KR101837925B1 - 신규 조절 요소 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 조절 요소, 및 관련된 벡터 및 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 클로닝된 유전자와 같은 핵산으로부터 폴리펩타이드의 발현을 개선하는 방법 및 상기 신규 조절 요소를 사용한 숙주 세포에서의 다양한 폴리펩타이드의 생성에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 상기 신규 조절 요소의 격리자로서의 용도, 유전자 치료에서의 용도, 또는 숙주 세포주 개선을 위한 용도에 관한 것이다.

Description

신규 조절 요소{Novel regulatory elements}
본 발명은 세포 배양 기술 분야에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신규 조절 요소, 클로닝된 유전자와 같은 핵산으로부터 폴리펩타이드의 발현을 개선하는 방법 및 이러한 신규 조절 요소를 사용한 진핵 숙주 세포에서의 다양한 폴리펩타이드의 생성에 관한 것이다.
사람 치료에 사용하기 위한 생물약제 시장은, 임상 실험으로 평가된 900개 초과의 생물 약제 및 2010년 500억의 예상 판매와 함께 높은 속도로 성장하고 있다. 최근 들어, 사람 단백질을 적절하게 프로세싱하고 변형시키는 능력에 기인하여 포유동물 세포로부터 생성되는 생물약제의 수가 증가하고 있다. 따라서, 재조합 단백질은 기능적으로 및 약동학적으로 사람과 친화적이다. 원핵 발현 시스템과 비교하여 단점은 보통 상당히 낮은 단백질 발현 수준이다. 따라서, 포유동물 세포로부터 생물약제의 성공적인 고수율 생성이 결정적이며, 숙주 세포주, 발현 시스템, 세포 성장 및 생산성, 배양 및 공급 배지, 생성 및 정제 과정, 단백질 구조 및 서열, 단백질 안정성 및 제형을 포함한 다양한 인자에 의해 지배된다.
재조합 단백질 발현은 목적하는 관심 유전자를 암호화하는 발현 벡터를 필요로 한다. 수개의 방법이 효과적인 단백질 생성을 위한 발현 벡터를 최적화하는데 이용되어 왔다. 유전자 발현은 전사 및 해독 수준에서 조절된다. 따라서, 많은 방법들은 단백질 암호화 유전자가 전사되는 효율을 개선하기 위해 강력한 프로모터 및 인핸서를 동정 및 최적화하는 것에 관한 것이다. 이러한 예는 CMV 즉시 초기 (immediate early) 프로모터 및 인핸서, SV40 프로모터 및 인핸서, 연장 인자 (EF) 프로모터, 폴리오마 (Polyoma) 인핸서 및 닭 [베타]-액틴 프로모터이다. 마찬가지로, mRNA를 안정화시키고 전사 종결을 증진시키는 강력한 폴리아데닐화 시그널 서열을 사용하여 발현 벡터에 의해 암호화되는 유전자로부터 단백질 발현을 증대시킨다. 생성된 mRNA가 해독되는 효율을 개선하기 위한 방법에는 해독 개시 부위 (AUG), 최적 리보좀 결합 부위, 예를 들어 코작 (Kozak) 서열 (GCCGCCACCAUGG; AUG는 개시 코돈을 구성한다) 또는 내부 리보좀 진입 부위 (IRES)의 이용이 있다.
진핵세포에서 고수준의 재조합 유전자 발현을 달성하기 위해 발현 벡터를 최적화하는데 이용되는 방법 중의 하나는 폴리아데닐화 시그널의 사용 및 선택을 포함한다. 다양한 폴리아데닐화 시스널이 재조합 단백질의 발현을 위한 벡터에 사용된다. 가장 일반적으로 사용되는 것은, 예를 들어 소 성장 호르몬 (BGH) (US 5,122,458), 시미안 바이러스 40 후기 및 초기 영역, 토끼 베타-글로빈, 마우스 또는 사람 면역글로빈, 폴리오마 바이러스 후기 영역으로부터의 폴리아데닐화 시그널을 포함한다.
진핵세포의 메신저 RNA (mRNA)에서, 3' 비해독 영역 (3'UTR)이 중요한 조절 요소이다. 많은 경우에, 이는 mRNA 안정성에 영향을 주고, 또한 해독 효율을 조절할 수 있다. 폴리아데닐화 시그널은 폴리아데닐화 단백질 복합체의 시그널 서열 내의 AAUAAA 서열에의 결합을 지시하는 3'UTR 내의 뉴클레오타이드 서열이다. 복합체는 AAUAAA 서열의 약 14 내지 30개 뉴클레오타이드 다운스트림에서 mRNA를 절단하는 엔도뉴클레아제 및 절단된 3' 말단에 약 100 내지 200개 아데닌 뉴클레오타이드 (폴리A 테일)의 스트링을 전사후 (post-transcriptionally) 삽입하는 폴리머라제를 포함한다. 폴리A 테일은 안정성, 해독 효율 및 핵으로부터 세포질로의 수송을 포함하여 mRNA 대사의 다양한 양상에 영향을 끼치는 것으로 믿어진다. 전형적으로, 폴리아데닐화 시그널은 절단 및 폴리아데닐화 부위를 플랭킹하는 2개의 인지 요소: 절단 부위의 약 14 내지 30개 뉴클레오타이드 업스트림에 있는 고도로 보존된 AAUAAA 서열 및 AAUAAA 서열의 약 20 내지 50개 뉴클레오타이드 다운스트림에 있는 저조하게 보존되는 G/U- 또는 U-풍부 영역으로 이루어진다. 이들 2개의 요소 사이의 절단은 통상 A 잔기의 3'측에 있다. 생체내에서, 상이한 폴리아데닐화 부위가 프로세싱되는 효율은 상당히 다양하다. 폴리아데닐화 단백질 복합체의 어셈블리 속도는 다단계 과정이며, 폴리아데닐화 시그널 서열의 세기와 관련된다. 예를 들어, 보다 신속한 어셈블리 속도 때문에 강력한 SV40 후기 폴리아데닐화 시그널에서의 절단이 보다 약한 SV40 초기 폴리아데닐화 시그널에서보다 신속하게 일어난다 [참조: Chao et al., Molecular and Cellular Biology, Vol. 19 (8), 5588 - 5600, 1999].
재조합 단백질의 생성을 위한 고생산자 세포주의 생성을 촉진하기 위해서, 대체적인 강력한 또는 더욱 강력한 폴리아데닐화 시그널을 동정할 필요가 있다. 강력한 또는 더욱 강력한 폴리아데닐화 시그널의 이용은 전사 종결을 증진시키고, 이는 결국 벡터 암호화된 mRNA의 생산, 안정성, 핵 유출 및/또는 해독을 증진시킨다. 이는 보다 높은 mRNA 수준을 이끌며, 이로써 생산자 세포의 생산성이 더욱 높아진다.
발명의 요지/해결책
따라서, 본 발명자는 차이니즈 햄스터 (크리세투스 그리세우스: Cricetus griseus)의 성장 호르몬으로부터 분리된 새로운 폴리아데닐화 시그널을 기술한다. 놀랍게도, 이러한 새로이 확인된 폴리아데닐화 시그널 (HGH라 불림)은 강력한 폴리아데닐화 시그널 BGH 및 SV40 후기를 능가한다. 폴리아데닐화 시그널 서열로서 HGH를 포함하는 벡터를 사용하는 경우, CHO-DG44 세포의 일시적 형질감염에서의 단백질 역가는, BGH를 포함하는 세포와 비교하여, 35% 이하로 증가하였다. 안정한 세포에서, 45 pg/세포/일 이하의 높은 비생산성(specific productivity) 및 유가식 공정에서 6.3 g/L 이하의 역가가 얻어졌다.
본 발명의 하나의 양태는 하나 이상의 HGH 폴리아데닐화 시그널 및 관심 생성물을 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열이다. HGH 폴리아데닐화 시그널은 이종 뉴클레오타이드 서열(들)의 다운스트림이며 이에 작동가능하게 결합된다. 본 발명의 또 다른 양태는 관심 생성물을 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오타이드 서열 및 하나 이상의 HGH 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 새로운 벡터이다. HGH 폴리아데닐화 시그널은 이종 뉴클레오타이드 서열(들)의 다운스트림이며 이에 작동가능하게 결합된다. 본 발명의 추가의 양태는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인지 서열을 통해 관심 유전자의 클로닝을 가능하게 하는 다운스트림 다중 클로닝 부위에 작동가능하게 결합된 하나 이상의 HGH 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 새로운 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 본 발명의 또 다른 양태는 HGH 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 진핵세포, 바람직하게는 포유동물 세포이다. 본 발명의 추가의 양태는 HGH 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드 서열로 형질감염된 진핵세포, 바람직하게는 포유동물 세포를 배양하는 것을 포함하여 관심 생성물을 생성하는 방법이다. 바람직한 양태에서, 관심 생성물은 폴리펩타이드이며, 목적하는 폴리펩타이드는 배양 배지로부터 회수된다.
본 발명의 자료는 sICAM의 일시적 발현에 대한 HGH 폴리아데닐화 시그널 서열의 영향을 나타낸다 (도 6). 놀랍게도, 최고의 sICAM 발현이 햄스터의 성장 호르몬 유전자로부터 유도된 폴리아데닐화 시그널 서열의 사용에 의해 얻어졌다. 역가는, BGH 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 벡터 pJR110으로 형질감염된 세포와 비교하여 21% 이하로 증가되고 (형질감염 시리즈 #1), SV40 후기 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 벡터 pJR106으로 형질감염된 세포와 비교하여, 40% 이하로 증가하였다 (형질감염 시리즈 #1).
또한, 본 발명의 자료는 IgG4 항체의 일시적 발현에 대한 HGH 폴리아데닐화 시그널의 영향을 나타낸다. 놀랍게도, HGH 폴리아데닐화 시그널 서열로 수득된 역가는 BGH 폴리아데닐화 시그널에 대한 것보다 평균 35% 더 높다 (도 7).
추가로, 본 발명의 자료는 상이한 HGH 변이체들의 시험을 나타낸다 (도 8). 발현 벡터 pJR135에 포함된 113 bp의 가장 짧은 HGH 서열이, 발현 벡터 pJR131에 포함된 324 bp의 HGH 서열과 비교하여, 78% 이하의 감소된 sICAM 발현을 이끌었다. 발현 벡터 pJR134에 포함된 189 bp의 HGH 서열은 BGH로 달성된 발현 수준에 필적하는 매우 우수한 sICAM 발현을 달성한다 (도 7). 최고의 발현은 발현 벡터 pJR131에 포함된 324 bp의 HGH 서열로 달성되며 (도 8), 이는 BGH 폴리아데닐화 시그널로 달성된 발현보다 훨씬 우수하였다 (35%) (도 7).
이는 서열번호 8의 bp 190 내지 324의 HGH 영역 사이에 관심 유전자의 효과적인 발현에 기여하는 서열이 위치된다는 것을 나타낸다.
또한, 본 발명의 자료는 HGH 폴리아데닐화 시그널을 사용한 고수준의 안정한 단백질 발현을 나타낸다. 10 내지 45 pg/세포/일 범위의 비생산성을 갖는 세포 풀 (pool) 및 세포 클론 및 유가식 공정에서 6.3 g/L 이하의 역가가 얻어졌다 (도 9).
본 발명은 서열번호 9와 적어도 75% 동일한 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 폴리아데닐화 시그널에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 서열번호 9와 적어도 75% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 폴리아데닐화 시그널에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 서열번호 9와 적어도 75% 동일성을 지니는 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 폴리아데닐화 시그널에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 서열번호 9와 적어도 75% 동일한 서열로 필수적으로 이루어진 핵산을 포함하는 폴리아데닐화 시그널에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 본 발명은 서열번호 9와 적어도 75% 동일한 서열로 이루어진 핵산을 포함하는 폴리아데닐화 시그널에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 서열번호 9를 포함하는 핵산을 포함하는 폴리아데닐화 시그널에 관한 것이다.
특정 양태에서, 본 발명은 서열번호 8과 적어도 75% 동일한 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 폴리아데닐화 시그널에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 서열번호 8과 적어도 75% 동일한 서열로 필수적으로 이루어진 핵산을 포함하는 폴리아데닐화 시그널에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 서열번호 8과 적어도 75% 동일한 서열로 이루어진 핵산을 포함하는 폴리아데닐화 시그널에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 서열번호 8을 포함하는 핵산을 포함하는 폴리아데닐화 시그널에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 양태에서, 폴리아데닐화 시그널은 서열번호 9 또는 서열번호 8과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일한 서열을 포함한다. 구체적 양태에서, 본 발명은 서열번호 9와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 폴리아데닐화 시그널에 관한 것이다. 또 다른 구체적 양태에서, 본 발명은 서열번호 9와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 폴리아데닐화 시그널에 관한 것이다. 구체적 양태에서, 본 발명은 서열번호 8과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 폴리아데닐화 시그널에 관한 것이다. 또 다른 구체적 양태에서, 본 발명은 서열번호 8과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 폴리아데닐화 시그널에 관한 것이다.
본 발명은 서열번호 9를 포함하는 서열의 핵산에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 서열번호 9로 필수적으로 이루어진 서열의 핵산에 관한 것이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명은 서열번호 9로 이루어진 서열의 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 서열번호 8을 포함하는 서열의 핵산에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 서열번호 8로 필수적으로 이루어진 서열의 핵산에 관한 것이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명은 서열번호 8로 이루어진 서열의 핵산에 관한 것이다.
바람직한 양태에서, 폴리아데닐화 시그널은 분리된다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열번호 9와 적어도 75% 동일한 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 분리된 폴리아데닐화 시그널에 관한 것이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열번호 9와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 분리된 폴리아데닐화 시그널에 관한 것이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열번호 9를 포함하는 핵산을 포함하는 분리된 폴리아데닐화 시그널에 관한 것이다. 추가의 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열번호 8과 적어도 75% 동일한 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 분리된 폴리아데닐화 시그널에 관한 것이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열번호 8과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 분리된 폴리아데닐화 시그널에 관한 것이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열번호 8을 포함하는 핵산을 포함하는 분리된 폴리아데닐화 시그널에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 서열번호 9를 포함하는 서열의 분리된 핵산에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 서열번호 8을 포함하는 서열의 핵산에 관한 것이다.
바람직한 양태에서, 폴리아데닐화 시그널은 이종 암호화 서열에 작동가능하게 결합된다. 특히 바람직한 양태에서, 폴리아데닐화 시그널은 상기한 폴리아데닐화 시그널로 수득된 역가/발현 수준이 BGH 폴리아데닐화 시그널에 대해 얻어진 것보다 적어도 10%, 바람직하게는 20%, 가장 바람직하게는 30% 높은 것으로 특징지어진다. 가장 바람직한 양태에서는 BGH 폴리아데닐화 시그널에 대해 얻어진 것보다 적어도 및/또는 평균 35% 더 높다.
구체적으로, 본 발명은 이종 암호화 서열에 작동가능하게 결합된 서열번호 9를 포함하는 서열의 핵산에 관한 것이다. 달리, 핵산의 서열은 이종 암호화 서열에 작동가능하게 결합된 서열번호 9로 필수적으로 이루어진다. 바람직하게는, 핵산의 서열은 이종 암호화 서열에 작동가능하게 결합된 서열번호 9로 이루어진다.
또한, 본 발명은 이종 암호화 서열에 작동가능하게 결합된 서열번호 8을 포함하는 서열의 핵산에 관한 것이다. 달리, 핵산의 서열은 이종 암호화 서열에 작동가능하게 결합된 서열번호 8로 필수적으로 이루어진다. 바람직하게는, 핵산의 서열은 이종 암호화 서열에 작동가능하게 결합된 서열번호 8로 이루어진다.
서열번호 9 또는 8을 포함하는 서열의 핵산은 터미네이터 기능을 갖는다. 바람직하게는, 이러한 핵산은 터미네이터 기능을 갖고 이종 암호화 서열에 작동가능하게 결합된다.
또한, 본 발명은 상술된 바와 같은 폴리아데닐화 시그널 또는 핵산 서열 중 하나를 포함하는 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다. 특정 양태에서, 상기 폴리아데닐화 시그널 또는 핵산 서열은 발현 단위/발현 카세트에 작동가능하게 결합된다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 벡터는 선별 및/또는 증폭 마커 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 글루타민 신테타제 또는 네오마이신 포스파타제 (neo)를 포함한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 관심 이종 생성물을 암호화하는 관심 이종 유전자를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 생성물은 폴리펩타이드이다. 바람직하게는, 이러한 폴리펩타이드는 항체, 항체 단편 또는 융합 단백질이다.
추가로, 본 발명은 상술된 바와 같은 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드 중 하나를 포함하는 세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 세포는 관심 생성물을 암호화하는 전사 단위와 작동가능하게 결합된 상술된 바와 같은 폴리아데닐화 시그널 또는 핵산 서열 중 하나를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 관심 생성물은 관심 뉴클레오타이드/핵산이다. 또 다른 양태에서, 관심 생성물은 관심 유전자에 의해 암호화되는 관심 폴리펩타이드이다. 바람직하게는, 이러한 폴리펩타이드는 항체, 항체 단편 또는 융합 단백질이다.
특정 양태에서, 세포는 진핵세포, 포유동물 세포, 햄스터 세포 또는 쥐 세포이다. 바람직하게는, 세포는 햄스터 세포이다. 더욱 바람직하게는, 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 가장 바람직하게는, 세포는 CHO DG44, CHO-K1 또는 DUKX-B11 세포이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 세포는 NSO 세포이다. 바람직한 양태에서, 상술된 바와 같은 세포는 배양된 세포이다. 바람직하게는, 이러한 세포는 혈청-비함유 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 이러한 세포는 현탁 배양으로 성장된다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, 세포는 상기한 폴리아데닐화 시그널 또는 핵산으로 수득된 역가/발현 수준이 BGH 폴리아데닐화 시그널에 대해 얻어진 것보다 적어도 10%, 바람직하게는 20%, 가장 바람직하게는 30% 더 높은 것으로 특징지어진다. 가장 바람직한 양태에서는 BGH 폴리아데닐화 시그널에 대해 얻어진 것보다 적어도 및/또는 평균 35% 더 높다. 바람직하게는, 이러한 세포는 35% 더 높은 발현 수준을 갖는다.
추가로, 본 발명은
(a) 상술된 바와 같은 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포를 제공하거나 상술된 바와 같은 세포를 제공하고,
(b) 상기 세포를, 세포의 증식 및 관심 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에 배양하고,
(c) 관심 폴리펩타이드를 수거하고,
(d) 관심 폴리펩타이드를 정제함을 포함하여, 관심 유전자에 의해 암호화되는 관심 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법의 특정 양태에서, 세포는 진핵세포, 포유동물 세포, 햄스터 세포 또는 쥐 세포이다. 바람직하게는, 세포는 CHO 세포, 가장 바람직하게는, CHO DG44, CHO-K1 또는 DUKX-B11 세포이다. 또한, NSO 세포도 바람직하다.
상기 방법의 바람직한 양태에서, 관심 폴리펩타이드는 재조합 단백질, 바람직하게는 분비된 폴리펩타이드, 가장 바람직하게는 치료 단백질이다. 가장 바람직하게는, 관심 폴리펩타이드는 항체, 예를 들어 모노클로날, 폴리클로날, 다특이적 또는 단일쇄 항체, 또는 이의 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및 Fc'-단편, 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 및 이들의 불변, 가변 또는 초가변 영역, 및 Fv- 및 Fd-단편이다. 상기 방법의 또 다른 바람직한 양태에서, 관심 폴리펩타이드는 융합 단백질 또는 스캐폴드 단백질이다.
또한, 본 발명의 단백질을 제조하기 위한 상술된 바와 같은 세포의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 격리자(insulator)로서의 이용을 위한 상술된 바와 같은 폴리아데닐화 시그널 또는 핵산 중 어느 하나의 용도에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 개선된 숙주 세포주를 생성하기 위한 상술된 바와 같은 폴리아데닐화 시그널 또는 핵산 중 어느 하나의 용도에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 유전자 치료에 사용하기 위한 상술된 바와 같은 폴리아데닐화 시그널 또는 핵산 중 어느 하나의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상술된 바와 같은 폴리아데닐화 시그널 또는 핵산 중 어느 하나, 벡터, 세포 및 상기 세포의 배양을 위한 세포 배양 배지를 포함하는 키트에 관한 것이다.
도 1: 기본 발현 벡터
도 1은 CHO-DG44 세포의 형질감염을 위해 사용되는 발현 벡터 고안을 도시적으로 나타낸다. "P/E"는 CMV 인핸서 및 프로모터 요소 모두를 포함하는 복합 단위이고, "P"는 프로모터 요소이며, "T"는 전사되는 메신저 RNA의 폴리아데닐화에 필요한 전사용 종결 시그널을 나타낸다. 폴리아데닐화 시그널 "BGH", "SV40L" 및 "HGH"는 각각 소 성장 호르몬의 3' 비해독 영역으로부터 유도되는 전사용 종결 시그널 (서열번호 12), SV40 후기 유전자 영역 (서열번호 11) 및 차이니즈 햄스터 성장 호르몬의 3' 비해독 영역 (서열번호 8)이다. 이들 폴리아데닐화 시그널은 "SfiI" 및 "XbaI"에 대한 제한 효소 부위에 의해 플랭킹된다. 각각의 전사 단위 내의 전사 개시의 위치 및 방향이 화살표로 표시된다. 관심 유전자의 클로닝을 위해, 제한 엔도뉴클레아제에 대한 다중 절단 부위 (다중 클로닝 부위 - "mcs")를 갖는 서열 영역이 프로모터/인핸서 요소 다음에 삽입된다. 증폭가능한 선별 마커 디하이드로폴레이트 리덕타제는 "dhfr"로 표기되며, 선별 마커 네오마이신 포스포트랜스퍼라제는 "npt"로 표기된다.
도 2: 크리세투스 그리세우스의 분리된 성장 호르몬 유전자 영역
도 2는 총 362 bp로 네스티드 (nested) PCR을 사용하여 게놈성 CHO-DG44 (차이니즈 햄스터 난소 세포주; 크리세투스 그리세우스) DNA로부터 증폭된 성장 호르몬 유전자 영역의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 7)을 나타낸다. 화살표는 증폭 반응에 사용되는 유전자 특이적 프라이머 GH for2의 방향, 길이 및 위치를 나타내고, 프라이머 서열 자체는 이탤릭체로 강조된다 (서열번호 2). 성장 호르몬 유전자 서열의 정지 코돈 TAG는 밑줄친 굵은 문자로 강조되며, 3' 비해독 영역의 324 bp가 이어진다.
도 3: 성장 호르몬 유전자의 3' 비해독 영역의 정렬
이러한 정렬에서 크리세투스 그리세우스 성장 호르몬의 분리된 3' 비해독 영역 (서열번호 8)이 시리안 햄스터 메소크리세투스 아우라투스 (Mesocricetus auratus) (Genbank S66299), 무스 무스쿨루스 (Mus musculus) (Genbank Z46663), 라투스 노르베기쿠스 (Rattus norvegicus) (Genbank V01239) 및 보스 타우루스 (Bos taurus) (Genbank J00008)의 3' 비해독 성장 호르몬 영역과 비교된다. 음영은 씨.그리세우스 서열과 상이한 뉴클레오타이드를 나타낸다.
도 4: 크리세투스 그리세우스 성장 호르몬의 3' 비해독 영역의 HGH 결실 유도체
이러한 정렬에서, 단지 3' 비해독 영역을 포함하는 362 뉴클레오타이드 크리세투스 그리세우스 성장 호르몬 (HGH) 서열 (서열번호 7)의 결실 유도체가 도시된다. 모든 유도체는 5' 말단이 동일하나 이들의 3' 말단은 상이하다. 서열번호 8을 갖는 가장 긴 유도체는 324개 뉴클레오타이드로 이루어진다. 서열번호 9는 189개 뉴클레오타이드로 이루어지고, 서열번호 10은 단지 113개 뉴클레오타이드로 이루어진다. 성장 호르몬의 정지 코돈 TAG는 밑줄친 굵은 글자로 강조되고, 폴리아데닐화 단백질 복합체 AATAAA에 대한 잠재적 결합 부위는 이탤릭체로 강조된다.
도 5: HGH 성능을 평가하기 위한 재조합 발현 벡터
모든 재조합 발현 벡터는 CMV 인핸서 및 프로모터 요소 ("P/E")의 조절 하에 관심 유전자 "sICAM"를 암호화한다. sICAM 전사는 소 성장 호르몬 "BGH"의 3' 비해독 영역 (서열번호 12), SV40 후기 유전자 영역 "SV40L" (서열번호 11) 또는 차이니즈 햄스터 성장 호르몬 "HGH"의 3' 비해독 영역 (서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10)에 의해 종결된다. 후자의 크기 (bp)가 지시된다. 이들 폴리아데닐화 시그널은 "SfiI" 및 "XbaI"에 대해 제한 효소 위치에 의해 플랭킹된다. "P"는 프로모터 요소를 나타내고, "T"는 전사용 종결 시그널을 나타낸다. 각각의 전사 단위 내의 전사 개시의 위치 및 방향이 화살표로 지시된다. 증폭가능한 선별성 마커 디하이드로폴레이트 리덕타제가 "dhfr"로 약칭된다.
도 6: 일시적 형질감염에서 HGH 성능의 평가
2개의 독립적 시리즈로 CHO-DG44 세포를 발현 벡터 pJR106, pJR110 및 pJR131 (모두 CMV 인핸서/프로모터 하에 sICAM을 암호화한다)로 형질감염한다. 전사를 종결하기 위해, SV40 후기 폴리아데닐화 시그널 (서열번호 11), 소 성장 호르몬 BGH의 3' 비해독 영역 (서열번호 12) 또는 차이니즈 햄스터 성장 호르몬 HGH의 3' 비해독 영역 (서열번호 8)을 사용한다. 형질감염한지 48시간 후, 상청액 중의 sICAM 역가를 ELISA를 이용하여 측정한다. 형질감염 효율을 보정하기 위해, 세포를 플라스미드 pCMV-SEAP로 공동-형질감염하고, SEAP 활성을 측정한다. 폴리아데닐화 시그널로서 HGH를 사용한 역가는, BGH로의 종결과 비교하여, 21% 이하로 증가되고, SV40 후기로의 종결과 비교하여, 40% 이하로 증가된다.
도 7: IgG4/kappa 항체의 일시적 발현에서 HGH 성능의 평가
CHO-DG44 세포를 벡터 조합 pBID/IgG4 및 pBIN/kappa (n=6) (항체의 중쇄 (IgG4) 및 경쇄 (카파)가 차이니즈 햄스터 성장 호르몬 HGH의 324 bp 3' 비해독 영역 (서열번호 8)에 의해 종결된다)로 공동-형질감염한다. 대조군으로서 CHO-DG44 세포를 벡터 조합 pBID-B/IgG4 및 pBIN-B/kappa (n=6) (BGH 폴리아데닐화 시그널 (서열번호 12)을 포함한다)로 공동-형질감염한다. 상이한 폴리아데닐화 서열과 비교하여, 다양한 벡터의 유전적 구성은 동일하다. 48시간 후, 상청액 중의 항체 역가를 ELISA로 측정한다. 형질감염 효율을 보정하기 위해, 세포를 플리스미드 pCMV-SEAP로 공동-형질감염하고, SEAP 활성을 측정한다. 폴리아데닐화 시그널로서 HGH를 사용한 역가는 BGH 폴리아데닐화 시그널에 대한 것보다 평균 35% 더 높다.
도 8: 일시적 형질감염에서 상이한 HGH 결실 변이체의 시험
2개의 독립적 시리즈로 CHO-DG44 세포를 발현 벡터 pJR131, pJR134 및 pJR135 (모두 CMV 인핸서/프로모터 하에 sICAM을 암호화한다)로 형질감염한다. 전사를 종결하기 위해, 차이니즈 햄스터 성장 호르몬 HGH의 3' 비해독 영역의 324 bp (서열번호 8), 189 bp (서열번호 9) 또는 113 bp (서열번호 10)를 사용한다. 모든 변이체는 동일한 5'를 갖지만 3' 말단이 상이하다. 상이한 폴리아데닐화 서열과 비교하여, 다양한 벡터의 유전자 구성은 동일하다. 형질감염한지 48시간 후, 상청액 중의 sICAM 역가를 ELISA를 이용하여 측정한다. 형질감염 효율을 보정하기 위해, 세포를 플라스미드 pCMV-SEAP로 공동-형질감염하고, SEAP 활성을 측정한다. 324 bp HGH 서열을 포함하는 벡터로 형질감염된 세포와 비교하여, 189 bp 및 113 bp HGH 결실 돌연변이체를 포함하는 벡터로 형질감염된 세포는 sICAM 발현 수준에 있어서 각각 23% 및 78%의 감소를 나타낸다.
도 9: HGH를 사용한 안정한 형질감염 세포에서의 고수준 단백질 발현
도 9에서는 생물반응기 또는 진탕 플라스크에서 수행된 유가식 공정에서 IgG1, IgG2 및 IgG4 항체 또는 IgG1 및 IgG2 Fc 융합 단백질을 발현하는 안정하게 형질감염된 CHO-DG44 세포 클론 또는 세포 풀의 비생산성 및 역가가 요약된다. 비생산성은 10 내지 45 pg/세포/일의 범위이고, 역가는 2.1 내지 6.3 g/L의 범위이다. 다양한 단백질의 발현을 위해 사용되는 벡터의 유전적 구성을 동일하다. 모두 관심 유전자의 전사를 종결하기 위해 폴리아데닐화 시그널로서 차이니즈 햄스터 성장 호르몬 (서열번호 8)의 324 bp 3' 비해독 영역을 포함한다. 형질감염한지 2일 후, DHFR- 및 NPT-기초 선별 후, 배양 배지에 100 nM 및 800 nM MTX를 첨가하여 2회의 연속적인 DHFR-매개된 유전자 증폭 단계를 수행함으로써 안정한 세포 풀을 선별한다. 희석 클로닝 또는 96웰 플레이트의 웰로의 단일 세포의 FACS-기초된 침착에 의해 단일 세포 클론을 수득한다.
일반적 양태인 "포함하는"은 보다 구체적인 양태 "이루어진"을 포함한다. 또한, 단수 및 복수 형태는 제한적으로 사용되지 않는다.
본 발명은 신규 조절 요소, 및 이종 유전자 생성물, 바람직하게는 생물약제학적으로 관련된 폴리펩타이드 또는 단백질의 고발현을 가능하게 하는 포유동물 세포주를 제조 및 선별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 주로 차이니즈 햄스터 (크리세투스 그리세우스)의 성장 호르몬으로부터 분리된 신규한 폴리아데닐화 시그널의 이용에 기초한다. 놀랍게도, HGH (서열번호 8)로 불리는 이러한 신규한 동정된 폴리아데닐화 시그널이 강력한 폴리아데닐화 시그널 BGH 및 SV40 후기를 능가하여 생산자 세포의 보다 높은 생산성을 이끈다는 것이 밝혀졌다.
본 발명에서 사용되는 용어는 하기의 의미를 갖는다.
용어 "폴리아데닐화 시그널", "폴리아데닐화 부위", "폴리A 시그널", "폴리A 부위" 또는 "종결 시그널" 또는 "터미네이터"는 시그널 서열 내의 AAUAAA 서열에 대한 폴리아데닐화 단백질 복합체의 결합을 지시하는 3'UTR 내의 뉴클레오타이드 서열을 언급한다. 복합체는 AAUAAA 서열에 대해 약 14 내지 30개 뉴클레오타이드 다운스트림의 mRNA를 절단하는 엔도뉴클레아제 및 절단된 3' 말단에 일렬의 약 100 내지 200개 아데닌 뉴클레오타이드 (폴리A 테일)를 전사후 (post-transcriptionally) 삽입하는 폴리머라제를 포함한다. 폴리A 테일은 안정성, 해독 효율 및 핵으로부터 세포질로의 수송을 포함하여 mRNA 대사의 다양한 양상에 영향을 끼치는 것으로 믿어진다. 전형적으로, 폴리아데닐화 시그널은 절단 및 폴리아데닐화 부위를 플랭킹하는 2개의 인지 요소: 절단 부위에 대해 약 14 내지 30개 뉴클레오타이드 업스트림의 고도로 보존된 AAUAAA 서열 및 AAUAAA 서열에 대해 약 20 내지 50개 뉴클레오타이드 다운스트림의 저조하게 보존된 G/U- 또는 U-풍부 영역으로 이루어진다. 이들 2개의 요소 사이의 절단은 통상 A 잔기의 3'측에 있다. 다양한 폴리아데닐화 시그널, 예를 들어 tk polyA [참조: Cole et al., Mol. Cell Biol., 5, 2104 - 2113, 1985], SV40 후기 [참조: Schek et al., Mol. Cell Biol. 12, 5386 - 5393, 1992] 및 초기 폴리A 또는 BGH 폴리A [참조: 미국특허 5,122,458]이 공지되어 있다.
폴리아데닐화 시그널에서 상술된 AAUAAA 서열이 바람직하나, mRNA의 폴리아데닐화를 시그널링할 수 있는 한 AAUAAA에 대해 상동성을 갖는 다른 헥사뉴클레오타이드 서열로 치환될 수 있다. 상동성 헥사뉴클레오타이드 서열의 예는 AAAAAA, AUUAAA, AAUAUA, AAUAAU, UAUAAA, AAUUAA, AAUAAG, AGUAAA, GAUAAA, AAUGAA, AAUAGA, AAGAAA, ACUAAA, CAUAAA, AAUCAA, AACAAA, AAUCAA, 및 AAUAAC를 포함한다. 따라서, 하나의 양태에서, HGH 폴리아데닐화 시그널은, 이들 헥사뉴클레오타이드가 mRNA의 폴리아데닐화를 시그널링할 수 있는 한, AAAAAA, AUUAAA, AAUAUA, AAUAAU, UAUAAA, AAUUAA, AAUAAG, AGUAAA, GAUAAA, AAUGAA, AAUAGA, AAGAAA, ACUAAA, CAUAAA, AAUCAA, AACAAA, AAUCAA, 및 AAUAAC로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 헥사뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
폴리아데닐화 시그널은 또한 "격리자 (insulator)" 또는 "격리 서열 (insulating sequence)"로서도 사용될 수 있다. 격리 서열은 이웃하는 유전자 서열의 상호작용 또는 방해를 차단하는 DNA 절편이다. 예를 들어, 격리자는 이웃하는 유전자의 프로모터 또는 인접한 뉴클레오타이드 서열에 있는 가성 (spurious) 프로모터로부터의 전사 판독 통과를 감소시킬 수 있다. 또는, 이는 격리 서열의 한측에 있는 인핸서와 격리 서열의 다른 한측에 있는 이웃 유전자의 프로모터의 상호작용을 차단한다. 본 발명에서 격리 서열의 결정적 특징은 업스트림 또는 다운스트림의 간섭 유전자 요소의 영향으로부터 조절 요소에 작동가능하게 연결된 정의된 전사 단위를 격리시키거나 보호하는 능력이다. 본 발명의 취지 상, 격리 서열은 (잠재적인) 간섭 유전자 서열과 격리될 전사 단위의 조절 서열 사이에 위치된다. 격리 서열은 하나 이상의 카피로 전사 단위의 한측 또는 양측에 놓일 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 격리 서열은 폴리아데닐화 시그널이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 폴리아데닐화 서열은 HGH 폴리아데닐화 서열이다.
또한, HGH 폴리아데닐화 서열의 작용성 유도체, 예를 들어 서브단편 또는 서브서열, 및 예를 들어 치환, 삽입, 부가 및/또는 결실에 의해 변형된 완전한 서열 또는 이의 서브단편의 작용성 돌연변이체/변이체를 사용할 수 있다. 상응하는 서브절편 또는 서브서열, 돌연변이체 또는 변이체가 하기에서는 "변형된 터미네이터" 또는 "유도체"로도 불린다.
"변형된 터미네이터" 또는 "유도체"는 서브단편 또는 서브서열 및 작용성 돌연변이체/변이체를 포함하는 서열번호 8의 작용성 유도체이며, 바람직하게는 서열번호 8에 있는 뉴클레오타이드 서열로 얻어진 발현 수준과 필적하게 관심 생성물의 발현 수준을 유도한다. 작동가능하게 연결된 리포터 유전자의 발현 수준이 경쟁적 리포터 유전자 검정으로 서열번호 8로 얻어진 발현 수준의 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 및 가장 바람직하게는 적어도 100%인 경우, 변형된 터미네이터가 본 발명의 취지에 유용한 것으로 판명된다. 햄스터 성장 호르몬 폴리아데닐화 시그널의 야생형 서열 서열번호 8과 최소한의 서열 상동성 또는 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 97%의 상보적 서열을 갖고 경쟁적 리포터 유전자 검정에서 상응하는 발현 수준을 이끄는 변형된 터미네이터가 특히 바람직하다.
상응하는 경쟁적 "리포터 유전자 검정"에서, 참조 서열 서열번호 8을 포함한 시험될 터미네이터 단편은 리포터 유전자의 다운스트림에 클로닝된다. 이러한 리포터 유전자는, 예를 들어 루시퍼라제, 분비되는 알칼리성 포스파타제 또는 녹색 형광 단백질 (GFP)을 암호화한다. 달리, 다른 폴리펩타이드 또는 단백질, 예를 들어 항체 또는 sICAM이 리포터 유전자로서 사용될 수 있다. 이어서, 이들 제작물은 형질감염에 의해 시험 세포, 예를 들어 CHO-DG44로 도입되고, 예를 들어 리포터 유전자의 단백질 함량을 측정함으로써 리포터 유전자의 발현 수준에 대한 문제의 변형된 터미네이터의 영향이 측정된다. 상응하는 시험이 본 발명의 실시예 2, 3 및 4에 기술되어 있다.
바람직한 HGH 폴리아데닐화 시그널은 서열번호 8의 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 9의 서열을 포함하는 이의 서브서열이다. 다른 양태에서, 폴리아데닐화 시그널은 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10과 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 뉴클레오타이드 서열이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 2개의 서열은, 뉴클레오타이드 서열이 적어도 75%, 바람직하게는 80%, 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 경우, 서열 동일성 또는 상동성을 갖는다. 또한, 실질적인 동일성은, 핵산 서열이 엄격한 조건 하에서 쇄의 상보체에 하이브리드화할 때도 존재한다.
본원에서 사용되는 용어 "엄격한 조건 하에서 하이브리드화"는 당업자에게 공지된 하이브리드화 및 세척에 대한 조건을 기술한다. 일반적으로, 엄격 조건은 규정된 이온 세기 및 pH에서 특정 서열에 대한 열적 융점 (Tm)보다 약 5 내지 10℃ 낮도록 선택된다. Tm은 (규정된 이온 세기, pH 및 핵산 농도 하에서) 표적물에 상보적인 프로브의 50%가 평형 상태에서 표적 서열에 하이브리드화하는 온도이다. 엄격 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M 나트륨 이온 농도 (또는 다른 염)이고, 온도가 짧은 프로브 (예: 10 내지 약 50개 뉴클레오타이드)에 대해서는 적어도 약 30℃, 긴 프로브 (예: 약 50개 뉴클레오타이드 초과)에 대해서는 적어도 약 60℃이다. 예시적인 엄격 조건은 5xSSC를 갖는 하이브리드화 완충액 중 60 내지 65℃에서의 하이브리드화 및 42℃에서 0.2xSSC/0.1% SDS로의 세척을 포함한다. 양성 하이브리드화 시그널은 배경 하이브리드화 이상으로 적어도 2배이다.
햄스터 성장 호르몬의 폴리아데닐화 서열 및 변형된 터미네이터 (이는 또한, 예를 들어 서열번호 7의 분리된 HGH 서열 또는 이의 선택된 단편의 업스트림 또는 다운스트림에 천연 발생 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다)는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 표준 기술을 이용하여 서열 또는 상동성 서열에 대해 알고 있는 당업자에 의해 수득될 수 있으며, 적합한 방법이 본원의 실시예 1에도 기술되어 있다. 서열번호 7에 기술된 서열로부터 출발하여, 적합한 단편이 선택될 수 있으며, 이러한 단편의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프로브가 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 종류의 프로브는, 예를 들어 햄스터 게놈의 라이브러리로부터, 예를 들어 하이드리드화에 의해 햄스터 성장 호르몬 유전자 또는 이의 3' 비해독 영역 또는 이의 다른 단편을 클로닝하는데 사용될 수 있다. 상술된 리포터 유전자 검정을 이용하여, 당업자는 큰 노력 없이도 작용성 터미네이터 단편을 확인할 수 있으며, 본 발명의 목적을 위해 이를 이용할 수 있다. 3' 비해독 영역 또는 이의 특정 단편은 게놈 DNA 또는 게놈 라이브러리로부터 상응하는 프라이머로 PCT 증폭시켜 수득될 수 있다. 또한, 3' 비해독 영역의 단편은 보다 큰 DNA 단편으로부터 제한된 엑소뉴클레아제 III 분해에 의해 수득될 수 있다. 이러한 DNA 분자는 또한 화학적으로 합성되거나 결합에 의해 화학적으로 합성된 단편으로부터 생성될 수 있다. 결실, 삽입, 부가 및 치환 돌연변이체가 부위-특이적 돌연변이유발, PCR-기본 돌연변이유발 기술 및/또는 당업자에게 공지된 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이체는 3, 6, 10, 20 또는 50 bp 이하의 위치에서 변경된다. 바람직하게는, 돌연변이체는 6 bp 위치에서 변경된다.
본원의 실시예 1에 기술되는 접근법과 유사한 접근법을 이용하여, 예를 들어 마우스, 래트 또는 시리안 햄스터 성장 호르몬 또는 다른 종의 성장 호르몬의 폴리아데닐화 시그널을 분리할 수 있다. 이들의 성능은 본원의 실시예 2, 3 또는 4에 기술되는 바와 같은 리포터 유전자 검정으로 시험될 수 있다. 햄스터 성장 호르몬 서열, 바람직하게는 3' 비해독 영역으로부터 유도되는 프로브를 사용하는 교차-하이브리드화에 의해, 다른, 바람직하게는 포유동물 종의 상응하는 상동성 유전자로부터 적합한 터미네이터 서열을 확인 및 분리하는 것도 가능하다. 적합한 기술은 당업자에게 공지되어 있다.
용어 "상동성 (homology)", "상동", "동일성 (identity)", "동일", "서열 동일성" 또는 "상동성 서열"은 상호교환적으로 사용된다. "상동성" 또는 "동일성"을 계산하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 서열 비교를 위해, 통상적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열은 최대로 일치되게 정렬된다. 최적 정렬을 위해 비교되는 핵산 서열 중 어느 하나에 갭이 도입될 수 있다. 2개의 서열 사이의 동일성 비율 (%)은, 갭의 수 및 2개 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수에 대한 함수이다. 서열 비교 및 2개의 서열 사이의 동일성 비율의 측정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 디폴트 프로그램 파라미터가 이용되거나 대체적 파라미터가 지정될 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은, 지정된 또는 디폴트 프로그램 파라미터에 기초하여, 참조 서열에 대한 시험 서열(들)의 동일성 비율 (%)을 계산한다. 동일성을 측정하는데 적합한 알고리즘에 대한 하나의 예가 BLAST 알고리즘 [참조: Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403 - 410, 1990; Gish et al., Nature Genetics 3, 266 - 272, 1993; Madden et al., Meth. Enzymol. 266, 131 - 141, 1996; Zhang et al., Genome Res. 7, 649 - 656, 1997; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389 - 3402, 1997]이다. 정렬 알고리즘에 대한 다른 컴퓨터화된 수행은 Wisconsin Genetics Software Package의 GAP, PILEUP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA이다. 그러나, 동일성 비율 (%)은 수동 정렬 및 육안 조사 및 계산에 의해서도 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 세포에서 핵산의 흡수, 증폭, 발현 또는 전달을 위한 천연 발생하거나 합성적으로 생성된 것, 예를 들어 플라스미드, 미니서클, 파지미드, 코즈미드, 인공적 염색체/미니-염색체, 박테리오파아지, 바이러스, 예를 들어 배큘로바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 박테리오파아지에 관한 것이다. 벡터를 제작하기 위한 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 다양한 공개문에 기술되어 있다. 특히, 프로모터, 인핸서, 종결 및 폴리아데닐화 시그널, 선별 마커, 복제 오리진 및 스플라이싱 시그널과 같은 작동 및 조절 성분의 기술을 포함하여 적합한 벡터를 제작하기 위한 기술이 당업자에게 공지되어 있다. 진핵세포 발현 벡터는 통상적으로 세균에서 벡터의 증폭을 용이하게 하는 원핵세포 서열, 예를 들어 복제 오리진 및 세균에서의 선별을 위한 항생제 내성 유전자를 포함할 것이다. 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 결합된 클로닝 부위를 포함하는 다양한 진핵세포 발현 벡터가 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있으며, 일부는 회사, 예를 들어 Stratagene (La Jolla, CA), Invitrogen (Carlsbad, CA), Promega (Madison, WI) 또는 BD Biosciences Clontech (Palo Alto, CA)로부터 구입할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태는 전사 종결 및 안정화를 위한 및/또는 격리 서열로서의 하나 이상의 HGH 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 관심 유전자를 암호화하는 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 또한, 관심 유전자 대신 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인지 서열을 통해 관심 유전자의 클로닝을 가능하게 하는 단지 다중 클로닝 부위만을 갖는 전사 종결 및 안정화용 및/또는 격리 서열로서의 HGH 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드 서열도 본 발명에 따라 바람직하다.
용어 "프로모터"는 이에 작동가능하게 연결된 유전자 또는 서열의 전사를 가능하게 하고 조절하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 프로모터는 RNA 폴리머라제를 결합하기 위한 인지 서열 및 전사를 위한 개시 부위 (전사 개시 부위)를 포함한다. 특정 세포 유형 또는 숙주 세포에서 바람직한 서열을 발현하기 위해서, 적합한 작용성 프로모터가 선택되어야 한다. 다양한 상이한 공급원으로부터의 구성적, 유도성 및 억제성 프로모터를 포함한 많은 프로모터가 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있고 (GenBank와 같은 데이터베이스에서 확인되며), 분리된 요소로서 또는 시판 공급원 (예: ATCC와 같은 기탁기관 및 다른 시판 공급원) 또는 개별 공급원으로부터의 폴리뉴클레오타이드 서열 내에 클로닝된 요소로서 이용가능하다. 유도성 프로모터에서, 프로모터의 활성은 시그널에 반응하여 증가되거나 감소될 수 있다. 예를 들어, 테트라사이클린 오퍼레이터 서열 (tetO)을 포함하는 테트라사이클린 (tet) 프로모터는 테트라사이클린-조절되는 트랜스활성화제 단백질 (tTA)에 의해 유도될 수 있다. tTA의 tetO에의 결합은 tet의 존재 하에서 억제된다. 다른 유도성 프로모터의 예는 jun, fos, 메탈로티오네인 및 열 쇼크 프로모터이다. 진핵세포에서의 고발현에 특히 적합한 프로모터 중에는, 예를 들어 햄스터의 유비퀴틴/S27a 프로모터 (WO 97/15664), SV40 초기 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터, 라우스 사코마 바이러스(Rous Sarcoma Virus)의 긴 말단 반복 영역, 사람 사이토메갈로바이러스 (CMV)의 초기 프로모터가 있다. 다른 이종 포유동물 프로모터의 예는 액틴, 면역글로불린 또는 열 쇼크 프로모터(들)이다.
상술된 프로모터는 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 상응하는 이종 프로모터는 발현 카세트에서 전사 활성을 증가/조절하기 위해서 다른 조절 서열에 작용가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 전사 활성을 증가시키기 위해 인핸서 서열에 작용가능하게 결합될 수 있다. 이를 위해, 하나 이상의 인핸서 및/또는 수개 카피의 인핸서 서열, 예를 들어 CMV 또는 SV40 인핸서가 사용될 수 있다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 발현 벡터는 하나 이상의 인핸서/인핸서 서열, 바람직하게는 CMV 또는 SV40 인핸서를 포함한다.
용어 "인핸서"는 프로모터의 활성에 대해 시스 위치에서 작용하여 이러한 프로모터에 작용가능하게 연결된 유전자 또는 암호화 서열의 전사를 자극하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 프로모터와는 달리, 인핸서의 효과는 위치 및 배향에 무관하며, 따라서 이들은 전사 단위 앞 또는 뒤, 인트론 내 또는 심지어는 암호화 영역 내에 위치될 수 있다. 인핸서는 전사 단위에 바로 인접한 위치 및 프로모터로부터 상당히 먼 위치 모두가 가능하다. 또한, 프로모터와 물리적 및 작용가능하게 겹칠 수 있다. 당업자는, 독립적 요소로서 또는 (예를 들어, ATCC에 기탁되거나 시판 및 개별 공급원으로부터의) 폴리뉴클레오타이드 서열 내에 클로닝된 요소로서 이용가능한, 다양한 공급원으로부터의 (GenBank와 같은 데이터뱅크에 기탁된, 예를 들어 SV40 인핸서, CMV 인해서, 폴리오마 인핸서, 아데노바이러스 인핸서) 많은 인핸서에 대해 알고 있을 것이다. 또한, 다수의 프로모터 서열은 빈번히 사용되는 CMV 프로모터와 같은 인핸서 서열을 포함한다. 사람 CMV 인핸서는 지금껏 확인된 가장 강력한 인핸서 중의 하나이다. 유도성 인핸서에 대한 하나의 예는 메탈로티오네인 인핸서이며, 이는 글루코코르티코이드 또는 중금속에 의해 자극될 수 있다.
"전사-조절 요소"는 통상적으로 발현될 유전자 서열의 업스트림인 프로모터, 전사 개시 및 종결 부위 및 폴리아데닐화 시그널을 포함한다.
용어 "전사 개시 부위"는 일차 전사체, 즉 mRNA 전구체로 삽입되는 제1 핵산에 상응하는 제작물에 있는 핵산을 언급한다. 전사 개시 부위는 프로모터 서열과 겹칠 수 있다.
용어 "전사 종결 부위"는, RNA 폴리머라제가 전사를 종결하게 유도하는, 통상적으로 관심 유전자 또는 전사될 서열의 스트레치의 3' 말단에 있는 뉴클레오타이드 서열을 언급한다.
"전사 단위", "발현 단위" 또는 "발현 카세트"는 전사될 하나 이상의 유전자를 포함하는 벡터, 제작물 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 내의 영역을 정의하며, 이 절편에 포함된 유전자는 서로 작동가능하게 결합된다. 이들은 단일 프로모터로부터 전사되고, 전사는 하나 이상의 폴리아데닐화 시그널에 의해 종결된다. 그 결과, 상이한 유전자가 적어도 전사적으로 연결된다. 하나 초과의 단백질 또는 생성물이 각각의 전사 단위 (다중시스트론성 전사 단위)로부터 전사 및 발현될 수 있다. 각각의 전사 단위는 이 단위에 포함된 임의의 선택된 서열의 전사 및 해독에 필요한 조절 요소를 포함할 것이다. 또한, 각각의 전사 단위는 동일하거나 상이한 조절 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 각각의 전사 단위는 동일한 터미네이터를 포함할 수 있다. IRES 요소 또는 인트론이 전사 단위 내 유전자의 작용적 연결을 위해 사용될 수 있다. 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 하나 초과의 전사 단위를 포함할 수 있다.
"해독 조절 요소"는 발현될 각각의 개별 폴리펩타이드를 위한 해독 개시 부위 (AUG), 정지 코돈 및 폴리A 시그널을 포함한다. 내부 리보좀 진입 부위 (IRES)가 일부 제작물에 포함될 수 있다. IRES는 하기와 같이 정의된다. 발현을 최적화하기 위해서, 잠재적으로 여분의 부적합한 대체적 해독 개시 코돈 또는 전사 또는 해독 수준에서 발현을 방해하거나 감소시킬 수 있는 다른 서열을 제거하도록 발현될 핵산 서열의 5'- 및/또는 3'-비해독 영역을 제거, 추가 또는 변경시키는 것이 필요할 수 있다. 컨센서스 리보좀 결합 부위 (코작 서열 GCCGCCACCAUGG (서열번호 13); AUG는 출발 코돈을 구성한다)가 해독 및 따라서 발현을 증진시키기 위해 출발 코돈의 바로 업스트림에 삽입될 수 있다. 이러한 리보좀 결합 부위 주위의 증가된 A/U 함량은 보다 효과적인 리보좀 결합을 추가로 증가시킨다. 분비되는 폴리펩타이드를 생성하기 위해서, 관심 유전자는 통상적으로 새로이 합성되는 폴리펩타이드가 폴리펩타이드의 분비를 위해 보내질 수 있는 ER 막으로 향하게 하고 이를 통과시키는 리더 또는 시그널 펩타이드를 암호화하는 시그널 서열을 포함한다. 리더 또는 시그널 펩타이드는 보편적이지 않지만 종종 분비되는 단백질의 아미노 말단에 위치하고 단백질이 ER 막을 가로지른 후 시그널 펩티다제에 의해 절단된다. 유전자 서열은 필수적이지 않지만 일반적으로 그 자신의 시그널 펩타이드 서열을 포함할 것이다. 고유 시그널 펩타이드 서열이 부재한 경우, 이종 시그널 펩타이드 서열이 선택되는 서열에 융합될 수 있다. 또는, 고유 시그널 펩타이드 서열이 이종의 것으로 대체될 수 있다. 다수의 시그널 펩타디드 서열이 당업자에게 공지되어 있으며, GenBank 및 EMBL과 같은 서열 데이터뱅크에 기탁되어 있다.
"내부 리보좀 진입 부위" 또는 "IRES"는 IRES의 5'에 있는 유전자와 무관하게 해독 개시를 작용가능하게 촉진하여 2개의 시스트론 (개방 판독 프레임)이 동물 세포에서 단일 전사체로부터 해독될 수 있게 하는 서열을 기술한다. IRES는 이의 바로 다운스트림인 개방 판독 프레임의 해독을 위한 독립적인 리보좀 진입 부위이다. 폴리시스트론성일 수 있는, 즉 mRNA로부터 연속적으로 해독되는 수개의 상이한 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 세균성 mRNA와는 다르게, 동물 세포의 대부분의 mRNA는 모노시스트론성이고, 단지 하나의 폴리펩타이드의 합성을 암호화한다. 진핵세포에서 폴리시스트론성 전사체를 사용하는 경우, 해독은 5'most 해독 개시 부위로부터 개시하고, 제1 정지 코돈에서 종결하며, 전사체가 리보좀으로부터 방출되어 mRNA 내의 단지 제1의 암호화된 폴리펩타이드만이 해독될 것이다. 진핵세포에서, 전사물 내의 제2 또는 후속 개방 판독 프레임에 작동가능하게 결합된 IRES를 갖는 폴리시스트론성 전사체는 다운스트림 개방 판독 프레임의 연속 해독을 가능하게 하여 동일 전사체에 의해 암호화되는 2개 이상의 폴리펩타이드를 생성한다. IRES는 길이가 다양하고, 예를 들어 뇌심근염 바이러스 (EMCV), 피코나바이러스 (예: FMDV), 폴리오 바이러스 (PV) 또는 C형 간염 바이러스 (HCV)와 같이 공급원이 다양할 수 있다. 다양한 IRES 서열 및 벡터 제작에 있어 이들의 이용이 기술되어 있으며 당업자에게 널리 공지되어 있다. 다운스트림 암호화 서열은 다운스트림 유전자의 발현에 부정적으로 영향을 끼치지 아니할 임의의 거리에서 IRES의 3' 말단에 작동가능하게 결합된다. IRES와 다운스트림 유전자의 개시부 사이의 최적 또는 허용가능한 거리는 거리를 달리하면서 거리의 함수로서 발현을 측정함으로써 용이하게 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "인트론"은 다양한 길이의 비-암호화 핵산 서열을 말하며, 통상적으로 많은 진핵 유전자 내에 존재하며, 인트론의 어느 하나의 말단에 또는 근처에 고도로 보존된 서열이 필요한 스플라이싱 프로세스에 의해 새로이 전사된 mRNA 전구체로부터 제거된다. 일반적으로, 스플라이싱의 프로세스는 인트론의 5' 및 3' 말단이 정확히 절단되고 mRNA의 생성 말단이 정확히 결합되어 단백질 합성을 위한 적합한 판독 프레임을 갖는 성숙한 mRNA가 생성되는 것을 필요로 한다. 엑손-인트론- 및 인트론-엑손-경계를 바로 둘러싸는 서열을 의미하는 많은 스플라이스 공여자 및 수용자 부위가 특징지어졌으며, 기술되어 있고, 당업자에게 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "관심 유전자", "목적 서열", "관심 폴리뉴클레오타이드" 또는 "목적 유전자"는 동일한 의미를 가지며, 관심 생성물을 암호화하는 임의의 길이의 폴리뉴클레오타이드 서열을 말한다. 선택된 서열은 전체 길이 또는 절단된 유전자, 융합 또는 태그화된 (tagged) 유전자일 수 있으며, cDNA, 게놈 DNA 또는 DNA 단편일 수 있다. 이는 고유 서열, 즉 천연 발생 형태(들)일 수 있거나, 필요한 경우, 돌연변이 되거나 달리는 변형될 수 있다. 이들 변형은 선택된 숙주 세포, 사람화 또는 태그화에서의 코돈 사용을 최적화하기 위한 코돈 최적화를 포함한다. 또한, 이는 시스-작용 부위, 예를 들어 (잠적(cryptic)) 스플라이스 공여자, 수용자 부위 및 분지 포인트, 폴리아데닐화 시그널, TATA-박스, 카이 (chi)-부위, 리보좀 진입 부위, 반복 서열, 이차 구조물 (예: 스템 루프), 전사 인자 또는 다른 조절 인자에 대한 결합 부위, 제한 효소 부위 등의 제거 또는 추가를 포함할 수 있으며, 단지 소수의 예 (단, 제한적이지 않음)를 제공한다. 선택된 서열은 분비, 세포질, 핵, 막 결합 또는 세포 표면 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
본 발명의 범위에서, 용어 "작용적 결합", "작용가능하게 결합된" 또는 "작동가능하게 결합된"은 2개 이상의 해산 서열 또는 서열 요소들이 이들의 의도된 방식대로 작용하도록 위치되는 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터/인핸서 또는 터미네이터는 시스 위치에 있는 결합된 유전자 서열의 전사를 조절 또는 변형할 수 있는 경우, 암호화 유전자 서열에 작용가능하게 결합된다. 일반적으로 (필연적이지 않음), 작용가능하게 결합된 DNA 서열은 인접하며, 2개의 폴리펩타이드 암호화 영역을 결합하는 것이 필요하거나 분비 시그널 펩타이드의 경우, 인접하고 판독 프레임에 있다. 그러나, 작동가능하게 결합된 프로모터가 일반적으로 업스트림에 위치되거나 작동가능하게 결합된 터미네이터가 일반적으로 암호화 서열의 다운스트림에 위치되더라도, 반드시 이와 인접하는 것은 아니다. 인핸서는 암호화 서열의 전사를 증가시키는 한, 인접할 필요는 없다. 이에, 인핸서는 암호화 서열의 업스트림 또는 다운스트림 및 심지어는 다소의 거리에 위치될 수 있다. 폴리아데닐화 부위는 전사가 암호화 서열을 통해 폴리아데닐화 시그널로 진행하는 방식으로 암호화 서열의 3' 말단에 위치되는 경우, 암호화 서열에 작동가능하게 결합된다. 결합은 당해 기술 분야에서 공지된 재조합 방법, 예를 들어 PCT 방법, 적합한 제한 부위에서의 연결 또는 어닐링에 의해 달성된다. 적합한 제한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 링커 또는 어댑터가 통상의 실시에 따라 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "핵산", "핵산 서열", "뉴클레오타이드 서열", "폴리뉴클레오타이드", "폴리뉴클레오타이드 서열" 또는 "DNA 서열"은 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편 또는 부분 및 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 언급하며, 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있고, 센스 또는 안티센스 쇄를 나타낼 수 있다. 서열은 비암호화 서열, 암호화 서열 또는 이둘의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 당업자에게 널리 공지된 표준 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
용어 "암호화하는 (encoding 또는 coding)"은, 정의된 서열의 뉴클레오타이드(즉, rRNA, tRNA, 또는 다른 RNA 분자) 또는 아미노산 및 이로부터 생기는 생물학적 특성을 갖는 생물학적 과정의 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용할 핵산 중의 뉴클레오타이드의 특정 서열, 예를 들어 염색체 중의 유전자 또는 mRNA의 고유한 특성을 언급한다. 따라서, 목적하는 단백질이 mRNA의 전사 및 후속 해독에 의해 세포 또는 또 다른 생물학적 시스템에서 생성되는 경우, 유전자는 단백질을 암호화한다. 유전자 또는 cDNA의 암호화 쇄 (뉴클레오타이드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 통상 데이터뱅크, 예를 들어 EMBL 또는 GenBank의 서열 목록에서 제공된다) 및 비암호화 쇄 (전사를 위한 주형으로서 사용된다) 모두 상기 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 암호화하는 것으로 언급될 수 있다. 단백질을 암호화하는 핵산은 상이한 뉴클레오타이드 서열을 가지나 유전자 코드의 축퇴 때문에 단백질의 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 핵산을 포함한다. 단백질을 암호화하는 핵산 및 뉴클레오타이드 서열은 인트론을 포함할 수 있다. 서열 목록에서, 서열은 RNA 서열보다는 DNA로 표시된다. 예를 들어, DNA로서 표시되는 경우, 출발 코돈은 AUG보다는 ATG로 표시된다.
본 발명에서 용어 "cDNA"는 역전사 및 통상적으로 mRNA 또는 유전자에 의해 생성되는 다른 RNA의 제2-쇄 합성에 의해 생성되는 데옥시리보핵산을 언급한다. 이본쇄인 경우, cDNA 분자는 암호화 또는 센스 및 비암호화 또는 안티센스 쇄 모두를 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "발현"은 숙주 세포에서 이종 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 언급한다. 숙주 세포에서 목적 생성물의 발현 수준은 세포에 존재하는 상응하는 RNA 또는 mRNA의 양 또는 선택된 서열에 의해 암호화되는 목적 폴리펩타이드의 양을 기준으로 하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 선택된 서열로부터 전사되는 mRNA는 노던 블롯 하이브리드화, 리보뉴클레아제 RNA 보호, 세포성 RNA에 대한 원위치 하이브리드화 또는 PCR에 의해 정량화될 수 있다. 선택된 서열에 의해 암호화되는 단백질은 다양한 방법, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯팅, 방사선면역검정, 면역침전, 단백질의 생물학적 활성 검정, 또는 단백질의 면역염색후 FACS 분석 PCR에 의해 정량화될 수 있다.
용어 "폴리펩타이드"는 "아미노산 잔기 서열" 또는 용어 "단백질"과 상호교환적으로 사용되며, 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 언급한다. 또한, 이들 용어는 반응을 통해 해독후 변형되는 단백질을 포함하며, 이로 제한됨이 없이, 글리코실화, 당화, 아세틸화, 포스포릴화, 산화, 아미드화 또는 단백질 프로세싱을 포함한다. 변형 및 변화, 예를 들어 다른 단백질에의 융합, 아미노산 서열 치환, 결실 또는 삽입이 폴리펩타이드의 구조에 만들어지고 분자는 이의 생물학적 활성을 유지한다. 예를 들어, 특정 아미노산 서열 치환이 폴리펩타이드 또는 이의 기본 핵산 암호화 서열에 만들어질 수 있으며, 유사한 특성을 갖는 단백질이 수득될 수 있다. 아미노산 변형은, 예를 들어 이의 기본 핵산 서열에서 부위-특이적 돌연변이유발 또는 폴리머라제 연쇄 반응 매개된 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있다. 또한, 용어 "폴리펩타이드"는, 예를 들어 면역글로불린 성분, 예를 들어 Fc 성분 및 성장 인자, 예를 들어 인터류킨으로 이루어진 융합 단백질을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 폴리클로날, 모노클로날, 이특이적, 다특이적, 사람, 사람화, 또는 키메릭 항체, 단일쇄 항체, 항체의 항원-결합 단편 (예: Fab 또는 F(ab')2 단편), 디설파이드 결합된 Fv 등을 포함한다. 이러한 항체는 화학적 합성, 재조합 또는 유전자도입 수단, 세포 (에: 하이브리도마) 배양, 또는 다른 수단에 의해 생성될 수 있다.
Fab 단편 (단편 항원-결합 = Fab)은 인접한 불변 영역에 의해 함께 유지되는 양 쇄의 가변 영역으로 이루어진다. 이들은 통상의 항체로부터 프로테아제 분해에 의해, 예를 들어 파파인에 의해 형성될 수 있으나, 유사한 Fab 단편들이 유전자 조작에 의해 생성될 수 있다. 추가의 항체 단편은 펩신으로의 단백질분해 절단에 의해 제조될 수 있는 F(ab')2 단편을 포함한다.
유전자 조작 방법을 이용하여, 단지 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 경쇄의 가변 영역 (VL)로만 이루어진 단축된 항체 단편을 생성할 수 있다. 이들은 Fv 단편 (단편 가변 = 가변부의 단편)으로도 언급된다. 이들 Fv-단편은 불변 쇄의 시스테인에 의한 2개의 쇄의 공유 결합이 부족하기 때문에, Fv 단편은 종종 안정화된다. 예를 들어 10 내지 30개 아미노산, 바람직하게는 15개 아미노산의 짧은 펩타이드 단편에 의해 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 결합하는 것이 유리하다. 이러한 방식으로, 펩타이드 링커에 의해 결합된 VH와 VL로 이루어진 단일 펩타이드 쇄가 수득된다. 이러한 종류의 항체 단백질은 단일쇄-Fv (scFv)로 공지되어 있다. 이러한 종류의 scFv-항체 단백질의 예를 종래 기술로부터 알 수 있다.
최근 들어, 다량체 유도체로서 scFv를 제조하기 위한 다양한 전략이 개발되었다. 이는, 특히 개선된 약력학 및 생분배 특성 및 증가된 결합 활성 (avidity)를 갖는 재조합 항체를 제조하려는 것이다. scFc의 다량체화를 달성하기 위해서, scFv는 다량체화 도메인을 갖는 융합 단백질로서 제조된다. 다량체화 도메인은, 예를 들어 IgG 또는 코일드 코일 구조 (나선형 구조)의 CH3 영역, 예를 들어 루이신-지퍼 (Leucin - zipper) 도메인일 수 있다. 그러나, scFv의 VH/VL 영역 사이의 상호작용이 다량체화 (예: 디아바디, 트리바디 및 펜타바디)에 사용되는 전략들도 있다. 디아바디는 이가 동종이량체성 scFv 유도체를 의미한다. scFv 분자 내의 링커를 5 내지 10개 아미노산으로 단축시켜 쇄간 VH/VL 중첩이 발생하는 동종이량체를 형성한다. 디아바디는 디설파이드 브릿지의 삽입에 의해 추가로 안정화될 수 있다. 디아바디-항체 단백질의 예를 종래 기술로부터 알 수 있다.
미니바디는 이가의 동종이량체성 scFv 유도체를 의미한다. 이는 (예를 들어, IgG1으로부터 유도되는) 힌지 영역 및 링커 영역을 통해 scFv에 연결되는 이량체화 영역으로서 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 가장 바람직하게는 IgG1의 CH3 영역을 포함하는 융합 단백질로 이루어진다. 미니바디-항체 단백질의 예를 종래 기술로부터 알 수 있다.
트리아바디는 삼가의 동종삼량체성 scFv 유도체를 의미한다. VH-VL이 링커 서열 없이 직접적으로 융합된 scFv 유도체가 삼량체를 형성한다.
또한, 당업자는 이가, 삼가 또는 사가 구조를 갖고 scFv로부터 유도되는 소위 미니항체와 익숙할 것이다. 다량체화는 이량체, 삼량체 또는 사량체의 코일드 코일 구조에 의해 수행된다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 관심 유전자는 상술된 바람직한 폴리펩타이드 중의 임의의 것, 바람직하게는 모노클로날 항체, 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다.
"관심 폴리펩타이드", "관심 단백질" 또는 "관심 생성물"은 선택된 숙주 세포에서 발현될 수 있는 단백질, 폴리펩타이드, 이의 단편, 펩타이드, 융합 단백질을 포함한다. 목적하는 단백질은 예를 들어 항체, 효소, 사이토킨, 림포카인, 부착 분자, 수용체 및 이들의 유도체 또는 단편, 및 효능제 (agonist) 또는 길항제로서 작용하고/하거나 치료적 또는 진단적 이용을 갖는 임의의 다른 폴리펩타이드일 수 있다.
특히, 목적하는 단백질/폴리펩타이드 또는 관심 단백질은, 이로 제한됨이 없이, 예를 들어 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자, hGH, tPA, 사이토킨, 예를 들어 인터류킨 (IL), 예를 들어 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, 인터페론 (IFN) 알파, IFN 알파, IFN 감마, IFN 오메가 또는 IFN 타우, 종양 괴사 인자 (TNF), 예를 들어 TNF 알파 및 TNF 베타, TNF 감마, TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1, VEGF 및 나노바디이다. 또한, 에리트로포이에틴 또는 임의의 다른 호르몬 성장 인자 및 효능제 또는 길항제로 작용하고/하거나 치료적 또는 진단적 이용을 가질 수 있는 임의의 다른 폴리펩타이드도 포함된다. 본 발명에 따른 방법은 항체, 예를 들어 모노클로날, 폴리클로날, 다특이적 및 단일쇄 항체, 또는 이의 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및 Fc'-단편, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄, 가변 또는 초가변 영역, 및 Fv- 및 Fd-단편의 생성에도 유리하게 사용될 수 있다.
"관심 생성물"은 또한 안티센스 RNA, tRNA, rRNA, 리보단백질의 일부인 다른 RNA 또는 다른 조절 RNA일 수 있다.
본 발명의 방법은 진핵세포에서 수행될 수 있다. 세포 및 세포주는, 예를 들어 세포 배양물에 존재할 수 있으며, 이로 제한됨이 없이, 진핵세포, 예를 들어 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포를 포함한다. 예를 들어, 세포는 난모세포, 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포 또는 임의의 유형의 분화된 세포일 수 있다. 진핵세포가 포유동물 세포인 방법이 바람직하다. 포유동물 세포가 사람, 유인원, 쥐, 래트, 토끼, 햄스터, 염소, 소, 양 또는 돼지 세포인 방법이 더욱 바람직하다. 생물약제의 생성을 위한 바람직한 세포주 또는 "숙주 세포"는 사람, 마우스, 래트, 원숭이, 또는 설치류 세포주이다. 햄스터 세포, 바람직하게는 BHK21, BHK TK-, CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1, CHO-S 및 CHO-DG44 세포 또는 이러한 세포주의 유도체/자손이 더욱 바람직하다. CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1, CHO-S 및 BHK21이 특히 바람직하고, CHO-DG44 및 CHO-DUKX 세포가 더욱더 바람직하다. 또한, 쥐 골수종 세포, 바람직하게는 NS0 및 Sp2/0 세포 또는 이러한 세포주의 유도체/자손도 생물약제 단백질을 위한 생산 세포주로 공지되어 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 쥐 및 햄스터 세포의 예가 표 1에 요약되어 있다.
Figure 112010080774775-pct00001
숙주 세포는 혈청 비함유 조건 하에서, 임의로 동물 기원의 임의의 단백질/펩타이드가 비함유된 배지에서 확립, 적응 및 완전 배양되는 경우 가장 바람직하다. 시판 배지, 예를 들어 Ham's F12 (Sigma, Deisenhofen, Germany), RPMI-1640 (Sigma), 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM; Sigma), 최소 필수 배지 (MEM; Sigma), 이스코브 변형 둘베코 배지 (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA), CHO-S-SFMII (Invtirogen), 혈청-비함유 CHO 배지 (Sigma), 단백질-비함유 CHO 배지 (Sigma), EX-CELL 배지 (SAFC), CDM4CHO 및 SFM4CHO (HyClone)가 예시적인 적합한 영양 용액이다. 어떠한 배지도, 필요한 경우, 다양한 화합물, 예를 들어 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예: 인슐린, 트랜스페린, 표피 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자), 염 (예: 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 포스페이트), 완충제 (예: HEPES), 뉴클레오사이드 (예: 아데노신, 티미딘), 글루타민, 글루코즈 또는 다른 등가의 에너지원, 항생제, 미량 원소로 보충될 수 있다. 또한, 어떠한 다른 필요한 보충물도 당업자에게 공지된 적합한 농도로 포함될 수 있다. 본 발명에서 혈청-비함유 배지의 사용이 바람직하나, 적당량의 혈청으로 보충된 배지도 숙주 세포의 배양을 위해 사용될 수 있다. 선별가능한 유전자를 발현하는 유전적으로 변형된 세포의 성장 및 선별을 위해, 적합한 선별제가 배양 배지에 첨가된다.
유전적으로 변형된 세포, 재조합체 또는 유전자도입 세포를 생성하는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 발현 벡터를 사용한 진핵 숙주 세포의 "형질감염"은 당업자에게 널리 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 형질감염 방법은, 이로 제한됨이 없이, 리포좀-매개된 형질감염, 인산칼슘 공동-침전, 전기천공, 폴리양이온 (예: DEAE 덱스트란)-매개된 형질감염, 원형질체 융합, 미세주사 및 바이러스 감염을 포함한다. 바람직하게는, 형질감염은 안정한 형질감염이다. 특정 숙주 세포주 및 유형에서 이종 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드의 최적 형질감염 빈도 및 발현을 제공하는 형질감염 방법이 선호된다. 적합한 방법은 통상의 절차로 결정될 수 있다. 안정한 형질감염체를 위해, 제작물은 숙주 세포의 게놈 또는 인공적 염색체/미니-염색체에 삽입되거나 숙주 세포 내에서 안정하게 유지되도록 에피좀에 위치된다. 관심 생성물(들)을 발현하는 유전적으로 변형된 세포의 생성을 위해, 모든 필요한 이종 유전자가 단일 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에 모노시스트론성 또는 멀티시스트론성 전사 단위로 위치될 수 있다. 이러한 경우, 숙주 세포는 단일 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드 서열로 형질감염된다. 또한, 이종 유전자는 상이한 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에 위치될 수 있다. 이러한 경우, 숙주 세포는 모든 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드 서열과 함께 공동-형질감염되고/되거나 관심 유전자를 암호화하는 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드 서열로 연속해서 형질감염된다.
정의 상, 숙주 세포에 삽입되는 모든 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 모든 유전자 및 이에 의해 암호화된 각각의 단백질 또는 RNA는 숙주 세포에 대해 "이종, "이종 서열", "이종 유전자", "이종 암호화 서열", "도입유전자" 또는 "이종 단백질"로 언급된다. 도입되는 서열 또는 도입되는 유전자가 숙주 세포의 내인성 서열 또는 내인성 유전자와 동일한 경우에도 이러한 정의가 적용된다. 예를 들어, 햄스터 숙주 세포로 도입되는 햄스터 액틴 유전자가 정의 상 이종 유전자이다.
용어 "내인성"은 세포 또는 유기체에 천연적으로 포함되어 있는 것을 의미한다. 따라서, 내인성 유전자는 비조작된 야생형 세포의 게놈에서 발견되는 유전자이다.
용어 "선별 마커 유전자"는 유전자를 수반하는 세포가 상응하는 선별제의 존재 하에서 이에 대해 또는 이에 대항하여 특이적으로 선별되도록 하는 유전자를 언급한다. 실례로서, 항생제 내성 유전자로 형질전환된 숙주 세포가 상응하는 항생제의 존재 하에서 이에 대해 양성으로 선별되게 하고 비-형질전환된 세포는 선별 배양 조건 하에서 성장 또는 생존할 수 없는 항생제 내성 유전자가 양성 선별 마커 유전자로서 사용될 수 있다. 선별 마커는 양성, 음성 또는 이작용성일 수 있다. 양성 선별 마커는 숙주 세포에서 약물에 대한 내성을 부여하거나 대사작용 또는 이화작용 결함을 보상함으로써 마커를 수반하는 세포의 선별을 가능하게 한다. 이와는 대조적으로, 음성 선별 마커는 마커를 수반하는 세포가 선택적으로 제거되게 한다. 예를 들어, 마커로서 HSV-tk 유전자의 사용은 세포가 아사이클로비르 및 강사이클로비르와 같은 작용제에 민감하게 할 것이다. 증폭가능한 선별 유전자를 포함하여 본원에서 사용되는 선별 마커 유전자는, 암호화된 생성물이 선별가능한 특성을 보유하는 한, 재조합적으로 조작된 돌연변이체 및 변이체, 단편, 작용성 등가물, 유도체, 동족체 및 천연 선별 마커 유전자의 융합물을 포함할 것이다. 유용한 유도체는 일반적으로 선별가능한 특성과 연관된 선별 마커의 영역 또는 도메인과 실질적인 서열 유사성 (아미노산 수준에서)을 갖는다. 이작용성 (즉, 양성/음성) 마커를 포함하여 당업자에게 널리 공지된 다양한 마커 유전자가 기술되어 있다 [참조: WO 92/08796 및 WO 94/28143, 본원에 참조로 삽입됨]. 예를 들어, 진핵세포에 통상 사용되는 선별 유전자는 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제 (APH), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HYG), 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 티미딘 키나제 (TK), 글루타민 신테타제, 아스파라긴 신테타제에 대한 유전자, 및 네오마이신 (G418), 프로마이신, 히스티디놀 D, 블레오마이신 및 플레오마이신에 대한 내성을 암호화하는 유전자를 포함한다.
"선별가능한 증폭성 마커 유전자"는 통상 이러한 조건 하에서 진핵세포의 성장에 필요한 효소를 암호화한다. 예를 들어, 선별가능한 증폭성 마커 유전자는 이로 형질감염된 숙주 세포가 선별제인 메토트렉세이트 (MTX)의 존재 하에서 성장하는 경우 유전자가 증폭되는 DHFR을 암호화할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 임의의 방법에 따라 유전적으로 변형된 숙주 세포가 본 발명에 포함되며, 이때 선별가능한 증폭성 마커 유전자는, 예를 들어 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 글루타민 신테타제, CAD, 아데노신 데아미나제, 아데닐레이트 데아미나제, UMP 신테타제, IMP 5'-데하이드로게나제, 크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, HGPRTase, 티미딘 키나제, 티미딜레이트 신테타제, P 당단백질 170, 리보뉴클레오타이드 리덕타제, 아스파라긴 신테타제, 아르기노석시네이트 신테타제, 오르니틴 데카복실라제, HMG CoA 리덕타제, 아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제, 트레오닐-tRNA 신테타제 또는 Na+K+-ATPase의 기능을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다. 표 2에 열거된 예시적인 선별가능한 증폭성 마커 유전자의 검토를 위해, 문헌 [참조: Kaufman, Methods in Enzymology, 185, 537 - 566, 1990]을 참조한다.
하나의 특정한 선별가능한 마커 유전자는 퓨린의 생합성에 필요한 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)을 암호화하는 유전자이다. DHFR 유전자가 결여된 세포는 퓨린이 결여된 배지에서 성장할 수 없을 것이다. 따라서, 퓨린이 결여된 배지에서 성장하는 이러한 세포에서 유전자를 선별 및 증폭시키기 위한 우성 선별 마커로서 DHFR 유전자가 유용하다. DHFR 유전자와 함께 사용되는 선별제는 메토트렉세이트 (MTX)이다.
또 다른 선별 및/또는 증폭 마커는 글루타민 신테타제 (GS) 유전자이다. GS 유전자는 아미노산 글루타민의 합성에 필요한 글루타민 신테타제 효소를 암호화한다. GS 유전자가 결여되거나 낮은 내인성 GS 수준을 발현하는 세포는 글루타민-비함유 배지에서 성장할 수 없을 것이다. 따라서, GS 유전자는 글루타민-비함유 배지에서 성장하는 이러한 세포에서 유전자를 선별 및 증폭시키기 위한 우성 선별 마커로서 유용하다. GS 유전자와 함께 사용되는 선별제는 메티오닌 설폭시민 (MSX)이다.
선별가능한 증폭성 마커 유전자
선별가능한 증폭성
마커 유전자		 등록번호 선별제
디하이드로폴레이트 리덕타제 M19869 (햄스터)
E00236 (마우스)		 메토트렉세이트 (MTX)
메탈로티오네인 D10551 (햄스터)
M13003 (사람)
M11794 (래트)		 카드뮴
CAD (카바모일-포스페이트 신테타제:아스파테이트 트랜스카바밀라제:데하이드로오로타제) M23652 (햄스터)
D78586 (사람)		 N-포스포아세틸-L-아스파테이트
아데노신 데아미나제 K02567 (사람)
M10319 (마우스)		 Xyl-A- 또는 아데노신, 2'데옥시코포르마이신
AMP (아데닐레이트) 데아미나제 D12775 (사람)
J02811 (래트)		 아데닌, 아자세린, 코포르마이신
UMP 신타제 J03626 (사람) 6-아자우리딘, 피라조푸란
IMP 5'데하이드로게나제 J04209 (햄스터)
J04208 (사람)
M33934 (마우스)		 미코페놀산
크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 X00221 (이.콜라이) 미코페놀산+제한적 크산틴
돌연변이체 HGPRTase 또는 돌연변이체 티미딘 키나제 J00060 (햄스터)
M13542, K02581 (사람)
J00423, M68489 (마우스)
M63983 (래트)
M36160 (헤르페스바이러스)		 하이포크산틴, 아미노프테린, 및 티미딘 (HAT)
티미딜레이트 신테타제 D00596 (사람)
M13019 (마우스)
L12138 (래트)		 5-플루오로데옥시우리딘
P-당단백질 170 (MDR1) AF016535 (사람)
J03398 (마우스)		 다수 약물, 예를 들어 아드리아마이신, 빈크리스틴, 콜히친
리보뉴클레오타이드 리덕타제 M124223, K02927 (마우스) 아피디콜린
글루타민 신테타제 AF150961 (햄스터)
U09114, M60803 (마우스)
M29579 (래트)		 메티오닌 설폭시민 (MSX)
아스파라긴 신테타제 M27838 (햄스터)
M27396 (사람)
U38940 (마우스)
U07202 (래트)		 β-아스파틸 하이드록사메이트, 알비진, 5'아자시티딘
아르기니노석시네이트 신테타제 X01630 (사람)
M31690 (마우스)
M26198 (소)		 카나바닌
오르니틴 데카복실라제 M34158 (사람)
J03733 (마우스)
M16982 (래트)		 α-디플루오로메틸오르니틴
HMG-CoA 리덕타제 L00183, M12705 (햄스터)
M11058 (사람)		 콤팍틴
N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 M55621 (사람) 투니카마이신
트레오닐-tRNA 신테타제 M63180 (사람) 보렐리딘
Na+K+-ATPase J05096 (사람)
M14511 (래트)		 오우아바인
또한, 선별은, 예를 들어 세포 표면 마커, 세균성 β-갈락토시다제 또는 형광 단백질 (예: 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 애쿠오레아 빅토리아 (Aequorea victoria) 및 레닐라 레니포르미스 (Renilla reniformis) 또는 다른 종으로부터의 이들의 변이체; 적색 형광 단백질, 형광 단백질 및 비-생물형광 종 (예: 디스코소마 종 (Discosoma sp .), 아네모니아 종 (Anemonia sp .), 클라불라리아 종 (Clavularia sp.), 조안투스 종 (Zoanthus sp .))으로부터의 이들의 변이체를 사용하는 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)에 의해 수행되어 재조합 세포를 선별할 수 있다.
용어 "선별제"는 특정한 선별가능한 유전자가 결여된 숙주 세포의 성장 또는 생존을 방해하는 물질을 언급한다. 예를 들어, 형질감염된 세포에서 APH (아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제)와 같은 항생제 내성 유전자의 존재를 선별하기 위해서, 항생제 게네티신 (G418)이 사용된다. 또한, 선별제는, 의존되는 선별 마커 유전자가 증폭가능한 선별 마커인 경우, 증폭가능한 유전자의 카피를 증폭시키기 위한 작용제로서 정의되는 "증폭제"를 포함할 수 있다. 예를 들어, MTX는 DHFR 유전자의 증폭에 유용한 선별제이다.
상술된 방법에 대한 추가의 양태는 관심 유전자(들)에 의해 암호화되고 상기 숙주 세포에서 발현되는 폴리펩타이드(들)/생성물(들)이 세포 또는, 배양 배지로 분비되는 경우, 세포 배양 상청액으로부터 분리되는 방법에 관한 것이다.
상기 생산 세포는 우선적으로 목적 유전자(들)의 발현 및 세포 및/또는 세포 배양 상청액으로부터 관심 단백질의 분리에 유리한 조건 하에서 혈청-비함유 배지 중에서 현탁 배양물로 배양된다. 바람직하게는, 관심 단백질은 분비되는 폴리펩타이드로서 배양 배지로부터 회수되거나, 분비 시그널 없이 발현되는 경우, 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 관심 단백질의 실질적으로 균질한 제제가 수득되도록 다른 재조합 단백질, 숙주 세포 단백질 및 오염물로부터 관심 단백질을 정제하는 것이 필요하다. 제1 단계로서, 종종 세포 및/또는 특정 세포 파편을 배양 배지 또는 용해물로부터 제거한다. 이후, 관심 생성물을 오염물인 가용성 단백질, 폴리펩타이드 및 핵산으로부터, 예를 들어 면역친화 또는 이온-교환 컬럼에서의 분획, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 세파덱스 크로마토그래피, 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지에서의 크로마토그래피에 의해 정제한다. 일반적으로, 숙주 세포에서 발현되는 이종 단백질을 정제하는 방법이 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있다.
본 발명의 실시는, 달리 지시되지 않는 한, 당업자가 알고 있는 세포 생물학, 분자 생물학, 세포 배양, 면역학 등에 대한 통상의 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 통용되는 문헌에 충분히 기술되어 있다.
하기 실시예는 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 이들은 단지 본 발명의 가능한 양태를 보이는 것이다. 당업자는 다른 양태에 이를 적용하기 위해 조건을 쉽게 조절할 수 있을 것이다.
실시예
약어
AP: 알칼리성 포스파타제
BGH: 소 성장 호르몬
bp: 염기쌍
CHO: 차이니즈 햄스터 난소
DHFR: 디하이드로폴레이트 리덕타제
ELISA: 효소-결합된 면역흡착 검정
FACS: 형광-활성화된 세포 분류기
HGH: 햄스터 성장 호르몬
HT: 하이포크산틴/티미딘
HRPO: 서양고추냉이 퍼옥시다제
IgG: 면역글로불린
IRES: 내부 리보좀 진입 부위
kb: 킬로베이스
mAb: 모노클로날 항체
MTX: 메토트렉세이트
NPT: 네오마이신 포스포트랜스퍼라제
nt: 뉴클레오타이드
PBS: 포스페이트 완충 식염수
PCR: 폴리머라제 연쇄 반응
SEAP: 분비된 알칼리성 포스파타제
sICAM: 가용성 세포내 부착 분자
UTR: 비해독 영역
재료 및 방법
세포 배양
CHO-DG44/dhfr-/- 세포를 하이포크산틴 및 티미딘 (HT)로 보충된 혈청-비함유 배지 CHO-S-SFMII (Invitrogen)에서 현탁물로 영구적으로 성장시킨다. 세포를 5% CO2를 포함하는 가습 대기에서 37 ℃의 세포 배양 플라스크에서 항온배양한다. 세포수 및 세포 생존력을 CASY1 세포 계수기 (Schaerfe System, Germany), Cedex (Innovatis AG, Germany)를 사용하거나 트리판 블루 염료 배제를 통해 측정한다. 세포를 2일 또는 3일마다 신선한 배지에 1 내지 3 x 105개 세포/mL의 농도로 시딩한다.
형질감염
CHO-DG44 세포의 형질감염을 리포펙타민 플러스(Lipofectamine Plus) 시약 (Invitrogen)을 사용하여 수행한다. 형질감염당 0,8 mL 하이포크산틴/티미딘 (HT)-보충된 CHO-S-SFMII 배지 중의 6 x 105개 지수 성장 세포를 6-웰 챔버의 웰에 시딩한다. 200 μL 용적의 플라스미드 DNA, 4 μL 리포펙타민 및 6 μL 플러스 (Plus) 시약의 혼합물을 각각의 형질감염에 대해 제조하고, 제조자의 프로토콜에 따라 세포에 가한다. 3시간 동안 항온배양한 후, 2 mL의 HT-보충된 CHO-S-SFMII 배지를 가한다.
일시적 형질감염을 삼중으로 수행하고, 형질감염한지 2일 후 상청액 및 세포를 수거한다. 안정하게 형질감염된 CHO-DG44 세포의 DHFR-기본 선별을 위해, 형질감염한지 48시간 후 배지를 HT-비함유 CHO-S-SFMII 배지로 교체한다. 증폭 선별제로서 5 내지 2000 mM (Sigma) 범위의 MTX를 배지에 가하여 DHFR-기본 유전자 증폭을 수행한다. 공동-형질감염의 경우, 형질감염한지 48시간 후의 세포를 200 내지 400 μg/mL의 농도로 G418 (Invitrogen)로 보충된 HT-비함유 CHO-S-SFMII 배지로 옮김으로써 안정한 형질감염된 CHO-DG44의 DHFR- 및 NPT-기본 선별을 수행한다.
발현 벡터
진핵 발현 벡터는 pAD-CMV1 벡터의 유도체이며 (WO 9201055), CMV 프로모터/인핸서에 의해 유도되는 이종 유전자의 구성적 발현을 매개한다. 관심 유전자의 전사체의 종결 및 폴리아데닐화를 위해, 벡터는 SV40 후기 폴리아데닐화 시그널 (서열번호 11) 또는 BGH 폴리아데닐화 시그널 (서열번호 12)를 포함한다. pBID 벡터는 증폭 선별 마커로서 DHFR 미니 유전자를 암호화하고 [참조: EP 0 393 438], pBIN 벡터는 SV40 초기 프로모터 및 티미딘 키나제 폴리아데닐화 시그널의 조절 하에 선별 마커로서 NPT 유전자를 암호화한다 (도 1).
사람 sICAM, 모노클로날 항체 (IgG1, IgG2 또는 IgG4 이소타입)의 중쇄 및 경쇄 또는 Fc 융합 단백질을 암호화하는 관심 유전자를 프로모터와 폴리아데닐화 시그널 사이에 위치된 다중 클로닝 부위를 이용하여 벡터에 클로닝한다.
ELISA
2개의 인 하우스 개발 (in house developed) sICAM 특이적 모노클로날 항체 (예를 들어 미국특허 5,284,931 및 5,475,091에 기술되어 있는 바와 같은)(이때, 항체 중의 하나는 HRPO-접합된 항체이다)를 사용하는 표준 프로토콜의 ELISA로 sICAM 역가를 정량화한다. 정제된 sICAM 단백질은 표준물로서 사용된다.
염소 항-사람 IgG Fc 단편 (Dianova) 및 AP-접합된 염소 항-사람 카파 경쇄 항체 (Sigma)를 사용하는 표준 프로토콜의 ELISA로 mAb 역가를 정량화한다. 발현된 mAb와 동일한 이소타입의 정제된 mAb 항체가 표준물로서 사용된다. 스펙트라 플루오르 플러스 판독기 (Spectra Fluor Plus reader, TECAN, Crailsheim, Germany)를 사용하여 샘플을 분석한다.
세포 생산성 (pg/세포/일)은 수학식 pg/((Ct-Co) t / ln (Ct-Co)) (여기서, "Co"는 시딩시의 세포수이고, "Ct"는 회수시의 세포수이며, "t"는 배양 기간이다)으로 계산된다.
SEAP 검정
SEAP 활성은 제조자 (Roche Diagnostics)의 프로토콜에 따라 SEAP 리포터 유전자 검정 (SEAP Reporter Gene Assay)으로 측정한다.
실시예 1: 햄스터 성장 호르몬 (HGH)의 전사 종결 영역의 분리 및 클로닝
CHO-DG44 게놈 (차이니즈 햄스터, 크리세투스 그리세우스)로부터의 성장 호르몬 유전자의 완전한 폴리아데닐화 시그널 영역을 분리하기 위해, 어댑터-연결된 게놈 CHO-DG44 DNA를 네스티드 (nested) PCR에서 주형으로 사용한다. 일차 PCR은 각각 어댑터 서열에 상보성을 갖는 프라이머 조합물 및 성장 호르몬 유전자 서열을 사용하여 수행한다. 유전자 특이적 프라이머 GH for1 (5'-GAGACCTACCTGCGGGTCA TGA-3'; 서열번호 1)이 시리안 햄스터 (메소크리세투스 아우라투스 (Mesocricetus auratus); Genbank S66299)의 성장 호르몬의 cDNA 서열을 기초로 하여 고안되며, 정지 코돈의 35 bp 업스트림에 위치된다. 제2 PCR은 내부 어댑터 프라이머 및 제2의 네스티드 유전자 특이적 프라이머 GH for2; 5'-AGTGCCGTCGCTTTGTGGAAA G-3'; 서열번호 2) (GH for1 프라이머 위치의 바로 업스트림에 위치됨)의 조합물로 제1 PCT 생성물에 대해 수행된다. 생성된 DNA 단편은 TA 클로닝 벡터 (Invitrogen)에 서브클로닝되며, 서열 분석에 의해 추가로 분석된다. 가장 긴 DNA 단편은 GH for2 프라이머 서열 이외에 암호화 영역의 3' 말단의 추가의 13 bp, 이어서 정지 코돈 및 크리세투스 그리세우스의 성장 호르몬의 3' 비해독 영역의 324 bp를 포함한다 (도 2; 서열번호 7).
총 324 bp의 바로 3' 비해독 영역 (서열번호 8)을 수득하기 위해서, 프라이머 GH Sfi for1 (서열번호 3) 및 GH Xba rev1 (서열번호 4)를 사용하는 또 다른 PCR을 수행한다. 이로써, TA 벡터에 서브클로닝된 상술된 362 bp DNA 단편 (서열번호 7)은 PCR에서 주형으로 사용된다. 증폭된 서열 (서열번호 8)은 다양한 종의 성장 호르몬 3' 비해독 영역과 하기의 상동성을 갖는다: 시리안 햄스터 메소크리세투스 아우라투스 (Mesocricetus auratus) (Genbank S66299)의 서열에 대해 72.1%, 무스 무스쿨루스 (Mus musculus) (Genbank Z46663)에 대해 71.6%, 라투스 노르베기쿠스 (Rattus norvegicus) (Genbank V01239)의 서열에 대해 61% 및 보스 타우루스 (Bos taurus) (Genbank J00008)의 BGH 서열에 대해 50.4% (도 3).
또한, PCR-기본 접근법을 분리된 3' 비해독 영역의 3' 말단의 다양한 결실을 갖는 서브클론을 생성하는데 이용한다. 프라이머 조합물 GH Sfi for 1 (서열번호 3) 및 GH Xba rev2 (서열번호 5)을 이용하여, 3' 비해독 영역의 189 bp 단편을 생성하고 (서열번호 9), 프라이머 조합물 GH Sfi for 1 (서열번호 3) 및 GH Xba rev3 (서열번호 6)을 사용하여 113 bp 서브단편을 생성한다 (서열번호 10). 따라서, 3' 비해독 영역의 모든 증폭된 단편은 정지 코돈 및 가변 3' 말단 이후의 첫번째 뉴클레오타이드에 상응하는 동일한 5' 말단을 갖는다 (도 4).
PCT 생성물을 SfiI 및 XbaI으로 분해하고, 생성된 제한 단편을 사람 sICAM을 암호화하는 벡터 pJR106에 있는 SV40 후기 폴리아데닐화 시그널 서열을 대체하는데 사용한다 (도 5). 생성되는 벡터 pJR131, pJR134 및 pJR135는, 각각 크기가 324 bp (서열번호 8), 189 bp (서열번호 9) 및 113 bp (서열번호 10)인, 짧은 HGH라 불리는, 크리세투스 그리세우스의 성장 호르몬으로부터 유도된 폴리아데닐화 시그널 서열을 포함한다.
실시예 2: sICAM의 일시적 발현에 대한 HGH 폴리아데닐화 시그널 서열의 영향
염색체 삽입 부위와는 관계없이 관심 유전자 sICAM의 발현에 대한 크리세투스 그리세우스 성장 호르몬 (HGH)로부터 유도된 폴리아데닐화 시그널 서열의 영향을 평가하기 위해서, 일시적 형질감염을 수행한다. CHO-DG44 세포를 햄스터 성장 호르몬의 3' UTR의 324 bp (=HGH, 서열번호 8)를 포함하는 플라스미드 pJR131로 형질감염한다 (도 5). SV40 후기 (pJR106) 또는 BGH (pJR110) 폴리아데닐화 시그널 서열을 포함하는 벡터를 대조군으로 사용한다 (도 5). 상이한 종결 서열을 제외하고는, sICAM의 발현을 위한 다양한 벡터의 유전자 구성은 동일하다.
상청액을 형질감염한지 2일 후에 수거하고, sICAM 역가를 ELISA를 사용하여 측정한다. 형질감염 효율을 보정하기 위해서, 세포를 분비형 알칼리성 포스파타제를 암호화하는 플라스미드 pCMV-SEAP (100 ng DNA/형질감염 반응)과 함께 공동-형질감염하고, SEAP 활성을 측정한다.
도 6은 이중으로 수행된 2개의 독립적인 일시적 형질감염 시리즈의 자료를 도시한다. 놀랍게도, 최고의 sICAM 발현은 햄스터의 성장 호르몬 유전자로부터 유도된 폴리아데닐화 시그널 서열로 얻어진다. 역가는, BGH 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 벡터 pJR110으로 형질감염된 세포와 비교하여, 21% 이하로 (형질감염 시리즈 #1) 증가하고, SV40 후기 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 벡터 pJR106으로 형질감염된 세포와 비교하여, 40% 이하로 (형질감염 시리즈 #1)로 증가한다.
실시예 3: IgG4 항체의 일시적 발현에 대한 HGH 폴리아데닐화 시그널의 영향
염색체 삽입 부위와는 관계없이 관심 유전자인 사람화된 IgG4/kappa mAb의 발현에 대한 크리세투스 그리세우스 성장 호르몬 (HGH)로부터 유도된 폴리아데닐화 시그널 서열의 영향을 평가하기 위해서, 일시적 형질감염을 수행한다. CHO-DG44 세포를 벡터 조합물 pBID/IgG4 및 pBIN/kappa로 형질감염한다. 두 벡터 모두 폴리아데닐화 시그널 서열로서 햄스터 성장 호르몬의 3' UTR의 324 bp (=HGH; 서열번호 8)를 포함한다. 대조군으로서, CHO-DG44 세포를 BGH 폴리아데닐화 시그널 서열을 포함하는 벡터 조합물 pBID-B/IgG4 및 pBIN-B/kappa와 함께 공동-형질감염한다 (기본 벡터에 대해 도 1 참조). 상이한 종결 서열을 제외하고는, IgG4/kappa mAb의 발현을 위한 다양한 벡터의 유전자 구성은 동일하다.
상청액을 형질감염한지 2일 후에 수거하고, IgG4 역가를 ELISA를 사용하여 측정한다. 벡터 조합물당 6개의 세포 풀을 형질감염한다. 형질감염 효율을 보정하기 위해서, 세포를 분비형 알칼리성 포스파타제를 암호화하는 플라스미드 pCMV-SEAP (100 ng DNA/형질감염 반응)과 함께 공동-형질감염하고, SEAP 활성을 측정한다.
놀랍게도, HGH 폴리아데닐화 시그널 서열로 얻어진 역가가 BGH 폴리아데닐화 시그널에 대한 것보다 평균 35% 더 높다 (도 7).
실시예 4: 상이한 HGH 변이체의 시험
크리세투스 그리세우스 성장 호르몬으로부터 유도된 324 bp HGH 서열 (서열번호 8)의 2개의 3' 결실 클론을 PCR로 생성하고, sICAM 유전자의 다운스트림에 폴리아데닐화 시그널 서열로서 위치시킨다. 생성된 벡터 pJR134 및 pJR135 (도 5)는, 각각 189 bp (서열번호 9) 및 113 bp (서열번호 10)의 HGH 서열의 짧은 스트레치를 포함하며, 공통된 5' 말단 위치를 갖는다 (도 4).
염색체 삽입 부위와는 관계없이 관심 유전자인 sICAM의 발현에 대한 HGH 결실 돌연변이체의 영향을 평가하기 위해서, CHO-DG44 세포를 벡터 pJR134 및 pJR135로 형질감염한다. 324 bp HGH 서열을 포함하는 벡터 pHR131을 대조군으로 사용한다 (도 5). 상이한 종결 서열을 제외하고는, sICAM의 발현을 위한 다양한 벡터의 유전자 구성은 동일하다. 형질감염한지 2일 후 상청액을 수거하고, ELISA를 이용하여 sICAM 역가를 측정한다. 형질감염 효율을 보정하기 위해서, 세포를 분비형 알칼리성 포스파타제를 암호화하는 플라스미드 pCMV-SEAP (100 ng DNA/형질감염 반응)과 함께 공동-형질감염하고, SEAP 활성을 측정한다.
도 8은 이중으로 수행된 2개의 독립적인 일시적 형질감염 시리즈의 자료를 도시한다. 2개의 HGH 결실 변이체 모두 감소된 sICAM 발현 수준을 이끈다. 발현 벡터 pJR134에 포함된 189 bp의 HGH 서열은 23% 이하의 보다 적당한 감소를 보인다. 따라서, 189 bp 단편은 BGH 및 SV40 후기 폴리아데닐화 시그널에 필적하는 성능을 나타낸다 (실시예 2 및 3 참조). 그러나, 발현 벡터 pJR135에 포함된 113 bp의 최단 HGH 서열은 78% 이하의 감소된 sICAM 발현을 이끈다. 이는 서열번호 8 서열의 bp 190 내지 324의 HGH 영역에 관심 유전자의 효과적인 발현에 기여하는 서열이 위치된다는 것을 나타낸다.
실시예 5: HGH 폴리아데닐화 시그널을 사용한 고수준의 안정한 단백질 발현
CHO-DG44 세포를 다양한 이소타입의 mAb (IgG1, IgG2, IgG4)의 중쇄 및 경쇄 또는 Fc 부분이 IgG1 또는 IgG2로부터 유도되는 Fc 융합 단백질을 암호화하는 벡터 조합물과 함께 공동-형질감염한다. 발현에 사용되는 기본 벡터 pBID 및 pBIN (도 1)는 관심 유전자의 다운스트림에 위치된 폴리아데닐화 시그널 서열로서 324 bp HGH 서열 (서열번호 8)을 포함한다. 형질감염한지 2일 후 DHFR- 및 NPT-기본 선별을 이용하여 안정한 세포 풀을 선별한다. 안정한 형질감염체에 대한 제1 선별 후, 배양 배지에 제1 라운드로 100 nM MTX를 가하고 이어서 800 nM MTX를 가함으로써 2회의 연속적인 DHFR-매개된 유전자 증폭 단계를 수행한다. 단일 세포 클론을 희석 클로닝 또는 단일 세포의 96 웰 플레이트 웰로의 FACS-기본 침착에 의해 수득한다.
실험 자료는 크리세투스 그리세우스로부터의 HGH 폴리아데닐화 시그널을 사용하여 안정한 형질감염체에서 관심 단백질의 고발현을 달성할 수 있음을 나타낸다. 10 내지 45 pg/세포/일 범위의 비생산성을 갖는 세포 풀 및 세포 클론 및 유가식 공정에서 6.3 g/L 이하의 역가가 수득된다 (도 9).
서열표:
서열번호 1: 프라이머 GH for1
서열번호 2: 프라이머 GH for2
서열번호 3: 프라이머 GH Sfi for1
서열번호 4: 프라이머 GH Xba rev1
서열번호 5: 프라이머 GH Xba rev2
서열번호 6: 프라이머 GH Xba rev3
서열번호 7: 크리세투스 그리세우스, 성장 호르몬 서열, 3' 암호화 영역의 일부 및 3' 비해독 영역 (362개 뉴클레오타이드)
서열번호 8: 크리세투스 그리세우스, 성장 호르몬의 3' 비해독 영역 (324개 뉴클레오타이드)
서열번호 9: 크리세투스 그리세우스, 성장 호르몬의 3' 비해독 영역 (189개 뉴클레오타이드)
서열번호 10: 크리세투스 그리세우스, 성장 호르몬의 3' 비해독 영역 (113개 뉴클레오타이드)
서열번호 11: SV40, 후기 종결 및 폴리아데닐화 서열 (222개 뉴클레오타이드)
서열번호 12: 보스 타우루스, 성장 호르몬의 종결 및 폴리아데닐화 서열 (208개 뉴클레오타이드)
서열번호 13: 코작 서열, 컨센서스 리보좀 결합 부위 (13개 뉴클레오타이드)
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Claims (16)

  1. 서열번호 8로 이루어진 핵산으로 이루어진 폴리아데닐화 시그널.
  2. 서열이 서열번호 8로 이루어진 핵산.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 시그널 또는 상기 핵산이 이종(heterologous) 암호화 서열에 작동가능하게 결합된(linked), 폴리아데닐화 시그널 또는 핵산.
  4. 제1항에 따른 폴리아데닐화 시그널을 포함하는, 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 관심 이종 생성물을 암호화하는 관심 이종 유전자를 포함하는, 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 관심 이종 생성물이 관심 폴리펩타이드이고, 상기 관심 폴리펩타이드가 항체, 항체 단편 또는 융합 단백질인, 벡터.
  7. 제4항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
  8. 제7항에 있어서, 제1항에 따른 상기 폴리아데닐화 시그널이 관심 생성물을 암호화하는 전사 단위에 작동가능하게 결합되고, 상기 관심 생성물은 관심 유전자에 의해 암호화되는 관심 폴리펩타이드인, 세포.
  9. 제7항에 있어서, 상기 세포가 햄스터 세포인, 세포.
  10. 관심 유전자에 의해 암호화되는 관심 폴리펩타이드를 생성하는 방법으로서,
    (a) 제5항 또는 제6항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하고,
    (b) 상기 세포를, 상기 세포의 증식 및 상기 관심 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에 배양하고,
    (c) 상기 관심 폴리펩타이드를 수거하고,
    (d) 상기 관심 폴리펩타이드를 정제함
    을 포함하는, 관심 유전자에 의해 암호화되는 관심 폴리펩타이드를 생성하는 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 격리자(insulator)로서 사용하기 위한, 폴리아데닐화 시그널 또는 핵산.
  12. 벡터, 세포, 상기 세포의 배양을 위한 세포 배양 배지 및 제1항 또는 제2항에 따른 폴리아데닐화 시그널 또는 핵산을 포함하는 키트.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
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