CN102165060B

CN102165060B - 新的调控组件

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Publication number: CN102165060B
Application number: CN2009801371650A
Authority: CN
Inventors: 芭芭拉.埃南克尔
Original assignee: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Current assignee: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Priority date: 2008-07-23
Filing date: 2009-07-22
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2029-07-22
Also published as: US20110312029A1; US20130177943A1; KR20110031912A; MX2011000535A; AU2009273239B2; DK2310501T3; NZ589268A; HRP20130888T1; SI2310501T1; JP2011526795A; CY1114483T1; MY156855A; US8466271B2; CA2724908C; AU2009273239A1; ES2421152T3; IL208700A0; SG188882A1; US8975391B2; HK1156663A1

Abstract

本发明系关于新颖调控组件以及相关载体及细胞。此外，本发明系关于自诸如克隆化基因等核酸改良多肽表达的方法，及在使用该等新颖调控组件的宿主细胞中生产各种多肽。另外，本发明系关于该等新颖调控组件作为绝缘子，用在基因疗法中或用于改良宿主细胞系的用途。

Description

新的调控组件

技术领域

本发明系关于细胞培养技术领域。本发明系关于新的调控组件，以及自诸如克隆化基因等核酸改良多肽之表达的方法，及在使用该等新颖调控组件的真核宿主细胞中生产各种多肽。

背景技术

供人类治疗使用之生物药物之市场继续以高速率增长，其中逾900种生物药物正在临床研究中进行评估且估计2010年销售额为500亿。当前，愈来愈多之生物药物系自哺乳动物细胞中生产，原因在于哺乳动物细胞能够正确加工并修饰人类蛋白质。因此，重组蛋白质在功能与药效方面皆与人类兼容。与原核表达系统相比，缺点通常为蛋白质表达量大幅降低。因此自哺乳动物细胞中成功且高产量生产生物药物至关重要，且视包括以下之各种因素而定：宿主细胞系、表达系统、细胞生长及生产力、培养及肴料培养基、生产及纯化程序、蛋白质结构及序列、蛋白质稳定性及配方。

表达重组蛋白质需要编码所要目标基因的表达载体。多种方法可用于优化表达载体以便进行有效蛋白质生产。基因表达系在转录及转译水平加以调控。因此，许多方法系关于鉴别及优化强启动子及增强子以提升蛋白质编码基因之转录效率。此等启动子及增强子之实例为CMV即刻早期启动子及增强子、SV40启动子及增强子、延伸因子(EF)启动子、多瘤病毒增强子及鸡[β]-肌动蛋白启动子。同样，亦使用稳定mRNA并强化转录终止之强聚腺苷酸化信号序列、经由表达载体所编码之基因增强蛋白质表达。提升所得mRNA之转译效率的方法为使用转译起始位点(AUG)、最佳核糖体结合位点(诸如Kozak序列(GCCGCCACCAUGG，AUG构成起始密码子))或内部核糖体进入位点(IRES)。

用以优化表达载体以便在真核细胞中获得更高量之重组基因表达之方法之一系关于聚腺苷酸化信号之使用及选择。多种聚腺苷酸化信号可用于载体中以便表达重组蛋白质。最常用之聚腺苷酸化信号包括例如来自牛生长激素(BGH)(美国专利第5，122，458号)、猴病毒40晚期及早期区、兔β-血球蛋白、小鼠或人类免疫球蛋白、多瘤病毒晚期区的聚腺苷酸化信号。

在真核信使RNA(mRNA)中，3′非翻译区(3′UTR)为重要调控组件。在多种情形下，其控制mRNA稳定性，且其亦可调控转译效率。聚腺苷酸化信号为3′UTR内的核苷酸序列，其导引聚腺苷酸化蛋白质复合物结合至信号序列内之AAUAAA序列。复合物含有：核酸内切酶，其在AAUAAA序列之下游约14至30个核苷酸处剪切mRNA；及聚合酶，其使一连串约100至200个腺嘌呤核苷酸(polyA尾)转录后合并至裂解之3′端。这种polyA尾影响mRNA代谢之许多方面，包括稳定性、转译效率及自细胞核至细胞质之转运。通常，聚腺苷酸化信号由侧接裂解及聚腺苷酸化位点的两个识别组件组成：位于裂解位点上游约14至30个核苷酸的高保守AAUAAA序列，及位于AAUAAA序列下游约20至50个核苷酸的低保守G/U富集区或U富集区。此等两个组件之间的裂解通常位于A残基之3′侧。在活体内，不同聚腺苷酸化位点之加工效率变化较大。聚腺苷酸化蛋白质复合物之组装速度为多级程序，且与聚腺苷酸化信号序列之强度相关。举例而言，因为组装速率更快，所以强SV40晚期聚腺苷酸化信号中发生裂解快于较弱SV40早期聚腺苷酸化信号(Chao等人，Molecular and Cellular Biology，第19卷(8)，5588-5600，1999)。

需要鉴别替代性强聚腺苷酸化信号或甚至极强之聚腺苷酸化信号以促进用于生产重组蛋白质之高生产细胞系的产生。使用强聚腺苷酸化信号或甚至极强之聚腺苷酸化信号可强化转录终止，从而增强经载体编码之mRNA、之生产、稳定性、核输出及/或翻译。此应产生较高量mRNA且因此可提高生产细胞之生产力。

发明概述

本文描述自中国仓鼠(灰仓鼠(Cricetus griseus))之生长激素所分离的新颖聚腺苷酸化信号。惊人地，已发现命名为HGH之此新鉴别聚腺苷酸化信号优于：BGH及SV40晚期强聚腺苷酸化信号。当使用包含HGH作为聚腺苷酸化信号序列之载体时，CHO-DG44细胞之瞬间转染中之蛋白质效价与包含BGH之细胞相比增加高达35％。在稳定细胞中，获得高达每天每个细胞45pg之高比生产力及补料分批培养中高达6.3g/L的效价。

本发明之一实施例为多核苷酸序列，其包含至少一个HGH聚腺苷酸化信号及至少一个编码目标产物的异源核苷酸序列。HGH聚腺苷酸化信号位于下游，且操作性连接至异源核苷酸序列。本发明之另一实施例为一种新颖载体，其包含至少一个编码目标产物的异源核苷酸序列及至少一个HGH聚腺苷酸化信号。HGH聚腺苷酸化信号位于下游，且操作性连接至异源核苷酸序列。本发明之又一实施例为新颖载体或多核苷酸序列，其包含至少一个操作性连接至上游多克隆位点之HGH聚腺苷酸化信号，该上游多克隆位点允许经由限制性核酸内切酶之识别序列克隆目标基因。本发明之又一实施例为一种包含HGH聚腺苷酸化信号的真核细胞(较佳为哺乳动物细胞)。本发明之又一实施例为一种用于生产目标产物的方法，其包含培养经包含HGH聚腺苷酸化信号之载体或多核苷酸序列转染的真核细胞，较佳哺乳动物细胞。在一较佳实施例中，目标产物为多肽，且所要多肽系自培养基中回收。

本发明之资料展示HGH聚腺苷酸化信号序列对sICAM之瞬间表达的影响(图6)。惊人地，使用来源于仓鼠之生长激素基因之聚腺苷酸化信号序列获得最高sICAM表达。与经含有BGH聚腺苷酸化信号之载体pJR110转染的细胞相比，效价增加高达21％(转染系列#1)，且与经含有SV40晚期聚腺苷酸化信号之载体pJR106所转染的细胞相比，效价增加高达40％(转染系列#1)。

本发明之资料另外展示HGH聚腺苷酸化信号对IgG4抗体之瞬间表达的影响。惊人地，用HGH聚腺苷酸化信号序列所得之效价相对于BGH聚腺苷酸化信号之效价平均高35％(图7)。

本发明之资料另外展示不同HGH变体之测试(图8)。表达载体pJR135中所含之113bp最短HGH序列与表达载体pJR131中所含之324bp HGH序列相比，使sICAM表达减幅高达78％。而表达载体pJR134中所含之189bpHGH序列产生与用BGH达成之表达量相当的极优sICAM表达(图7)。使用表达载体pJR131中所含之324bp HGH序列达成最佳表达结果(图8)，大大优于(35％)用BGH聚腺苷酸化信号所达成的表达(图7)。

这表明，SEQ ID NO：8序列bp 190至324之间的HGH区对目标基因的有效表达作出贡献。

本发明之数据还表明，用所述HGH聚腺苷酸化信号高水平稳定表达蛋白质。获得比生产力在每天每个细胞10-45pg范围内且补料分批培养中效价高达6.3g/L的细胞池(pool)及细胞克隆(图9)。

本发明系关于一种包含核酸之聚腺苷酸化信号，该核酸包含与SEQ IDNO：9至少75％一致的序列。本发明进一步系关于一种包含核酸之聚腺苷酸化信号，该核酸包含与SEQ ID NO：9具有至少75％一致性的序列。本发明另外系关于一种包含核酸之聚腺苷酸化信号，该核酸包含与SEQ ID NO：9具有至少75％一致性的序列。本发明尤其系关于一种包含核酸之聚腺苷酸化信号，该核酸基本上由与SEQ ID NO：9至少75％一致之序列组成。

本发明较佳系关于一种包含核酸之聚腺苷酸化信号，该核酸由与SEQID NO：9至少75％一致的序列组成。本发明另外系关于一种包含核酸之聚腺苷酸化信号，该核酸包含SEQ ID NO：9。

在一特定实施例中，本发明系关于一种包含核酸之聚腺苷酸化信号，该核酸包含与SEQ ID NO：8至少75％一致的序列。本发明尤其系关于一种包含核酸之聚腺苷酸化信号，该核酸基本上由与SEQ ID NO：8至少75％一致的序列组成。本发明较佳系关于一种包含核酸之聚腺苷酸化信号，该核酸由与SEQ ID NO：8至少75％一致的序列组成。本发明另外系关于一种包含核酸之聚腺苷酸化信号，该核酸包含SEQ ID NO：8。

在本发明之又一实施例中，聚腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：8至少80％、85％、90％、95％或98％一致的序列。在一特定实施例中，本发明系关于一种包含核酸之聚腺苷酸化信号，该核酸包含与SEQ ID NO：9至少85％一致的序列。在另一特定实施例中，本发明系关于一种包含核酸之聚腺苷酸化信号，该核酸包含与SEQ ID NO：9至少95％一致的序列。在一特定实施例中，本发明系关于一种包含核酸之聚腺苷酸化信号，该核酸包含与SEQ ID NO：8至少85％一致的序列。在另一特定实施例中，本发明系关于一种包含核酸之聚腺苷酸化信号，该核酸包含与SEQ IDNO：8至少95％一致的序列。

本发明系关于一种核酸，其序列包含SEQ ID NO：9。较佳地，本发明系关于一种核酸，其序列基本上由SEQ ID NO：9组成。更佳地，本发明系关于一种核酸，其序列由SEQ ID NO：9组成。

本发明系关于一种核酸，其序列包含SEQ ID NO：8。较佳地，本发明系关于一种核酸，其序列基本上由SEQ ID NO：8组成。更佳地，本发明系关于一种核酸，其序列由SEQ ID NO：8组成。

在一较佳实施例中，该聚腺苷酸化信号经分离。在一较佳实施例中，本发明系关于一种包含核酸之经分离聚腺苷酸化信号，该核酸包含与SEQ IDNO：9至少75％一致的序列。在另一较佳实施例中，本发明系关于一种包含核酸之经分离聚腺苷酸化信号，该核酸包含与SEQ ID NO：9至少95％一致的序列。在又一较佳实施例中，本发明系关于一种包含核酸之经分离聚腺苷酸化信号，该核酸包含SEQ ID NO：9。在另一较佳实施例中，本发明系关于一种包含核酸之经分离聚腺苷酸化信号，该核酸包含与SEQ ID NO：8至少75％一致的序列。在另一较佳实施例中，本发明系关于一种包含核酸之经分离聚腺苷酸化信号，该核酸包含与SEQ ID NO：8至少95％一致的序列。在又一较佳实施例中，本发明系关于一种包含核酸之经分离聚腺苷酸化信号，该核酸包含SEQ ID NO：8。

较佳地，本发明系关于一种经分离核酸，其序列包含SEQ ID NO：9。更佳地，本发明系关于一种经分离核酸，其序列包含SEQ ID NO：8。

在一较佳实施例中，该聚腺苷酸化信号操作性连接至异源编码序列。在一特别较佳实施例中，该聚腺苷酸化信号之特征在于，用该聚腺苷酸化信号所得之效价/表达量比针对BGH聚腺苷酸化信号所得之彼等效价/表达量高至少10％、较佳20％且最佳30％。在一最佳实施例中，用该聚腺苷酸化信号所得之效价/表达量比针对BGH聚腺苷酸化信号所得之彼等效价/表达量至少且/或平均高35％。

本发明尤其系关于一种核酸，其序列包含操作性连接至异源编码序列之SEQ ID NO：9。或者，其序列基本上由操作性连接至异源编码序列之SEQ IDNO：9组成。较佳地，其序列由操作性连接至异源编码序列之SEQ ID NO：9组成。

本发明另外系关于一种核酸，其序列包含操作性连接至异源编码序列之SEQ ID NO：8。或者，其序列基本上由操作性连接至异源编码序列之SEQ IDNO：8组成。较佳地，其序列由操作性连接至异源编码序列之SEQ ID NO：8组成。

一种核酸，其序列包含SEQ ID NO：9或8且具有终止子功能。较佳地，该核酸具有终止子功能，且操作性连接至异源编码序列。

本发明另外系关于一种载体或多核苷酸序列，其包含上述任一种聚腺苷酸化信号或核酸序列。在一特定实施例中，该等聚腺苷酸化信号或核酸序列操作性连接至表达单元/表达盒。在本发明之另一实施例中，该载体包含选择及/或扩增标记：二氢叶酸还原酶(DHFR)、谷氨酰胺合成酶或新霉素磷酸酶(neo)。在本发明之一较佳实施例中，该载体或多核苷酸序列包含编码目标异源产物的目标异源基因。较佳地，该产物为多肽。较佳地，该多肽为抗体、抗体片段或融合蛋白质。

本发明另外系关于一种包含上述任一种载体或多核苷酸序列的细胞。较佳地，该细胞包含操作性连接至编码目标产物之转录单元、上述任一种聚腺苷酸化信号或核酸序列。较佳地，该目标产物为目标核苷酸/核酸。在该细胞之另一实施例中，该目标产物为藉由目标基因编码的目标多肽。较佳地，该多肽为抗体、抗体片段或融合蛋白质。

在一特定实施例中，该细胞为真核细胞、哺乳动物细胞、仓鼠细胞或鼠类细胞。较佳地，该细胞为仓鼠细胞。更佳地，该细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。最佳地，该细胞为CHO DG44、CHO-K1或DUKX-B11细胞。在另一较佳实施例中，该细胞为NSO细胞。在一较佳实施例中，所述该等细胞为经培养之细胞。较佳地，在无血清之培养基中培养该等细胞。较佳地，该等细胞生长于悬浮培养物中。在本发明之另一较佳实施例中，该细胞之特征在于，用该聚腺苷酸化信号或核酸序列所得之效价/表达量比针对BGH聚腺苷酸化信号所得之彼等效价/表达量高至少10％、较佳20％且最佳30％。在一最佳实施例中，用该聚腺苷酸化信号或核酸序列所得之效价/表达量比针对BGH聚腺苷酸化信号所得之彼等效价/表达量至少且/或平均高35％。较佳地，该细胞具有高出35％的表达量。

本发明另外系关于一种制备由目标基因所编码之目标多肽的方法，该方法包含：

(a)提供包含如上所述之载体或多核苷酸序列的宿主细胞，或提供如上所述的细胞，

(b)在允许细胞增殖及表达目标基因的条件下培养该等细胞，

(C)收集目标多肽，及

(d)纯化目标多肽。

在该方法之一特定实施例中，该细胞为真核细胞、哺乳动物细胞、仓鼠细胞或鼠类细胞。该细胞较佳为CHO细胞，最佳为CHO DG44、CHO-K1或DUKX-B11细胞。此外，NSO细胞较佳。

在该方法之一较佳实施例中，目标多肽为重组蛋白质，较佳为分泌多肽，更佳为治疗性蛋白质。最佳地，目标多肽为抗体，诸如单克隆、多克隆、多特异性或单链抗体，或其片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fc及Fc′片段：免疫球蛋白重链及轻链及其恒定区、可变区或超变区，以及Fv片段及Fd片段。在该方法之另一较佳实施例中，目标多肽为融合蛋白质或支架蛋白质。

本发明进一步系关于上述细胞用于生产蛋白质的用途。

本发明另外系关于上述任一种聚腺苷酸化信号或核酸用作绝缘子(insulator)之用途。

另外，本发明系关于上述任一种聚腺苷酸化信号或核酸用于产生经改良之宿主细胞系的用途。

本发明尤其系关于上述任一种聚腺苷酸化信号或核酸用于基因治疗之用途。

本发明进一步系关于一种试剂盒，其包含上述任一种聚腺苷酸化信号或核酸、载体、细胞及用于培养该细胞之细胞培养基。

附图说明

图1：基本表达载体

图1示意性展示用于转染CHO-DG44细胞的表达载体设计。“P/E”意谓含有CMV增强子与启动子组件两者之复合物单元，“P”为启动子组件且“T”为转录终止信号，这是经转录的信使RNA发生聚腺苷酸化时所需。聚腺苷酸化信号“BGH”、“SV40L”及“HGH”分别为来源于牛生长激素之3′非翻译区(SEQ ID NO：12)、SV40晚期基因区(SEQ ID NO：11)及中国仓鼠生长激素之3′非翻译区(SEQ ID NO：8)的转录终止信号。此等聚腺苷酸化信号与“SfiI”及“XbaI”之限制性酶切位点侧接。各转录单元内之转录起始的位置及方向藉由箭头指示。克隆目标基因时，将带有多个限制性核酸内切酶剪切位点(多克隆位点-“mcs”)的序列区插在启动子/增强子组件之后。可扩增的可选标记二氢叶酸还原酶缩写为“dhfr”，可选标记新霉素磷酸酶缩写为“npt”。

图2：分离的灰仓鼠生长激素基因区

图2展示使用巢式PCR、自基因组CHO-DG44(中国仓鼠卵巢细胞系：灰仓鼠)DNA扩增之具有总共362bp之生长激素基因区之核苷酸序列(SEQID NO：7)。箭头指示扩增反应中所用之基因特异性引物GH for2的方向、长度及位置，引物序列自身以斜体醒目显示(SEQ ID NO：2)。生长激素基因序列之终止密码子TAG藉由加下划线之粗体字母醒目显示，且后续为324bp之3′非翻译区。

图3：生长激素基因之3′非翻译区之比对

在此比对中，比较灰仓鼠经分离之3′非翻译生长激素区(SEQ ID NO：8)与叙利亚(Syrian)仓鼠金黄地鼠(Mesocricetus auratus)(Genbank S66299)、家鼹鼠(Mus musculus)(Genbank Z46663)、褐鼠(Rattus norvegicus)(GenbankV01239)及温带牛(Bos taurus)(Genbank J00008)的3′非翻译生长激素区。阴影指示不同于灰仓鼠序列的核苷酸。

图4：灰仓鼠生长激素之3′非翻译区的HGH缺失衍生物

在此比对中，展示仅含有3′非翻译区之362个核苷酸之灰仓鼠生长激素(HGH)序列(SEQ ID NO：7)的缺失衍生物。所有衍生物具有相同5′端及不同3′端。具有SEQ ID NO：8之最长衍生物由324个核苷酸组成。SEQ ID NO：9由189个核苷酸组成，且SEQ ID NO：10仅由113个核苷酸组成。生长激素基因序列之终止密码子TAG藉由加下划线之粗体字母醒目显示，且聚腺苷酸化蛋白质复合物AATAAA之潜在结合位点以斜体醒目显示。

图5：用于评估HGH效能的重组表达载体

所有重组表达载体皆在CMV增强子及启动子组件(“P/E”)之控制下编码目标基因“sICAM”。sICAM转录终止于牛生长激素“BGH”之3′非翻译区(SEQ ID NO：12)、SV40晚期基因区“SV40L”(SEQ ID NO：11)或中国仓鼠生长激素“HGH”之3′非翻译区(SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10)。后者之大小用碱基对示出。此等聚腺苷酸化信号与“SfiI”及“XbaI”之限制性酶切位点侧接。“P”指示启动子组件，“T”指示转录终止信号。各转录单元内之转录起始位置及方向藉由箭头指示。可扩增之可选标记二氢叶酸还原酶缩写为“dhfr”。

图6：评估瞬间转染中之HGH效能

在两个独立系列中，用表达载体pJR106、pJR110及pJR131转染CHO-DG44细胞，该等载体皆在CMV增强子/启动子下编码sICAM。使用SV40晚期聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO：11)、牛生长激素BGH之3′非翻译区(SEQ ID NO：12)或中国仓鼠生长激素HGH之3′非翻译区(SEQ ID NO：8)终止转录。48小时后，使用ELISA测定上清液中的sICAM效价。为校正转染效率，细胞被质粒pCMV-SEAP共转染，量测SEAP活性。用HGH作为聚腺苷酸化信号时的效价与用BGH终止时的相比增加高达21％，与用SV40晚期终止时的相比增加高达40％。

图7：评估IGG4/KAPPA抗体之瞬间表达中之HGH效能

用载体组合pBID/IgG4与pBIN/kappa共转染CHO-DG44细胞(n＝6)，其中抗体之重链(IgG4)及轻链(kappa)之转录终止于中国仓鼠生长激素HGH之324bp 3′非翻译区(SEQ ID NO：8)。作为对照，用含有BGH聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO：12)的载体组合pBID-B/IgG4与pBIN-B/kappa共转染CHO-DG44细胞(n＝6)。除聚腺苷酸化序列不同外，不同载体之遗传构成相同。48小时后，使用ELISA测定上清液中的抗体效价。为校正转染效率，细胞被质粒pCMV-SEAP共转染，量测SEAP活性。用HGH作为聚腺苷酸化信号，效价相对于BGH聚腺苷酸化信号平均高35％。

图8：测试瞬间转染中之不同HGH缺失变体

在两个独立系列中，用在CMV增强子/启动子下编码sICAM的表达载体pJR131、pJR134及pJR135转染CHO-DG44细胞。使用中国仓鼠生长激素HGH之324bp(SEQ ID NO：8)、189bp(SEQ ID NO：9)或113bp(SEQID NO：10)3′非翻译区终止转录。所有变体具有相同5′端、但不同3′端。除聚腺苷酸化序列不同外，不同载体之遗传构成相同。转染后48小时，使用ELISA测定上清液中之sICAM效价。为校正转染效率，细胞被质粒pCMV-SEAP共转染，量测SEAP活性。与经含有324bp HGH序列之载体转染之细胞相比，经含有189bp及113bp HGH缺失变体之载体转染的细胞分别展示sICAM表达量减少23％及78％。

图9：在使用HGH之稳定转染细胞中高水平表达蛋白质

图9总结了生物反应器或摇瓶中进行的补料分批培养中，表达IgG1、IgG2及IgG4抗体或IgG1与IgG2Fc融合蛋白质的稳定转染的CHO-DG44细胞克隆或细胞池的比生产力及效价。比生产力为10-45pg/细胞/天，效价为2.1-6.3g/L。用于表达不同蛋白质之载体之遗传构成相同。所有载体含有中国仓鼠生长激素之324bp 3′非翻译区(SEQ ID NO：8)作为聚腺苷酸化信号以终止目标基因的转录。转染后2天，使用基于DHFR及基于NPT之选择术选择稳定细胞池，接着藉由向培养基中添加100nM及800nM MTX来进行2个连续的DHFR介导基因扩增步骤。藉由稀释克隆或将单细胞基于FACS沉积于96孔板的孔中来获得单细胞克隆。

发明详述

通用实施例“包含”涵盖更特定实施例“由...组成”。此外，单数及复数形式不以限制方式使用。

本发明提供新颖调控组件及制备并选择允许高量表达异源基因产物(较佳生物药物相关多肽或蛋白质)之哺乳动物细胞系的方法。本发明之方法主要基于使用自中国仓鼠(灰仓鼠)生长激素所分离的新颖聚腺苷酸化信号。惊人地，已发现命名为HGH(SEQ ID NO：8)之此新鉴别聚腺苷酸化信号优于BGH及SV40晚期强聚腺苷酸化信号，从而提高生产细胞之生产力。

本发明过程中所使用之术语具有以下含义。

术语“聚腺苷酸化信号”、“聚腺苷酸化位点”、“polyA信号”、“polyA位点”或“终止信号”或“终止子”系指3′UTR内之核苷酸序列，其导引聚腺苷酸化蛋白质复合物结合至信号序列内之AAUAAA序列。该复合物含有：核酸内切酶，其在AAUAAA序列之下游约14至30个核苷酸处剪切mRNA；及聚合酶，其将一连串约100至200个腺嘌呤核苷酸(polyA尾)转录后合并至裂解之3′端。据信polyA尾影响mRNA代谢之多个方面，包括稳定性、翻译效率及自核至细胞质之转运。通常，聚腺苷酸化信号由侧接裂解及聚腺苷酸化位点的两个识别组件组成：位于裂解位点上游约14至30个核苷酸的高保守AAUAAA序列，及位于AAUAAA序列下游约20至50个核苷酸的低保守G/U富集区或U富集区。此等两个组件之间的裂解通常位于A残基之3′侧。已知各种聚腺苷酸化信号，诸如tk polyA(Cole等人，Mol.Cell Biol.，5，2104-2113，1985)、SV40晚期(Schek等人，Mol.Cell Biol.12，5386-5393，1992)及早期polyA或BGHpolyA(例如美国专利第5,122,458号中所述)。

在聚腺苷酸化信号中，虽然上述AAUAAA序列较佳，但其可用与AAUAAA同源的其它六多核苷酸序列取代，只要此等六多核苷酸序列能够传导mRNA之聚腺苷酸化信号。同源六多核苷酸序列之实例包括AAAAAA、AUUAAA、AAUAUA、AAUAAU、UAUAAA、AAUUAA、AAUAAG、AGUAAA、GAUAAA、AAUGAA、AAUAGA、AAGAAA、ACUAAA、CAUAAA、AAUCAA、AACAAA、AAUCAA及AAUAAC。因此，在一实施例中，HGH聚腺苷酸化信号包含选自由以下组成之群的六多核苷酸序列而非本发明之AAUAAA：AAAAAA、AUUAAA、AAUAUA、AAUAAU、UAUAAA、AAUUAA、AAUAAG、AGUAAA、GAUAAA、AAUGAA、AAUAGA、AAGAAA、ACUAAA、CAUAAA、AAUCAA、AACAAA、AAUCAA及AAUAAC，只要此等六体多核苷酸能够传导mRNA之聚腺苷酸化信号。

聚腺苷酸化信号亦可用作“绝缘子(insulator)”或“绝缘序列(insulatingsequence)”。绝缘序列为阻断相邻基因序列之相互作用或干扰的DNA区段。举例而言，绝缘子可减少自相邻基因之启动子或邻近核苷酸序列中之伪启动子(spurious promoter)进行转录通读。或其阻断位于绝缘序列一侧上之增强子与位于绝缘序列另一侧上之相邻基因之启动子的相互作用。本发明之含义内之绝缘序列的定义特性为其能够将操作性连接至调控组件的限定转录单元绝缘或保护而不受上游或下游干扰基因组件之影响。为此目的，绝缘序列系置放于(潜在)干扰基因序列与待绝缘之转录单元的调控序列之间。绝缘序列可能以一或多个复本置放于转录单元的任一侧或两侧上。在本发明之一较佳实施例中，绝缘序列为聚腺苷酸化信号。在本发明之一较佳实施例中，聚腺苷酸化序列为HGH聚腺苷酸化序列。

亦可使用HGH聚腺苷酸化序列之功能衍生物(诸如次片段或次序列)以及其完整序列或次片段之经修饰(例如藉由取代、插入、添加及/或缺失加以修饰)的功能突变体/变体。相应次片段或次序列、突变体或变体在下文中亦称为“经修饰之终止子”或“衍生物”。

“经修饰之终止子”或“衍生物”为SEQ ID NO：8之功能衍生物，其包括次片段或次序列及功能突变体/变体，且较佳产生表达量与用SEQ ID NO：8中所指定之核苷酸序列所得之表达量相当的目标产物。若在比较性报导基因检定中，操作性连接之报导基因之表达量为用SEQ ID NO：8所得之表达量的至少60％、较佳至少75％、更佳至少90％且最佳至少100％，则经修饰之终止子证明适用于本发明之目的。尤其较佳为与仓鼠生长激素聚腺苷酸化信号之野生类型序列SEQ ID NO：8或其互补序列具有至少75％、较佳至少80％、较佳至少85％、更佳至少95％且最佳至少97％之最小序列同源性且在比较性报导基因检定中产生相应表达量的经修饰之终止子。

在相应比较性“报导基因检定”中，将待测试之终止子片段(包括参考序列SEQ ID NO：8)克隆于报导基因下游。此报导基因编码例如荧光素酶、分泌之碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白质(GFP)。或者，可使用其它多肽或蛋白质(例如抗体或sICAM)作为报导基因。随后藉由转染将此等构建体引入测试细胞(例如CHO-DG44)中，且例如藉由量测报导基因之蛋白质含量来测定所述之经修饰终止子对报导基因之表达量的影响。相应测试描述于本发明之实施例2、3及4中。

较佳HGH聚腺苷酸化信号为包含包括SEQ ID NO：9序列之SEQ IDNO：8序列或其次序列的核苷酸序列。在其它实施例中，聚腺苷酸化信号为核苷酸序列，其包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ.ID NO：9或SEQ ID NO：10具有同源性或序列一致性的核苷酸序列。如本文中所使用，当核苷酸序列至少75％、较佳80％、较佳85％、更佳90％且甚至更佳95％或高于95％同源或一致时，两个序列具有序列一致性或同源性。当核酸序列在严格条件下与该股之补体杂交时，亦存在大体一致性。

如本文中所使用，术语“在严格条件下杂交”描述熟习此项技术者已知之杂交及洗涤条件。通常，选择在指定离子强度及pH下比特定序列之热熔点(Tm)低约5-10℃的严格条件。Tm为与标靶互补之探针之50％与标靶序列杂交平衡时的温度(在指定离子强度、pH及核酸浓度下)。严格条件将为在pH7.0至8.3盐浓度小于约1.0M钠离子，通常约0.01至1.0M钠离子浓度(或其它盐)，且温度对于短探针(例如10至约50个核苷酸)为至少约30℃且对于长探针(例如大于约50个核苷酸)为至少约60℃。例示性严格条件包括在使用5×SSC之杂交缓冲液中在60至65℃杂交及使用0.2×SSC/0.1％SDS在42℃洗涤。阳性杂交信号比背景杂交高至少2倍。

仓鼠生长激素之聚腺苷酸化序列及经修饰之终止子(亦可包括例如SEQID NO：7之分离HGH序列之上游或下游天然存在之核苷酸序列或其选择片段)可藉由了解该序列或同源序列的熟习此项技术者使用此项技术中已知之各种标准方法获得，适合方法亦描述于本发明实施例1中。例如，可自SEQID NO：7中所述之序列开始选择适合片段，含有此部分序列的寡核苷酸探针可以化学合成。此种探针可用于例如藉由杂交自仓鼠基因组库克隆仓鼠生长激素基因或其3′非翻译区或其它片段。使用上述报导基因检定，熟习此项技术者可不费力地鉴别功能终止子片段，且将其用于本发明之目的。使用来自基因组DNA或基因组库之相应引物藉由PCR扩增可以容易地获得3′非翻译区或其特殊片段。3′非翻译区之片段亦可由较大DNA片段经限制之外切核酸酶III消化获得。此等DNA分子亦可化学合成，或藉由连接、自化学合成之片段产生。缺失、插入、添加及取代突变体可藉由熟习此项技术者已知之定点诱发突变、基于PCR之诱发突变技术及/或化学合成法来产生。较佳地，突变体在多达3、6、10、20或50bp位置变异。较佳地，突变体在6bp位置变异。

如本发明实施例1中所述之类似方法可用以分离例如小鼠、大鼠或叙利亚仓鼠生长激素或其它物种之生长激素之聚腺苷酸化信号。其效能可在如本发明之实施例2、3或4中所述之报导基因检定中进行测试。藉由与来源于仓鼠生长激素序列(较佳来源于3′非翻译区)之探针交叉杂交，亦可自经鉴别之合适终止子序列并自其它物种(较佳哺乳动物)之相应同源基因中分离合适终止子序列。合适技术为熟习此项技术者已知。

术语“同源性”、“同源”、“一致性”、“一致”、“序列一致性”或“同源序列”可互换使用。用于计算“同源性”或“一致性”之方法熟知于此项技术中。序列比较时，通常一个序列充当测试序列所比较之参考序列。将序列对准以达成最大一致性。在比较中可将间隙引入任一核酸序列中以达成最佳对准。两个序列之间的一致性百分比为该等序列所共有之一致位置数的函数(考虑需要引入以达成两个序列最佳对准的间隙数及每个间隙之长度)。可使用数学算法完成两个序列之间的序列比较及一致性百分比之测定。可使用预设程序参数，或可指定替代性参数。接着，序列比较算法基于所指定或预设之程序参数计算测试序列相对于参考序列之一致性百分比。适于测定一致性之一算法实例为BLAST算法(Altschul等人，J.Mol.Biol.215，403-410，1990；Gish等人，Nature Genetics 3，266-272，1993；Madden等人，Meth.Enzymol.266，131-141，1996；Zhang等人，Genome Res.7，649-656，1997；Altschul等人，Nucleic Acids Res.25，3389-3402，1997)。比对算法之其它计算机化实施例为Wisconsin Genetics软件包中的GAP、PILEUP、BESTFIT、FASTA及TFASTA。然而，亦可藉由人工比对及目视检查及计算来测定一致性百分比。

如本文中所使用之术语“载体”系关于用于捕捉、增殖、表达或传递细胞中之核酸的天然存在或合成产生之构建体，例如质粒、小环、噬菌质粒、黏质粒、人造染色体/小染色体、噬菌体、病毒(诸如杆状病毒、反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹单纯型病毒、噬菌体)。用以建构载体之方法为熟习此项技术者所熟知，且描述于各种出版物中。详言之，用于建构合适载体之特定技术(包括对诸如启动子、增强子、终止及聚腺苷酸化信号、选择标记、复制起点及剪接信号之功能及调控组份的描述)为熟习此项技术者所熟知。真核表达载体通常亦含有便于在细菌中传播载体之原核序列(诸如复制起点)及选用于细菌中之抗生素抗性基因。含有多核苷酸可操作性连接于其中之克隆位点的多种真核表达载体在此项技术中为熟知的，且一些真核表达载体可自以下公司购得：诸如La Jolla，CA；Invitrogen，Carlsbad，CA；Promega，Madison，WI或BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA.。

本发明之一较佳实施例为含有一或多个编码目标基因之转录单元的载体或多核苷酸序列，该等载体或多核苷酸序列包含至少一个HGH聚腺苷酸化信号用于转录终止及稳定化及/或作为绝缘序列。根据本发明，亦较佳为包含用于转录终止及稳定化及/或作为绝缘序列之HGH聚腺苷酸化信号的载体或多核苷酸序列，该等载体或多核苷酸序列仅具有一个多克隆位点而非目标基因，该多克隆位点允许经由限制性核酸内切酶之识别序列克隆目标基因。

术语“启动子”指示多核苷酸序列，其允许并控制与其操作性连接之基因或序列之转录。启动子含有用于结合RNA聚合酶的识别序列与用于转录之起始位点(转录起始位点)。为在特定细胞类型或宿主细胞中表达所要序列，必须选定合适功能启动子。大量启动子(包括多种不同来源之组成性、可诱导性及可抑制性启动子)在此项技术中为熟知的(且已鉴别于诸如GenBank之数据库中)，且可以独立组件或克隆于多核苷酸序列内之组件、自商业来源(例如寄存中心，诸如ATCC，以及其它商业来源)或个别来源获得。在可诱导性启动子中，可响应信号增加或减少启动子之活性。举例而言，含有四环素(tetracycline)操纵序列(tetO)之四环素(tet)启动子可藉由四环素调控之反式激活蛋白(tTA)来诱导。tTA与tetO之结合在tet存在下被抑制。其它可诱导性启动子之实例为jun、fos、金属硫蛋白及热休克启动子。尤其适于高表达于真核细胞中之启动子例如为仓鼠之泛素/S27a启动子(WO 97/15664)、SV40早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-I启动子、劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)之长末端重复区、人类细胞巨大病毒之早期启动子(CMV)。其它异源哺乳动物启动子之实例为肌动蛋白、免疫球蛋白或热休克启动子。

前述启动子在此项技术中为熟知的。相应异源启动子可功能性连接至其它调控序列以便在表达盒中增强/调控转录活性。举例而言，启动子可功能性连接至增强子序列以增强转录活性。为此，可使用一或多个增强子及/或增强子序列之多个复本，例如CMV或SV40增强子。因此，在另一实施例中，根据本发明之表达载体含有一或多个增强子/增强子序列，较佳为CMV或SV40增强子。

术语“增强子”指示以顺式位置对启动子之活性起作用且因此刺激功能性连接至此启动子之基因或编码序列之转录的多核苷酸序列。不同于启动子，增强子之作用独立于位置及取向，且其可因此定位于转录单元之前或之后、内含子内或甚至编码区内。增强子可紧邻转录单元且远离启动子定位。亦可与启动子具有实体及功能重迭。熟习此项技术者已知各种来源之多种增强子(及寄存于诸如Genbank之数据库中之多种增强子，例如SV40增强子、CMV增强子、多瘤病毒增强子、腺病毒增强子)，该等增强子可以独立组件或克隆于多核苷酸序列内的组件(例如保藏在ATCC或商业及个别来源之组件)获得。多种启动子序列亦含有增强子序列，诸如常用CMV启动子。人类CMV增强子为迄今所鉴别之最强增强子之一。可诱导性增强子之一实例为金属硫蛋白增强子，其可藉由糖皮质激素或重金属刺激。

“转录调控组件”通常包含位于待表达之基因序列上游的启动子、转录起始及终止位点以及聚腺苷酸化信号。

术语“转录起始位点”系指构建体内对应于第一核酸且并入初级转录物(亦即mRNA前驱物)中的核酸。转录起始位点可与启动子序列重迭。

术语“转录终止位点”系指通常描绘于目标基因之3′端或待转录之序列段之3′端、促使RNA聚合酶终止转录的核苷酸序列。

“转录单元”、“表达单元”或“表达盒”系定义含有一或多个待转录基因之载体、构建体或多核苷酸序列内之区，其中该区段内所含之基因彼此操作性连接。其自单一激活子转录，且转录终止于至少一个聚腺苷酸化信号。从而将不同基因至少以转录方式连接。每个转录单元(多顺反子转录单元)可转录并表达一种以上蛋白质或产物。每个转录单元包含为转录及翻译该单元内所含之任何选定序列所需的调控组件。且每个转录单元可含有相同或不同之调控组件。举例而言，每个转录单元可含有相同终止子。IRES组件或内含子可用于转录单元内基因之功能连接。载体或多核苷酸序列可含有一个以上转录单元。

“翻译调控组件”包含待表达之每个个别多肽之翻译起始位点(AUG)、终止密码子及polyA信号。内部核糖体进入位点(IRES)可包括于一些构建体中。IRES定义如下。为优化表达，宜移除、添加或修改待表达之核酸序列之5′非翻译区及/或3′非翻译区以排除任何潜在多余的不当替代性翻译起始密码子或在转录或翻译层面上可能干扰或减少表达的其它序列。共同核糖体结合位点(Kozak序列：GCCGCCACCAUGG(SEQ ID NO：13)；AUG构成起始密码子)可紧邻起始密码子上游插入以增强翻译且因此增强表达。此核糖体结合位点周围之A/U含量增大进一步引起更有效之核糖体结合。为产生分泌多肽，目标基因通常包括编码前导肽或信号肽之信号序列，其将新合成之多肽导引至ER膜且通过ER膜，ER膜为多肽为分泌而途经之处。前导肽或信号肽通常(但非绝对)位于所分泌蛋白质之胺基末端，且在蛋白质跨越ER膜之后藉由信号肽酶裂解。基因序列通常(但非必定)含有其自身信号肽序列。在缺乏天然信号肽序列之情况下，可将异源信号肽序列与选定序列融合。或可将天然信号肽序列置换为异源信号肽序列。多种信号肽序列已知于熟习此项技术者，且寄存于诸如Genbank及EMBL的序列数据库中。

“内部核糖体进入位点”或“IRES”描述不依赖于IRES之基因5′而功能性促进翻译起始且允许在动物细胞中自单一转录物翻译两个顺反子(开放阅读框架)的序列。IRES提供独立核糖体进入位点以便翻译其下游紧邻的开放阅读框架。不同于可呈多顺反子性(亦即，编码自mRNA依序翻译之多个不同多肽)之细菌性mRNA，动物细胞之大部分mRNA呈单顺反子性且编码合成仅一种多肽。使用真核细胞中之多顺反子性转录物，翻译可起始于5′多数翻译起始位点，终止于第一终止密码子，且转录物自核糖体释放，从而仅翻译mRNA中之第一编码多肽。在真核细胞中，在转录物中具有操作性连接至第二或后续开放阅读框架之IRES的多顺反子性转录物允许依序翻译彼下游开放阅读框架以产生藉由同一转录物所编码的两个或两个以上多肽。IRES可长度不一，且来源于多种来源，例如脑心肌炎病毒(EMCV)、小核糖核酸病毒(例如FMDV)、脊髓灰白质炎病毒(PV)或C型肝炎病毒(HCV)。各种IRES序列及其用于载体建构之用途已描述且熟知于此项技术中。下游编码序列系在不消极影响下游基因之表达的任何距离处操作性连接至IRES的3′端。IRES与下游基因之起始端之间的最佳或可容许距离可藉由改变距离并量测随距离而变之表达而容易地测定。

如本文中所使用之术语“内含子”系指通常存在于多种真核基因内、长度不一的非编码核酸序列，该非编码核酸序列系藉由剪接方法、自新转录之mRNA前驱物中移除，内含子之任一端处或附近必需存在高度保守序列以便剪接。一般而言，剪接方法需要使内含子之5′及3′端正确裂解且将mRNA之所得端准确接合，以便产生具有用于蛋白质合成之适当阅读框架的成熟mRNA。多种剪接供体及剪接受体位点(意谓紧紧围绕外显子-内含子边界及内含子-外显子边界之序列)已表征并描述，且对于熟习此项技术者为已知的。

如本文中所使用之术语“目标基因”、“所要序列”、“目标多核苷酸”或“所要基因”具有相同含义，且系指编码目标产物之具有任何长度的多核苷酸序列。选定序列可为全长或截短基因、融合或标记基因，且可为cDNA、基因组DNA或DNA片段。其可为天然序列(亦即天然存在之形式)，或可突变或视需要以其它方式修饰。此等修饰包括密码子优化(以优化用于选定宿主细胞中之密码子)、人源化或标记。此外，为仅列举几个非限制性实例，其可包括移除或添加：顺式作用位点(诸如(隐蔽)剪接供体、受体位点及分支点)、聚腺苷酸化信号、TATA盒、chi位点、核糖体进入位点、重复序列、二级结构(例如茎环)、转录因子或其它调控因子之结合位点、限制性酶切位点等。选定序列可编码分泌多肽、细胞质多肽、细胞核多肽、膜结合多肽或细胞表面多肽。

在本说明书之范畴内，术语“功能性连接”或“操作性连接”意谓两个或两个以上核酸序列或序列组件以容许其以其预定方式起作用之方式定位。举例而言，若启动子/增强子或终止子能够控制或调节所连接之基因序列以顺式位置转录，则该启动子/增强子或终止子功能性连接至编码基因序列。通常(但非必定)，功能性连接之DNA序列为邻接的，且在需要接合两个多肽编码区时或在分泌信号肽之状况下为邻接的且位于阅读框架中。然而，尽管操作性连接之启动子通常定位于编码序列的上游或操作性连接之终止子通常定位于编码序列的下游，但启动子与编码序列并非必定邻接。增强子不一定邻接，只要其增强编码序列之转录。为此，其可定位于编码序列之上游或下游，且甚至可保持某些距离。若聚腺苷酸化位点以使得转录经由编码序列行进至聚腺苷酸化信号中之方式定位于编码序列的3′端，则聚腺苷酸化位点操作性连接至编码序列。连接系藉由此项技术中已知之重组方法(例如使用PCR方法)、藉由连接于合适限制位点或藉由黏接来实现。若合适限制性位点不存在，则可根据常规实务使用合成寡核苷酸连接子或转接子(adaptors)。

如本文中所使用之术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”或“DNA序列”系指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸以及其片段及部分，且系指染色体组或合成来源之DNA或RNA，其可为单股或双股且表示有义或反义股。序列可为非编码序列、编码序列或两者之混合物。本发明之核酸序列可使用熟习此项技术者熟知之标准技术来制备。

术语“编码”系指核酸中之特定核苷酸序列(诸如染色体中之基因或mRNA)在生物程序中充当用于合成具有指定核苷酸(亦即rRNA、tRNA、其它RNA分子)或氨基酸序列之其它聚合物及巨分子之模板的固有特性及由其所获得之生物特性。因此，若在细胞或其它生物系统中藉由转录并随后翻译mRNA来产生所要蛋白质，则基因编码蛋白质。基因或cDNA之编码股(其核苷酸序列与mRNA序列一致且通常提供于例如EMBL或Genbank之数据库的序列表中)与非编码股(用作转录模板)可称为编码该基因或cDNA之蛋白质或其它产物。编码蛋白质之核酸包括具有不同核苷酸序列、但因基因密码简并而编码蛋白质之相同氨基酸序列的任何核酸。编码蛋白质之核酸及核苷酸序列可包括内含子。在序列表中，序列以DNA而非RNA序列呈现。举例而言，当以DNA呈现时，起始密码子系以ATG而非AUG呈现。

在本发明之上下文中，术语“cDNA”系指藉由逆转录且通常藉由对基因所产生之mRNA或其它RNA进行第二股合成所产生的脱氧核酸。若cDNA分子为双股，则其具有编码股或有义股与非编码股或反义股。

如本文中所使用之术语“表达”系指在宿主细胞内转录及/或翻译异源核酸序列。所要产物在宿主细胞中之表达量可基于存在于细胞中之相应RNA或mRNA之量或藉由选定序列所编码之所要多肽的量来测定。举例而言，自选定序列转录之mRNA可藉由北方墨点杂交(Northern blothybridization)、核糖核酸酶RNA保护、与细胞RNA原位杂交或藉由PCR来定量。选定序列所编码之蛋白质可藉由各种方法来定量，例如ELISA、西方墨点法(Wetsern blotting)、放射性免疫检定、免疫沉淀法、检定蛋白质之生物活性，或对蛋白质进行免疫抑制、继之进行FACS分析及PCR。

术语“多肽”与“氨基酸残基序列”或术语“蛋白质”可互换使用，且系指具有任何长度之氨基酸多聚物。此等术语亦包括翻译后经由反应被修饰之蛋白质，该等反应包括(但不限于)糖基化、糖化、乙酰化、磷酸化、氧化、酰胺化或蛋白质加工。可在维持分子生物功能活性的同时，在多肽结构中进行修饰及改变，例如与其它蛋白质融合、氨基酸序列取代、缺失或插入。举例而言，可在多肽或其潜在核酸编码序列中进行某些氨基酸序列取代且可获得具有类似特性之蛋白质。氨基酸修饰可(例如)藉由对其潜在核酸序列进行定点诱发突变或聚合酶链反应介导诱发突变而来制备。术语“多肽”因此亦包括例如由免疫球蛋白组份(例如Fc组份)及生长因子(例如白介素)组成的融合蛋白质。

如本文中所使用，术语“抗体”包括多克隆、单克隆、双特异性、多特异性、人类、人源化或嵌合抗体、单链抗体、抗体之抗原结合片段(例如Fab或F(ab′)2片段)、二硫键键接之Fv等。此等抗体可经由化学合成、经由重组或转基因方式、经由细胞(例如杂交瘤)培养或藉由其它方式产生。

Fab片段(抗原结合片段＝Fab)由两条链之可变区组成，该两条链藉由相邻恒定区维系在一起。此等Fab片段不仅可藉由蛋白酶消化(例如用木瓜蛋白酶)、自常规抗体形成，而且类似Fab片段可同时藉由基因工程产生。其它抗体片段包括F(ab′)2片段，其可藉由胃蛋白酶进行蛋白水解分裂来制备。

使用基因工程方法可产生缩短之抗体片段，其仅由重链(VH)及轻链(VL)之可变区组成。此等片段称为FV片段(可变片段＝可变部分之片段)。因为此等Fv片段在两条链中缺乏恒定链之半胱氨酸之共价键结，所以Fv片段常为稳定的。藉由短肽片段(例如10至30个氨基酸，较佳15个氨基酸)连接重链与轻链之可变区为有利的。以此方式，获得由肽连接子所连接之VH及VL组成的单肽链。此种抗体蛋白质称为单链Fv(scFv)。此种scFv抗体蛋白质之实例获知于先前技术。

近年来，已开发用于制备呈多聚体衍生物形式之scFv的多种策略。此目的尤其为产生药物动力学及生物分布特性改良以及结合亲和力增强的重组抗体。为达成scFv之多聚，以具有多聚域之融合蛋白质形式制备scFv。多聚域可为例如IgG之CH3区或卷曲螺旋结构(螺旋结构)，诸如亮氨酸拉链域(Leucin-zipper domain)。然而，亦存在利用scFv之VH/VL区之间相互作用进行多聚化(例如双功能抗体、三功能抗体及五功能抗体)之策略。熟习此项技术者了解，双功能抗体意谓二价同二聚scFv衍生物。将scFv分子中之连接子缩短至5-10个氨基酸可形成同二聚体，其中发生链间VH/VL重达。双功能抗体另外可藉由合并二硫键桥来稳定化。双功能抗体-抗体蛋白质之实例获知于现有技术。

熟习此项技术者了解，微型抗体(minibody)意谓二价同二聚scFv衍生物。其由含有免疫球蛋白(较佳为IgG，最佳为IgG1)之CH3区作为二聚合区的融合蛋白质组成，此二聚合区经由铰链区(例如亦来自IgG1)及连接子区连接至scFv。微型抗体-抗体蛋白质之实例获知于先前技术。

熟习此项技术者了解，三功能抗体(triabody)意谓三价同三聚scFv衍生物。其中VH-VL不经由连接子序列而直接融合之ScFv衍生物可形成三聚体。

熟习此项技术者亦熟知具有二价、三价或四价结构且自scFv所衍生之所谓微型抗体。二聚合、三聚合或四聚合卷曲螺旋结构可进行多聚化。在本发明之一较佳实施例中，目标基因编码上述任何彼等所要多肽，较佳编码单克隆抗体、其衍生物或片段。

“目标多肽”、“目标蛋白质”或“目标产物”包括蛋白质、多肽、其片段、肽、融合蛋白质，其皆可表达于选定宿主细胞中。所要蛋白可为例如抗体、酶类、细胞因子、淋巴激素、粘附分子、受体及其衍生物或片段，及可充当激动剂或拮抗剂且/或具有治疗或诊断用途之任何其它多肽。

尤其，所要蛋白质/多肽或目标蛋白质为例如(但不限于)胰岛素、胰岛素样生长因子、hGH、tPA、细胞因子(诸如白介素(IL)，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18)、干扰素(IFN)α、IFNβ、IFNγ、IFNomega或IFNtau、肿瘤坏死因子(TNF)(诸如TNFα及TNFβ、TNFγ、TRAIL)、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1、VEGF及纳米抗体(nanobody)。亦包括生产红细胞生成素或可充当激动剂或拮抗剂且/或具有治疗或诊断用途之任何其它激素生长因子及任何其它多肽。根据本发明之方法亦可有利地用于生产抗体，诸如单克隆、多克隆、多特异性及单链抗体或其片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fc及Fc′片段)；免疫球蛋白重链及轻链及其恒定区、可变区或超变区：以及Fv及Fd片段。

“目标产物”亦可为反义RNA、tRNA、rRNA、作为核糖蛋白质之一部分的其它RNA，或其它调控RNA。

本发明之方法可在所有真核细胞中进行。细胞及细胞系可存在于例如细胞培养物中，且包括(但不限于)真核细胞，诸如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞。举例而言，细胞可为卵母细胞、胚胎干细胞、造血干细胞或任何类型之分化细胞。其中真核细胞为哺乳动物细胞之方法较佳。其中哺乳动物细胞为人类、猿、鼠类、大鼠、兔、仓鼠、山羊、牛、绵羊或猪细胞的方法更佳。用于生产生物药物的较佳细胞系或“宿主细胞”为人类、小鼠、大鼠、猴或啮齿动物细胞系。更佳为仓鼠细胞，较佳为BHK21、BHKTK^-、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1、CHO-S及CHO-DG44细胞或任何此等细胞系之衍生物/后代。尤其较佳为CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-K1、CHO-S及BHK21，且甚至更佳为CHO-DG44及CHO-DUKX细胞。此外，鼠类骨髓瘤细胞(较佳NS0及Sp2/0细胞或任何此等细胞系之衍生物/后代)亦已知可用作生物药物蛋白质的生产细胞系。可在本发明之含义内使用之鼠类及仓鼠细胞之实例亦总结于表1中。

表1：真核生产细胞系

细胞系	序号
		NS0	ECACC第85110503号
Sp2/0-Ag14	ATCC CRL-1581
		BHK21	ATCC CCL-10
BHKTK-	ECACC第85011423号
		HaK	ATCC CCL-15
2254-62.2(BHK-21衍生物)	ATCC CRL-8544
		CHO	ECACC第8505302号
CHO野生型	ECACC 00102307
		CHO-K1	ATCC CCL-61
CHO-DUKX(＝CHO duk-，CHO/dhfr-)	ATCC CRL-9096
		CHO-DUKX B11	ATCC CRL-9010
CHO-DG44	Urlaub等人，Cell 33(2)，405-412，1983
		CHO Pro-5	ATCC CRL-1781
CHO-S	Invitrogen Catt第10743-029号
		Lec13	Stanley P.等人，Ann.Rev.Genetics 18，525-552，1984
V79	ATCC CCC-93
		B14AF28-G3	ATCC CCL-14
HEK 293	ATCC CRL-1573
		COS-7	ATCC CRL-1651
U266	ATCC TIB-196
		HuNS1	ATCC CRL-8644

Per.C6	Fallaux，F.J.等人，Human Gene Therapy 9(13)，1909-1917，1998
		CHL	ECACC第87111906号

在无血清条件下及视情况在无任何动物源蛋白质/肽之培养基中建立、调适且完全培养的宿主细胞为最佳的。诸如以下之市售培养基为例示性适当营养溶液：Ham′s F12(Sigma，Deisenhofen，Germany)、RPMI-1640(Sigma)、杜贝科氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(DMEM)；Sigma)、最低必需培养基(MEM；Sigma)、斯考弗氏改良杜贝科氏培养基(Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium(IMDM)；Sigma)、CD-CHO(Invitrogen，Carlsbad，CA)、CHO-S-SFMII(Invtirogen)、无血清CHO培养基(Sigma)、无蛋白质CHO培养基(Sigma)、EX-CELL培养基(SAFC)、CDM4CHO及SFM4CHO(HyClone)。需要时，任何培养基可补充有多种化合物，例如激素及/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白、表皮生长因子、胰岛素样生长因子)、盐(诸如氯化钠、磷酸钙、磷酸镁)、缓冲液(诸如HEPES)、核苷(诸如腺苷、胸苷)、谷氨酰胺、葡萄糖或其它等效能量源、抗生素、微量元素。亦可以熟习此项技术者已知之适当浓度包括任何其它必要补充剂。在本发明中，较佳使用无血清培养基，但亦可使用补充有适量血清的培养基培养宿主细胞。为培养及选择表达可选基因之遗传修饰细胞，将合适选择剂添加至培养基中。

可藉由熟习此项技术者熟知之任何方法用多核苷酸序列或表达载体“转染”真核宿主细胞，产生遗传修饰细胞、重组或转基因细胞。转染方法包括(但不限于)脂质粒介导之转染法、磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、聚阳离子(例如DEAE聚葡萄糖)介导之转染法、原生体融合法、显微注射法及病毒感染法。转染较佳为稳定转染。提供异源基因或多核苷酸在具体宿主细胞系及细胞类型中之最佳转染频率及表达的转染方法是有利的。适合的方法可由常规程序判定。对于稳定转染物而言，构建体整合于宿主细胞基因组或人造染色体/微型染色体中，或作为游离体而存在，以稳定地维持于宿主细胞内。为产生表达目标产物之遗传修饰细胞，所有需要之异源基因可位于单顺反子或多顺反子转录单元中之单一载体或多核苷酸序列上。在此状况下，用单一载体或多核苷酸序列转染宿主细胞。异源基因亦可位于不同载体或多核苷酸序列上。在此状况下，用所有载体或多核苷酸序列共转染宿主细胞，及/或用编码目标基因之载体或多核苷酸序列连续数轮转染宿主细胞。

依据定义，插入宿主细胞中之每个多核苷酸序列或每个基因及所编码之各别蛋白质或RNA相对于宿主细胞称为“异源”、“异源序列”、“异源基因”、“异源编码序列”、“转基因”或“异源蛋白质”。即使欲引入之序列或欲引入之基因与宿主细胞之内源序列或内源基因一致，此称谓亦适用。举例而言，引入仓鼠宿主细胞中之仓鼠肌动蛋白基因依据定义为异源基因。

术语“内源”意谓天然含于细胞或生物体内。因此，内源基因为存在于未操作之野生型细胞之基因组中的基因。

术语“选择标记基因”系指一种基因，其在相应选择剂存在下仅允许特异性选择载运该基因之细胞。举例而言，抗生素抗性基因可用作正可选标记基因，该基因在相应抗生素存在下允许正选择经基因转型之宿主细胞；非转型之宿主细胞在选择培养条件下不能生长或存活。可选标记可为正、负或双功能可选标记。正可选标记允许选择载运赋予药物抗性或弥补宿主细胞之新陈代谢或分解代谢缺陷之标记的细胞。相比之下，负选择标记允许选择性排除载运该标记之细胞。举例而言，使用HSV-tk基因作为标记将使得细胞敏感于诸如阿昔洛韦(acyclovir)及更昔洛韦(gancyclovir)之药剂。本文中使用之包括可扩增之可选基因的可选标记基因将包括天然可选标记基因之重组工程改造突变体及变体、片段、功能等效物、衍生物、同源物及融合物，只要经编码之产物保留可选特性。可用衍生物在与可选特性相关联之可选标记的区或域中通常具有实质序列类似性(在氨基酸层面)。熟习此项技术者熟知之多种标记基因已有描述，该等标记基因包括双功能(亦即正/负)标记(参见例如WO 92/08796及WO 94/28143，该等专利以引用方式并入本文中)。举例而言，常用于真核细胞之可选基因包括针对胺基糖苷磷酸转移酶(APH)、潮霉素磷酸转移酶(HYG)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶、天冬酰胺合成酶之基因，及编码抗新霉素(G418)、嘌呤霉素(puromycin)、组胺醇D(histidinol D)、博莱霉素(bleomycin)及腐草霉素(phleomycin)之抗性的基因。

“可选可扩增标记基因”通常编码一种在彼等条件下为真核细胞生长所需要之酶。举例而言，可选可扩增标记基因可编码DHFR，当经DHFR基因转染之宿主细胞在选择剂甲胺喋呤(methotrexate)(MTX)存在下生长时，DHFR基因被扩增。因此，根据本文中所述之任何方法遗传修饰之宿主细胞涵盖于本发明，其中可选可扩增标记基因编码例如具有以下酶之功能的多肽：二氢叶酸还原酶(DHFR)、谷氨酰胺合成酶、CAD、腺苷脱氨酶、腺苷酸脱氨酶、UMP合成酶、IMP 5′-脱氢酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、次黄嘌呤乌嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRTase)、胸苷激酶、胸苷酸合成酶、P醣蛋白170、核糖核苷酸还原酶、天冬酰氨酸合成酶、精氨酰琥珀酸合成酶、鸟氨酸脱羧酶、HMG CoA还原酶、乙酰葡糖胺转移酶、苏氨酰基-tRNA合成酶或Na⁺K⁺-三磷酸腺苷酶(Na⁺K⁺-ATPase)。欲回顾表2中所列之例示性可选可扩增标记基因，参见Kaufman，Methods in Enzymology，185，537-566，1990。

一种特定的可选可扩增标记基因为编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因，二氢叶酸还原酶为嘌呤之生物合成所必需。缺乏DHFR基因之细胞将不能在缺乏嘌呤之培养基上生长。DHFR基因因此可用作显性可选标记以选择并扩增在缺乏嘌呤之培养基中生长之此等细胞中的基因。配合DHFR基因使用之选择剂为甲胺喋呤(MTX)。

另一个选择及/或扩增标记为谷氨酰胺合成酶(GS)基因。GS基因编码为合成氨基酸谷氨酰胺所需之谷氨酰胺合成酶。缺乏GS基因或表达低量内源GS之细胞将不能在无谷氨酰胺之培养基中生长。GS基因因此可用作显性可选标记以选择并扩增在无谷氨酰胺之培养基中生长之此等细胞中的基因。配合GS基因使用之选择剂为甲硫氨酸磺酰亚胺(MSX)。

表2：可选可扩增标记基因

亦可藉由荧光活化细胞分选术(FACS)、使用以下进行选择以针对重组细胞选择：例如细胞表面标记、细菌性β-半乳糖苷酶，或维多利亚管水母(Aequorea victoria)及海肾(Renilia yeniformis)或其它物种之荧光蛋白质(例如绿色荧光蛋白质(GFP))及其变体：非生物发光物种(例如珊瑚属(Discosomasp.)、海葵属(Anemonia sp.)、软珊瑚属(Clavularia sp.)、六放珊瑚属(Zoanthussp.))之红色荧光蛋白质、荧光蛋白质及其变体。

术语“选择剂”系指干扰缺乏特定可选基因之宿主细胞之生长或存活的物质。举例而言，为针对存在于经转染细胞中之抗生素抗性基因(APH(胺基糖苷磷酸转移酶))选择，使用抗生素遗传霉素(Geneticin)(G418)。选择剂亦可包含“扩增剂”，为本文中之目的，其定义为用于扩增可扩增基因之复本的药剂(若所依赖之可选标记基因为可扩增可选标记)。举例而言，MTX为可用于DHFR基因之扩增的选择剂。

上述方法之另一实施例系关于一种方法，其中若多肽/产物分泌于培养基中，则自细胞或细胞培养液上清液中分离藉由目标基因编码且表达于该宿主细胞中之多肽/产物。

较佳在有利于表达所要基因及自细胞及/或细胞培养液上清液分离目标蛋白质的条件下、在无血清培养基中、以悬浮培养法培养该等生产细胞。较佳地，自培养基回收作为分泌多肽的目标蛋白质，或其自宿主细胞溶胞物回收(若表达时无分泌信号)。必需以达成目标蛋白质之实质上同源性制备的方式自其它重组蛋白质、宿主细胞蛋白质及污染物纯化目标蛋白质。作为第一步骤，通常自培养基或溶胞物移除细胞及/或细胞微粒碎片。其后例如藉由以下方法自污染性可溶蛋白质、多肽及核酸纯化目标产物：免疫亲和柱或离子交换柱溶离法、乙醇沉淀法、逆相HPLC、Sephadex层析法、二氧化硅或阳离子交换树脂(诸如DEAE)层析法。一般而言，教示熟习此项技术者如何纯化宿主细胞所表达之异源蛋白质的方法在此项技术中为熟知的。

除非另外指示，否则本发明之实施将使用熟习此项技术者之技能范围内之细胞生物学、分子生物学、细胞培养学、免疫学及类似者之常规技术。此等技术已充分揭示于当前文献中。

以下实施例不具限制性。其仅展示本发明之可能实施例。熟习此项技术者可易调整条件以使其适用于其它实施例。

实施例

缩写

AP：碱性磷酸酶

BGH：牛生长激素

bp：碱基对

CHO：中国仓鼠卵巢

DHFR：二氢叶酸还原酶

ELISA：酶联免疫吸附实验

FACS：荧光活化细胞分选仪

HGH：仓鼠生长激素

HT：次黄嘌呤/胸苷

HRPO：辣根过氧化物酶

IgG：免疫球蛋白

IRES：内部核糖体进入位点

kb：千碱基

mAb：单克隆抗体

MTX：甲胺喋呤

NPT：新霉素磷酸转移酶

nt：核苷酸

PBS：磷酸盐缓冲生理盐水

PCR：聚合酶链式反应

SEAP：分泌之碱性磷酸酶

sICAM：可溶性细胞内粘附分子

UTR：非翻译区

材料及方法

细胞培养

使CHO-DG44/dhfr^-/-细胞悬浮生长于补充有次黄嘌呤及胸苷(HT)之无血清培养基CHO-S-SFMII(Invitrogen)中。在含有5％CO₂之加湿氛围下、在37℃下、在细胞培养瓶中培育细胞。用CASY1细胞计数器(Schaerfe System，Germany)、Cedex(Innovatis AG，Germany)或经由锥虫蓝染料排除法测定细胞数目以及细胞存活率。每隔两至三天，将细胞以1-3×10⁵个细胞/毫升之浓度接种于新鲜培养基中。

转染

使用Lipofectamine Plus试剂(Invitrogen)进行CHO-DG44细胞之转染。每次转染将6×10⁵个指数级生长于0.8mL补充有次黄嘌呤/胸苷(HT)之CHO-S-SFMII培养基中的细胞接种于6孔室之孔中。依循制备商之方案，每次转染产生质粒DNA、4μL Lipofectamine及6μL Plus试剂之200μL体积的混合物，且添加至细胞中。培育3小时后，添加2mL补充有HT之CHO-S-SFMII培养基。

重复进行瞬间转染三次且在转染后2天收集上清液及细胞。对于基于DHFR选择稳定转染之CHO-DG44细胞，在转染后48小时将该培养基置换为无HT之CHO-S-SFMII培养基。藉由将5-2000nM范围内之MTX(Sigma)作为扩增选择剂添加至培养基中来达成基于DHFR之基因扩增。在共转染状况下，藉由将转染后48小时之细胞移入补充有200-400μg/mL浓度之G418(Invitrogen)之无HT之CHO-S-SFMII培养基中来基于DHFR及NPT选择稳定转染之CHO-DG44细胞。

表达载体

真核表达载体为pAD-CMV1载体(WO 9201055)之衍生物，且介导藉由CMV启动子/增强子所驱动之异源基因的组成性表达。为终止目标基因转录及使目标基因转录物聚腺苷酸化，载体含有SV40晚期聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO：11)或BGH聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO：12)。pBID载体编码作为可扩增选择标记的DHFR微型基因(参见例如EP0 393 438)，而pBIN载体在SV40早期启动子及胸苷激酶聚腺苷酸化信号控制下编码作为选择标记的NPT基因(图1)。

使用定位于启动子与聚腺苷酸化信号之间的多克隆位点将编码人类sICAM、单克隆抗体(IgG1、IgG2或IgG4同种型)之重链及轻链或Fc融合蛋白质的目标基因克隆于载体中。

ELISA

使用两种内部开发之sICAM特异性单克隆抗体、依据标准方案、藉由ELISA定量sICAM效价(如例如美国专利第5,284,931号及第5,475,091号中所述)，其中一种抗体为结合HRPO的抗体。使用经纯化之sICAM蛋白质作为标准。

使用山羊抗人类IgG Fc片段(Dianova)及结合AP之山羊抗人类kappa轻链抗体(Sigma)、依据标准方案、藉由ELISA定量mAb效价。以所表达mAb形式使用经纯化之同种型mAb抗体作为标准。

使用Spectra Fluor Plus读取器(TECAN，Crailsheim，Germany)分析样本。

利用公式pg/((Ct-Co)t/1n(Ct-Co))计算细胞生产力(pg/细胞/天)，其中“Co”为接种时细胞数，“Ct”为收集时细胞数，“t”为培养时间。

SEAP检定

根据制备商之方案(Roche Diagnostics)、利用SEAP报导基因检定测定SEAP活性。

实施例1：分离及克隆仓鼠生长激素(HGH)之转录终止区

为自CHO-DG44基因组(中国仓鼠，灰仓鼠)分离生长激素基因之完整聚腺苷酸化信号区，连接转接子之基因组CHO-DG44DNA充当巢式PCR之模板。使用分别与转接子序列及生长激素基因序列互补的引物组合进行初次PCR。基于叙利亚仓鼠(金黄地鼠：Genbank S66299)之生长激素的cDNA序列设计基因特异性引物GH for1(5′-GAGACCTACCTGCGGGTCA TGA-3′；SEQ ID NO：1)，且定位于终止密码子之上游35bp处。用内部转接子引物与直接定位于GH for1引物位置下游之第二巢式基因特异性引物GH for2(5′-AGTGCCGTCGCTTTGTGGAAA G-3′；SEQ ID NO：2)之组合、对初次PCR产物进行二次PCR。将所得DNA片段亚克隆于TA克隆载体(Invitrogen)中，且藉由序列分析进一步分析。除GH for2引物序列外，最长DNA片段进一步含有13bp之编码区3′端：继之为终止密码子及324bp之灰仓鼠之生长激素之3′非翻译区(图2；SEQ ID NO：7)。

为仅获得具有总共342bp之3′非翻译区(SEQ ID NO：8)，使用引物GHSfi for 1(SEQ ID NO：3)及GH Xba rev 1(SEQ ID NO：4)再进行PCR。因此亚克隆于TA载体中之上述362bp DNA片段(SEQ ID NO：7)充当PCR模板。经扩增之序列(SEQ ID NO：8)与不同物种之生长激素3′非翻译区具有以下同源性：与叙利亚仓鼠金黄地鼠序列(Genbank S66299)72.1％同源；与家鼹鼠序列(Genbank Z46663)71.6％同源：与褐鼠序列(Genbank V01239)61％同源：及与温带牛BGH序列(Genbank J00008)50.4％同源(图3)。

亦利用基于PCR之方法产生其中经分离之3′非翻译区之3′端具有不同缺失的亚克隆。使用引物组合GH Sfi for1(SEQ ID NO：3)与GH Xba rev2(SEQID NO：5)产生3′非翻译区之189bp片段(SEQ ID NO：9)，且使用引物组合GH Sfi for 1(SEQ ID NO：3)与GH Xba rev3(SEQ ID NO：6)产生113bp次片段(SEQ ID NO：10)。因此，3′非翻译区之所有扩增片段具有相同5′端，其对应于终止密码子及可变3′端之后的第一核苷酸(图4)。

用SfiI及XbaI消化PCR产物，且使用所得限制性片段置换编码人类sICAM之载体pJR106中的SV40晚期聚腺苷酸化信号序列(图5)。所得载体pJR131、pJR134及pJR135现分别含有324bp(SEQ ID NO：8)、189bp(SEQID NO：9)及113bp(SEQ ID NO：10)之尺寸、来源于灰仓鼠之生长激素的聚腺苷酸化信号序列，称为短HGH(图5)。

实施例2：HGH聚腺苷酸化信号序列对SICAM瞬间表达的影响

为评估来源于灰仓鼠生长激素之聚腺苷酸化信号序列(HGH)对表达目标基因sICAM的影响，独立于染色体整合位点进行瞬间转染。用含有324bp之仓鼠生长激素3′UTR(＝HGH，SEQ ID NO：8)的质粒pJR131转染CHO-DG44细胞(图5)。含有SV40晚期(pJR106)或BGH(pJR110)聚腺苷酸化信号序列之载体用作对照(图5)。除终止序列不同外，用于表达sICAM之不同载体之遗传构成相同。

在转染后2天收集上清液，且使用ELISA测定sICAM效价。为修正转染效率，用编码所分泌之碱性磷酸酶之质粒pCMV-SEAP(每个转染反应100ng DNA)共转染细胞，且量测SEAP活性。

图6展示双重复进行之2个独立瞬间转染系列的数据。惊人地，使用来源于仓鼠生长激素基因之聚腺苷酸化信号序列获得最高sICAM表达。与经含有BGH聚腺苷酸化信号之载体pJR110所转染的细胞相比，效价增加高达21％(转染系列#1)，且与经含有SV40晚期聚腺苷酸化信号之载体pJR106所转染的细胞相比，效价增加高达40％(转染系列#1)。

实施例3：HGH聚腺苷酸化信号对IGG4抗体瞬间表达的影响

为评估来源于灰仓鼠生长激素(HGH)之聚腺苷酸化信号序列对表达目标基因人源化IgG4/kappa mAb的影响，独立于染色体整合位点进行瞬间转染。用载体组合pBID/IgG4及pBIN/kappa共转染CHO-DG44细胞。两个载体均含有324bp之仓鼠生长激素3′UTR(＝HGH；SEQ ID NO：8)作为聚腺苷酸化信号序列。作为对照，用含有BGH聚腺苷酸化信号的载体组合pBID-B/IgG4与pBIN-B/kappa共转染CHO-DG44细胞(对于基本载体参见图1)。除终止序列不同外，用于表达IgG4/kappa mAb之不同载体之遗传构成相同。

转染后2天收集上清液，且使用ELISA测定IgG4效价。每个载体组合转染6个细胞池。为修正转染效率，用编码所分泌之碱性磷酸酶之质粒pCMV-SEAP(每个转染反应100ng DNA)共转染细胞，且量测SEAP活性。

惊人地，用HGH聚腺苷酸化信号序列所获得之效价比针对BGH聚腺苷酸化信号所获得之效价平均高35％(图7)。

实施例4：测试不同HGH变体

藉由PCR产生两个来源于灰仓鼠生长激素之324bp HGH序列(SEQ IDNO：8)之3′缺失克隆，且作为聚腺苷酸化信号序列置放于sICAM基因下游。所得载体pJR134及pJR135(图5)分别含有189bp(SEQ，ID NO：9)及113bp(SEQ ID NO：10)之较短HGH序列段，该等序列段具有共同5′端位置(图4)。

为评估HGH缺失变体对表达目标基因sICAM的影响，独立于染色体整合位点进行瞬间转染。用载体pJR134及pJR135转染CHO-DG44细胞。含有324bp HGH序列之载体pJR131用作对照(图5)。除终止序列不同外，用于表达sICAM之不同载体之遗传构成相同。

在转染后2天收集上清液，且使用ELISA测定sICAM效价。为修正转染效率，用编码所分泌之碱性磷酸酶之质粒pCMV-SEAP(每次转染反应100ng DNA)共转染细胞，且量测SEAP活性。

图8展示双重复进行之2个独立瞬间转染系列的数据。两个HGH缺失变体均引起sICAM表达量减少。表达载体pJR134中所含189bp之HGH序列引起高达23％之较缓和减幅。因此，189bp片段展示与BGH及SV40晚期聚腺苷酸化信号相当的效能(参见实施例2及3)。然而，表达载体pJR135中所含之113bp最短HGH序列引起高达78％之sICAM表达量减幅。此展示定位于SEQ ID NO：8序列之bp 190至324之HGH区之间有助于有效表达目标基因。

实施例5：使用HGH聚腺苷酸化信号高水平稳定表达蛋白质

用编码mAb不同同种型(IgG1、IgG2、IgG4)之重链与轻链或Fc融合蛋白质之载体组合共转染CHO-DG44细胞，其中Fc部分来源于IgG1或IgG2。用于表达之基本载体pBID及pBIN(图1)含有324bp HGH序列(SEQ ID NO：8)作为定位于目标基因下游的聚腺苷酸化信号序列。在转染后2天使用基于DHFR及基于NPT之选择法选择稳定细胞池。首先选择稳定转染剂，接着藉由在第一轮中向培养基中添加100nM MTX且随后添加800nM MTX来进行两个连续的DHFR介导基因扩增步骤。藉由稀释克隆或基于FACS将单一细胞沉积于96孔板之孔中来获得单一细胞克隆。

实验数据展示，可使用来源于灰仓鼠之HGH聚腺苷酸化信号达成目标蛋白质在稳定转染剂中之高表达。获得具有每天每细胞10-45pg范围内之比生产力及补料分批培养中高达6.3g/L之效价的细胞池及细胞克隆(图9)。

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