MX2011000535A - Nuevos elementos reguladores. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a nuevos elementos reguladores así como a vectores y células relacionadas. Además, se refiere a métodos de mejora de la expresión de polipéptidos a partir de ácidos nucleicos tales como genes donados y a la producción de diversos polipéptidos en células hospedadoras usando dichos nuevos elementos reguladores. Además, la invención se refiere a usos de dichos nuevos elementos reguladores como aislantes, en terapia génica o para mejorar líneas celulares hospedadoras.

Description

NUEVOS ELEMENTOS REGULADORES ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO TÉCNICO La invención se refiere al campo de la tecnología de cult fiere a nuevos elementos reguladores así como a un método para sión de polipéptidos a partir de ácidos nucleicos tales como gene roducción de diversos polipéptidos en una célula hospedador o dichos nuevos elementos reguladores.

ANTECEDENTES El mercado para biofarmacéuticos para usar en terapi úa creciendo a gran velocidad, con más de 900 biofarmacéuti dos en estudios clínicos y ventas estimadas de 50.000 millone ímente, se produce un número creciente de biofarmacéuticos S de mamíferos debido a su capacidad para procesar correc car proteínas humanas. Por lo tanto, las proteínas recombin La expresión de la proteína recombinante requiere un sión que codifica el gen de interés deseado. Se han emple dos para optimizar vectores de expresión para una producción . La expresión de genes está regulada a nivel transcripcional y tr lo tanto, muchos métodos están relacionados con la ident ización de promotores y potenciadores fuertes para mejorar la e e se transcriben genes que codifican proteínas. Son ejemplos otor y potenciador temprano inmediato de CMV, el promotor y p 40, el promotor del factor de elongación (EF), el potenciador de motor de [beta]-actina de pollo. Asimismo, también se usan sec es de poliadenilación fuertes que estabilizan ARNm y au ación de la transcripción para aumentar la expresión de proteína codificados por los vectores de expresión. Entre los métodos pa acia con la que se traduce el ARNm resultante está el uso de siti traducción (AUG), sitios óptimos de unión a ribosoma, tale ncia de Kozak (GCCGCCACCAUGG; AUG constituye el codón n tardía de virus polioma.

En ARN mensajero eucariota (ARNm) la región no tr R) es un elemento regulador importante. En muchos casos d ilidad del ARNm y también puede regular la eficacia de tradu les de poliadenilación son secuencias de nucleótidos en el int que dirige la unión de un complejo proteico de poliadenila ncía AAUAAA dentro de la secuencia señal. El complejo co ucleasa que corta el ARNm aproximadamente 14 a 30 nucleótid de la secuencia AAUAAA y una polimerasa que nscripcionalmente una hebra de aproximadamente 100 a 200 enina (cola poliA) en el extremo 3' escindido. Se piensa que la en muchos aspectos del metabolismo de ARNm, incluyendo ia de traducción y transporte desde el núcleo al citoplasma. Típic de poliadenilación consiste en dos elementos de reconoci ean el sitio de escisión y poliadenilación: una secuencia ente conservada aproximadamente 14 a 30 nucleótidos cadena señal de poliadenilación temprana más débil de SV40 (C ular and Cellular Biology, Vol.19 (8), 5588 - 5600, 1999).

Existe la necesidad de identificar señales de poliadenilac uso muy fuertes alternativas para acelerar la generación de línea ente productoras para la producción de proteínas recombinantes. es de poliadenilación fuertes o incluso muy fuertes potencia la t transcripción, que a su vez da como resultado una producción, tación nuclear y/o traducción del ARNm codificado por ntado. Esto conduciría a mayores niveles de ARNm y por lo t resultado una mayor productividad de células productoras.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN/SOLUCIÓN En este documento se describe una nueva señal de polia a a partir de la hormona de crecimiento del hámster Chino S). Sorprendentemente, se ha descubierto que esta enilación recién identificada, denominada HGH, supera a las s enilación fuertes de BGH y tardía de SV40. Cuando se usan ve tivamente a la secuencia o secuencias de nucleótidos heteról ación de la presente invención es un nuevo vector que comprend ecuencia de nucleótidos heteróloga que codifica un producto de i S una señal de poliadenilación de HGH. La señal de poliadenilaci cadena abajo y unida operativamente a la secuencia o secu ótidos heterólogas. Una realización adicional de la presente inven vector o secuencia polinucleotídica que comprende al menos un enilación de HGH unida operativamente a un sitio de clonaci a arriba que permite la clonación del gen de interés a través de s onocimiento para endonucleasas de restricción. Otra realización nte invención es una célula eucariota, preferiblemente una ero, que comprende la señal de poliadenilación de HGH. Una nal más de la presente invención es un método para producir u rés que comprende cultivar células eucariotas, preferiblemente ero transfectadas con vectores o secuencias polinucleotí enden la señal de poliadenilación de HGH. En una realización pr fección n° 1) en comparación con células transfectadas con 06 que contiene la señal de poliadenilación tardía de SV40.

Los datos de la presente invención muestran adicion cto de la señal de poliadenilación de HGH sobre la expresión tra ticuerpo lgG4. Sorprendentemente, los títulos obtenidos con la l de poliadenilación de HGH son como promedio 35% superiores de poliadenilación de BGH (Tabla 4).

Los datos de la presente invención muestran adiciona o de diferentes variantes de HGH (Tabla 5). La secuencia de de 113 pb contenida en el vector de expresión pJR135 cond sión de sICAM reducida hasta 78% en comparación con la se de 324 pb contenida del vector de expresión pJR131. Mient ncia de HGH de 189 pb contenida en el vector de expresión resultado una expresión de sICAM muy buena comparable sión logrado con BGH (Tabla 4). El mejor resultado de expresió secuencia de HGH de 324 pb contenida en el vector de expresi sos semicontinuos de hasta 6.3 g/l (Tabla 6).

La invención se refiere a una señal de poliadenil rende un ácido nucleico que comprende una secuencia que dad de al menos 75% con la SEC ID N°: 9. La invención se refie señal de poliadeniiación que comprende un ácido nucleico que ecuencia que tiene una identidad de al menos 75% con la SEC I ción se refiere además a una señal de poliadeniiación que com nucleico que comprende una secuencia con una identidad de on la SEC ID N°: 9. La invención se refiere específicamente a un enilación que comprende un ácido nucleico que consiste esencia ecuencia con una identidad de al menos 75% con la SEC ID N°: 9.

La invención se refiere preferibleménte a una enilación que comprende un ácido nucleico que consiste en una na identidad de al menos el 75% con la SEC ID N°: 9. La inv además a una señal de poliadeniiación que comprende un ácid mprende la SEC ID N°: 9. rende la SEC ID N°: 8.

En una realización adicional de la presente invención, l enilación comprende una secuencia con una identidad de al m 90%, 95% o 98% con la SEC ID N°: 9 o SEC ID N°: 8. En una ífica la invención se refiere a una señal de poliadenilación que ido nucleico que comprende una secuencia con una identidad d con la SEC ID N°: 9. En otra realización específica la invención s eñal de poliadenilación que comprende un ácido nucleico que ecuencia con una identidad de al menos 95% con la SEC ID N°: ción específica la invención se refiere a una señal de poliadeni rende un ácido nucleico que comprende una secuencia con un menos 85% con la SEC ID N°: 8. En otra realización específica la iere a una señal de poliadenilación que comprende un ácido nu rende una secuencia con una identidad de. al menos 95% con la La invención se refiere a un ácido nucleico cuya ° En una realización preferida, se aisla dicha señal de polia una realización preferida, la invención se refiere a una denilación aislada que comprende un ácido nucleico que comp ncia con una identidad de al menos 75% con la SEC ID N°: ación preferida la invención se refiere a una señal de poliadenilac comprende un ácido nucleico que comprende una secuenci dad de al menos 95% con la SEC ID N°: 9. En otra realización pre ención se refiere a una señal de poliadenilación aislada que co nucleico que comprende la SEC ID N°: 9. En una realizació nal, la invención se refiere a una señal de poliadenilación a rende un ácido nucleico que comprende una secuencia con un menos 75% con la SEC ID N°: 8. En otra realización preferida, l iere a una señal de poliadenilación aislada que comprende ico que comprende una secuencia con una identidad de al meno C ID N°: 8. En otra realización preferida más, la invención se re de poliadenilación aislada que comprende un ácido nu ° idos para la señal de poliadenilación de BGH. En una realiz rida, son al menos y/o como promedio 35% superiores a los obte al de poliadenilación de BGH.

La invención se refiere específicamente a un ácido nuc ncía comprende la SEC ID N°: 9 unida operativamente a una cante heteróloga. Como alternativa, la secuencia del mism ialmente en la SEC ID N°: 9 unida operativamente a una cante heteróloga. Preferiblemente, la secuencia del mismo con ID N°: 9 unida operativamente a una secuencia codificante heteról La invención se refiere además a un ácido nucleico cuya rende la SEC ID N°: 8 unida operativamente a una secuencia loga. Como alternativa, la secuencia del mismo consiste esenci C ID N°: 8 unida operativamente a una secuencia codificante Preferiblemente, la secuencia del mismo consiste en la a operativamente a una secuencia codificante heteróloga.

Un ácido nucleico cuya secuencia comprende la SEC ID elección y/o amplificación dihidrofolato reductasa (DHFR), asa o neomicina fosfatasa (neo). En una realización preferida de ? ción, el vector o la secuencia polinucleotídica comprende un gen ólogo que codifica un producto de interés heterólogo. Preferiblem cto es un polipéptido. Preferiblemente dicho polipéptido es un ento de anticuerpo o proteína de fusión.

La invención se refiere adicionalmente a una célula que c ualquiera de los vectores o secuencias polinucleotídicas que se h ormente. Preferiblemente, la célula comprende una cualquie s de poliadenilación o secuencias de ácidos nucleicos que se h ormente unidas operativamente a una unidad de transcripción q oducto de interés. Preferiblemente dicho producto de inter tido/ácido nucleico de interés. En otra realización de la cé to de interés es un polipéptido de interés codificado por un gen iblemente dicho polipéptido es un anticuerpo, fragmento de an a de fusión. rida de la presente invención la célula se caracteriza po s/niveles de expresión obtenidos con dicha señal de poliad ncia de ácido nucleico son al menos 10%, preferiblemente 2 riblemente 30% superiores a los obtenidos para la señal de poli 3H. En una realización más preferida son al menos y/o de pro riores a los obtenidos para la señal de poliadenilación riblemente, dicha célula tiene niveles de expresión 35% superiore La invención se refiere adicionalmente a un método de polipéptido de interés codificado por un gen de interés, compre o: Proporcionar una célula hospedadora que comprende u ncia polinucleotídica como se ha descrito anteriormente o propor como se ha descrito anteriormente, Cultivar dichas células en condiciones que permitan la p células y la expresión del gen de interés, Recoger el polipéptido de interés y terés es un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal, specífico o de cadena sencilla o un fragmento del mismo, p entos Fab, Fab', F (ab')2, Fe y Fe', cadenas de inmunoglobulin y su región constante, variable o hipervariable, así como fragm ? otra realización preferida de dicho método el polipéptido de ínte ína de fusión o una proteína de armazón.

La invención se refiere además a un uso de la célula c ito anteriormente para la fabricación de proteínas.

La invención se refiere además a un uso de una cualqu es de poliadenilación o ácidos nucleicos que se han descrito ant el uso como un aislante.

Además, la invención se refiere a un uso de una cualqu es de poliadenilación o ácidos nucleicos como se ha ormente para la generación de líneas celulares hospedadoras me La invención se refiere específicamente a un uso de una s señales de poliadenilación o ácidos nucleicos que se ha d compuesta que contiene tanto el elemento potenciador como p "P" un elemento promotor y "T" una señal de terminació cripción, que es necesaria para la poliadenilación de ARN crito. Las señales de poliadenilación "BGH", "SV40L" y "HGH" s rminación para la transcripción obtenidas de la región no traduci ona de crecimiento bovina (SEC ID N°: 12), la región del gen tardí ID N°: 11) y la región no traducida 3' de la hormona de crec ter Chino (SEC ID N°: 8), respectivamente. Estas señales de poli flanqueadas por sitios de enzimas de restricción para "Sfi\" y ión y la dirección del inicio de la transcripción dentro de cada ripción se indican mediante una flecha. Para la clonación del gen serta una región de secuencia con múltiples sitios de ucleasas de restricción (sitios de clonación múltiple - "mes") d nto promotor/potenciador. El marcador de selección a ofolato reductasa se abrevia a "dhfr" y el marcador de selección ransferasa se abrevia a "npt". iento está destacado mediante letras en negrita subrayadas y es 4 pb de la región no traducida 3'.

RA 3: ALINEAMIENTO DE REGIONES NO TRADUCIDAS 3' A HORMONA DE CRECIMIENTO En este alineamiento la región no traducida 3' aisl ona de crecimiento de Cricetus griseus (SEC ID N°: 8) se comp no traducida 3' de la hormona de crecimiento del há cricetus auratus (Genbank S66299), Mus musculus (Genbank s nofvegicus (Genbank V01239) y Sos taurus (Genbank J reado indica nucleótidos que difieren de la secuencia de C. griseu RA 4: DERIVADOS DE DELECIÓN DE HGH DE LA RE UCIDA 3' DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO DE EUS En este alineamiento se muestran los derivados de dele ncia de la hormona de crecimiento de Cricetus griseus (HG tidos (SEC ID N°: 7) que contiene sólo la región no traducida 3'. ' s "sICAM" bajo el control del elemento potenciador y promoto "). La transcripción de sICAM termina por la región no traducid ona de crecimiento bovina "BGH" (SEC ID N°: 12), la región del 40 "SV40L" (SEC ID N°: 11) o la región no traducida 3' de la h iento de hámster Chino "HGH" (SEC ID N°: 8, SEC ID N°: 9, e indica el tamaño de esta última en pares de bases. Estas enílación están flanqueadas por sitios de enzimas de restricción al". "P" indica un elemento promotor y " una señal de terminac ripción. La posición y la dirección del inicio de la transcripción unidad de transcripción se indican mediante una flecha. El m ión amplificable dihidrofolato reductasa se abrevia a "dhfr".

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las expresiones generales "que comprende" o "compre en la expresión más específica "que consiste en". Además, l ar y plural no se utilizan de modo limitante.

La presente invención proporciona nuevos elementos reg Los términos utilizados en el transcurso de esta present el siguiente significado.

Las expresiones "señal de poliadenilación", enilación", "señal poliA", "sitio poliA" o "señal de terminación" o "t ieren a secuencias de nucleótidos dentro de la UTR 3' que dirig complejo proteico de poliadenilación a una secuencia AAUAAA d ncía señal. El complejo contiene una endonucleasa que corta madamente 14 a 30 nucleótidos cadena abajo de la secuencia polimerasa que incorpora postranscripcionalmente una imadamente 100 a 200 nucleótidos de adenina (cola poliA) en el ido. Se piensa que la cola poliA influye en muchos asp olismo de ARNm, incluyendo estabilidad, eficacia de tra orte desde el núcleo al citoplasma. Típicamente, la señal de polia te en dos elementos de reconocimiento que flanquean el sitio de enilación: una secuencia AAUAAA altamente conservada aproxim 0 nucleótidos cadena arriba del sitio de escisión y una región rica ucleotídicas con homología con AAUAAA siempre que sean c izar la poliadenilación de ARNm. Los ejemplos de ucleotídicas homologas incluyen AAAAAA, AUUAAA, AAUAUA, AA, AAUUAA, AAUAAG, AGUAAA, GAUAAA, AAUGAA, AA, ACUAAA, CAUAAA, AAUCAA, AACAAA, AAUCAA y AAUA en una realización la señal de poliadenilación de HGH comp ncía hexanucleotídica seleccionada del grupo que consiste en \AA, AAUAUA, AAUAAU, UAUAAA, AAUUAA, AAUAAG, \, AAUGAA, AAUAGA, AAGAAA, ACUAAA, CAUAAA, \, AAUCAA y AAUAAC en lugar de la presente AAUAAA, si hexanucleótidos sean capaces de señalizar la poliadenilación de Las señales de poliadenilación también pueden usa ntes" o "secuencias aislantes". Las secuencias aislantes son seg ue bloquean interacciones o interfieren en secuencias génicas ve lo, los aislantes pueden reducir la ultra lectura transcripció tor de un gen vecino o promotores falsos en secuencias de n uiera o en ambos lados de la unidad de transcripción en una o En una realización preferida de la presente invención, la te es una señal de poliadenílación. En una realización preferi ción, la señal de poliadenílación es la señal de poliadenílación de También es posible usar derivados funcionales de la se enilación de HGH tales como subfragmentos o subsecuencias, ntes/variantes funcionales de la secuencia completa o subfragme os que se han modificado, por ejemplo, por sustitución, inserci eleción. Los subfragmentos o subsecuencias, mutantes o pondientes se denominan también en lo sucesivo "ter icados" o "derivados".

Un "terminador modificado" o "derivado" es un derivado fu C ID N°: 8 que incluye subfragmentos o subsecuencias y mutante nales y que preferiblemente conduce a niveles de expresión de u erés comparables a los niveles de expresión obtenidos con la se tidos que se proporciona en la SEC ID N°: 8. Un terminador liblemente al menos 97% y que conducen a niveles de spondientes en un ensayo de gen indicador comparativo.

En un "ensayo de gen indicador" comparativo correspon entos terminadores a ensayar, incluyendo la secuencia de refer o: 8, se clonan cadena abajo de un gen indicador. Este gen ca, por ejemplo, luciferasa, fosfatasa alcalina secretada o prot scente (GFP). Como alternativa, pueden usarse otros polip nas, por ejemplo un anticuerpo o sICAM, como genes indicado rucciones se introducen posteriormente en las células de en ío, CHO-DG44, por transfección y la influencia del terminador estión sobre el nivel de expresión del gen indicador se dete lo, por medición del contenido de proteína del gen indicador. S sayo correspondiente en los ejemplos 2, 3 y 4 de la presente inve Una señal de poliadenilación de HGH preferida es la se tidos que comprende la secuencia de la SEC ID N°: 8 o una subs misma que comprende la secuencia de la SEC ID N°: 9.

Como se usa en la presente memoria, la expresión iciones rigurosas" describe condiciones para la hibridación y lava cidas para los especialistas en la técnica. Generalmente, las c sas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 - 10°C l punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a y pH definidos. La Tm es la temperatura (en una fuerza ió ntración de ácido nucleico definidas) a la que el 50% de l ementarías a la diana hibridan con la secuencia diana en equ ciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración salin ón sodio aproximadamente 1.0 M, típicamente una concentraci de aproximadamente 0.01 a 1.0 M (u otras sales) a pH 7.0 ratura es de al menos aproximadamente 30°C para sondas c io, de 10 a aproximadamente 50 nucleótidos) y de madamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, ma madamente 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas ejemplare ción de 60 a 65°C en un tampón de hibridación con SSC 5x o adecuado en la presente invención en el ejemplo 1. Partie ncía descrita en la SEC ID N°: 7 puede seleccionarse un ado, por ejemplo, y puede sintetizarse químicamente u ucleotídica que contiene la secuencia de esta fracción. Una son puede usarse, por ejemplo, para clonar el gen de la ho iento de hámster o la región no traducida 3' u otros fragme a, por ejemplo, por hibridación de una genoteca del genoma d o el ensayo del gen indicador descrito anteriormente el especiali ón de identificar fragmentos terminadores funcionales sin un gra rlos para los fines de la presente invención. La región no trad entos especiales de la misma pueden obtenerse fácilmente icación por PCR con cebadores correspondientes a partir ico o de una genoteca genómica. También pueden obtenerse f región no traducida 3' mediante digestión limitada con exonucl de fragmentos de ADN de mayor tamaño. Dichas moléculas n pueden sintetizarse químicamente o producirse a partir de f iento de otras especies. Su rendimiento puede ensayarse en e dicador como se describe en los ejemplos 2, 3 ó 4 de la presente Mediante hibridación cruzada con sondas derivadas de la hormona de crecimiento de hámster, preferiblemente de la ida 3', también es posible identificar y aislar secuencias ter adas a partir de genes homólogos correspondientes de otras iblemente de mamíferos. Los especialistas en la técnica dimientos adecuados.

Las expresiones "homología", "homólogo", "identidad", idad de secuencia" o "secuencia homóloga" se usan mbiable. Se conocen bien en la técnica métodos para C logía" o "identidad". Para la comparación de secuencias, típica ncia actúa como una secuencia de referencia con la que se co cias de ensayo. Las secuencias se alinean para una corres a. Pueden introducirse huecos en cualquiera de las secuencias cos en la comparación para un alineamiento óptimo. El porc ndose en los parámetros del programa designados o por d lo de un algoritmo que es adecuado para determinar la ident itmo BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403 - 410, 1990; e Genetics 3, 266 - 272, 1993; Madden et al., Meth. Enzymol. 1996; Zhang et al., Genome Res. 7, 649 - 656, 1997; Altschul et Res. 25, 3389 - 3402, 1997). Otras aplicaciones informat tmos de alineamientos son GAP, PILEUP, BESTFIT, FASTA y T quete de Programas Informáticos de Wisconsin Genetics. Sin én puede determinarse el porcentaje de identidad mediante ali al e inspección visual y cálculo.

El término "vector" como se usa en la presente memoria, strucciones generadas sintéticamente o de origen natural para ración, expresión o transmisión de ácidos nucleicos en una io, plásmidos, minicírculos, fagémidos, cósmidos, cr les/minicromosomas, bacteriófagos, virus tales como b rus, adenovirus, virus adenoasociados, virus herpes simple, bact óticos para selección en bacterias. Una diversidad de vectores de iotas que contienen un sitio de clonación en el que pue tivamente un polinucleótido son bien conocidos en la técnica disponibles en el mercado en compañías tales como Stratagen vitrogen, Carlsbad, CA; Promega, Madison, Wl o BD Bioscience lto, CA.

Una realización preferida de la invención son vectores o S cleotídicas que contienen una o más unidades de transcri an genes de interés que comprenden al menos una enilación de HGH para la terminación de la transcripción y la est rno secuencia aislante. También se prefieren de acuerdo con la es o secuencias polinucleotídicas que comprenden se nilación de HGH para la terminación de la transcripción y la est mo secuencia aislante que en lugar de genes de interés sólo tien nación múltiple que permite la clonación del gen de interés ncías de reconocimiento para endonucleasas de restricción. " " como GenBank) y están disponibles como elementos se ntos clonados dentro de secuencias polinucleotídicas d rciales (por ejemplo, depósitos tales como la ATCC así como otr rciales) o individuales. En promotores inducibles, la actividad de e aumentarse o reducirse en respuesta a una señal. Por e otor de tetraciclina (tet) que contiene la secuencia operadora de puede inducirse mediante una proteína transactivadora reg iclina (tTA). La unión de la tTA al tetO se inhibe en presencia d íos de otros promotores inducibles jun, fos, metalotioneína y pro e térmico. De los promotores que son particularmente adecuado xpresión en eucariotas, están por ejemplo el promotor de ubiq mster (documento WO 97/15664), promotor temprano de SV 40 principal de adenovirus, promotor de metalotioneína-l de ratón, l etición terminal larga del Virus del Sarcoma de Rous, el promotor itomegalovirus humano (CMV). Son ejemplos de otros prom eros heterólogo el promotor o promotores de actina, inmunoglob ción en otra realización, contiene uno o más potenciadores/ ciadoras, preferiblemente un potenciador de CMV o SV40.

El término "potenciador" denota una secuencia polinucle localización cis actúa sobre la actividad de un promotor y p ula la transcripción de un gen o secuencia codificante nalmente a este promotor. A diferencia de los promotores, el ef ciadores es independiente de la posición y orientación y p n situarse delante o detrás de la unidad de transcripción, de o incluso dentro de la región codificante. El potenciador puede en la proximidad inmediata de la unidad de transcripción co cia considerable del promotor. También es posible tener un sol y funcional con el promotor. El especialista tendrá conocimiento ciadores de diversas fuentes (y depositados en bases de datos t ank, por ejemplo, potenciadores de SV40, potenciadores ciadores de polioma, potenciadores de adenovirus) que están d elementos independientes o elementos clonados dentro de s sar, sitios de inicio y terminación de la transcripción y una enilación.

La expresión "sitio de inicio de la transcripción" se refiere ico en la construcción que se corresponde con el primer ácid orado en el transcrito primario, es decir, el precursor de ARNm. de la transcripción puede solapar con las secuencias promotoras.

La expresión "sitio de terminación de la transcripción" s ecuencia de nucleótidos normalmente representada en el extr e interés o de la extensión de secuencias que se va a trans ca que la ARN polimerasa termine la transcripción.

Una "unidad de transcripción", "unidad de expresión" o " ión" define una región dentro de un vector, construcción o cleotídica que contiene uno o más genes que se van a transcribir, nes contenidos dentro del segmento están unidos operativament nscriben a partir de un solo promotor y la transcripción se termina nos una señal de poliadenilación. Como resultado, los genes r o secuencia polinucleotídica puede contener más de una cripción.

Los "elementos reguladores de la traducción" comprend cio de la traducción (AUG), un codón de terminación y una señal polipéptido individual que se va a expresar. Puede incluirse un s trada del ribosoma (IRES) en algunas construcciones. IRES s uación. Para optimizar la expresión puede ser conveniente elimi rar regiones no traducidas 5* y/o 3' de la secuencia de ácidos nuc a expresar para eliminar cualquier codón de inicio de la ativo extra potencialmente inapropiado u otras secuencias qu rir con o reducir la expresión, a nivel de transcripción o traducció rse sitios de unión al ribosoma de consenso (secuencia CCACCAUGG (SEC ID N°: 13); AUG constituye el codón atamente cadena arriba del codón de inicio para potenciar la tr tanto la expresión. Contenidos aumentados de A/U alrededor de ón al ribosoma promueven una unión al ribosoma más eficaz. Par ncia de péptido señal heteróloga con la secuencia seleccion ncía de péptido señal nativa puede sustituirse por una heter ialistas conocen numerosas secuencias de péptidos señal itadas en bases de datos de secuencias tales como GenBank y E Un "sitio interno de entrada del ribosoma" o "IRES" de ncía que promueve funcionalmente el inicio de la endientemente del gen 5' al IRES y permite que se traduzcan do de lectura abiertas) a partir de un solo transcrito en una célula proporciona un sitio de entrada del ribosoma independient ción de la fase de lectura abierta inmediatamente cadena abajo rencia del ARNm bacteriano que puede ser policistrónico, es deci polipéptidos diferentes que se traducen de forma secuencial a p , la mayoría de los ARNm de células animales son monocis an la síntesis de un sólo polipéptido. Con un transcrito policistróni eucariota, la traducción se iniciaría desde el sitio de inicio de la t ', terminaría en el primer codón de terminación y el transcrito s técnica. La secuencia codificante cadena abajo está unida oper remo 3' del IRES a cualquier distancia que no afecte negativar sión del gen cadena abajo. La distancia óptima o permisible entr icio del gen cadena abajo puede determinarse fácilmente v cia y midiendo la expresión en función de la distancia.

El término "intrón" como se usa en la presente memoria, ecuencia de ácido nucleico no codificante de longitud variable, ño nte dentro de muchos genes eucariotas, que se elimina de un pr recién transcrito mediante el proceso de corte y empalme para arias secuencias altamente conservadas en o próximas a cualqui trón. En general, el proceso de corte y empalme requiere que lo del intrón se escindan correctamente y los extremos resultantes n unirse con precisión, de modo que se produce un ARNm m la fase de lectura apropiada para la síntesis proteica. Se han car rito y se conocen por los especialistas muchos sitios donadores lme y aceptores de corte y empalme, refiriéndose a las s Estas modificaciones incluyen optimizaciones de co izar el uso de codón en la célula hospedadora seleccionada, hu rcaje. Además, pueden incluir la eliminación o adiciones de ción en cis tales como sitios donadores de corte y empalme aceptores y puntos de ramificación, señales de poliadenilación, c chi, sitios de entrada del ribosoma, secuencias de repetición, darias (por ejemplo, estructuras de tallo-bucle), sitios de unión pa .1 nscripción u otros factores reguladores, sitios de enzimas de ara dar algunos ejemplos no limitantes. La secuencia seleccion ar un polipéptido secretado, citoplásmico, nuclear, unido a mem icie celular.

Dentro del alcance de la presente invención, los términ nal", "unido funcionalmente" o "unido operativamente" significan ecuencias de ácidos nucleicos o elementos de secuencia se sitú que los permite funcionar de la forma deseada. Por eje tor/potenciador o terminador está unido funcionalmente a una nscripción de la secuencia codificante. Para esto pueden localiza o cadena abajo de la secuencia codificante e incluso a cierta di e poliadenilación está unido operativamente a una secuencia co caliza en el extremo 3' de la secuencia codificante de una for ripción se desarrolla por la secuencia codificante hacia la enilación. La unión se logra mediante métodos recombinantes co nica, por ejemplo, usando metodología de PCR, por ligación e ción adecuados o por hibridación. Pueden usarse enla adores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica co stán presentes sitios de restricción adecuados.

Las expresiones "ácido nucleico", "secuencia de ácido ncia de nucleótidos", "polinucleótido", "secuencia polinucle ncia de ADN", como se usan en la presente memoria, se refi ucleótido, nucleótido o polinucleótido y fragmentos y porcion s y a ADN o ARN de origen genómico o sintético, que pueden s narios y representar la cadena sentido o antisentido. La secuen N) o aminoácidos definida y las propiedades biológicas resultan misma. Por consiguiente, un gen codifica una proteína si l da se produce en una célula u otro sistema biológico por tran rior traducción del ARNm. Tanto la secuencia codificante, cuya cleótidos es idéntica a la secuencia de ARNm y que habitua rciona en listas de secuencias de bases de datos, por ejempl ank, como la secuencia no codificante, usada como el mofc ripción de un gen o ADNc, pueden mencionarse como que c na u otro producto de ese gen o ADNc. Un ácido nucleico que c na incluye cualquier ácido nucleico que tiene diferentes secu tidos pero codifica la misma secuencia de aminoácidos de l a la degeneración del código genético. Los ácidos nuclei ncías de nucleótidos que codifican proteínas pueden incluir intro e Secuencias las secuencias se presentan como secuencia de ARN. Por ejemplo, cuando se presentan como ADN, el codón d ta como ATG en lugar de AUG. " " ad de ARN o ARNm correspondiente que está presente en la ad del polipéptido deseado codificado por la secuencia selecci ío, el ARNm transcrito a partir de una secuencia seleccion ificarse por hibridación de transferencia de Northern, protección d onucleasa, hibridación in situ con ARN celular o por PCR. Las cadas por una secuencia seleccionada pueden cuantificarse p os, por ejemplo, por ELISA, por transferencia de We nmunoensayos, por inmunoprecipitación, por ensayo de la ica de la proteína, o por inmunotinción de la proteína seguido y PCR.

El término "polipéptido" se usa de forma intercamb encia de restos aminoacídicos" o el término "proteína" y se ros de aminoácidos de cualquier longitud. Estos términos incluy nas que se modifican postraduccionalmente mediante reacci en, pero sin limitación, glicosilación, glicación, acet ilación, fo ión, amidación o procesamiento de proteínas. Pueden éptido" incluye también por lo tanto, por ejemplo, proteínas de sten en un componente de inmunoglóbulina, por ejemplo, el comp actor de crecimiento, por ejemplo, una interleuquina.

Como se usa en la presente memoria, el término " e un anticuerpo policlonal, monoclonal, biespecífico, multi no, humanizado o quimérico, un anticuerpo de cadena s ento de unión a antígeno de un anticuerpo (por ejemplo, un frag b')2), un Fv unido por disulfuro, etc. Dichos anticuerpos pueden ntesis química, por medios recombinantes o transgénicos, media r (por ejemplo, hibridoma) o por otros medios.

Los fragmentos Fab (fragmento de unión a antígen ten en las regiones variables de las dos cadenas que se mantie región constante adyacente. Pueden formarse mediante dig sa, por ejemplo, con papaína, a partir de anticuerpos convencion nto también pueden producirse fragmentos Fab similares ería genética. Los fragmentos de anticuerpo adicionales ' era mediante un fragmento peptídico corto, por ejemplo de oácidos, preferiblemente de 15 aminoácidos. De este modo, se o cadena peptídica que consiste en VH y VL, ligadas por un dico. Una proteína de anticuerpo de este tipo se conoce como a sencilla (scFv). En la técnica anterior se conocen ejemplos d ticuerpo scFv de este tipo.

En los últimos años, se han desarrollado diversas estrat rar scFv como derivado multimérico. Se pretende que esto co Jlar, a anticuerpos recombinantes con propiedades farmacocin tribución mejoradas, así como a una avidez de unión aumen guir la multimerización de scFv, se prepararon scFv en forma d sión con dominios de multimerización. Los dominios de multi n ser, por ejemplo, la región CH3 de una IgG o estructura sup cturas de hélice) tal como dominios de cremallera de leucina. Sin mbién estrategias en las que se utiliza la interacción entre la del scFv para la multimerización (por ejemplo, dia-, tri- y pent riblemente lgG1 , como región de dimerización que está conect mediante una región de bisagra (por ejemplo, de lgG1) y adora. En la técnica anterior se conocen ejemplos de pr erpo-minicuerpo.

Por triacuerpo, el especialista en la técnica se refiere a: u Fv homotrimérico trivalente. Los derivados de scFv en los que V adas directamente sin una secuencia enlazadora conducen a la eros.

El especialista en la técnica estará también familiariza inados minianticuerpos, que tienen una estructura bi-, tri- o tetr n de scFv. Se lleva a cabo la multimerización mediante enrolladas di-, tri- o tetraméricas. En una realización prefer nte invención, el gen de interés codifica cualquiera de los p dos mencionados anteriormente, preferiblemente un onal, un derivado o un fragmento del mismo.

El "polipéptido de interés", "proteína de interés" o "pr " IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 , IL-12, IL-13, I , IL-17, IL-18, interferón (IFN) alfa, IFN beta, IFN gamma, IFN o actores de necrosis tumoral (TNF) talestal como TNF alfa y TNF a, TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 , VEGF y na También se incluye la producción de eritropoyetina o cu r de crecimiento hormonal y cualquier otro polipéptido que p agonista o antagonista y/o tener un uso terapéutico o de diag o de acuerdo coh la invención también puede usarse ventajosa ducción de anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales, p specíficos y de cadena sencilla o fragmentos de los mismos, p entos Fab, Fab\ F (ab')2, Fe y Fe', cadenas de inmunoglobulin y su región constante, variable e hipervariable, así como fragm El "producto de interés" también puede ser un ARN , ARNr, otros ARN que son parte de riboproteínas u otros ARN re El método de la presente invención puede realizarse en cción de agentes biofarmacéuticos líneas celulares humanas, d de mono o de roedor. Se prefieren más células de hámster, prefe s BHK21 , BHK TK", CHO, CHO-K1 , CHO-DUKX, CHO-DUKX o los derivados/progenies de cualquiera de estas líneas cel ren particularmente células CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 , 1 , y aún más preferiblemente células CHO-DG44 y CHO-DUKX én se conocen células de mieloma murino, preferiblemente cél o los derivados/progenies de cualquiera de dichas líneas célul celulares productoras para proteínas biofarmacéuticos. Se resu 1 ejemplos de células murinas y de hámster que pueden us o de esta invención. 1 : Líneas celulares de producción eucariota Las células hospedadoras se prefieren más cuando se e y se cultivan completamente en condiciones sin Cualquiera de los medios puede complementarse s ario con una densidad de compuestos, siendo ejemplos hormona es de crecimiento (tales como insulina, transferrina, factor de c rmico, factor de crecimiento similar a insulina), sales (tales como , fosfato de calcio y de magnesio), tampones (tales como ósidos (tales como adenosina, timidina), glutamina, glucosa u otr ergía equivalentes, antibióticos u oligoelementos. Puede incluirs uier otro complemento necesario a concentraciones apropiada ido por los especialistas en la técnica. En la presente invención, o de medio sin suero, pero también pueden utilizars ementados con una cantidad adecuada de suero para el cultivo dadoras. Para el crecimiento y selección de células m icamente que expresan un gen de selección, se añade un ión adecuado al medio de cultivo.

La "transfección" de células hospedadoras eucari eias polinucleotídica o vectores de expresión que da como minarse mediante procedimientos rutinarios. Para transfectante nstrucciones se integran en el genoma de la célula hospedado osoma artificial/minicromosoma o se localizan episómicamente de antengan establemente en la célula hospedadora. Para la gen s modificadas genéticamente que expresan el producto o pr s todos los genes heterólogos necesariamente pueden localiz ector o secuencia polinucleótidica en unidades de transcripció istrónicas.

En este caso la célula hospedadora se transfecta co uales o secuencias polinucleotídicas. Los genes heterólogo n situarse en diferentes vectores o secuencias polinucleotídica las células hospedadoras se co-transfectan con todos los nejas polinucleotídicas y/o se transfectan en rondas sucesiva es o secuencias polinucleotídicas que codifican los genes de inte Por definición, cada secuencia polinucleótidica o cada ge a célula hospedadora y la proteína pertinente o el ARN codific ntra en el genoma de la célula de tipo silvestre sin manipular.

La expresión "gen marcador de selección" se refiere a u ite seleccionar específicamente sólo las células que llevan el g la presencia de un agente de selección correspondiente. A ción, puede usarse un gen de resistencia a antibióticos como gen elección positivo que permite seleccionar positivamente dadora transformada con el gen en presencia del pondiente; una célula hospedadora no transformada no podrí vivir en las condiciones del cultivo de selección. Los marc ión pueden ser positivos, negativos o bifuncionales. Los marc ión positivos permiten la selección de las células que llevan el m ir resistencia a un fármaco o compensar un defecto metabólico o élula hospedadora. Por el contrario, los marcadores de selección en eliminar selectivamente a las células que llevan el mare lo, usando el gen HSV-tk como marcador las células se harán s s tales como acyclovir y ganciclovir. Los genes marcadores de ivo/negativo) (véase, por ejemplo, los documentos WO 92/08 8143), incorporados en la presente memoria como referencia. P enes de selección usados comúnmente con células eucariotas i s de la aminoglicósido fosfotransferasa (APH), higromicina fosfo ), dihidrofolato reductasa (DHFR), timidina quinasa (TK), tasa, asparagina sintetasa, y genes que codifican la resistencia a 8), puromicina, histidinol D, bleomicina y fleomicina.

El Mgen marcador de selección amplificable" codifica ha nzima que es necesaria para el crecimiento de células eucariot ciones. Por ejemplo, el gen marcador de selección amplifica car DHFR cuyo gen se amplifica cuando una célula ho ectadas con el mismo se cultiva en presencia del agente rexato (MTX). Por consiguiente, están incluidas en este invenci dadoras genéticamente modificadas de acuerdo con cualqui to en la presente memoria en las que el gen marcador de icable codifica, por ejemplo, un polipéptido que tiene la fun Un gen marcador de selección amplificable particular es ea la dihidrofolato reductasa (DHFR) que es necesaria para la bio s. Las células que carecen del gen de DHFR no crecerán en un e de purinas. El gen de DHFR por lo tanto es útil como un m ción dominante para seleccionar y amplificar genes en dichas c en un medio que carece de purinas. El agente de selección u n gen de DHFR es metotrexato (MTX).

Otro marcador de selección y/o amplificación es el ina sintetasa (GS). El gen de GS codifica la enzima glutamin s necesaria para síntesis del aminoácido glutamina. Las c en del gen de GS o que expresan bajos niveles de GS endógeno dios sin glutamina. El gen de GS por lo tanto es útil como un m ión dominante para seleccionar y amplificar genes en dichas c n en medio sin glutamina. El agente de selección usado junto con sulfoximina de metionina (MSX). 2: Genes marcadores de selección amplificable La selección también puede realizarse por separación das por fluorescencia (FACS) usando, por ejemplo, un marc rficie celular, ß-galactosidasa bacteriana o proteínas fluoresc lo, proteínas verdes fluorescentes (GFP) y sus variantes de a y Renilla reniformis u otras especies; proteínas rojas flú ínas fluorescentes y sus variantes de especies no bioluminisc ío, Discosoma sp., Anemonia sp., Clavularia sp., Zoanthus cionar las células recombinantes.

La expresión "agente de selección" se refiere a una sus ere con el crecimiento o supervivencia de una célula hospedador gen de selección particular. Por ejemplo, para seleccionar con re cia de un gen de resistencia a antibióticos tal como APH (ami ransferasa) en una célula transfectadas, se usa el antibiótico ). El agente de selección también puede comprender un " " Dichas células de producción se cultivan preferentement uero y en cultivos en suspensión en condiciones favorables para l en o genes deseados y el aislamiento de la proteína de interés de el sobrenadante de cultivo de las células. Preferiblemente, la p s se recupera del medio de cultivo como un polipéptido secretad erarse de lisados de las células hospedadoras si se expresa sin creción. Es necesario purificar la proteína de interés de otras binantes, proteínas de la célula hospedadora y contaminante e obtengan preparaciones sustancialmente homogéneas de la p s. Como primera etapa, a menudo se retiran células y/o residuo ulados del medio de cultivo o lisado. Se purifica después de ello nterés de las proteínas solubles, polipéptidos y ácidos minantes, por ejemplo, mediante fraccionamiento en col oafinidad o intercambio iónico, precipitación con etanol, HPL a, cromatografía Sephadex, cromatografía en sílice o en una mbio catiónico tal como DEAE. En general, son bien conoci iente las condiciones para aplicarlas a otras realizaciones.

EJEMPLOS ABREVIATURAS Fosfatasa alcalina : Hormona de crecimiento bovino Pares de bases Ovario de hámster Chino : Dihidrofolato reductasa : Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas : Aparato de separación de células activadas por flu Hormona de crecimiento de hámster Hipoxantina/timidina : Peroxidasa de rábano rusticano Inmunoglobulina Sitio interno de entrada del ribosoma Kilobase MATERIALES Y MÉTODOS o celular Se cultivan de forma permanente células CHO-DG4 nsión en el medio sin suero CHO-S-SFMII (Invitrogen) complem ntina y timidina (HT). Las células se incuban en matraces de s a 37°C en una atmósfera humidificada que contiene C02 al 5%. lulas así como la viabilidad celular se determinan con un C s CASY1 (Schaerfe System, Alemania), un Cedex (Inno nía) o mediante exclusión de colorante tripán azul. Las células s concentración de 1-3 x 105 células/ml en recién preparado limpi días. fecciones Se realizaron transfecciones de células CHO-DG44 usan ctamine Plus (Invitrogen). Por transfección, se siembran 6 x 105 iento exponencial en 0.8 mi de medio CHO-S-SFMII complem ntina/timidina (HT) en un pocilio de una cámara de 6 pocilios. ezcla de ADN plasmídico, 4 µ? de Lipofectamine y 6 µ? de reacti o. En el caso de co-transfecciones, se realiza una selección y NPT de células CHO-DG44 transfectadas de forma estable tr células 48 horas post-transfección a medio CHO-S-SFMI iementado con G418 (Invitrogen) en una concentración de 200 - res de Expresión Son vectores de expresión eucariotas derivados del v (documento WO 9201055) y median la expresión constitutiva de logos dirigidos por el promotor/potenciador de CMV. Para la terr iadenilación del transcrito del gen de interés los vectores contien liadenilación tardía de SV40 (SEC ID N°: 11) o la señal de poli H (SEC ID N°: 12). Los vectores pBID codifican un minigen de D dor de selección amplificable (véase, por ejemplo, el documento mientras que los vectores pBIN codifican un gen NPT como m ión bajo el control del promotor temprano de SV40 y una nilación de timidina quinasa (Figura 1).

Los genes de interés que codifican sICAM humano, ?.

Se cuantifican los títulos de mAb mediante ELISA con ndónales usando un fragmento Fe de cabra anti-lgG humana ( ticuerpo de cabra anti-cadena ligera kappa humana conjugad a). Se usa anticuerpo mAb purificado del mismo isotipo que el patrón.

Las muestras se analizan usando un lector Spectra N, Crailsheim, Alemania).

Se calcula la productividad celular (pg/célula/día) con la f o) t/ln (Ct-Co)) por la que "Co" es el número de células en el mo ra, "Ct" el número de células en el momento de la recogida y T ltivo. o de SEAP La actividad de SEAP se determina con el Ensayo de Ge AP de acuerdo con el protocolo del fabricante (Roche Diagnostics PLQ 1 : AISLAMIENTO Y CLONACIÓN DE LA RE ACCTACCTGCGGGTCA TGA-3'; SEC ID N°: 1) se diseña bas secuencia de ADNc de la hormona de crecimiento del há ocrícetus auratus; Genbank S66299) y se localiza 35 pb cadena n de terminación. Se realiza una PCR secundaria sobre los prod primaria con una combinación de un cebador adaptador int ndo cebador específico de gen anidado GH CCGTCGCTTTGTGGAAA G-3'; SEC ID N°: 2), situado dir a abajo de la posición del cebador GH forl . Los fragmento antes se subclonan en un vector de clonación TA (Invitrogen) y s nalmente mediante análisis de secuencia. El fragmento de ADN ne adicionalmente, aparte de la secuencia del cebador GH for2, o 3' de la región codificante seguidas de un codón de terminació región no traducida 3' de la hormona de crecimiento de Crícet a 2; SEC ID N°: 7).

Para obtener sólo la región no traducida 3' con 324 pb en 8) se realiza otra PCR usando los cebadores GH Sfi forl (SEC I ° El enfoque basado en PCR también se usa para la gen lones con diversas deleciones del extremo 3' de la región no tr a. Usando la combinación de cebadores GH Sfi for 1 (SEC ID N rev2 (SEC ID N°: 5), se genera un fragmento de 189 pb de la cida 3' (SEC ID N°: 9) y con la combinación de cebadores GH Sfi : 3) y GH Xba rev3 (SEC ID N°: 6) se genera un subfragmento ID N°: 10). Por lo tanto, todos los fragmentos amplificados de la ida 3' tienen un extremo 5' idéntico que se corresponde con ótido después del codón de terminación y un extremo 3' variable ( Los productos de PCR se digieren con Sfil y Xbal y los f stricción resultantes se usan para sustituir la secuencia enilación tardía de SV40 en el vector pJR106 que codifica slCAI a 5). Los vectores resultantes pJR131 , pJR134 y pJR135 contie cuencia señal de poliadenilación procedente de la hormona de c cetus gríseus, denominada HGH corta con un tamaño de 324 p , 189 pb (SEC ID N°: 9) y 113 pb (SEC ID N°: 10), respectivame res que contenían la secuencia señal de poliadenilación tardí 106) o de BGH (pJR110) como control (Figura 5). Aparte de las rminación diferentes el sistema genético de los diversos vecto sión de sICAM es idéntico.

Se recogieron sobrenadantes 2 días post-transfec minaron los títulos de sICAM usando ELISA. Para corregir por la ección las células se co-transfectaron con el plásmido pCMV-SE N/reacción de transfección), que codifica la fosfatasa alcalina s de la actividad de SEAP.

La Tabla 3 muestra los datos de 2 series de transfección ndientes realizadas por duplicado. Sorprendentemente, la exp da de sICAM se obtiene con la secuencia señal de políadenilació n de la hormona de crecimiento de hámster. El título se aum serie de transfección n° 1) en comparación con células transfecta pJR110 que contiene la señal de poliadenilación de BGH y s 40% (serie de transfección n° 1) en comparación con células tra IPLO 3: IMPACTO DE LA SEÑAL DE POLIADENILACIÓ E LA EXPRESIÓN TRANSITORIA DE UN ANTICUERPO IGG4 Para evaluar el impacto de la secuencia señal de poli dente de la hormona de crecimiento de Cricetus griseus (HGH sión de un gen de interés, mAb lgG4/kappa humanizado, se ecciones transitorias independientes de sitios de integración cro o-transfectaron células CHO-DG44 con la combinación de gG4 y pBIN/kappa. Ambos vectores contienen 324 pb de la UT na de crecimiento de hámster (=HGH; SEC ID N°: 8) como una de poliadenilación. Como control se co-transfectaron células combinación de vectores pBID-B/lgG4 y pBIN-B/kappa que co de poliadenilación BGH (véase la Figura 1 para vectores básic secuencias de terminación diferentes el sistema genético de lo es para la expresión del mAb de lgG4/kappa es idéntico.

Se recogieron los sobrenadantes 2 días post-transfec 4: Secuencia de Transfección tra binación de vectores terminación (n=6) pBID-B/lgG4 + BGH lgG4 40 + 6 n pBIN-B/kappa (SEC ID N°: 12) HGH D/lgG4 + pBIN/kappa |gG4 54 + 8 n (SEC ID N°: 8) PLO 4: ENSAYO DE DIFERENTES VARIANTES DE HGH Se generaron dos clones de deleción 3' de la secuencia d procedente de la hormona de crecimiento de Cricetus griseus ( diante PCR y se colocaron como una secuencia señal de polia a abajo del gen de sICAM. Los vectores resultantes pJR134 5) contienen una extensión más corta de la secuencia de HGH ID N°: 9) y 113 pb (SEC ID N°: 10), respectivamente, que ti ' minaron los títulos de sICAM usando ELISA. Para corregir por la ección las células se co-transfectaron con el plásmido pCMV-SE DN/reacción de transfeccion), que codifica la fosfatasa alcalina s de la actividad de SEAP.

La tabla 5 muestra los datos de 2 series de transfeccion endientes realizadas por duplicado. Ambas variantes de deleció cían a niveles de expresión de sICAM reducidos. La secuencia b contenida en el vector de expresión pJR134 daba como res ción más moderada de hasta 23%. Por lo tanto, el fragmento tra un rendimiento comparable al de la señal de poliadenilación de SV40 (véanse los ejemplos 2 y 3). Sin embargo, la secuenci orta de 113 pb contenida en el vector de expresión pJR135 con sión de sICAM reducida hasta 78%. Esto demuestra que entre la de 190 a 324 pb de la SEC ID N°: 8 se localizan secue buyen a una expresión eficaz de un gen de interés. 5: res que codifican la cadena pesada y ligera de mAb de divers , lgG2, lgG4) o proteínas de fusión Fe en las que la parte Fe o lgG2. Los vectores básicos pBID y pBIN (Figura 1) usad sión contienen la secuencia de HGH de 324 pb (SEC ID N ncía señal de poliadenilación situada cadena abajo del gen de cionan combinaciones de células estables usando una selección y NPT 2 días post-transfección. La primera selección de tra les se sigue de dos etapas sucesivas de amplificación génica m por adición al medio de cultivo de MTX 100 nM en la primer riormente, MTX 800 nM. Se obtienen clones de una sola célul ción por dilución o una deposición basada en FACS de células i cillos de una placa de 96 pocilios.

Los datos experimentales muestran que puede conseguir sión de una proteína de interés en transfectantes estables usan liadenilación de HGH de Cricetus gríseas. Se obtienen combin s y clones celulares con productividades específicas en el interv (biorreae combinación de 2.1 células 44 (matraz de (MTX 800 nM) ína de combinación de 3.9 con Fe células 45 (matraz de ) (MTX 800 nM) na de combinación de 3.4 con Fe células 34 (matraz de ) (MTX 800 nM) TABLA DE SECUENCIAS: ID N°: 1 Cebador GH for1 ID N°: 2 Cebador GH for2 ID N°: 3 Cebador GH Sfi forl D N°: 4 Cebador GH Xba revi D N°: 5 Cebador GH Xba rev2 D N°: 6 Cebador GH Xba rev3 D N°: 7 Secuencia de la hormona de crecimiento de Cricetus gri ión codificante 3' y región no traducida 3' (362 nucleótidos) ID N°: 12 Secuencia de terminación y poliadenilación de la h miento de Bos taurus (208 nucleótidos) ID N°: 13 Secuencia de Kozak, sitio de unión del ribosoma de co ótidos)

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. - La Señal de poliadenilación que comprende un áci omprende una secuencia con una identidad de al menos 75% c : 9. 2. - La Señal de poliadenilación de acuerdo con la reivin omprende una secuencia con una identidad de al menos 75% c : 8. 3. - La Señal de poliadenilación de acuerdo con las reivin , que comprende una secuencia con una identidad de al menos 95% o 98% con la SEC ID N°: 9 o SEC ID N°: 8. 4. - Señal de poliadenilación de acuerdo con las reivindica comprende la SEC ID N°: 8. 5. - Un ácido nucleico cuya secuencia comprende la SEC I 6. - Un ácido nucleico cuya secuencia comprende la SEC 7. - La Señal de poliadenilación o el ácido nucleico de a ¡vindicaciones 1 a 6 en el ue dicha señal de oliadenilación o d n polipéptido de interés y dicho polipéptido de interés es un entó de anticuerpo o proteína de fusión. 11. - La Célula que comprende el vector o secuencia polin a cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10. 12. - La Célula de acuerdo con lá reivindicación 11 , est de poliadenilación o dicho ácido nucleico de las reivindicaciones 1 tivamente a una unidad de transcripción que codifica un pr s, y en la que el producto de interés es un polipéptido de interés gen de interés. 13. - La Célula de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, célula es una célula de hámster. 14. - Un Método de generación de un polipéptido ado por un gen de interés, comprendiendo el método: (a) Propor hospedadora que comprende un vector o secuencia polinucle o con una cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10 o propor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, ( células en condiciones ue ermitan la roliferación de las c