 수 있다.
본원의 변형된 TSCM 및/또는 TCM을 포함하는 본원의 변형된 T 세포는 PI3K 경로 성분의 하나 이상의 억제제를 포함하는 성장 배지를 이용한 절차의 방법 내 임의의 단계에서 인큐베이션, 배양, 성장, 저장되거나 그 외 합해질 수 있다. PI3K 경로 성분의 예시적인 억제제는 TWS119(GSK 3B 억제제 XII로도 공지됨; 화학식 C18H14N4O2를 갖는 CAS 번호 601514-19-6)와 같은 GSK3β의 억제제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. PI3K 경로 성분의 예시적인 억제제는 bb007(블루버드바이오(BLUEBIRDBIO)™)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용되는 용어 "전기 천공" 및 "뉴클레오펙션"은 세포막(세포막, 핵막 또는 이들 모두)이 본 발명의 핵산, 트랜스포존, 벡터 또는 조성물에 대해 투과성이 되도록 또는 투과성이 커지도록 유도하는 전기 펄스를 제공함으로써 세포에 본 발명의 핵산, 트랜스포존, 벡터 또는 조성물을 전달하는 대안적인 수단을 기술하는 것을 의미한다.
뉴클레오펙션의 특정 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 큐벳(들)에서 동시에 수행된다. 뉴클레오펙션의 특정 실시양태에서, 방법은 2개의 큐벳에서 동시에 수행된다. 임상 또는 상업적 적용을 위해 더 큰 규모로 수행되는 공정에서, 예를 들어, 뉴클레오펙션은 많은 절차가 동시에 진행되는 대용량 카세트에서 수행될 수 있다. 뉴클레오펙션의 특정 실시양태에서, 인큐베이션 단계는 미리 가온시킨 T 세포 증식 조성물에서 다수의 1차 인간 T 세포를 포함하는 조성물을 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 인큐베이션 단계는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24시간 또는 그 사이의 임의의 수/부분 시간의 기간이 걸릴 수 있다. 인큐베이션 단계는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 또는 그 사이의 임의의 수/부분 일(day)의 기간이 걸릴 수 있다. 인큐베이션 단계는 적어도 1주일이 걸릴 수 있다. 뉴클레오펙션의 특정 실시양태에서, 인큐베이션 단계는 2일의 기간이 걸린다. 뉴클레오펙션의 특정 실시양태에서, 적용 단계는 하기 프로그램(들) EI-115, EI-151, EI-156, EI-158, EG-115, EG-142, EG-151, ES-115, ES-151, EO-151, EO-148, EO-156, EO-210, EO-213, 및 FI-156 중 하나 이상을 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 적용 단계는 하기 프로그램(들) EI-115, EI-151, EI-156, EI-158, EG-115, EG-142, EG-151, ES-115, ES-151, EO-151, EO-148, EO-156, EO-210, EO-213, 및 FI-156 중 하나 이상, 또는 각 펄스가 동일한 기간 및 강도, 및 실질적으로 유사한 펄스 사이의 기간을 갖는 동일한 횟수의 전기 펄스를 제공하는 프로그램을 적용하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 적용 단계는 론자 아막사(Lonza Amaxa), 맥스사이트 테크놀로지(MaxCyte technology), BTX 펄스애질(BTX PulseAgile) 및 바이오래드 진펄서(BioRad GenePulser)를 포함하나 이에 제한되지 않는 공지된 전기 천공/뉴클레오펙션 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 뉴클레오펙션의 특정 실시양태에서, 적용 단계는 적어도 1회의 전기 펄스를 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 뉴클레오펙션의 특정 실시양태에서, 적용 단계는 세포의 세포막 및/또는 핵막이 투과성이 되도록 유도하기에 충분한 적어도 1회의 전기 펄스를 본 발명의 조성물에 적용하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에서 제공된 양은 예시적이고 비제한적이지만, 이들 양(예를 들어, 비율 또는 상대 존재량) 사이의 관계를 사용하여 더 큰 규모의 공정 및 제조를 위해 본원에서 예시된 방법을 변형시킬 수 있다.
본 발명의 변형된 T 세포(예를 들어, TSCM 및/또는 TCM)를 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 활성화 보충물은 하나 이상의 사이토카인(들)을 포함한다. 하나 이상의 사이토카인(들)은 림포카인을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 사이토 카인을 포함할 수 있다. 예시적인 림포카인은 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-3(IL-3), 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-7(IL-7), 인터류킨-15(IL-15), 인터류킨-21(IL-21), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF: granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) 및 인터페론-감마(INFγ)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 사이토카인(들)은 IL-2를 포함할 수 있다.
본 발명의 변형된 T 세포(예를 들어, TSCM 및/또는 TCM)를 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 증식 보충물은 하나 이상의 사이토카인(들)을 포함한다. 하나 이상의 사이토카인(들)은 림포카인을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 사이토카인을 포함할 수 있다. 예시적인 림포카인은 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-3(IL-3), 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-7(IL-7), 인터류킨-15(IL-15), 인터류킨-21(IL-21), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 인터페론-감마(INFγ)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 사이토카인(들)은 IL-2를 포함할 수 있다.
본 발명의 변형된 T 세포(예를 들어, TSCM 및/또는 TCM)를 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포는 미접촉 T 세포이다. 미접촉 T 세포는 CD45RA, CCR7 및 CD62L을 발현할 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트의 미접촉 T 세포를 포함하는 세포 집단에 적용된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변형된 TSCM 및/또는 TCM의 생산 효율은 본 발명의 방법이 적용되는 세포 집단에서 미접촉 T 세포의 비율 또는 퍼센트를 증가시킴으로써 증가될 수 있다.
본 발명의 변형된 TSCM 및/또는 TCM을 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포는 기억 T 세포이다.
본원의 변형된 TSCM 및/또는 TCM을 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포는 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 발현한다.
본 발명의 변형된 TSCM 및/또는 TCM을 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포는 미접촉 T 세포(변형된 TN)이며 변형된 TN은 CD45RA, CCR7 및 CD62L 중 하나 이상을 발현한다. 본 발명의 변형된 TSCM 및/또는 TCM을 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포는 변형된 TSCM T 기억 줄기세포(변형된 TSCM)이며 변형된 TSCM은 CD45RA, CD95, IL-2Rβ, CR7, 및 CD62L 중 하나 이상을 발현한다. 본 발명의 변형된 TSCM 및/또는 TCM을 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포는 중심 기억 T 세포(변형된 TCM)이며 변형된 TCM은 CD45RO, CD95, IL-2Rβ, CCR7, 및 CD62L 중 하나 이상을 발현한다. 본 발명의 변형된 TSCM 및/또는 TCM을 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포는 이펙터 기억 T 세포(변형된 TEM)이며 변형된 TEM은 CD45RO, CD95 및 IL -2Rβ 중 하나 이상을 발현한다. 본 발명의 변형된 TSCM 및/또는 TCM을 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포는 이펙터 T 세포(변형된 TEFF)이며 변형된 TEFF는 CD45RA, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 발현한다.
본 발명의 변형된 TSCM 및/또는 TCM을 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포는 CD4 및/또는 CD8을 발현할 수 있다. 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포는 다양한 비율의 CD4 및/또는 CD8을 발현할 수 있다. 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포는 자연 발생적이지 않은 다양한 비율의 CD4 및/또는 CD8을 발현할 수 있다. 특정 실시양태에서, 자연 발생적이지 않을 수 있는 다양한 비율의 CD4 및/또는 CD8을 발현하는 1차 인간 T 세포는 이종 세포 집단이다.
본 발명의 변형된 TSCM 및/또는 TCM을 생성하는 방법의 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포는 예를 들어 전혈, 말초 혈액, 제대혈, 림프액, 림프절 조직, 골수 및 뇌척수액(CSF: cerebral spinal fluid)으로부터 단리, 제조 또는 유래될 수 있다, 본원에 사용되는 용어 "말초 혈액"은 순환 혈액 풀로부터 얻거나 제조되고 림프계, 비장, 간 또는 골수 내에 격리되지 않은 혈액의 세포 성분(예를 들어, 적혈구, 백혈구 및 혈소판)을 지칭한다. 제대혈은 림프계, 비장, 간 또는 골수 내에 격리된 혈액 및 말초 혈액과 구별된다. 용어 "제대혈", "태혈" 또는 "탯줄 혈액"은 호환적으로 사용될 수 있으며, 출산 후 태반에, 그리고 부착된 제대에 남아있는 혈액을 말한다. 탯줄 혈액은 종종 조혈 세포를 포함한 줄기세포를 포함한다.
본 발명의 1차 인간 T 세포는 pan T 세포를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 pan T 세포는 아형, 활성화 상태, 성숙 상태 또는 세포 표면 마커 발현에 의한 분류 없이 생물학적 샘플로부터 단리된 모든 T 림프구를 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 방법은 게놈 편집 구조물을 포함하는 조성물 또는 조성물을 변형된 TSCM 또는 TCM 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 게놈 편집 구조물은 가이드 RNA 및 CRISPR(클러스터된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복부) 관련 단백질 9(Cas9) DNA 엔도뉴클레아제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 게놈 편집 구조물은 DNA 결합 도메인 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 게놈 편집 구조물은 융합 단백질을 코딩한다. 특정 실시양태에서, 게놈 편집 구조물은 DNA 결합 도메인 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 코딩하며 여기서 발현된 DNA 결합 도메인관 발현된 IIS형 엔도뉴클레아제는 비공유적으로 결합된다. 게놈 편집 구조물이 DNA 결합 도메인 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 게놈 편집 구조물은 Cas9 엔도뉴클레아제에서 유래된 서열을 포함한다. 게놈 편집 구조물이 DNA 결합 도메인 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 DNA 결합 도메인이다. Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열이 DNA 결합 도메인인 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 불활성 Cas9를 코딩한다. Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열이 DNA 결합 도메인인 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 절두된 Cas9를 코딩한다. 특정 실시양태에서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 위치 10에서 아스파르트산(D)에서 알라닌(A)으로의 아미노산 치환(D10A)을 포함한다. 특정 실시양태에서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 위치 840에서 히스티딘(H)에서 알라닌(A)으로의 아미노산 치환(H840A)을 포함하거나 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 불활성화된 Cas9(dCas9)(서열 번호 33)를 포함한다. 특정 실시양태에서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 위치 580에서 아스파라긴(N)에서 알라닌(A)으로의 아미노산 치환(N580A)을 포함한다. 특정 실시양태에서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 절두되고 불활성화된 Cas9(dSaCas9)(서열 번호 32)를 포함한다. 게놈 편집 구조물이 DNA 결합 도메인 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 게놈 편집 구조물은 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)로부터 유래된 서열을 포함한다. 게놈 편집 구조물이 DNA 결합 도메인 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, TALEN으로부터 유래된 서열은 DNA 결합 도메인이다. 특정 실시양태에서, 게놈 편집 구조물은 TALEN을 포함한다. 게놈 편집 구조물이 DNA 결합 도메인 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 게놈 편집 구조물은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)로부터 유래된 서열을 포함한다. 게놈 편집 구조물이 DNA 결합 도메인 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, ZFN으로부터 유래된 서열은 DNA 결합 도메인이다. 특정 실시양태에서, 게놈 편집 구조물은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 포함한다.
본 발명의 변형된 TSCM 및/또는 TCM 세포를 생산하는 방법은 더 많은 수 또는 더 큰 비율의 변형된 TSCM 및/또는 TCM 세포를 생산하도록 최적화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 거친 세포 집단은 증가된 수 또는 더 큰 비율의 미접촉 T 세포를 함유하도록 농축될 수 있다. 본 발명의 방법을 거친 T 세포 집단에서의 미접촉 T 세포의 수 및/또는 비율이 증가함에 따라, 생산되는 본 발명의 TSCM 및/또는 TCM 세포의 수 및/또는 비율도 증가한다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 본 발명의 방법에 필요한 선행하는 시간 또는 기간의 길이가 감소함에 따라, 본 방법에 의해 생산되는 본 발명의 변형된 TSCM 및/또는 TCM 세포의 수 및/또는 비율이 증가한다. 본 발명의 방법에 필요한 선행하는 시간 또는 기간의 길이 또는 "제조 기간"은 또한 본 발명의 방법을 거치는 세포의 "수명 외 기간(out-of-life period)"이라고 지칭될 수 있다.
본 발명의 변형된 T 세포를 제조하는 방법의 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포는 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 발현한다. 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포는 미접촉 T 세포(TN)이며 TN은 하나 이상의 CD45RA, CCR7 및 CD62L 중 하나 이상을 발현한다. 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포는 T 기억 줄기세포(TSCM)이며 TSCM은 CD45RA, CD95, IL-2Rβ, CR7 및 CD62L 중 하나 이상을 발현한다. 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포는 중심 기억 T 세포(TCM)이며 TCM은 CD45RO, CD95, IL-2Rβ, CCR7 및 CD62L 중 하나 이상을 발현한다. 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포는 이펙터 기억 T 세포(TEM)이며 TEM은 CD45RO, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 발현한다. 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포는 이펙터 T 세포(TEFF)이며 TEFF는 CD45RA, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 발현한다. 특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포는 CD4 및/또는 CD8을 발현한다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 변형된 TSCM을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 변형된 TCM을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 변형된 TSCM 및 변형된 TCM을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 변형된 TSCM 및 변형된 TCM을 포함하는 조성물의 특정 실시양태에서, 다수의 TSCM은 조성물의 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99%를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 변형된 TSCM 및 변형된 TCM을 포함하는 조성물의 특정 실시양태에서, 다수의 TCM은 조성물의 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99%를 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 변형된 TSCM 및/또는 TCM을 포함하는 조성물의 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 의약의 제조를 위한 용도를 제공한다. 상기 용도의 특정 실시양태에서, 변형된 TSCM 및/또는 TCM은 자가 유래성이다. 상기 용도의 특정 실시양태에서, 변형된 TSCM 및/또는 TCM은 동종 이계성이다. 특정 실시양태에서, 항원 수용체는 T 세포 수용체이다. 특정 실시양태에서, T 세포 수용체는 자연 발생적이다. 특정 실시양태에서, T 세포 수용체는 자연 발생적이지 않다. 특정 실시양태에서, 특히, T 세포 수용체가 자연 발생적이지 않은 실시양태에서, T 세포 수용체는 야생형 T 세포 수용체와 비교하여 하나 이상의 돌연변이(들)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 특히, T 세포 수용체가 자연 발생적이지 않은 실시양태에서, T 세포 수용체는 재조합 T 세포 수용체이다. 특정 실시양태에서, 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 특정 실시양태에서, CAR은 CARTyrin이다. 특정 실시양태에서, CAR은 하나 이상의 VHH 서열(들)을 포함한다. 특정 실시양태에서, CAR은 VCAR이다.
본 발명은 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 변형된 TSCM 및/또는 TCM을 포함하는 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 TSCM 및/또는 TCM은 자가 유래성이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 TSCM 및/또는 TCM은 동종 이계성이다. 특정 실시양태에서, 항원 수용체는 T 세포 수용체이다. 특정 실시양태에서, T 세포 수용체는 자연 발생적이다. 특정 실시양태에서, T 세포 수용체는 자연 발생적이지 않다. 특정 실시양태에서, 특히, T 세포 수용체가 자연 발생적이지 않은 실시양태에서, T 세포 수용체는 야생형 T 세포 수용체와 비교하여 하나 이상의 돌연변이(들)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 특히, T 세포 수용체가 자연 발생적이지 않은 실시양태에서, T 세포 수용체는 재조합 T 세포 수용체이다. 특정 실시양태에서, 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 특정 실시양태에서, CAR은 CARTyrin이다. 특정 실시양태에서, CAR은 하나 이상의 VHH 서열(들)을 포함한다. 특정 실시양태에서, CAR은 VCAR이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 암이고 항원 수용체는 암 항원을 특이적으로 표적화한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 감염성 질환 또는 장애이고 항원 수용체는 바이러스, 박테리아, 효모 또는 미생물 항원을 특이적으로 표적화한다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 분비 단백질의 활성의 결여 또는 불충분한 양에 의해 유발되는 질환 또는 장애이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 치료 단백질의 활성의 대체 또는 치료 단백질의 양의 증가에 의해 치료되는 질환 또는 장애이다. 특정 실시양태에서, 치료 단백질은 분비 단백질이다. 특정 실시양태에서, 분비 단백질은 신체의 국소 영역 내에서 활성 또는 충분한 양이 결여되어있다. 특정 실시양태에서, 신체의 국소 영역은 천연 T 세포 또는 변형된 T 세포에 의해 접근 가능하다. 특정 실시양태에서, 변형된 T 세포는 생체 내, 생체 외, 시험관 내 또는 원위치에서 생산된다.
도 1은 실시예 1의 방법의 제11일에 CAR-TSCM 표현형의 출현을 나타내는 일련의 플롯이다. 세포를 대리(surrogate) CARTyrin 플라스미드로 뉴클레오펙션시켰다. CAR-TSCM 세포는 아래 두 플롯에 나타낸 바와 같이 CD62L과 CD45RA를 발현한다.
도 2는 제19일에 실시예 1의 방법에 의해 생산된 CAR-TSCM의 순도를 나타내는 일련의 플롯이다. 제19일에 실시예 1에 기재된 방법에 의해 생산된 CAR-TSCM 세포 집단은 B 세포 또는 림프구를 포함하지 않았다. 세포의 대부분은 CD3+ T 세포이다. 1.1%만이 자연 살해 세포이고 1.7%는 자연 살해 T 세포이다.
도 3은 실시예 1에 기재된 방법의 제11일에 T 세포의 대부분이 CARTyrin을 발현함을 나타내는 플롯이다.
도 4는 실시예 1에 기재된 방법의 제19일에 CAR-TSCM 표현형의 농축을 나타내는 일련의 플롯이다. 세포를 대리 CARTyrin 플라스미드로 뉴클레오펙션시켰다. CAR-TSCM 세포는 아래 두 플롯에 나타난 바와 같이 CD62L과 CD45RA를 발현한다.
도 5는 실시예 1에 기재된 방법의 제19일에 T 세포 고갈이 없음을 나타내는 일련의 플롯이다. 제19일에, 이 방법에 의해 생성된 세포 집단은 T 세포 활성화 및 고갈에 대한 마커인 PD1을 발현하지 않는다. CARTyrin을 발현하는 이들 세포는 제조 후 휴지 상태에 거의 성공적으로 도달하였다. 이들은 달리 PD1 발현 수준을 높이는 항원 비의존적(토닉) 신호전달의 징후를 보이지 않는다. 토닉 신호는 CAR T 세포 요법의 조기 고갈 및 효능 감소를 일으키는 일부 CAR 분자에 의해 야기되는 것으로 가정된다.
도 6a는 유도성 카스파제 폴리펩티드(안전 스위치, "iC9"), CARTyrin(항-BCMA), 및 선택 가능 마커를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포존을 코딩하는 서열을 함유하는 플라스미드로 전위된 T 세포를 나타내는 일련의 플롯이다. 왼쪽 플롯은 플라스미드의 부재하에서 트랜스포사제에 노출된 생존 T 세포를 나타낸다. 오른쪽 플롯은 플라스미드의 존재하에서 트랜스포사제에 노출된 생존 T 세포를 나타낸다. 세포는 과활성 트랜스포사제("슈퍼 피기백") 또는 야생형 피기백 트랜스포사제에 노출되었다.
도 6b는 녹색 형광 단백질(GFP: green fluorescent protein)을 코딩하는 서열을 함유하는 플라스미드로 전위된 T 세포를 나타내는 일련의 플롯이다. 왼쪽 플롯은 플라스미드의 부재하에서 트랜스포사제에 노출된 생존 T 세포를 나타낸다. 오른쪽 플롯은 플라스미드의 존재하에서 트랜스포사제에 노출된 생존 T 세포를 나타낸다. 세포는 과활성 트랜스포사제("슈퍼 피기백") 또는 야생형 피기백 트랜스포사제에 노출되었다.
도 6c는 과활성 피기백 트랜스포사제에 대한 WT로의 전위로 인해 형질전환된 T 세포의 비율(%)을 나타내는 표이다. 과활성 피기백 트랜스포사제(슈퍼 피기백 트랜스포사제)와 접촉된 T 세포는 WT 트랜스포사제보다 4배나 큰 비율로 형질전환되었다.
도 6d는 뉴클레오펙션 후 5일에 과활성 피기백 트랜스포사제에 대한 WT로의 전위로 인해 형질전환된 T 세포의 비율(%)을 나타내는 표이다. 과활성 피기백 트랜스포사제(슈퍼 피기백 트랜스포사제)와 접촉된 T 세포는 WT 트랜스포사제보다 훨씬 더 큰 비율로 형질전환되었다.
도 7은 피기백™- 및 렌티바이러스-생산된 CAR+ T 세포 사이의 표현형의 차이를 나타내는 그래프이다. CAR+ T 세포는 피기백 전위 또는 렌티바이러스 형질도입을 사용하여 생산하였다. 인간 pan T 세포를 CAR을 코딩하는 피기백으로 전위시키고, 전위 후 제2일에 항-CD3/CD28 비드로 자극하고, 증식하고, 전위 후 제19일에 조사하였다. 렌티바이러스를 사용한 생산을 위해, pan T 세포를 CD3/CD28 비드로 자극하고, CAR을 코딩하는 렌티바이러스(MOI 5)로 형질도입시키고, 증식하고, 자극 후 제18일에 조사하였다. 그런 후, CAR+ T 세포의 각 집단을 표준 기억 마커 CD62L, CD45RA 및 CD95의 발현에 기초하여 특성화하였다. 각 CAR+ T 세포 서브세트의 비율(%)은 미접촉(CD62L+CD45RA+), Tcm(CD62L+CD45RA-), Tem(CD62L-CD45RA-) 및 Teff(CD62L-CD45RA+)로 정의하였다. 모든 CAR+ T 세포는 CD95+였다.
도 8a 및 도 8b는 피기백™이 미접촉 T 세포를 우선적으로 전위시킴을 보여주는 한 쌍의 그래프이다. 인간 pan T 세포를 미접촉(CD62L+ CD45RA+), Tcm(CD62L+ CD45RA-), Tem(CD62L-CD45RA-) 및 Teff(CD62L-CD45RA+) 서브세트로 분류하였다(BD FACSAria II 유동 세포 계측기 사용). 분류된 서브세트를 각각 피기백-GFP로 전위시키거나 렌티바이러스-GFP로 형질도입시켰다. 전자 경우, 각각의 분류된 서브세트를 피기백-GFP로 전위시키고, 이식 후 제2일에 항-CD3/CD28 비드로 자극하고, 증식하고, 전위 후 제19일에 조사하였다. 후자 경우, 분류된 서브세트를 CD3/CD28 비드로 자극하고, GFP를 코딩하는 렌티바이러스(MOI 5)로 형질도입시키고, 증식하고, 자극 후 제19일에 조사하였다. n = 3 공여자.
도 9는 피기백™ 제조 공정에서 미접촉 T 세포가 드문 경우에도 다발성 골수종(MM: multiple myeloma) 환자의 샘플에서 TSCM이 높은 수준으로 생산됨을 보여주는 한 쌍의 그래프이다. MM 환자(삼각형)와 건강한 공여자(원)의 T 세포를 포세이다(Poseida) 제조 공정 전(왼쪽)과 후(오른쪽)에 유동 세포 분석으로 기억 마커 발현에 대해 특성화하였다. CD45RA 및 CD62L의 발현을 FACS로 평가하고, MM 환자 및 건강한 공여자에 대해 플롯을 나타낸다. MM 환자의 T 세포는 일반적으로, 이와는 반대인 건강한 정상 공여자의 T 세포와 달리, 미접촉 및 TSCM 세포의 빈도는 낮지만 Teff의 빈도는 높다고 공지되어 있다. 상이한 MM 환자의 미접촉 및 Tscm의 입력 빈도에 관계없이, 포세이다 제조 공정을 사용하여 P-BCMA-101을 생산하여 높은 수준의 CD8+ Tscm을 나타낸 산물을 얻었다(E). 이것은 적극적으로 치료를 받고 있는 MM 환자에도 적용되었다(적색 삼각형).
도 10은 슬리핑 뷰티(SB100x) 전위 시스템 및 본 발명의 방법으로 형질전환된 인간 pan T 세포에서 T 및 TSCM 세포 마커를 특성화하는 일련의 형광 활성화된 세포 분류(FACs: Fluorescence Activated Cell Sorting) 플롯이다. 슬리핑 뷰티(SB100x) 전위는 포세이다 제조 공정을 사용하여 Tscm 표현형을 우세하게 생산한다. 나타낸 바와 같이, 슬리핑 뷰티 또는 피기백 트랜스포존 플라스미드 및 SB100x 또는 SPB mRNA 각각의 1㎍을 사용하여 인간 pan T 세포를 전위시켰다. 전위 후, 생체 외에서 세포를 증식하고, 포세이다 제조 약물 선별 시스템을 사용하여 비전위된 모든 세포를 제거하였다. 배양 18일 후, 세포를 표현형 마커 CD4, CD8, CD45RA 및 CD62L로 염색하였다. 줄기세포 기억 표현형(Tscm)은 CD45RA 및 CD62L 이중 양성 세포로 정의되며 모든 샘플에서 세포의 > 65%를 차지한다. 한 열의 모든 패널은 공통된 x 축 및 y 축 매개 변수를 공유한다. 각 행에서 위에서 아래로, 2.5 마이크로그램(μg)의 슬리핑 뷰티 트랜스포존 SB100x(상단), 5 μg의 SB100x(상단에서 두 번째), 10 μg의 SB100x(상단에서 세 번째), 5 μg의 피기백 트랜스존 P-BCMA-101(하단에서 두 번째) 및 하단의 염색되지 않은 대조군으로 전위된 T 세포로부터의 데이터를 나타낸다. 첫 번째와 두 번째 열의 왼쪽에서 오른쪽 순서로 x 축은 전방 산란(Forward Scatter)(FSC)을 50k의 증가로 0에서 250,000(1000은 "k"로 축약함)까지의 단위로 나타낸다. 왼쪽에서 세 번째 열의 x 축은 CD8 발현을 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지로 적힌 눈금으로 나타낸다. 마지막 오른쪽 열은 CD62L 발현을 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지로 적힌 눈금으로 나타낸다. 첫 번째 열의 y 축은 측방 산란((Side Scatter)(SSC)을 50k의 증가로 0에서 250k까지의 단위로 나타낸다. 왼쪽에서 두 번째 열의 y 축은 세포 생존능 마커 7 아미노액티노마이신 D(7AAD)의 발현을 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지로 나타낸다. 왼쪽에서 세 번째 열의 y 축은 마커 CD4의 발현을 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지로 나타낸다. 오른쪽 열의 y 축은 마커 CD45RA의 발현을 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지로 나타낸다.
도 11은 혈액 응고를 유도하는 인간 응고 경로를 나타내는 개략도이다. 예를 들어 내피 손상에 의한 접촉 활성화는 내인성 응고 경로를 활성화한다. 조직 인자는 예를 들어 외상 후, 외인성 응고 경로를 활성화한다. 두 경로 모두는 프로트롬빈을 트롬빈으로의 전환에서 만나, 피브리노겐에서 피브린으로의 전환을 촉매한다. 혈소판과 함께 중합된 피브린은 응괴를 형성한다. 인자 IX(원)가 없는 경우 응고에 결함이 생긴다. 인자 VIII(FVIII) 결핍은 혈우병 A의 발생으로 이어진다. 인자 IX(FIX) 결핍은 혈우병 B의 발생으로 이어진다. 혈우병 B는 25,000 내지 30,000명 중 대략 1명의 빈도로 발생하는 희귀 질환이다. 혈우병 B 사례 중 60%가 중증이다. 혈우병 B 환자의 1% 미만이 정상적인 FIX 수준을 보인다. 본 발명의 조성물 및 방법 이전에, 혈우병 B에 대한 표준 치료는 연간 약 $ 250,000의 비용으로 2 내지 3일마다 재조합 인자 IX 단백질의 주입을 수반한다. 이 표준 치료 옵션과는 현저히 대조적으로, 본 발명의 TSCM 세포는 수십 년 동안 인간에서 유지된다.
도 12는 FIX 분비 T 세포를 나타내는 일련의 형광 활성화된 세포 분류(FACS 플롯)이다. 인간 인자 IX 전이유전자를 코딩하는 T 세포는 세포의 약 80%에서 TSCM 표현형을 보였다. 6개의 패널은 왼쪽에서 오른쪽 순서로 설명한다. (1) x 축의 전방 산란(FSC) 대 y 축의 측방 산란(SSC). x 축은 50k의 증가로 0에서 250,000(1000은 k로 축약함)까지이고, y 축은 50k의 증가로 0에서 250k까지이다. (2) x 축의 FSC 대 세포 생존능 마커 7 아미노액티노마이신 D(7AAD). x 축은 50k의 증가로 0에서 250k까지로 표시된다. y 축은 위에서 아래로 -103, 0, 103, 104, 105로 나타낸다. (3) x 축에는 Cy7 염료에 컨쥬게이션된 항-CD56-APC(CDC56-APC-Cy7)을 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지의 단위로 나타낸다. y 축에는 피코에리트린(PE)에 컨쥬게이션된 항-CD3을 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지의 단위로 나타낸다. (4) X 축에는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)에 컨쥬게이션된 항-CD8을 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지의 단위로 나타낸다. y 축에는 브릴리언트 바이올렛(Brilliant Violet) 650 염료(BV650)에 컨쥬게이션된 항-CD4을 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지의 단위로 나타낸다. (5) X 축에는 브릴리언트 바이올렛 421 염료(BV421)에 컨쥬게이션된 항 CD62L 항체를 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지의 단위로 나타낸다. y 축에는 PE 및 Cy7에 컨쥬게이션된 항-CD45RA 항체를 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지의 단위로 나타낸다. 이 패널은 상자로 표시되어 있다. (6) x 축에는 브릴리언트 바이올렛 786(BV786)에 컨쥬게이션된 항-CCR7 항체를 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지의 단위로 나타낸다. y 축에서 PE 및 Cy7에 컨쥬게이션된 항-CD45RA를 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지의 단위로 나타낸다.
도 13a는 본 발명의 변형된 T 세포의 생산 중에 인간 인자 IX 분비를 나타내는 그래프이다. Y 축에는 밀리리터(mL)당 나노그램(ng)의 인자 IX 농도를 20의 증가로 0에서 80까지 나타낸다. x 축에는 9일 및 12일의 T 세포를 나타낸다.
도 13b는 T 세포에 의해 생산된 분비 인간 인자 IX의 응고 활성을 나타내는 그래프이다. y 축에는 인간 혈장에 대한 인자 IX 활성(%)을 2의 증가로 0에서 8까지 나타낸다. x 축은 9일 및 12일의 T 세포를 나타낸다.
도 14a 내지 도 14e는 HR 또는 MMEJ 및 상응하는 서열을 사용하여 AAVS1 부위로의 부위 특이적 통합을 위한 일련의 플라스미드 지도이다. A) 부위 특이적 (AAVS1) 상동 재조합(HR: homologous recombination), B) 부위 특이적 (AAVS1) 미세 상동성 매개 말단 결합(MMEJ: microhomology-mediated end-joining) 재조합 및 C) TTAA 특이적 피기백™ 전위를 통한 인간 pan T 세포의 게놈으로의 안정한 통합을 시험하기 위한 공여 플라스미드. HR 및 MMEJ 공여 플라스미드의 경우, GFP-2A-DHFR 유전자 발현 카세트는 AAVS1 부위 통합을 위한 상동성 암(arm) 및 CRISPR/Cas9 표적화 부위가 측면에 위치하였다; 피기백™ 공여 플라스미드의 경우, GFP-2A-DHFR 유전자 발현 카세트는 피기백™ 트랜스포존 요소가 측면에 위치한다. HR 및 MMEJ 플라스미드를 위한 상동성 암은 각각 500 bp 및 25 bp이다. 패널 D 및 E, 및 F는 각각 서열 번호 41 및 42를 나타낸다.
도 15는 뉴클레오펙션 후 3일에 1차 인간 pan T 세포에서 전이유전자(GFP) 발현을 나타내는 그래프이다. CRISPR 리보 뉴클레오티드(RNP) 표적화 시약이 있거나 없이 HR 또는 MMEJ 공여 플라스미드를 뉴클레오펙션을 통해 pan T 세포에 동시에 전달하였다. 대조군으로서 공여 플라스미드만을 받은 T 세포를 포함하였다. pan T 세포를 또한 피기백™ 트랜스포존 전달 시스템을 사용하여 변형시켰다. 제0일에 TCR 자극을 통해 T 세포를 활성화하고, 뉴클레오펙션 후 제3일에 유세포 분석에 의해 GFP+ T 세포 비율(%)을 평가하였으며 데이터를 막대그래프로 요약한다.
도 16은 뉴클레오펙션 후 11일에 1차 인간 pan T 세포에서 전이유전자(GFP) 발현 및 선별을 나타내는 그래프이다. 비시스트론(bi-cistronic) GFP-2A-DHFR 통합 카세트에 코딩된 DHFR 선별 유전자를 사용하여 메토트렉세이트를 첨가하여 안정적으로 통합된 전이유전자를 가진 활성화된 T 세포를 선별하였다. 뉴클레오펙션 후 제11일에 유세포 분석에 의해 GFP+ T 세포 비율(%)을 측정하였으며 데이터를 막대그래프로 요약한다. 전위 시약, RNP + HR 또는 MMEJ 공여 플라스미드를 받은 pan T 세포에서 선별을 통해 GFP+ 세포는 매우 농축되었지만, 공여 플라스미드만을 투여하는 T 세포에서는 그렇지 않았다.
도 17a 내지 도 17c는 AAVS1 부위에서 HR 및 MMEJ에 의해 변형된 1차 인간 pan T 세포의 표현형을 나타내는 일련의 그래프이다. 뉴클레오펙션 후 제11일에 유동 분석에 의해 GFP+ CD8+ pan T 세포의 표현형을 분석하였다. A) 세포를 7AAD(세포 생존능), CD4, CD8, CD45RA 및 CD62L로 염색하였고, FACS 플롯은 게이팅 전략을 나타낸다. CD45RA+CD62L+(줄기세포 기억 T 세포(Tscm)), CD45RA-CD62L+(중심 기억 T 세포(Tcm)), CD45RA-CD62L-(이펙터 기억 T 세포(Tem)) 및 CD45RA+CD62L-(T 이펙터(Teff))의 발현에 의해 CD8+ 세포 서브세트를 정의하였다. B) 각 T 세포 서브세트에서 전체 GFP+ CD8+ T 세포의 비율(%)을 막대그래프로 요약한다. Cas9 RNP와 함께 피기백™ 트랜스포존 시스템, 또는 HR 및 MMEJ를 사용하여 모든 경우에서 농축된 GFP+ Tscm 집단을 달성하였다. C) 뉴클레오펙션 후 제13일에 pan T 세포의 전체 수를 분석하고 데이터를 막대그래프로 요약한다.
도 18a 내지 도 18b는 AAVS1 부위로의 부위 특이적 통합을 나타내는 겔 전기영동 결과의 한 쌍의 사진이다. 각각의 군에서 선별된 세포를 수거하고 게놈 DNA를 추출하여 PCR의 주형으로 사용하여 A) HR 및 B) MMEJ를 위한 AAVS1 부위로의 부위 특이적 통합을 확인하였다. 2쌍의 프라이머는 개별적으로 AAVS1 표적 부위의 5'-말단 연결부분[삽입의 프로모터 영역을 프라이밍하는 하나의 프라이머 EF1a-2r CACCGGAGCCAATTCCCACT (서열 번호 36) 및 5' 말단에서 500bp 상동성 암을 넘어 AAVS1 영역을 프라이밍하는 다른 프라이머 AAVS-3r CTGCACCACGTGATGTCCTC (서열 번호 37)로 HR 또는 MMEJ 모두에 대해 0.73 kb DNA 단편을 얻음] 및 3'-말단 연결부분[폴리 A 신호 영역을 프라이밍하는 하나의 프라이머 SV40pA-1r GTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAG (서열 번호 38) 및 500bp 5' 상동성 암을 넘어 AAVS1 영역을 프라이밍하는 다른 프라이머 AAVS-2f CTGGGGACTCTTTAAGGAAAGAAG (서열 번호 39)로 HR 또는 MMEJ에 대해 0.76kb DNA 절편을 얻음]를 증폭한다. PCR 산물을 아가로오스 겔에 나타냈다. HR 샘플에서 비특이적 밴드는 단 한 번의 라운드만으로 얻은 결과이며 추가적인 라운드를 제공하였을 경우 아마도 분석되었을 것이다.
도 2는 제19일에 실시예 1의 방법에 의해 생산된 CAR-TSCM의 순도를 나타내는 일련의 플롯이다. 제19일에 실시예 1에 기재된 방법에 의해 생산된 CAR-TSCM 세포 집단은 B 세포 또는 림프구를 포함하지 않았다. 세포의 대부분은 CD3+ T 세포이다. 1.1%만이 자연 살해 세포이고 1.7%는 자연 살해 T 세포이다.
도 3은 실시예 1에 기재된 방법의 제11일에 T 세포의 대부분이 CARTyrin을 발현함을 나타내는 플롯이다.
도 4는 실시예 1에 기재된 방법의 제19일에 CAR-TSCM 표현형의 농축을 나타내는 일련의 플롯이다. 세포를 대리 CARTyrin 플라스미드로 뉴클레오펙션시켰다. CAR-TSCM 세포는 아래 두 플롯에 나타난 바와 같이 CD62L과 CD45RA를 발현한다.
도 5는 실시예 1에 기재된 방법의 제19일에 T 세포 고갈이 없음을 나타내는 일련의 플롯이다. 제19일에, 이 방법에 의해 생성된 세포 집단은 T 세포 활성화 및 고갈에 대한 마커인 PD1을 발현하지 않는다. CARTyrin을 발현하는 이들 세포는 제조 후 휴지 상태에 거의 성공적으로 도달하였다. 이들은 달리 PD1 발현 수준을 높이는 항원 비의존적(토닉) 신호전달의 징후를 보이지 않는다. 토닉 신호는 CAR T 세포 요법의 조기 고갈 및 효능 감소를 일으키는 일부 CAR 분자에 의해 야기되는 것으로 가정된다.
도 6a는 유도성 카스파제 폴리펩티드(안전 스위치, "iC9"), CARTyrin(항-BCMA), 및 선택 가능 마커를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포존을 코딩하는 서열을 함유하는 플라스미드로 전위된 T 세포를 나타내는 일련의 플롯이다. 왼쪽 플롯은 플라스미드의 부재하에서 트랜스포사제에 노출된 생존 T 세포를 나타낸다. 오른쪽 플롯은 플라스미드의 존재하에서 트랜스포사제에 노출된 생존 T 세포를 나타낸다. 세포는 과활성 트랜스포사제("슈퍼 피기백") 또는 야생형 피기백 트랜스포사제에 노출되었다.
도 6b는 녹색 형광 단백질(GFP: green fluorescent protein)을 코딩하는 서열을 함유하는 플라스미드로 전위된 T 세포를 나타내는 일련의 플롯이다. 왼쪽 플롯은 플라스미드의 부재하에서 트랜스포사제에 노출된 생존 T 세포를 나타낸다. 오른쪽 플롯은 플라스미드의 존재하에서 트랜스포사제에 노출된 생존 T 세포를 나타낸다. 세포는 과활성 트랜스포사제("슈퍼 피기백") 또는 야생형 피기백 트랜스포사제에 노출되었다.
도 6c는 과활성 피기백 트랜스포사제에 대한 WT로의 전위로 인해 형질전환된 T 세포의 비율(%)을 나타내는 표이다. 과활성 피기백 트랜스포사제(슈퍼 피기백 트랜스포사제)와 접촉된 T 세포는 WT 트랜스포사제보다 4배나 큰 비율로 형질전환되었다.
도 6d는 뉴클레오펙션 후 5일에 과활성 피기백 트랜스포사제에 대한 WT로의 전위로 인해 형질전환된 T 세포의 비율(%)을 나타내는 표이다. 과활성 피기백 트랜스포사제(슈퍼 피기백 트랜스포사제)와 접촉된 T 세포는 WT 트랜스포사제보다 훨씬 더 큰 비율로 형질전환되었다.
도 7은 피기백™- 및 렌티바이러스-생산된 CAR+ T 세포 사이의 표현형의 차이를 나타내는 그래프이다. CAR+ T 세포는 피기백 전위 또는 렌티바이러스 형질도입을 사용하여 생산하였다. 인간 pan T 세포를 CAR을 코딩하는 피기백으로 전위시키고, 전위 후 제2일에 항-CD3/CD28 비드로 자극하고, 증식하고, 전위 후 제19일에 조사하였다. 렌티바이러스를 사용한 생산을 위해, pan T 세포를 CD3/CD28 비드로 자극하고, CAR을 코딩하는 렌티바이러스(MOI 5)로 형질도입시키고, 증식하고, 자극 후 제18일에 조사하였다. 그런 후, CAR+ T 세포의 각 집단을 표준 기억 마커 CD62L, CD45RA 및 CD95의 발현에 기초하여 특성화하였다. 각 CAR+ T 세포 서브세트의 비율(%)은 미접촉(CD62L+CD45RA+), Tcm(CD62L+CD45RA-), Tem(CD62L-CD45RA-) 및 Teff(CD62L-CD45RA+)로 정의하였다. 모든 CAR+ T 세포는 CD95+였다.
도 8a 및 도 8b는 피기백™이 미접촉 T 세포를 우선적으로 전위시킴을 보여주는 한 쌍의 그래프이다. 인간 pan T 세포를 미접촉(CD62L+ CD45RA+), Tcm(CD62L+ CD45RA-), Tem(CD62L-CD45RA-) 및 Teff(CD62L-CD45RA+) 서브세트로 분류하였다(BD FACSAria II 유동 세포 계측기 사용). 분류된 서브세트를 각각 피기백-GFP로 전위시키거나 렌티바이러스-GFP로 형질도입시켰다. 전자 경우, 각각의 분류된 서브세트를 피기백-GFP로 전위시키고, 이식 후 제2일에 항-CD3/CD28 비드로 자극하고, 증식하고, 전위 후 제19일에 조사하였다. 후자 경우, 분류된 서브세트를 CD3/CD28 비드로 자극하고, GFP를 코딩하는 렌티바이러스(MOI 5)로 형질도입시키고, 증식하고, 자극 후 제19일에 조사하였다. n = 3 공여자.
도 9는 피기백™ 제조 공정에서 미접촉 T 세포가 드문 경우에도 다발성 골수종(MM: multiple myeloma) 환자의 샘플에서 TSCM이 높은 수준으로 생산됨을 보여주는 한 쌍의 그래프이다. MM 환자(삼각형)와 건강한 공여자(원)의 T 세포를 포세이다(Poseida) 제조 공정 전(왼쪽)과 후(오른쪽)에 유동 세포 분석으로 기억 마커 발현에 대해 특성화하였다. CD45RA 및 CD62L의 발현을 FACS로 평가하고, MM 환자 및 건강한 공여자에 대해 플롯을 나타낸다. MM 환자의 T 세포는 일반적으로, 이와는 반대인 건강한 정상 공여자의 T 세포와 달리, 미접촉 및 TSCM 세포의 빈도는 낮지만 Teff의 빈도는 높다고 공지되어 있다. 상이한 MM 환자의 미접촉 및 Tscm의 입력 빈도에 관계없이, 포세이다 제조 공정을 사용하여 P-BCMA-101을 생산하여 높은 수준의 CD8+ Tscm을 나타낸 산물을 얻었다(E). 이것은 적극적으로 치료를 받고 있는 MM 환자에도 적용되었다(적색 삼각형).
도 10은 슬리핑 뷰티(SB100x) 전위 시스템 및 본 발명의 방법으로 형질전환된 인간 pan T 세포에서 T 및 TSCM 세포 마커를 특성화하는 일련의 형광 활성화된 세포 분류(FACs: Fluorescence Activated Cell Sorting) 플롯이다. 슬리핑 뷰티(SB100x) 전위는 포세이다 제조 공정을 사용하여 Tscm 표현형을 우세하게 생산한다. 나타낸 바와 같이, 슬리핑 뷰티 또는 피기백 트랜스포존 플라스미드 및 SB100x 또는 SPB mRNA 각각의 1㎍을 사용하여 인간 pan T 세포를 전위시켰다. 전위 후, 생체 외에서 세포를 증식하고, 포세이다 제조 약물 선별 시스템을 사용하여 비전위된 모든 세포를 제거하였다. 배양 18일 후, 세포를 표현형 마커 CD4, CD8, CD45RA 및 CD62L로 염색하였다. 줄기세포 기억 표현형(Tscm)은 CD45RA 및 CD62L 이중 양성 세포로 정의되며 모든 샘플에서 세포의 > 65%를 차지한다. 한 열의 모든 패널은 공통된 x 축 및 y 축 매개 변수를 공유한다. 각 행에서 위에서 아래로, 2.5 마이크로그램(μg)의 슬리핑 뷰티 트랜스포존 SB100x(상단), 5 μg의 SB100x(상단에서 두 번째), 10 μg의 SB100x(상단에서 세 번째), 5 μg의 피기백 트랜스존 P-BCMA-101(하단에서 두 번째) 및 하단의 염색되지 않은 대조군으로 전위된 T 세포로부터의 데이터를 나타낸다. 첫 번째와 두 번째 열의 왼쪽에서 오른쪽 순서로 x 축은 전방 산란(Forward Scatter)(FSC)을 50k의 증가로 0에서 250,000(1000은 "k"로 축약함)까지의 단위로 나타낸다. 왼쪽에서 세 번째 열의 x 축은 CD8 발현을 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지로 적힌 눈금으로 나타낸다. 마지막 오른쪽 열은 CD62L 발현을 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지로 적힌 눈금으로 나타낸다. 첫 번째 열의 y 축은 측방 산란((Side Scatter)(SSC)을 50k의 증가로 0에서 250k까지의 단위로 나타낸다. 왼쪽에서 두 번째 열의 y 축은 세포 생존능 마커 7 아미노액티노마이신 D(7AAD)의 발현을 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지로 나타낸다. 왼쪽에서 세 번째 열의 y 축은 마커 CD4의 발현을 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지로 나타낸다. 오른쪽 열의 y 축은 마커 CD45RA의 발현을 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지로 나타낸다.
도 11은 혈액 응고를 유도하는 인간 응고 경로를 나타내는 개략도이다. 예를 들어 내피 손상에 의한 접촉 활성화는 내인성 응고 경로를 활성화한다. 조직 인자는 예를 들어 외상 후, 외인성 응고 경로를 활성화한다. 두 경로 모두는 프로트롬빈을 트롬빈으로의 전환에서 만나, 피브리노겐에서 피브린으로의 전환을 촉매한다. 혈소판과 함께 중합된 피브린은 응괴를 형성한다. 인자 IX(원)가 없는 경우 응고에 결함이 생긴다. 인자 VIII(FVIII) 결핍은 혈우병 A의 발생으로 이어진다. 인자 IX(FIX) 결핍은 혈우병 B의 발생으로 이어진다. 혈우병 B는 25,000 내지 30,000명 중 대략 1명의 빈도로 발생하는 희귀 질환이다. 혈우병 B 사례 중 60%가 중증이다. 혈우병 B 환자의 1% 미만이 정상적인 FIX 수준을 보인다. 본 발명의 조성물 및 방법 이전에, 혈우병 B에 대한 표준 치료는 연간 약 $ 250,000의 비용으로 2 내지 3일마다 재조합 인자 IX 단백질의 주입을 수반한다. 이 표준 치료 옵션과는 현저히 대조적으로, 본 발명의 TSCM 세포는 수십 년 동안 인간에서 유지된다.
도 12는 FIX 분비 T 세포를 나타내는 일련의 형광 활성화된 세포 분류(FACS 플롯)이다. 인간 인자 IX 전이유전자를 코딩하는 T 세포는 세포의 약 80%에서 TSCM 표현형을 보였다. 6개의 패널은 왼쪽에서 오른쪽 순서로 설명한다. (1) x 축의 전방 산란(FSC) 대 y 축의 측방 산란(SSC). x 축은 50k의 증가로 0에서 250,000(1000은 k로 축약함)까지이고, y 축은 50k의 증가로 0에서 250k까지이다. (2) x 축의 FSC 대 세포 생존능 마커 7 아미노액티노마이신 D(7AAD). x 축은 50k의 증가로 0에서 250k까지로 표시된다. y 축은 위에서 아래로 -103, 0, 103, 104, 105로 나타낸다. (3) x 축에는 Cy7 염료에 컨쥬게이션된 항-CD56-APC(CDC56-APC-Cy7)을 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지의 단위로 나타낸다. y 축에는 피코에리트린(PE)에 컨쥬게이션된 항-CD3을 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지의 단위로 나타낸다. (4) X 축에는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)에 컨쥬게이션된 항-CD8을 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지의 단위로 나타낸다. y 축에는 브릴리언트 바이올렛(Brilliant Violet) 650 염료(BV650)에 컨쥬게이션된 항-CD4을 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지의 단위로 나타낸다. (5) X 축에는 브릴리언트 바이올렛 421 염료(BV421)에 컨쥬게이션된 항 CD62L 항체를 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지의 단위로 나타낸다. y 축에는 PE 및 Cy7에 컨쥬게이션된 항-CD45RA 항체를 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지의 단위로 나타낸다. 이 패널은 상자로 표시되어 있다. (6) x 축에는 브릴리언트 바이올렛 786(BV786)에 컨쥬게이션된 항-CCR7 항체를 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지의 단위로 나타낸다. y 축에서 PE 및 Cy7에 컨쥬게이션된 항-CD45RA를 10의 거듭제곱으로 증가하는 0에서 105까지의 단위로 나타낸다.
도 13a는 본 발명의 변형된 T 세포의 생산 중에 인간 인자 IX 분비를 나타내는 그래프이다. Y 축에는 밀리리터(mL)당 나노그램(ng)의 인자 IX 농도를 20의 증가로 0에서 80까지 나타낸다. x 축에는 9일 및 12일의 T 세포를 나타낸다.
도 13b는 T 세포에 의해 생산된 분비 인간 인자 IX의 응고 활성을 나타내는 그래프이다. y 축에는 인간 혈장에 대한 인자 IX 활성(%)을 2의 증가로 0에서 8까지 나타낸다. x 축은 9일 및 12일의 T 세포를 나타낸다.
도 14a 내지 도 14e는 HR 또는 MMEJ 및 상응하는 서열을 사용하여 AAVS1 부위로의 부위 특이적 통합을 위한 일련의 플라스미드 지도이다. A) 부위 특이적 (AAVS1) 상동 재조합(HR: homologous recombination), B) 부위 특이적 (AAVS1) 미세 상동성 매개 말단 결합(MMEJ: microhomology-mediated end-joining) 재조합 및 C) TTAA 특이적 피기백™ 전위를 통한 인간 pan T 세포의 게놈으로의 안정한 통합을 시험하기 위한 공여 플라스미드. HR 및 MMEJ 공여 플라스미드의 경우, GFP-2A-DHFR 유전자 발현 카세트는 AAVS1 부위 통합을 위한 상동성 암(arm) 및 CRISPR/Cas9 표적화 부위가 측면에 위치하였다; 피기백™ 공여 플라스미드의 경우, GFP-2A-DHFR 유전자 발현 카세트는 피기백™ 트랜스포존 요소가 측면에 위치한다. HR 및 MMEJ 플라스미드를 위한 상동성 암은 각각 500 bp 및 25 bp이다. 패널 D 및 E, 및 F는 각각 서열 번호 41 및 42를 나타낸다.
도 15는 뉴클레오펙션 후 3일에 1차 인간 pan T 세포에서 전이유전자(GFP) 발현을 나타내는 그래프이다. CRISPR 리보 뉴클레오티드(RNP) 표적화 시약이 있거나 없이 HR 또는 MMEJ 공여 플라스미드를 뉴클레오펙션을 통해 pan T 세포에 동시에 전달하였다. 대조군으로서 공여 플라스미드만을 받은 T 세포를 포함하였다. pan T 세포를 또한 피기백™ 트랜스포존 전달 시스템을 사용하여 변형시켰다. 제0일에 TCR 자극을 통해 T 세포를 활성화하고, 뉴클레오펙션 후 제3일에 유세포 분석에 의해 GFP+ T 세포 비율(%)을 평가하였으며 데이터를 막대그래프로 요약한다.
도 16은 뉴클레오펙션 후 11일에 1차 인간 pan T 세포에서 전이유전자(GFP) 발현 및 선별을 나타내는 그래프이다. 비시스트론(bi-cistronic) GFP-2A-DHFR 통합 카세트에 코딩된 DHFR 선별 유전자를 사용하여 메토트렉세이트를 첨가하여 안정적으로 통합된 전이유전자를 가진 활성화된 T 세포를 선별하였다. 뉴클레오펙션 후 제11일에 유세포 분석에 의해 GFP+ T 세포 비율(%)을 측정하였으며 데이터를 막대그래프로 요약한다. 전위 시약, RNP + HR 또는 MMEJ 공여 플라스미드를 받은 pan T 세포에서 선별을 통해 GFP+ 세포는 매우 농축되었지만, 공여 플라스미드만을 투여하는 T 세포에서는 그렇지 않았다.
도 17a 내지 도 17c는 AAVS1 부위에서 HR 및 MMEJ에 의해 변형된 1차 인간 pan T 세포의 표현형을 나타내는 일련의 그래프이다. 뉴클레오펙션 후 제11일에 유동 분석에 의해 GFP+ CD8+ pan T 세포의 표현형을 분석하였다. A) 세포를 7AAD(세포 생존능), CD4, CD8, CD45RA 및 CD62L로 염색하였고, FACS 플롯은 게이팅 전략을 나타낸다. CD45RA+CD62L+(줄기세포 기억 T 세포(Tscm)), CD45RA-CD62L+(중심 기억 T 세포(Tcm)), CD45RA-CD62L-(이펙터 기억 T 세포(Tem)) 및 CD45RA+CD62L-(T 이펙터(Teff))의 발현에 의해 CD8+ 세포 서브세트를 정의하였다. B) 각 T 세포 서브세트에서 전체 GFP+ CD8+ T 세포의 비율(%)을 막대그래프로 요약한다. Cas9 RNP와 함께 피기백™ 트랜스포존 시스템, 또는 HR 및 MMEJ를 사용하여 모든 경우에서 농축된 GFP+ Tscm 집단을 달성하였다. C) 뉴클레오펙션 후 제13일에 pan T 세포의 전체 수를 분석하고 데이터를 막대그래프로 요약한다.
도 18a 내지 도 18b는 AAVS1 부위로의 부위 특이적 통합을 나타내는 겔 전기영동 결과의 한 쌍의 사진이다. 각각의 군에서 선별된 세포를 수거하고 게놈 DNA를 추출하여 PCR의 주형으로 사용하여 A) HR 및 B) MMEJ를 위한 AAVS1 부위로의 부위 특이적 통합을 확인하였다. 2쌍의 프라이머는 개별적으로 AAVS1 표적 부위의 5'-말단 연결부분[삽입의 프로모터 영역을 프라이밍하는 하나의 프라이머 EF1a-2r CACCGGAGCCAATTCCCACT (서열 번호 36) 및 5' 말단에서 500bp 상동성 암을 넘어 AAVS1 영역을 프라이밍하는 다른 프라이머 AAVS-3r CTGCACCACGTGATGTCCTC (서열 번호 37)로 HR 또는 MMEJ 모두에 대해 0.73 kb DNA 단편을 얻음] 및 3'-말단 연결부분[폴리 A 신호 영역을 프라이밍하는 하나의 프라이머 SV40pA-1r GTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAG (서열 번호 38) 및 500bp 5' 상동성 암을 넘어 AAVS1 영역을 프라이밍하는 다른 프라이머 AAVS-2f CTGGGGACTCTTTAAGGAAAGAAG (서열 번호 39)로 HR 또는 MMEJ에 대해 0.76kb DNA 절편을 얻음]를 증폭한다. PCR 산물을 아가로오스 겔에 나타냈다. HR 샘플에서 비특이적 밴드는 단 한 번의 라운드만으로 얻은 결과이며 추가적인 라운드를 제공하였을 경우 아마도 분석되었을 것이다.
본 발명은 강력한 CAR 활성을 갖는 줄기세포 기억 T 세포(TSCM)(본원에서 CAR-TSCM으로 지칭됨)를 보존하거나 유도하는 조건하에 피기백™ 트랜스포존 시스템을 사용하여 인간 키메라 항원 수용체(CAR) 발현 T 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법을 사용하여 생산된 CAR-TSCM을 포함하는 조성물은 ≥60% CAR-TSCM을 포함하고 상기 T 세포 서브세트와 일치하는 뚜렷한 기능적 프로파일을 나타낸다. 본 발명의 조성물에서 발견된 다른 T 세포 서브세트는 중심 기억 CAR-T 세포(CAR-TCM), 이펙터 기억 CAR-T 세포(CAR-TEM), 이펙터 CAR-T 세포(CAR-TE), 및 말단 분화된 이펙터 CAR-T 세포(CAR-TTE)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 선형 경로의 분화가 이들 세포의 생성을 담당할 수 있다: 미접촉 T 세포(TN) > TSCM > TCM > TEM > TE > TTE, 이로써 TN은 TSCM을 직접적으로 발생시키는 부모 전구체이며, 그 후 차례로 TCM 등을 직접 발생시킨다. 본 발명의 CAR-TSCM, CARTyrin-TSCM 및/또는 VCAR-TSCM을 포함하는 조성물은 CAR-TSCM이 가장 풍부하게 존재하면서 하나 이상의 각 부모 CAR-T 세포 서브세트(예를 들어, TSCM > TCM > TEM > TE > TTE)를 포함할 수 있다. 각 부모 T 세포 서브세트의 절대적인 양/존재량 및 상대적인 비율은 환자 혈액 및 자연 발생 세포 집단 샘플 간에 다양할 수 있으며, 자연 발생 세포 집단은 높은 존재량 및/또는 비율의 TSCM을 가질 수 있지만, 비자연 발생 CAR-TSCM을 포함하는 본 발명의 조성물이 질환 및 암에 대해 환자를 치료하는데 보다 강력하고 효과적이다.
키메라-항원 수용체(CAR)-T 세포를 사용한 면역 요법은 암 요법에 대한 흥미로운 치료법으로 부상하고 있다. 종양 관련 항원(Ag)을 표적화하는 자가 유래 CAR 변형된 T 세포는 강력한 종양 살해를 일으킬 수 있으며, 일부 경우에 CD19+ 혈액 악성 종양의 완전한 완화를 가져올 수 있다. 종래의 생물학적 제제 및 화학 치료법과는 달리, CAR-T 세포는 Ag 인식시 신속하게 재생하는 능력을 보유함으로써, 잠재적으로 반복 치료의 필요성을 없애준다. 이를 달성하기 위해, CAR-T 세포는 초기에 종양 파괴를 유발할 뿐만 아니라 잠재적인 암 재발을 예방하기 위해 생존 가능한 기억 T 세포의 안정한 집단으로서 환자에서 존속되어야 한다. 따라서 초기 기억 세포, 특히 줄기세포 기억(TSCM)을 함유하는 CAR-T 산물뿐만 아니라 Ag 비의존성(토닉) 신호전달을 통한 T 세포 고갈을 일으키지 않는 CAR 분자의 개발에 집중적으로 노력해왔다. 줄기세포 유사 CAR-T는 최대한의 자가 재생 능력 및 중심 기억(TCM), 이펙터 기억(TEM) 및 이펙터 T 세포(TE)를 유도하는 다능성 능력을 나타냄으로써 더 우수한 종양 제거 및 장기적인 CAR-T 생착을 가져올 것이다.
본 발명의 CAR-TSCM은 CARTyrin이라고 지칭되는 Centyrin 기반 CAR을 포함할 수 있다(따라서, 세포는 CARTyrin-TSCM으로 지칭될 수 있음). Centyrin은 인간 컨센서스 테나신(tenascin) FN3 도메인을 기반으로 하는 또 다른 스캐폴드 분자이며, scFv 분자보다 작으며, 안정성을 높이고 CAR 분자에서 토닉 신호전달의 가능성을 감소시키는 단량체 특성에 대해 선별될 수 있다. 본 발명의 CARTyrin은 부적절한 유전자 활성화 또는 사일런싱(silencing)을 차단하여 CARTyrin 발현을 안정화하는데 도움을 주기 위해 2개의 시스 조절 격리 인자가 측면에 위치하는 카르티닌을 코딩하는 플라스미드 DNA 트랜스포존을 사용하여 T 세포에 도입될 수 있다.
본 발명의 CAR-TSCM은 VCAR이라 지칭되는 VHH 기반 CAR을 포함할 수 있다(따라서, 세포는 VCAR-TSCM으로 지칭될 수 있음). 본 발명의 VCAR은 부적절한 유전자 활성화 또는 사일런싱을 차단하여 VHH 발현을 안정화하는데 도움을 주기 위해 2개의 시스 조절 격리 인자가 측면에 위치한 VHH를 코딩하는 플라스미드 DNA 트랜스포존을 사용하여 T 세포에 도입될 수 있다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 피기백™(PB) 트랜스포존 시스템을 사용하여 항원(암 항원 포함) 특이적 CARTyrin 또는 VCAR을 휴지의 pan T 세포에 안정적으로 통합시킬 수 있으며, 이에 의해 트랜스포존은 단일 전기 천공 반응에서 슈퍼 피기백™(SPB)이라고 불리는 mRNA 트랜스포사제와 함께 동시 전달되었다(하지만, 트랜스포존과 트랜스포사제는 세포 내로 도입될 때까지 별도의 조성물에 포함됨). 피기백™ 트랜스포존을 접촉되지 않은(untouched) 휴지의 1차 인간 pan T 세포에 전달하여 20 내지 30%의 세포에서 PB 전달 유전자가 안정적으로 통합되고 발현되었다. 예기치 않게, 이 변형된 CARTyrin 발현 T 세포의 대부분은 일반적으로 줄기 기억 T 세포(TSCM 세포)와 관련된 마커인 CD62L 및 CD45RA의 발현에 양성이었다. 이 표현형이 CAR-T 세포 자극 및 증식시 유지되었음을 확인하기 위해, CD62L 및 CD45RA의 발현에 양성인 변형된 CARTyrin 발현 T 세포를 CD3 및 CD28의 자극을 통해 활성화하였다. CD3 및 CD28의 자극 결과로, CARTyrin+ T 세포의 > 60%는 줄기세포 기억 표현형을 나타냈다. 또한, 암 항원에 특이적인 CARTyrin을 발현한 이들 세포는 강력한 항종양 이펙터 기능을 충분히 발현할 수 있었다.
PB 시스템이 줄기 유사 마커의 발현을 향상시키는데 직접 기여하는지를 결정하기 위해, PB 전위 또는 렌티바이러스(LV) 형질도입에 의해 생성된 CAR-T 세포의 표현형을 비교하였다. 이를 수행하기 위해, CARTyrin 전이유전자를 바이러스 생산을 위한 일반적인 LV 구조물에 서브클로닝하여 새로운 벡터를 제작하였다. PB 전위 또는 LV 형질도입에 의해 접촉되지 않은 휴지 T 세포에 CARTyrin을 도입한 후, CARTyrin+ 세포를 증식한 후 휴지 상태로 복귀되도록 하였다. 기억 및 고갈 관련 마커의 동역학 분석, 항상성 사이토카인 또는 종양 관련 Ag에 반응한 이차 증식, 사이토카인 생산, 및 표적 종양 세포에 반응한 용해능을 포함하는 다양한 표현형 및 기능적 특성을 측정하였다. PB 전위된 CARTyrin+ T 세포와 달리, LV 형질도입된 CARTyrin+ T 세포는 증가된 기억 표현형을 나타내지 않았다. 또한, PB 전위된 세포는 2차 증식 및 표적 종양 세포의 살해에 대해 동등 이상의 능력을 나타냈다. 종합적으로, 이러한 데이터는 PB 전위에 의해 생산된 CAR-T 세포가 대부분, CAR-T 분야에서 매우 바람직한 산물 표현형인 TSCM 세포임을 입증한다. 또한, 이러한 CARTyrin+ T 세포는 강력한 항종양 활성을 나타내며 토닉 신호전달 및 기능적 고갈의 경향이 적을 수 있는 Centyrin 기반 CAR의 사용으로 인해 생체 내에서 더 오래 지속하는 세포를 생성할 수 있다.
키메라
항원 수용체
본 발명은 (a) 항원에 각각 특이적으로 결합하는 하나 이상의 서열을 포함하는 항원 인식 영역을 포함하는 엑토도메인(ectodomain); (b) 막 횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 포함하는 엔도도메인(endodomain)을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항원 인식 영역은 이중 특이적 또는 일렬의(tandem) CAR을 생산하기 위해 항원에 각각 특이적으로 결합하는 2개의 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원 인식 영역은 3중 특이적 CAR을 생산하기 위해 항원에 각각 특이적으로 결합하는 3개의 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 특정 실시양태에서, 엑토도메인은 항원 인식 영역과 막 횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함할 수 있다. 항원에 각각 특이적으로 결합하는 서열은 단쇄 항체(예를 들어, scFv), 항체의 하나 이상의 단편을 포함하는 서열(예를 들어, VHH, CAR과 관련하여 VCAR로서 지칭됨), 항체 모방체 및 Centyrin(CAR과 관련하여 CARTyrin으로 지칭됨)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 CAR의 특정 실시양태에서, 신호 펩티드는 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR의 특정 실시양태에서, 신호 펩티드는 인간 CD8α 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 인간 CD8α 신호 펩티드는 (서열 번호 8)를 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인간 CD8α 신호 펩티드는 (서열 번호 8)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 8)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 인간 CD8α 신호 펩티드는 (서열 번호 9)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 CAR의 특정 실시양태에서, 막 횡단 도메인은 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 막 횡단 도메인을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR의 특정 실시양태에서, 막 횡단 도메인은 인간 CD8α 막 횡단 도메인을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. CD8α 막 횡단 도메인은 (서열 번호 10)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 10)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CD8α 막 횡단 도메인은 (서열 번호 11)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 CAR의 특정 실시양태에서, 엔도도메인은 인간 CD3ζ 엔도도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 CAR의 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 보조 자극 도메인은 인간 4-1BB, CD28, CD40, ICOS, MyD88, OX-40 세포 내 세그먼트 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR의 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 보조 자극 도메인은 CD28 및/또는 4-1BB 보조 자극 도메인을 포함할 수 있다. CD28 보조 자극 도메인은 (서열 번호 12)을 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 12)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CD28 보조 자극 도메인은 (서열 번호 13)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 4-1BB 보조 자극 도메인은 (서열 번호 14)을 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 14)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 4-1BB 보조 자극 도메인은 (서열 번호 15)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 4-1BB 보조 자극 도메인은 막 횡단 도메인과 CD28 보조 자극 도메인 사이에 위치될 수 있다.
본 발명의 CAR의 특정 실시양태에서, 힌지는 인간 CD8α, IgG4 및/또는 CD4 서열로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR의 특정 실시양태에서, 힌지는 인간 CD8α 서열로부터 유도된 서열을 포함할 수 있다. 힌지는 (서열 번호 16)를 포함하는 인간 CD8α 아미노산 서열 또는 (서열 번호 16)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 인간 CD8α 힌지 아미노산 서열은 (서열 번호 17)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 CAR 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 CAR을 포함하는 트랜스포존을 제공한다. 본 발명의 트랜스포존은 에피솜으로 유지되거나 재조합/변형된 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 트랜스포존은 비바이러스 유전자 전달을 향상시키기 위해 트랜스포존 및 트랜스포사제를 이용하는 2가지 성분 피기백 시스템의 일부일 수 있다.
본 발명의 트랜스포존은 트랜스포존을 발현하는 세포의 동정, 농축 및/또는 단리를 위한 선별 유전자를 포함할 수 있다. 예시적인 선별 유전자는 세포 생존능 및 생존에 필수적인 임의의 유전자 산물(예를 들어, 전사체, 단백질, 효소)을 코딩한다. 예시적인 선별 유전자는 선별 유전자에 의해 코딩된 유전자 산물의 부재하에서 세포가 민감한(또는 세포에 치명적일 수 있는) 약물 공격에 대한 내성을 부여하는데 필수적인 임의의 유전자 산물(예를 들어, 전사체, 단백질, 효소)을 코딩한다. 예시적인 선별 유전자는 선별 유전자의 부재하에서 세포 생존능 및/또는 생존에 필수적인 하나 이상의 영양소가 결여된 세포 배지에서 생존능 및/또는 생존에 필수적인 임의의 유전자 산물(예를 들어, 전사체, 단백질, 효소)을 코딩한다. 예시적인 선별 유전자는 neo(네오마이신에 대한 내성을 부여함), DHFR(디히드로폴레이트 리덕타아제를 코딩하며 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여함), TYMS(티미딜레이트 신테타아제를 코딩함), MGMT(O(6)-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제를 코딩함), 다약제 내성 유전자(MDR1), ALDH1(알데히드 디히드로게나아제 1 패밀리, 구성원 A1), FRANCF, RAD51C(RAD51 파라로그 C를 코딩함), GCS(글루코실세라미드 신타아제를 코딩함), 및 NKX2.2(NK2 호메오박스(Homeobox) 2를 코딩함)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 트랜스포존은, 예를 들어 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 서열과 본 발명의 선별 유전자 사이에 위치하는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드(들)를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 자가 절단 펩티드는, 예를 들어 T2A 펩티드, GSG-T2A 펩티드, E2A 펩티드, GSG-E2A 펩티드, F2A 펩티드, GSG-F2A 펩티드, P2A 펩티드 또는 GSG-P2A 펩티드를 포함할 수 있다. T2A 펩티드는 (서열 번호 18)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 18)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 19)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 19)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 20)를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. E2A 펩티드는 (서열 번호 21)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 21)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-E2A 펩티드는 (서열 번호 22)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 22)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. F2A 펩티드는 (서열 번호 23)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 23)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-F2A 펩티드는 (서열 번호 24)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 24)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. P2A 펩티드는 (서열 번호 25)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 25)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-P2A 펩티드는 (서열 번호 26)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 26)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 트랜스포존은 제1 및 제2의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며, 제1 자가 절단 펩티드는, 예를 들어, 본 발명의 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 서열의 상류에 위치하며, 제2 자가 절단 펩티드는, 예를 들어, 본 발명의 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 서열의 하류에 위치한다. 제1 및/또는 제2 자가 절단 펩티드는, 예를 들어, T2A 펩티드, GSG-T2A 펩티드, E2A 펩티드, GSG-E2A 펩티드, F2A 펩티드, GSG-F2A 펩티드, P2A 펩티드, 또는 GSG-P2A 펩티드를 포함할 수 있다. T2A 펩티드는 (서열 번호 18)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 18)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 19)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 19)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 20)를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. E2A 펩티드는 (서열 번호 21)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 21)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-E2A 펩티드는 (서열 번호 22)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 22)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. F2A 펩티드는 (서열 번호 23)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 23)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-F2A 펩티드는 (서열 번호 24)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 24)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. P2A 펩티드는 (서열 번호 25)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 25)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-P2A 펩티드는 (서열 번호 26)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 26)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 트랜스포존을 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 조성물을 도입하는 방법은 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 포함하는 조성물을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 mRNA 서열일 수 있다.
본 발명의 트랜스포존은 피기백 트랜스포존을 포함할 수 있다. 본 발명의 트랜스포사제 효소는 피기백 트랜스포사제 또는 컴패티블 효소를 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 CAR을 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 벡터는 재조합 벡터일 수 있다.
본 발명의 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 또는 이들의 임의의 조합으로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV)로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 재조합 AAV(rAAV)를 포함할 수 있다. 본 발명의 예시적인 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 서열 옆에 시스로 위치하는 2개 이상의 역전된 말단 반복(ITR: inverted terminal repeat) 서열을 포함한다. 본 발명의 예시적인 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는 모든 혈청형(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 및 AAV9)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 예시적인 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는 하나의 혈청형의 게놈 및 다른 혈청형의 캡시드(예를 들어, AAV2/5, AAV-DJ 및 AAV-DJ8)를 함유하는 AAV 혼성체 및 자가 상보적 AAV(scAAV)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 예시적인 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는 rAAV-LK03을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 바이러스 벡터는 선별 유전자를 포함할 수 있다. 선별 유전자는 세포 생존능 및 생존에 필수적인 유전자 산물을 코딩할 수 있다. 선별 유전자는 선택적 세포 배양 조건에 의해 공격받을 때 세포능 및 생존에 필수적인 유전자 산물을 코딩할 수 있다. 선택적 세포 배양 조건은 세포 생존능 또는 생존에 유해한 화합물을 포함할 수 있으며 여기서 유전자 산물은 화합물에 내성을 부여한다. 예시적인 선별 유전자는 neo(네오마이신에 대한 내성을 부여함), DHFR(디히드로폴레이트 리덕타아제를 코딩하며 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여함), TYMS(티미딜레이트 신테타아제를 코딩함), MGMT(O(6)-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제를 코딩함), 다약제 내성 유전자(MDR1), ALDH1(알데히드 디히드로게나아제 1 패밀리, 구성원 A1), FRANCF, RAD51C(RAD51 파라로그 C를 코딩함), GCS(글루코실세라미드 신타아제를 코딩함), 및 NKX2.2(NK2 호메오박스 2를 코딩함), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바이러스 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 적어도 하나의 절단 펩티드를 포함할 수 있으며 상기 자가 절단 펩티드는 CAR과 선별 유전자 사이에 위치한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며 여기서 제1 자가 절단 펩티드는 CAR의 상류에 위치하고 제2 자가 절단 펩티드는 CAR의 하류에 위치한다. 자가 절단 펩티드는, 예를 들어, T2A 펩티드, GSG-T2A 펩티드, E2A 펩티드, GSG-E2A 펩티드, F2A 펩티드, GSG-F2A 펩티드, P2A 펩티드, 또는 GSG-P2A 펩티드를 포함할 수 있다. T2A 펩티드는 (서열 번호 18)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 18)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 19)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 19)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 20)를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. E2A 펩티드는 (서열 번호 21)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 21)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-E2A 펩티드는 (서열 번호 22)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 22)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. F2A 펩티드는 (서열 번호 23)를 포함하는 서열 또는 (서열 번호 23)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-F2A 펩티드는 (서열 번호 24)를 포함하는 서열 또는 (서열 번호 24)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. P2A 펩티드는 (서열 번호 25)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 25)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-P2A 펩티드는 (서열 번호 26)를 포함하는 서열 또는 (서열 번호 26)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 CAR을 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 실시양태에서, 벡터는 mRNA 벡터이다. 벡터는 재조합 mRNA 벡터일 수 있다. 본 발명의 T 세포는 T 세포와 본 발명의 CAR을 포함하는 mRNA 벡터를 접촉시키기 전에 증식될 수 있다. 그런 후, mRNA 벡터를 포함하는 T 세포인 변형된 T 세포를 대상체에게 투여할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 CAR을 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 실시양태에서, 벡터는 나노입자이다. 본 발명의 예시적인 나노입자 벡터는 핵산(예를 들어, RNA, DNA, 합성 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 이들의 임의의 조합), 아미노산(L-아미노산, D-아미노산, 합성 아미노산, 변형된 아미노산, 또는 이들의 임의의 조합), 중합체(예를 들어, 폴리머좀), 미셀, 지질(예를 들어, 리포솜), 유기 분자(예를 들어, 탄소 원자, 시트, 섬유, 튜브), 무기 분자(예를 들어, 인산칼슘 또는 금) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 나노입자 벡터는 수동적으로 또는 능동적으로 세포막을 가로 질러 운반될 수 있다.
본 발명의 나노입자는 선별 유전자를 포함할 수 있다. 선별 유전자는 세포 생존능 및 생존에 필수적인 유전자 산물을 코딩할 수 있다. 선별 유전자는 선택적 세포 배양 조건에 의해 공격받을 때 세포 생존능 및 생존에 필수적인 유전자 산물을 코딩할 수 있다. 선택적 세포 배양 조건은 세포 생존능 또는 생존에 유해한 화합물을 포함할 수 있으며 여기서 유전자 산물은 화합물에 내성을 부여한다. 예시적인 선별 유전자는 neo(네오마이신에 대한 내성을 부여함), DHFR(디히드로폴레이트 리덕타아제를 코딩하며 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여함), TYMS(티미딜레이트 신테타아제를 코딩함), MGMT(O(6)-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제를 코딩함), 다약제 내성 유전자(MDR1), ALDH1(알데히드 디히드로게나아제 1 패밀리, 구성원 A1), FRANCF, RAD51C(RAD51 파라로그 C를 코딩함), GCS(글루코실세라미드 신타아제를 코딩함), 및 NKX2.2(NK2 호메오박스 2를 코딩함), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며 여기서 자가 절단 펩티드는 CAR과 나노입자 사이에 위치한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며 여기서 제1 자가 절단 펩티드는 CAR의 상류에 위치하고 제2 자가 절단 펩티드는 CAR의 하류에 위치한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며 여기서 제1 자가 절단 펩티드는 CAR과 나노입자 사이에 위치하고 제2 자가 절단 펩티드는 CAR의 하류에 위치한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며 여기서 제1 자가 절단 펩티드는 CAR과 나노입자 사이에 위치하고 제2 자가 절단 펩티드는 CAR의 하류, 예를 들어 CAR과 선별 유전자 사이에 위치한다. 자가 절단 펩티드는, 예를 들어, T2A 펩티드, GSG-T2A 펩티드, E2A 펩티드, GSG-E2A 펩티드, F2A 펩티드, GSG-F2A 펩티드, P2A 펩티드, 또는 GSG-P2A 펩티드를 포함할 수 있다. T2A 펩티드는 (서열 번호 18)를 포함하는 서열 또는 (서열 번호 18)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 19)를 포함하는 서열 또는 (서열 번호 19)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 20)를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. E2A 펩티드는 (서열 번호 21)를 포함하는 서열 또는 (서열 번호 21)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-E2A 펩티드는 (서열 번호 22)를 포함하는 서열 또는 (서열 번호 22)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. F2A 펩티드는 (서열 번호 23)를 포함하는 서열 또는 (서열 번호 23)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-F2A 펩티드는 (서열 번호 24)를 포함하는 서열 또는 (서열 번호 24)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. P2A 펩티드는 (서열 번호 25)를 포함하는 서열 또는 (서열 번호 25)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-P2A 펩티드는 (서열 번호 26)를 포함하는 서열 또는 (서열 번호 26)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
본원은 본 발명의 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
CARTyrin
본 발명은 (a) 적어도 하나의 Centyrin을 포함하는 항원 인식 영역을 포함하는 엑토도메인; (b) 막 횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 제공한다. 본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, Centyrin을 포함하는 CAR을 CARTyrin으로 지칭한다. 특정 실시양태에서, 항원 인식 영역은 이중 특이적 또는 일렬의 CAR을 생산하기 위해 2개의 Centyrin을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원 인식 영역은 3중 특이적 CAR을 생산하기 위해 3개의 Centyrin을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 특정 실시양태에서, 엑토도메인은 항원 인식 영역과 막 횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 (a) 적어도 하나의 단백질 스캐폴드 또는 항체 모방체를 포함하는 항원 인식 영역을 포함하는 엑토도메인; (b) 막 횡단 도메인 및 (c) 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항원 인식 영역은 이중 특이적 또는 일렬의 CAR을 생산하기 위해 2개의 스캐폴드 단백질 또는 항체 모방체를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원 인식 영역은 3중 특이적 CAR을 생산하기 위해 3개의 단백질 스캐폴드 또는 항체 모방체를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 특정 실시양태에서, 엑토도메인은 항원 인식 영역과 막 횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 CAR의 특정 실시양태에서, 신호 펩티드는 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR의 특정 실시양태에서, 신호 펩티드는 인간 CD8α 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 인간 CD8α 신호 펩티드는 (서열 번호 8)를 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인간 CD8α 신호 펩티드는 (서열 번호 8)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 8)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 인간 CD8α 신호 펩티드는 (서열 번호 9)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 CAR의 특정 실시양태에서, 막 횡단 도메인은 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 막 횡단 도메인을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR의 특정 실시양태에서, 막 횡단 도메인은 인간 CD8α 막 횡단 도메인을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. CD8α 막 횡단 도메인은 (서열 번호 10)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 10)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CD8α 막 횡단 도메인은 (서열 번호 11)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 CAR의 특정 실시양태에서, 엔도도메인은 인간 CD3ζ 엔도도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 CAR의 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 보조 자극 도메인은 인간 4-1BB, CD28, CD40, ICOS, MyD88, OX-40 세포 내 세그먼트 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR의 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 보조 자극 도메인은 CD28 및/또는 4-1BB 보조 자극 도메인을 포함할 수 있다. CD28 보조 자극 도메인은 (서열 번호 12)을 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 12)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CD28 보조 자극 도메인은 (서열 번호 13)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 4-1BB 보조 자극 도메인은 (서열 번호 14)을 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 14)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 4-1BB 보조 자극 도메인은 (서열 번호 15)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 4-1BB 보조 자극 도메인은 막 횡단 도메인과 CD28 보조 자극 도메인 사이에 위치될 수 있다.
본 발명의 CAR의 특정 실시양태에서, 힌지는 인간 CD8α, IgG4 및/또는 CD4 서열로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR의 특정 실시양태에서, 힌지는 인간 CD8α 서열로부터 유도된 서열을 포함할 수 있다. 힌지는 (서열 번호 16)를 포함하는 인간 CD8α 아미노산 서열 또는 (서열 번호 16)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 인간 CD8α 힌지 아미노산 서열은 (서열 번호 17)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 Centyrin은 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있으며, 상기 스캐폴드는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 Centyrin은 적어도 하나의 피브로넥틴 III 형(FN3) 도메인의 컨센서스 서열을 포함하는 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있으며, 상기 스캐폴드는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 적어도 하나의 피브로넥틴 III 형(FN3) 도메인은 인간 단백질로부터 유래될 수 있다. 인간 단백질은 테나신-C 일 수 있다. 컨센서스 서열은 (서열 번호 1) 또는 (서열 번호 2)를 포함할 수 있다. 컨센서스 서열은 (서열 번호 3)를 포함하는 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 컨센서스 서열은 (a) 컨센서스 서열의 위치 13 내지 16에서 아미노산 잔기 TEDS를 포함하거나 이로 이루어진 A-B 루프; (b) 컨센서스 서열의 위치 22 내지 28에서 아미노산 잔기 TAPDAAF를 포함하거나 이로 이루어진 B-C 루프; (c) 컨센서스 서열의 위치 38 내지 43에서 아미노산 잔기 SEKVGE를 포함하거나 이로 이루어진 C-D 루프; (d) 컨센서스 서열의 위치 51 내지 54에서 아미노산 잔기 GSER를 포함하거나 이로 이루어진 D-E 루프; (e) 컨센서스 서열의 위치 60 내지 64에서 아미노산 잔기 GLKPG를 포함하거나 이로 이루어진 E-F 루프; (f) 컨센서스 서열의 위치 75 내지 81에서 아미노산 잔기 KGGHRSN을 포함하거나 이로 이루어진 F-G 루프; 또는 (g) (a) 내지 (f)의 임의의 조합 내에 하나 이상의 위치에서 변형될 수 있다. 본 발명의 Centyrin은 적어도 5개의 피브로넥틴 III 형(FN3) 도메인, 적어도 10개의 피브로넥틴 III 형(FN3) 도메인 또는 적어도 15개의 피브로넥틴 III 형(FN3) 도메인을 포함할 수 있다. 스캐폴드는 10-9M 이하, 10-10M 이하, 10-11M 이하, 10-12M 이하, 10-13M 이하, 10-14M 이하 및 10-15M 이하의 KD로부터 선택된 적어도 하나의 친화도로 항원에 결합할 수 있다. KD는 표면 플라스몬 공명에 의해 결정될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 CAR 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 CAR을 포함하는 트랜스포존을 제공한다. 본 발명의 트랜스포존은 에피솜으로 유지되거나 재조합/변형된 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 트랜스포존은 비바이러스 유전자 전달을 향상시키기 위해 트랜스포존 및 트랜스포사제를 이용하는 2가지 성분 피기백 시스템의 일부일 수 있다.
본 발명의 트랜스포존은 트랜스포존을 발현하는 세포의 동정, 농축 및/또는 단리를 위한 선별 유전자를 포함할 수 있다. 예시적인 선별 유전자는 세포 생존능 및 생존에 필수적인 임의의 유전자 산물(예를 들어, 전사체, 단백질, 효소)을 코딩한다. 예시적인 선별 유전자는 선별 유전자에 의해 코딩된 유전자 산물의 부재하에서 세포가 민감한(또는 세포에 치명적일 수 있는) 약물 공격에 대한 내성을 부여하는데 필수적인 임의의 유전자 산물(예를 들어, 전사체, 단백질, 효소)을 코딩한다. 예시적인 선별 유전자는 선별 유전자의 부재하에서 세포 생존능 및/또는 생존에 필수적인 하나 이상의 영양소가 결여된 세포 배지에서 생존능 및/또는 생존에 필수적인 임의의 유전자 산물(예를 들어, 전사체, 단백질, 효소)을 코딩한다. 예시적인 선별 유전자는 neo(네오마이신에 대한 내성을 부여함), DHFR(디히드로폴레이트 리덕타아제를 코딩하며 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여함), TYMS(티미딜레이트 신테타아제를 코딩함), MGMT(O(6)-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제를 코딩함), 다약제 내성 유전자(MDR1), ALDH1(알데히드 디히드로게나아제 1 패밀리, 구성원 A1), FRANCF, RAD51C(RAD51 파라로그 C를 코딩함), GCS(글루코실세라미드 신타아제를 코딩함), 및 NKX2.2(NK2 호메오박스 2를 코딩함)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 트랜스포존은, 예를 들어 하나 이상의 단백질 스캐폴드, 본 발명의 센트린 또는 CARTyrin과 본 발명의 선별 유전자 사이에 위치하는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드(들)를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 자가 절단 펩티드는, 예를 들어 T2A 펩티드, GSG-T2A 펩티드, E2A 펩티드, GSG-E2A 펩티드, F2A 펩티드, GSG-F2A 펩티드, P2A 펩티드 또는 GSG-P2A 펩티드를 포함할 수 있다. T2A 펩티드는 (서열 번호 18)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 18)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 19)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 19)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 20)를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. E2A 펩티드는 (서열 번호 21)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 21)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-E2A 펩티드는 (서열 번호 22)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 22)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. F2A 펩티드는 (서열 번호 23)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 23)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-F2A 펩티드는 (서열 번호 24)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 24)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. P2A 펩티드는 (서열 번호 25)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 25)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-P2A 펩티드는 (서열 번호 26)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 26)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 트랜스포존은 제1 및 제2의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며, 제1 자가 절단 펩티드는, 예를 들어, 하나 이상의 단백질 스캐폴드, 본 발명의 센트린 또는 CARTyrin의 상류에 위치하며, 제2 자가 절단 펩티드는, 예를 들어, 하나 이상의 단백질 스캐폴드, 본 발명의 센트린 또는 CARTyrin의 서열의 하류에 위치한다. 제1 및/또는 제2 자가 절단 펩티드는, 예를 들어, T2A 펩티드, GSG-T2A 펩티드, E2A 펩티드, GSG-E2A 펩티드, F2A 펩티드, GSG-F2A 펩티드, P2A 펩티드, 또는 GSG-P2A 펩티드를 포함할 수 있다. T2A 펩티드는 (서열 번호 18)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 18)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 19)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 19)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 20)를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. E2A 펩티드는 (서열 번호 21)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 21)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-E2A 펩티드는 (서열 번호 22)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 22)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. F2A 펩티드는 (서열 번호 23)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 23)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-F2A 펩티드는 (서열 번호 24)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 24)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. P2A 펩티드는 (서열 번호 25)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 25)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-P2A 펩티드는 (서열 번호 26)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 26)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 트랜스포존을 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 조성물을 도입하는 방법은 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 포함하는 조성물을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 mRNA 서열일 수 있다.
본 발명의 트랜스포존은 피기백 트랜스포존을 포함할 수 있다. 본 발명의 트랜스포사제 효소는 피기백 트랜스포사제 또는 컴패티블 효소를 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 CAR을 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 벡터는 재조합 벡터일 수 있다.
본 발명의 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 또는 이들의 임의의 조합으로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV)로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 재조합 AAV(rAAV)를 포함할 수 있다. 본 발명의 예시적인 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는 단백질 스캐폴드, 본 발명의 센트린 또는 CARTyrin을 코딩하는 서열 옆에 시스로 위치하는 2개 이상의 역전된 말단 반복(ITR) 서열을 포함한다. 본 발명의 예시적인 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는 모든 혈청형(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 및 AAV9)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 예시적인 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는 하나의 혈청형의 게놈 및 다른 혈청형의 캡시드(예를 들어, AAV2/5, AAV-DJ 및 AAV-DJ8)를 함유하는 AAV 혼성체 및 자가 상보적 AAV(scAAV)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 예시적인 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는 rAAV-LK03을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 바이러스 벡터는 선별 유전자를 포함할 수 있다. 선별 유전자는 세포 생존능 및 생존에 필수적인 유전자 산물을 코딩할 수 있다. 선별 유전자는 선택적 세포 배양 조건에 의해 공격받을 때 세포 생존능 및 생존에 필수적인 유전자 산물을 코딩할 수 있다. 선택적 세포 배양 조건은 세포 생존능 또는 생존에 유해한 화합물을 포함할 수 있으며 여기서 유전자 산물은 화합물에 내성을 부여한다. 예시적인 선별 유전자는 neo(네오마이신에 대한 내성을 부여함), DHFR(디히드로폴레이트 리덕타아제를 코딩하며 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여함), TYMS(티미딜레이트 신테타아제를 코딩함), MGMT(O(6)-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제를 코딩함), 다약제 내성 유전자(MDR1), ALDH1(알데히드 디히드로게나아제 1 패밀리, 구성원 A1), FRANCF, RAD51C(RAD51 파라로그 C를 코딩함), GCS(글루코실세라미드 신타아제를 코딩함), 및 NKX2.2(NK2 호메오박스 2를 코딩함), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바이러스 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 적어도 하나의 절단 펩티드를 포함할 수 있으며 상기 자가 절단 펩티드는 CAR과 선별 유전자 사이에 위치한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며 여기서 제1 자가 절단 펩티드는 CAR의 상류에 위치하고 제2 자가 절단 펩티드는 CAR의 하류에 위치한다. 자가 절단 펩티드는, 예를 들어, T2A 펩티드, GSG-T2A 펩티드, E2A 펩티드, GSG-E2A 펩티드, F2A 펩티드, GSG-F2A 펩티드, P2A 펩티드, 또는 GSG-P2A 펩티드를 포함할 수 있다. T2A 펩티드는 (서열 번호 18)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 18)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 19)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 19)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 20)를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. E2A 펩티드는 (서열 번호 21)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 21)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-E2A 펩티드는 (서열 번호 22)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 22)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. F2A 펩티드는 (서열 번호 23)를 포함하는 서열 또는 (서열 번호 23)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-F2A 펩티드는 (서열 번호 24)를 포함하는 서열 또는 (서열 번호 24)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. P2A 펩티드는 (서열 번호 25)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 25)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-P2A 펩티드는 (서열 번호 26)를 포함하는 서열 또는 (서열 번호 26)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 CAR을 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 실시양태에서, 벡터는 mRNA 벡터이다. 벡터는 재조합 mRNA 벡터일 수 있다. 본 발명의 T 세포는 T 세포와 본 발명의 CAR을 포함하는 mRNA 벡터를 접촉시키기 전에 증식될 수 있다. 그런 후, mRNA 벡터를 포함하는 T 세포인 변형된 T 세포를 대상체에게 투여할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 CAR을 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 실시양태에서, 벡터는 나노입자이다. 본 발명의 예시적인 나노입자 벡터는 핵산(예를 들어, RNA, DNA, 합성 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 이들의 임의의 조합), 아미노산(L-아미노산, D-아미노산, 합성 아미노산, 변형된 아미노산, 또는 이들의 임의의 조합), 중합체(예를 들어, 폴리머좀), 미셀, 지질(예를 들어, 리포솜), 유기 분자(예를 들어, 탄소 원자, 시트, 섬유, 튜브), 무기 분자(예를 들어, 인산칼슘 또는 금) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 나노입자 벡터는 수동적으로 또는 능동적으로 세포막을 가로 질러 운반될 수 있다.
본 발명의 나노입자는 선별 유전자를 포함할 수 있다. 선별 유전자는 세포 생존능 및 생존에 필수적인 유전자 산물을 코딩할 수 있다. 선별 유전자는 선택적 세포 배양 조건에 의해 공격받을 때 세포 생존능 및 생존에 필수적인 유전자 산물을 코딩할 수 있다. 선택적 세포 배양 조건은 세포 생존능 또는 생존에 유해한 화합물을 포함할 수 있으며 여기서 유전자 산물은 화합물에 내성을 부여한다. 예시적인 선별 유전자는 neo(네오마이신에 대한 내성을 부여함), DHFR(디히드로폴레이트 리덕타아제를 코딩하며 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여함), TYMS(티미딜레이트 신테타아제를 코딩함), MGMT(O(6)-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제를 코딩함), 다약제 내성 유전자(MDR1), ALDH1(알데히드 디히드로게나아제 1 패밀리, 구성원 A1), FRANCF, RAD51C(RAD51 파라로그 C를 코딩함), GCS(글루코실세라미드 신타아제를 코딩함), 및 NKX2.2(NK2 호메오박스 2를 코딩함), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며 여기서 자가 절단 펩티드는 CAR과 나노입자 사이에 위치한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며 여기서 제1 자가 절단 펩티드는 CAR의 상류에 위치하고 제2 자가 절단 펩티드는 CAR의 하류에 위치한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며 여기서 제1 자가 절단 펩티드는 CAR과 나노입자 사이에 위치하고 제2 자가 절단 펩티드는 CAR의 하류에 위치한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며 여기서 제1 자가 절단 펩티드는 CAR과 나노입자 사이에 위치하고 제2 자가 절단 펩티드는 CAR의 하류, 예를 들어 CAR과 선별 유전자 사이에 위치한다. 자가 절단 펩티드는, 예를 들어, T2A 펩티드, GSG-T2A 펩티드, E2A 펩티드, GSG-E2A 펩티드, F2A 펩티드, GSG-F2A 펩티드, P2A 펩티드, 또는 GSG-P2A 펩티드를 포함할 수 있다. T2A 펩티드는 (서열 번호 18)를 포함하는 서열 또는 (서열 번호 18)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 19)를 포함하는 서열 또는 (서열 번호 19)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 20)를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. E2A 펩티드는 (서열 번호 21)를 포함하는 서열 또는 (서열 번호 21)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-E2A 펩티드는 (서열 번호 22)를 포함하는 서열 또는 (서열 번호 22)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. F2A 펩티드는 (서열 번호 23)를 포함하는 서열 또는 (서열 번호 23)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-F2A 펩티드는 (서열 번호 24)를 포함하는 서열 또는 (서열 번호 24)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. P2A 펩티드는 (서열 번호 25)를 포함하는 서열 또는 (서열 번호 25)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. GSG-P2A 펩티드는 (서열 번호 26)를 포함하는 서열 또는 (서열 번호 26)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
본원은 본 발명의 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
스캐폴드
단백질
Centyrin은 본 발명의 단백질 스캐폴드의 한 예이다. 본 발명의 CAR의 항원 인식 영역은 적어도 하나의 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있다.
본 발명의 단백질 스캐폴드는 피브로넥틴 III 형(FN3) 반복 단백질, 코딩 또는 상보적인 핵산, 벡터, 숙주 세포, 조성물, 조합물, 제제, 장치 및 이들의 제조 및 사용 방법으로부터 유래될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 단백질 스캐폴드는 인간 테나신-C(이하, "테나신")의 다중 FN3 도메인의 컨센서스 서열로 구성된다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단백질 스캐폴드는 15FN3 도메인의 컨센서스 서열이다. 본 발명의 단백질 스캐폴드는 다양한 분자, 예를 들어 세포 표적 단백질에 결합하도록 설계될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단백질 스캐폴드는 항원의 야생형 및/또는 변이체 형태의 에피토프에 결합하도록 설계될 수 있다.
본 발명의 단백질 스캐폴드는 추가적인 분자 또는 모이어티, 예를 들어 항체의 Fc 영역, 알부민 결합 도메인 또는 반감기에 영향을 미치는 다른 모이어티를 포함할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 단백질 스캐폴드는 단백질 스캐폴드를 코딩할 수 있는 핵산 분자에 결합될 수 있다.
본 발명은 숙주 세포에서 다중 FN3 도메인의 컨센서스 서열에 기초하여 적어도 하나의 단백질 스캐폴드를 발현시키는 적어도 하나의 방법으로서, 적어도 하나의 단백질 스캐폴드가 검출 가능하고/거나 회수 가능한 양으로 발현되는 조건하에 본원에 기재된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 다중 FN3 도메인의 컨센서스 서열 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 코딩 핵산에 기초한 단백질 스캐폴드; 및 (b) 적합하고/거나 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 적어도 하나의 조성물을 제공한다.
본 발명은 피브로넥틴 III 형(FN3) 반복 단백질, 바람직하게는 다중 FN3 도메인의 컨센서스 서열, 더 바람직하게는 인간 테나신으로부터의 다중 FN3 도메인의 컨센서스 서열에 기초한 단백질 스캐폴드의 라이브러리를 생성하는 방법을 제공한다. 라이브러리는 스캐폴드의 일부분, 예를 들어 루프 영역의 특정 위치에서 분자 내의 아미노산 또는 아미노산의 수를 (돌연변이에 의해) 변경하여 스캐폴드를 연속 생성함으로써 형성된다. 라이브러리는 단일 루프의 아미노산 조성을 변경함으로써 또는 다수의 루프 또는 스캐폴드 분자의 추가 위치를 동시에 변경함으로써 생성될 수 있다. 변경된 루프는 이에 따라 길어지거나 짧아질 수 있다. 이러한 라이브러리는 각 위치에서 가능한 모든 아미노산 또는 설계된 서브세트의 아미노산을 포함하도록 생성될 수 있다. 라이브러리 구성원은 시험관 내 또는 CIS 디스플레이(DNA, RNA, 리보솜 디스플레이 등), 효모, 세균 및 파지 디스플레이와 같은 디스플레이로 스크리닝하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 단백질 스캐폴드는 환원 조건 하에서의 안정성 및 고농도에서의 용해도와 같은 향상된 생물물리학적 특성을 제공하며; 이들은 이. 콜라이(E. coli)와 같은 원핵생물 시스템, 효모와 같은 진핵생물 시스템 및 토끼 망상 적혈구 용해물 시스템과 같은 시험관 내 전사/번역 시스템에서 발현되고 폴딩될 수 있다.
본 발명은 제한 없이 포유동물 유래 스캐폴드를 포함하는 피브로넥틴 III형(FN3)의 컨센서스 서열에 기초한 단리된 재조합 및/또는 합성 단백질 스캐폴드뿐 아니라 컨센서스 FN3 서열에 기초한 단백질 스캐폴드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 코딩 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 진단 및 치료 조성물, 방법 및 장치를 포함하여, 상기 핵산 및 단백질 스캐폴드의 제조 및 사용 방법을 추가로 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 단백질 스캐폴드는 국소, 경구로 또는 혈액-뇌 장벽을 통과하여 투여되는 능력, 포유동물 세포 발현 능력에 비해 자원의 기능으로서 단백질의 증가된 발현을 위해 다중 표적 또는 동일한 표적의 다중 에피토프에 결합하는 이중 특이적 또는 일렬의 분자로 조작되도록 허용하는 이. 콜라이에서 발현하는 능력, 약물, 중합체, 및 프로브에 접합될 수 있는 능력, 고농도로 제제화될 수 있는 능력, 및 질환 조직 및 종양에 효과적으로 침투하는 상기 분자의 능력과 같이, 종래의 치료법에 대한 이점을 제공한다.
또한, 단백질 스캐폴드는 항체의 가변 영역을 모방하는 폴드와 관련한 항체의 많은 특성을 갖는다. 이 배향은 FN3 루프가 항체 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)과 유사하게 노출되도록 할 수 있다. 이들은 세포 표적에 결합할 수 있어야 하고, 특정 결합 또는 관련 특성을 개선하기 위해, 루프는 변경, 예를 들어, 친화도 성숙될 수 있다.
본 발명의 단백질 스캐폴드의 6개의 루프 중 3개는 위상적으로 항체의 상보성 결정 영역(CDR 1 내지 3), 즉 항원 결합 영역에 해당하는 한편, 나머지 3개의 루프는 항체 CDR과 유사한 방식으로 표면에 노출된다. 이들 루프는 서열 번호 1의 잔기 13 내지 16, 22 내지 28, 38 내지 43, 51 내지 54, 60 내지 64 및 75 내지 81에 또는 대략 이들 잔기에 걸쳐있다. 바람직하게는, 잔기 22 내지 28, 51 내지 54 및 75 내지 81에서 또는 대략 이들 잔기에서 루프 영역은 결합 특이성 및 친화도를 위해 변경된다. 하나 이상의 이들 루프 영역은 골격 부분으로서 그의 서열을 유지하는 다른 루프 영역 및/또는 다른 가닥과 무작위 배정되어 라이브러리를 형성하고, 특정 단백질 표적에 대해 높은 친화도를 갖는 라이브러리로부터 강력한 결합체를 선택할 수 있다. 하나 이상의 루프 영역은 단백질과 항체 CDR 상호 작용과 유사하게 표적 단백질과 상호 작용할 수 있다.
본 발명의 스캐폴드는 단쇄 항체(예를 들어, scFv)를 포함할 수 있다. 본 발명의 단쇄 항체는 항체의 3개의 경쇄 및 3개의 중쇄 CDR을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 단쇄 항체는 항체의 3개의 경쇄 및 3개의 중쇄 CDR을 포함하며, 상기 단쇄 항체의 상보성 결정 영역(CDR)은 인간 서열이다. 본 발명은 (a) 적어도 하나의 단쇄 항체(예를 들어, scFv)를 포함하는 항원 인식 영역을 포함하는 엑토도메인; (b) 막 횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항원 인식 영역은 이중 특이적 또는 일렬의 CAR을 생산하기 위해 2개의 단쇄 항체(예를 들어, 2개의 scFv)를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원 인식 영역은 3중 특이적 CAR을 생산하기 위해 3개의 단쇄 항체(예를 들어, 3개의 scFv)를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 특정 실시양태에서, 엑토도메인은 항원 인식 영역과 막 횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 스캐폴드는 항체의 하나 이상의 단편(예를 들어, VHH)을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체의 하나 이상의 단편을 포함하는 서열은 항체의 2개의 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 서열은 항체의 2개의 중쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 VHH의 상보성 결정 영역(CDR)은 인간 서열이다. 본 발명의 스캐폴드는 항체의 하나 이상의 단편(예를 들어, VHH)을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명은 (a) 항체의 하나 이상의 단편(예를 들어, VHH)을 포함하는 적어도 하나의 서열을 포함하는 항원 인식 영역을 포함하는 엑토도메인; (b) 막 횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항원 인식 영역은 이중 특이적 또는 일렬의 CAR을 생산하기 위해 항체의 하나 이상의 단편(예를 들어, 2개의 VHH)을 포함하는 2개의 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원 인식 영역은 3중 특이적 CAR을 생산하기 위해 항체의 하나 이상의 단편(예를 들어, 3개의 VHH)을 포함하는 3개의 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 특정 실시양태에서, 엑토도메인은 항원 인식 영역과 막 횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 스캐폴드는 항체 모방체를 포함할 수 있다.
용어 "항체 모방체"는 표적 서열에 특이적으로 결합하고 자연 발생 항체와는 다른 구조를 갖는 유기 화합물을 기재함을 의미한다. 항체 모방체는 단백질, 핵산 또는 소분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 모방체가 특이적으로 결합하는 표적 서열은 항원일 수 있다. 항체 모방체는 우수한 용해도, 조직 침투력, 열과 효소에 대한 안정성(예를 들어, 효소 분해에 대한 내성) 및 낮은 생산 비용을 포함하지만 이에 제한되지 않는 항체보다 우수한 특성을 제공할 수 있다. 예시적인 항체 모방체는 애피바디, 애필린, 애피머, 애피틴, 알파바디, 안티칼린, 및 아비머(결합 활성(avidity) 다량체로도 공지됨), DARPin(Designed Ankyrin Repeat Protein: 설계된 안키린 반복 단백질), 피노머(Fynomer), 쿠니츠(Kunitz) 도메인 펩티드, 및 모노바디를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 애피바디 분자는 디설피드 다리를 전혀 갖지 않는 하나 이상의 알파 나선을 포함하거나 이로 이루어진 단백질 스캐폴드를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 애피바디 분자는 3개의 알파 나선을 포함하거나 이들로 이루어진다. 예를 들어, 본 발명의 애피바디 분자는 면역글로불린 결합 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 애피바디 분자는 단백질 A의 Z 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 애필린 분자는 예를 들어 감마-B 크리스탈린 또는 유비퀴틴의 노출된 아미노산의 변형에 의해 생산된 단백질 스캐폴드를 포함한다. 애필린 분자는 기능적으로 항원에 대한 항체의 친화도를 모방하지만, 구조적으로 항체를 모방하지는 않는다. 애필린을 만드는 데 사용되는 임의의 단백질 스캐폴드에서, 적절하게 폴딩된 단백질 분자에서 용매 또는 가능한 결합 파트너에 접근 가능한 아미노산은 노출된 아미노산으로 간주한다. 이들 노출된 아미노산 중 임의의 하나 이상은 표적 서열 또는 항원에 특이적으로 결합하도록 변형될 수 있다.
본 발명의 애피머 분자는 특정 표적 서열에 대한 고친화도 결합 부위를 제공하는 펩티드 루프를 나타내도록 조작된 고도로 안정한 단백질을 포함하는 단백질 스캐폴드를 포함한다. 본 발명의 예시적인 애피머 분자는 시스타틴 단백질 또는 이의 3차 구조를 기본으로 하는 단백질 스캐폴드를 포함한다. 본 발명의 예시적인 애피머 분자는 역 평행 베타-시트 상부에 놓인 알파-나선을 포함하는 공통의 3차 구조를 공유할 수 있다.
본 발명의 애피틴 분자는 인공 단백질 스캐폴드를 포함하며, 그 구조는 예를 들어 DNA 결합 단백질(예를 들어, DNA 결합 단백질 Sac7d)로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 애피틴은 항원의 전체 또는 일부일 수 있는 표적 서열에 선택적으로 결합한다. 본 발명의 예시적인 애피틴은 DNA 결합 단백질의 결합 표면상의 하나 이상의 아미노산 서열을 무작위 배정하고 그 결과 단백질을 리보솜 디스플레이 및 선별을 적용함으로써 제조된다. 본 발명의 애피틴의 표적 서열은 예를 들어 게놈에서 또는 펩티드, 단백질, 바이러스 또는 박테리아의 표면에서 발견될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 애피틴 분자는 효소의 특이적 억제제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 애피틴 분자는 내열성 단백질 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다.
본 발명의 알파바디 분자는 또한 세포 침투성 알파 바디(CPAB: Cell-Penetrating Alphabody)로 지칭될 수 있다. 본 발명의 알파바디 분자는 다양한 표적 서열(항원을 포함함)에 결합하는 작은 단백질(전형적으로 10 kDa 미만)을 포함한다. 알파바디 분자는 세포 내 표적 서열에 도달하고 결합할 수 있다. 구조적으로, 본 발명의 알파바디 분자는 단쇄 α 나선(자연 발생 코일형 코일(coiled-coil) 구조와 유사함)을 형성하는 인공 서열을 포함한다. 본 발명의 알파바디 분자는 표적 단백질에 특이적으로 결합하도록 변형된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있다. 분자의 결합 특이성에 관계없이, 본 발명의 알파바디 분자는 정확한 폴딩 및 열 안정성을 유지한다.
본 발명의 안티칼린 분자는 단백질 또는 소분자의 표적 서열 또는 부위에 결합하는 인공 단백질을 포함한다. 본 발명의 안티칼린 분자는 인간 리포칼린으로부터 유래된 인공 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 안티칼린 분자는 예를 들어 단클론 항체 또는 이의 단편 대신에 사용될 수 있다. 안티칼린 분자는 단클론 항체 또는 이의 단편보다 우수한 조직 침투 및 열 안정성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 예시적인 안티칼린 분자는 약 20 kDa의 질량을 갖는 약 180개의 아미노산을 포함할 수 있다. 구조적으로, 본 발명의 안티칼린 분자는 루프 및 부착된 알파 나선에 의해 쌍으로 연결된 역 평행 β-가닥을 포함하는 배럴 구조를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 안티칼린 분자는 루프 및 부착된 알파 나선에 의해 쌍으로 연결된 8개의 역 평행 β-가닥을 포함하는 배럴 구조를 포함한다.
본 발명의 아비머 분자는 표적 서열(항원일 수도 있음)에 특이적으로 결합하는 인공 단백질을 포함한다. 본 발명의 아비머는 동일한 표적 내에 또는 별개의 표적들 내의 여러 결합 부위를 인식할 수 있다. 본 발명의 아비머가 하나 초과의 표적을 인식할 때, 아비머는 이중 특이적 항체의 기능을 모방한다. 인공 단백질 아비머는 각각 약 30 내지 35개 아미노산의 2개 이상의 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 이들 펩티드는 하나 이상의 링커 펩티드를 통해 연결될 수 있다. 아비머의 하나 이상의 펩티드의 아미노산 서열은 막 수용체의 A 도메인으로부터 유래될 수 있다. 아비머는 경우에 따라 디설피드 결합 및/또는 칼슘을 포함할 수 있는 견고한 구조를 갖는다. 본 발명의 아비머는 항체와 비교하여 더 우수한 열 안정성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 DARPin(설계된 안키린 반복 단백질)은 표적 서열에 대해 높은 특이성 및 높은 친화도를 갖는 유전자 조작된, 재조합 또는 키메라 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 DARPin은 안키린 단백질로부터 유래되고, 경우에 따라, 안키린 단백질의 적어도 3개의 반복 모티프(반복적인 구조 단위로도 지칭됨)를 포함한다. 안키린 단백질은 고친화도 단백질-단백질 상호 작용을 매개한다. 본 발명의 DARPin은 큰 표적 상호 작용 표면을 포함한다.
본 발명의 피노머는 인간 Fyn SH3 도메인으로부터 유래된 작은 결합 단백질(약 7 kDa)을 포함하고 항체와 동일한 친화도 및 동일한 특이성으로 표적 서열 및 분자에 결합하도록 조작된다.
본 발명의 쿠니츠 도메인 펩티드는 쿠니츠 도메인을 포함하는 단백질 스캐폴드를 포함한다. 쿠니츠 도메인은 프로테아제 활성을 억제하기 위한 활성 부위를 포함한다. 구조적으로, 본 발명의 쿠니츠 도메인은 디설피드가 풍부한 알파+베타 폴드를 포함한다. 이 구조는 소 췌장 트립신 억제제에 의해 예시된다. 쿠니츠 도메인 펩티드는 특정 단백질 구조를 인식하고 경쟁적인 프로테아제 억제제로서 역할을 한다. 본 발명의 쿠니츠 도메인은 에칼란티드(인간 지방 단백질 관련 응고 억제제(LACI: lipoprotein-associated coagulation inhibitor)로부터 유래됨)를 포함할 수 있다.
본 발명의 모노바디는 단쇄 항체와 크기가 유사한 작은 단백질(약 94개 아미노산을 포함하고 약 10 kDa의 질량을 가짐)이다. 이 유전적으로 조작된 단백질은 항원을 포함한 표적 서열에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 모노바디는 하나 이상의 독특한 단백질 또는 표적 서열을 특이적으로 표적화할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 모노바디는 인간 피브로넥틴의 구조를 모방하는 단백질 스캐폴드, 더 바람직하게는 피브로넥틴의 10번째 세포 외 III형 도메인의 구조를 모방하는 단백질 스캐폴드를 포함한다. 피브로넥틴의 10번째 세포 외 III형 도메인 및 이의 모노바디 모방체는 배럴을 형성하는 7개의 베타 시트 및 항체의 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 상응하는 각각의 측면에 노출된 3개의 루프를 포함한다. 항체의 가변 도메인의 구조와는 대조적으로, 모노바디는 중앙 디설피드 결합뿐만 아니라 금속 이온에 대한 결합 부위가 전혀 없다. 다중 특이적 모노바디는 루프 BC 및 FG를 변형시킴으로써 최적화될 수 있다. 본 발명의 모노바디는 아드넥틴을 포함할 수 있다.
스캐폴드
단백질의 생산 및 생성
본 발명의 적어도 하나의 스캐폴드 단백질은 당 업계에 잘 공지된 바와 같이, 경우에 따라 세포주, 혼합 세포주, 불멸화 세포 또는 불멸화 세포의 클론 집단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)]을 참조한다.
스캐폴드 단백질로부터의 아미노산은 면역원성을 감소시키거나 결합 친화도, 온-레이트, 오프-레이트, 결합력, 특이성, 반감기, 안정성, 용해도 또는 임의의 다른 적절한 특성을 감소, 향상 또는 변형시키기 위해 변경, 첨가 및/또는 결실될 수 있다.
경우에 따라, 스캐폴드 단백질은 항원에 대한 고친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 유지하면서 조작될 수 있다. 이 목표를 달성하기 위해, 스캐폴드 단백질은 경우에 따라 부모 서열 및 조작된 서열의 3차원 모델을 사용하여 부모 서열 및 다양한 개념의 조작된 산물의 분석 공정에 의해 제조될 수 있다. 3차원 모델은 일반적으로 이용 가능하며 당업자에게는 익숙하다. 선택된 후보 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 예시하고 디스플레이하고 가능한 면역원성을 측정할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다(예를 들어, 캘리포니아주 몬로비아 소재의 젠코(Xencor, Inc.)의 이뮤노필터(Immunofilter) 프로그램). 이들 디스플레이를 조사하여 후보 서열의 작용에 있어 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 스캐폴드 단백질의 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 표적 항원(들)에 대한 친화도와 같은 원하는 특성이 달성되도록 부모 서열 및 기준 서열로부터 잔기를 선택하고 조합할 수 있다. 상기 절차에 대안적으로 또는 이에 부가하여, 다른 적절한 조작 방법이 사용될 수 있다.
피기백
트랜스포존
시스템
본 발명의 방법은 항원 수용체를 본 발명의 1차 인간 T 세포에 도입하는데 사용되는 방법에 관계없이 본 발명의 변형된 TSCM을 생산한다. 본 발명의 방법은 본 발명의 항원 수용체 또는 치료 단백질을 피기백 트랜스포존 시스템을 사용하여 1차 인간 T 세포에 도입할 때 본 발명의 변형된 TSCM의 더 큰 효능 및/또는 더 많은 존재량, 비율, 수율을 가진 본 발명의 변형된 TSCM을 생산한다. 본 발명의 피기백 트랜스포존 시스템은 본 발명의 항원 수용체를 포함하는 피기백 트랜스포존을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 1차 인간 T 세포는 본 발명의 항원 수용체를 포함하는 피기백 트랜스포존과 본 발명의 트랜스포사제를 동시에(또는 매우 가까운 시간 근접성으로) 접촉시킨다. 예를 들어, 트랜스포존과 트랜스포사제를 세포 내로 도입하기 전에 1차 인간 T 세포, 트랜스포존 및 트랜스포사제는 동일한 용기(예를 들어, 큐벳)에 포함된다 - 그러나 이들은 세포 없이 상호작용이 허용되지 않는다. 바람직하게는, 트랜스포존과 트랜스포사제를 세포 내로 도입하기 전에 1차 인간 T 세포는 본 발명의 항원 수용체를 포함하는 피기백 트랜스포존과 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제와 동시에 접촉된다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제는 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제를 코딩하는 mRNA 서열이다.
피기백 트랜스포존 및 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제에 관한 추가의 개시 내용은 국제 특허 공개 WO 2010/099296호, 미국 특허 제8,399,643호, 미국 특허 제9,546,382호, 미국 특허 제6,218,185호, 제6,551,825호, 미국 특허 제6,962,810호, 및 미국 특허 제7,105,343호에서 찾아볼 수 있으며, 이들의 내용은 각각 본원에 그 전문으로 참고로 포함된다.
본 발명은 DNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조물을 숙주 세포 내로 도입하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 도입 단계는 피기백 트랜스포존 시스템에 의해 매개된다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 2개의 시스 조절 격리 인자가 측면에 위치한 항원 수용체 또는 치료 단백질을 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 피기백 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포존이 피기백 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포사제가 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제인 실시양태에서, 트랜스포사제를 코딩하는 서열은 mRNA 서열이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 피기백™(PB) 트랜스포사제 효소이다. 피기백(PB) 트랜스포사제 효소는 하기와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 하기 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다:
특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4의 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 2개 이상에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4의 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 3개 이상에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4의 서열의 하기 위치 30, 165, 282, 및 538 각각에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4의 서열의 위치 30에서 아미노산 치환은 이소류신(I)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4의 서열의 위치 165에서 아미노산 치환은 글리신(G)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4의 서열의 위치 282에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4의 서열의 위치 538에서 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에서 리신(K)으로의 치환이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제 효소는 위치 30에서 아미노산 치환이 이소류신(I)에서 발린(V)으로의 치환이고, 위치 165에서 아미노산 치환이 글리신(G)에서 세린(S)으로의 치환이고, 위치 282에서 아미노산 치환이 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이고, 위치 538에서 아미노산 치환이 아스파라긴(N)에서 리신(K)으로의 치환인 서열 번호 4의 서열의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제 효소는 하기와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:
트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 서열의 위치 3, 46, 82, 103, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 258, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 486, 503, 552, 570 및 591 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 위치 46, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 485, 503, 552 및 570 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 3에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 아스파라긴(N)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 46에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 46에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 트레오닌(T)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 82에서 아미노산 치환은 이소류신(I)에서 트립토판(W)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 103에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 119에서 아미노산 치환은 아르기닌(R)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 125에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 125에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 177에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 177에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 히스티딘(H)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 180에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 180에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 180에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 185에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 187에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 200에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 트립토판(W)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 207에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 209에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 226에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 235에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 아르기닌(R)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 240에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 241에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 243에서 아미노산 치환은 프롤린(P)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 258에서 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 296에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 트립토판(W)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 296에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 티로신(Y)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 296에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 298에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 298에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 298에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 311에서 아미노산 치환은 프롤린(P)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 311에서 아미노산 치환은 프롤린(P)에서 발린으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 315에서 아미노산 치환은 아르기닌(R)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 319에서 아미노산 치환은 트레오닌(T)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 327에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 아르기닌(R)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 328에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 340에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 340에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 421에서 아미노산 치환은 아스파르트산(D)에서 히스티딘(H)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 436에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 456에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 티로신(Y)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 470에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 485에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 503에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 503에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 552에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 570에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 트레오닌(T)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 591에서 아미노산 치환은 글루타민(Q)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 591에서 아미노산 치환은 글루타민(Q)에서 아르기닌(R)으로의 치환이다.
트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 2, 3, 4, 5, 6개 이상에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 2, 3, 4, 5, 6개 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 103에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 194에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 372에서 아미노산 치환은 아르기닌(R)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 375에서 아미노산 치환은 리신(K)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 450에서 아미노산 치환은 아스파르트산(D)에서 아스파라긴(N)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 509에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 위치 570에서 치환은 아스파라긴(N)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환을 포함할 수 있다. 피기백™ 트랜스포사제 효소가 서열 번호 4의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환을 포함하는 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5의 서열의 위치 372, 375 및 450에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환, 서열 번호 4의 위치 372에서 아르기닌(R)에서 알라닌(A)으로의 치환, 및 서열 번호 4의 위치 375에서 리신(K)에서 알라닌(A)으로의 치환을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 4의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환, 서열 번호 4의 위치 372에서 아르기닌(R)에서 알라닌(A)으로의 치환, 서열 번호 4의 위치 375에서 리신(K)에서 알라닌(A)으로의 치환 및 서열 번호 4의 위치 450에서 아스파르트산(D)에서 아스파라긴(N)으로의 치환을 포함할 수 있다.
"도입"은 폴리뉴클레오티드 구조물이 숙주 세포의 내부에 접근하는 방식으로 구조물을 공장에 제공하는 것을 의미한다. 단지 폴리뉴클레오티드 구조물이 숙주의 한 세포의 내부에 접근하기만 한다면, 본 발명의 방법은 폴리뉴클레오티드 구조물을 숙주 세포에 도입하는 특정 방법에 의존하지 않는다. 박테리아, 식물, 진균 및 동물에 폴리뉴클레오티드 구조물을 도입하는 방법은 당 업계에 잘 공지되어 있으며, 안정한 형질전환 방법, 일시적인 형질전환 방법 및 바이러스 매개 방법을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 용어 "내인성"은 표적 유전자 또는 이것이 도입되는 숙주 세포와 자연적으로 관련된 핵산 또는 단백질 서열을 지칭한다.
"안정한 형질전환"은 공장에 도입된 폴리뉴클레오티드 구조물이 숙주의 게놈에 통합되어 그 자손에 유전될 수 있는 것을 의미한다.
"일시적 형질전환"은 숙주에 도입된 폴리뉴클레오티드 구조물이 숙주의 게놈에 통합되지 않는 것을 의미한다.
바람직한 실시양태에서, 피기백 트랜스포존 시스템은 안정한 형질전환에 의해 외인성 서열을 1차 인간 T 세포에 도입하여 변형된 TSCM 또는 TCM을 생성하는데 사용된다.
추가적인 트랜스포존 시스템
발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 슬리핑 뷰티 트랜스포존이다. 특정 실시양태, 특히 트랜스포존이 슬리핑 뷰티 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 또는 과활성 슬리핑 뷰트 트랜스포사제(SB100X)이다.
본 발명은 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM) 또는 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체 또는 치료 단백질을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 트랜스포존 조성물 및 (b) 트랜스포사제 또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포사제 조성물을 1차 인간 T 세포에 도입하여 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 변형된 T 세포가 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM) 또는 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM) 또는 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM) 또는 다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 방법으로서, (a) 항원 수용체를 포함하는 트랜스포존을 포함하는 트랜스포존 조성물 및 (b) 트랜스포사제 또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포사제 조성물을 다수의 1차 인간 T 세포에 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하며, 상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 줄기 기억 T 세포(TSCM) 또는 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM) 또는 다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 슬리핑 뷰티 트랜스포존이다. 특정 실시양태, 특히 트랜스포존이 슬리핑 뷰티 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 또는 과활성 슬리핑 뷰티 트랜스포사제(SB100X)이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 효소는 하기와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 과활성 슬리핑 뷰티(SB100X) 트랜스포사제 효소는 하기와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제는 헬리트론 트랜스포사제이다. 헬리트론 트랜스포사제는 300 내지 360만 년 전에 활성이 있던 박쥐 게놈의 고대 요소인 헬레이저 트랜스포존을 동원한다. 본 발명의 예시적인 헬레이저 트랜스포존은 Helibat1을 포함하며, 이는 하기를 포함하는 핵산 서열을 포함한다:
다른 트랜스포사제와 달리, 헬리트론 트랜스포사제는 RN아제 H 유사 촉매 도메인을 함유하지 않지만, 대신에 복제 개시 도메인(Rep) 및 DNA 헬리카제 도메인으로 구성된 RepHel 모티프를 포함한다. Rep 도메인은 HUH 슈퍼 패밀리 뉴클레아제의 뉴클레아제 도메인이다.
본 발명의 예시적인 헬리트론 트랜스포사제는 하기를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다:
헬리트론 전위에서, 트랜스포존의 3 '말단에 가까운 헤어핀은 종결 인자로서 기능을 한다. 그러나 이 헤어핀은 트랜스포스포사제에 의해 우회되어, 측면 서열의 형질도입을 초래할 수 있다. 또한, 헬레이저 전위는 공유적으로 폐쇄된 원형의 중간체를 생성한다. 또한, 헬리트론 전위는 표적 부위 중복이 없을 수 있다. 헬레이저 서열에서, 트랜스포사제는 LTS 및 RTS라고 명명된 좌측 및 우측 말단 서열이 측면에 위치한다. 이들 서열은 보존된 5'-TC/CTAG-3' 모티프로 종결된다. 헤어핀 종결 구조를 형성할 잠재력을 가진 19 bp 회문 염기 서열은 RTS의 11개 뉴클레오티드 상류에 위치하며, 서열 (서열 번호 29)로 이루어진다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제는 Tol2 트랜스포사제이다. Tol2 트랜스포존은 메다카 어류의 게놈으로부터 단리 또는 유래될 수 있으며, hAT 패밀리의 트랜스포존과 유사할 수 있다. 본 발명의 예시적인 Tol2 트랜스포존은 약 4.7 킬로베이스를 포함하는 서열에 의해 코딩되고, 4개의 엑손을 함유하는 Tol2 트랜스포사제 코딩 유전자를 함유한다. 본 발명의 예시적인 Tol2 트랜스포사제는 하기를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다:
역전된 반복 서열, 말단 가까운 서열 및 Tol2 트랜스포사제를 포함하는 본 발명의 예시적인 Tol2 트랜스포존은 하기를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다:
상동 재조합
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 본 발명의 변형된 CAR-TSCM 또는 CAR-TCM은 상동 재조합에 의해 항원 수용체를 본 발명의 1차 인간 T 세포에 도입함으로써 생산된다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 상동 재조합은 본 발명의 게놈 편집 조성물 또는 구조물에 의해 유도되는 단일 또는 이중 가닥 절단에 의해 유도된다. 본 발명의 상동 재조합 방법은 게놈 서열에 본 발명의 게놈 편집 조성물 또는 구조물을 접촉시켜 서열에 하나 이상의 절단을 유도하고 외인성 공여 서열 조성물에 게놈 서열 내 진입 지점을 제공하는 단계를 포함한다. 본 발명의 공여 서열 조성물은 세포의 천연 DNA 복구 기구에 의해 유도된 진입 지점에서 게놈 서열에 통합된다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 상동 재조합은 본 발명의 항원 수용체 및/또는 공여 서열 조성물을 코딩하는 서열을 "게놈 세이프 하버(genomic safe harbor)" 부위에 도입한다. 특정 실시양태에서, 포유동물 게놈 서열은 게놈 세이프 하버 부위를 포함한다. 특정 실시양태에서, 영장류 게놈 서열은 게놈 세이프 하버 부위를 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 게놈 서열은 게놈 세이프 하버 부위를 포함한다.
게놈 세이프 하버 부위는 반드시 새로 삽입된 유전 요소가 신뢰성 있게 기능을 하고(예를 들어, 치료 유효한 발현 수준으로 발현되고) 숙주 생물체에 위험을 일으키는 해로운 변화를 숙주 게놈에 일으키지 않게 하는 방식으로 새로운 유전 물질의 통합을 수용할 수 있다. 가능한 게놈 세이프 하버는 인간 알부민 유전자의 인트론 서열, 아데노 관련 바이러스 부위 1(AAVS1), 염색체 19 상의 AAV 바이러스의 자연 발생적 통합 부위, 케모카인(C-C 모티프) 수용체 5(CCR5) 유전자의 부위 및 마우스 Rosa26 유전자좌의 인간 오르토 로그 부위를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 상동 재조합은 본 발명의 항원 수용체 및/또는 공여 서열 조성물을 코딩하는 서열을 내인성 T 세포 수용체 또는 주요 조직 적합성 복합체(MHC: major histocompatibility complex) 중 하나 이상의 구성요소를 코딩하는 서열에 도입한다. 특정 실시양태에서, 내인성 T 세포 수용체 또는 MHC를 코딩하는 게놈 서열 내에 상동 재조합을 유도하는 것은 내인성 유전자를 파괴하고, 경우에 따라 내인성 유전자의 코딩 서열의 일부분을 본 발명의 공여 서열 조성물로 대체시킨다. 특정 실시양태에서, 내인성 T 세포 수용체 또는 MHC를 코딩하는 게놈 서열 내에 상동 재조합을 유도하는 것은 내인성 유전자를 파괴하고, 경우에 따라 내인성 유전자의 전체 코딩 서열을 본 발명의 공여 서열 조성물로 대체시킨다. 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 상동 재조합에 의한 본 발명의 항원 수용체 또는 공여 서열 조성물을 코딩하는 서열의 도입은 항원 수용체를 내인성 T 세포 프로모터에 작동 가능하게 연결시킨다. 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 상동 재조합에 의한 본 발명의 항원 수용체 또는 공여 서열 조성물을 코딩하는 서열의 도입은 항원 수용체 또는 치료 단백질을 전사 또는 번역 조절 요소에 작동 가능하게 연결시킨다. 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 상동 재조합에 의한 본 발명의 항원 수용체 또는 공여 서열 조성물을 코딩하는 서열의 도입은 항원 수용체 또는 치료 단백질을 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결시킨다. 특정 실시양태에서, 전사 조절 요소는 내인성 T 세포 5'UTR을 포함한다.
상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물은 다수의 T 세포 중 적어도 하나의 1차 T 세포의 게놈 서열과 접촉한다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물은 다수의 T 세포 중 1차 T 세포의 일부분의 게놈 서열과 접촉한다. 특정 실시양태에서, 1차 T 세포의 일부분은 다수의 T 세포 중 총 1차 T 세포 수의 적어도 1%, 2%, 5%, 7%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트이다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물은 다수의 T 세포 중 각각의 1차 T 세포의 게놈 서열과 접촉한다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물은 단일 가닥 절단을 유도한다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물은 이중 가닥 절단을 유도한다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 도입 단계는 공여 서열 조성물을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 공여 서열 조성물은 항원 수용체를 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 공여 서열 조성물은 항원 수용체, 5' 게놈 서열 및 3 '게놈 서열을 코딩하는 서열을 포함하며, 상기 5' 게놈 서열은 게놈 편집 조성물에 의해 유도된 절단 지점의 5'에 있는 1차 T 세포의 게놈 서열과 상동이거나 동일하고 상기 3' 게놈 서열은 게놈 편집 조성물에 의해 유도된 절단 지점의 3'에 있는 1차 T 세포의 게놈 서열과 상동이거나 동일하다. 특정 실시양태에서, 5' 게놈 서열 및/또는 3' 게놈 서열은 적어도 50 bp, 100 bp, 적어도 200 bp, 적어도 300 bp, 적어도 400 bp, 적어도 500 bp, 적어도 600 bp, 적어도 700 bp, 적어도 800 bp, 적어도 900 bp, 적어도 1000 bp, 적어도 1100 bp, 적어도 1200 bp, 적어도 1300 bp, 적어도 1400, 또는 적어도 1500 bp, 적어도 1600 bp, 적어도 1700 bp, 적어도 1800 bp, 적어도 1900 bp, 적어도 2000 bp 길이 또는 종점을 포함하여 이들 중 임의의 염기쌍(bp) 길이를 포함한다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물 및 공여 서열 조성물은 게놈 서열과 동시에 또는 순차적으로 접촉된다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물 및 공여 서열 조성물은 게놈 서열과 순차적으로 접촉되고, 게놈 편집 조성물이 먼저 제공된다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물은 DAN 결합 도메인을 코딩하는 서열 및 뉴클레아제 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물은 DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 TALEN의 DNA 결합 도메인을 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 ZFN의 DNA 결합 도메인을 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 실시양태에서, 뉴클레아제 도메인은 Cas9 뉴클레아제 또는 이의 서열을 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 실시양태에서, 뉴클레아제 도메인은 불활성 Cas9(서열 번호 33, 위치 10에서 아스파르트산(D)에서 알라닌(A)으로의 치환(D10A) 및 위치 840에서 히스티딘(H)에서 알라닌(A)으로의 치환(H840A)을 포함)를 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 실시양태에서, 뉴클레아제 도메인은 짧은 불활성 Cas9(서열 번호 32, 위치 10에서 아스파르트산(D)에서 알라닌(A)으로의 치환(D10A) 및 위치 540의 아스파라긴(N)에서 알라닌(A)으로의 치환(N540A)을 포함)를 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 실시양태에서, 뉴클레아제 도메인은 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하거나 추가로 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 실시양태에서, IIS형 엔도뉴클레아제는 AciI, Mn1I, AlwI, BbvI, BccI, BceAI, BsmAI, BsmFI, BspCNI, BsrI, BtsCI, HgaI, HphI, HpyAV, Mbo1I, My1I, PleI, SfaNI, AcuI, BciVI, BfuAI, BmgBI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BseRI, BsgI, BsmI, BspMI, BsrBI, BsrBI, BsrDI, BtgZI, BtsI, EarI, EciI, MmeI, NmeAIII, BbvCI, Bpu10I, BspQI, SapI, BaeI, BsaXI, CspCI, BfiI, MboII, Acc36I, FokI 또는 Clo051을 포함한다. 특정 실시양태에서, IIS형 엔도뉴클레아제는 Clo051을 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 실시양태에서, 뉴클레아제 도메인은 TALEN 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 포함하거나 추가로 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 실시양태에서, 뉴클레아제 도메인은 ZFN 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 포함하거나 추가로 포함한다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물은 게놈 서열 내 절단을 유도하고, 공여 서열 조성물은 1차 T 세포의 내인성 DNA 복구 기전을 사용하여 삽입된다. 상동 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 실시양태에서, 공여 서열 조성물의 삽입은 게놈 편집 조성물의 DNA 결합 부위를 제거함으로써 게놈 편집 조성물의 추가 활성을 방지한다.
본 발명의 상동 재조합 방법의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물 또는 구조물의 뉴클레아제 도메인은 1차 인간 T 세포의 게놈 서열 내 한정된 위치에서 절단을 도입할 수 있고, 동종 이량체 또는 이종 이량체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제이다. 동종 이량체 또는 이종 이량체를 포함하는 이펙터 분자를 비롯한 이펙터 분자는 Cas9, Cas9 뉴클레아제 도메인 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, Cas9는 촉매 불활성이거나 "불활성화된" Cas9(dCas9)이다. 특정 실시양태에서, Cas9는 Cas9의 촉매 불활성 또는 "불활성화된" 뉴클레아제 도메인이다. 특정 실시양태에서, dCas9는 본원에서 "작은" dCas9 또는 dSaCas9로 지칭되는, 전장의 촉매 불활성화된 Cas9로부터 유래된 더 짧은 서열에 의해 코딩된다.
특정 실시양태에서, 불활성된 작은 Cas9(dSaCas9)는 활성의 뉴클레아제에 작동 가능하게 연결된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 DNA 결합 도메인 및 분자 뉴클레아제를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진 융합 단백질을 제공하며, 상기 뉴클레아제는 작은 불활성화된 Cas9(dSaCas9)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 dSaCas9는 촉매 부위를 불활성화하는 돌연변이 D10A 및 N580A(밑줄 및 굵은체)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 dSaCas9는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
특정 실시양태에서, 본 발명의 dCas9는 스태필로코쿠스 피오제네스(Staphyloccocus pyogenes)로부터 단리 또는 유래된 dCas9를 포함한다. 특정 실시양태에서, dCas9는 촉매 부위를 불활성화하는 dCas9의 아미노산 서열의 위치 10 및 840에서 치환을 갖는 dCas9를 포함한다. 특정 실시양태에서, 이들 치환은 D10A 및 H840A이다. 특정 실시양태에서, dCas9의 아미노산 서열은 하기 서열을 포함한다:
본 발명의 특정 실시양태에서, 뉴클레아제 도메인은 dCas9 또는 dSaCas9 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 본원의 특정 실시양태에서, 뉴클레아제 도메인은 AciI, Mn1I, AlwI, BbvI, BccI, BceAI, BsmAI, BsmFI, BspCNI, BsrI, BtsCI, HgaI, HphI, HpyAV, Mbo1I, My1I, PleI, SfaNI, AcuI, BciVI, BfuAI, BmgBI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BseRI, BsgI, BsmI, BspMI, BsrBI, BsrBI, BsrDI, BtgZI, BtsI, EarI, EciI, MmeI, NmeAIII, BbvCI, Bpu10I, BspQI, SapI, BaeI, BsaXI, CspCI, BfiI, MboII, Acc36I, FokI 또는 Clo051을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 IIS형 엔도뉴클레아제 및 dSaCas9를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 뉴클레아제 도메인은 dSaCas9 및 Clo051을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 예시적인 Clo051 뉴클레아제 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다:
예시적인 dCas9-Clo051 뉴클레아제 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다(Clo051 서열은 밑줄, 링커는 굵은 기울임체, dCas9 서열은 기울임체로 나타냄):
특정 실시양태에서, 1차 인간 T 세포의 게놈 DNA 내 한정된 위치에서 절단을 도입할 수 있는 뉴클레아제는 동종 이량체 또는 이종 이량체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 본 발명의 게놈 편집 조성물 또는 구조물의 뉴클레아제 도메인은 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)로부터 단리, 유래 또는 재조합된 뉴클레아제 도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. TALEN은 예정된 DNA 서열 또는 개별 핵산에 결합하는 디자이너 단백질을 만드는 방법을 제공하는 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인을 가진 전사 인자이다. 모듈 DNA 결합 도메인은 전사 활성화제 유사(TAL: transcriptional activator-like) 단백질, 또는 더 구체적으로 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)에서 확인되어 관심의 DNA 서열에 결합하는 합성 전사 인자의 새로운(de novo) 생성을 가능하게 하며, 바람직할 경우, 단백질 또는 폴리펩티드 상에 존재하는 제2 도메인이 DNA와 관련된 활성을 수행할 수 있게 한다. TAL 단백질은 생물체 산토모나스(Xanthomonas)와 랄스토니아(Ralstonia)에서 유래하였다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물 또는 구조물의 뉴클레아제 도메인은 TALEN 및 IIS형 엔도뉴클레아제로부터 단리, 유도 또는 재조합된 뉴클레아제 도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, IIS형 엔도뉴클레아제는 AciI, Mn1I, AlwI, BbvI, BccI, BceAI, BsmAI, BsmFI, BspCNI, BsrI, BtsCI, HgaI, HphI, HpyAV, Mbo1I, My1I, PleI, SfaNI, AcuI, BciVI, BfuAI, BmgBI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BseRI, BsgI, BsmI, BspMI, BsrBI, BsrBI, BsrDI, BtgZI, BtsI, EarI, EciI, MmeI, NmeAIII, BbvCI, Bpu10I, BspQI, SapI, BaeI, BsaXI, CspCI, BfiI, MboII, Acc36I, FokI 또는 Clo051을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, IIS형 엔도뉴클레아제는 Clo051(서열 번호 34)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 게놈 편집 조성물 또는 구조물의 뉴클레아제 도메인은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 및 IIS형 엔도뉴클레아제로부터 단리, 유래 또는 재조합된 뉴클레아제 도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, IIS형 엔도뉴클레아제는 AciI, Mn1I, AlwI, BbvI, BccI, BceAI, BsmAI, BsmFI, BspCNI, BsrI, BtsCI, HgaI, HphI, HpyAV, Mbo1I, My1I, PleI, SfaNI, AcuI, BciVI, BfuAI, BmgBI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BseRI, BsgI, BsmI, BspMI, BsrBI, BsrBI, BsrDI, BtgZI, BtsI, EarI, EciI, MmeI, NmeAIII, BbvCI, Bpu10I, BspQI, SapI, BaeI, BsaXI, CspCI, BfiI, MboII, Acc36I, FokI 또는 Clo051을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, IIS형 엔도뉴클레아제는 Clo051(서열 번호 34)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다.
본원의 게놈 편집 조성물 또는 구조물의 특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제 도메인은 공유적으로 결합될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 게놈 편집 조성물 또는 구조물의 특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제 도메인은 비공유 결합을 통해 작동 가능하게 연결될 수 있다.
변형된 T 세포로부터의 분비 단백질
본 발명의 조성물 및 방법의 특정 실시양태에서, 변형된 T 세포는 치료 단백질을 발현한다. 본 발명의 치료 단백질은 분비 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 치료와 관련하여, 치료 단백질은 분비 인간 단백질을 포함하는 인간 단백질이다. 본 발명의 CAR-T 세포에 의해 발현되거나 분비될 때, CAR-T 세포 및 이로부터 분비된 치료 단백질을 포함하는 조합물은 단일 요법으로 간주할 수 있다. 그러나 본 발명의 CAR-T 세포는 제2 약제와의 병용 요법으로 투여될 수 있다. 본 발명의 변형된 T 세포에 의해 발현되거나 분비될 수 있는 인간 분비 단백질의 데이터베이스는 proteinatlas.org/search/protein_class:Predicted%20secreted%20proteins에서 확인될 수 있으며, 그 내용은 본원에 참고로 포함된다. 예시적인 인간 분비 단백질을 제공하지만, 표 1에서의 인간 분비 단백질에 제한되지 않는다.
<표 1>
본 발명의 일부 실시양태에서, T 세포는 분비 단백질 및 분비 인간 단백질을 포함하는 치료 단백질을 발현하도록 변형된다. 장애의 방법의 일부 실시양태에서, 인간 단백질을 발현 또는 분비하도록 변형된 CAR-T 세포를 포함하는 조성물을 사용하여 응고 장애를 치료한다. 혈액 응고는 응고 캐스케이드로 알려진 다단계 과정을 통해 일어난다. 외인성 경로에서, 조직 인자(인자 III 또는 트롬보플라스틴으로도 알려짐)는 인자 VII과 접촉하여 활성화된 VIIa 복합체를 형성한다. 이것이 응고 프로테아제 캐스케이드를 개시하여 불활성 인자 X를 활성의 프로테아제 인자 Xa로 전환시키고, 이는 활성화된 인자 V와 함께 프로트롬빈(II)으로부터 트롬빈(IIa)를 생산한다. 내인성 경로에서 콜라겐은 고분자량 키니노겐, 프리칼리크레인 및 인자 XII과 복합체를 형성하여 인자 XII를 인자 XIIa로 전환한다. 인자 XIIa는 인자 XI을 인자 XIa로 전환하고, 인자 XIa는 인자 IX를 활성화하여 인자 IXa를 생산하며, 이는 인자 FVIIIa와 함께 테나아제 복합체를 형성하고, 이는 인자 X를 활성화하고, 이는 프로트롬빈(II)을 트롬빈(IIa)으로 전환한다. 트롬빈은 차례로 피브리노겐(I)을 피브린으로 전환하며, 이는 인자 XIIIa와 함께 가교 결합된 피브린 응혈을 형성한다. 많은 응고 장애는 응고 캐스케이드와 관련된 혈액에서 분비 단백질의 수준이 낮은 결과이다. 응고 장애는 부상시 몸에서 흘리는 혈액량을 크게 증가시키거나 피부 아래 또는 필수 장기에서 출혈을 일으킬 수 있다. 이 장애는 흔히 유전적이다. 응고 인자의 결핍에 의해 유발되는 예시적인, 그러나 비제한적인 질환에는 혈우병, 폰 빌레브란트병 및 항트롬빈 III, 단백질 C 또는 단백질 S의 결핍이 포함된다. 혈우병 A와 B는 X 연관되며, 응고 인자 VIII 및 인자 IX(FIX) 각각의 수준이 불충분하여 유발된다. 혈우병 C는 불충분한 인자 XI에 의해 유발된다. 인자 II, VII, X 또는 XII 결핍은 또한 출혈 장애를 일으킬 수 있다. 폰 빌레브란트병은 혈액 내 폰 빌레브란트 응고 인자의 낮은 수준에서 기인한다. 일부 경우에, 응고를 조절하는 혈액 단백질의 결핍은 너무 많은 응고를 초래할 수 있다. 인자 V 라이덴(Leiden)은 유전병으로, 인자 V 라이덴 단백질이 과잉 반응하여 혈액의 너무 빈번하거나 너무 많은 응고를 일으킨다. 출혈을 조절하는데 도움을 주는 항트롬빈 III, 단백질 C 또는 단백질 S의 결핍도 과도한 응고를 유발할 수 있다. 현재, 혈우병과 같은 응고 장애는 혈액 수혈 또는 결핍 응고 인자의 주입(대체 요법)으로 치료된다. 그러나 대체 요법의 합병증에는 응고 인자에 대한 항체 발생, 혈액 유래 산물로부터 바이러스 감염 및 관절 손상이 포함된다. 따라서 추가적인 치료법이 요구된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, T 세포는 분비 단백질 및 분비 인간 단백질을 포함하는 치료 단백질을 발현하도록 변형된다. 장애의 방법의 일부 실시양태에서, 인간 단백질을 발현 또는 분비하도록 변형된 CAR-T 세포를 포함하는 조성물이 효소 대체 요법에 사용된다. 효소 대체 요법은 전형적으로 질환의 증상을 야기하는 근본적인 효소 결함을 상쇄하는 효소를 포함하는 치료 유효량의 조성물의 정맥 내 주입을 수반한다. 따라서 결핍된 효소 활성은 이러한 방식으로 외인성으로 공급된다. 본 발명의 변형된 T 세포에 의해 치료될 수 있는 예시적인 질환은 리소좀 축적병, 고쉐병(글루코세레브로시다아제 효소), 파브리병, 뮤코다당증 I(MPS I: mucopolysaccharidosis I), 뮤코다당증 II(MPS II 또는 헌터 증후군, 이두로네이트 2-설파타아제 결핍에 의해 야기됨), 뮤코다당증 VI(MPS VI, 아릴설파타아제 B 결핍에 의해 야기됨) 및 폼페병(또는 글리코겐 축적병 II형, 산 알파-글루코시다아제 결핍에 의해 야기됨)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 효소 대체 요법으로 치료될 수 있는 추가 질환으로는 아데노신 디아미나아제(ADA: Adenosine deaminase) 결핍, 간 효소 N-아세틸글루타메이트 신테타아제(NAGS: N-acetylglutamate synthetase) 결핍에 의한 고암모니아 혈증, 저인산효소증, 리소좀 산 리파아제 결핍, 모르키오 증후군 A, 월만 LAL 리소좀 산 리파아제 결핍, A1AT(Alpha1-Antitrypsin: 알파1-항트립신) 결핍 및 요소 회로 질환이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 효소 대체 요법 중에 환자에게 공급되는 효소는 알파1-항트립신, β-글루코세레브로시다아제, 아데노신 디아미나아제, 알파-갈락토시다아제 A, α-L-이두로니다제, 이두로네이트-2-설파타아제, N-아세틸갈락토사민-6 설파타아제, N-아세틸갈락토사민-4 설파타아제 및 리소좀 산 리파아제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일부 실시양태에서, T 세포는 분비 단백질 및 분비 인간 단백질을 포함하는 치료 단백질을 발현하도록 변형된다. 장애의 방법의 일부 실시양태에서, 인간 단백질을 발현 또는 분비하도록 변형된 CAR-T 세포를 포함하는 조성물을 사용하여 인간 항체를 생산한다. 일부 실시양태에서, 분비 단백질을 발현하는 변형된 T 세포에 의해 치료되는 질환은 항체 또는 항체 단편의 정맥 내 주입 또는 주사를 통해 치료될 수 있는 질환이다. 항체 기반 요법은 암 이외에도 관절염 및 천식과 같은 면역 기반 질환 및 감염을 비롯하여 많은 유형의 질환뿐 아니라 기타 질환을 치료하는데 사용된다. 본 발명의 변형된 T 세포로 치료될 수 있는 예시적인, 그러나 비제한적인 질환 목록은 혈소판 응집, 클로스트리디움 디피실리(Clostirdium difficile) 감염, 류마티스 관절염, 크론병, 판상형 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 소아 특발성 관절염, 알츠하이머병, 패혈병, 다발성 경화증, 고콜레스테롤혈증, 전신 홍반 루푸스, 장기 이식 거부 반응 방지, 바이러스 감염, 천식, 중증 알레르기 장애, 망막병증, 골다공증, 염증성 장 질환, 염증성 질환, 인플루엔자 A, 발작성 야간 혈색뇨, 그람 음성 박테리아에 의한 패혈증, 건선, 침습성 칸디다 감염, 궤양성 대장염, 저콜레스테롤혈증, 호흡기 세포융합 바이러스 감염, 국소 분절성 사구체 경화증, 이식편대 숙주병, 강직성 척추염, HIV 감염, 궤양성 대장염, 자가면역 질환, 만성 천식, 녹내장 수술 후 흉터 감소, 고콜레스테롤혈증, 백혈구 질환, 전신 피부경화증, 호흡기 세포융합 바이러스(예방), 홍반 루푸스, 1형 당뇨병, 염증, 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 감염, 황반 변성, 탄저병, 거대세포 바이러스 감염, 기도, 피부 및 소화관의 염증, 전신 홍반 루푸스, 류마티스성 질환, 포도막염, 거대세포 바이러스 감염, 피부근염, 다발성 근염, 섬유증, 맥락막 및 망막 혈관신생, 근위축증, 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 감염, 루푸스 신염, 소포성 림프종, 만성 간염 B 및 궤양성 대장염을 포함한다.
입양 세포 요법으로서 변형된 세포의 주입
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 변형된 세포는 주사 또는 정맥 내 주입을 통해 환자에게 전달된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 1kg당 2x105 내지 5x108 세포, 또는 이들의 임의의 범위, 값 또는 분율을 포함한다.
본원의 특정 실시양태에서, 본 발명의 변형된 세포는 주사 또는 정맥 내 주입을 통해 환자에게 전달된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 0.2x106 내지 20x106 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 0.2x106 세포, 투여당 환자 체중 kg당 2x106 세포, 투여당 환자 체중 kg당 20x106 세포, 투여당 환자 체중 kg당 이들 사이의 임의의 세포를 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 변형된 세포는 주사 또는 정맥 내 주입을 통해 환자에게 전달된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 1㎏당 1x106 세포 또는 약 1x106 세포를 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 변형된 세포는 주사 또는 정맥 내 주입을 통해 환자에게 전달된다. 특정 실시양태에서, 본원의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 1kg당 3x106 세포 또는 약 3x106 세포를 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 변형된 세포는 주사 또는 정맥 내 주입을 통해 환자에게 전달된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 0.7x106 내지 6.7x106 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 0.7x106 세포, 투여당 환자 체중 kg당 6.7x106 세포, 또는 투여당 환자 체중 kg당 이들 사이의 임의의 세포를 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 변형된 세포는 주사 또는 정맥 내 주입을 통해 환자에게 전달된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 0.7x106 내지 16x106 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 0.7x106 세포, 투여당 환자 체중 kg당 2x106 세포, 투여당 환자 체중 kg당 6x106 세포, 투여당 환자 체중 kg당 10.7x106 세포, 투여당 환자 체중 kg당 16x106 세포, 또는 투여당 환자 체중 kg당 이들 사이의 임의의 세포를 포함한다.
본원의 특정 실시양태에서, 본 발명의 변형된 세포는 주사 또는 정맥 내 주입을 통해 환자에게 전달된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 1.2x106 내지 7.1x106 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 1.2x106 세포, 투여당 환자 체중 kg당 7.1x106 세포, 또는 투여당 환자 체중 kg당 이들 사이의 임의의 개수의 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 2x106 내지 3x106 세포를 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 변형된 세포는 주사 또는 정맥 내 주입을 통해 환자에게 전달된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 1106x106 내지 2106x106 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 1106x106 세포, 투여당 환자 체중 kg당 2106x106 세포 또는 투여당 환자 체중 kg당 이들 사이의 임의의 개수의 세포를 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 변형된 세포는 주사 또는 정맥 내 주입을 통해 환자에게 전달된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 0.7x106 내지 1.3x106 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 0.7x106 세포, 투여당 환자 체중 kg당 1.3x106 세포, 또는 투여당 환자 체중 kg당 이들 사이의 임의의 개수의 세포를 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 변형된 세포는 주사 또는 정맥 내 주입을 통해 환자에게 전달된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 1회 또는 다회 용량을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 분할된 용량을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 초기 용량 및 유지 용량을 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 변형된 세포는 T 세포이고, T 세포는 시험관 내 증식 또는 약학적으로 허용 가능한 담체와의 제제화 전에 T 세포 마커에 따라 분류될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 T 세포는 CD8+ 및/또는 CD4+ 마커를 사용하여 분류될 수 있다.
핵산 분자
단백질 스캐폴드를 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 mRNA, hnRNA, tRNA 또는 임의의 다른 형태와 같은 RNA 형태일 수 있거나, 클로닝에 의해 수득된 또는 합성 생산된 cDNA 및 게놈 DNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는 DNA의 형태, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. DNA는 삼중 가닥, 이중 가닥 또는 단일 가닥 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 적어도 하나의 가닥의 DNA 또는 RNA의 임의의 부분은 센스 가닥으로도 알려진 코딩 가닥일 수 있거나, 안티 센스 가닥으로도 지칭되는 비코딩 가닥일 수 있다.
본 발명의 단리된 핵산 분자는, 경우에 따라 하나 이상의 인트론과 함께, 오픈 리딩 프레임(ORF: open reading frame), 예를 들어, 그러나 이에 제한되지 않는, 적어도 하나의 단백질 스캐폴드의 적어도 하나의 특정 부분을 포함하는 핵산 분자; 표적 단백질에 결합하는 단백질 스캐폴드 또는 루프 영역에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자; 및 상기한 것들과 실질적으로 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 유전자 암호의 축퇴성으로 인해, 본원에 기재된 바와 같고/거나 당 업계에 공지된 바와 같은 단백질 스캐폴드, Centyrin, CAR, CARTyrin, 트랜스포존 및/또는 트랜스포사제를 여전히 코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 물론, 유전자 암호는 당 업계에 잘 공지되어 있다. 따라서, 당업자가 본 발명의 특정 단백질 스캐폴드를 코딩하는 이러한 축퇴성 핵산 변이체를 생성하는 것은 일상적일 것이다. 예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., 상기]를 참조하며, 이러한 핵산 변이체는 본 발명에 포함된다.
본원에서 지시된 바와 같이, 단백질 스캐폴드, Centyrin, CAR, CARTyrin, 트랜스포존 및/또는 트랜스포사제를 코딩하는 핵산을 포함하는 본 발명의 핵산 분자는 단백질 스캐폴드, Centyrin, CAR, CARTyrin, 트랜스포존 및/또는 트랜스포사제 단편 자체의 아미노산 서열을 코딩하는 것; 전체 단백질 스캐폴드, Centyrin, CAR, CARTyrin, 트랜스포존, 및/또는 트랜스포사제 또는 이들의 일부에 대한 코딩 서열; 단백질 스캐폴드, Centyrin, CAR, CARTyrin, 트랜스포존 및/또는 트랜스포사제, 단편 또는 일부분에 대한 코딩 서열뿐만 아니라, 적어도 하나의 인트론과 같은 추가의 코딩 서열을 포함하거나 포함하지 않으면서, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호(예를 들어, 리보솜 결합 및 mRNA의 안정성)를 포함하는 mRNA 프로세싱, 전사에 역할을 하는 전사되는 비번역 서열과 같은 비코딩 5' 및 3' 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는 추가적인 비코딩 서열과 함께, 적어도 하나의 신호 리더 또는 융합 펩티드에 대한 코딩 서열과 같은 추가의 서열; 추가적인 기능을 제공하는 아미노산과 같은 추가적인 아미노산을 코딩하는 추가의 코딩 서열을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 단백질 스캐폴드, Centyrin, CAR, CARTyrin, 트랜스포존 및/또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열은 단백질 스캐폴드 단편 또는 일부분을 포함하는 융합된 단백질 스캐폴드, Centyrin, CAR, CARTyrin, 트랜스포존 및/또는 트랜스포사제의 정제를 용이하게 하는 펩티드를 코딩하는 서열과 같은 마커 서열에 융합될 수 있다,
핵산의 제작
본 발명의 단리된 핵산은 당 업계에 잘 공지된 바와 같이, (a) 재조합 방법, (b) 합성 기술, (c) 정제 기술, 및/또는 (d) 이들의 조합을 사용하여 제조될 수 있다.
핵산은 편리하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 이외의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함하는 다중 클로닝 부위가 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕기 위해 핵산에 삽입될 수 있다. 또한, 번역 가능한 서열을 삽입하여 본 발명의 번역된 폴리뉴클레오티드의 단리를 도울 수 있다. 예를 들어, 헥사-히스티딘 마커 서열은 본 발명의 단백질을 정제하는 편리한 수단을 제공한다. 코딩 서열을 제외한 본원의 핵산은 경우에 따라, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 어댑터 또는 링커이다.
클로닝 및/또는 발현에서 기능을 최적화하기 위해, 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕기 위해, 또는 폴리뉴클레오티드의 세포 내로의 도입을 향상시키기 위해, 추가의 서열이 상기 클로닝 및/또는 발현 서열에 첨가될 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터 및 링커의 사용은 당 업계에 잘 공지되어 있다(예를 들어, 상기 문헌[Ausubel] 또는 상기 문헌[Sambrook] 참조).
핵산을 제작하기 위한 재조합 방법
RNA, cDNA, 게놈 DNA 또는 이들의 임의의 조합과 같은 본 발명의 단리된 핵산 조성물은 당업자에게 공지된 많은 클로닝 방법론을 사용하여 생물학적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 엄격한 조건하에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 원하는 서열을 동정한다. RNA의 단리 및 cDNA 및 게놈 라이브러리의 제작은 당업자에게 잘 공지되어 있다(예를 들어, 상기 문헌[Ausubel] 또는 상기 문헌[Sambrook] 참조).
벡터 및 숙주 세포
본 발명은 또한 당 업계에 공지된 바와 같이, 본 발명의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 재조합 벡터로 유전자 조작된 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의한 적어도 하나의 단백질 스캐폴드의 생산에 관한 것이다. 예를 들어, 상기 문헌[Sambrook, et al.; Ausubel, et al.]을 참조하며, 이들 각각은 전체가 본원에 참고로 포함된다.
예를 들어, PB-EF1a 벡터가 사용될 수 있다. 벡터는 하기 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
폴리뉴클레오티드는 경우에 따라 숙주에서의 증식을 위한 선별 마커를 함유하는 벡터에 연결될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 인산 칼슘 침전물과 같은 침전물 또는 하전된 지질과의 복합체로 도입된다. 벡터가 바이러스일 경우, 적절한 패키징 세포주를 사용하여 시험관 내에서 패키징한 다음 숙주 세포로 형질도입될 수 있다.
DNA 삽입물은 적절한 프로모터에 작동 가능하게 연결되어야 한다. 발현 구조물은 전사 개시, 종결을 위한 부위 및 전사되는 영역 내에 번역을 위한 리보솜 결합 부위를 추가로 포함할 것이다. 구조물에 의해 발현되는 성숙한 전사체의 코딩 부분은 바람직하게는 번역되는 mRNA의 말단에 적절하게 위치된 개시 및 종결 코돈(예를 들어, UAA, UGA 또는 UAG)에서 번역 개시를 포함할 것이며, 포유동물 또는 진핵 세포 발현에서 UAA 및 UAG가 선호된다.
발현 벡터는 바람직하게는 그러나 경우에 따라 적어도 하나의 선택 가능한 마커를 포함할 것이다. 이러한 마커로는 예를 들어, 진핵생물 세포 배양을 위한 암피실린, 제오신(Sh bla 유전자), 퓨로마이신(pac 유전자), 하이그로마이신 B(hygB 유전자), G418/제네티신(neo 유전자), 미코페놀산 또는 글루타민 신테타아제(GS, 미국 특허 제5,122,464호; 제5,770,359호; 제5,827,739호), 블라스티시딘(bsd 유전자) 내성 유전자뿐만 아니라 이. 콜라이 및 기타 박테리아 또는 원핵생물에서 배양하기 위한 암피실린, 제오신(Sh bla 유전자), 퓨로마이신(pac 유전자), 하이그로마이신 B(hygB 유전자), G418/제네티신(neo 유전자), 카나마이신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신, 카르베니실린, 블레오마이신, 에리트로마이신, 폴리믹신 B 또는 테트라사이클린(상기 특허는 이로써 전체가 본원에 참고로 포함됨) 내성 유전자가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 상기한 숙주 세포에 적절한 배양 배지 및 조건은 당 업계에 공지되어있다. 적합한 벡터는 당업자에게 기꺼이 명백할 것이다. 숙주 세포 내로 벡터 구조물의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온성 지질 매개 형질감염, 전기 천공, 형질도입, 감염 또는 다른 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법은 상기 문헌[Sambrook, Chapter 1-4 and 16-18; Ausubel, Chapters 1, 9, 13, 15, 16]을 참조한다.
발현 벡터는 바람직하게는 그러나 경우에 따라 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 변형된 세포를 단리하기 위한 적어도 하나의 선별 가능한 세포 표면 마커를 포함할 것이다. 본 발명의 선별 가능한 세포 표면 마커는 세포 또는 세포의 서브세트를 세포의 정의된 또 다른 서브세트와 구별하는 표면 단백질, 당단백질 또는 단백질 군을 포함한다. 바람직하게는 선택 가능한 세포 표면 마커는 본 발명의 조성물 또는 방법에 의해 변형된 세포를 본 발명의 조성물 또는 방법에 의해 변형되지 않은 세포와 구별한다. 이러한 세포 표면 마커는 "세포 표면 항원 무리(cluster of designation)" 또는 "분류 결정 인자(classification of determinant)" 단백질(종종 "CD"로 약칭됨), 예를 들어 CD19, CD271, CD34, CD22, CD20, CD33, CD52, 또는 이들의 임의의 조합의 절두된 또는 전체 길이 형태를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 세포 표면 마커는 자살 유전자 마커 RQR8을 추가로 포함한다(Philip B et al. Blood. 2014 Aug 21; 124(8):1277-87).
발현 벡터는 바람직하게는 그러나 경우에 따라, 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 변형된 세포를 단리하기 위한 적어도 하나의 선별 가능한 약물 내성 마커를 포함할 것이다. 본 발명의 선별 가능한 약물 내성 마커는 야생형 또는 돌연변이 Neo, DHFR, TYMS, FRANCF, RAD51C, GCS, MDR1, ALDH1, NKX2.2, 또는 이들의 임의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 적어도 하나의 단백질 스캐폴드는 융합 단백질과 같은 변형된 형태로 발현될 수 있으며, 분비 신호뿐만 아니라 추가적인 이종 기능성 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 아미노산, 특히 하전된 아미노산의 영역이 숙주 세포에서, 정제 중에 또는 후속적인 취급 및 저장 중에 안정성 및 지속성을 향상시키기 위해 단백질 스캐폴드의 N- 말단에 첨가될 수 있다. 또한, 펩티드 모이어티는 정제를 용이하게 하기 위해 본 발명의 단백질 스캐폴드에 첨가될 수 있다. 이러한 영역은 단백질 스캐폴드 또는 이의 적어도 하나의 단편의 최종 제조 전에 제거될 수 있다. 이러한 방법은 상기 문헌[Sambrook, Chapters 17.29-17.42 and 18.1-18.74; Ausubel, Chapters 16, 17 and 18]과 같은 많은 표준 실험실 매뉴얼에 기술되어있다.
당업자는 본 발명의 단백질을 코딩하는 핵산의 발현에 이용 가능한 다수의 발현 시스템에 대해 잘 알고 있다. 다르게는, 본 발명의 핵산은 본 발명의 단백질 스캐폴드를 코딩하는 내인성 DNA를 함유하는 숙주 세포에서 (조작에 의해) 작동시킴(turning on)으로써 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 이러한 방법은 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,580,734호, 제5,641,670호, 제5,733,746호 및 제5,733,761호에 기재된 바와 같이 당 업계에 잘 공지되어 있다.
단백질 스캐폴드, 이의 특정 부분 또는 변이체의 생산에 유용한 세포 배양의 예는 당 업계에 공지된 바와 같이 박테리아, 효모 및 포유동물 세포이다. 포유동물 세포 현탁액 또는 생물 반응기가 사용될 수 있지만 포유동물 세포 시스템은 종종 세포의 단일 층의 형태로 존재할 것이다. 손상되지 않은 글리코실화된 단백질을 발현할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 본 기술 분야에서 개발되었고, 예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(버지니아주 마나사스 소재)(www.atcc.org)로부터 쉽게 이용 가능한 COS-1(예를 들어, ATCC CRL 1650), COS-7(예를 들어, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21(예를 들어, ATCC CRL-10), CHO(예를 들어, ATCC CRL 1610) 및 BSC-1(예를 들어, ATCC CRL-26) 세포주, Cos-7 세포, CHO 세포, hep G2 세포, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, 293 세포, HeLa 세포 등을 포함한다. 바람직한 숙주 세포는 골수종 및 림프종 세포와 같은 림프계 기원의 세포를 포함한다. 특히 바람직한 숙주 세포는 P3X63Ag8.653 세포(ATCC 수탁 번호 CRL-1580) 및 SP2/0-Ag14 세포(ATCC 수탁 번호 CRL-1851)이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 재조합 세포는 P3X63Ab8.653 또는 SP2/0-Ag14 세포이다.
이들 세포를 위한 발현 벡터는 하기와 같은 예를 들어, 그러나 이에 제한되지 않는, 하기 발현 조절 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 복제 기점; 프로모터(예를 들어, 후기 또는 초기 SV40 프로모터, CMV 프로모터(미국 특허 제5,168,062호; 제5,385,839호), HSV tk 프로모터, pgk(포스포글리세레이트 키나아제) 프로모터, EF-1 알파 프로모터(미국 특허 제5,266,491호), 적어도 하나의 인간 프로모터, 인핸서, 및/또는 프로세싱 정보 부위, 예를 들어 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위(예를 들어, SV40 거대 T Ag 폴리 A 첨가 부위) 및 전사 종결 서열. 예를 들어, 상기 문헌[Ausubel et al.; Sambrook, et al.]을 참조한다. 본 발명의 핵산 또는 단백질의 생산에 유용한 다른 세포는 공지되어 있거나, 예를 들어 세포주 및 하이브리도마의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 카탈로그(www.atcc.org) 또는 기타 공지된 또는 상용 공급처로부터 이용 가능하다.
진핵 숙주 세포가 사용되는 경우, 폴리아데닐화 또는 전사 종결 서열이 전형적으로 벡터에 혼입된다. 종결 서열의 예는 소 성장 호르몬 유전자의 폴리아데닐화화 서열이다. 전사체의 정확한 스플라이싱을 위한 서열도 포함될 수 있다. 스플라이싱 서열의 예는 SV40의 VP1 인트론이다(Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983)). 또한, 숙주 세포에서 복제를 조절하기 위한 유전자 서열은 당 업계에 공지된 바와 같이 벡터에 혼입될 수 있다.
단백질
스캐폴드의
정제
단백질 스캐폴드는 단백질 A 정제, 황산 암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성(hydrophobic interaction) 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는 잘 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC": High performance liquid chromatography)도 정제에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), 예를 들어, Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10]을 참조하며, 이들 각각은 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 단백질 스캐폴드는 천연 정제 산물, 화학적 합성 절차의 산물, 및 예를 들어 이. 콜라이, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 생산된 산물을 포함한다. 재조합 생산 절차에서 사용되는 숙주에 따라, 본 발명의 단백질 스캐폴드는 글리코실화될 수 있거나 글리코실화되지 않을 수 있다. 이러한 방법은 상기 문헌[Sambrook, Sections 17.37-17.42; Ausubel, Chapters 10, 12, 13, 16, 18 and 20, Colligan, Protein Science, Chapters 12-14, 이들 모두는 전체가 본원에 참고로 포함됨]와 같은 많은 표준 실험실 매뉴얼에 기술되어있다.
변이체
본 발명의 단백질 스캐폴드를 구성하는 아미노산은 종종 축약된다. 아미노산 표기는 당해 분야에서 잘 이해되는 바와 같이 단일 문자 코드, 3문자 코드, 명칭 또는 3개의 뉴클레오티드 코돈(들)에 의해 아미노산을 지정하여 나타낼 수 있다(문헌[Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, Third Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994] 참조). 본원의 단백질 스캐폴드는 본원에서 특정된 바와 같은 자연적 돌연변이 또는 인간 조작으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다. 본 발명의 단백질 스캐폴드에서 기능에 필수적인 아미노산은 부위 지정 돌연변이 유발 또는 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 확인될 수 있다(예를 들어, 상기 문헌[Ausubel, Chapters 8, 15; Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)]). 후자의 절차는 분자 내의 모든 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 이어서, 생성된 돌연변이 분자를 생물학적 활성, 예를 들어, 그러나 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 중화 활성에 대해 시험한다. 단백질 스캐폴드 결합에 결정적인 부위는 또한 결정화, 핵자기 공명 또는 광친화성 표지와 같은 구조 분석에 의해 확인될 수 있다(Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) 및 de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)).
본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로 상보적인"은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540개 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 영역에 대해 제2 서열의 상보체와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제1 서열을 지칭하거나, 두 서열이 엄격한 혼성화 조건하에서 혼성화함을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로 동일한"은 제1 서열과 제2 서열이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540개 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 영역에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일함, 또는 핵산과 관련하여 제1 서열이 제2 서열의 상보체와 실질적으로 상보적일 경우를 지칭한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체"는 핵산을 기술하는데 사용되는 경우, (i) 참조된 뉴클레오티드 서열의 일부 또는 단편; (ii) 참조된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부의 상보체; (iii) 참조된 핵산 또는 이의 상보체와 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 엄격한 조건하에 참조된 핵산, 이의 상보체 또는 이들과 실질적으로 동일한 서열에 혼성화하는 핵산을 지칭한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 복제 기점을 함유하는 핵산 서열을 지칭한다. 벡터는 바이러스 벡터, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가 복제의 염색체 외 벡터일 수 있으며, 바람직하게는 DNA 플라스미드이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체"는 펩티드 또는 폴리펩티드를 기술하는데 사용되는 경우, 아미노산의 삽입, 결실 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만, 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 또한, 변이체는 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 가진 참조된 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미할 수 있다.
아미노산의 보존적 치환, 즉 아미노산을 유사한 특성(예를 들어, 친수성, 하전된 영역의 정도 및 분포)의 상이한 아미노산으로 대체하는 것은 일반적으로 사소한 변화를 수반하는 것으로 당 업계에서 인식된다. 이러한 사소한 변화는 당 분야에서 이해되는 바와 같이, 부분적으로, 아미노산의 소수친수 지수(hydropathic index)를 고려함으로써 확인될 수 있다(Kyte et al., J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982)). 아미노산의 소수친수 지수는 소수성 및 전하에 대한 고려사항에 기초한다. 유사한 소수친수 지수의 아미노산은 치환될 수 있고 단백질 기능을 여전히 유지할 수 있다. 한 양태에서, ± 2의 소수친수 지수를 갖는 아미노산이 치환된다. 아미노산의 친수성은 또한 단백질이 생물학적 기능을 유지하게 하는 치환을 밝히는데 사용될 수 있다. 펩티드와 관련하여 아미노산의 친수성을 고려하여 펩티드의 가장 큰 국소 평균 친수성을 계산할 수 있으며, 이는 항원성 및 면역원성과 우수한 상관관계가 있다고 보고된 유용한 측정법이다. 본원에서 전체가 참고로 포함된 미국 특허 제4,554,101호.
유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환은 펩티드가 생물학적 활성, 예를 들어 면역원성을 유지하게 할 수 있다. 치환은 서로의 ± 2 이내의 친수성 값을 갖는 아미노산으로 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성 값은 모두 그 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향을 받는다. 그러한 관찰과 일치하여, 생물학적 기능에 호환되는 아미노산 치환은 소수성, 친수성, 전하, 크기 및 기타 특성에 의해 나타난 바와 같이 아미노산의 상대적인 유사성, 특히 아미노산의 측쇄에 따라 결정되는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 "보존적" 아미노산 치환은 하기 표 A, B 또는 C에 제시된 바와 같이 정의될 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드 및/또는 이러한 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변형에 의해 도입된 보존적 치환을 포함한다. 아미노산은 물리적 특성 및 2차 및 3차 단백질 구조에 대한 기여도에 따라 분류될 수 있다. 보존적 치환은 하나의 아미노산에서 유사한 특성을 가진 또 다른 아미노산으로의 치환이다. 예시적인 보존적 치환은 표 A에 제시한다.
<표 A>
대안적으로, 보존적 아미노산은 표 B에 제시된 바와 같이 문헌[Lehninger, Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY, N.Y. (1975), pp.71-77]에 기재된 바와 같이 분류될 수 있다.
<표 B>
대안적으로, 예시적인 보존적 치환은 표 C에 제시한다.
<표 C>
본 발명의 폴리펩티드는 아미노산 잔기의 하나 이상의 삽입, 결실 또는 치환, 또는 이들의 임의의 조합뿐만 아니라 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환 이외의 변형을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산은 하나 이상의 보존적 치환을 함유할 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 "하나 초과"의 상기 아미노산 치환은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 이상의 상기 열거된 아미노산 치환을 포함한다. 용어 "하나 초과"라는 용어는 2, 3, 4 또는 5개의 열거된 아미노산 치환을 지칭할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 및 단백질, 이들의 전체 서열 또는 이들의 임의의 일부는 비자연 발생적일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 및 단백질은 자연 발생적이지 않은 하나 이상의 돌연변이, 치환, 결실 또는 삽입을 함유할 수 있어, 전체 아미노산 서열을 비자연 발생적으로 만든다. 본 발명의 폴리펩티드 및 단백질은 하나 이상의 중복, 역전 또는 반복 서열을 함유할 수 있으며, 그 결과 서열은 자연 발생적이지 않으며, 전체 아미노산 서열이 비자연 발생적으로 만든다. 본 발명의 폴리펩티드 및 단백질은 자연 발생적이지 않은 변형, 인공 또는 합성 아미노산을 함유할 수 있어, 전체 아미노산 서열이 비자연 발생적으로 만든다.
본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, "서열 동일성"은 디폴트 파라미터를 사용하여 미국 국립 생물공학 정보센터(NCBI: National Center for Biotechnology Information) ftp 사이트로부터 검색될 수 있는 2개의 서열(bl2seq)을 블라스팅(blasting)하기 위한 독립형 실행 가능 BLAST 엔진 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다(Tatusova and Madden, FEMS Microbiol Lett., 1999, 174, 247-250; 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함됨). 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 사용될 때 용어 "동일한" 또는 "동일성"은 각각의 서열의 명시된 영역에 걸쳐 동일한 잔기의 명시된 퍼센트를 지칭한다. 퍼센트는 두 서열을 최적으로 정렬하고, 명시된 영역에 걸쳐 두 서열을 비교하고, 두 서열에서 동일한 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치된 위치의 수를 산출하고, 일치된 위치의 수를 명시된 영역의 총 위치 수로 나누고 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센트를 얻음으로써 계산될 수 있다. 두 서열의 길이가 상이하거나 정렬이 하나 이상의 엇갈린 말단(staggered end)을 생성하고 명시된 비교 영역이 단일 서열만을 포함하는 경우, 단일 서열의 잔기는 계산의 분모에는 포함되지만 분자에는 포함되지 않는다. DNA와 RNA를 비교할 때, 티민(T)과 우라실(U)은 동등한 것으로 간주할 수 있다. 동일성은 수동으로 또는 BLAST 또는 BLAST 2.0과 같은 컴퓨터 서열 알고리즘을 사용하여 얻을 수 있다.
실시예
실시예
1: 줄기 유사 변형된 T 세포의 생산
다음은 T 세포의 바람직한 줄기 유사 특성을 유도하거나 보존하는 조건하에서 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 T 세포를 변형시키는 하나의 프로토콜의 예시적이지만 비제한적인 예이다.
제0일: T 세포의
뉴클레오펙션
37℃, 5% CO2, 고습도 인큐베이터에서 이뮤노컬트™-XF T 세포 증식 배지(Stemcell Technologies, Cat #: 10981)를 미리 가온시킨다. 5x106 T 세포/반응(100 ㎕ 큐벳 크기)에 대해, 6웰 플레이트의 단일 웰에 반응당 3 mL의 배지를 가온시킨다. 25x106 T 세포/반응(100 ㎕ 큐벳 크기)에 대해, Gx-Rex10(Wilson Wolf, Cat # : 80040S)에 반응당 20 mL의 배지를 가온시킨다.
P3 1차 세포 용액(Lonza, Cat # : PBP3-02250)을 실온까지 가온시키고 필요하다면 보충물을 첨가한다.
X-유닛(Lonza, Cat #: AAF-1002X)을 제어하는 4D-뉴클레오펙터(Nucleofector)™ 시스템의 코어 유닛(Lonza, Cat #: AAF-1002B)을 켠다. P3 완충액을 사용하는데 필요한 뉴클레오펙션 수를 프로그래밍한다. EO-210 프로그램.
큐벳을 표지하고, 트랜스퍼 피펫(론자(Lonza) P3 키트와 함께 제공됨)을 미리 개봉하고, 세포로 작업하기 전에 핵산의 적절한 희석액을 제조한다.
트랜스포존 플라스미드일 경우, 뉴클레아제 무함유 H2O 중 0.5 μg/㎕ 용액을 제조한다.
클리니맥스 프로디지(CliniMACs Prodigy)를 사용하여 수집한 CD14, CD56, 및 CD19 제거된 세포를 계수하고 요구되는 세포 수에 필요한 부피를 계산한다.
헤레우스 멀티퓨지(Heraeus Multifuge) X3R 벤치 탑 원심분리기(Thermofisher Scientific)에서 7에서 제동하면서 90 g에서 10분간 T 세포를 원심분리한다. 반응당 동일한 개수의 세포를 사용하여 여러 반응을 수행하는 경우, 단일 원심분리 관에서 필요한 모든 세포를 원심분리한다. 부피에 따라 15 mL(Fisher, Cat #: 14-959-49B) 또는 50 mL(Fisher, Cat #: 14-959-49A) 원뿔 튜브를 사용할 수 있다. 원심분리 과정에서 P3 1차 세포 용액 상자(Lonza, Cat #: PBP3-02250)와 함께 제공되는 큐벳의 바닥에 핵산을 직접 첨가한다. 큐벳의 하단의 한 구석에 총 1 μg의 트랜스포존에 대해 단계 4에서 만든 0.5 μg/㎕ 트랜스포존 플라스미드 용액 2 ㎕를 첨가한다. 5 μg의 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제 mRNA를 큐벳의 다른 구석에 첨가한다.
mRNA는 신속하게 분해될 수 있기 때문에, RN아제의 잠재적인 존재로 인해 전기 천공 전에 다른 핵산 용액 및 세포와 접촉하는 시간을 최소화하는 것이 최적이다. 이것이, 예를 들어, 혼합을 방지하기 위해 트랜스포존과 트랜스포사제를 큐벳의 반대 구석에 전달하는 이유이다. 또한, 핵산의 총 부피를 총 반응 부피를 10 ㎕(10%) 미만으로 유지하는 것이 최적이다.
트랜스포존(1㎍)과 트랜스포사제(5㎍) 두 가지 모두의 양은 반응당 세포 수에 관계없이 동일하게 유지한다. 전위 효율은 5x106 세포/100 ㎕ 반응과 25x106 세포/100 ㎕ 반응 사이에서 변화없이 유지된다.
원심분리 후, 세포 펠렛을 건드리지 않으면서 배지를 완전히 흡인한다.
반응당 보충물을 함유하는 실온 P3 완충액 100 ㎕에 세포 펠렛을 현탁한다.
최적으로 용액에 기포가 조금도 들어가지 않도록 주의하면서, 적합한 핵산을 함유하는 큐벳에 P3 완충액 중 세포 100 ㎕를 옮긴다. 한 번에 최대 2개의 큐벳에만 세포를 로딩할 것을 권장한다. 세포를 큐벳에 첨가한 후, 뉴클레오펙션 전에 세포와 mRNA의 접촉 시간을 줄이기 위해서 신속하고 효율적으로 작업하는 것이 최적이다. 최대 10분 동안 P3 완충액에 휴지하는 세포에 대해서는 전위 효율의 감소가 관찰되지 않았지만 P3에 세포가 남아있는 시간을 최소화할 것을 권장한다.
여러 번 가볍게 쳐서 큐벳의 내용물을 혼합하고 최대 2개의 큐벳을 4D-뉴클레오펙터™ X-유닛에 로딩한다.
프로그램 EO-210으로 세포에 펄스를 주어 기계에 의해 기록되는 오류가 없었는지를 확인한다.
론자 P3 키트에 제공된 전용 피펫을 사용하여 뉴클레오펙션된 세포를 6웰 플레이트 또는 G-Rex10에 즉시 옮긴다. 세포를 옮기기 위해서, 먼저 6웰 플레이트 또는 G-Rex 플라스크에서 전용 피펫 안으로 미리 가온시킨 소량의 배지를 뽑아 올린다. 그런 후 배지를 큐벳에 페펫팅하고 큐벳의 전체 내용물을 피펫을 사용하여 최종 배양 접시에 옮긴다. 큐벳 또는 최종 배양 접시에서 세포를 위아래로 피펫팅하지 않을 것을 권장한다.
남아있는 모든 반응에 대해 P3 완충액 중 세포를 적합한 핵산을 함유하는 큐벳으로 옮기기에서부터 뉴클레오펙션된 세포를 혼합하고, 펄스를 주고, 6웰 플레이트 또는 G-Rex10로 옮기기까지의 프로토콜을 반복한다.
37℃, 5% CO2, 고습도의 인큐베이터에 세포를 둔다.
제2일: T 세포 활성화
25 ㎕/mL의 이뮤토컬트™ 인간 CD3/CD28/CD2 T 세포 활성화제(Stemcell Technologies, Cat #: 10970)를 뉴클레오펙션된 세포에 첨가한다.
세포를 피펫팅하여 부드럽게 혼합한다.
37℃, 5% CO2, 고습도의 인큐베이터에 세포를 다시 둔다.
G-Rex 플라스크에서 배양하는 세포일 경우: 뚜렷한 세포 덩어리가 관찰될 때까지 배양물을 건드리지 않는 것이 필수적이다. 따라서, 세포의 파괴/혼합/피펫팅과 배지 첨가 및 교환을 분리할 것을 권장한다.
배양 배지 주의 사항: G-Rex 플라스크에서 세포를 배양하는 경우, 배지 첨가 및/또는 교환은 글루코오스 및 다른 대사 물질 수준을 기준으로 수행되어야 한다. 글루코스 수준(또는 또 다른 지시 대사 물질)이 임계 수준(예를 들어, ~ 100 mg/dL의 글루코오스)으로 떨어지면 미리 가온시킨 이뮤노컬트™-XF T 세포 증식 배지를 사용하여 배지 부피를 2배로 늘리거나 배지 절반 교환으로 보충해야 한다. 배지 첨가는 천천히 수행해야 하며 가능한 세포를 거의 파괴하지 않도록 주의해야 한다. 배지 절반 교환은 세포가 배양 플라스크의 바닥에 완전히 정착할 수 있도록 세포 배양물의 물리적 파괴 후 적어도 12시간 후에 수행해야 한다.
세포 샘플링 및 파괴: 세포는 배양 기간의 대부분 동안 건드리지 않은 채 두어야 한다.
크고 뚜렷한 세포 응집체가 형성되면 활성화 시약 첨가 후 세포 배양물의 1차 파괴를 수행해야 한다(응집체는 G-Rex 막에서 볼 수 있는 3 내지 4 X 3 내지 4의 사각형 격자로 측정될 것이다).
세포 응집체가 요구되는 크기에 도달하면, 이들을 10 mL 혈청용 피펫을 사용하여 물리적으로 파괴할 수 있다. 이 시점은 공여 및 전위 효율에 따라 제11일 내지 제14일 사이에 일어날 수 있다. 어떤 경우에는, 이 시점은 예를 들어, 뉴클레오펙션에 수동 카세트, 큰 부피 및/또는 많은 세포 수를 사용하는 경우에, 제11일보다 제14일 가까이에 일어날 수 있다. 이 시점에서 세포 계수, 생존능 및 유동 분석을 위해 세포 샘플을 수집해야 한다. 이상적으로 이 시점에서 배양 배지의 부피는 사용된 초기 부피(G-Rex100의 경우 200mL)에서 두 배를 넘지 않을 것이다. 세포를 다시 건드릴 필요가 없도록 한 번에 필요한 모든 세포를 수집할 것을 권장한다.
세포가 파괴되면, 세포를 시작한 동일한 부피의 배지에서 12시간 동안 건드리지 않고 두어야 한다. 세포는 이 시점에서 재응집해야 한다; 그러나 응집체는 더 작아지고 수가 더 많아질 것이다. 이 응집체는 G-Rex 막 격자에서 1 내지 2 X 1 내지 2개의 정사각형으로 측정되어야 한다.
세포의 1차 파괴 후 3일(배양에 따라 제14일 내지 제17일)에, 이들을 두 번째로 피펫팅할 수 있다. 세포 수, 생존능 및 유세포 분석을 위해 샘플을 다시 취해야 한다. 다시 한번, 샘플링 후 적어도 12시간 동안 세포를 건드리지 않고 두어야 한다. 세포가 다시 건드릴 필요가 없도록 한 번에 필요한 모든 세포를 수집할 것을 권장한다.
이 2차 파괴 후에, 세포는 아마도 덩어리를 전혀 형성하지 않을 것이며, 세포 성장 속도는 상당히 느려질 것이다.
배양 제17일 내지 제20일에 세포의 2차 파괴 후 3일에 세포를 수거해야 한다.
유세포
분석
제5일, D-데이, D-데이 + 3일 및 D-데이 + 6일에 유동 분석을 실행해야 한다.
제5일, D-데이, D-데이 + 3일에, CD45, CD4, CD8, 및 CARTyrin 유동 패널을 사용한다.
D-데이 + 6일에, 3가지 표적 패널이 있었다:
a.
패널 1: CD3, CD8, CD4, CARTyrin, CD45RA, CD45RO, CD62L
b.
패널 2: CD3, CD8, CD4, CARTyrin, CD25, CXCR4, PD-1
c.
패널 3: CD45, CD14, CD20, CD56, CD8, CD4, CD3
실시예
2:
CARTyrin
+ 줄기 기억 T 세포의 기능적 특성화
부적절한 유전자 활성화 또는 사일런싱을 차단하여 CARTyrin 발현을 안정화하는 것을 돕기 위해 2개의 시스 조절 격리 인자가 측면에 위치한 CARTyrin을 코딩하는 플라스미드 DNA 트랜스포존을 사용하여 본 발명의 CARTyrin을 T 세포에 도입할 수 있다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 항원 특이적(암 항원 특이적 포함) 카르티닌을 휴지의 pan T 세포에 안정하게 통합시키는데 피기백™(PB) 트랜스포존 시스템을 사용할 수 있으며, 이에 의해 단일 전기 천공 반응에서 슈퍼 피기백™(SPB)이라고 불리는 mRNA 트랜스포사제 효소와 함께 트랜스포존을 동시 전달하였다. 피기백™ 트랜스포존을 접촉되지 않은 안정된 1차 인간 pan T 세포에 전달하여 20 내지 30%의 세포에 PB-전달된 유전자가 안정적으로 통합되고 발현되었다. 예상 외로, 이들 변형된 CARTyrin 발현 T 세포의 대부분은 줄기 기억 T 세포(TSCM 세포)와 일반적으로 연관된 마커인 CD62L과 CD45RA의 발현이 양성이었다. 이 표현형이 CAR-T 세포 자극 및 증식시 유지되었다는 것을 확인하기 위해, CD62L 및 CD45RA의 발현에 양성인 변형된 CARTyrin 발현 T 세포를 CD3 및 CD28의 자극을 통해 활성화하였다. CD3 및 CD28를 자극한 결과로서, CARTyrin+ T 세포의 > 60%이 줄기세포 기억 표현형을 나타냈다. 또한, 암 항원에 특이적인 CARTyrin을 발현한 이들 세포는 강력한 항종양 이펙터 기능을 충분히 발현할 수 있었다.
PB 시스템이 줄기 유사 마커의 발현을 향상시키는데 직접적으로 기여하는지를 결정하기 위해, PB 전위 또는 렌티바이러스(LV) 형질도입에 의해 생성된 CAR-T 세포의 표현형을 비교하였다. 이를 수행하기 위해, CARTyrin 전이유전자를 바이러스 생산을 위한 일반적인 LV 구조물에 서브클로닝하여 새로운 벡터를 제작하였다. PB 전위 또는 LV 형질도입에 의해 접촉되지 않은 휴지 T 세포에 CARTyrin을 도입한 후, CARTyrin+ 세포를 증식시킨 후 휴지 상태로 복귀되도록 하였다. 기억 및 고갈 관련 마커의 동역학 분석, 항상성 사이토카인 또는 종양 관련 Ag에 반응한 이차 증식, 사이토카인 생산, 및 표적 종양 세포에 반응한 용해능을 포함하는 다양한 표현형 및 기능적 특성을 측정하였다. PB 전위된 CARTyrin+ T 세포와 달리, LV 형질도입된 CARTyrin+ T 세포는 증가된 기억 표현형을 나타내지 않았다. 또한, PB 전위된 세포는 2차 증식 및 표적 종양 세포의 살해에 대해 동등 이상의 능력을 나타냈다. 종합적으로, 이러한 데이터는 PB 전위에 의해 생산된 CAR-T 세포가 대부분, CAR-T 분야에서 매우 바람직한 산물 표현형인 TSCM 세포임을 입증한다. 또한, 이러한 CARTyrin+ T 세포는 강력한 항종양 활성을 나타내며 토닉 신호전달 및 기능적 고갈의 경향이 적을 수 있는 Centyrin 기반 CAR의 사용으로 인해 생체 내에서 더 오래 지속하는 세포를 생성할 수 있다.
실시예
3: 슬리핑
뷰티
전위는 대부분
T
SCM
표현형을
생성한다
슬리핑 뷰티(SB100x) 전위는 본 발명의 방법을 사용하여 대부분 TSCM 표현형을 생성하였다. 인간 pan T 세포를 [도 10]에 나타낸 바와 같이 슬리핑 뷰티 또는 피기백 트랜스포존 플라스미드 및 SB100x 또는 SPB mRNA 각각 1μg을 사용하여 전위시켰다. 전위 후, 세포를 생체 외에서 증식시키고 비전위된 모든 세포를 약물 선별 시스템을 사용하여 제거하였다. 배양 18일 후, 세포를 표현형 마커 CD4, CD8, CD45RA 및 CD62L로 염색하였다. 줄기세포 기억 표현형(Tscm)은 CD45RA 및 CD62L 이중 양성 세포에 의해 정의되며 모든 샘플에서 세포의 > 65%를 차지한다.
실시예
4: 변형된 T 세포에서 인자 IX의 발현
인자 IX의 유전적 결핍(도 11)은 혈우병 B라고 불리는 생명을 위협하는 질환을 유발한다. 혈우병 B는 희귀 질환으로 2만 5천 명당 1명 내지 3만 명당 1명이 앓고 있다. 현재의 혈우병 B 치료는 연간 약 $ 250,000의 비용으로 2 내지 3일마다 재조합 인자 IX 단백질의 주입을 수반한다.
줄기세포 T 세포(TSCM 세포)는 수십 년 동안 인간에서 유지되고 있으며, 따라서 빈번한 수혈의 필요 없이도 혈우병 B 환자에서 결핍된 인자 IX를 공급하여 인자 IX를 분비하는 이상적인 매개체이다. T 세포를 인자 IX를 분비하는 피기백으로 형질전환시켰다. 인간 인자 IX 전이유전자를 코딩하는 형질전환 T 세포를 FACS를 사용하여 T 및 TSCM 세포 마커에 대해 조사하였을 때, 전체 세포의 약 80%가 TSCM 표현형을 나타냈다(도 12). 이들 변형된 T 세포는 인간 인자 IX를 분비할 수 있었고(도 13A), 이 분비된 인자 IX는 응고 활성을 제공하였다(도 13B).
참고에 의한 포함
임의의 상호 참조된 또는 관련된 특허 또는 출원을 포함하여 본원에 인용된 모든 문헌은 명백히 배제되거나 달리 제한되지 않는 한 이로써 그 전문으로 본원에 참고로 포함된다. 어떤 문헌의 인용도 이것이 본원에 개시 또는 청구된 어떤 발명에 관한 선행 기술임을 인정하거나 이것이 단독으로 또는 임의의 다른 참고 문헌 또는 문헌들과의 임의의 조합으로 상기 어떤 발명을 교시, 제안 또는 공개하는 것임을 인정하는 것은 아니다. 또한, 이 문서에서 용어의 어떤 의미 또는 정의가 참조로 포함된 문서에서 동일한 용어의 어떤 의미 또는 정의와 상충하는 정도까지 이 문서의 해당 용어에 지정된 의미 또는 정의가 적용될 것이다.
다른 실시양태
본 발명의 특정 실시양태가 예시되고 기술되었지만, 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고서 다양한 다른 변경 및 변형이 이루어질 수 있다. 첨부된 청구항의 범위는 본 발명의 범위 내에 있는 이러한 모든 변경 및 변형을 포함한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Poseida Therapeutics
OSTERTAG, Eric
SHEDLOCK, Devon
<120> MODIFIED STEM CELL MEMORY T CELLS, METHODS OF MAKING AND METHODS
OF USING SAME
<130> POTH-012/01WO
<150> 62/402,707
<151> 2016-09-30
<150> 62/553,058
<151> 2017-08-31
<150> 62/556,309
<151> 2017-09-08
<150> 62/502,508
<151> 2017-05-05
<160> 42
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 89
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FN3 domain consensus sequence
<400> 1
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser
65 70 75 80
Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr
85
<210> 2
<211> 90
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FN3 consensus sequence
<400> 2
Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe
20 25 30
Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg
65 70 75 80
Ser Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr
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<211> 270
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FN3 consensus sequence
<400> 3
atgctgcctg caccaaagaa cctggtggtg tctcatgtga cagaggatag tgccagactg 60
tcatggactg ctcccgacgc agccttcgat agttttatca tcgtgtaccg ggagaacatc 120
gaaaccggcg aggccattgt cctgacagtg ccagggtccg aacgctctta tgacctgaca 180
gatctgaagc ccggaactga gtactatgtg cagatcgccg gcgtcaaagg aggcaatatc 240
agcttccctc tgtccgcaat cttcaccaca 270
<210> 4
<211> 594
<212> PRT
<213> Trichoplusia ni
<400> 4
Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln
1 5 10 15
Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Ile Ser Asp
20 25 30
His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile
35 40 45
Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu
50 55 60
Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn
65 70 75 80
Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His
85 90 95
Cys Trp Ser Thr Ser Lys Ser Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu
100 105 110
Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile
115 120 125
Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile
130 135 140
Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg
145 150 155 160
Glu Ser Met Thr Gly Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile
165 170 175
Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn
180 185 190
His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr
195 200 205
Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu
210 215 220
Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val
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Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile
245 250 255
Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu
260 265 270
Gly Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Met Tyr Ile Pro Asn Lys Pro
275 280 285
Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Tyr Lys
290 295 300
Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn
305 310 315 320
Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val
325 330 335
His Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Asn Trp Phe Thr Ser Ile
340 345 350
Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val
355 360 365
Gly Thr Val Arg Ser Asn Lys Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn
370 375 380
Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro
385 390 395 400
Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu
405 410 415
Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys
420 425 430
Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr
435 440 445
Leu Asp Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg
450 455 460
Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn
465 470 475 480
Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val
485 490 495
Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Ser Leu Thr Ser
500 505 510
Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu
515 520 525
Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Asn Glu Val Pro Gly Thr Ser
530 535 540
Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr
545 550 555 560
Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Asn Ala Ser Cys Lys Lys
565 570 575
Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys Gln Ser
580 585 590
Cys Phe
<210> 5
<211> 594
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Super Piggybac Transposase
<400> 5
Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln
1 5 10 15
Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Val Ser Asp
20 25 30
His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile
35 40 45
Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu
50 55 60
Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn
65 70 75 80
Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His
85 90 95
Cys Trp Ser Thr Ser Lys Ser Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu
100 105 110
Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile
115 120 125
Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile
130 135 140
Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg
145 150 155 160
Glu Ser Met Thr Ser Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile
165 170 175
Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn
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Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val
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Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile
245 250 255
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260 265 270
Gly Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Val Tyr Ile Pro Asn Lys Pro
275 280 285
Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Thr Lys
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Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn
305 310 315 320
Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val
325 330 335
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340 345 350
Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val
355 360 365
Gly Thr Val Arg Ser Asn Lys Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn
370 375 380
Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro
385 390 395 400
Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu
405 410 415
Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys
420 425 430
Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr
435 440 445
Leu Asp Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg
450 455 460
Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn
465 470 475 480
Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val
485 490 495
Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Ser Leu Thr Ser
500 505 510
Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu
515 520 525
Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Lys Glu Val Pro Gly Thr Ser
530 535 540
Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr
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Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Asn Ala Ser Cys Lys Lys
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Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys Gln Ser
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Cys Phe
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<211> 340
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sleeping Beauty Transposase
<400> 6
Met Gly Lys Ser Lys Glu Ile Ser Gln Asp Leu Arg Lys Lys Ile Val
1 5 10 15
Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser Lys Arg Leu
20 25 30
Lys Val Pro Arg Ser Ser Val Gln Thr Ile Val Arg Lys Tyr Lys His
35 40 45
His Gly Thr Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Ser Gly Arg Arg Arg Tyr Leu
50 55 60
Ser Pro Arg Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Lys Val Gln Ile Asn Pro
65 70 75 80
Arg Thr Thr Ala Lys Asp Leu Val Lys Met Leu Glu Glu Thr Gly Thr
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Lys Val Ser Ile Ser Thr Val Lys Arg Val Leu Tyr Arg His Asn Leu
100 105 110
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Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly Glu Ala Cys
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<223> hyperactive sleeping beauty transposase
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Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser Lys Arg Leu
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Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly Glu Ala Cys
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Lys Pro Lys Asn Thr Ile Pro Thr Val Lys His Gly Gly Gly Ser Ile
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Met Leu Trp Gly Cys Phe Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Leu His Lys
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Trp Leu Lys Asp Asn Lys Val Lys Val Leu Glu Trp Pro Ser Gln Ser
260 265 270
Pro Asp Leu Asn Pro Ile Glu Asn Leu Trp Ala Glu Leu Lys Lys Arg
275 280 285
Val Arg Ala Arg Arg Pro Thr Asn Leu Thr Gln Leu His Gln Leu Cys
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Gln Glu Glu Trp Ala Lys Ile His Pro Asn Tyr Cys Gly Lys Leu Val
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<213> Artificial Sequence
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
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Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence coding for human CD8alpha transmembrane
domain
<400> 11
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<210> 12
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
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Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
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Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 13
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequenec
<220>
<223> nucleotide sequence encoding the CD28 costimulatory domain
<400> 13
cgcgtgaagt ttagtcgatc agcagatgcc ccagcttaca aacagggaca gaaccagctg 60
tataacgagc tgaatctggg ccgccgagag gaatatgacg tgctggataa gcggagagga 120
cgcgaccccg aaatgggagg caagcccagg cgcaaaaacc ctcaggaagg cctgtataac 180
gagctgcaga aggacaaaat ggcagaagcc tattctgaga tcggcatgaa gggggagcga 240
cggagaggca aagggcacga tgggctgtac cagggactga gcaccgccac aaaggacacc 300
tatgatgctc tgcatatgca ggcactgcct ccaagg 336
<210> 14
<211> 42
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 15
<211> 126
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding the 4-1BB costimulatory domain
<400> 15
aagagaggca ggaagaaact gctgtatatt ttcaaacagc ccttcatgcg ccccgtgcag 60
actacccagg aggaagacgg gtgctcctgt cgattccctg aggaagagga aggcgggtgt 120
gagctg 126
<210> 16
<211> 45
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 17
<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence encoding human CD8alpha hinge
<400> 17
actaccacac cagcacctag accaccaact ccagctccaa ccatcgcgag tcagcccctg 60
agtctgagac ctgaggcctg caggccagct gcaggaggag ctgtgcacac caggggcctg 120
gacttcgcct gcgac 135
<210> 18
<211> 18
<212> PRT
<213> Thosea asigna
<400> 18
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 19
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GSG-T2A
<400> 19
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 20
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GSG-T2A
<400> 20
ggatctggag agggaagggg aagcctgctg acctgtggag acgtggagga aaacccagga 60
cca 63
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> Equine rhinitis A
<400> 21
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 22
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GSG-E2A peptide
<400> 22
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 23
<211> 22
<212> PRT
<213> Foot and nout disease virus type O
<400> 23
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 24
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GSG-F2A peptide
<400> 24
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 25
<211> 19
<212> PRT
<213> Porcine teschovirus-1
<400> 25
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 26
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GSG-P2A peptide
<400> 26
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 27
<211> 5296
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Helraiser transposon
<400> 27
tcctatataa taaaagagaa acatgcaaat tgaccatccc tccgctacgc tcaagccacg 60
cccaccagcc aatcagaagt gactatgcaa attaacccaa caaagatggc agttaaattt 120
gcatacgcag gtgtcaagcg ccccaggagg caacggcggc cgcgggctcc caggaccttc 180
gctggccccg ggaggcgagg ccggccgcgc ctagccacac ccgcgggctc ccgggacctt 240
cgccagcaga gagcagagcg ggagagcggg cggagagcgg gaggtttgga ggacttggca 300
gagcaggagg ccgctggaca tagagcagag cgagagagag ggtggcttgg agggcgtggc 360
tccctctgtc accccagctt cctcatcaca gctgtggaaa ctgacagcag ggaggaggaa 420
gtcccacccc cacagaatca gccagaatca gccgttggtc agacagctct cagcggcctg 480
acagccagga ctctcattca cctgcatctc agaccgtgac agtagagagg tgggactatg 540
tctaaagaac aactgttgat acaacgtagc tctgcagccg aaagatgccg gcgttatcga 600
cagaaaatgt ctgcagagca acgtgcgtct gatcttgaaa gaaggcggcg cctgcaacag 660
aatgtatctg aagagcagct actggaaaaa cgtcgctctg aagccgaaaa acagcggcgt 720
catcgacaga aaatgtctaa agaccaacgt gcctttgaag ttgaaagaag gcggtggcga 780
cgacagaata tgtctagaga acagtcatca acaagtacta ccaataccgg taggaactgc 840
cttctcagca aaaatggagt acatgaggat gcaattctcg aacatagttg tggtggaatg 900
actgttcgat gtgaattttg cctatcacta aatttctctg atgaaaaacc atccgatggg 960
aaatttactc gatgttgtag caaagggaaa gtctgtccaa atgatataca ttttccagat 1020
tacccggcat atttaaaaag attaatgaca aacgaagatt ctgacagtaa aaatttcatg 1080
gaaaatattc gttccataaa tagttctttt gcttttgctt ccatgggtgc aaatattgca 1140
tcgccatcag gatatgggcc atactgtttt agaatacacg gacaagttta tcaccgtact 1200
ggaactttac atccttcgga tggtgtttct cggaagtttg ctcaactcta tattttggat 1260
acagccgaag ctacaagtaa aagattagca atgccagaaa accagggctg ctcagaaaga 1320
ctcatgatca acatcaacaa cctcatgcat gaaataaatg aattaacaaa atcgtacaag 1380
atgctacatg aggtagaaaa ggaagcccaa tctgaagcag cagcaaaagg tattgctccc 1440
acagaagtaa caatggcgat taaatacgat cgtaacagtg acccaggtag atataattct 1500
ccccgtgtaa ccgaggttgc tgtcatattc agaaacgaag atggagaacc tccttttgaa 1560
agggacttgc tcattcattg taaaccagat cccaataatc caaatgccac taaaatgaaa 1620
caaatcagta tcctgtttcc tacattagat gcaatgacat atcctattct ttttccacat 1680
ggtgaaaaag gctggggaac agatattgca ttaagactca gagacaacag tgtaatcgac 1740
aataatacta gacaaaatgt aaggacacga gtcacacaaa tgcagtatta tggatttcat 1800
ctctctgtgc gggacacgtt caatcctatt ttaaatgcag gaaaattaac tcaacagttt 1860
attgtggatt catattcaaa aatggaggcc aatcggataa atttcatcaa agcaaaccaa 1920
tctaagttga gagttgaaaa atatagtggt ttgatggatt atctcaaatc tagatctgaa 1980
aatgacaatg tgccgattgg taaaatgata atacttccat catcttttga gggtagtccc 2040
agaaatatgc agcagcgata tcaggatgct atggcaattg taacgaagta tggcaagccc 2100
gatttattca taaccatgac atgcaacccc aaatgggcag atattacaaa caatttacaa 2160
cgctggcaaa aagttgaaaa cagacctgac ttggtagcca gagtttttaa tattaagctg 2220
aatgctcttt taaatgatat atgtaaattc catttatttg gcaaagtaat agctaaaatt 2280
catgtcattg aatttcagaa acgcggactg cctcacgctc acatattatt gatattagat 2340
agtgagtcca aattacgttc agaagatgac attgaccgta tagttaaggc agaaattcca 2400
gatgaagacc agtgtcctcg actttttcaa attgtaaaat caaatatggt acatggacca 2460
tgtggaatac aaaatccaaa tagtccatgt atggaaaatg gaaaatgttc aaagggatat 2520
ccaaaagaat ttcaaaatgc gaccattgga aatattgatg gatatcccaa atacaaacga 2580
agatctggta gcaccatgtc tattggaaat aaagttgtcg ataacacttg gattgtccct 2640
tataacccgt atttgtgcct taaatataac tgtcatataa atgttgaagt ctgtgcatca 2700
attaaaagtg tcaaatattt atttaaatac atctataaag ggcacgattg tgcaaatatt 2760
caaatttctg aaaaaaatat tatcaatcat gacgaagtac aggacttcat tgactccagg 2820
tatgtgagcg ctcctgaggc tgtttggaga ctttttgcaa tgcgaatgca tgaccaatct 2880
catgcaatca caagattagc tattcatttg ccaaatgatc agaatttgta ttttcatacc 2940
gatgattttg ctgaagtttt agatagggct aaaaggcata actcgacttt gatggcttgg 3000
ttcttattga atagagaaga ttctgatgca cgtaattatt attattggga gattccacag 3060
cattatgtgt ttaataattc tttgtggaca aaacgccgaa agggtgggaa taaagtatta 3120
ggtagactgt tcactgtgag ctttagagaa ccagaacgat attaccttag acttttgctt 3180
ctgcatgtaa aaggtgcgat aagttttgag gatctgcgaa ctgtaggagg tgtaacttat 3240
gatacatttc atgaagctgc taaacaccga ggattattac ttgatgacac tatctggaaa 3300
gatacgattg acgatgcaat catccttaat atgcccaaac aactacggca actttttgca 3360
tatatatgtg tgtttggatg tccttctgct gcagacaaat tatgggatga gaataaatct 3420
cattttattg aagatttctg ttggaaatta caccgaagag aaggtgcctg tgtgaactgt 3480
gaaatgcatg cccttaacga aattcaggag gtattcacat tgcatggaat gaaatgttca 3540
catttcaaac ttccggacta tcctttatta atgaatgcaa atacatgtga tcaattgtac 3600
gagcaacaac aggcagaggt tttgataaat tctctgaatg atgaacagtt ggcagccttt 3660
cagactataa cttcagccat cgaagatcaa actgtacacc ccaaatgctt tttcttggat 3720
ggtccaggtg gtagtggaaa aacatatctg tataaagttt taacacatta tattagaggt 3780
cgtggtggta ctgttttacc cacagcatct acaggaattg ctgcaaattt acttcttggt 3840
ggaagaacct ttcattccca atataaatta ccaattccat taaatgaaac ttcaatttct 3900
agactcgata taaagagtga agttgctaaa accattaaaa aggcccaact tctcattatt 3960
gatgaatgca ccatggcatc cagtcatgct ataaacgcca tagatagatt actaagagaa 4020
attatgaatt tgaatgttgc atttggtggg aaagttctcc ttctcggagg ggattttcga 4080
caatgtctca gtattgtacc acatgctatg cgatcggcca tagtacaaac gagtttaaag 4140
tactgtaatg tttggggatg tttcagaaag ttgtctctta aaacaaatat gagatcagag 4200
gattctgctt atagtgaatg gttagtaaaa cttggagatg gcaaacttga tagcagtttt 4260
catttaggaa tggatattat tgaaatcccc catgaaatga tttgtaacgg atctattatt 4320
gaagctacct ttggaaatag tatatctata gataatatta aaaatatatc taaacgtgca 4380
attctttgtc caaaaaatga gcatgttcaa aaattaaatg aagaaatttt ggatatactt 4440
gatggagatt ttcacacata tttgagtgat gattccattg attcaacaga tgatgctgaa 4500
aaggaaaatt ttcccatcga atttcttaat agtattactc cttcgggaat gccgtgtcat 4560
aaattaaaat tgaaagtggg tgcaatcatc atgctattga gaaatcttaa tagtaaatgg 4620
ggtctttgta atggtactag atttattatc aaaagattac gacctaacat tatcgaagct 4680
gaagtattaa caggatctgc agagggagag gttgttctga ttccaagaat tgatttgtcc 4740
ccatctgaca ctggcctccc atttaaatta attcgaagac agtttcccgt gatgccagca 4800
tttgcgatga ctattaataa atcacaagga caaactctag acagagtagg aatattccta 4860
cctgaacccg ttttcgcaca tggtcagtta tatgttgctt tctctcgagt tcgaagagca 4920
tgtgacgtta aagttaaagt tgtaaatact tcatcacaag ggaaattagt caagcactct 4980
gaaagtgttt ttactcttaa tgtggtatac agggagatat tagaataagt ttaatcactt 5040
tatcagtcat tgtttgcatc aatgttgttt ttatatcatg tttttgttgt ttttatatca 5100
tgtctttgtt gttgttatat catgttgtta ttgtttattt attaataaat ttatgtatta 5160
ttttcatata cattttactc atttcctttc atctctcaca cttctattat agagaaaggg 5220
caaatagcaa tattaaaata tttcctctaa ttaattccct ttcaatgtgc acgaatttcg 5280
tgcaccgggc cactag 5296
<210> 28
<211> 1496
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Helitron transposase
<400> 28
Met Ser Lys Glu Gln Leu Leu Ile Gln Arg Ser Ser Ala Ala Glu Arg
1 5 10 15
Cys Arg Arg Tyr Arg Gln Lys Met Ser Ala Glu Gln Arg Ala Ser Asp
20 25 30
Leu Glu Arg Arg Arg Arg Leu Gln Gln Asn Val Ser Glu Glu Gln Leu
35 40 45
Leu Glu Lys Arg Arg Ser Glu Ala Glu Lys Gln Arg Arg His Arg Gln
50 55 60
Lys Met Ser Lys Asp Gln Arg Ala Phe Glu Val Glu Arg Arg Arg Trp
65 70 75 80
Arg Arg Gln Asn Met Ser Arg Glu Gln Ser Ser Thr Ser Thr Thr Asn
85 90 95
Thr Gly Arg Asn Cys Leu Leu Ser Lys Asn Gly Val His Glu Asp Ala
100 105 110
Ile Leu Glu His Ser Cys Gly Gly Met Thr Val Arg Cys Glu Phe Cys
115 120 125
Leu Ser Leu Asn Phe Ser Asp Glu Lys Pro Ser Asp Gly Lys Phe Thr
130 135 140
Arg Cys Cys Ser Lys Gly Lys Val Cys Pro Asn Asp Ile His Phe Pro
145 150 155 160
Asp Tyr Pro Ala Tyr Leu Lys Arg Leu Met Thr Asn Glu Asp Ser Asp
165 170 175
Ser Lys Asn Phe Met Glu Asn Ile Arg Ser Ile Asn Ser Ser Phe Ala
180 185 190
Phe Ala Ser Met Gly Ala Asn Ile Ala Ser Pro Ser Gly Tyr Gly Pro
195 200 205
Tyr Cys Phe Arg Ile His Gly Gln Val Tyr His Arg Thr Gly Thr Leu
210 215 220
His Pro Ser Asp Gly Val Ser Arg Lys Phe Ala Gln Leu Tyr Ile Leu
225 230 235 240
Asp Thr Ala Glu Ala Thr Ser Lys Arg Leu Ala Met Pro Glu Asn Gln
245 250 255
Gly Cys Ser Glu Arg Leu Met Ile Asn Ile Asn Asn Leu Met His Glu
260 265 270
Ile Asn Glu Leu Thr Lys Ser Tyr Lys Met Leu His Glu Val Glu Lys
275 280 285
Glu Ala Gln Ser Glu Ala Ala Ala Lys Gly Ile Ala Pro Thr Glu Val
290 295 300
Thr Met Ala Ile Lys Tyr Asp Arg Asn Ser Asp Pro Gly Arg Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Pro Arg Val Thr Glu Val Ala Val Ile Phe Arg Asn Glu Asp Gly
325 330 335
Glu Pro Pro Phe Glu Arg Asp Leu Leu Ile His Cys Lys Pro Asp Pro
340 345 350
Asn Asn Pro Asn Ala Thr Lys Met Lys Gln Ile Ser Ile Leu Phe Pro
355 360 365
Thr Leu Asp Ala Met Thr Tyr Pro Ile Leu Phe Pro His Gly Glu Lys
370 375 380
Gly Trp Gly Thr Asp Ile Ala Leu Arg Leu Arg Asp Asn Ser Val Ile
385 390 395 400
Asp Asn Asn Thr Arg Gln Asn Val Arg Thr Arg Val Thr Gln Met Gln
405 410 415
Tyr Tyr Gly Phe His Leu Ser Val Arg Asp Thr Phe Asn Pro Ile Leu
420 425 430
Asn Ala Gly Lys Leu Thr Gln Gln Phe Ile Val Asp Ser Tyr Ser Lys
435 440 445
Met Glu Ala Asn Arg Ile Asn Phe Ile Lys Ala Asn Gln Ser Lys Leu
450 455 460
Arg Val Glu Lys Tyr Ser Gly Leu Met Asp Tyr Leu Lys Ser Arg Ser
465 470 475 480
Glu Asn Asp Asn Val Pro Ile Gly Lys Met Ile Ile Leu Pro Ser Ser
485 490 495
Phe Glu Gly Ser Pro Arg Asn Met Gln Gln Arg Tyr Gln Asp Ala Met
500 505 510
Ala Ile Val Thr Lys Tyr Gly Lys Pro Asp Leu Phe Ile Thr Met Thr
515 520 525
Cys Asn Pro Lys Trp Ala Asp Ile Thr Asn Asn Leu Gln Arg Trp Gln
530 535 540
Lys Val Glu Asn Arg Pro Asp Leu Val Ala Arg Val Phe Asn Ile Lys
545 550 555 560
Leu Asn Ala Leu Leu Asn Asp Ile Cys Lys Phe His Leu Phe Gly Lys
565 570 575
Val Ile Ala Lys Ile His Val Ile Glu Phe Gln Lys Arg Gly Leu Pro
580 585 590
His Ala His Ile Leu Leu Ile Leu Asp Ser Glu Ser Lys Leu Arg Ser
595 600 605
Glu Asp Asp Ile Asp Arg Ile Val Lys Ala Glu Ile Pro Asp Glu Asp
610 615 620
Gln Cys Pro Arg Leu Phe Gln Ile Val Lys Ser Asn Met Val His Gly
625 630 635 640
Pro Cys Gly Ile Gln Asn Pro Asn Ser Pro Cys Met Glu Asn Gly Lys
645 650 655
Cys Ser Lys Gly Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Asn Ala Thr Ile Gly Asn
660 665 670
Ile Asp Gly Tyr Pro Lys Tyr Lys Arg Arg Ser Gly Ser Thr Met Ser
675 680 685
Ile Gly Asn Lys Val Val Asp Asn Thr Trp Ile Val Pro Tyr Asn Pro
690 695 700
Tyr Leu Cys Leu Lys Tyr Asn Cys His Ile Asn Val Glu Val Cys Ala
705 710 715 720
Ser Ile Lys Ser Val Lys Tyr Leu Phe Lys Tyr Ile Tyr Lys Gly His
725 730 735
Asp Cys Ala Asn Ile Gln Ile Ser Glu Lys Asn Ile Ile Asn His Asp
740 745 750
Glu Val Gln Asp Phe Ile Asp Ser Arg Tyr Val Ser Ala Pro Glu Ala
755 760 765
Val Trp Arg Leu Phe Ala Met Arg Met His Asp Gln Ser His Ala Ile
770 775 780
Thr Arg Leu Ala Ile His Leu Pro Asn Asp Gln Asn Leu Tyr Phe His
785 790 795 800
Thr Asp Asp Phe Ala Glu Val Leu Asp Arg Ala Lys Arg His Asn Ser
805 810 815
Thr Leu Met Ala Trp Phe Leu Leu Asn Arg Glu Asp Ser Asp Ala Arg
820 825 830
Asn Tyr Tyr Tyr Trp Glu Ile Pro Gln His Tyr Val Phe Asn Asn Ser
835 840 845
Leu Trp Thr Lys Arg Arg Lys Gly Gly Asn Lys Val Leu Gly Arg Leu
850 855 860
Phe Thr Val Ser Phe Arg Glu Pro Glu Arg Tyr Tyr Leu Arg Leu Leu
865 870 875 880
Leu Leu His Val Lys Gly Ala Ile Ser Phe Glu Asp Leu Arg Thr Val
885 890 895
Gly Gly Val Thr Tyr Asp Thr Phe His Glu Ala Ala Lys His Arg Gly
900 905 910
Leu Leu Leu Asp Asp Thr Ile Trp Lys Asp Thr Ile Asp Asp Ala Ile
915 920 925
Ile Leu Asn Met Pro Lys Gln Leu Arg Gln Leu Phe Ala Tyr Ile Cys
930 935 940
Val Phe Gly Cys Pro Ser Ala Ala Asp Lys Leu Trp Asp Glu Asn Lys
945 950 955 960
Ser His Phe Ile Glu Asp Phe Cys Trp Lys Leu His Arg Arg Glu Gly
965 970 975
Ala Cys Val Asn Cys Glu Met His Ala Leu Asn Glu Ile Gln Glu Val
980 985 990
Phe Thr Leu His Gly Met Lys Cys Ser His Phe Lys Leu Pro Asp Tyr
995 1000 1005
Pro Leu Leu Met Asn Ala Asn Thr Cys Asp Gln Leu Tyr Glu Gln
1010 1015 1020
Gln Gln Ala Glu Val Leu Ile Asn Ser Leu Asn Asp Glu Gln Leu
1025 1030 1035
Ala Ala Phe Gln Thr Ile Thr Ser Ala Ile Glu Asp Gln Thr Val
1040 1045 1050
His Pro Lys Cys Phe Phe Leu Asp Gly Pro Gly Gly Ser Gly Lys
1055 1060 1065
Thr Tyr Leu Tyr Lys Val Leu Thr His Tyr Ile Arg Gly Arg Gly
1070 1075 1080
Gly Thr Val Leu Pro Thr Ala Ser Thr Gly Ile Ala Ala Asn Leu
1085 1090 1095
Leu Leu Gly Gly Arg Thr Phe His Ser Gln Tyr Lys Leu Pro Ile
1100 1105 1110
Pro Leu Asn Glu Thr Ser Ile Ser Arg Leu Asp Ile Lys Ser Glu
1115 1120 1125
Val Ala Lys Thr Ile Lys Lys Ala Gln Leu Leu Ile Ile Asp Glu
1130 1135 1140
Cys Thr Met Ala Ser Ser His Ala Ile Asn Ala Ile Asp Arg Leu
1145 1150 1155
Leu Arg Glu Ile Met Asn Leu Asn Val Ala Phe Gly Gly Lys Val
1160 1165 1170
Leu Leu Leu Gly Gly Asp Phe Arg Gln Cys Leu Ser Ile Val Pro
1175 1180 1185
His Ala Met Arg Ser Ala Ile Val Gln Thr Ser Leu Lys Tyr Cys
1190 1195 1200
Asn Val Trp Gly Cys Phe Arg Lys Leu Ser Leu Lys Thr Asn Met
1205 1210 1215
Arg Ser Glu Asp Ser Ala Tyr Ser Glu Trp Leu Val Lys Leu Gly
1220 1225 1230
Asp Gly Lys Leu Asp Ser Ser Phe His Leu Gly Met Asp Ile Ile
1235 1240 1245
Glu Ile Pro His Glu Met Ile Cys Asn Gly Ser Ile Ile Glu Ala
1250 1255 1260
Thr Phe Gly Asn Ser Ile Ser Ile Asp Asn Ile Lys Asn Ile Ser
1265 1270 1275
Lys Arg Ala Ile Leu Cys Pro Lys Asn Glu His Val Gln Lys Leu
1280 1285 1290
Asn Glu Glu Ile Leu Asp Ile Leu Asp Gly Asp Phe His Thr Tyr
1295 1300 1305
Leu Ser Asp Asp Ser Ile Asp Ser Thr Asp Asp Ala Glu Lys Glu
1310 1315 1320
Asn Phe Pro Ile Glu Phe Leu Asn Ser Ile Thr Pro Ser Gly Met
1325 1330 1335
Pro Cys His Lys Leu Lys Leu Lys Val Gly Ala Ile Ile Met Leu
1340 1345 1350
Leu Arg Asn Leu Asn Ser Lys Trp Gly Leu Cys Asn Gly Thr Arg
1355 1360 1365
Phe Ile Ile Lys Arg Leu Arg Pro Asn Ile Ile Glu Ala Glu Val
1370 1375 1380
Leu Thr Gly Ser Ala Glu Gly Glu Val Val Leu Ile Pro Arg Ile
1385 1390 1395
Asp Leu Ser Pro Ser Asp Thr Gly Leu Pro Phe Lys Leu Ile Arg
1400 1405 1410
Arg Gln Phe Pro Val Met Pro Ala Phe Ala Met Thr Ile Asn Lys
1415 1420 1425
Ser Gln Gly Gln Thr Leu Asp Arg Val Gly Ile Phe Leu Pro Glu
1430 1435 1440
Pro Val Phe Ala His Gly Gln Leu Tyr Val Ala Phe Ser Arg Val
1445 1450 1455
Arg Arg Ala Cys Asp Val Lys Val Lys Val Val Asn Thr Ser Ser
1460 1465 1470
Gln Gly Lys Leu Val Lys His Ser Glu Ser Val Phe Thr Leu Asn
1475 1480 1485
Val Val Tyr Arg Glu Ile Leu Glu
1490 1495
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Helraiser palindromic sequence
<400> 29
gtgcacgaat ttcgtgcacc gggccactag 30
<210> 30
<211> 649
<212> PRT
<213> Oryzias latipes
<400> 30
Met Glu Glu Val Cys Asp Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Thr Val Gln
1 5 10 15
Asn Gln Pro Gln Asp Gln Glu His Pro Trp Pro Tyr Leu Arg Glu Phe
20 25 30
Phe Ser Leu Ser Gly Val Asn Lys Asp Ser Phe Lys Met Lys Cys Val
35 40 45
Leu Cys Leu Pro Leu Asn Lys Glu Ile Ser Ala Phe Lys Ser Ser Pro
50 55 60
Ser Asn Leu Arg Lys His Ile Glu Arg Met His Pro Asn Tyr Leu Lys
65 70 75 80
Asn Tyr Ser Lys Leu Thr Ala Gln Lys Arg Lys Ile Gly Thr Ser Thr
85 90 95
His Ala Ser Ser Ser Lys Gln Leu Lys Val Asp Ser Val Phe Pro Val
100 105 110
Lys His Val Ser Pro Val Thr Val Asn Lys Ala Ile Leu Arg Tyr Ile
115 120 125
Ile Gln Gly Leu His Pro Phe Ser Thr Val Asp Leu Pro Ser Phe Lys
130 135 140
Glu Leu Ile Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Ser Val Ile Thr Arg Pro
145 150 155 160
Thr Leu Arg Ser Lys Ile Ala Glu Ala Ala Leu Ile Met Lys Gln Lys
165 170 175
Val Thr Ala Ala Met Ser Glu Val Glu Trp Ile Ala Thr Thr Thr Asp
180 185 190
Cys Trp Thr Ala Arg Arg Lys Ser Phe Ile Gly Val Thr Ala His Trp
195 200 205
Ile Asn Pro Gly Ser Leu Glu Arg His Ser Ala Ala Leu Ala Cys Lys
210 215 220
Arg Leu Met Gly Ser His Thr Phe Glu Val Leu Ala Ser Ala Met Asn
225 230 235 240
Asp Ile His Ser Glu Tyr Glu Ile Arg Asp Lys Val Val Cys Thr Thr
245 250 255
Thr Asp Ser Gly Ser Asn Phe Met Lys Ala Phe Arg Val Phe Gly Val
260 265 270
Glu Asn Asn Asp Ile Glu Thr Glu Ala Arg Arg Cys Glu Ser Asp Asp
275 280 285
Thr Asp Ser Glu Gly Cys Gly Glu Gly Ser Asp Gly Val Glu Phe Gln
290 295 300
Asp Ala Ser Arg Val Leu Asp Gln Asp Asp Gly Phe Glu Phe Gln Leu
305 310 315 320
Pro Lys His Gln Lys Cys Ala Cys His Leu Leu Asn Leu Val Ser Ser
325 330 335
Val Asp Ala Gln Lys Ala Leu Ser Asn Glu His Tyr Lys Lys Leu Tyr
340 345 350
Arg Ser Val Phe Gly Lys Cys Gln Ala Leu Trp Asn Lys Ser Ser Arg
355 360 365
Ser Ala Leu Ala Ala Glu Ala Val Glu Ser Glu Ser Arg Leu Gln Leu
370 375 380
Leu Arg Pro Asn Gln Thr Arg Trp Asn Ser Thr Phe Met Ala Val Asp
385 390 395 400
Arg Ile Leu Gln Ile Cys Lys Glu Ala Gly Glu Gly Ala Leu Arg Asn
405 410 415
Ile Cys Thr Ser Leu Glu Val Pro Met Phe Asn Pro Ala Glu Met Leu
420 425 430
Phe Leu Thr Glu Trp Ala Asn Thr Met Arg Pro Val Ala Lys Val Leu
435 440 445
Asp Ile Leu Gln Ala Glu Thr Asn Thr Gln Leu Gly Trp Leu Leu Pro
450 455 460
Ser Val His Gln Leu Ser Leu Lys Leu Gln Arg Leu His His Ser Leu
465 470 475 480
Arg Tyr Cys Asp Pro Leu Val Asp Ala Leu Gln Gln Gly Ile Gln Thr
485 490 495
Arg Phe Lys His Met Phe Glu Asp Pro Glu Ile Ile Ala Ala Ala Ile
500 505 510
Leu Leu Pro Lys Phe Arg Thr Ser Trp Thr Asn Asp Glu Thr Ile Ile
515 520 525
Lys Arg Gly Met Asp Tyr Ile Arg Val His Leu Glu Pro Leu Asp His
530 535 540
Lys Lys Glu Leu Ala Asn Ser Ser Ser Asp Asp Glu Asp Phe Phe Ala
545 550 555 560
Ser Leu Lys Pro Thr Thr His Glu Ala Ser Lys Glu Leu Asp Gly Tyr
565 570 575
Leu Ala Cys Val Ser Asp Thr Arg Glu Ser Leu Leu Thr Phe Pro Ala
580 585 590
Ile Cys Ser Leu Ser Ile Lys Thr Asn Thr Pro Leu Pro Ala Ser Ala
595 600 605
Ala Cys Glu Arg Leu Phe Ser Thr Ala Gly Leu Leu Phe Ser Pro Lys
610 615 620
Arg Ala Arg Leu Asp Thr Asn Asn Phe Glu Asn Gln Leu Leu Leu Lys
625 630 635 640
Leu Asn Leu Arg Phe Tyr Asn Phe Glu
645
<210> 31
<211> 4682
<212> DNA
<213> Oryzias latipes
<400> 31
cagaggtgta aagtacttga gtaattttac ttgattactg tacttaagta ttatttttgg 60
ggatttttac tttacttgag tacaattaaa aatcaatact tttactttta cttaattaca 120
tttttttaga aaaaaaagta ctttttactc cttacaattt tatttacagt caaaaagtac 180
ttattttttg gagatcactt cattctattt tcccttgcta ttaccaaacc aattgaattg 240
cgctgatgcc cagtttaatt taaatgttat ttattctgcc tatgaaaatc gttttcacat 300
tatatgaaat tggtcagaca tgttcattgg tcctttggaa gtgacgtcat gtcacatcta 360
ttaccacaat gcacagcacc ttgacctgga aattagggaa attataacag tcaatcagtg 420
gaagaaaatg gaggaagtat gtgattcatc agcagctgcg agcagcacag tccaaaatca 480
gccacaggat caagagcacc cgtggccgta tcttcgcgaa ttcttttctt taagtggtgt 540
aaataaagat tcattcaaga tgaaatgtgt cctctgtctc ccgcttaata aagaaatatc 600
ggccttcaaa agttcgccat caaacctaag gaagcatatt gaggtaagta cattaagtat 660
tttgttttac tgatagtttt tttttttttt tttttttttt tttttgggtg tgcatgtttt 720
gacgttgatg gcgcgccttt tatatgtgta gtaggcctat tttcactaat gcatgcgatt 780
gacaatataa ggctcacgta ataaaatgct aaaatgcatt tgtaattggt aacgttaggt 840
ccacgggaaa tttggcgcct attgcagctt tgaataatca ttatcattcc gtgctctcat 900
tgtgtttgaa ttcatgcaaa acacaagaaa accaagcgag aaattttttt ccaaacatgt 960
tgtattgtca aaacggtaac actttacaat gaggttgatt agttcatgta ttaactaaca 1020
ttaaataacc atgagcaata catttgttac tgtatctgtt aatctttgtt aacgttagtt 1080
aatagaaata cagatgttca ttgtttgttc atgttagttc acagtgcatt aactaatgtt 1140
aacaagatat aaagtattag taaatgttga aattaacatg tatacgtgca gttcattatt 1200
agttcatgtt aactaatgta gttaactaac gaaccttatt gtaaaagtgt taccatcaaa 1260
actaatgtaa tgaaatcaat tcaccctgtc atgtcagcct tacagtcctg tgtttttgtc 1320
aatataatca gaaataaaat taatgtttga ttgtcactaa atgctactgt atttctaaaa 1380
tcaacaagta tttaacatta taaagtgtgc aattggctgc aaatgtcagt tttattaaag 1440
ggttagttca cccaaaaatg aaaataatgt cattaatgac tcgccctcat gtcgttccaa 1500
gcccgtaaga cctccgttca tcttcagaac acagtttaag atattttaga tttagtccga 1560
gagctttctg tgcctccatt gagaatgtat gtacggtata ctgtccatgt ccagaaaggt 1620
aataaaaaca tcaaagtagt ccatgtgaca tcagtgggtt agttagaatt ttttgaagca 1680
tcgaatacat tttggtccaa aaataacaaa acctacgact ttattcggca ttgtattctc 1740
ttccgggtct gttgtcaatc cgcgttcacg acttcgcagt gacgctacaa tgctgaataa 1800
agtcgtaggt tttgttattt ttggaccaaa atgtattttc gatgcttcaa ataattctac 1860
ctaacccact gatgtcacat ggactacttt gatgttttta ttacctttct ggacatggac 1920
agtataccgt acatacattt tcagtggagg gacagaaagc tctcggacta aatctaaaat 1980
atcttaaact gtgttccgaa gatgaacgga ggtgttacgg gcttggaacg acatgagggt 2040
gagtcattaa tgacatcttt tcatttttgg gtgaactaac cctttaatgc tgtaatcaga 2100
gagtgtatgt gtaattgtta catttattgc atacaatata aatatttatt tgttgttttt 2160
acagagaatg cacccaaatt acctcaaaaa ctactctaaa ttgacagcac agaagagaaa 2220
gatcgggacc tccacccatg cttccagcag taagcaactg aaagttgact cagttttccc 2280
agtcaaacat gtgtctccag tcactgtgaa caaagctata ttaaggtaca tcattcaagg 2340
acttcatcct ttcagcactg ttgatctgcc atcatttaaa gagctgatta gtacactgca 2400
gcctggcatt tctgtcatta caaggcctac tttacgctcc aagatagctg aagctgctct 2460
gatcatgaaa cagaaagtga ctgctgccat gagtgaagtt gaatggattg caaccacaac 2520
ggattgttgg actgcacgta gaaagtcatt cattggtgta actgctcact ggatcaaccc 2580
tggaagtctt gaaagacatt ccgctgcact tgcctgcaaa agattaatgg gctctcatac 2640
ttttgaggta ctggccagtg ccatgaatga tatccactca gagtatgaaa tacgtgacaa 2700
ggttgtttgc acaaccacag acagtggttc caactttatg aaggctttca gagtttttgg 2760
tgtggaaaac aatgatatcg agactgaggc aagaaggtgt gaaagtgatg acactgattc 2820
tgaaggctgt ggtgagggaa gtgatggtgt ggaattccaa gatgcctcac gagtcctgga 2880
ccaagacgat ggcttcgaat tccagctacc aaaacatcaa aagtgtgcct gtcacttact 2940
taacctagtc tcaagcgttg atgcccaaaa agctctctca aatgaacact acaagaaact 3000
ctacagatct gtctttggca aatgccaagc tttatggaat aaaagcagcc gatcggctct 3060
agcagctgaa gctgttgaat cagaaagccg gcttcagctt ttaaggccaa accaaacgcg 3120
gtggaattca acttttatgg ctgttgacag aattcttcaa atttgcaaag aagcaggaga 3180
aggcgcactt cggaatatat gcacctctct tgaggttcca atgtaagtgt ttttcccctc 3240
tatcgatgta aacaaatgtg ggttgttttt gtttaatact ctttgattat gctgatttct 3300
cctgtaggtt taatccagca gaaatgctgt tcttgacaga gtgggccaac acaatgcgtc 3360
cagttgcaaa agtactcgac atcttgcaag cggaaacgaa tacacagctg gggtggctgc 3420
tgcctagtgt ccatcagtta agcttgaaac ttcagcgact ccaccattct ctcaggtact 3480
gtgacccact tgtggatgcc ctacaacaag gaatccaaac acgattcaag catatgtttg 3540
aagatcctga gatcatagca gctgccatcc ttctccctaa atttcggacc tcttggacaa 3600
atgatgaaac catcataaaa cgaggtaaat gaatgcaagc aacatacact tgacgaattc 3660
taatctgggc aacctttgag ccataccaaa attattcttt tatttattta tttttgcact 3720
ttttaggaat gttatatccc atctttggct gtgatctcaa tatgaatatt gatgtaaagt 3780
attcttgcag caggttgtag ttatccctca gtgtttcttg aaaccaaact catatgtatc 3840
atatgtggtt tggaaatgca gttagatttt atgctaaaat aagggatttg catgatttta 3900
gatgtagatg actgcacgta aatgtagtta atgacaaaat ccataaaatt tgttcccagt 3960
cagaagcccc tcaaccaaac ttttctttgt gtctgctcac tgtgcttgta ggcatggact 4020
acatcagagt gcatctggag cctttggacc acaagaagga attggccaac agttcatctg 4080
atgatgaaga ttttttcgct tctttgaaac cgacaacaca tgaagccagc aaagagttgg 4140
atggatatct ggcctgtgtt tcagacacca gggagtctct gctcacgttt cctgctattt 4200
gcagcctctc tatcaagact aatacacctc ttcccgcatc ggctgcctgt gagaggcttt 4260
tcagcactgc aggattgctt ttcagcccca aaagagctag gcttgacact aacaattttg 4320
agaatcagct tctactgaag ttaaatctga ggttttacaa ctttgagtag cgtgtactgg 4380
cattagattg tctgtcttat agtttgataa ttaaatacaa acagttctaa agcaggataa 4440
aaccttgtat gcatttcatt taatgttttt tgagattaaa agcttaaaca agaatctcta 4500
gttttctttc ttgcttttac ttttacttcc ttaatactca agtacaattt taatggagta 4560
cttttttact tttactcaag taagattcta gccagatact tttactttta attgagtaaa 4620
attttcccta agtacttgta ctttcacttg agtaaaattt ttgagtactt tttacacctc 4680
tg 4682
<210> 32
<211> 1053
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dSaCas9
<400> 32
Met Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Ala Ile Gly Ile Thr Ser Val
1 5 10 15
Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly
20 25 30
Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg
35 40 45
Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile
50 55 60
Gln Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp His
65 70 75 80
Ser Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys Gly Leu
85 90 95
Ser Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His Leu
100 105 110
Ala Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu Glu Asp Thr
115 120 125
Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser Lys Ala
130 135 140
Leu Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys Lys
145 150 155 160
Asp Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg Phe Lys Thr Ser Asp Tyr
165 170 175
Val Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr His Gln
180 185 190
Leu Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Thr Arg
195 200 205
Arg Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly Trp Lys
210 215 220
Asp Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr Phe
225 230 235 240
Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Tyr
245 250 255
Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp Glu Asn
260 265 270
Glu Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn Val Phe
275 280 285
Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu
290 295 300
Val Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser Thr Gly Lys
305 310 315 320
Pro Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His Asp Ile Lys Asp Ile Thr
325 330 335
Ala Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile Ala
340 345 350
Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu Leu
355 360 365
Thr Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile Ser
370 375 380
Asn Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala Ile
385 390 395 400
Asn Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr Asn Asp Asn Gln Ile Ala
405 410 415
Ile Phe Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys Lys Val Asp Leu Ser Gln
420 425 430
Gln Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu Ser Pro
435 440 445
Val Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn Ala Ile
450 455 460
Ile Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala Arg
465 470 475 480
Glu Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met Ile Asn Glu Met Gln Lys
485 490 495
Arg Asn Arg Gln Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr Thr
500 505 510
Gly Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His Asp
515 520 525
Met Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu
530 535 540
Asp Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile Pro
545 550 555 560
Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Lys
565 570 575
Gln Glu Glu Ala Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr Leu
580 585 590
Ser Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His Ile
595 600 605
Leu Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys Glu
610 615 620
Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys Asp
625 630 635 640
Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Gly Leu
645 650 655
Met Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp Val Lys
660 665 670
Val Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys Trp
675 680 685
Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp
690 695 700
Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys
705 710 715 720
Leu Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys
725 730 735
Gln Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys Glu
740 745 750
Ile Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys Asp
755 760 765
Tyr Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Glu Leu Ile
770 775 780
Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr Leu
785 790 795 800
Ile Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu
805 810 815
Lys Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His His
820 825 830
Asp Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr Gly
835 840 845
Asp Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn Tyr
850 855 860
Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile
865 870 875 880
Lys Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp
885 890 895
Tyr Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Pro Tyr
900 905 910
Arg Phe Asp Val Tyr Leu Asp Asn Gly Val Tyr Lys Phe Val Thr Val
915 920 925
Lys Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val Asn Ser
930 935 940
Lys Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn Gln Ala
945 950 955 960
Glu Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Asn Asn Asp Leu Ile Lys Ile Asn Gly
965 970 975
Glu Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Leu Leu Asn Arg Ile
980 985 990
Glu Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu Asn Met
995 1000 1005
Asn Asp Lys Arg Pro Pro Arg Ile Ile Lys Thr Ile Ala Ser Lys
1010 1015 1020
Thr Gln Ser Ile Lys Lys Tyr Ser Thr Asp Ile Leu Gly Asn Leu
1025 1030 1035
Tyr Glu Val Lys Ser Lys Lys His Pro Gln Ile Ile Lys Lys Gly
1040 1045 1050
<210> 33
<211> 1368
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dCas9 with X at position 1, X can be any amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 33
Xaa Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765
Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780
Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800
Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815
Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830
Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845
Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880
Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895
Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005
Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020
Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
1025 1030 1035
Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala
1040 1045 1050
Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
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Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val
1070 1075 1080
Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1085 1090 1095
Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys
1100 1105 1110
Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
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Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
1130 1135 1140
Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
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Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser
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Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
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Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly
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Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
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Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
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His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys
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Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala
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Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala
1310 1315 1320
Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
1325 1330 1335
Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
1340 1345 1350
Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
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<212> PRT
<213> Clostridium sp. 7_2_43FAA
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Glu Gly Ile Lys Ser Asn Ile Ser Leu Leu Lys Asp Glu Leu Arg Gly
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Gln Ile Ser His Ile Ser His Glu Tyr Leu Ser Leu Ile Asp Leu Ala
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Phe Asp Ser Lys Gln Asn Arg Leu Phe Glu Met Lys Val Leu Glu Leu
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Leu Val Asn Glu Tyr Gly Phe Lys Gly Arg His Leu Gly Gly Ser Arg
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Lys Pro Asp Gly Ile Val Tyr Ser Thr Thr Leu Glu Asp Asn Phe Gly
65 70 75 80
Ile Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Glu Gly Tyr Ser Leu Pro Ile
85 90 95
Ser Gln Ala Asp Glu Met Glu Arg Tyr Val Arg Glu Asn Ser Asn Arg
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Asp Glu Glu Val Asn Pro Asn Lys Trp Trp Glu Asn Phe Ser Glu Glu
115 120 125
Val Lys Lys Tyr Tyr Phe Val Phe Ile Ser Gly Ser Phe Lys Gly Lys
130 135 140
Phe Glu Glu Gln Leu Arg Arg Leu Ser Met Thr Thr Gly Val Asn Gly
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Ser Ala Val Asn Val Val Asn Leu Leu Leu Gly Ala Glu Lys Ile Arg
165 170 175
Ser Gly Glu Met Thr Ile Glu Glu Leu Glu Arg Ala Met Phe Asn Asn
180 185 190
Ser Glu Phe Ile Leu Lys Tyr
195
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PB-EF1a vector
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tgtacataga ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg 60
cgtaaaattg acgcatgtgt tttatcggtc tgtatatcga ggtttattta ttaatttgaa 120
tagatattaa gttttattat atttacactt acatactaat aataaattca acaaacaatt 180
tatttatgtt tatttattta ttaaaaaaaa acaaaaactc aaaatttctt ctataaagta 240
acaaaacttt tatcgaatac ctgcagcccg ggggatgcag agggacagcc cccccccaaa 300
gcccccaggg atgtaattac gtccctcccc cgctaggggg cagcagcgag ccgcccgggg 360
ctccgctccg gtccggcgct ccccccgcat ccccgagccg gcagcgtgcg gggacagccc 420
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cctgcagaca cctgggggga tacggggaaa agttgactgt gcctttcgat cgaaccatgg 540
acagttagct ttgcaaagat ggataaagtt ttaaacagag aggaatcttt gcagctaatg 600
gaccttctag gtcttgaaag gagtgggaat tggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg 660
cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta 720
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cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa 840
cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt 900
tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacc tggctgcagt acgtgattct 960
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cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat 1080
ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca tttaaaattt 1140
ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga 1200
tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca 1260
gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta 1320
gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc 1380
ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc 1440
cggccctgct gcagggagct caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga 1500
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tggatcttgg ttcattctca agcctcagac agtggttcaa agtttttttc ttccatttca 1800
ggtgtcgtga gaattctaat acgactcact atagggtgtg ctgtctcatc attttggcaa 1860
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ggatccacgg gtaccgatca catatgcctt taattaaaca ctagttctat agtgtcacct 1980
aaattccctt tagtgagggt taatggccgt aggccgccag aattgggtcc agacatgata 2040
agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt 2100
tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt 2160
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ccttttgctc acatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa 3900
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tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc 4020
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cgccgcattg catcagccat gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg 4440
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tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca 4680
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atcataatat tattgaagca tttatcaggg ttcgtctcgt cccggtctcc tcccaatgca 4800
tgtcaatatt ggccattagc catattattc attggttata tagcataaat caatattggc 4860
tattggccat tgcatacgtt gtatctatat cataata 4897
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> EF1a-2r primer
<400> 36
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAVS-3r primer
<400> 37
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SV40pA-1r primer
<400> 38
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAVS-2f primer
<400> 39
ctggggactc tttaaggaaa gaag 24
<210> 40
<211> 1591
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dCas9-Clo051
<400> 40
Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Gly Ile Lys Ser Asn Ile
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Ser Leu Leu Lys Asp Glu Leu Arg Gly Gln Ile Ser His Ile Ser His
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Glu Tyr Leu Ser Leu Ile Asp Leu Ala Phe Asp Ser Lys Gln Asn Arg
35 40 45
Leu Phe Glu Met Lys Val Leu Glu Leu Leu Val Asn Glu Tyr Gly Phe
50 55 60
Lys Gly Arg His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ile Val Tyr
65 70 75 80
Ser Thr Thr Leu Glu Asp Asn Phe Gly Ile Ile Val Asp Thr Lys Ala
85 90 95
Tyr Ser Glu Gly Tyr Ser Leu Pro Ile Ser Gln Ala Asp Glu Met Glu
100 105 110
Arg Tyr Val Arg Glu Asn Ser Asn Arg Asp Glu Glu Val Asn Pro Asn
115 120 125
Lys Trp Trp Glu Asn Phe Ser Glu Glu Val Lys Lys Tyr Tyr Phe Val
130 135 140
Phe Ile Ser Gly Ser Phe Lys Gly Lys Phe Glu Glu Gln Leu Arg Arg
145 150 155 160
Leu Ser Met Thr Thr Gly Val Asn Gly Ser Ala Val Asn Val Val Asn
165 170 175
Leu Leu Leu Gly Ala Glu Lys Ile Arg Ser Gly Glu Met Thr Ile Glu
180 185 190
Glu Leu Glu Arg Ala Met Phe Asn Asn Ser Glu Phe Ile Leu Lys Tyr
195 200 205
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly
210 215 220
Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro
225 230 235 240
Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys
245 250 255
Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu
260 265 270
Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys
275 280 285
Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys
290 295 300
Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu
305 310 315 320
Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp
325 330 335
Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys
340 345 350
Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu
355 360 365
Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly
370 375 380
Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu
385 390 395 400
Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser
405 410 415
Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg
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Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly
435 440 445
Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe
450 455 460
Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys
465 470 475 480
Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp
485 490 495
Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile
500 505 510
Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro
515 520 525
Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu
530 535 540
Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys
545 550 555 560
Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp
565 570 575
Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu
580 585 590
Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu
595 600 605
Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His
610 615 620
Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp
625 630 635 640
Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu
645 650 655
Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser
660 665 670
Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp
675 680 685
Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile
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Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu
705 710 715 720
Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu
725 730 735
Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu
740 745 750
Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn
755 760 765
Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile
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Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn
785 790 795 800
Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys
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Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val
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Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu
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Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys
885 890 895
Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp
900 905 910
Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln
915 920 925
Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala
930 935 940
Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val
945 950 955 960
Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala
965 970 975
Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg
980 985 990
Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu
995 1000 1005
Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu
1010 1015 1020
Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln
1025 1030 1035
Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile
1040 1045 1050
Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val
1055 1060 1065
Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro
1070 1075 1080
Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu
1085 1090 1095
Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr
1100 1105 1110
Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe
1115 1120 1125
Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val
1130 1135 1140
Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn
1145 1150 1155
Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys
1160 1165 1170
Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
1175 1180 1185
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala
1190 1195 1200
Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser
1205 1210 1215
Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met
1220 1225 1230
Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr
1235 1240 1245
Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr
1250 1255 1260
Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn
1265 1270 1275
Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala
1280 1285 1290
Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys
1295 1300 1305
Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu
1310 1315 1320
Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp
1325 1330 1335
Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr
1340 1345 1350
Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys
1355 1360 1365
Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg
1370 1375 1380
Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly
1385 1390 1395
Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr
1400 1405 1410
Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser
1415 1420 1425
Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys
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Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys
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Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln
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His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe
1475 1480 1485
Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu
1490 1495 1500
Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala
1505 1510 1515
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1520 1525 1530
Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr
1535 1540 1545
Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser
1550 1555 1560
Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly
1565 1570 1575
Gly Asp Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ser Ser
1580 1585 1590
<210> 41
<211> 4073
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pHR-GFP- selection gene plasmid
<400> 41
ggggccacta gggacaggat cggcgtcttc actcgctggg ttcccttttc cttctccttc 60
tggggcctgt gccatctctc gtttcttagg atggccttct ccgacggatg tctcccttgc 120
gtcccgcctc cccttcttgt aggcctgcat catcaccgtt tttctggaca accccaaagt 180
accccgtctc cctggcttta gccacctctc catcctcttg ctttctttgc ctggacaccc 240
cgttctcctg tggattcggg tcacctctca ctcctttcat ttgggcagct cccctacccc 300
ccttacctct ctagtctgtg ctagctcttc cagccccctg tcatggcatc ttccaggggt 360
ccgagagctc agctagtctt cttcctccaa cccgggcccc tatgtccact tcaggacagc 420
atgtttgctg cctccaggga tcctgtgtcc ccgagctggg accaccttat attcccaggg 480
ccggttaatg tggctctggt tctgggtact tttatctgtc ccgacgtccg atcgaaccat 540
ggacagttag ctttgcaaag atggataaag ttttaaacag agaggaatct ttgcagctaa 600
tggaccttct aggtcttgaa aggagtggga attggctccg gtgcccgtca gtgggcagag 660
cgcacatcgc ccacagtccc cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aaccggtgcc 720
tagagaaggt ggcgcggggt aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt 780
cccgagggtg ggggagaacc gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc 840
aacgggtttg ccgccagaac acaggtaagt gccgtgtgtg gttcccgcgg gcctggcctc 900
tttacgggtt atggcccttg cgtgccttga attacttcca cctggctgca gtacgtgatt 960
cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg tgggagagtt cgaggccttg cgcttaagga 1020
gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctgggc gctggggccg ccgcgtgcga 1080
atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc catttaaaat 1140
ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa tgcgggccaa 1200
gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc ccgtgcgtcc 1260
cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat cggacggggg 1320
tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg tatcgccccg 1380
ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag atggccgctt 1440
cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga gcgggcgggt 1500
gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc atgtgactcc 1560
acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct cgagcttttg gagtacgtcg 1620
tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc cccacactga gtgggtggag 1680
actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct tggaatttgc cctttttgag 1740
tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt tcttccattt 1800
caggtgtcgt gagaattcta atacgactca ctatagggtg tgctgtctca tcattttggc 1860
aaagattggc caccaagctt accgccatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg 1920
tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg 1980
gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg 2040
gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct 2100
tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag 2160
gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg 2220
aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca 2280
aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct 2340
atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca 2400
tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg 2460
gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc 2520
ccaacgagaa gcgtgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc 2580
tcggcatgga cgagctgtac aaggaaggaa gaggcagcct gctgacatgt ggcgacgtgg 2640
aggagaaccc tggcccaatg gtgggcagcc tgaattgtat cgtggccgtg tcccagaaca 2700
tgggcatcgg caagaatggc gattttcctt ggccccctct gagaaatgag tccagatact 2760
ttcagaggat gaccacaacc agctccgtgg agggcaagca gaacctggtc atcatgggca 2820
agaagacatg gttctctatc ccagagaaga accgccccct gaagggccgg atcaatctgg 2880
tgctgagcag ggagctgaag gagccacccc agggagcaca ctttctgtcc aggtctctgg 2940
acgatgccct gaagctgacc gagcagcctg agctggccaa caaggtggac atggtgtgga 3000
tcgtgggcgg ctctagcgtg tataaggagg ccatgaatca ccctggccac ctgaagctgt 3060
tcgtgacacg gatcatgcag gactttgagt ccgatacctt ctttccagag atcgacctgg 3120
agaagtacaa gctgctgccc gagtatcctg gcgtgctgtc tgatgtgcag gaggagaagg 3180
gcatcaagta caagttcgag gtgtatgaga agaacgattg ataacatatg cctttaatta 3240
aacactagtt ctatagtgtc acctaaattc cctttagtga gggttaatgg ccgtaggccg 3300
ccagaattgg gtccagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga 3360
atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc 3420
attataagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt 3480
cagggggagg tgtgggaggt tttttcggac tctaggacct gcgcatgcgc ttggggtacc 3540
taggatatcg acagaaaagc cccatcctta ggcctcctcc ttcctagtct cctgatattg 3600
ggtctaaccc ccacctcctg ttaggcagat tccttatctg gtgacacacc cccatttcct 3660
ggagccatct ctctccttgc cagaacctct aaggtttgct tacgatggag ccagagagga 3720
tcctgggagg gagagcttgg cagggggtgg gagggaaggg ggggatgcgt gacctgcccg 3780
gttctcagtg gccaccctgc gctaccctct cccagaacct gagctgctct gacgcggccg 3840
tctggtgcgt ttcactgatc ctggtgctgc agcttcctta cacttcccaa gaggagaagc 3900
agtttggaaa aacaaaatca gaataagttg gtcctgagtt ctaactttgg ctcttcacct 3960
ttctagtccc caatttatat tgttcctccg tgcgtcagtt ttacctgtga gataaggcca 4020
gtagccagcc ccgtcctggc agggctgtgc ctctagggac aggattggtg acg 4073
<210> 42
<211> 3089
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pMMEJ-GFP-selection gene plasmid
<400> 42
ccaatcctgt ccctagtggc cccactgtgg ggacgtccga tcgaaccatg gacagttagc 60
tttgcaaaga tggataaagt tttaaacaga gaggaatctt tgcagctaat ggaccttcta 120
ggtcttgaaa ggagtgggaa ttggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc gcacatcgcc 180
cacagtcccc gagaagttgg ggggaggggt cggcaattga accggtgcct agagaaggtg 240
gcgcggggta aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg 300
gggagaaccg tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc 360
cgccagaaca caggtaagtg ccgtgtgtgg ttcccgcggg cctggcctct ttacgggtta 420
tggcccttgc gtgccttgaa ttacttccac ctggctgcag tacgtgattc ttgatcccga 480
gcttcgggtt ggaagtgggt gggagagttc gaggccttgc gcttaaggag ccccttcgcc 540
tcgtgcttga gttgaggcct ggcctgggcg ctggggccgc cgcgtgcgaa tctggtggca 600
ccttcgcgcc tgtctcgctg ctttcgataa gtctctagcc atttaaaatt tttgatgacc 660
tgctgcgacg ctttttttct ggcaagatag tcttgtaaat gcgggccaag atctgcacac 720
tggtatttcg gtttttgggg ccgcgggcgg cgacggggcc cgtgcgtccc agcgcacatg 780
ttcggcgagg cggggcctgc gagcgcggcc accgagaatc ggacgggggt agtctcaagc 840
tggccggcct gctctggtgc ctggcctcgc gccgccgtgt atcgccccgc cctgggcggc 900
aaggctggcc cggtcggcac cagttgcgtg agcggaaaga tggccgcttc ccggccctgc 960
tgcagggagc tcaaaatgga ggacgcggcg ctcgggagag cgggcgggtg agtcacccac 1020
acaaaggaaa agggcctttc cgtcctcagc cgtcgcttca tgtgactcca cggagtaccg 1080
ggcgccgtcc aggcacctcg attagttctc gagcttttgg agtacgtcgt ctttaggttg 1140
gggggagggg ttttatgcga tggagtttcc ccacactgag tgggtggaga ctgaagttag 1200
gccagcttgg cacttgatgt aattctcctt ggaatttgcc ctttttgagt ttggatcttg 1260
gttcattctc aagcctcaga cagtggttca aagttttttt cttccatttc aggtgtcgtg 1320
agaattctaa tacgactcac tatagggtgt gctgtctcat cattttggca aagattggcc 1380
accaagctta ccgccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 1440
ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 1500
ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 1560
gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 1620
cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 1680
gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 1740
gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 1800
aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 1860
gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 1920
agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 1980
ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 2040
cgtgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac 2100
gagctgtaca aggaaggaag aggcagcctg ctgacatgtg gcgacgtgga ggagaaccct 2160
ggcccaatgg tgggcagcct gaattgtatc gtggccgtgt cccagaacat gggcatcggc 2220
aagaatggcg attttccttg gccccctctg agaaatgagt ccagatactt tcagaggatg 2280
accacaacca gctccgtgga gggcaagcag aacctggtca tcatgggcaa gaagacatgg 2340
ttctctatcc cagagaagaa ccgccccctg aagggccgga tcaatctggt gctgagcagg 2400
gagctgaagg agccacccca gggagcacac tttctgtcca ggtctctgga cgatgccctg 2460
aagctgaccg agcagcctga gctggccaac aaggtggaca tggtgtggat cgtgggcggc 2520
tctagcgtgt ataaggaggc catgaatcac cctggccacc tgaagctgtt cgtgacacgg 2580
atcatgcagg actttgagtc cgataccttc tttccagaga tcgacctgga gaagtacaag 2640
ctgctgcccg agtatcctgg cgtgctgtct gatgtgcagg aggagaaggg catcaagtac 2700
aagttcgagg tgtatgagaa gaacgattga taacatatgc ctttaattaa acactagttc 2760
tatagtgtca cctaaattcc ctttagtgag ggttaatggc cgtaggccgc cagaattggg 2820
tccagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa 2880
aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg 2940
caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggaggt 3000
gtgggaggtt ttttcggact ctaggacctg cgcatgcgct tggggtacct aggatatcgg 3060
atggggcttt tctgtcacca atcctgagg 3089
Claims (304)
- 변형된 줄기 기억 T 세포(stem memory T cell)(TSCM)를 생산하는 방법으로서,
1차 인간 T 세포에 (a) 항원 수용체, 치료 단백질 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 트랜스포존 조성물 및 (b) 트랜스포사제 또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포사제 조성물을 도입하여 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 포함하며,
상기 변형된 T 세포가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써
변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 것인 방법. - 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서,
다수의 1차 인간 T 세포에 (a) 항원 수용체, 치료 단백질 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 트랜스포존 조성물 및 (b) 트랜스포사제 또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포사제 조성물을 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 포함하며,
상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 25%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써
다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 것인 방법. - 제2항에 있어서, 다수의 변형된 T 세포의 적어도 60%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 방법.
- 변형된 중심 기억 T 세포(central memory T cell)(TCM)를 생산하는 방법으로서,
1차 인간 T 세포에 (a) 항원 수용체, 치료 단백질 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 트랜스포존 조성물 및 (b) 트랜스포사제 또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포사제 조성물을 도입하여 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 포함하며,
상기 변형된 T 세포가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써
변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 것인 방법. - 다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 방법으로서,
다수의 1차 인간 T 세포에 (a) 항원 수용체, 치료 단백질 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 트랜스포존 조성물 및 (b) 트랜스포사제 또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포사제 조성물을 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 포함하며,
상기 다수의 변형된 T 세포의 적어도 25%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써
다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 것인 방법. - 제5항에 있어서, 다수의 변형된 T 세포의 적어도 60%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포존은 2개의 시스 조절 격리 인자(insulator) 요소가 측면에 위치한 항원 수용체 또는 치료 단백질을 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA 트랜스포존인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포존은 피기백(piggyBac) 트랜스포존인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포사제는 피기백 트랜스포사제인 방법.
- 제9항에 있어서, 피기백 트랜스포사제는 서열 번호 4를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 피기백 트랜스포사제는 과활성 변이체이며, 상기 과활성 변이체는 서열 번호 4의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 서열 번호 4의 위치 30에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)에서 발린(V)으로의 치환(I30V)인 방법.
- 제11항에 있어서, 서열 번호 4의 위치 165에서의 아미노산 치환은 글리신(G)에서 세린(S)으로의 치환(G165S)인 방법.
- 제11항에 있어서, 서열 번호 4의 위치 282에서의 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환(M282V)인 방법.
- 제11항에 있어서, 서열 번호 4의 위치 538에서의 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에서 리신(K)으로의 치환(N538K)인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포사제는 슈퍼 피기백(SPB: Super piggyBac) 트랜스포사제인 방법.
- 제16항에 있어서, 슈퍼 피기백(SPB) 트랜스포사제는 서열 번호 5를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포사제를 코딩하는 서열은 mRNA 서열인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포존은 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 트랜스포존인 방법.
- 제1항 내지 제6항 또는 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포사제는 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 또는 과활성 슬리핑 뷰티 트랜스포사제(SB100X)인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포존은 헬레이저(Helraiser) 트랜스포존인 방법.
- 제1항 내지 제6항 또는 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포사제는 헬리트론(Helitron) 트랜스포사제인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포존은 Tol2 트랜스포존인 방법.
- 제1항 내지 제6항 또는 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포사제는 Tol2 트랜스포사제인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포존은 임의의 종으로부터 유래 또는 재조합된 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 또는 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포존은 합성인 것인 방법.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 수용체는 T 세포 수용체인 방법.
- 제27항에 있어서, T 세포 수용체는 자연 발생적인 것인 방법.
- 제27항에 있어서, T 세포 수용체는 자연 발생적이 아닌 것인 방법.
- 제29항에 있어서, T 세포 수용체는 야생형 T 세포 수용체와 비교하여 하나 이상의 돌연변이(들)를 포함하는 것인 방법.
- 제29항 또는 제30항에 있어서, T 세포 수용체는 재조합 T 세포 수용체인 방법.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인 방법.
- 제32항에 있어서, CAR은 CARTyrin인 방법.
- 제32항에 있어서, CAR은 하나 이상의 VHH 서열(들)을 포함하는 것인 방법.
- 제34항에 있어서, CAR은 VCAR인 방법.
[청구항 33]
제1항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1차 인간 T 세포에 (c) 치료 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 제2 트랜스포존을 포함하는 조성물을 도입하여 치료 단백질을 발현할 수 있는 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
[청구항 34]
제33항에 있어서, 치료 단백질은 분비 또는 분비 가능한 단백질인 방법.
[청구항 35]
제33항 또는 제34항에 있어서, 치료 단백질을 코딩하는 서열은 핵산 서열인 방법. - 제35항에 있어서, 치료 단백질을 코딩하는 서열은 DNA 서열인 방법.
- 제33항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, (b)의 트랜스포사제 조성물은 (a)의 트랜스포존 및 (c)의 제2 트랜스포존을 동원하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1차 인간 T 세포에 (d) 트랜스포사제 또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 제2 트랜스포사제 조성물을 도입하는 단계를 추가로 포함하며,
(d)의 제2 트랜스포사제는 (c)의 트랜스포존을 전위시킬 수 있고,
(d)의 제2 트랜스포사제 조성물과 (b)의 트랜스포사제 조성물은 동일하지 않은 것인 방법. - 제38항에 있어서, (b)의 트랜스포사제 조성물은 (a)의 트랜스포존을 동원하고 (d)의 트랜스포사제 조성물은 (c)의 트랜스포존을 동원하는 것인 방법.
- 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서,
(a) 1차 인간 T 세포에 항원 수용체, 치료 단백질 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 도입하여 변형된 T 세포를 생산하는 단계로서, 항원 수용체 또는 치료 단백질은 트랜스포존에 포함되지 않은 것인 단계, 및
(b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 변형된 T 세포를 접촉시켜 활성화된 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 포함하며,
상기 활성화된 변형된 T 세포가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써
변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 것인 방법. - 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서,
(a) 다수의 1차 인간 T 세포에 항원 수용체, 치료 단백질 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하는 단계로서, 항원 수용체 또는 치료 단백질은 트랜스포존에 포함되지 않은 것인 단계, 및
(b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 다수의 변형된 T 세포를 접촉시켜 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 포함하며,
상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 25%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써
다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 것인 방법. - 제41항에 있어서, 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 60%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 방법.
- 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 방법으로서,
(a) 1차 인간 T 세포에 항원 수용체, 치료 단백질 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 도입하여 변형된 T 세포를 생산하는 단계로서, 항원 수용체 또는 치료 단백질은 트랜스포존에 포함되지 않은 것인 단계, 및
(b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 변형된 T 세포를 접촉시켜 활성화된 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 포함하며,
상기 활성화된 변형된 T 세포가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써
변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 것인 방법. - 다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 방법으로서,
(a) 다수의 1차 인간 T 세포에 항원 수용체, 치료 단백질 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하는 단계로서, 항원 수용체 또는 치료 단백질은 트랜스포존에 포함되지 않은 것인 단계, 및
(b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 다수의 변형된 T 세포를 접촉시켜 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 포함하며,
상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 25%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써
다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 것인 방법. - 제44항에 있어서, 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 60%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 방법.
- 제40항 내지 제45항 중 어느 하나의 항에 있어서, 바이러스 벡터는 항원 수용체 또는 치료 단백질을 포함하는 것인 방법.
- 제46항에 있어서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제46항에 있어서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제48항에 있어서, 레트로바이러스는 감마레트로바이러스인 방법.
- 제40항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV: adeno-associated virus)로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제40항 내지 제45항 중 어느 하나의 항에 있어서, 핵산 벡터는 항원 수용체 또는 치료 단백질을 포함하는 것인 방법.
- 제51항에 있어서, mRNA 벡터는 항원 수용체 또는 치료 단백질을 포함하는 것인 방법.
- 제40항 내지 제45항 중 어느 하나의 항에 있어서, 나노입자 벡터는 항원 수용체 또는 치료 단백질을 포함하는 것인 방법.
- 제40항 내지 제45항 중 어느 하나의 항에 있어서, 도입 단계는 상동 재조합을 포함하는 것인 방법.
- 제54항에 있어서, 상동 재조합은 항원 수용체 또는 치료 단백질을 포함하는 조성물, 게놈 편집 구조물, 및 다수의 1차 인간 T 세포 중 적어도 하나의 1차 인간 T 세포의 게놈 서열을 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제55항에 있어서, 벡터는 항원 수용체 또는 치료 단백질을 포함하는 것인 방법.
- 제56항에 있어서, 벡터는 아데노 관련 벡터(AAV)인 방법.
- 제54항 내지 제57항 중 어느 하나의 항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 가이드 RNA 및 클러스터된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복서열(CRISPR; clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 관련 단백질 9(Cas9) DNA 엔도뉴클레아제를 포함하는 것인 방법.
- 제58항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 DNA 결합 도메인 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하는 것인 방법.
- 제59항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 융합 단백질을 코딩하는 것인 방법.
- 제59항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 DNA 결합 도메인 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 코딩하며, 발현된 DNA 결합 도메인과 발현된 IIS형 엔도뉴클레아제는 비공유적으로 결합된 것인 방법.
- 제58항 내지 제62항 중 어느 하나의 항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제62항에 있어서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 DNA 결합 도메인 방법.
- 제62항 또는 제63항에 있어서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 불활성 Cas9를 코딩하는 것인 방법.
- 제64항에 있어서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 위치 840에서 히스티딘(H)의 알라닌(A)으로의 아미노산 치환(H840A)을 포함하는 것인 방법.
- 제62항 내지 제65항 중 어느 하나의 항에 있어서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 절두된 Cas9를 코딩하는 것인 방법.
- 제66항에 있어서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 위치 580에서 아스파라긴(N)의 알라닌(A)으로의 아미노산 치환(N580A)을 포함하는 것인 방법.
- 제62항 내지 제67항 중 어느 하나의 항에 있어서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 위치 10에서 아스파르트산(D)의 알라닌(A)으로의 아미노산 치환(D10A)을 포함하는 것인 방법.
- 제58항 내지 제61항 중 어느 하나의 항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN: transcription activator-like effector nuclease)로부터 유래된 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제69항에 있어서, TALEN으로부터 유래된 서열은 DNA 결합 도메인인 방법.
- 제58항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 TALEN을 포함하는 것인 방법.
- 제58항 내지 제61항 중 어느 하나의 항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN: zinc-finger nuclease)로부터 유래된 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제72항에 있어서, ZFN으로부터 유래된 서열은 DNA 결합 도메인인 방법.
- 제58항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 포함하는 것인 방법.
- 제58항 내지 제74항 중 어느 하나의 항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 포유동물 염색체 상의 세이프 하버 부위(safe harbor site)를 표적화하는 것인 방법.
- 제58항 내지 제74항 중 어느 하나의 항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 인간 염색체 상의 세이프 하버 부위를 표적화하는 것인 방법.
- 제75항 또는 제76항에 있어서, 염색체는 생체 내, 원위치, 생체 외 또는 시험관 내에 존재하는 것인 방법.
- 제58항 내지 제77항 중 어느 하나의 항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 포유동물 염색체 상의 내인성 T 세포 수용체의 구성요소를 코딩하는 서열 또는 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC)의 구성요소를 코딩하는 서열을 표적화하는 것인 방법.
- 제58항 내지 제77항 중 어느 하나의 항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 인간 염색체 상의 내인성 T 세포 수용체의 구성요소를 코딩하는 서열 또는 주요 조직 적합성 복합체(MHC)의 구성요소를 코딩하는 서열을 표적화하는 것인 방법.
- 제40항 내지 제79항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 수용체는 T 세포 수용체인 방법.
- 제80항에 있어서, T 세포 수용체는 자연 발생적인 것인 방법.
- 제80항에 있어서, T 세포 수용체는 자연 발생적이 아닌 것인 방법.
- 제82항에 있어서, T 세포 수용체는 야생형 T 세포 수용체와 비교하여 하나 이상의 돌연변이(들)를 포함하는 것인 방법.
- 제82항 또는 제83항에 있어서, T 세포 수용체는 재조합 T 세포 수용체인 방법.
- 제40항 내지 제79항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인 방법.
- 제85항에 있어서, CAR은 하나 이상의 Centyrin 서열(들)을 포함하는 것인 방법.
- 제86항에 있어서, CAR은 CARTyrin인 방법.
- 제85항에 있어서, CAR은 하나 이상의 VHH 서열(들)을 포함하는 것인 방법.
- 제88항에 있어서, CAR은 VCAR인 방법.
- 제40항 내지 제89항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1차 인간 T 세포에 치료 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 도입하여 치료 단백질을 발현할 수 있는 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제40항 내지 제90항 중 어느 하나의 항에 있어서, 치료 단백질은 분비 또는 분비 가능한 단백질인 방법.
- 제90항 또는 제91항에 있어서, 치료 단백질을 코딩하는 서열은 핵산 서열인 방법.
- 제92항에 있어서, 치료 단백질을 코딩하는 서열은 DNA 서열인 방법.
- 제90항 내지 제93항 중 어느 하나의 항에 있어서, 도입 단계는 상동 재조합을 포함하는 것인 방법.
- 제40항 내지 제94항 중 어느 하나의 항에 있어서, (b)의 T 세포 활성화제 조성물은 항-인간 CD2 단일 특이적 사량체 항체 복합체를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제40항 내지 제42항 또는 제46항 내지 제95항 중 어느 하나의 항에 있어서,
(c) 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브(Iscove)의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물과 활성화된 변형된 T 세포를 접촉시켜 다수의 증식된 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 추가로 포함하며,
상기 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 2%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 방법. - 제96항에 있어서, 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트는 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 방법.
- 제97항에 있어서, 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 60%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 방법.
- 제43항 내지 제95항 중 어느 하나의 항에 있어서,
(c) 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물과 활성화된 변형된 T 세포를 접촉시켜 다수의 증식된 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 추가로 포함하며,
상기 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 2%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 방법. - 제99항에 있어서, 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트는 중심 기억 T 세포(TCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 방법.
- 제99항에 있어서, 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 60%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 방법.
- 제40항 내지 제42항 또는 제46항 내지 제101항 중 어느 하나의 항에 있어서,
(d) 다수의 증식된 변형된 T 세포를 농축하여 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트로 포함하는 조성물을 생산하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제40항 내지 제42항 또는 제46항 내지 제101항 중 어느 하나의 항에 있어서,
(d) 다수의 증식된 변형된 T 세포를 농축하여 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 적어도 60%로 포함하는 조성물을 생산하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제43항 내지 제101항 중 어느 하나의 항에 있어서,
(d) 다수의 증식된 변형된 T 세포를 농축하여 중심 기억 T 세포(TCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트로 포함하는 조성물을 생산하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제43항 내지 제101항 중 어느 하나의 항에 있어서,
(d) 다수의 증식된 변형된 T 세포를 농축하여 중심 기억 T 세포(TCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 적어도 60%로 포함하는 조성물을 생산하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제102항 또는 제103항에 있어서, 농축 단계는 다수의 농축된 변형된 T 세포로부터 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 단리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제106항에 있어서, 농축 단계는 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물과 단리된 변형된 TSCM을 접촉시켜 다수의 증식된 농축된 변형된 TSCM을 생산하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제104항 또는 제105항에 있어서, 농축 단계는 다수의 농축된 변형된 T 세포로부터 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 단리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제108항에 있어서, 농축 단계는 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물과 단리된 변형된 TCM을 접촉시켜 다수의 증식된 농축된 변형된 TCM을 생산하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제40항 내지 제109항 중 어느 하나의 항에 있어서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 니코틴아미드, 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD), 디이소프로필 아디페이트(DIPA), n-부틸-벤젠술폰아미드, 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필)에스테르, 팔미트산, 리놀레산, 올레산, 스테아르산 히드라지드, 올레아미드, 스테롤 및 알칸 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제40항 내지 제109항 중 어느 하나의 항에 있어서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산 및 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제111항에 있어서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 0.9 mg/kg 내지 90 mg/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제111항에 있어서, T 세포 증식 조성물은 약 9 mg/kg 농도의 옥탄산, 약 2 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2 mg/kg 농도의 올레산 및 약 1 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제111항에 있어서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 6.4 μmol/kg 내지 640 μmol/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.7 μmol/kg 내지 70 μmol/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 0.25 μmol/kg 내지 25 μmol/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제111항에 있어서, T 세포 증식 조성물은 약 64 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 리놀레산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.5 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서,
(a) 1차 인간 T 세포에 항원 수용체 또는 치료 단백질을 포함하는 조성물을 도입하여 변형된 T 세포를 생산하는 단계로서, 트랜스포존이 항원 수용체를 포함하는 것인 단계, 및
(b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 변형된 T 세포를 접촉시켜 활성화된 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 포함하고,
상기 활성화된 변형된 T 세포가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써
변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 것인 방법. - 다수의 변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 방법으로서,
(a) 다수의 1차 인간 T 세포에 항원 수용체 또는 치료 단백질을 포함하는 조성물을 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하는 단계로서, 트랜스포존이 항원 수용체를 포함하는 것인 단계, 및
(b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 다수의 변형된 T 세포를 접촉시켜 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 포함하며,
상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 25%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써
변형된 줄기 기억 T 세포(TSCM)를 생산하는 것인 방법. - 제117항에 있어서, 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 60%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 방법.
- 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 방법으로서,
(a) 1차 인간 T 세포에 항원 수용체 또는 치료 단백질을 포함하는 조성물을 도입하여 변형된 T 세포를 생산하는 단계로서, 트랜스포존이 항원 수용체를 포함하는 것인 단계, 및
(b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 변형된 T 세포를 접촉시켜 활성화된 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 포함하며,
상기 활성화된 변형된 T 세포가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써
변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 것인 방법. - 다수의 변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 방법으로서,
(a) 다수의 1차 인간 T 세포에 항원 수용체 또는 치료 단백질을 포함하는 조성물을 도입하여 다수의 변형된 T 세포를 생산하는 단계로서, 트랜스포존이 항원 수용체를 포함하는 것인 단계, 및
(b) 항-인간 CD3 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일 특이적 사량체 항체 복합체, 및 활성화 보충제 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 활성화제 조성물과 상기 다수의 변형된 T 세포를 접촉시켜 다수의 활성화된 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 포함하며,
상기 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 25%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현함으로써
변형된 중심 기억 T 세포(TCM)를 생산하는 것인 방법. - 제120항에 있어서, 다수의 활성화된 변형된 T 세포의 적어도 60%가 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 방법.
- 제116항 내지 제121항 중 어느 하나의 항에 있어서, (b)의 T 세포 활성화제 조성물은 항-인간 CD2 단일 특이적 사량체 항체 복합체를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제116항 내지 제118항 또는 제122항 중 어느 하나의 항에 있어서,
(c) 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물과 활성화된 변형된 T 세포를 접촉시켜 다수의 증식된 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 추가로 포함하며,
상기 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 2%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 방법. - 제123항에 있어서, 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 방법.
- 제123항에 있어서, 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 60%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 방법.
- 제119항 내지 제122항 중 어느 하나의 항에 있어서,
(c) 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물과 활성화된 변형된 T 세포를 접촉시켜 다수의 증식된 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 추가로 포함하며,
상기 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 2%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 방법. - 제126항에 있어서, 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 방법.
- 제126항에 있어서, 다수의 증식된 변형된 T 세포의 적어도 60%가 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 것인 방법.
- 제116항 내지 제118항 또는 제122항 내지 제128항 중 어느 하나의 항에 있어서,
(d) 다수의 증식된 변형된 T 세포를 농축하여 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트로 포함하는 조성물을 생산하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제116항 내지 제118항 또는 제122항 내지 제128항 중 어느 하나의 항에 있어서,
(d) 다수의 증식된 변형된 T 세포를 농축하여 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 적어도 60%로 포함하는 조성물을 생산하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제119항 내지 제128항 중 어느 하나의 항에 있어서,
(d) 다수의 증식된 변형된 T 세포를 농축하여 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트로 포함하는 조성물을 생산하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제119항 내지 제128항 중 어느 하나의 항에 있어서,
(d) 다수의 증식된 변형된 T 세포를 농축하여 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 적어도 60%로 포함하는 조성물을 생산하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제129항 또는 제130항에 있어서, 농축 단계는 다수의 농축된 변형된 T 세포로부터 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 단리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제133항에 있어서, 농축 단계는 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물과 단리된 변형된 TSCM을 접촉시켜 다수의 증식된 농축된 변형된 TSCM을 생산하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제131항 또는 제132항에 있어서, 농축 단계는 다수의 농축된 변형된 T 세포로부터 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현하는 변형된 T 세포를 단리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제135항에 있어서, 농축 단계는 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물과 단리된 변형된 TSCM을 접촉시켜 다수의 증식된 농축된 변형된 TSCM을 생산하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제116항 내지 제136항 중 어느 하나의 항에 있어서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 니코틴아미드, 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD), 디이소프로필 아디페이트(DIPA), n-부틸-벤젠술폰아미드, 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필)에스테르, 팔미트산, 리놀레산, 올레산, 스테아르산 히드라지드, 올레아미드, 스테롤 및 알칸 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제116항 내지 제137항 중 어느 하나의 항에 있어서, T 세포 증식 조성물은 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산 및 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제138항에 있어서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 0.9 mg/kg 내지 90 mg/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제138항에 있어서, T 세포 증식 조성물은 약 9 mg/kg 농도의 옥탄산, 약 2 mg/kg 농도의 팔미트산, 약 2 mg/kg 농도의 리놀레산, 약 2 mg/kg 농도의 올레산 및 약 1 mg/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제138항에 있어서, T 세포 증식 조성물은 종점을 포함하여 6.4 μmol/kg 내지 640 μmol/kg 농도의 옥탄산; 종점을 포함하여 0.7 μmol/kg 내지 70 μmol/kg 농도의 팔미트산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도의 리놀레산; 종점을 포함하여 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도의 올레산; 및 종점을 포함하여 0.25 μmol/kg 내지 25 μmol/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제138항에 있어서, T 세포 증식 조성물은 약 64 μmol/kg 농도의 옥탄산, 약 7 μmol/kg 농도의 팔미트산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 리놀레산, 약 7.5 μmol/kg 농도의 올레산 및 약 2.5 μmol/kg 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제116항 내지 제142항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1차 인간 T 세포에 (c) 치료 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 제2 트랜스포존을 포함하는 조성물을 도입하여 치료 단백질을 발현할 수 있는 변형된 T 세포를 생산하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제143항에 있어서, 치료 단백질은 분비 또는 분비 가능한 단백질인 방법.
- 제143항 또는 제144항에 있어서, 치료 단백질을 코딩하는 서열은 핵산 서열인 방법.
- 제143항 또는 제144항에 있어서, 치료 단백질을 코딩하는 서열은 DNA 서열인 방법.
- 제143항 내지 제146항 중 어느 하나의 항에 있어서, (b)의 트랜스포사제 조성물은 (a)의 트랜스포존 및 (c)의 제2 트랜스포존을 동원하는 것인 방법.
- 제143항 내지 제147항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1차 인간 T 세포에 (d) 트랜스포사제 또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 제2 트랜스포사제 조성물을 도입하는 단계를 추가로 포함하고,
(d)의 제2 트랜스포사제는 (c)의 트랜스포존을 전위시킬 수 있고,
(d)의 제2 트랜스포사제 조성물과 (b)의 트랜스포사제 조성물은 동일하지 않은 것인 방법. - 제1항 내지 제148항 중 어느 하나의 항에 있어서, 도입 단계는 게놈 편집 구조물을 포함하는 조성물을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제149항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 가이드 RNA 및 클러스터된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복서열(CRISPR) 관련 단백질 9(Cas9) DNA 엔도뉴클레아제를 포함하는 것인 방법.
- 제150항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 DNA 결합 도메인 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하는 것인 방법.
- 제151항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 융합 단백질을 코딩하는 것인 방법.
- 제151항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 DNA 결합 도메인 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 코딩하며, 발현된 DNA 결합 도메인과 발현된 IIS형 엔도뉴클레아제는 비공유적으로 결합된 것인 방법.
- 제149항 내지 제153항 중 어느 하나의 항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제154항에 있어서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 DNA 결합 도메인 방법.
- 제154항 또는 제155항에 있어서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 불활성 Cas9를 코딩하는 것인 방법.
- 제156항에 있어서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 위치 840에서 히스티딘(H)의 알라닌(A)으로의 아미노산 치환(H840A)을 포함하는 것인 방법.
- 제154항 내지 제157항 중 어느 하나의 항에 있어서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 절두된 Cas9를 코딩하는 것인 방법.
- 제158항에 있어서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 위치 580에서 아스파라긴(N)의 알라닌(A)으로의 아미노산 치환(N580A)을 포함하는 것인 방법.
- 제154항 내지 제159항 중 어느 하나의 항에 있어서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 위치 10에서 아스파르트산(D)의 알라닌(A)으로의 아미노산 치환(D10A)을 포함하는 것인 방법.
- 제149항 내지 제153항 중 어느 하나의 항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)로부터 유래된 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제161항에 있어서, TALEN으로부터 유래된 서열은 DNA 결합 도메인인 방법.
- 제149항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 TALEN을 포함하는 것인 방법.
- 제149항 내지 제153항 중 어느 하나의 항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)로부터 유래된 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제164항에 있어서, ZFN으로부터 유래된 서열은 DNA 결합 도메인인 방법.
- 제149항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 포함하는 것인 방법.
- 제149항 내지 제153항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1차 인간 T 세포에 치료 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 도입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제167항에 있어서, 치료 단백질은 분비 또는 분비 가능한 단백질인 방법.
- 제168항에 있어서, 치료 단백질은 세포 내 단백질인 방법.
- 제168항에 있어서, 치료 단백질은 시토졸 단백질인 방법.
- 제168항에 있어서, 치료 단백질은 막 결합된 단백질인 방법.
- 제168항에 있어서, 치료 단백질은 막 횡단 단백질인 방법.
- 제1항 내지 제172항 중 어느 하나의 항에 있어서, 변형된 TSCM의 세포 표면 마커는 CD62L 및 CD45RA를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제172항 중 어느 하나의 항에 있어서, 변형된 TSCM의 세포 표면 마커는 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제172항 중 어느 하나의 항에 있어서, 변형된 TSCM의 세포 표면 마커는 CD45RA, CD95, IL-2Rβ, CR7, 및 CD62L 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제172항 중 어느 하나의 항에 있어서, 변형된 TCM의 세포 표면 마커는 CD45RO, CD95, IL-2Rβ, CCR7 및 CD62L 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제96항 내지 제176항 중 어느 하나의 항에 있어서, 다수의 증식된 변형된 T 세포는 미접촉(naive) T 세포(변형된 TN)를 포함하며, CAR-TN의 세포 표면 마커는 CD45RA, CCR7 및 CD62L 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제96항 내지 제176항 중 어느 하나의 항에 있어서, 다수의 증식된 변형된 T 세포는 중심 기억 T 세포(변형된 TCM)를 포함하며, CAR-TCM의 세포 표면 마커는 CD45RO, CD95, IL-2Rβ, CCR7, 및 CD62L 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제96항 내지 제176항 중 어느 하나의 항에 있어서, 다수의 증식된 변형된 T 세포는 이펙터 기억 T 세포(변형된 TEM)를 포함하며, CAR-TEM의 세포 표면 마커는 CD45RO, CD95, 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제96항 내지 제176항 중 어느 하나의 항에 있어서, 다수의 증식된 변형된 T 세포는 이펙터 T 세포(변형된 TEFF)를 포함하며, CAR-TEFF의 세포 표면 마커는 CD45RA, CD95, 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제39항 또는 제116항 내지 제180항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포존은 2개의 시스 조절 격리 인자 요소가 측면에 위치한 항원 수용체 또는 치료 단백질을 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA 트랜스포존인 방법.
- 제181항에 있어서, 도입 단계는 트랜스포사제를 코딩하는 mRNA 서열을 포함하는 조성물을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제181항 또는 제182항에 있어서, 트랜스포존은 피기백 트랜스포존인 방법.
- 제181항 내지 제183항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포사제는 피기백 트랜스포사제인 방법.
- 제184항에 있어서, 피기백 트랜스포사제는 서열 번호 4를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제184항 또는 제185항에 있어서, 피기백 트랜스포사제는 과활성 변이체이며, 상기 과활성 변이체는 서열 번호 4의 위치 30, 165, 282, 및 538 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
- 제186항에 있어서, 서열 번호 4의 위치 30에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)에서 발린(V)으로의 치환(I30V)인 방법.
- 제186항에 있어서, 서열 번호 4의 위치 165에서의 아미노산 치환은 글리신(G)에서 세린(S)으로의 치환(G165S)인 방법.
- 제186항에 있어서, 서열 번호 4의 위치 282에서의 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환(M282V)인 방법.
- 제186항에 있어서, 서열 번호 4의 위치 538에서의 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에서 리신(K)으로의 치환(N538K)인 방법.
- 제183항 내지 제190항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포사제는 슈퍼 피기백(SPB) 트랜스포사제인 방법.
- 제191항에 있어서, 슈퍼 피기백(SPB) 트랜스포사제는 서열 번호 5를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제39항 또는 제116항 내지 제180항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포존은 슬리핑 뷰티 트랜스포존인 방법.
- 제193항에 있어서, 트랜스포사제는 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 또는 과활성 슬리핑 뷰티 트랜스포사제(SB100X)인 방법.
- 제1항 내지 제39항 또는 제116항 내지 제180항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포존은 헬레이저 트랜스포존인 방법.
- 제195항에 있어서, 트랜스포사제는 헬리트론 트랜스포사제인 방법.
- 제1항 내지 제39항 또는 제116항 내지 제180항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포존은 Tol2 트랜스포존인 방법.
- 제197항에 있어서, 트랜스포사제는 Tol2 트랜스포사제인 방법.
- 제1항 내지 제39항 또는 제116항 내지 제198항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포사제를 코딩하는 서열은 mRNA 서열인 방법.
- 제1항 내지 제39항 또는 제116항 내지 제180항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포존은 임의의 종으로부터 유래 또는 재조합된 것인 방법.
- 제1항 내지 제39항 또는 제116항 내지 제180항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포존은 합성인 것인 방법.
- 제1항 내지 제39항 또는 제116항 내지 제180항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포존은 선별 유전자를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제202항에 있어서, T 세포 증식 조성물은 선별제를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제203항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 수용체는 T 세포 수용체인 방법.
- 제204항에 있어서, T 세포 수용체는 자연 발생적인 것인 방법.
- 제204항에 있어서, T 세포 수용체는 자연 발생적이 아닌 것인 방법.
- 제206항에 있어서, T 세포 수용체는 야생형 T 세포 수용체와 비교하여 하나 이상의 돌연변이(들)를 포함하는 것인 방법.
- 제206항 또는 제207항에 있어서, T 세포 수용체는 재조합 T 세포 수용체인 방법.
- 제1항 내지 제203항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인 방법.
- 제209항에 있어서, CAR은 하나 이상의 Centyrin 서열(들)을 포함하는 것인 방법.
- 제210항에 있어서, CAR은 CARTyrin인 방법.
- 제209항에 있어서, CAR은 하나 이상의 VHH 서열(들)을 포함하는 것인 방법.
- 제212항에 있어서, CAR은 VCAR인 방법.
- 제1항 내지 제39항 및 제116항 내지 제213항 중 어느 하나의 항에 있어서, 도입 단계는 전기 천공 또는 뉴클레오펙션을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제39항 및 제116항 내지 제213항 중 어느 하나의 항에 있어서, 도입 단계는 뉴클레오펙션을 포함하며, 뉴클레오펙션은
(a) 큐벳에서 트랜스포존 조성물, 트랜스포사제 조성물, 및 다수의 1차 인간 T 세포를 포함하는 조성물을 접촉시키는 단계;
(b) 큐벳에 1회 이상의 전기 펄스를 적용하는 단계, 및
(c) 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캅토에탄올, 아이스코브의 MDM, 및 증식 보충물 중 하나 이상을 포함하는 T 세포 증식 조성물을 포함하는 조성물에서 다수의 1차 인간 T 세포를 포함하는 조성물을 37℃에서 인큐베이션하는 단계
를 포함하는 것인 방법. - 제215항에 있어서, 트랜스포존은 제1 트랜스포존 또는 제2 트랜스포존인 방법.
- 제215항 또는 제216항에 있어서, 트랜스포사제 조성물은 제1 트랜스포사제 조성물 또는 제2 트랜스포사제 조성물인 방법.
- 제214항 내지 제217항 중 어느 하나의 항에 있어서, 트랜스포존 조성물은 뉴클레아제 무함유 물을 포함하는 0.5 μg/㎕ 용액이고, 큐벳은 1 μg의 트랜스포존을 생성하도록 2 ㎕의 트랜스포존 조성물을 포함하는 것인 방법.
- 제218항에 있어서, 트랜스포존 조성물은 피기백 트랜스포존을 포함하는 것인 방법.
- 제219항에 있어서, 트랜스포존 조성물은 슬리핑 뷰티 트랜스포존을 포함하는 것인 방법.
- 제219항 또는 제220항에 있어서, 트랜스포사제 조성물은 5 μg의 트랜스포사제를 포함하는 것인 방법.
- 제221항에 있어서, 트랜스포사제 조성물은 슈퍼 피기백(SPB) 트랜스포사제를 포함하는 것인 방법.
- 제221항에 있어서, 트랜스포사제 조성물은 과활성 슬리핑 뷰티(SB100X) 트랜스포사제를 포함하는 것인 방법.
- 제219항에 있어서, 트랜스포존은 헬레이저 트랜스포존을 포함하는 것인 방법.
- 제224항에 있어서, 트랜스포사제 조성물은 헬리트론 트랜스포사제를 포함하는 것인 방법.
- 제219항에 있어서, 트랜스포존은 Tol2 트랜스포존을 포함하는 것인 방법.
- 제226항에 있어서, 트랜스포사제 조성물은 Tol2 트랜스포사제를 포함하는 것인 방법.
- 제215항 내지 제227항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1차 인간 T 세포를 포함하는 조성물은 1차 인간 T 세포의 세포 생존도 및/또는 줄기 유사 표현형을 유지하거나 향상시키는 완충액을 포함하는 것인 방법.
- 제228항에 있어서, 완충액은 뉴클레오펙션 전에 1차 인간 T 세포의 세포 생존도 및/또는 줄기 유사 표현형을 유지하거나 향상시키는 것인 방법.
- 제228항에 있어서, 완충액은 뉴클레오펙션 중에 1차 인간 T 세포의 세포 생존도 및/또는 줄기 유사 표현형을 유지하거나 향상시키는 것인 방법.
- 제228항에 있어서, 완충액은 뉴클레오펙션 후에 1차 인간 T 세포의 세포 생존도 및/또는 줄기 유사 표현형을 유지하거나 향상시키는 것인 방법.
- 제228항 내지 제231항 중 어느 하나의 항에 있어서, 완충액은 P3 1차 세포 용액을 포함하는 것인 방법.
- 제228항 내지 제231항 중 어느 하나의 항에 있어서, 완충액은 KCl, MgCl2, ClNa, 글루코오스 및 Ca(NO3)2 중 하나 이상을 임의의 절대 또는 상대 존재량 또는 농도로 포함하는 것인 방법.
- 제228항에 있어서, 완충액은 HEPES, 트리스(Tris)/HCl 및 인산 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택된 보충물을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제228항 또는 제229항에 있어서, 완충액은 5 mM KCl, 15 mM MgCl2, 90 mM ClNa, 10 mM 글루코오스 및 0.4 mM Ca(NO3)2을 포함하는 것인 방법.
- 제235항에 있어서, 완충액은 20 mM HEPES 및 75 mM 트리스/HCl를 포함하는 보충물을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제236항에 있어서, 완충액은 pH 7.2에서 40 mM Na2HPO4/NaH2PO4를 포함하는 보충물을 추가로 포함하는 것인 방법,
- 제215항 또는 제228항 내지 제237항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1차 인간 T 세포를 포함하는 조성물에는 CD14, CD56, 및/또는 CD19를 발현하는 세포가 고갈된 것인 방법.
- 제215항 내지 제238항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1차 인간 T 세포를 포함하는 조성물은 100 ㎕의 완충액 및 5x106 내지 25x106 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제215항 내지 제239항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 큐벳(들)에서 동시에 수행되는 것인 방법.
- 제215항 내지 제240항 중 어느 하나의 항에 있어서, 인큐베이션 단계는 미리 가온시킨 T 세포 증식 조성물에서 다수의 1차 인간 T 세포를 포함하는 조성물을 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제215항 내지 제241항 중 어느 하나의 항에 있어서, 인큐베이션 단계는 2일의 기간을 갖는 것인 방법.
- 제40항 내지 제242항 중 어느 하나의 항에 있어서, 활성화 보충물은 하나 이상의 사이토카인(들)을 포함하는 것인 방법
- 제243항에 있어서, 하나 이상의 사이토카인(들)은 IL-2를 포함하는 것인 방법.
- 제96항 내지 제244항 중 어느 하나의 항에 있어서, 증식 보충물은 하나 이상의 사이토카인(들)을 포함하는 것인 방법.
- 제245항에 있어서, 하나 이상의 사이토카인(들)은 IL-2를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제246항 중 어느 하나의 항에 있어서, 변형된 TSCM 세포 또는 변형된 TCM 세포에 게놈 편집 구조물을 포함하는 조성물을 도입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제247항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 가이드 RNA 및 클러스터된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복서열(CRISPR) 관련 단백질 9(Cas9) DNA 엔도뉴클레아제를 포함하는 것인 방법.
- 제248항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 DNA 결합 도메인 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하는 것인 방법.
- 제249항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 융합 단백질을 코딩하는 것인 방법.
- 제249항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 DNA 결합 도메인 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 코딩하며, 발현된 DNA 결합 도메인과 발현된 IIS형 엔도뉴클레아제는 비공유 결합된 것인 방법.
- 제247항 내지 제251항 중 어느 하나의 항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제252항에 있어서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 DNA 결합 도메인인 방법.
- 제253항에 있어서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 위치 840에서 히스티딘(H)의 알라닌(A)으로의 아미노산 치환(H840A)을 포함하는 것인 방법.
- 제252항 내지 제254항 중 어느 하나의 항에 있어서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 절두된 Cas9를 코당하는 것인 방법.
- 제255항에 있어서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 위치 580에서 아스파라긴(N)의 알라닌(A)으로의 아미노산 치환(N580A)을 포함하는 것인 방법.
- 제252항 내지 제256항 중 어느 하나의 항에 있어서, Cas9 엔도뉴클레아제로부터 유래된 서열은 위치 10에서 아스파르트산(D)의 알라닌(A)으로의 아미노산 치환(D10A)을 포함하는 것인 방법.
- 제247항 내지 제251항 중 어느 하나의 항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)로부터 유래된 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제258항에 있어서, TALEN으로부터 유래된 서열은 DNA 결합 도메인인 방법.
- 제247항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 TALEN을 포함하는 것인 방법.
- 제247항 내지 제251항 중 어느 하나의 항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)로부터 유래된 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제261항에 있어서, ZFN으로부터 유래된 서열은 DNA 결합 도메인인 방법.
- 제247항에 있어서, 게놈 편집 구조물은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제263항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1차 인간 T 세포는 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 발현하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제263항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1차 인간 T 세포는 미접촉 T 세포(TN)이며 TN은 CD45RA, CCR7 및 CD62L 중 하나 이상을 발현하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제263항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1차 인간 T 세포는 T 기억 줄기세포(TSCM)이며 TSCM은 CD45RA, CD95, IL-2Rβ, CR7, 및 CD62L 중 하나 이상을 발현하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제263항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1차 인간 T 세포는 중심 기억 T 세포(TCM)이며 TCM은 CD45RO, CD95, IL-2Rβ, CCR7, 및 CD62L 중 하나 이상을 발현하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제263항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1차 인간 T 세포는 이펙터 기억 T 세포(TEM)이며 TEM은 CD45RO, CD95, 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 발현하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제263항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1차 인간 T 세포는 이펙터 T 세포(TEFF)이며 TEFF는 CD45RA, CD95, 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 발현하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제269항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1차 인간 T 세포는 CD4 및/또는 CD8을 발현하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제270항 중 어느 하나의 항의 방법에 의해 생산된 변형된 TSCM을 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제270항 중 어느 하나의 항의 방법에 의해 생산된 변형된 TCM을 포함하는 조성물.
- 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 의약 제조를 위한 제271항 또는 제272항의 조성물의 용도.
- 제273항에 있어서, 변형된 TSCM 또는 변형된 TCM은 자가 유래인 용도.
- 제274항에 있어서, 변형된 TSCM 또는 변형된 TCM은 동종 이계인 용도.
- 제273항 내지 제275항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 수용체는 T 세포 수용체인 용도.
- 제276항에 있어서, T 세포 수용체는 자연 발생적인 것인 용도.
- 제276항에 있어서, T 세포 수용체는 자연 발생적이 아닌 것인 용도.
- 제278항에 있어서, T 세포 수용체는 야생형 T 세포 수용체와 비교하여 하나 이상의 돌연변이(들)를 포함하는 것인 용도.
- 제278항 또는 제279항에 있어서, T 세포 수용체는 재조합 T 세포 수용체인 용도.
- 제273항 내지 제275항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인 용도.
- 제281항에 있어서, CAR은 하나 이상의 Centyrin 서열(들)을 포함하는 것인 용도.
- 제282항에 있어서, CAR은 CARTyrin인 용도.
- 제283항에 있어서, CAR은 하나 이상의 VHH 서열(들)을 포함하는 것인 용도.
- 제284항에 있어서, CAR은 VCAR인 용도.
- 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이의 치료 방법으로서, 제271항 또는 제272항의 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제286항에 있어서, 변형된 TSCM 또는 변형된 TCM은 자가 유래인 방법.
- 제286항에 있어서, 변형된 TSCM 또는 변형된 TCM는 동종 이계인 방법.
- 제286항 내지 제288항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 수용체는 T 세포 수용체인 방법.
- 제289항에 있어서, T 세포 수용체는 자연 발생적인 것인 방법.
- 제289항에 있어서, T 세포 수용체는 자연 발생적이 아닌 것인 방법.
- 제291항에 있어서, T 세포 수용체는 야생형 T 세포 수용체와 비교하여 하나 이상의 돌연변이(들)를 포함하는 것인 방법.
- 제291항 또는 제292항에 있어서, T 세포 수용체는 재조합 T 세포 수용체인 방법.
- 제286항 내지 제288항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인 방법.
- 제294항에 있어서, CAR은 하나 이상의 Centyrin 서열(들)을 포함하는 것인 방법.
- 제295항에 있어서, CAR은 CARTyrin인 방법.
- 제294항에 있어서, CAR은 하나 이상의 VHH 서열(들)을 포함하는 것인 방법.
- 제297항에 있어서, CAR은 VCAR인 방법.
- 제286항 내지 제298항 중 어느 하나의 항에 있어서, 질환 또는 장애는 암이고 항원 수용체는 암 항원을 특이적으로 표적화하는 것인 방법.
- 제286항 내지 제298항 중 어느 하나의 항에 있어서, 질환 또는 장애는 감염성 질환 또는 장애이고 항원 수용체는 바이러스, 박테리아, 효모 또는 미생물 항원을 특이적으로 표적화하는 것인 방법.
- 제286항 내지 제298항 중 어느 하나의 항에 있어서, 질환 또는 장애는 분비 단백질의 활성 결여 또는 낮은 존재량을 특징으로 하는 질환 또는 장애이거나, 질환 또는 장애는 분비 단백질의 활성 또는 존재량을 증가시킴으로써 치료되는 질환 또는 장애인 방법.
- 제301항에 있어서, 분비 단백질은 응고 인자 VIII 또는 응고 인자 IX 단백질을 포함하는 것인 방법.
- 제301항 또는 제302항에 있어서, 분비 단백질의 존재량은 국소 부위에서 결정되는 것인 방법.
- 제303항에 있어서, 국소 부위는 변형된 TSCM 세포 또는 변형된 TCM 세포에 의해 접근 가능한 것인 방법.
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