KR101608225B1 - 신규한 재조합 서열 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 진핵세포에서 박테리오파지 람다 인테그라제 Int에 의해 수행되는 DNA의 서열-특이적 재조합에 수반되는 att 재조합 서열의 변이체인 신규한 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다. 이러한 신규한 att 재조합 서열은, 예를 들어 attP.b, attP.a, attL.a, attR.a 및 attR.b이다. 또한, 본 발명은 하나 이상의 재조합 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 DNA를 세포에 도입하고, 하나 이상의 추가의 재조합 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 DNA를 세포에 도입하고, 박테리오파지 람다 인테그라제 Int에 의해 서열 특이적 재조합을 수행함을 포함하여, 진핵세포에서 DNA를 서열 특이적으로 재조합하는 방법에 관한 것이며, 상기 제1 또는 제2 DNA 중 하나 이상은 신규한 att 재조합 서열, 예를 들어 attP.b, attP.a, attL.a, attR.a 및 attR.b이다.

Description

신규한 재조합 서열{Novel recombination sequences}
본 발명은 진핵세포에서 박테리오파지 람다 인테그라제 Int에 의해 수행되는 DNA의 서열-특이적 재조합에 수반되는 att 재조합 서열의 변이체인 신규한 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다. 이러한 신규한 att 재조합 서열은, 예를 들어 attP.b, attP.a, attL.a, attR.a 및 attR.b이다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 재조합 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 DNA를 세포에 도입하고, 하나 이상의 추가의 재조합 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 DNA를 세포에 도입하며, 박테리오파지 람다 인테그라제 Int에 의해 서열 특이적 재조합을 수행함을 포함하여, 진핵세포에서 DNA를 서열 특이적으로 재조합하는 방법에 관한 것이며, 상기 제1 또는 제2 DNA 중 하나 이상은 신규한 att 재조합 서열 (예: attP.b, attP.a, attL.a, attR.a 및 attR.b)이다.
진핵세포 게놈의 조절된 조작 및 에피솜 벡터로부터 재조합 단백질의 발현은 살아있는 유기체에서 특정 유전자의 기능(들)을 분석하기 위한 중요한 방법이다. 또한, 상기 조작은 의학에서 유전자 요법에 중요한 역할을 한다. 이와 관련해서, 유전자이식 동물의 생성, 유전자 또는 유전자 절편의 변화 (소위 "유전자 표적화") 및 외래 DNA의 고등 진핵생물의 게놈으로의 표적화된 통합 (integration)이 특히 중요하다. 최근에, 이들 기술들은 서열 특이적 재조합 시스템의 특징화 및 적용에 의해 개선될 수 있었다.
또한, 목적하는 폴리펩타이드/생성물을 암호화 및 발현하는 발현 카세트의 생물공학적 관련 숙주 세포에의 서열-특이적 통합이 생물의약의 생성에 보다 중요해졌다. 안정한 형질전환된 세포주에서 목적하는 폴리펩타이드의 발현 수준은 통합 부위에 의존적이다. 서열 특이적 통합에 의해, 높은 전사 활성을 갖는 부위가 바람직하게 사용될 수 있었다. 목적하는 폴리펩타이드/생성물을 발현하는 생산 세포주를 생성하기 위한 통상의 방법은 재조합 발현 벡터의 숙주 세포의 게놈으로의 무작위 통합에 기초한다. 안정하게 형질전환된 세포주에서 관심있는 통합된 유전자(들)의 발현 수준 차이는 주로 염색체 위치 및 복제수의 차이에 기인한다. 이질염색질 부근에서의 무작위 통합은 다양한 수준의 이식유전자 발현을 초래한다. 관심있는 통합된 유전자(들)의 발현을 증진시키는 염색체 위치는 진정염색질의 전사적 활성 영역인 것으로 생각된다. 이러한 통합의 임의성은 재조합 세포의 강건함 (robustness), 생산성 및 품질에 커다란 다양성을 초래하므로, 목적하는 폴리펩타이드를 고수준으로 발현하는 적합한 세포를 확인 및 분리하는데 복잡한 스크리닝 과정을 필요로 한다. 또한, 비균질성은 각각의 클론에 대해 최적화된 생산 과정이 개발되어야 한다는 것을 의미하며, 이는 적합한 생산 세포주의 개발이 시간 소모적이고 노동 집중적이며 비용이 많이 드는 과정이 되게 한다.
보존적인 서열 특이적 DNA 재조합효소 (recombinase)는 2가지 부류로 분류된다. 소위 "인테그라제"라 불리는 제1 부류의 구성원은, 하기에서 재조합 서열로 명명될, 2개의 한정된 뉴클레오타이드 서열 사이의 DNA 쇄를 절단하고 재결합하는 것을 촉매한다. 재조합 서열은 2개의 상이한 DNA 분자 또는 하나의 DNA 분자 상에 존재할 수 있어, 각각 분자간 또는 분자내 재조합을 초래한다. 분자내 재조합에 있어, 반응의 결과는 서로에 대한 재조합 서열 각각의 배향에 의존적이다. 역위된 (inverted), 즉 반대 배향의 재조합 서열의 경우, 재조합 서열 사이에 놓인 DNA 절편의 역위 (inversion)가 일어난다. DNA 기질 상에서 직렬 (direct), 즉 탠덤 (tandem) 반복인 재조합 서열의 경우, 결실이 일어난다. 분자간 재조합의 경우, 즉 2개의 재조합 서열이 모두 2개의 상이한 DNA 분자에 위치되는 경우, 2개의 DNA 분자의 융합이 일어날 수 있다. 인테그라제 부류의 구성원들은 통상 분자내 및 분자간 재조합을 촉매하며, 소위 "인버타제/리졸바제"라 불리는 제2 부류의 재조합효소는 단지 분자내 재조합만을 촉매할 수 있다.
현재, 진핵세포 게놈의 조작에 사용되는 재조합효소는 인테그라제 부류에 속한다. 이러한 재조합효소는 박테리오파지 P1의 Cre 재조합효소 및 효모로부터의 Flp 재조합효소이다. Cre 재조합효소가 결합하는 재조합 서열은 loxP라 불린다. loxP는 2개의 13 bp 길이의 역위된 뉴클레오타이드 서열 및 역위된 서열 사이에 놓인 8 bp 길이의 스페이서로 이루어진 34 bp 길이의 뉴클레오타이드 서열이다. Flp를 위한 결합 서열로 명명되는 FRT도 유사하게 제작된다. 그러나, 이 서열은 loxP와는 다르다. 따라서, 재조합 서열은 서로 대체될 수 없다 (즉, Cre는 FRT 서열을 재조합할 수 없고, FLP는 loxP 서열을 재조합할 수 없다). 2개의 재조합 시스템 모두 장거리에 걸쳐 활성이다 (즉, 자리 바뀌거나 결실되고 2개의 loxP 또는 FRT 서열에 의해 플랭킹(flanking)될 DNA 절편은 수만 bp 길이일 수 있다).
지금까지 인버타제/리졸바제 부류의 3개의 구성원이 진핵세포 게놈의 조작에 대해 사용되어 왔다. 박테리오파지 Mu 인버타제 Gin의 돌연변이체는 보조인자 없이 식물 원형질체에서 DNA 단편의 역위를 촉매할 수 있다. 그러나, 이러한 돌연변이체는 과다-재조합원성 (hyper-recombinogenic)이며, 즉 천연적인 재조합 서열 이외의 다른 서열에서도 DNA 쇄 절단을 촉매하는 것으로 밝혀졌다. 이는 식물 원형질체 게놈에서 의도되지 않은 부분적으로는 치명적인 재조합 사건을 이끌 수 있다. 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Sterptococus pyogenes)로부터의 β-재조합효소는 마우스 세포 배양물에서 직렬 반복으로서 2개의 재조합 서열 사이에서 재조합을 촉매하여 절편을 잘라낸다. 그러나, 결실과 동시에, 진핵세포 게놈의 조작을 위한 시스템의 조절된 이용을 부적합하게 하는 역위도 검출되었다. 이. 콜라이로부터의 γδ 레졸바제의 돌연변이체가 에피솜 및 인공적으로 도입된 게놈 재조합 서열에 활성인 것으로 밝혀졌으나, 후자 반응의 효율은 여전히 상당히 저조하다.
각각 Cre 및 Flp 재조합효소를 사용한 진핵세포 게놈의 조작은 중요한 단점을 나타낸다. 결실의 경우, 즉 게놈에서 2개의 탠덤 반복된 loxP 또는 FRT 재조합 서열의 재조합시, 탠덤 반복물 사이에 놓인 DNA 절편의 비가역적인 상실이 있다. 따라서, 이러한 DNA 절편에 위치된 유전자가 세포 및 유기체에서 영구히 상실될 것이다. 따라서, 예를 들어 유기체의 후기 발단 단계에서, 유전자 기능의 새로운 분석을 위한 최초 상태의 재구성이 불가능하다. 결실에 의해 야기되는 DNA 절편의 비가역적 상실은 각각의 DNA 절편의 역위에 의해 피해질 수 있다. 유전자는 상실 없이 역위에 의해 불활성화될 수 있고, 후기 발달 단계에서 또는 성숙 동물에서 역 (back) 재조합을 통한 재조합효소의 적시 조절 발현에 의해 다시 켜질 수 있다. 그러나, 이러한 변형된 방법에서 Cre 및 Flp 재조합효소의 사용은, 재조합 서열이 재조합 사건에 의해 변화될 수 없을 것이기 때문에 역위가 조절될 수 없는 단점을 갖는다. 따라서, 반응의 평형에서 단지 일부, 기껏해야 표적 세포의 50%에서 각각의 DNA 절편의 역위에 기인하여 각각의 유전자의 불활성화를 일으키는 반복적인 재조합 사건이 발생한다. 적어도 부분적으로는 단일 재조합 후 추가의 반응에 사용될 수 없는 돌연변이된 loxP 서열을 구성함으로써 이러한 문제를 해결하고자 하는 노력이 있었다. 그러나, 단점은 반응의 유일함, 즉 역위에 의한 유전자의 불활성화 후 역 재조합에 의한 후속적 활성화가 없다는 것이다.
Flp 재조합효소의 추가의 단점은 37 ℃에서 감소된 열 안정성이며, 보다 고등 진핵생물에서, 예를 들어 약 39 ℃의 체온을 갖는 마우스에서 재조합 반응의 효율이 상당히 제한된다. 따라서, 야생형 재조합효소와 같이 보다 높은 열 안정성을 나타내는 Flp 돌연변이체가 생성되었다. 그러나, 이들 돌연변이체 Flp 효소는 여전히 Cre 재조합효소보다 낮은 재조합 효율을 나타낸다.
서열 특이적 재조합효소에 대한 추가의 이용이 의학 분야, 예를 들어 유전자 요법에 속하며, 이러한 경우 재조합효소는 목적하는 DNA 절편을 안정하고 조절된 방식으로 각각의 사람 표적 세포의 게놈에 통합시킨다. Cre 및 Flp 모두 새포간 재조합을 촉매할 수 있다. 2개의 재조합효소 모두, 각각의 재조합 서열의 카피를 보유하는 플라스미드 DNA를, 이전에 상동 재조합을 통해 진핵세포의 게놈으로 삽입된 상응하는 재조합 서열과 재조합시킨다. 그러나, 이러한 반응은 진핵세포 게놈에서 "천연적으로" 발생하는 재조합 서열을 수반하는 것이 바람직하다. loxP 및 FRT는 각각 길이가 34개 및 54개 뉴클레오타이드이기 때문에, 게놈의 일부로서의 이들 재조합 서열의 정확한 일치는 통계학적으로 가능할 것 같지 않다. 재조합 서열이 존재한다고 하더라도, 상술된 역 반응의 단점이 여전히 존재한다. 즉, 2개의 Cre 및 Flp 재조합효소 모두, 분자내 재조합에 의한 성공적 통합 후 삽입된 DNA 절편을 잘라낼 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 과제는 단순하고 조절가능한 재조합 시스템, 및 필요한 작업 수단을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가의 과제는 목적하는 DNA 서열의 안정하고 표적된 통합을 수행할 수 있는 재조합 시스템 및 필요한 작업 수단을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가의 과제는 재조합 시스템에 기초하여 개선된 단백질 발현 시스템의 생성을 가능하게 하는 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요지
박테리오파지 람다 인테그라제 Int 재조합 시스템 및 att 재조합 서열을 사용함으로써 해법이 제공된다. 특허원 WO01/16345 및 WO2004/048584이 참조로 본원에 삽입된다.
본 발명의 구체적인 과제는, 관심있는 유전자의 서열에 작동가능하게 결합되는 경우 진핵세포 시스템에서 부위-특이적 재조합을 매개하는 것 이상으로 기능성을 확장하도록 특별히 변형된 대체적 att 서열을 제공하는 것이다.
예를 들어, 박테리오파지 람다의 야생형 또는 변형된 인테그라제에 의해 유도되는 재조합 사건을 증진시키기 위해 attB, attP, attL 및/또는 attR 서열 또는 이들의 유도체에 치환, 결실 및/또는 삽입이 도입될 수 있으며, 상기 증진은, 동일한 조건 하에서 동일한 재조합효소를 사용하는 상응하는 천연 발생 재조합 서열과 비교하여, 예를 들어 (i) 재조합 사건 (통합 및/또는 절단)의 효율 증가, (ii) 재조합 특이성 증가, (iii) 절단성 재조합 사건의 선호, (iv) 통합적 재조합 사건의 선호, (v) 일부 또는 전체 숙주 인자에 대한 필요 조건의 완화로 이루어질 수 있다. 달리, 부위-특이적 재조합을 위한 매개자로서 att 서열을 이용하기 위한 것뿐만 아니라 이들을 이용함으로써 기능성을 확대하기 위해서, 예를 들어 조절 서열로서 치환, 결실 및/또는 삽입을 attB, attP, attL 및/또는 attR 서열 또는 이들의 유도체에 도입하여 시스-작용 부위, 예를 들어 (잠재성) 스플라이스 공여체, 수용체 부위 및 브랜치 포인트, 폴리아데닐화 시그널, TATA 박스, chi-부위, 리보좀 도입 부위, 반복 서열, 2차 구조물 (예: 스템 루프), 전사 인자 또는 다른 조절 인자에 대한 결합 부위, 제한 효소 부위 등 (이로 제한되지 않음)으로 작용할 수 있는 서열/뉴클레오타이드를 제거, 변화, 생성 또는 첨가할 수 있다.
치환이 attP, attL 및 attR 서열에 도입되었다. 놀랍게도, 특히 잘 작동하는 일부 att 서열/att-변이체가 본원에 기술된다. 예기치 못하게도, 일부 바람직산 att 변이체는, 비록 IHF, XIS, FIS 및/또는 Int에 대한 결합 부위에 치환이 있을 수 있지만, 여전히 부위-특이적 재조합을 매개할 수 있었다.
본 발명은 하기 설명과 함께 보다 상세히 설명된다.
도 1: 최초 att P 서열과 att P - 변이체 att P .b의 정렬
attP 변이체 attP.b (서열번호 3)는, attP 야생형 서열 (서열번호 2)과 비교하여, 밑줄과 함께 굵은 글씨체로 강조된, 9개의 치환을 포함한다. 이는 96.3%의 서열 상동성에 해당한다.
도 2: 현탁 배양에서 성장하도록 적응된 CHO - DG44 세포에서 att P 변이체 및 att P 야생형을 사용한 분자간 재조합
현탁 배양에서 성장하도록 적응된 CHO-DG44 세포를 먼저 람다 인테그라제 Int-h/218 암호화 플라스미드로 형질감염시키고, 경우에 따라, 혈청-비함유 배지에서 IHF 암호화 플라스미드로 형질감염시켰다.
제1 형질감염한지 24시간 후, 이들 세포를 제2 형질감염으로 다양한 기질 벡터 (substrate vector): pBI-26/attP (attP 야생형 서열; 서열번호 2) + pZsGreen/attB (attB 야생형 서열; 서열번호 1), pBI-26/ attP.b (attP 변이체; 서열번호 3) + pZsGreen/attB (attB 야생형 서열; 서열번호 1) 및 pBI-26/attP.b (attP 변이체; 서열번호 3) + pZsGreen/attP.b (attP 변이체; 서열번호 3)의 조합물로 형질감염시켰다.
양성 대조군으로서 및 형질감염 효율을 측정하기 위해서, 발현 플라스미드 pBI-267ZsGreen을 사용하였다. pBI-26/ZsGreen은 CMV-프로모터의 조절 하에서 녹색 형광 단백질을 발현한다.
제2 형질감염한지 48시간 후, 세포를 FACS 분석을 이용해 분석하고, 형광 세포의 비율을 측정하였다.
세포를 인테그라제 및 IHF 발현 벡터를 사용해 미리 형질감염시키는 경우, attP.b 및 attB 기질 벡터 사이에 세포내 재조합을 갖는 형광 세포의 비율은 평균 1.2%이고, attP.b 및 attP.b 기질 벡터 사이는 평균 1.5%이며, attP 및 attB 기질 벡터 사이는 평균 1.7%이다 (6개의 형질감염된 세포 풀 (pool) 각각으로부터의 평균값).
인테그라제 발현 벡터를 사용하여 단지 사전-형질감염된 세포에 있어서, attP.b와 attB 기질 벡터 사이에 분자간 재조합을 갖는 형광 세포의 비율은 평균 0.3%이고, attP.b와 attP.b 기질 벡터 사이는 평균 0.4%이며, attP와 attB 기질 벡터 사이는 평균 1.1%이다 (6개의 형질감염된 세포 풀 각각에 대한 평균값).
상술된 모든 경우에서, 배경 형광은, 상응하는 플라스미드는 사용하였으나 람다-인테그라제 및 IHF를 암호화하는 플라스미드는 첨가하지 않고 형질감염시킨 세포에 대한 FACS 분석에 기초하여, 우선적으로 감산하였다.
도 3: 최초 att P 서열과 att P 변이체 att P .a의 정렬
attP 변이체 attP.a (서열번호 4)는, attP 야생형 서열 (서열번호 2)과 비교하여, 밑줄과 함께 굵은 글씨체로 강조된, 9개의 치환을 포함한다. 이는 96.3%의 서열 상동성에 해당한다.
도 4: 현탁 배양에서 성장하도록 적응된 CHO - DG44 세포에서 att P 변이체 att P.a, att P .b 및 att P 야생형을 사용한 분자간 재조합
현탁액 적응된 CHO-DG44 세포를 플라스미드 조합물 pBI-26/attP.b (attP 변이체; 서열번호 3) + pZsGreen/attP.b (attP 변이체; 서열번호 3), pBI-26/attP.a (attP 변이체; 서열번호 4) + pZsGreen/attP.a (attP 변이체; 서열번호 4) 또는 pBI-26/attP (attP 야생형; 서열번호 2) + pZsGreen/attP (attP 야생형; 서열번호 2)로 혈청-비함유 배지에서 형질감염시켰다. 모든 경우에서, 세포를 람다 인테그라제 Int-h/218를 암호화하는 플라스미드 pCMV SS Inth218로 공동-형질감염시켰다.
배경 형광을 측정하기 위한 음성 대조군으로서, 모의 (mock)-형질감염된 세포를 생성하였다. 형질감염한지 72시간 후, 세포를 FACS-분석을 이용하여 분석하고, 형광 세포의 부분을 측정하였다.
형광 세포의 비율은 평균적으로, attP.b 기질 벡터 쌍 사이의 분자간 재조합에 대해서는 세포의 2%를 차지하고, attP.a 기질 벡터 쌍 사이의 분자간 재조합에 대해서는 세포의 1.9%를 차지하며, attP 기질 벡터 쌍 사이의 분자간 재조합에 대해서는 세포의 1.9%를 차지한다 (3개의 형질감염된 세포 풀로부터의 평균값).
상술된 모든 경우에서, 배경 형광은, 상응하는 플라스미드 조합은 사용하였으나 모의 플라스미드로서 람다-인테그라제 플라스미드보다는 오히려 공 (empty) 벡터를 첨가하여 형질감염시킨 세포에 대한 FACS 분석에 기초하여, 우선적으로 감산하였다.
도 5: 최초 att L 서열과 att L 변이체 att L * 및 att L .a의 정렬
attL 변이체 attL.a (서열번호 7) 및 attL* (서열번호 6) 각각은, attL 야생형 서열 (서열번호 12)과 비교하여, 밑줄과 함께 굵은 글씨체로 강조된, 1개의 치환을 포함한다. 이는 99%의 서열 상동성에 해당한다.
도 6: 최초 att R 서열과 att R 변이체 att R *, att R .a 및 att R .b의 정렬
attR 변이체 attR.a (서열번호 10) 및 attR.b (서열번호 11)는, attR 야생형 서열 (서열번호 13)과 비교하여, 밑줄과 함께 굵은 글씨체로 강조된, 8개의 치환을 포함하고 attR* (서열번호 8)은 1개의 치환을 포함한다. 이는 각각 95% 및 99.4%의 서열 상동성에 해당한다.
도 7: att L 과 att R 변이체 사이의 분자간 재조합
제1 단계에서, CHO-DG44 세포를 람다 인테그라제 Int-h/218, IHF 및 XIS를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염한지 24시간 후, 세포를 제2 형질감염으로 다양한 attL 및 attR 기질 벡터 (n=3)의 조합으로 형질감염시켰다. 양성 대조군으로서 및 형질감염 효율을 측정하기 위해서, CMV 프로모터 조절 하에서 녹색 형광 단백질을 암호화하는 발현 플라스미드 pBI-26/ZsGreen을 사용한다. 형질감염한지 48시간 후, 세포를 FACS-분석으로 분석하고, 형광 세포의 비율과 평균적인 상대적 ZsGreen 형광 (X-평균)을 측정한다. 모든 경우에서, 배경 형광은, 제2 형질감염에서는 동일한 기질 벡터 조합의 상응하는 플라스미드를 사용하여 형질감염시키고 제1 형질감염에서는 단지 모의-형질감염시킨 세포에 대한 FACS 분석에 기초하여, 우선적으로 감산하였다.
도 8: att L 과 att B 변이체 및 att P 와 att R 변이체 사이의 분자간 교차-재조합
제1 단계에서, CHO-DG44 세포를 람다 인테그라제 Int-h/218, IHF 및 XIS를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염한지 24시간 후, 제2 형질감염으로 세포를 다양한 attL 및 attB 또는 attP 및 attR 기질 벡터 (n=3)의 조합물로 형질감염시켰다. 양성 대조군으로서 및 형질감염 효율을 측정하기 위해서, CMV 프로모터의 조절 하에서 녹색 형광 단백질을 암호화하는 발현 플라스미드 pBI-26/ZsGreen를 사용한다. 제2 형질감염한지 48시간 후, 세포를 FACS-분석을 이용해 분석하고, 형광 세포의 비율 및 평균의 상대적 ZsGreen 형광을 측정한다. 모든 경우에서, 배경 형광은, 제2 형질감염에서는 동일한 기질 벡터 조합의 상응하는 플라스미드를 사용하여 형질감염시키고 제1 형질감염에서는 단지 모의-형질감염시킨 세포에 대한 FACS 분석에 기초하여, 우선적으로 감산하였다.
도 9: PCR 에 의한 교차- 재조합의 검증
attL 및 attB 또는 attL.a 및 attB 기질 벡터 조합으로 형질감염시킨 세포 풀로부터 분리된 플라스미드 DNA에 대한 PCR을 프라이머 조합 CENfor2 및 ZsGrev1을 사용하여 수행한다. 기질 벡터의 쌍 사이의 성공적인 분자간 재조합의 경우, pZsGreen/att-벡터에 위치된 ZsGreen은 이들 사이에 상응하는 결합 부위를 갖는 pBI-26/att-벡터에 위치된 CMV 인핸서/프로모터의 조절하에 들어온다. 결과적으로, 상술된 프라이머를 사용한 PCR 생성물은 성공적인 재조합 사건의 경우에만 발생할 것이다. 실제로, pCM SS Inth218, pIHF 및 pBI/TI-X로 사전-형질감염된 후 기질 벡터의 쌍으로 제2 형질감염시킨 모든 세포 풀에서, 400 bp의 예상된 PCR 생성물이 검출된다. 기질 벡터의 쌍을 사용한 제2 형질감염으로 형질감염된 모의 사전-형질감염된 세포 풀에서는 어떠한 PCR 생성물도 수득되지 않는다.
일반적 양태인 "포함하는" 또는 "포함된"은 보다 구체적인 양태인 "이루어진"을 포함한다. 또한, 단수 및 복수 형태가 제한적으로 사용되지는 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어는 하기 의미를 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "형질전환 (transformation)" 또는 "형질전환시키기 위해서", "형질감염 (transfection)" 또는 "형질감염시키기 위해서"는 핵산 서열을 세포에 도입시켜 유전적으로 변형된, 재조합, 형질전환된 또는 유전자삽입된 세포를 생성하는 것을 의미한다. 도입은 당해 기술 분야에 널리 공지된 임의의 방법으로 수행될 수 있다. 그 방법은, 이로 제한됨이 없이, 리포펙션, 전기천공, 폴리양이온 (예: DEAE-덱스트란)-매개된 형질감염, 원형질체 융합, 바이러스 감염 및 마이크로주입을 포함하거나 칼슘법, 전기쇼크법, 정맥내/근육내 주입, 에어로졸 흡입 또는 난모세포 주입에 의해 수행될 수 있다. 형질전환으로 숙주 세포의 일시적 또는 안정한 형질전환이 이루어질 수 있다. 용어 "형질전환" 또는 "형질전환시키기 위해서"는 또한 각각의 바이러스에 대해 천연적인 방식으로 바이러스 핵산 서열을 도입하는 것을 의미한다. 바이러스 핵산 서열은 나출된 (naked) 핵산 서열로서 존재할 필요는 없으나, 바이러스 단백질 외피에 패키징될 수 있다. 따라서, 이 용어는 종종 용어 "형질전환" 또는 "형질전환시키기 위해서"로 공지된 방법에만 관련되지는 않는다. 도입된 핵산의 최적 형질감염 빈도 및 발현을 제공하는 형질감염 방법이 선호된다. 적합한 방법은 통상의 절차에 의해 결정될 수 있다. 안정한 형질감염체를 위해서, 제작물은 숙주 세포내에 안정하게 유지되도록 숙주 세포 게놈 또는 인공 염색체/미니-염색체에 통합되거나 에피솜에 위치된다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 서열"은 att 서열, 이의 임의의 유도체 또는 동족체, 바람직하게는 attB (서열번호 1), attP (서열번호 2), attL (서열번호 12) 및 attR (서열번호 13) 서열 및 이의 유도체, 예를 들어 예시적인 서열 attP.b (서열번호 3), attP.a (서열번호 4), attL* (서열번호 6), attL.a (서열번호 7), attR* (서열번호 8), attR.a (서열번호 10) 및 attR.b (서열번호 11)에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "유도체" 또는 "변이체"는 attB, attP, attL 및 attR 서열, 및 천연적으로 발생하는 attB, attP, attL 및 attR 서열과는 대조적으로 오버랩 영역 및/또는 코어 영역에서 하나 이상의 치환, 바람직하게는 7개, 보다 바람직하게는 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 치환을 갖는 attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 및 attR.b에 관한 것이다. 또한, 용어 "유도체" 또는 "변이체"는 attB, attP, attL 또는 attR의 하나 이상의 코어 Int 결합 부위에 관한 것이다. 또한, 용어 "유도체" 또는 "변이체"는 attP, attL 또는 attR의 하나 이상의 코어 Int 결합 부위 + Int에 대한 하나 이상의 카피의 암(arm)-결합 부위에 관한 것이다. 또한, 용어 "유도체" 또는 "변이체"는 attP, attL 또는 attR의 하나 이상의 코어 Int 결합 부위 + 하나 이상의 카피의 Int, FIS 또는 XIS 인자 결합 부위에 관한 것이다. 또한, 용어 "유도체"는 이들 특징의 조합에 관한 것이다. 또한, 용어 "유도체"는 IHF, FIS 또는 XIS 인자 결합 부위 또는 Int 암 결합 부위에서의 치환에 관한 것이다. 또한, 용어 "유도체" 또는 "변이체"는 이의 임의의 기능성 단편 및 서열-특이적 재조합을 지지하는 진핵세포에서의 내인성 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 사람 게놈에서 확인되는 attH에 관한 것이다 [참조: WO 01/16345]. 용어 "유도체" 또는 "변이체"는 일반적으로 본 발명의 의도된 이용을 실현하는데 적합한 attB, attP, attL 또는 attR 서열을 포함하며, 이는 상기 서열이 박테리오파지 람다의 인테그라제 (야생형 또는 변형)에 의한 서열-특이적 재조합 사건을 매개함을 의미한다.
용어 "기능성 단편"은 변형에도 불구하고 박테리오파지 람다의 야생형 또는 변형 인테그라제에 의해 유도되는 서열-특이적 재조합을 매개할 수 있는 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 (야생형 또는 변형된 단백질 결합 부위의 존재 또는 부재를 포함) attB, attP, attL, attR, attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 및 attR.b 서열에 관한 것이다. 치환, 결실 및/또는 삽입은, 예를 들어 박테리오파지 람다의 야생형 또는 변형 인테그라제에 의해 유도되는 재조합 사건을 증진시키기 위해 attB, attP, attL 및/또는 attR 또는 이들의 유도체에 도입될 수 있으며, 상기 증진은, 동일한 조건 하에서 동일한 재조합효소를 사용하는 상응하는 천연 발생 재조합 서열과 비교하여, 예를 들어 (i) 재조합 사건 (통합 및/또는 절단)의 효율 증가, (ii) 재조합 특이성 증가, (iii) 절단성 재조합 사건의 선호, (iv) 통합적 재조합 사건의 선호, (v) 일부 또는 전체 숙주 인자에 대한 필요 조건의 완화로 이루어질 수 있다. 또한, 치환, 결실 및/또는 삽입은, 예를 들어 재조합 서열에서 개시 코돈 (ATG) 또는 종결 코돈 (TAA, TAG, TGA)으로 기능하거나 관심있는 유전자를 암호화하는 유전자 서열에 판독 프레임으로 작동가능하게 결합 (융합)될 때 특정 아미노산을 암호화할 수 있는 뉴클레오타이드 삼중자를 제거, 변화, 생성 또는 부가하기 위해서 attB, attP, attL 및/또는 attR 서열 또는 이들의 유도체에 도입될 수 있다. 달리, 부위-특이적 재조합을 위한 매개자로서 att 서열을 이용하기 위한 것뿐만 아니라 이들을 이용함으로써 기능성을 확대하기 위해서, 예를 들어 조절 서열로서 치환, 결실 및/또는 삽입을 attB, attP, attL 및/또는 attR 서열 또는 이들의 유도체에 도입하여 시스-작용 부위, 예를 들어 (잠재성) 스플라이스 공여체, 수용체 부위 및 브랜치 포인트, 폴리아데닐화 시그널, TATA 박스, chi-부위, 리보좀 도입 부위, 반복 서열, 2차 구조물 (예: 스템 루프), 전사 인자 또는 다른 조절 인자에 대한 결합 부위, 제한 효소 부위 등 (이로 제한되지 않음)으로 작용할 수 있는 서열/뉴클레오타이드를 제거, 변화, 생성 또는 부가할 수 있다.
변형된 재조합 부위 또는 변형된 인테그라제의 기능성은 목적하는 특정한 특성에 의존적인 방식으로 측정될 수 있으며, 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에서 기술되는 바와 같은 공동-형질감염 검정 (실시예 1 참조)을 이용하여 다양한 세포주에서 염색체외 DNA의 인테그라제-매개된 재조합을 특징화할 수 있다. 간단히 설명하면, 세포를 인테그라제 단백질을 암호화하는 발현 벡터 (임의로, IHF, XIS 및/또는 FIS와 같은 보조-인자를 암호화하는 벡터를 첨가할 수 있다), 및 기능성/비-기능성 리포터 유전자 (예를 들어, GFP와 같은 형광 단백질)를 암호화하고 이에 하나 이상의 재조합 서열을 포함하는 재조합효소에 대한 기질인 기질 벡터로 공동-형질감염시킨다. 발현 벡터에 의한 인테그라제의 발현 시, 리포터 유전자의 기능은 비-기능성/기능성일 것이다. 따라서, 재조합 활성은 재조합된 기질 벡터를 회복하고, (예를 들어, PCR, 재조합 영역의 서열 분석, 재조합 효소 분석, 서던 블롯 분석을 수행함으로써) DNA 수준에서 재조합의 증거를 찾거나 (예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯팅, 방사선면역, 면역침전, 면역염색, 형광 단백질의 FACS-분석을 수행함으로써) 단백질 수준에서 재조합의 증거를 찾아냄으로써 검정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "오버랩 영역"은 DNA 쇄 교환 (쇄 절단 및 재연결 포함)이 일어나는 재조합 서열에 대한 서열을 정의하며, 야생형 att 부위의 컨센서스 (consensus) DNA 서열 5'-TTTATAC-3' 또는 기능성 뉴클레오타이드 치환을 갖는 상기 서열에 관한 것이다. 유일한 필수 조건은 오버랩 영역의 서열이 재조합 파트너 서열 사이에서 동일해야 한다는 것이다.
용어 "코어 결합 부위"는 각각의 세트의 야생형 att 부위에서 오버랩 영역에 의해 분리된 역위된 배향의 2개의 불완전 반복 카피에 관한 것이다. 코어 결합 부위는 저친화성으로 인테그라제를 결합함으로써 재조합에 필수적이다. 각각의 코어 결합 부위는 9개의 인접 염기쌍으로 이루어지며, 야생형 att 부위에서 뉴클레오타이드 서열 5'-CTGCTTTTT-3'의 B-서열, 뉴클레오타이드 서열 5'-CAAGTTAGT-3' (역 상보적 쇄)의 B'-서열, 뉴클레오타이드 서열 5'-CAGCTTTTT-3'의 C-서열, 및 뉴클레오타이드 서열 5'-CAACTTAGT-3' (역 상보적 쇄)의 C'-서열의 DNA 서열 또는 기능성 뉴클레오타이드 치환을 갖는 상기 서열에 관한 것이다.
본원에 사용되는 용어 "Int에 대한 암-결합 부위" 또는 "암-결합 부위"는 컨센서스 서열 5'-C/AAGTCACTAT-3' 또는 기능성 뉴클레오타이드 치환을 갖는 상기 서열에 관한 것이다. Int에 대한 암-결합 부위는 코어 Int 결합 부위(들)의 상류 및/또는 하류에서 다양한 거리에 위치될 수 있다.
재조합 서열, 오버랩 영역, 코어 결합 부위, 암-결합 부위 및 숙주 인자 결합 부위와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "동족체" 또는 "상동성" 또는 "유사"는, 천연적으로 발생하는 재조합 서열, 오버랩 영역, 코어 결합 부위, 암-결합 부위 및 숙주 인자 결합 부위에 대해, 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱더 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상 동일한 핵산 서열에 관한 것이다. 예를 들어, NCBI의 유사성 알고리즘 BLAST에서의 표준 변수를 이용할 때, 재조합 서열과 비교하여 P < 10-5의 개연율을 보이는 서열이 상동 또는 유사한 것으로 간주된다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 세포에서 핵산의 흡수, 증식, 발현 또는 전달을 위한 천연으로 발생하거나 합성적으로 생성되는 제작물, 예를 들어 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체/미니-염색체, 박테리오파지, 바이러스 또는 레트로바이러스에 관한 것이다. 벡터를 제작하기 위해 이용되는 방법은 당업자에게 널리 공지되고 다양한 공개문에 기술되어 있다. 특히, 기능 및 조절 성분, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 종결 및 폴리아데닐화 시그널, 선별 마커, 복제 오리진 및 스플라이싱 시그널을 포함한 적합한 벡터를 제작하기 위한 기술이 당업자에게 공지되어 있다. 진핵세포 발현 벡터는 통상적으로 세균에서의 벡터의 증식을 촉진하는 원색세포 서열, 예를 들어 복제 오리진 및 세균에서의 선별을 위한 항생제 내성 유전자도 포함할 것이다. 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결될 수 있는 클로닝 부위를 포함하는 다양한 진핵세포 발현 벡터가 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 일부는 회사 (예: Stratagene, La Jolla, CA; Invitrogen, Carlsbad, CA; Promega, Madison, WI; 또는 BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)로부터 시판된다.
본원에서 사용되는 용어 "관심있는 유전자", "목적하는 서열" 또는 "목적하는 유전자"는 동일한 의미를 가지며, 관심있는 생성물을 암호화하는 임의의 길이의 폴리뉴클레오타이드 서열을 언급한다. 선택된 서열은 전체 길이 또는 절단된 유전자, 융합 또는 태그화된 (tagged) 유전자일 수 있으며, cDNA, 게놈성 DNA 또는 DNA 단편, 바람직하게는 cDNA일 수 있다. 이는 천연 서열, 즉 천연적으로 발생하는 형태(들)일 수 있거나, 돌연변이되거나 필요에 따라 변형될 수 있다. 이들 변형은 선택된 숙주 세포에서의 코돈 사용을 최적화하기 위한 코돈 최적화, 사람화 또는 태그화를 포함한다. 또한, 이들은 시스-작용 부위, 예를 들어 (잠재성) 스플라이스 공여체, 수용체 부위 및 브랜치 포인트, 폴리아데닐화 시그널, TATA-박스, chi-부위, 리보좀 도입 부위, 반복 서열, 2차 구조물 (예: 스템 루프), 전사 인자 또는 다른 조절 인자를 위한 결합 부위, 제한 효소 부위 등 (이로 제한되지 않음)의 제거 또는 부가를 포함할 수 있다. 선택된 서열은 분비, 세포질, 핵, 막 결합 또는 세포 표면 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. "관심있는 생성물"은 단백질, 폴리펩타이드, 이의 단편, 펩타이드, 안티센스 RNA (이들 모두 선택된 숙주 세포에서 발현될 수 있다)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "핵산 서열", "뉴클레오타이드 서열" 또는 "DNA 서열"은 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편 또는 일부인, 게놈성 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 언급하며, 이는 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있고 센스 또는 안티센스 쇄를 나타낼 수 있다. 이 서열은 비-암호화 서열, 암호화 서열 또는 이 둘의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 코돈이 이들의 동의 코돈에 의해 대체된 핵산 영역을 포함한다.
본 발명의 핵산 서열은 당업자에 널리 공지된 표준 기술을 이용하여 제조될수 있다. 용어 "암호화하는" 또는 "암호화"는 규정된 서열의 뉴클레오타이드 (즉, rRNA, tRNA, 기타 RNA 분자) 또는 아미노산을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 고분자의 합성을 위한 주형으로서 역할을 하는 핵산에서의 특정 서열, 예를 들어 염색체 중의 유전자 또는 mRNA에 대한 고유한 특성 및 이로부터 생기는 생물학적 특성을 언급한다. 따라서, 유전자에 의해 생성되는 mRNA의 전사 및 해독이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우, 유전자는 단백질을 암호화한다. 유전자 또는 cDNA의 암호화 쇄 (mRNA 서열과 동일하고 서열 목록에서 통상 제공되는 뉴클레오타이드 서열) 및 비-암호화 쇄 (전사를 위한 주형으로서 사용됨) 모두 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 암호화하는 것으로 언급될 수 있다. 단백질을 암호화하는 핵산은 상이한 뉴클레오타이드 서열을 가지나 유전자 코드의 축퇴 때문에 동일한 아미노산 서열의 단백질을 암호화하는 모든 핵산을 포함한다. 단백질을 암호화하는 핵산 및 뉴클레오타이드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "폴리펩타이드"는 아미노산 잔기 서열 또는 단백질과 상호교환적으로 사용되며 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 언급한다. 또한, 이 용어는, 이로 제한됨이 없이, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 또는 단백질 프로세싱을 포함하는 반응을 통해 해독후 변형되는 단백질을 포함한다. 변형 및 변화, 예를 들어 다른 단백질에의 융합, 아미노산 서열 치환, 결실 또는 삽입은, 분자가 이의 생물학적 작용 활성을 유지하는 한, 폴리펩타이드의 구조에 만들어질 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산 서열 치환이 폴리펩타이드 또는 이의 기본적인 핵산 암호화 서열에 만들어질 수 있으며, 유사한 특성을 갖는 단백질이 수득될 수 있다. 아미노산 변형은, 예를 들어 기본적인 핵산 서열에 부위-특이적 돌연변이유발 또는 폴리머라제 연쇄 반응 매개된 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "발현"은 숙주 세포에서 이종 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 언급한다. 숙주 세포에서 목적하는 생성물의 발현 수준은 세포에 존재하는 상응하는 mRNA의 양 또는 선택된 서열에 의해 암호화되는 목적하는 폴리펩타이드의 양에 기초하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 선택된 서열로부터 전사되는 mRNA는 노던 블롯 하이브리드화, 리보뉴클레아제 RNA 보호, 세포성 RNA에 대한 원위치 (in situ) 하이브리드화 또는 PCR에 의해 정량될 수 있다. 선택된 서열에 의해 암호화되는 단백질은 다양한 방법, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯팅, 방사선면역검정, 면역침전, 단백질의 생물학적 활성 검정, 또는 단백질의 면역염색 후 FACS 분석 PCR에 의해 정량화될 수 있다.
"발현 카세트"는 전사될 하나 이상의 유전자를 포함하는 제작물 내의 영역을 정의하며, 절편에 포함된 유전자는 서로 작동가능하게 결합되며 단일 프로모터로부터 전사되므로, 상이한 유전자는 적어도 전사적으로는 연결된다. 하나 초과의 단백질 또는 생성물은 각각의 전사 단위로부터 전사 및 발현될 수 있다. 각각의 전사 단위는 단위에 포함되는 임의의 선택된 서열의 전사 및 해독에 필요한 조절 성분을 포함할 것이다.
용어 "작동가능하게 결합된"은 2개 이상의 핵산 서열 또는 서열 성분이 이들의 의도된 방식으로의 기능을 가능하게 하는 방식으로 위치되는 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서는 결합된 서열의 전사를 조절 또는 조정하기 위해 시스로 작용하는 경우 암호화 서열에 작동가능하게 결합된다. 일반적으로, 반드시는 아니나, 작동가능하게 결합되는 DNA 서열들은 인접하며, 2개의 단백질 암호화 영역을 연결하는 것이 필요한 경우 또는 분비 리더의 경우, 인접하고 판독 프레임에 존재한다.
용어 "선별 마커 유전자"는 유전자를 보유하는 세포가 상응하는 선별제의 존재 하에서 특이적으로 선별되게 하는 유전자를 언급한다. 설명을 위한 것으로서, 항생제 내성 유전자가 상응하는 항생제의 존재 하에서 이 유전자로 형질전환된 숙주 세포가 양성으로 선별되게 하는 양성 선별 마커 유전자로 사용될 수 있으며, 비-형질전환된 숙주 세포는 선별 배양 조건 하에서 성장 또는 생존할 수 없을 것이다. 선별 마커는 양성, 음성 또는 이기능성일 수 있다. 양성 선별 마커는 약물에 대한 내성을 부여함으로써 마커를 보유하는 세포에 대한 선별을 가능하게 하거나 숙주 세포에서 대사작용 또는 이화작용 결함을 보상한다. 이와는 대조적으로, 음성 선별 마커는 마커를 보유하는 세포가 선택적으로 제거되게 한다. 예를 들어, 마커로서 HSV-tk 유전자를 사용하는 것은 세포를 아사이클로버 및 강사이클로버와 같은 작용제에 민감하게 할 것이다. 증폭가능한 선별 유전자를 포함하여 본원에서 사용되는 선별 마커 유전자는, 암호화된 생성물이 선별 특성을 보유하는 한, 천연의 선별 마커에 대한 재조합적으로 조작된 돌연변이체 및 변이체, 단편, 기능성 등가물, 유도체, 동족체 및 융합물을 포함할 것이다. 유용한 유도체는 일반적으로 선별가능한 특성과 연관된 선별 마커의 영역 또는 도메인에서 실질적인 서열 유사성 (아미노산 수준에서)을 갖는다. 이기능성 (즉, 양성/음성) 마커 [참조: WO 92/08796 및 WO 94/28143, 본원에 참조로 삽입됨]를 포함하여, 다양한 마커 유전자가 기술되었다. 예를 들어, 진핵세포에서 일반적으로 사용되는 선별 유전자는 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제 (APH), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HYG), 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 티미딘 키나제 (TK), 글루타민 신테타제, 아스파라신 신테타제에 대한 유전자, 및 네오마이신 (G418), 푸로마이신, 히스티디놀 D, 블레오마이신 및 플레오마이신을 암호화하는 유전자를 포함한다.
또한, 선별은 재조합 세포를 선별하기 위해, 예를 들어 세포 표면 마커, 세균 -갈락토시다제 또는 형광 단백질 [예: 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 아쿠오레아 빅토리아 (Aequorea victoria) 및 레닐라 레니포르미스 (Renilla reniformis) 또는 기타 종으로부터의 이들의 변이체; 적색 형광 단백질 및 비-생물발광 종 (예: 디스코소마 종 (Discosoma sp.), 아네모니아 종 (Anemonia sp.), 클라불라리아 종 (Clavularia sp.), 조안투스 종 (Zoanthus sp.)으로부터의 이들의 변이체]을 사용하는 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)에 의해 수행될 수 있다.
용어 "선별제"는 특정 선별 유전자에서는 결여된, 숙주 세포의 성장 또는 생존을 방해하는 물질을 언급한다. 예를 들어, 형질전환된 세포에서 APH (아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제)와 같은 항생제 내성 유전자의 존재를 선별하기 위해, 항생제 게네티신 (G418)이 사용된다.
박테리오파지 람다의 인테그라제 (종종 및 본원에서 "Int"로 표기됨)은 Cre 및 Flp와 같이 서열 특이적 보존적 DNA 재조합효소의 인테그라제 부류에 속한다. 이의 천연적 기능으로서, Int는 attB 및 attP의 2개의 상이한 재조합 서열 사이의 통합적 재조합을 촉매한다. attB는 21개 뉴클레오타이드를 포함하며, 이. 콜라이 게놈으로부터 최초로 분리되었다 [참조: Mizuuchi, M. and Mizuuchi, K. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 3220]. 다른 한편으로, 243개 뉴클레오타이드를 갖는 attP는 보다 길며, 박테리오파지 람다의 게놈에서 천연적으로 발생한다 [참조: Landy, A. and Ross, W. (1977) Science, 197, pp. 1147]. Int 재조합효소는 attP에서 모두 7개의 결합 부위 및 attB에서 2개의 결합 부위를 갖는다. Int의 생물학적 기능은 이. 콜라이 염색체의 유전자좌 attB에 환형 파지 게놈을 서열 특이적으로 통합시키는 것이다. Int는 통합적 재조합을 위해 소위 통합 숙주 인자 (종종 및 본원에서 "IHF"로 표기됨)라 불리는 단백질 보조-인자를 필요로 한다 [참조: Kikuchi, Y. und Nash, H. (1978) J. Biol. Chem., 253, 7149]. IHF는 기능성 재조합 컴플렉스의 attP와의 어셈블리에 필요하다. 통합 반응을 위한 제2 보조-인자는 attP에 대한 DNA 네거티브 슈퍼코일링이다. 마지막으로, attB와 attP 사이의 재조합은, 추가의 재조합 반응, 절단 반응을 위한 기질 및 인식 서열로서 기능하는, attL 및 attR의 2개의 새로운 재조합 서열의 형성을 이끈다. 박테리오파지 람다 통합에 대한 포괄적인 개요가 문헌 [참조: Landy, A. (1989) Annu. Rev. Biochem., 58, pp. 913]에 기술되어 있다.
세균 게놈 밖으로 파지 게놈의 절단은 또한 Int 재조합효소에 의해서도 촉매된다. 이를 위해, 박테리오파지 람다에 의해 암호화되는 Int 및 IHF에 추가하여, 추가의 보조-인자가 필요하다. 이는 attR에 2개의 결합 부위를 갖는 절제효소 (excisionase) (통상 및 본원에서 "XIS"라 표기됨)이다 [참조: Gottesman, M. and Weisberg, R. (1971) The Bacteriophage Lamda, Cold Spring Harbor Laboratory, pp.l13]. 통합적 재조합과는 대조적으로, 재조합 서열의 DNA 네거티브 슈퍼코일링은 절단성 재조합에 필수적이지 않다. 그러나, DNA 네거티브 슈퍼코일링은 재조합 반응의 효능을 증가시킨다. 절단 반응의 효능에 대한 추가의 개선은 XIS와 함께 작용하는 제2 보조-인자, 즉 FIS (factor for inversion stimulation; 역위 자극을 위한 인자)로 달성될 수 있다 [참조: Landy, A. (1989) Annu. Rev. Biochem., 58, pp.913]. 절단은 일반적으로 통합에 대한 정확히 역반응으로서, 즉 attB 및 attP가 다시 생성된다. 박테리오파지 람다 절단에 대한 포괄적인 개요가 문헌 [참조: Landy, A. (1989) Annu. Rev. Biochem., 58, pp. 913]에 기술되어 있다.
본 발명은 attP.b (서열번호 3), attP.a (서열번호 4), attL* (서열번호 6), attL.a (서열번호 7), attR* (서열번호 8), attR.a (서열번호 10) 및 attR.b (서열번호 11)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 분자 또는 이의 유도체 또는 동족체에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 attP.b (서열번호 3), attP.a (서열번호 4), attL* (서열번호 6), attL.a (서열번호 7), attR* (서열번호 8), attR.a (서열번호 10) 및 attR.b (서열번호 11)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 attP.b (서열번호 3), attP.a (서열번호 4), attL* (서열번호 6), attL.a (서열번호 7), attR* (서열번호 8), attR.a (서열번호 10) 또는 attR.b (서열번호 11)를 포함하는 핵산 분자 또는 이의 유도체 또는 동족체에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 attP.b (서열번호 3), attP.a (서열번호 4), attL* (서열번호 6), attL.a (서열번호 7), attR* (서열번호 8), attR.a (서열번호 10) 또는 attR.b (서열번호 11)를 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 핵산 서열이 진핵세포에서 DNA의 서열-특이적 재조합을 매개하며, 서열 특이적 재조합이 박테리오파지 람다 인테그라제 Int에 의해 수행되는 핵산 분자에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 상기 인테그라제 Int는 변형된 Int, 바람직하게는 Int-h 또는 Int-h/218이다. 추가의 바람직한 양태에서, 상기 인테그라제는 서열번호 15를 갖는다.
또한, 본 발명은 상기된 핵산 분자 중 어느 하나를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 구체적 양태에서, 상기 벡터는 진핵세포 발현 벡터이다. 추가의 구체적인 양태에서, 상기 벡터는 프로모터 및/또는 관심있는 이종 유전자 및/또는 선별 마커 및/또는 인핸서를 포함한다. 또 다른 양태에서, 선별 마커는 DHFR, 글루타민 신테타제 또는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제이다.
또한, 본 발명은 게놈, 인공 염색체, 미니염색체, 에피솜 성분, 또는 본 발명의 벡터에 통합된 본원에 기술된 핵산 분자를 포함하는 세포에 관한 것이다. 구체적 양태에서, 세포는 진핵세포, 예를 들어 효모, 식물, 벌레 (worm), 곤충, 조류 (avian), 어류, 파충류 또는 포유동물 세포이다. 보다 구체적인 양태에서, 진핵세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 원숭이 신장 CV1 세포, 원숭이 신장 COS 세포, 사람 수정체 상피 PER.C6TM 세포, 사람 배아 신장 HEK293 세포, 사람 양막 세포 (amniocyte cell), 사람 골수종 세포, 베이비 햄스터 신장 세포, 아프리카 그린 원숭이 신장 세포, 사람 자궁경부 (cervical) 암종 세포, 개 (canine) 신장 세포, 버팔로 래트 간 세포, 사람 폐 세포, 사람 간 세포, 마우스 유방 종양 또는 골수종 세포, 예를 들어 NS0, 개, 돼지, 마카크 (macaque), 래트, 토끼, 고양이 및 염소 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 포유동물 세포이다. 바람직한 양태에서, CHO 세포는 CHO 야생형, CHO K1, CHO DG44, CHO DUKX-B11, CHO Pro-5, 바람직하게는 CHO DG44이다.
또한, 본 발명은
a) 제1 attB, attP, attP.b, attP.a, attL, attL*, attL.a, attR, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열을 포함하는 DNA를 세포에 도입하고,
b) 제2 attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열을 포함하는 DNA를 세포에 도입하거나,
이와는 반대의 순서로 도입하고;
c) 박테리오파지 람다 인테그라제 Int에 의해 서열 특이적 재조합을 수행함을 포함하여, 진핵세포에서 DNA를 서열 특이적 재조합하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법의 구체적인 양태에서, 제1 DNA 서열은 attB 서열을 포함하고, 제2 서열은 attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열을 포함하거나, 또는 이와는 반대이다.
상기 방법의 추가의 구체적인 양태에서, 제1 DNA 서열은 attP.b 서열을 포함하고, 제2 서열은 attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열을 포함한다.
상기 방법의 바람직한 양태에서, 제1 DNA 서열은 attP.b 서열을 포함하고, 제2 서열은 또한 attP.b 서열을 포함한다.
구체적인 양태에서, DNA의 서열 특이적 재조합 방법은 본 발명에 따른 제1 att 서열이 인공 염색체/미니염색체 또는 진핵세포의 게놈에 통합된 진핵세포에서 수행된다. 추가의 바람직한 양태에서, 상기 방법은 본 발명의 방법에 따른 단계 b) 및 c)를 추가로 포함한다.
추가의 양태에서, 상기 방법은 제1 att 서열이 진핵 세포의 게놈에 천연적으로 존재하거나 미리 도입됨을 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 양상은
a) attB, attP, attP.b, attP.a, attL, attL*, attL.a, attR, attR*, attR.a 또는 attR.b를 포함하는 제1 DNA를 세포에 도입하고,
b) attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열을 포함하는 제2 DNA를 도입하거나,
이와는 반대의 순서로 도입하고;
c) 관심있는 하나 이상의 유전자를 세포에 도입하고;
d) 상기 세포를 박테리오파지 람다 인테그라제 Int와 접촉시키고;
e) 박테리오파지 람다 인테그라제 Int에 의한 서열-특이적 재조합을 수행하여 제2 DNA를 제1 DNA에 통합시키고;
f) 상기 세포를 관심있는 유전자(들)가 발현되는 조건 하에서 배양하는 것을 포함하여, 진핵세포에서 하나 이상의 목적하는 폴리펩타이드(들)/생성물(들)을 암호화하는 관심있는 하나 이상의 유전자를 발현시키는 방법에 관한 것이다.
바람직한 양태에서, 상기 방법은 제2 DNA가 숙주 세포에 도입되기 전에, 제1 DNA가 숙주 세포 게놈, 인공 염색체/미니염색체 또는 숙주 세포의 에피솜 성분에 통합됨을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열 및 관심있는 하나 이상의 유전자를 포함하는 DNA를 진핵세포에 도입하고;
상기 세포를 박테리오파지 람다 인테그라제 Int와 접촉시키고;
상기 세포에서 천연적으로 발생하는 재조합 서열과 상기 세포에 도입된 DNA 사이에서 박테리오파지 람다 인테그라제 Int에 의한 서열-특이적 재조합을 수행하고;
상기 세포를 관심있는 유전자가 발현되는 조건 하에서 배양함을 포함하여, 박테리오파지 람다 Int에 의해 매개되는 서열-특이적 재조합을 가능하게 하는 하나 이상의 천연 발생 재조합 서열 또는 이의 기능성 돌연변이체를 갖는 진핵세포에서 하나 이상의 목적하는 폴리펩타이드(들)/생성물(들)을 암호화하는 관심있는 하나 이상의 유전자를 발현시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, aattR.a 또는 attR.b 서열 및 관심있는 하나 이상의 유전자를 포함하는 DNA를 진핵세포에 도입하고;
상기 세포를 박테리오파지 람다 인테그라제 Int와 접촉시키고;
상기 세포에서 천연적으로 발생하는 재조합 서열과 상기 세포에 도입된 DNA 사이에서 박테리오파지 람다 인테그라제 Int에 의한 서열-특이적 재조합을 수행하고;
상기 세포를 관심있는 유전자가 발현되는 조건 하에서 배양함을 포함하여, 박테리오파지 람다 Int에 의해 매개되는 서열-특이적 재조합을 가능하게 하는 하나 이상의 천연 발생 재조합 서열 또는 이의 기능성 돌연변이체를 갖는 진핵세포에서 관심있는 하나 이상의 폴리펩타이드를 생성하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 양태에서, 상기 방법은 천연적으로 발생하는 서열이 attH임을 특징으로 한다. 추가의 바람직한 양태에서, 상기 방법은 천연적으로 발생하는 서열이 서열번호 14임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열 및 관심있는 하나 이상의 유전자를 포함하는 DNA를 진핵세포에 도입하고;
상기 세포를 박테리오파지 람다 인테그라제 Int와 접촉시키고;
상기 세포에서 천연적으로 발생하는 재조합 서열과 상기 세포에 도입된 DNA 사이에서 박테리오파지 람다 인테그라제 Int에 의한 서열-특이적 재조합을 수행하고;
상기 세포를 관심있는 유전자가 발현되는 조건 하에서 배양함을 포함하여, 박테리오파지 람다 Int에 의해 매개되는 서열-특이적 재조합을 가능하게 하는 하나 이상의 재조합 서열 또는 이의 기능성 돌연변이체를 갖는 진핵세포에서 관심있는 하나 이상의 폴리펩타이드를 생성하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 양태에서, 본 방법은 목적하는 폴리펩타이드(들)/생성물(들)이 숙주 세포 또는 세포 배양 배지로부터 분리됨을 특징으로 한다.
구체적인 양태에서, 본 발명의 방법은 attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열이 Int에 대한 하나 이상의 카피의 암-결합 부위(들)을 포함하거나, 상기 서열은 하나 이상의 카피의 코어 Int 결합 부위(들)을 포함하거나, 상기 서열은 Int에 대한 하나 이상의 카피의 암-결합 부위(들)와 하나 이상의 카피의 코어 Int 결합 부위(들)의 조합을 포함함을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 방법은 attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열이 하나 이상의 카피의 코어 Int 결합 부위(들)로 이루어짐을 특징으로 한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 방법은 attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열이 하나 이상의 카피의 코어 Int 결합 부위(들)로 이루어지거나, 상기 att-서열의 유도체가 Int에 대한 하나 이상의 카피의 암-결합 부위(들)와 하나 이상의 카피의 코어 Int 결합 부위(들)의 조합으로 이루어짐을 특징으로 한다.
구체적인 양태에서, 본 발명의 방법은 코어 결합 부위가 9개의 인접한 염기쌍으로 이루어지고, 야생형 att 부위에서 뉴클레오타이드 서열 5'-CTGCTTTTT-3'의 B-서열, 뉴클레오타이드 서열 5'-CAAGTTAGT-3' (역 상보성 쇄)의 B'-서열, 뉴클레오타이드 서열 5'-CAGCTTTTT-3'의 C-서열, 및 뉴클레오타이드 서열 5'-CAACTTAGT-3' (역 상보성 쇄)의 C'-서열로 이루어진 DNA 서열 또는 기능성 뉴클레오타이드 치환을 갖는 서열에 관한 것이라는 것을 특징으로 한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 방법은 서열-특이적 재조합이 Int, 및 XIS, FIS 및/또는 IHF 중에서 선택되는 하나 이상의 보조인자에 의해 수행됨을 특징으로 한다.
추가의 바람직한 양태에서, 본 발명의 방법은 서열-특이적 재조합을 변형된 Int, 바람직하게는 Int-h 또는 Int-h/218로 수행함을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 방법은 Int, Int-h 또는 Int-h/218, XIS, FIS 및/또는 IHF를 세포에 순수한 형태로 가하거나, 인테그라제 또는 숙주 인자를 암호화하는 mRNA로 가하거나 숙주 세포에 의해 공동-발현시켜 서열-특이적 재조합을 수행함을 특징으로 한다.
추가의 양태에서, 본 발명의 방법은 추가로 Int 유전자, 또는 Int 유전자와 XIS 유전자, FIS 유전자 및/또는 IHF 유전자 중에서 선택되는 하나 이상의 보조인자 유전자를 포함하는 제3 DNA 또는 제3 DNA와 제4 DNA 서열을 세포에 도입함을 특징으로 한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 방법은 서열 특이적 재조합을 변형된 Int, 바람직하게는 Int-h 또는 Int-h/218에 의해 수행하는 경우 XIS, FIS 및 IHF 중 어떠한 것도 필요로 하지 않음을 특징으로 한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 방법은 관심있는 폴리펩타이드가 항체, 호르몬 또는 성장 인자임을 특징으로 한다.
구체적인 양태에서, 본 발명의 방법은 숙주 세포가 포유동물 세포임을 특징으로 한다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 방법은 포유동물 세포가 설치류 세포, 바람직하게는 마우스 또는 햄스터 세포임을 특징으로 한다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 방법은 햄스터 세포가 BHK 또는 CHO 세포이고 마우스 세포가 쥐 골수종 세포, 바람직하게는 NS0 및 Sp2/0 세포임을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양상은
a) 제1 attB, attP, attP.b, attP.a, attL, attL*, attL.a, attR, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 세포에 도입하고,
b) 제2 attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 세포에 도입하고, 여기서 제1 DNA 서열이 attB 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 경우, 제2 서열은 attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하거나, 제1 DNA 서열이 attP.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 경우, 제2 서열은 attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하거나, 제1 DNA 서열이 attL 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 경우, 제2 서열은 attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하거나, 제1 DNA 서열이 attR 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 경우, 제2 서열은 attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하고,
c) 박테리오파지 람다 인테그라제 Int에 의해 서열 특이적 재조합을 수행함을 포함하여, 진핵세포에서 DNA를 서열 특이적 재조합하는 방법에 관한 것이다.
단계 c)에서 서열-특이적 재조합을 Int 또는 Int 및 XIS, FIS, 및/또는 IHF에 의해 수행하는 방법이 바람직하다. 단계 c)에서 서열-특이적 재조합을 Int 또는 Int 및 XIS 인자, 또는 Int 및 IHF, 또는 Int 및 XIS 및 IHF에 의해 수행하는 방법이 가장 바람직하다. 단계 c)에서 서열-특이적 재조합을 Int, 바람직하게는 Int-h 또는 Int-h/218에 의해 수행하는 방법이 더욱 바람직하다. 이와 관련해서, XIS, FIS 및/또는 IHF과 함께 변형된 Int의 사용도 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명의 보다 바람직한 양태에서, 진핵세포에서의 DNA의 서열 특이적 재조합은 동일하거나 거의 동일한 재조합 부위 사이에서 수행될 것이다. 따라서, 본 발명은 상술된 바와 같은 서열 특이적 재조합 방법에 관한 것이며, 이때 제1 DNA 서열이 attP.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 경우 제2 서열도 attP.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하거나, 제1 DNA 서열이 attP.a 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 경우 제2 서열도 attP.a 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하거나, 제1 DNA 서열이 attL* 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 경우 제2 서열도 attL* 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하거나, 제1 DNA 서열이 attL.a 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 경우 제2 서열도 attL.a 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하거나, 제1 DNA 서열이 attR* 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 경우 제2 서열도 attR* 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하거나, 제1 DNA 서열이 attR.a 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 경우 제2 서열도 attR.a 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하거나, 제1 DNA 서열이 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 경우 제2 서열도 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함한다.
본 발명의 방법은 천연적으로 발생하는 attB, attP, attL, 및/또는 attR 서열뿐만 아니라 변형된, 예를 들어 치환된 attB, attP, attL, 및/또는 attR 서열을 사용하여서도 수행될 수 있다. 예를 들어, attB [참조: Nash, H. (1981) Annu. Rev. Genet., 15, pp. 143; Nussinov, R. and Weisberg, R. (1986) J. Biomol. Struct. Dynamics, 3, pp 1134] 및/또는 attP [참조: Nash, H. (1981) Annu. Rev. Genet., 15, pp.143]에서 하나 이상의 치환을 갖는 attP와 a ttB 상동 서열 (야생형 서열의 돌연변이체) 사이에서 박테리오파지 람다 및 이. 콜라이의 통합적 재조합이 관측되었다.
따라서, 본 발명은 사용된 attB, attP, attP.b, attP.a, attL, attL*, attL.a, attR, attR*, attR.a, 및/또는 attR.b 서열이, 천연적으로 발생하는 attB, attP, attL, 및/또는 attR 서열과 비교하여, 하나 이상의 치환을 갖는 방법에 관한 것이다. attB, attP, attP.b, attP.a, attL, attL*, attL.a, attR, attR*, attR.a, 및/또는 attR.b 서열이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 치환을 갖는 방법이 바람직하다. 치환은 오버랩 영역, 코어 영역, IHF, FIS 또는 XIS 인자 결합 부위, 또는 Int 암 결합 부위에서 발생할 수 있다. 7개의 뉴클레오타이드를 포함하는 완전한 오버랩 영역이 또한 치환될 수 있다. 치환이 코어 영역 또는 오버랩 영역에서 attB, attP, attP.b, attP.a, attL, attL*, attL.a, attR, attR*, attR.a, 및/또는 attR.b 서열에 도입되는 방법이 보다 바람직하다. 오버랩 영역에서 하나의 치환이 도입되고 코어 영역에서 1 또는 2개의 치환이 동시에 도입되는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명은 사용된 attB, attP, attP.b, attP.a, attL, attL*, attL.a, attR, attR*, attR.a, 및/또는 attR.b 서열이, 천연적으로 발생하는 attB, attP, attL, 및/또는 attR 서열과 비교하여, 재조합 부위에 대한 유도체 또는 동족체 (이의 기능성 단편 포함)인 방법에 관한 것이다.
재조합 서열로 하나 이상의 치환(들) 형태의 변형은 변형(들)에도 불구하고 재조합이 수행되도록 선택될 수 있다. 이러한 치환의 예는, 예를 들어 문헌 [참조: Nash, H. (1981), 상기 참조; Nussinov, R. and Weisberg, R. (1986), 상기 참조]에 열거되어 있으며, 제한적인 것으로 간주되지 않는다. 추가의 변형은, 예를 들어 돌연변이유발법에 의해 용이하게 도입될 수 있고, 시험 재조합에 의해 이들의 사용에 대해 시험될 수 있다.
또한, 본 발명은 사용되는 attB, attP, attL, 및/또는 attR 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체가 각각의 코어 Int 결합 부위 중 하나만을 포함하는 방법에 관한 것이나, 2개를 초과하는 코어 Int 결합 부위도 또한 바람직하다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 사용되는 attB, attP, attL, 및/또는 attR 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체가 각각의 코어 Int 결합 부위 중 단지 하나만으로 이루어진 방법에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 사용되는 attB, attP, attL, 및/또는 attR 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체는 2개 초과의 코어 Int 결합 부위로 이루어진다.
또한, 본 발명은 사용되는 attB, attP, attP.b, attP.a, attL, attL*, attL.a, attR, attR*, attR.a, 및/또는 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체가 코어 Int 결합 부위에 추가하여 하나 이상, 바람직하게는 2, 3, 4, 5개 이상의 카피의 Int에 대한 암-결합 부위를 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 결합 부위는 서열 5'-C/AAGTCACTAT-3' (서열번호 5 및 9) 또는 뉴클레오타이드 치환을 갖고 Int 결합에 대해 기능성인 이의 변형된 서열을 갖는 컨센서스 모티브를 포함한다. Int에 대한 암-결합 부위(들)은 코어 Int 결합 부위(들)의 상류 및/또는 하류에서 다양한 거리에 위치될 수 있다.
본 발명의 방법을 수행하기 위해서, 제1 재조합 서열은 목적하는 표적 유전자좌, 예를 들어 진핵세포의 게놈 또는 인공 염색체/미니염색체에의 통합을 가능하게 하는 추가의 DNA 서열을 포함할 수 있다. 이러한 재조합은, 예를 들어 내재적인 세포성 재조합 기작에 의해 매개되는 상동 재조합을 통해 일어난다. 상기 재조합을 위해, 추가의 DNA 서열은 표적 유전자좌의 DNA와 상동성이어야 하고, 각각 attB, attL, attP, attR, attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 또는 이의 유도체 또는 동족체의 3' 및 5' 모두를 정해야 한다. 당업자는 상동 재조합이 충분한 개연성으로 발생하기 위해서 각각의 3' 및 5' 서열이 어느 정도의 상동성 및 길이를 가져야 하는지를 알 수 있다 [참조: Capecchi, M. (1989) Science, 244, pp. 1288].
그러나, 제1 재조합 서열은 진핵세포의 게놈 또는 임의의 인공 염색체/미니염색체로 임의의 다른 기작으로, 예를 들어 내재적인 세포성 재조합 사건에 의해서도 매개되는 무작위 통합을 통해 통합될 수 있다. 통합되는 부위와는 다른 부위를 이용하는, 예를 들어 loxP / FRT 서열을 사용하는 서열-특이적 재조합을 통한 제1 재조합 부위의 통합도 있을 수 있다.
또한, 제2 재조합 서열은 상동 재조합을 통한 목적하는 표적 유전자 좌로의 통합에 필요한 DNA 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 대해, 제1 및/또는 제2 재조합 서열 모두 추가의 DNA 서열을 포함할 수 있다. 2개의 DNA 서열 모두 추가의 DNA 서열을 포함하는 방법이 바람직하다.
추가의 DNA 서열의 존재 또는 부재하에서 제1 및 제2 재조합 서열의 도입은 연속적으로 및 공동-형질전환 (재조합 서열이 2개의 상이한 DNA 분자에 존재한다)으로 수행될 수 있다. 추가의 DNA 서열의 존재 또는 부재하에서 제1 및 제2 재조합 서열이 존재하며 이들이 단일 DNA 분자로 진핵세포에 도입되는 방법이 바람직하다. 또한, 제1 재조합 서열이 세포에 도입되고 제2 재조합 서열이 또 다른 세포에 도입된 후 세포들이 융합될 수 있다. 융합이란 용어는 가장 넓은 범위의 세포 융합뿐만 아니라 유기체의 교차도 의미한다.
본 발명의 방법은 분자내 재조합에서 비-직렬로 (indirectly) 배향된 재조합 서열 사이에 놓인 DNA 절편을 역위시키는데 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 분자내 재조합에서 직렬로 (directly) 배향된 재조합 서열 사이에 놓인 DNA 절편을 결실시키는데 이용될 수 있다. 재조합 서열이 서로 5'-3' 또는 3'-5' 배향으로 삽입되는 경우, 이들은 직렬 배향으로 존재한다. 예를 들어 attB 서열은 5'-3' 배향으로 통합되고 attP 서열은 3'-5' 배향으로 통합되는 경우, 재조합 서열은 비-직렬 배향 (indirect orientation)이다. 재조합 서열이 서로, 예를 들어 상동 재조합을 통해 엑손의 5' 및 3'인 인트론 서열에 삽입되고 재조합이 인테그라제에 의해 수행되는 경우, 엑손은 비-직렬 배향의 재조합 서열의 경우 역위되고 비-직렬 배향의 재조합 서열의 경우 결실될 것이다. 이러한 절차에 따라, 각각의 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩타이드는 이의 활성 또는 기능을 상실하거나, 전사가 역위 또는 결실에 의해 중단되어 어떠한 (완전한) 전사물도 생성되지 않을 수 있다. 이러한 방식으로, 예를 들어 암호화된 폴리펩타이드의 생물학적 기능이 조사될 수 있다. 또한, 역위 또는 결실 반응은, 예를 들어 암호화되는 폴리펩타이드의 개방 판독 프레임을 암호화되는 폴리펩타이드의 전사 및/또는 해독을 가능하게 하는 조절 인자와 기능적으로 연결시킴으로써 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자의 발현을 활성화시키는데 이용될 수 있다. 이들 조절 인자는, 이로 제한됨이 없이, 다양한 진핵세포 발현 시스템에 대해 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있는 프로모터 및/또는 인핸서 인자를 포함한다.
그러나, 제1 및/또는 제2 재조합 서열은 관심있는 하나 이상의 폴리펩타이드/생성물을 암호화하는 추가의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 구조 단백질, 효소적 또는 조절 단백질이 분자내 재조합 후 일시적으로나 안정하게 발현되는 게놈에 재조합 서열을 통해 도입될 수 있다. 도입된 폴리펩타이드/생성물은 내인성 또는 외인성의 것일 수 있다. 또한, 마커 단백질 또는 생물약학적으로 관련된 치료적 폴리펩타이드가 도입될 수 있다. 당업자는 본 발명에 따른 방법의 적용에 대한 이러한 열거가 단지 예시적인 것으로서 제한적이 아니라는 것을 안다.
또한, 본 발명의 방법은 에피솜 기질 (episomal substrate)에서 분자내 재조합에 의해 벡터 상의 DNA 절편을 결실 또는 역위시키는데 이용될 수 있다. 결실 반응은, 예를 들어 소위 헬퍼 바이러스로부터 패키징 서열을 결실시키는데 이용될 수 있다. 이러한 방법은 유전자 치료 적용을 위한 바이러스 벡터의 산업적 생산에서 광범위한 적용을 갖는다.
분자간 재조합은 각각 일 카피의 attB, attP, attL, attR, attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 또는 att 서열의 다양한 조합 또는 이의 유도체 또는 동족체를 갖는 2개의 DNA 분자의 융합을 이끈다. 예를 들어, attB 또는 이의 유도체 또는 동족체는 세포 또는 인공 염색체/미니염색체의 공지되고 널리 특징분석된 게놈성 유전자좌에서 상동 재조합을 통해 도입될 수 있다. 그 후, attB, attP, attL, attR, attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 보유 벡터 또는 DNA-절편이 분자간 재조합을 통해 상기 게놈성 attB 서열에 통합될 수 있다. 재조합이 발생하는 진핵세포에서 돌연변이체인 인테그라제, 예를 들어 Int-h 또는 Int-h/218의 공동-발현이 이러한 방법에서 바람직하다. 돌연변이체인 인테그라제 Int-h/218의 공동-발현이 가장 바람직하다. 임의의 돌연변이체 인테그라제를 암호화하는 유전자는 형질감염될, 바람직하게는 공동-형질감염될 제2 DNA 벡터, 또는 attP, attL, attR, attB, attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 보유하는 벡터 또는 DNA-절편에 위치될 수 있다. 추가의 서열, 예를 들어 loxP / FRT 서열에 의해 플랭킹된 특정 마커 단백질에 대한 유전자가 attB, attP, attL, attR, attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 보유 벡터 또는 DNA-절편에 위치될 수 있다. 이러한 접근으로, 예를 들어 일 세포 유형에서의 상이한 유전자의 상대적인 발현 분석시, 상기 유전자가 각각의 게놈 통합 유전자좌에 대한 포지티브 또는 네거티브 효과에 의해 영향을 받지 않는 것이 달성될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 에피솜 기질에서 분자간 재조합에 의해 벡터 상의 DNA 절편을 융합하는데 이용될 수 있다. 융합 반응은, 예를 들어 표현형을 스크리닝하기 위해서 재조합 단백질 또는 관련 도메인을 발현시키는데 이용될 수 있다. 이러한 방법은 진핵세포에서 단백질 기능의 고효율 (high throughput) 분석에 이용될 수 있다.
상술된 바와 같이, 분자간 재조합은, 예를 들어 에피솜 기질, 인공 염색체/미니염색체, 또는 제1 재조합 서열을 포함하는 다양한 숙주 세포 게놈으로 하나 이상의 목적하는 폴리펩타이드(들)/생성물(들)을 암호화하는 관심있는 하나 이상의 유전자를 도입하는데 이용될 수 있다. 이와 관련해서, 제2 DNA는 하나 이상의 재조합 서열, 예를 들어 attP, attB, attL, attR, attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a, attR.b 또는 이의 유도체 또는 동족체 이외에, 하나 이상의 목적하는 단백질(들)/생성물(들)의 발현을 위한 하나 이상의 발현 카세트(들)을 포함한다. 이 발현 카세트는 제2 재조합 서열을 포함하는 DNA와 발현 카세트 사이의 서열-특이적 재조합을 가능하게 하는 재조합 서열을 통해 목적하는 표적 유전자좌로 도입될 수 있으며, 제1 재조합 서열은 상기 에피솜 기질, 인공 염색체/미니염색체 또는 숙주 세포 게놈에 미리 도입된다. 이러한 양태는 생물약학적 생성물의 생성에 적합한 고발현 세포를 확립하는데 매우 중요할 수 있다.
이와 관련해서, 하나 이상의 재조합 서열을 포함하는 제1 DNA는, 예를 들어 랜덤 통합에 의해 숙주 세포의 게놈, 인공 염색체/미니염색체 또는 숙주 세포에 포함된 에피솜 기질에 도입되어야 한다. 달리, 숙주 세포는 상응하는 하나 이상의 재조합 부위(들)을 포함하는 인공 염색체/미니염색체 또는 에피솜 기질로 형질전환될 수 있다. 박테리오파지 람다 인테그라제 Int에 의해 인식되는 목적하는 표적 유전자좌로 재조합 서열(들)을 통합시키기 위한 또 다른 방법은 상술된 바와 같은 상동 재조합 기술을 이용하는 것이다.
재조합 서열(들)이 목적하는 표적 유전자좌에 도입된 안정한 형질감염체의 선별을 용이하게 하기 위해서, 선별 마커 유전자가 동시에 동일한 표적 유전자좌에 공동-도입된다. 이는, 예를 들어 재조합 서열(들) 및 선별 마커 유전자가 표적 유전자좌로 도입되는 동일한 벡터 또는 DNA 절편에 공동-위치되는 경우, 상술된 임의의 방법 (상동 재조합, 랜덤 통합 등)에 의해 달성될 수 있다. 선별 마커의 발현 수준은 통합 부위에서 전사 활성과 관련되므로, 통합 부위에서 고발현 수준을 보이는 세포, 세포 강건함 및, 예를 들어 생물반응기에서의 양호한 성장 특성이 매우 효과적으로 확인될 수 있다. 선별 마커 유전자의 발현 수준은 당해 기술 분야에서 널리 공지된 방법, 예를 들어 세포에 존재하는 상응하는 mRNA의 양 또는 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 양에 기초하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 도입되는 유전자 서열로부터 전사되는 mRNA는 노던 블롯 하이브리드화, 리보뉴클레아제 RNA 보호, 세포성 RNA에의 원위치 하이브리드화 또는 PCR에 의해 정량될 수 있다. 선택된 서열에 의해 암호화되는 단백질은 다양한 방법, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯팅, 방사선면역검정, 면역침전, 단백질의 생물학적 활성에 대한 검정, 단백질의 면역염색 후 FACS 분석, 또는 형광 단백질의 형광 시그널의 측정에 의해 정량될 수 있다. 이러한 방법에 의해 생물약제를 생성하기 위한 생산 세포주에 대한 우수한 후보가 수득될 수 있다.
통합된 재조합 서열(들) (제1 재조합 서열(들))은 전사 활성 유전자좌로의 박테리오파지 람다 인테그라제 Int에 의한 서열-특이적 재조합을 통해 추가의 DNA 분자, 예를 들어 하나 이상의 추가의 재조합 서열 (제2 재조합 서열)을 보유하는 벡터 또는 DNA 절편을 통합하는 것을 가능하게 한다. 바람직하게는, 하나 이상의 제2 재조합 서열을 포함하는 추가의 DNA 분자는 관심있는 하나 이상의 생물약학적 관련 유전자의 발현을 위한 발현 카세트를 추가로 포함한다. 이를 위해, 바람직하게는 전사 활성 유전자좌에서 숙주 세포 게놈에 통합된, 제1 통합된 재조합 서열을 포함하는 숙주 세포가 박테리오파지 람다 인테그라제 Int를 위한 제2 제조합 서열을 포함하는 DNA 분자로 형질감염되고, 제1 및 제2 재조합 서열 사이의 서열-특이적 재조합, 바람직하게는 제1 재조합 서열을 포함하는 숙주 세포 게놈으로 제2 재조합 서열을 포함하는 DNA 분자의 통합을 가능하게 하는 조건 하에서 배양된다. 제1 및 제2 재조합 서열은, 박테리오파지 람다 인테그라제 Int에 의한 서열 특이적 재조합을 가능하게 하는 attP, attB, attL, attR, attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a, attR.b 또는 이의 유도체 또는 동족체, 또는 이의 임의의 기능성 돌연변이체일 수 있다. 예를 들어, 제1 재조합 서열이 attP 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 경우, 제2 재조합 서열은 attP, attB, attL, attR, attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a, attR.b 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함할 수 있다.
서열-특이적 재조합이 Int에 의해서나 Int 및 XIS, FIS 및/또는 IHF에 의해 수행되는 방법이 바람직하다. 서열-특이적 재조합을 Int, Int 및 XIS 인자, Int 및 IHF, 또는 Int 및 XIS 및 IHF에 의해 수행하는 방법이 가장 바람직하다. 서열-특이적 재조합을 변형된 Int, 바람직하게는 Int-h 또는 Int-h/218에 의해 수행하는 방법이 더욱 바람직하다. 이와 관련하여, XIS 및/또는 IHF와 함께 변형된 Int의 사용도 본 발명의 범위에 속한다.
이러한 접근으로서, 박테리오파지 람다 인테그라제 Int에 대한 제2 재조합 서열을 포함하는 임의의 DNA 서열(들)을 숙주 세포의 공지되고 널리 특징분석되며 규명된 유전자좌에 통합시킨다. 서열-특이적 재조합이 발생한 세포를 선별하기 위해서, 예를 들어 프로모터 또는 프로모터/인핸서의 부재 하에서 선별 마커 유전자를 포함하는 비-기능성 발현 카세트 또는 유전자 암호화 영역의 일부만을 도입할 수 있다. 서열-특이적 재조합이 발생하는 경우에만, 선별 마커의 효율적인 발현을 갖는 완전한 기능성 발현 카세트가 생성됨으로써 서열 특이적 통합을 통해 관심있는 유전자가 통합된 세포의 선별이 가능하게 될 것이다.
본 발명의 방법에 의해, 단순히 규명된 통합 부위에서, 예를 들어 게놈성 유전자좌로 통합된 DNA 서열을 확인함으로써 숙주 세포와 상이한 생산 세포주를 수득할 수 있다. 상이한 세포 클론 사이의 적은 유전적 변화에 기인하여, 생산 세포주의 개발을 위한 보다 일반적인 과정이 이용될 수 있어 클론 선별 및 최적화된 생산 과정의 개발을 위한 시간 및 수용력이 감소될 수 있다. 생산 세포주는 목적하는 폴리펩타이드(들)을 제조하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 양상은
attB, attP, attP.b, attP.a, attL, attL*, attL.a, attR, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 제1 DNA를 세포에 도입하고;
attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 제2 DNA 및 관심있는 하나 이상의 유전자를 세포에 도입하고;
상기 세포를 박테리오파지 람다 인테그라제 Int와 접촉시키고;
박테리오파지 람다 인테그라제 Int에 의한 서열-특이적 재조합을 수행하여 제2 DNA를 제1 DNA에 통합시키고;
상기 세포를 관심있는 유전자(들)가 발현되는 조건 하에서 배양하는 것을 포함하여, 진핵세포에서 하나 이상의 목적하는 폴리펩타이드(들)/생성물(들)을 암호화하는 관심있는 하나 이상의 유전자를 발현시키는 방법에 관한 것이다.
제1 DNA 서열이 attP.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 경우 제2 서열이 attB, attP, attP.b, attP.a, attL, attL*, attL.a, attR, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 방법, 제1 DNA 서열이 attP.a 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 경우 제2 서열이 attB, attP, attP.b, attP.a, attL, attL*, attL.a, attR, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 방법, 제1 DNA 서열이 attL* 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 경우 제2 서열이 attB, attP, attP.b, attP.a, attL, attL*, attL.a, attR, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 방법, 제1 DNA 서열이 attL.a 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 경우 제2 서열이 attB, attP, attP.b, attP.a, attL, attL*, attL.a, attR, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 방법, 제1 DNA 서열이 attR* 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 경우 제2 서열이 attB, attP, attP.b, attP.a, attL, attL*, attL.a, attR, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 방법, 제1 DNA 서열이 attR.a 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 경우 제2 서열이 attB, attP, attP.b, attP.a, attL, attL*, attL.a, attR, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 방법, 또는 제1 DNA 서열이 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 경우 제2 서열이 attB, attP, attP.b, attP.a, attL, attL*, attL.a, attR, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 방법이 바람직하다.
본 발명의 방법의 보다 바람직한 양태에서, 제1 DNA는, 제2 DNA가 세포에 도입되기 전에, 게놈, 인공 염색체/미니염색체 또는 숙주 세포의 에피솜 성분으로, 바람직하게는 높은 전사 활성을 나타내는 부위에서 통합된다.
또한, 본 발명은
attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 DNA 및 관심있는 하나 이상의 유전자를 숙주 세포의 게놈으로 통합된 하나의 attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 숙주 세포에 도입하고;
상기 세포를 박테리오파지 람다 인테그라제 Int와 접촉시키고;
박테리오파지 람다 인테그라제 Int에 의한 서열-특이적 재조합을 수행하여 제2 DNA를 제1 DNA에 통합시키고;
상기 세포를 관심있는 유전자(들)가 발현되는 조건 하에서 배양함을 포함하여, 숙주 세포의 게놈으로 통합된 하나의 attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 포함하는 숙주 세포에서 관심있는 하나 이상의 유전자를 발현하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 숙주 세포 게놈으로 통합되는 attB, attP, attL, attR, attP.b, attP.a, attL*, attL.a, attR*, attR.a 또는 attR.b 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체를 사용하는 것뿐만 아니라 게놈의 천연 발생 재조합 서열, 예를 들어 WO01/16345에 기술된 attH-부위 (5'-GAAATTCTTTTTGATACTAACTTGTGT-3'; 서열번호 14) 또는 Int 또는 이의 임의의 기능성 돌연변이체에 의해 매개되는 서열-특이적 재조합을 가능하게 하는 임의의 다른 재조합 서열을 사용하여 수행될 수 있다.
서열-특이적 재조합이 Int, Int 및 XIS 인자, Int 및 IHF, 또는 Int 및 XIS 및 IHF에 의해 수행되는 방법이 바람직하다. 서열-특이적 재조합이 변형된 Int, 바람직하게는 Int-h 또는 Int-h/218에 의해 수행되는 방법이 바람직하다. 이와 관련하여, XIS 및/또는 IHF와 함께 변형된 Int의 사용이 본 발명의 범위에 속한다. Int, Int-h 또는 Int-h/218, XIS, 및/또는 IHF는 순수한 형태로 세포에 첨가되거나 서열-특이적 재조합이 수행되는 숙주 세포에 의해 공동-발현될 수 있다.
상술된 방법의 추가의 양태는 관심있는 유전자(들)에 의해 암호화되고 숙주 세포에서 발현되는 폴리펩타이드(들)/생성물(들)이 세포, 또는 배양 배지로 분비되는 경우 세포 배양 상청액으로부터 분리되는 방법에 관한 것이다.
생산 세포는 유리하게는 혈청-비함유 배지 및 현탁 배양물에서 목적하는 유전자(들)의 발현에 유리한 조건 하에서 배양되며, 세포 및/또는 세포 배양 상청액으로부터 관심있는 단백질을 분리한다. 바람직하게는, 관심있는 단백질은 배양 배지로부터 분비되는 폴리펩타이드로서 회수되거나 분비 시그널의 부재 하에서 발현되는 경우 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 관심있는 단백질의 실질적 균질 제제를 수득하기 위해 다른 재조합 단백질, 숙주 세포 단백질 및 오염물로부터 관심있는 단백질을 정제하는 것이 필요하다. 제1 단계로서, 종종 세포 및/또는 미립자 세포 파편을 배양 배지 또는 용해물로부터 제거한다. 그 후, 관심있는 생성물을 오염물인 가용성 단백질, 폴리펩타이드 및 핵산으로부터, 예를 들어 면역친화성 또는 이온-교환성 칼럼에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지 상에서의 Sephadex 크로마토그래피에 의해 정제한다. 일반적으로, 숙주 세포에 의해 발현되는 이종 단백질을 정제하는 방법은 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다, 따라서, 관심있는 하나 이상의 유전자를 발현시키는 상술된 방법은, 목적하는 폴리펩타이드가 숙주세포로부터 또는 배양 배지로 분비되는 경우 세포 배양물로부터 정제되는 추가의 정제 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 모든 진핵세포에서 수행될 수 있다. 세포 및 세포주는, 예를 들어 세포 배양물에 존재하며, 이로 제한됨이 없이, 진핵세포, 예를 들어 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포를 포함한다. 예를 들어, 세포는 난모세포, 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포 또는 임의의 유형의 분화된 세포일 수 있다. 진핵세포가 포유동물 세포인 방법이 바람직하다. 포유동물 세포가 사람, 시미안 (simian), 쥐, 래트, 토끼, 햄스터, 염소, 소, 양 또는 돼지 세포인 방법이 보다 바람직하다. 생물약제의 생성을 위한 바람직한 세포주 또는 "숙주 세포"는 사람, 마우스, 래트, 원숭이 또는 설치류 세포주이다. 햄스터 세포, 바람직하게는 BHK21, BHK TK-, CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1, 및 CHO-DG44 세포 또는 임의의 이러한 세포주의 유도체/자손이 보다 바람직하다. CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 및 BHK21이 특히 바람직하고, CHO-DG44 및 CHO-DUKX 세포가 보다 더 바람직하다. 또한, 쥐 골수종 세포, 바람직하게는 NS0 및 Sp2/0 세포 또는 임의의 이러한 세포주의 유도체/자손도 생산 세포주로서 공지되어 있다.
숙주세포는 혈청 비함유 조건 하에서, 임의로 동물 기원의 어떠한 단백질/펩타이드도 없는 배지에서 확립되고 적응되며 완전히 배양되는 것이 가장 바람직하다. 시판 배지, 예를 들어 햄스 (Ham's) F12 (Sigma, Deisenhofen, Germany), RPMI-1640 (Sigma), 둘베코의 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: DMEM; Sigma), 최소 필수 배지 (MEM; Sigma), 이스코브의 변형 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium) (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA), CHO-S-SFMII (Invtirogen), 혈청-비함유 CHO 배지 (Sigma), 및 단백질-비함유 CHO 배지 (Sigma)가 예시적인 적합한 영양 용액이다. 임의의 배지는, 필요한 경우, 하기와 같은 다양한 화합물로 보충될 수 있다: 예를 들어, 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예: 인슐린, 트랜스페린, 상피 성장 인자, 인슐린형 성장 인자), 염 (예: 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 포스페이트), 완충액 (예: HEPES), 뉴클레오사이드 (예: 아데노신, 티미딘), 글루타민, 글루코즈 또는 다른 동등한 에너지원, 항생제, 미량 원소. 또한, 임의의 다른 필요한 보충물도 당업자에게 공지된 적합한 농도로 포함될 수 있다. 본 발명에서, 혈청-비함유 배지의 사용이 바람직하나, 적당량의 혈청으로 보충된 배지도 숙주 세포의 배양을 위해 사용될 수 있다. 적합한 유전자를 발현하는 유전적으로 변형된 세포의 성장 및 선별을 위해, 적합한 선별제를 배양 배지에 가한다.
본 발명의 "목적하는 단백질/폴리펩타이드" 또는 "관심있는 단백질/폴리펩타이드"는 예를 들어, 이로 제한됨이 없이, 인슐린형 성장 인자, hGH, tPA, 사이토카인, 예를 들어 인터루킨 (IL), 예를 들어 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, 인터페론 (IFN) 알파, IFN 베타, IFN 감마, IFN 오메가 또는 IFN 타우 (tau), 종양 괴사 인자 (TNF), 예를 들어 TNF 알파 및 TNF 베타, TNF 감마, TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 및 VEGF이다. 또한, 에리트로포이에틴 또는 효능제 또는 길항제로서 기능하고/하거나 치료 또는 진단 용도를 가질 수 있는 임의의 다른 호르몬 성장 인자 및 임의의 다른 폴리펩타이드가 포함된다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 항체, 예를 들어 모노클로날, 폴리클로날, 다특이적 및 단일 쇄 항체, 또는 이의 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및 Fc'-단편, 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 쇄 및 이들의 불변, 가변 또는 초가변 영역, 및 Fv- 및 Fd-단편의 생성에 유리하게 이용될 수 있다.
Fab 단편 (Fragment antigen-binding = Fab)는 인접한 불변 영역에 의해 서로 붙들린 2개 쇄 모두의 가변 영역으로 이루어진다. 이들은 통상의 항체로부터 프로테아제 분해, 예를 들어 파파인에 의해 형성될 수 있으나, 유사한 Fab 단편이 또한 유전자 조작에 의해 생성될 수 있다. 추가의 항체 단편은 파파인에 의한 단백분해적 절단에 의해 제조될 수 있는 F(ab')2 단편을 포함한다.
유전자 조작 방법을 이용하여, 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 영역만을 이루어진 단축된 항체 단편을 생성할 수 있다. 이는 Fv 단편 (Fragment variable = 가변부의 단편)으로 언급된다. 이들 Fv-단편은 불변쇄의 시스테인에 의한 2개의 쇄에 대한 공유 결합이 없기 때문에, Fv 단편은 종종 안정화된다. 짧은 펩타이드 단편, 예를 들어 10 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 15개의 아미노산에 의해 중쇄와 경쇄의 가변 영역을 연결하는 것이 유리하다. 이러한 방식으로, 펩타이드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL로 이루어진 단일 펩타이드 쇄가 수득된다. 이러한 종류의 항체 단백질이 단일쇄-Fv (scFv)로 공지되어 있다. 이러한 종류의 scFv-항체 단백질의 예는 선행 기술로서 알려져 있다.
최근, scFv를 다량체 유도체로서 제조하기 위한 다양한 전략이 개발되었다. 이는 특히 개선된 약동학 및 생물분배 특성 및 증가된 결합 활성을 갖는 재조합 항체를 만들고자 하는 것이다. scFv의 다량체화를 달성하기 위해서, scFv를 다량체화 도메인을 갖는 융합 단백질로서 제조하였다. 다량체화 도메인은, 예를 들어 IgG의 CH3 영역 또는 감긴 코일 (coiled coil) 구조 (나선 구조), 예를 들어 류신-지퍼 (Leucin - zipper) 도메인일 수 있다. 그러나, scFv의 VH/VL 영역 사이의 상호작용이 다량체화 (예: 디아바디, 트리바디 및 펜타바디)에 대해 이용되는 전략도 있다. 당업자에게 있어 디아바디 (diabody)는 이가 동종이량체 scFv 유도체를 의미한다. scFv 분자의 링커를 5 내지 10개 아미노산으로의 단축시키는 것은 쇄간 VH/VL-중첩이 발생하는 동종이량체의 형성을 이끈다. 디아바디는 디설파이드 브릿지의 삽입에 의해 추가로 안정화될 수 있다. 디아바디-항체 단백질의 예는 선행 기술로서 공지되어 있다.
당업자에게 있어 미니바디 (minibody)는 이가의 동종이량체성 scFv 유도체를 의미한다. 이는 힌지 영역 (예를 들어, IgG1으로부터의 것) 및 링커 영역을 통해 scFv에 연결되는 이량체화 영역으로서 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 가장 바람직하게는 IgG1의 CH3 영역을 포함하는 융합 단백질로 이루어진다. 미니바디-항체 단백질의 예는 선행 기술로서 공지되어 있다.
당업자에게 있어 트리아바디 (triabody)는 삼가 동종삼량체성 scFv 유도체를 의미한다. VH-VL이 링커 서열 없이 직접적으로 융합되는 scFv 유도체가 삼량체의 형성을 이끈다.
또한, 당업자는 이가, 삼가 또는 사가 구조를 갖고 scFv로부터 유도되는 소위 미니항체를 잘 알고 있을 것이다. 다량체화는 이량체, 삼량체 또는 사량체의 감긴 코일 구조에 의해 수행된다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 관심있는 항체는 상술된 목적하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 모노클로날 항체, 이의 유도체 또는 단편을 암호화한다.
본 발명의 양태를 수행하기 위해서, 인테그라제는 재조합 서열에 작용해야 한다. 인테그라제 또는 인테그라제 유전자 및/또는 보조-인자 또는 보조-인자 유전자, 예를 들어 XIS 인자 또는 XIS 인자 유전자 및/또는 IHF 또는 IHF 유전자가 제1 및 제2 재조합 서열을 도입하기 전에 이미 진핵세포에 존재할 수 있다. 또한, 이들은 제1 및 제2 재조합 서열의 도입 사이에 또는 제1 및 제2 재조합 서열의 도입 후에 도입될 수 있다. 재조합효소 및 숙주 인자 단백질의 정제는 문헌 [참조: Nash, H.A. (1983) Methods of Enzymology, 100, pp. 210; Filutowicz, M. et al. (1994) Gene, 147, pp.149]에 기술되어 있다. 이들이 알려져 있지 않은 경우, 세포 추출물이 사용되거나, 예를 들어 Int 또는 Cre 재조합효소에 대해 기술된 절차를 이용하여 효소가 부분적으로 정제될 수 있다. 정제된 단백질은 표준 기술, 예를 들어 주입 또는 미세주입에 의해 또는 IHF에 대해 WO2004/048584의 실시예 3에 기술된 바와 같이 리포펙틴에 의해 도입될 수 있다. 달리, 인테그라제 또는 숙주 인자를 암호화하는 mRNA가 세포에 도입될 수 있다. 서열-특이적 재조합에 사용되는 인테그라제는 바람직하게는 반응이 수행되는 세포에서 발현된다. 이를 위해, 인테그라제 유전자를 포함하는 제3 DNA 서열이 세포에 도입될 수 있다. 서열 특이적 재조합이, 예를 들어 attL/attR로 수행되는 경우, XIS 인자 유전자 (제4 DNA 서열)이 추가로 세포에 도입될 수 있다. 제3 및/또는 제4 DNA 서열이 세포의 진핵세포 게놈 또는 인공 염색체/미니염색체로 상동 재조합 또는 랜덤하게 통합되는 방법이 가장 바람직하다. 제3 및/또는 제4 DNA 서열이 조절 서열을 포함하여 인테그라제 유전자 및/또는 XIS 인자 유전자의 공간적 및/또는 일시적인 발현이 일어나는 방법이 더욱 바람직하다.
이러한 경우, 공간적 발현은, 각각 Int 재조합효소, XIS 인자 및/또는 IHF 인자가 세포 유형 특이적 프로모터의 사용에 의해 특정 세포 유형에서만 발현되고 이들 세포,예를 들어 간 세포, 신장 세포, 신경 세포 또는 면역계의 세포에서만 재조합을 촉매한다는 것을 의미한다. 인테그라제/XIS 인자/IHF 발현의 조절시, 일시적 발현은 특정 발달 단계로부터 또는 특정 발달 단계에서 또는 성숙 유기체에서의 특정 시점에서 활성인 프로모터에 의해 달성될 수 있다. 또한, 일시적 발현은 유도성 프로모터, 예를 들어 인테페론 또는 테트라사이클린 의존적 프로모터의 사용에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 인테그라제는 박테리오파지 람다의 야생형 및 변형된 (돌연변이된) 인테그라제 모두 일 수 있다. 야생형 인테그라제는 단지 보조-인자, 즉 IHF와 함께 고수율로 재조합 반응을 수행할 수 있으므로, 본 발명의 방법에서 변형된 인테그라제를 사용하는 것이 바람직하다. 야생형 인테그라제가 본 발명의 방법에 사용되는 경우, 재조합 반응을 자극하기 위해 IHF가 추가로 필요할 수 있다. 변형된 인테그라제는 상기 인테그라제가 IHF 또는 다른 숙주 인자, 예를 들어 XIS 및 FIS 없이 재조합 반응을 수행할 수 있도록 변형된다. 예를 들어, attL와 attR 서열 사이의 재조합 반응은 숙주 인자의 첨가 없이 변형된 Int로 수행될 수 있다 [참조: WO2004/048584].
변형된 폴리펩타이드의 생성 및 목적하는 활성의 스크리닝은 현 기술 상태에서 쉽게 수행될 수 있다. 예를 들어, 변형된 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열은 시험관내에서 또는 세균 또는 진핵세포로 암호화 서열의 도입시 인테그라제로 전사 및 해독될 임의의 핵산 서열을 포함하고자 한다. 변형된 인테그라제 단백질 암호화 서열은 천연적으로 발생하거나 (자발적 돌연변이에 의함), 암호화되는 폴리펩타이드의 생물학적 작용 활성 (재조합효소 활성을 의미)이 유지되는 한, 천연적 발생 또는 야생형 단백질의 재조합적으로 조작된 돌연변이체 및 변이체, 절단된 버젼 및 단편, 기능성 등가물, 유도체, 동족체 및 융합물일 수 있다. 본 발명의 실시예 또는 WO　01/16345의 실시예 3 및/또는 결과 5.2에서 기술되는 바와 같이 기질 벡터 및 발현 벡터를 사용한 공동-형질감염 검정으로 측정시, 변형된 재조합효소가 야생형 인테그라제 Int 활성의 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 100% 이상의 활성을 갖는 경우, 재조합효소 활성이 유지된다. 특정 아미노산 서열 치환이 인테그라제 또는 이의 기본적인 핵산 암호화서열에 이루어질 수 있으며, 유사한 특성을 갖는 단백질이 수득될 수 있다. 아미노산의 친수도 지수 [참조: Kyte, J. et al. (1982) J. Mol. Biol., 157, pp. 105]에 의해 기능적으로 등가인 인테그라제 폴리펩타이드를 제공하는 아미노산 치환이 기본적인 핵산 서열에서 부위-특이적 돌연변이유발 또는 폴리머라제 연쇄 반응 매개된 돌연변이유발을 수행함으로써 제조될 수 있다. 야생형 단백질과 비교하여 개선된 재조합효소 활성/재조합 효율 또는 하나 이상의 숙주 인자에 독립적인 재조합 활성을 나타내는 돌연변이체 또는 변형된 인테그라제가 본 발명에서 바람직하다. "야생형 단백질"은 암호화된 폴리펩타이드에 대한 완전한, 비절단된, 비변형된, 천연적 발생 유전자를 의미한다. 바람직한 2개의 Int 돌연변이체는 Int-h 및 Int-h/218로 표시되는 박테리오파지 람다 인테그라제이다 [참조: Miller et al. (1980) Cell, 20, pp. 721; Christ, N. and Droge, P. (1999) J. Mol. Biol., 288, pp. 825]. Int-h는 야생형 Int와 비교하여 위치 174에서 글루타메이트 잔기 대신 리신 잔기를 포함한다. Int-h/218은 위치 218에서 글루타메이트 잔기 대신 추가의 리신 잔기를 포함하며, Int-h 유전자의 PCR 돌연변이유발에 의해 생성되었다. 상기 돌연변이체는 이. 콜라이에서, 진핵세포에서 및 시험관내에서 보조-인자 IHF, XIS, 및/또는 FIS 및 네거티브 슈퍼코일링 없이, 즉 반응관에서 정제된 기질로 attB/attB, attP/attP, attL/attL 또는 attR/attR 및 모든 가능한 조합, 예를 들어 attP/attR, attL / attP , attL / attB , 또는 attR / attB 또는 이의 유도체 또는 동족체 사이의 재조합을 촉매할 수 있다. 재조합 효율의 개선이 보조-인자, 예를 들어 FIS로 달성될 수 있다. 돌연변이체 Int-h/218은 증가된 효율로 재조합 반응을 촉매하기 때문에 바람직하다.
제1 반응이 절단을 이끌고 사용된 2개의 재조합 서열이 동일, 예를 들어 attP.b/attP.b인 경우, 재조합 후 생성된 재조합 서열은 기질 상의 서열, 예를 들어 2개의 attP.b 서열과 동일할 것이다. 그러나, 2개의 파트너 서열이 상이한 경우, 예를 들어 attP.b/R인 경우, 재조합 반응은 하나의 서열 (예: attP.b)로부터의 기능성 절반 및 다른 하나의 서열 (attR)로부터의 기능성 절반 서열을 포함하는 하이브리드 재조합 서열을 생성할 것이다. 기능성 절반 재조합 부위는, 서열의 5' 또는 3'가 각각의 경우에서 고려되는 오버랩을 형성하기 때문에, 기능성 절반-부위의 일부로서 정의될 수 있다. 사용된 재조합 서열의 각각의 오버랩 영역이 동일한 경우, 절단 반응은 본 발명에 따른 임의의 재조합 서열로 수행될 수 있다. 또한, 오버랩 영역은 서로에 대한 재조합 서열의 배향, 즉 역위 또는 직렬을 나타낸다. 반응은 야생형 Int를 사용하여 저효율로 수행될 수 있으나, IHF의 첨가 또는 IHF의 부재하에서 코어 결합 부위 이외에 암 결합 부위(들)의 존재는 효율을 증가시킨다. 이 반응은 변형된 Int에 의해 어떠한 보조인자 없이도 수행될 수 있다.
또한, Xis 인자 유전자를 포함하는 추가의 DNA 서열이 세포에 도입되는 방법이 바람직하다. 추가의 DNA 서열이 Xis 인자 유전자의 공간적 및/또는 일시적 발현을 일으키는 조절 DNA 서열을 추가로 포함하는 방법이 가장 바람직하다.
예를 들어, 특정 세포 유형에서 유전자의 활성화/불활성화를 이끄는 Int에 의한 성공적인 통합적 분자내 재조합 (역위) 후, Int의 동시적 발현과 함께 XIS의 유도된 공간적 및/또는 일시적 발현에 의해 나중에 다시 불활성화되거나 활성화될 수 있다.
또한, 본 발명은 진핵세포에서 DNA의 서열 특이적 재조합시 임의의 재조합 서열 또는 이의 유도체 또는 동족체, 예를 들어 attP.b (서열번호 3)의 유도체 또는 동족체의 용도에 관한 것이다. 진핵세포는 이의 세포에 인테그라제 또는 Xis 인자를 갖지 않는 유기체, 예를 들어 포유동물의 세포 집합체로 존재할 수 있다. 상기 유기체는 다른 유기체 (이의 세포에 인테그라제 또는 Xis 인자를 가짐)와의 번식에 사용되어 자손 (서열 특이적 재조합이 자손의 세포에서 수행됨)이 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 진핵세포에서 서열 특이적 재조합시 인테그라제 또는 인테그라제 유전자 및 Xis 인자 또는 Xis 인자 유전자 및 IHF 인자 또는 IHF 인자 유전자의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법이 수행된 후 수득되는 진핵세포 및 세포주에 관한 것이다.
본 발명의 실시는, 달리 지시되지 않는 한, 당해 기술 분야에 속하는 세포 생물학, 분자 생물학, 세포 배양, 면역학 등의 통상의 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 통용되는 문헌에 충분히 기술되어 있다. 본원에 언급되는 모든 공개문 및 특허원은 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자의 수준을 나타낸 것이다. 본원에서 인용되는 모든 공개문 및 특허원은 본 발명이 속하는 기술의 현 상태를 보다 충분히 기술하기 위해 전부 참조로 본원에 삽입된다. 상기에서 일반적으로 기술된 본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 보다 쉽게 이해될 것이며, 하기 실시예는 본 발명의 특정 양태를 설명하고자 포함된 것으로서 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예
방법
세포 배양 및 형질감염
CHO-DG44/dhfr-/- 세포 [참조: Urlaub, G. et al, (1983), Cell, 33, pp. 405]를 하이포크산틴 및 티미딘 (HT)으로 보충된 혈청-비함유 배지 CHO-S-SFMII (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, DE)에서 현탁물로 불변하게 성장시켰으며, 5% CO2를 포함하는 가습 대기에서 37 ℃에서 세포 배양 플라스크에서 항온배양하였다. 세포의 수 및 세포 생존성을 Cedex (Innovatis)을 통해 측정하였다. 세포를 2 내지 3일 간격으로 신선한 배지에 1 내지 3 x 105개 세포/mL의 농도로 시딩하였다.
CHO-DG44 세포의 일시적 형질감염을 리포펙타민 플러스 (Lipofectamine Plus) 시약 (Invitrogen)을 사용하여 수행하였다. 형질감염 당 0.8 mL 하이포크산틴/티미딘 (HT)-보충된 CHO-S-SFMII 배지 중의 6 x 105개 대수 성장 세포를 6-웰 챔버의 웰에 시딩하였다. 각각의 형질감염을 위해 용적 200 μL 중에 플라스미드 DNA, 4 μL 리포펙타민 및 6 μL 플러스 시약의 혼합물을 제조하여 제작자의 프로토콜에 따라 세포에 가하였다. 3시간 동안 항온배양한 후, 2 mL의 HT-보충된 CHO-S-SFMII 배지를 가하였다.
형질감염된 CHO - DG44 세포로부터 플라스미드 DNA 의 분리
플라스미드 DNA의 분리를 위한 세포를 형질감염 48시간 후에 수거하고, 세포 (1.5 mL 세포 현탁물)을 마이크로원심분리기에서 1분 동안 7000 rpm으로 원심분리시켜 펠릿화시켰다. 세포 용해 및 플라스미드 DNA의 추출을 위해, QIAprep Spin Miniprep을 제작자 (Qiagen)의 프로토콜에 따라 이용하였다. 플라스미드 DNA를 100 μL EB 완충액에 용출시켰다.
PCR
형질감염된 세포 풀로부터 추출된 분리된 플라스미드 DNA를 분자간 재조합을 검출하기 위한 PCR에서 주형으로서 사용하였다. 반응 구성은 하기와 같다:
1.0 μL 플라스미드 DNA
0.5 μL 프라이머 CENfor2 (10 μM; 서열번호 15)
0.5 μL 프라이머 ZsGrev1 (10 μM; 서열번호 16)
10.5 μL dH2O
12.5 μL 2x GoTaq Green Mastermix (Promega)
초기 변성 (94 ℃, 30초), 이어서 30 사이클의 변성 (94 ℃, 10초), 어닐링 (60 ℃, 10초) 및 연장 (72 ℃, 30초) 및 최종 연장 단계 (72 ℃, 5분). 5 μL의 각각의 PCR 샘플을 2% 아가로즈 겔에 로딩하고 전기영동으로 분리시켰다.
벡터 시스템
pBI-26/attP: CMV 프로모터 및 연속해서 attP 서열 (서열번호 2) 포함
pBI-26/attP.b: CMV 프로모터 및 연속해서 attP 변이체 attP.b (서열번호 3) 포함
pBI-26/attP.a: CMV 프로모터 및 연속해서 attP 변이체 attP.a (서열번호 4) 포함
pBI-26/attL: CMV 프로모터 및 연속해서 attL 서열 (서열번호 12) 포함
pBI-26/attL.a: CMV 프로모터 및 연속해서 attL 변이체 attL.a (서열번호 7) 포함
pZsGreen/attB: 개시 코돈 상류에 attB-서열 (서열번호 1)과 함께 프로모터가 없는 형광 녹색 단백질 포함
pZsGreen/attP.b : 개시 코돈 상류에 attP 변이체 attP.b (서열번호 3)와 함께 프로모터가 없는 형광 녹색 단백질 포함
pZsGreen/attP.a: 개시 코돈 상류에 attP 변이체 attP.a (서열번호 4)와 함께 프로모터가 없는 형광 녹색 단백질 포함
pZsGreen/attR: 개시 코돈 상류에 attR-서열 (서열번호 13)과 함께 프로모터가 없는 형광 녹색 단백질 포함
pZsGreen/attR.a: 개시 코돈 상류에 attR 변이체 attR.a (서열번호 10)와 함께 프로모터가 없는 형광 녹색 단백질 포함
pZsGreen/attR.b : 개시 코돈 상류에 attR 변이체 attR.b (서열번호 11)와 함께 프로모터가 없는 형광 녹색 단백질 포함
pBI-26/ZsGreen: 형질감염 효율을 측정하기 위한 양성 대조군; CMV 프로모터의 조절 하에 형광 녹색 단백질을 발현
pCMV SS Inth218: CMV 프로모터의 조절 하에 람다 인테그라제 Int-h/218을 발현
pIHF: CMV 인핸서/베타-액틴 프로모터 (닭)의 조절 하에 C-말단 His-Tag를 갖는 IHF를 발현
pBI/TI-X: CMV 인핸서/UbS27a 프로모터 (햄스터)의 조절 하에 XIS (절단 인자)를 발현
실시예 1: CHO - DG44 세포에서 att P - 변이체 att P .b를 사용한 분자간 재조합
attP 변이체 attP.b (서열번호 3)는 attP 야생형 서열 (서열번호 2)과 비교하여 9개의 치환을 포함한다. 이는 96.3%의 서열 상동성에 해당한다 (도 1):
Figure 112010034362890-pct00001
9개의 치환이 IHF, XIS, FIS 및 Int에 대한 결합 부위에 위치하기 때문에, attP 변이체 attP.b가 혈청 비함유 배양 조건 하의 현탁 적응된 CHO-DG44 세포에서 또 다른 재조합 부위와 여전히 재조합할 수 있는지를 시험하였다. 재조합 반응을 촉매하기 위해, 람다 인테그라제, 구체적으로 Int-h/218 인테그라제가 사용되었다.
먼저, CHO-DG44 세포를 람다 인테그라제 Int-h/218 및 IHF 암호화 플라스미드로 형질감염시켰다. 3개의 상이한 유형의 형질감염된 세포 풀을 생성하였다:
- 세포 풀당 lμg pCMV SS Inth218을 사용하여 형질감염
- 세포 풀당 각각 450 ng pCMV SS Inth218 및 600 ng pIHF를 사용하여 형질감염
- 어떠한 플라스미드도 가하지 않고 모의-형질감염된 세포 풀 (배경 형광에 대한 대조군으로 사용됨)
제1 형질감염한지 24시간 후, 세포 풀을 재조합 서열을 포함하는 하기 조합의 기질 벡터를 사용하여 다시 형질감염시켰다:
a) pBI26/ZsGreen (= 양성 대조군으로 사용) (500 ng)
b) pBI-26/attP (500 ng) + pZsGreen/attB (500 ng)
c) pBI-26/attP.b (500 ng) + pZsGreen/attB (500 ng)
d) pBI-26/attP.b (500 ng) + pZsGreen/attP.b (500 ng)
상기 열거된 조합의 형질감염된 세포 풀 각각에 모든 플라스미드 조합이 삽입되었다 (조합당 6개의 풀 각각이 형질감염되었다). 배경 형광을 측정하기 위한 음성 대조군으로서 사용되는 모의-형질감염된 세포에 대해서는, 기질 벡터 조합당 단지 2개의 풀이 형질감염되었다.
제2 형질감염한지 48시간 후, 세포를 FACScalibur (Becton Dickinson)를 사용하여 분석하였다. 자료의 분석은 CellQuest-소프트웨어 (Becton Dickinson)를 사용하여 수행하였다.
양성 대조 벡터 pBI-26/ZsGreen로 형질감염된 세포 풀에서의 형광 세포의 비율을 측정함으로써 결정된 형질감염 효율은 혈청-비함유 배지에서의 현탁 적응된 CHO-DG44 세포에서 평균 20 내지 25%였다.
각각 attP와 attB, attP.b와 attB 또는 attP.b와 attP.b 재조합 서열 사이의 성공적인 분자간 통합적 재조합의 결과로서, 형광 단백질은 CMV 프로모터의 조절하에 놓여야 한다. 형광 단백질의 발현은 재조합 사건에 대한 리포터로서 기능한다.
기질 벡터로 형질감염된 세포의 FACS 분석은, attP와 attB, attP.b와 attB 및 attP.b의 쌍 사이에서 성공적인 분자간 재조합 사건이 있다는 것을 보였다 (도 2).
세포가 인테그라제 및 IHF 발현 벡터의 조합으로 먼저 형질감염되는 실험 구성에서의 형광 세포의 비율은 attP.b와 attB 기질 벡터 사이의 분자간 재조합에 대해서는 평균 1.2%, attP.b와 attP.b 기질 벡터 사이의 분자간 재조합에 대해서는 1.5%, attP와 attB 기질 벡터 사이의 분자간 재조합에 대해서는 1.7%였다. 세포가 단지 인테그라제 발현 벡터로 미리-형질감염되는 실험 구성에서의 형광 세포의 비율은 낮았다. attP.b와 attB 기질 벡터 사이의 분자간 재조합에 대해서는 평균 0.3%, attP.b와 attP.b 기질 벡터 사이의 분자간 재조합에 대해서는 평균 0.4%, attP와 attB 기질 벡터 사이의 분자간 재조합에 대해서는 평균 1.1%였다. 상술된 모든 경우에서, 배경 형광은, 상응하는 플라스미드는 사용하였으나 람다-인테그라제 및 IHF를 암호화하는 플라스미드는 첨가하지 않고 형질감염시킨 세포의 FACS 분석에 기초하여, 먼저 감산하였다. 놀랍게도, attP.b 변이체는, IHF, XIS, FIS 및 Int에 대한 결합 부위에 치환이 위치되지만, attB 서열과의 부위-특이적 재조합 및 또 다른 attP.b 서열과의 부위-특이적 재조합을 여전히 매개할 수 있었다.
실시예 2: CHO - DG44 세포에서 att P 변이체 att P .a 및 att P .b 및 att P 야생형을 사용한 분자간 재조합
attP 변이체 attP.a (서열번호 4)는 attP 야생형 서열 (서열번호 2)과 비교하여 9개의 치환을 포함한다. 이는 96.3%의 서열 상동성에 해당한다 (도 3):
Figure 112010034362890-pct00002
attP 변이체 attP.b (서열번호 3)는 attP 야생형 서열 (서열번호 2)과 비교하여 9개의 치환을 포함한다. 이는 96.3%의 서열 상동성에 해당한다 (도 1):
Figure 112010034362890-pct00003
치환이 IHF, XIS, FIS 및/또는 Int에 대한 결합 부위에 위치하기 때문에, attP 변이체가 혈청 비함유 배양 조건 하의 현탁 적응된 CHO-DG44 세포에서 동일한 제2의 attP 변이체와 여전히 재조합할 수 있는지를 시험하였다. 재조합 반응을 촉매하기 위해, 람다 인테그라제, 구체적으로 Int-h/218 인테그라제가 사용되었다.
현탁 적응된 CHO-DG44 세포를 혈청-비함유 배지에서 재조합 서열을 포함하는 하기 조합의 기질 벡터 (각각 3개의 세포 풀)로 형질감염시켰다:
a) pBI-26/attP.b (200 ng) + pZsGreen/attP.b (200 ng)
b) pBI-26/attP.a (200 ng) + pZsGreen/attP.a (200 ng)
c) pBI-26/attP (200 ng) + pZsGreen/attP (200 ng)
모든 경우에서, 세포를 람다 인테그라제 Int-h/218를 암호화하는 플라스미드 pCMV SS Inth218 (300 ng)으로 공동-형질감염시켰다.
형질감염한지 72시간 후, 세포를 FACScalibur (Becton Dickinson)를 사용하여 분석하였다. 자료의 분석은 CellQuest-소프트웨어 (Becton Dickinson)를 사용하여 수행하였다.
각각 attP.b와 attP.a 또는 attP 재조합 서열 쌍 사이의 성공적인 분자간 통합적 재조합의 결과로서, 형광 단백질은 CMV 프로모터의 조절하에 놓여야 한다. 형광 단백질의 발현은 재조합 사건에 대한 리포터로서 기능한다.
기질 벡터로 형질감염된 세포의 FACS 분석은, 야생형 attP 쌍 사이뿐만 아니라 attP.b와 attP.a 쌍 사이에서 성공적인 분자간 재조합 사건이 있다는 것을 보였다 (도 4).
형광 세포의 비율은 attP.b 기질 벡터 쌍 사이의 분자간 재조합에 대해서는 평균 2%, attP.a 기질 벡터 쌍 사이의 분자간 재조합에 대해서는 1.9%, attP 기질 벡터 쌍 사이의 분자간 재조합에 대해서는 1.9%였다 (각각의 3개의 형질감염된 세포 풀로부터의 평균값).
상술된 모든 경우에서, 배경 형광은, 상응하는 플라스미드 조합은 사용하였으나 모의 플라스미드로서 람다-인테그라제를 발현하는 플라스미드보다는 오히려 공 (empty) 벡터 (300 ng)를 첨가하여 형질감염시킨 세포의 FACS 분석에 기초하여, 먼저 감산하였다.
놀랍게도, 모든 attP 변이체는, IHF, XIS, FIS 및/또는 Int에 대한 결합 부위에 치환이 위치되지만, 부위-특이적 재조합을 여전히 매개할 수 있었다.
실시예 3: CHO - DG44 세포에서 att L 과 att R 변이체 사이의 분자간 재조합
attL 변이체 attL.a (서열번호 7)는 attL 야생형 서열 (서열번호 12)과 비교하여 1개의 치환을 포함한다. 이는 99%의 서열 상동성에 해당한다 (도 5):
Figure 112010034362890-pct00004
attR 변이체 attR.a (서열번호 10)는 attR 야생형 서열 (서열번호 13)과 비교하여 8개의 치환을 포함한다. 이는 95.1%의 서열 상동성에 해당한다 (도 6):
Figure 112010034362890-pct00005
attR 변이체 attR.b (서열번호 11)는 attR 야생형 서열 (서열번호 13)과 비교하여 8개의 치환을 포함한다. 이는 95.1%의 서열 상동성에 해당한다 (도 6):
Figure 112010034362890-pct00006
다양한 attL 재조합 부위가 혈청 비함유 배양 조건 하의 현탁 적응된 CHO-DG44 세포에서 다양한 attR 재조합 부위와 재조합할 수 있는지를 시험하였다. 재조합 반응을 촉매하기 위해, 람다 인테그라제, 구체적으로 Int-h/218 인테그라제가 사용되었다.
먼저, CHO-DG44 세포를 람다 인테그라제 Int-h/218, IHF 암호화 및 XIS 암호화 플라스미드로 형질감염시켰다. 2개의 상이한 유형의 형질감염된 세포 풀을 생성하였다:
a) 세포 풀당 각각 400 ng pCMV SS Inth218, 400 ng pIHF 및 400 ng pBI/TI-X를 사용하여 형질감염
b) 어떠한 플라스미드도 가하지 않고 모의-형질감염된 세포 풀 (배경 형광에 대한 대조군으로 사용됨)
제1 형질감염한지 24시간 후, 세포 풀을 등몰량으로 재조합 서열을 포함하는 하기 조합의 기질 벡터를 사용하여 다시 형질감염시켰다:
a) pBI-26/ZsGreen (= 양성 대조군으로 사용) (650 ng)
b) pBI-26/attL (600 ng) + pZsGreen/attR (350 ng)
c) pBI-26/attL.a (600 ng) + pZsGreen/attR.a (350 ng)
d) pBI-26/attL.a (600 ng) + pZsGreen/attR.b (350 ng)
상기 열거된 조합의 형질감염된 세포 풀 각각에 모든 플라스미드 조합이 삽입되었다 (조합당 3개의 풀 각각이 형질감염되었다). 배경 형광을 측정하기 위한 음성 대조군으로서 사용되는 모의-형질감염된 세포에 대해서는, 기질 벡터 조합당 단지 1개의 풀이 형질감염되었다.
제2 형질감염한지 48시간 후, 세포를 FACScalibur (Becton Dickinson)를 사용하여 분석하였다. 자료의 분석은 CellQuest-소프트웨어 (Becton Dickinson)를 사용하여 수행하였다.
양성 대조 벡터 pBI-26/ZsGreen로 형질감염된 세포 풀에서의 형광 세포의 비율을 측정함으로써 결정된 형질감염 효율은 혈청-비함유 배지에서의 현탁 적응된 CHO-DG44 세포에서 평균 23.8%였다.
각각 attL과 attR, attL.a와 attR.a 또는 attL.a와 attR.b 재조합 서열 사이의 성공적인 분자간 통합적 재조합의 결과로서, 형광 단백질은 CMV 프로모터의 조절하에 놓여야 한다. 형광 단백질의 발현은 재조합 사건에 대한 리포터로서 기능한다.
기질 벡터로 형질감염된 세포의 FACS 분석은, 시험 시리즈의 모든 조합 사이에서 성공적인 분자간 재조합 사건이 있다는 것을 보였다 (도 7).
형광 세포의 비율은 attL과 attR 기질 벡터 사이의 분자간 재조합에 대해서는 평균 3.2%, attL.a과 attR.a 기질 벡터 사이의 분자간 재조합에 대해서는 평균 2.3%, attL.a와 attR.b 기질 벡터 사이의 분자간 재조합에 대해서는 평균 1.2%였다. 상술된 모든 경우에서, 배경 형광은, 상응하는 플라스미드는 사용하였으나 람다-인테그라제, IHF 및 XIS를 암호화하는 플라스미드는 첨가하지 않고 형질감염시킨 세포의 FACS 분석에 기초하여, 먼저 감산하였다. 23.8%의 형질감염 평균 효율에 기초할 때, 형질감염된 세포의 5 내지 13%는 야생형 attL과 attR 기질 벡터 사이에서 및 attL 및 attR 변이체를 포함하는 기질 벡터 사이에서 성공적인 분자간 재조합을 나타내었다. ZsGreen 형광 상대 평균 (X-평균)은 상당히 증가하였으며, 기질 벡터의 쌍으로 형질감염된 세포 풀에 대해 96 내지 216의 범위였다 (도 7). 이와 비교하여, 음성 대조군 (모의-형질감염된 세포, 플라스미드 첨가 없음)은 ZsGreen 형광 상대 평균이 13이고, pBI-26/ZsGreen으로 형질감염된 양성 대조 세포는 ZsGreen 형광 상대 평균이 733이었다.
성공적인 분자간 재조합을 확인하기 위해, 형질감염된 세포 풀로부터 분리된 플라스미드 DNA에 대한 PCR을 프라이머 조합 CENfor2 (서열번호 15) 및 ZsGrev1 (서열번호 16)을 사용하여 수행하였다. 기질 벡터 쌍 사이의 성공적인 분자간 재조합의 경우, pZsGreen/att-벡터에 위치된 ZsGreen은 이들 사이의 상응하는 부착 부위와 함께 pBI-26/att-벡터에 위치된 CMV 인핸서/프로모터의 조절 하에 들어온다. 그 결과, 상술된 프라이머를 사용한 PCR 생성물은 단지 성공적인 재조합 사건의 경우에만 발생한다. 실제로, pCMV SS Inth218, pIHF 및 pBI/TI-X로 미리-형질감염되고 그 후 기질 벡터의 쌍으로 제2 형질감염된 모든 세포 풀에서, 약 380 bp의 예측된 PCR 생성물이 검출되었다. 기질 벡터의 쌍을 사용한 제2 형질감염으로 형질감염된 모의 사전-형질감염된 세포 풀에서는 어떠한 PCR 생성물도 수득되지 않는다.
실시예 4: CHO - DG44 세포에서 att L 와 att B 변이체 및 att P 와 att R 변이체 사이의 분자간 재조합
하기에 나타낸 attL 변이체 attL.a (서열번호 7)는 attL 야생형 서열 (서열번호 12)과 비교하여 1개의 치환을 포함한다. 이는 99%의 서열 상동성에 해당한다 (도 5):
Figure 112010034362890-pct00007
하기에 나타낸 attR 변이체 attR.a (서열번호 10)는 attR 야생형 서열 (서열번호 13)과 비교하여 8개의 치환을 포함한다. 이는 95.1%의 서열 상동성에 해당한다 (도 6):
Figure 112010034362890-pct00008
하기에 나타낸 attR 변이체 attR.b (서열번호 11)는 attR 야생형 서열 (서열번호 13)과 비교하여 8개의 치환을 포함한다. 이는 95.1%의 서열 상동성에 해당한다 (도 6):
Figure 112010034362890-pct00009
혈청 비함유 배양 조건 하의 현탁 적응된 CHO-DG44 세포에서 attP가 attR 변이체와 재조합하고 attB가 attL 변이체와 재조합할 수 있는지를 시험하였다. 재조합 반응을 촉매하기 위해서, 람다 인테그라제, 특히 Int-h/218 인테그라제를 사용하였다.
먼저, CHO-DG44 세포를 람다 인테그라제 Int-h/218, IHF 암호화 및 XIS 암호화 플라스미드로 형질감염시켰다. 2개의 상이한 유형의 형질감염된 세포 풀을 생성하였다:
a) 세포 풀당 각각 400 ng pCMV SS Inth218, 400 ng pIHF 및 400 ng pBI/TI-X를 사용하여 형질감염
b) 어떠한 플라스미드도 가하지 않고 모의-형질감염된 세포 풀 (배경 형광에 대한 대조군으로 사용됨)
제1 형질감염한지 24시간 후, 세포 풀을 등몰량으로 재조합 서열을 포함하는 하기 조합의 기질 벡터를 사용하여 다시 형질감염시켰다:
a) pBI-26/ZsGreen (= 양성 대조군으로서 사용) (650 ng)
b) pBI-26/attL (600 ng) + pZsGreen/attB (350 ng)
c) pBI-26/attL.a (600 ng) + pZsGreen/attB (350 ng)
d) pBI-26/attP (600 ng) + pZsGreen/attR (350 ng)
e) pBI-26/attP (600 ng) + pZsGreen/attR.a (350 ng)
f) pBI-26/attP (600 ng) + pZsGreen/attR.b (350 ng)
상기 열거된 조합의 형질감염된 세포 풀 각각에 모든 플라스미드 조합이 삽입되었다 (조합당 3개의 풀 각각이 형질감염되었다). 배경 형광을 측정하기 위한 음성 대조군으로서 사용되는 모의-형질감염된 세포에 대해서는, 기질 벡터 조합당 단지 1개의 풀이 형질감염되었다.
제2 형질감염한지 48시간 후, 세포를 FACScalibur (Becton Dickinson)를 사용하여 분석하였다. 자료의 분석은 CellQuest-소프트웨어 (Becton Dickinson)를 사용하여 수행하였다.
양성 대조 벡터 pBI-26/ZsGreen로 형질감염된 세포 풀에서의 형광 세포의 비율을 측정함으로써 결정된 형질감염 효율은 혈청-비함유 배지에서의 현탁 적응된 CHO-DG44 세포에서 평균 22%였다.
각각 attL와 attB, attL.a와 attB, attP와 attR, attP와 attR.a 또는 attP와 attR.b 재조합 서열 사이의 성공적인 분자간 통합적 재조합의 결과로서, 형광 단백질은 CMV 프로모터의 조절하에 놓여야 한다. 형광 단백질의 발현은 재조합 사건에 대한 리포터로서 기능한다.
놀랍게도, 기질 벡터로 형질감염된 세포의 FACS 분석은, 시험 시리즈 중 통상적이지 않은 교차-조합의 attL와 attB 변이체 및 attR와 attP 변이체 사이에서 성공적인 분자간 재조합 사건이 있다는 것을 보였다 (도 8).
형광 세포의 비율은 attL과 attB 기질 벡터 사이의 분자간 재조합에 대해서는 평균 2.3%, attL.a과 attB 기질 벡터 사이의 분자간 재조합에 대해서는 평균 2%, attP와 attR 기질 벡터 사이의 분자간 재조합에 대해서는 평균 2.3%, attP와 attR.a 기질 벡터 사이의 분자간 재조합에 대해서는 평균 1.5%, attP와 attR.b 기질 벡터 사이의 분자간 재조합에 대해서는 평균 1.1%였다. 상술된 모든 경우에서, 배경 형광은, 상응하는 플라스미드는 사용하였으나 람다-인테그라제, IHF 및 XIS를 암호화하는 플라스미드는 첨가하지 않고 형질감염시킨 세포의 FACS 분석에 기초하여, 먼저 감산하였다. 22%의 형질감염 평균 효율에 기초할 때, 형질감염된 세포의 5 내지 10.5%는 attL의 변이체와 attB 기질 벡터 사이에서 및 attP 및 attR 변이체를 포함하는 기질 벡터 사이에서 성공적인 분자간 재조합을 나타내었다. ZsGreen 형광 상대 평균 (X-평균)은 상당히 증가하였으며, 기질 벡터의 쌍으로 형질감염된 세포 풀에 대해 65 내지 403의 범위였다 (도 8). 이와 비교하여, 음성 대조군 (모의-형질감염된 세포, 플라스미드 첨가 없음)은 ZsGreen 형광 상대 평균이 15이고, pBI-26/ZsGreen으로 형질감염된 양성 대조 세포는 ZsGreen 형광 상대 평균이 640이었다.
실시예 5: CHO - DG44 세포에서 att L 과 att B 변이체 사이의 분자간 재조합의 PCR 방법에 의한 확인
CHO-DG44 세포를 람다 인테그라제 Int-h/218, IHF 암호화 및 XIS 암호화 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포 풀의 2개의 상이한 유형이 생성되었다:
c) 세포 풀당 각각 400 ng pCMV SS Inth218, 400 ng pIHF 및 400 ng pBI/TI-X를 사용하여 형질감염
d) 어떠한 플라스미드도 가하지 않고 모의-형질감염된 세포 풀 (배경 형광에 대한 대조군으로서 사용됨)
제1 형질감염한지 24시간 후, 세포 풀을 재조합 서열을 포함하는 하기 조합의 기질 벡터를 사용하여 다시 형질감염시켰다:
a) pBI-26/attL (600 ng) + pZsGreen/attB (350 ng)
b) pBI-26/attL.a (600 ng) + pZsGreen/attB (350 ng)
상기 열거된 조합의 형질감염된 세포 풀 각각에 모든 플라스미드 조합이 삽입되었다 (조합당 3개의 풀 각각이 형질감염되었다). 배경 형광을 측정하기 위한 음성 대조군으로서 사용되는 모의-형질감염된 세포에 대해서는, 기질 벡터 조합당 단지 1개의 풀이 형질감염되었다.
제2 형질감염한지 48시간 후, 플라스미드 DNA를 형질감염된 세포 풀로부터 분리하였다. attL와 attB 기질 벡터 사이의 성공적인 분자간 재조합을 확인하기 위해, 분리된 플라스미드 DNA에 대한 PCR을 프라이머 조합 CENfor2 (서열번호 15) 및 ZsGrev1 (서열번호 16)를 사용하여 수행하였다. 기질 벡터 쌍 사이의 성공적인 분자간 재조합의 경우, pZsGreen/att-벡터에 위치된 ZsGreen은 이들 사이의 상응하는 부착 부위와 함께 pBI-26/att-벡터에 위치된 CMV 인핸서/프로모터의 조절 하에 들어온다. 그 결과, 상술된 프라이머를 사용한 PCR 생성물은 단지 성공적인 재조합 사건의 경우에만 발생한다. 실제로, pCM SS Inth218, pIHF 및 pBI/TI-X로 미리-형질감염되고 그 후 기질 벡터의 쌍으로 제2 형질감염된 모든 세포 풀에서, 약 400 bp의 예측된 PCR 생성물이 검출되었다 (도 9). 기질 벡터의 쌍을 사용한 제2 형질감염으로 형질감염된 모의 사전-형질감염된 세포 풀에서는 어떠한 PCR 생성물도 수득되지 않는다.
서열 표:
서열번호 1 attB (이. 콜라이)
서열번호 2 attP (박테리오파지 람다 DNA)
서열번호 3 attP.b (인공적)
서열번호 4 attP.a (인공적)
서열번호 5 결합 부위 컨센서스 모티브
서열번호 6 attL* (인공적)
서열번호 7 attL.a (인공적)
서열번호 8 attR* (인공적)
서열번호 9 결합 부위 컨센서스 모티브
서열번호 10 attR.a (인공적)
서열번호 11 attR.b (인공적)
서열번호 12 attL (이. 콜라이)
서열번호 13 attR (이. 콜라이)
서열번호 14 attH (호모 사피엔스 DNA)
서열번호 15 프라이머 CENfor2
서열번호 16 프라이머 ZsGrev1
<110> Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG <120> Novel recombination sequences <130> P01-2313 <150> EP 07122004.0 <151> 2007-11-30 <150> EP 08157764.5 <151> 2008-06-06 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 ctgctttttt atactaactt g 21 <210> 2 <211> 243 <212> DNA <213> Bacteriophage lambda <400> 2 tctgttacag gtcactaata ccatctaagt agttgattca tagtgactgc atatgttgtg 60 ttttacagta ttatgtagtc tgttttttat gcaaaatcta atttaatata ttgatattta 120 tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt tatactaagt tggcattata aaaaagcatt 180 gcttatcaat ttgttgcaac gaacaggtca ctatcagtca aaataaaatc attatttgat 240 ttc 243 <210> 3 <211> 243 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> attP.b <400> 3 gctgttacag gtcactaata ccatctacgt agttgattca tattgtctgc atatcttgtg 60 ttttacagta ttatctagtc tgttttttat ccaaaatcta atttattata ttgatattta 120 tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt tatactaagt tggcattata aaaaagcatt 180 gcttatcaat ttgttgcaac gaacaggtca ctatcagtca aaatataatc attatttgat 240 ttc 243 <210> 4 <211> 243 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> attP.a <400> 4 gctgttacag gtcactaata ccatctatgt agttgattca tattgtctgc atatcttgtg 60 ttttacagta ttatctagtc tgttttttat ccaaaatcta atttattata ttgatattta 120 tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt tatactaagt tggcattata aaaaagcatt 180 gcttatcaat ttgttgcaac gaacaggtca ctatcagtca aaatataatc attatttgat 240 ttc 243 <210> 5 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> binding site consensus motive <400> 5 cagtcactat 10 <210> 6 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> att L* <400> 6 ctgctttttg atactaagtt ggcattataa aaaagcattg cttatcaatt tgttgcaacg 60 aacaggtcac tatcagtcaa aataaaatca ttatttgatt tc 102 <210> 7 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> attL.a <400> 7 ctgctttttt atactaagtt ggcattataa aaaagcattg cttatcaatt tgttgcaacg 60 aacaggtcac tatcagtcaa aatataatca ttatttgatt tc 102 <210> 8 <211> 162 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> attR* <400> 8 tctgttacag gtcactaata ccatctaagt agttgattca tagtgactgc atatgttgtg 60 ttttacagta ttatgtagtc tgttttttat gcaaaatcta atttaatata ttgatattta 120 tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt gatactaact tg 162 <210> 9 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> binding site consensus motive <400> 9 aagtcactat 10 <210> 10 <211> 162 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> attR.a <400> 10 gctgttacag gtcactaata ccatctatgt agttgattca tattgtctgc atatcttgtg 60 ttttacagta ttatctagtc tgttttttat ccaaaatcta atttattata ttgatattta 120 tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt tatactaact tg 162 <210> 11 <211> 162 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> attR.b <400> 11 gctgttacag gtcactaata ccatctacgt agttgattca tattgtctgc atatcttgtg 60 ttttacagta ttatctagtc tgttttttat ccaaaatcta atttattata ttgatattta 120 tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt tatactaact tg 162 <210> 12 <211> 102 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 12 ctgctttttt atactaagtt ggcattataa aaaagcattg cttatcaatt tgttgcaacg 60 aacaggtcac tatcagtcaa aataaaatca ttatttgatt tc 102 <210> 13 <211> 162 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 13 tctgttacag gtcactaata ccatctaagt agttgattca tagtgactgc atatgttgtg 60 ttttacagta ttatgtagtc tgttttttat gcaaaatcta atttaatata ttgatattta 120 tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt tatactaact tg 162 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 gaaattcttt ttgatactaa cttgtgt 27 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer CENfor2 <400> 15 gacgtcaatg ggagtttgtt ttg 23 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer ZsGrev1 <400> 16 atccaatgcc ctctcccgtg 20

Claims (25)

  1. 서열번호 3의 서열로 이루어진 attP.b, 서열번호 4의 서열로 이루어진 attP.a, 서열번호 7의 서열로 이루어진 attL.a, 서열번호 10의 서열로 이루어진 attR.a 및 서열번호 11의 서열로 이루어진 attR.b로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산 서열이 진핵세포에서 DNA의 서열-특이적 재조합을 매개하며, 서열 특이적 재조합이 박테리오파지 람다 인테그라제 Int에 의해 수행되는 핵산 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 벡터가 진핵세포 발현 벡터인 벡터.
  5. 제3항에 있어서, 벡터가 프로모터, 관심있는 이종 유전자, 선별 마커 및 인핸서로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 요소를 포함하는 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 선별 마커가 DHFR, 글루타민 신테타제 또는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제인 벡터.
  7. 게놈, 인공 염색체, 미니염색체 또는 에피솜 성분에 통합되거나, 제1항 또는 제2항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터에 통합된, 제1항 또는 제2항에 따른 핵산 분자를 포함하는 분리된 세포.
  8. 제7항에 있어서, 세포가 진핵세포인 분리된 세포.
  9. 제8항에 있어서, 진핵세포가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 원숭이 신장 CV1 세포, 원숭이 신장 COS 세포, 사람 수정체 상피 PER.C6TM 세포, 사람 배아 신장 HEK293 세포, 사람 양막 세포, 사람 골수종 세포, 베이비 햄스터 신장 세포, 아프리카 그린 원숭이 신장 세포, 사람 자궁경부 암종 세포, 개 신장 세포, 버팔로 래트 간 세포, 사람 폐 세포, 사람 간 세포, 마우스 유방 종양 또는 골수종 세포, 개, 돼지, 마카크(macaque), 래트, 토끼, 고양이 및 염소 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 포유동물 세포인 분리된 세포.
  10. 제9항에 있어서, CHO 세포가 CHO 야생형, CHO K1, CHO DG44, CHO DUKX-B11 및 CHO Pro-5로부터 선택되는, 분리된 세포.
  11. a) 서열번호 1의 서열로 이루어진 attB, 서열번호 2의 서열로 이루어진attP, 서열번호 3의 서열로 이루어진 attP.b, 서열번호 4의 서열로 이루어진 attP.a, 서열번호 12의 서열로 이루어진 attL, 서열번호 7의 서열로 이루어진 attL.a, 서열번호 13의 서열로 이루어진 attR, 서열번호 10의 서열로 이루어진 attR.a 또는 서열번호 11의 서열로 이루어진 attR.b의 서열을 포함하는 제1 DNA를 분리된 세포에 도입하고,
    b) 서열번호 3의 서열로 이루어진 attP.b, 서열번호 4의 서열로 이루어진 attP.a, 서열번호 7의 서열로 이루어진 attL.a, 서열번호 10의 서열로 이루어진 attR.a 또는 서열번호 11의 서열로 이루어진 attR.b의 서열을 포함하는 제2 DNA를 분리된 세포에 도입하거나,
    이와는 반대의 순서로 DNA를 분리된 세포에 도입하고;
    c) 박테리오파지 람다 인테그라제 Int에 의해 서열 특이적 재조합을 수행함을 포함하여, 분리된 진핵세포에서 DNA를 서열 특이적 재조합하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 단계 a)의 제1 DNA 서열이 서열번호 1의 attB 서열을 포함하는 경우, 단계 b)의 제2 DNA 서열이 서열번호 3의 서열로 이루어진 attP.b, 서열번호 4의 서열로 이루어진 attP.a, 서열번호 7의 서열로 이루어진 attL.a, 서열번호 10의 서열로 이루어진 attR.a 또는 서열번호 11의 서열로 이루어진 attR.b를 포함하거나, 이와는 반대로 제1 DNA 서열이 서열번호 3의 서열로 이루어진 attP.b, 서열번호 4의 서열로 이루어진 attP.a, 서열번호 7의 서열로 이루어진 attL.a, 서열번호 10의 서열로 이루어진 attR.a 또는 서열번호 11의 서열로 이루어진 attR.b를 포함하는 경우, 제2 DNA 서열이 서열번호 1의 attB 서열을 포함하는, 분리된 진핵세포에서 DNA를 서열 특이적 재조합하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 단계 a)의 제1 DNA 서열이 서열번호 3의 attP.b 서열을 포함하는 경우, 단계 b)의 제2 DNA 서열이 서열번호 3의 서열로 이루어진 attP.b, 서열번호 4의 서열로 이루어진 attP.a, 서열번호 7의 서열로 이루어진 attL.a, 서열번호 10의 서열로 이루어진 attR.a 또는 서열번호 11의 서열로 이루어진 attR.b를 포함하거나, 이와는 반대로 제1 DNA 서열이 서열번호 3의 서열로 이루어진 attP.b, 서열번호 4의 서열로 이루어진 attP.a, 서열번호 7의 서열로 이루어진 attL.a, 서열번호 10의 서열로 이루어진 attR.a 또는 서열번호 11의 서열로 이루어진 attR.b를 포함하는 경우, 제2 DNA 서열이 서열번호 3의 attP.b 서열을 포함하는, 분리된 진핵세포에서 DNA를 서열 특이적 재조합하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 제1 DNA 서열이 서열번호 3의 attP.b 서열을 포함하는 경우, 제2 DNA 서열이 또한 서열번호 3의 attP.b 서열을 포함하는, 분리된 진핵세포에서 DNA를 서열 특이적 재조합하는 방법.
  15. 제11항에 따른 단계 b) 및 c)를 포함하여, 제11항에 따른 제1 DNA가 인공 염색체/미니염색체 또는 진핵세포의 게놈에 통합된 진핵세포에서 DNA를 서열 특이적 재조합하는 방법.
  16. 제11항에 있어서, 제1 DNA가 진핵세포의 게놈에 천연적으로 존재하거나 미리 도입되는, 분리된 진핵세포에서 DNA를 서열 특이적 재조합하는 방법.
  17. a) 서열번호 1의 서열로 이루어진 attB, 서열번호 2의 서열로 이루어진 attP , 서열번호 3의 서열로 이루어진attP.b, 서열번호 4의 서열로 이루어진 attP.a, 서열번호 12의 서열로 이루어진attL, 서열번호 6의 서열로 이루어진 attL*, 서열번호 7의 서열로 이루어진 attL.a, 서열번호 13의 서열로 이루어진 attR, 서열번호 10의 서열로 이루어진 attR.a 또는 서열번호 11의 서열로 이루어진 attR.b의 서열을 포함하는 제1 DNA를 분리된 세포에 도입하고,
    b) 서열번호 3의 서열로 이루어진 attP.b, 서열번호 4의 서열로 이루어진attP.a, 서열번호 7의 서열로 이루어진 attL.a, 서열번호 10의 서열로 이루어진attR.a 또는 서열번호 11의 서열로 이루어진 attR.b의 서열을 포함하는 제2 DNA를 도입하거나,
    이와는 반대의 순서로 제1 DNA 및 제2 DNA를 도입하고;
    c) 관심있는 하나 이상의 유전자를 분리된 세포에 도입하고;
    d) 상기 세포를 박테리오파지 람다 인테그라제 Int와 접촉시키고;
    e) 박테리오파지 람다 인테그라제 Int에 의한 서열-특이적 재조합을 수행하여 제2 DNA를 제1 DNA에 통합시키고;
    f) 상기 세포를 관심있는 유전자(들)가 발현되는 조건 하에서 배양함을 포함하여, 분리된 진핵세포에서 하나 이상의 목적하는 폴리펩타이드(들)/생성물(들)을 암호화하는 관심있는 하나 이상의 유전자를 발현시키는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 제2 DNA가 숙주 세포에 도입되기 전에, 제1 DNA가 숙주 세포 게놈, 인공 염색체/미니염색체 또는 숙주 세포의 에피솜 성분에 통합되는, 분리된 진핵세포에서 하나 이상의 목적하는 폴리펩타이드(들)/생성물(들)을 암호화하는 관심있는 하나 이상의 유전자를 발현시키는 방법.
  19. a) 서열번호 3의 서열로 이루어진 attP.b, 서열번호 4 서열로 이루어진 attP.a, 서열번호 7의 서열로 이루어진 attL.a, 서열번호 10의 서열로 이루어진 attR.a 또는 서열번호 11의 서열로 이루어진 attR.b의 서열 및 관심있는 하나 이상의 유전자를 포함하는 DNA를 분리된 진핵세포에 도입하고;
    b) 상기 진핵세포를 박테리오파지 람다 인테그라제 Int와 접촉시키고;
    c) 상기 진핵세포에서 천연적으로 발생하는 재조합 서열과 상기 세포에 도입된 DNA 사이에서 박테리오파지 람다 인테그라제 Int에 의한 서열-특이적 재조합을 수행하고;
    d) 상기 진핵세포를 관심있는 유전자(들)가 발현되는 조건 하에서 배양함
    을 포함하는, 박테리오파지 람다 Int에 의해 매개되는 서열-특이적 재조합을 가능하게 하는 하나 이상의 천연적으로 발생하는 재조합 서열 또는 이의 임의의 기능성 돌연변이체를 갖는, 분리된 진핵세포에서 하나 이상의 목적하는 폴리펩타이드(들)/생성물(들)을 암호화하는 관심있는 하나 이상의 유전자를 발현시키는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 천연적으로 발생하는 서열이 서열번호 14의 서열로 이루어진 attH인, 분리된 진핵세포에서 하나 이상의 목적하는 폴리펩타이드(들)/생성물(들)을 암호화하는 관심있는 하나 이상의 유전자를 발현시키는 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 목적하는 폴리펩타이드(들)/생성물(들)이 숙주 세포 또는 세포 배양 배지로부터 분리되는, 분리된 진핵세포에서 하나 이상의 목적하는 폴리펩타이드(들)/생성물(들)을 암호화하는 관심있는 하나 이상의 유전자를 발현시키는 방법.
  22. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 서열-특이적 재조합을 Int, 및 XIS, FIS 및 IHF으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 보조인자에 의해 수행하는, 분리된 진핵세포에서 DNA를 서열 특이적 재조합하는 방법.
  23. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 서열-특이적 재조합을 변형된 Int에 의해 수행하는, 분리된 진핵세포에서 DNA를 서열 특이적 재조합하는 방법.
  24. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 목적하는 폴리펩타이드(들)/생성물(들)이 항체, 호르몬 또는 성장 인자인, 분리된 진핵세포에서 하나 이상의 목적하는 폴리펩타이드(들)/생성물(들)을 암호화하는 관심있는 하나 이상의 유전자를 발현시키는 방법.
  25. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵세포가 포유동물 세포인, 분리된 진핵세포에서 DNA를 서열 특이적 재조합하는 방법.
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