CN104278032A - 一种新型双启动子结构单元 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种新型双启动子结构单元。本发明公开了一种新型双启动子结构单元，其包含2个核酸序列如SEQ ID NO.2所示的CMV启动子和一段核酸序列如SEQ ID NO.1所示的序列，该双启动子结构单元在经染色体整合后使得表达系统中目的基因的转录或表达增加。本发明的启动子结构单元可用在哺乳动物细胞表达载体的构建中，构建好的质粒可以用于哺乳动物细胞的瞬时转染及稳定表达细胞株的构建，本发明的启动子单元比传统CMV启动子有更强的转录效率。

Description

一种新型双启动子结构单元

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种新型双启动子结构单元。

背景技术

在整个生物制药行业中，约有70％蛋白药物是由中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞表达的。目前市场上广泛应用的CHO细胞表达系统主要有美国LifeTechnologies公司的DG44细胞表达系统和英国Lonza公司的CHO K1表达系统。

DG44细胞表达系统/CHO K1细胞表达系统中一个共同的特点就是都使用单拷贝CMV启动子，CMV启动子是属于强启动子，能够高效的驱动外源基因在CHO细胞中的转录。然而，生物制药整个过程中包括原材料，设备昂贵，成本居高不下。各大医药公司越来越重视如何提高蛋白表达水平，进而进一步降低成本。而细胞表达外源蛋白的水平的一个关键因素就是外源蛋白mRNA的转录效率，这就涉及到对启动子的结构进行改造，达到更大的转录效率。

发明内容

本发明目的在于彻底克服从培养基中除去这些重组蛋白同时维持CHO细胞的正常生长及高水平的表达量，最终开发出了一种可用于培养CHO细胞的不含有重组蛋白的化学成分确定的培养基。

本发明公开了一种新型双启动子结构单元，其包含2个核酸序列如SEQ IDNO.2所示的CMV启动子和一段核酸序列如SEQ ID NO.1所示的序列，该双启动子结构单元在经染色体整合后使得表达系统中目的基因的转录或表达增加。

在一些实施例中，所示双启动子结构单元为SEQ ID NO.3、或与SEQ ID NO.3互补的核苷酸序列。

另一方面，本发明公开了一种真核表达载体，其特征在于所述表达载体包含所述的新型双启动子结构单元。

另一方面，本发明公开了一种真核宿主细胞，其特征在于其包含所述的真核表达载体，该宿主细胞为哺乳动物细胞，该哺乳动物细胞为CHO、NSO，Sp2/0-Ag14、BHK21、BHK TK′HaK、2254-62.2、V79、B14AF28-G3、或CHL细胞。CHO细胞为CHO-K1、CHO-DUKX，CHO-DUKX B1、CHO-DG44、或CHO Pro-5细胞。

另一方面，本发明公开了一种形成经稳定转染的高产真核宿主细胞系的方法，其特征在于具有下列步骤：(a)将所述的新型双启动子结构单元整合至包含目的基因的真核表达载体中；(b)用此表达载体转染真核宿主细胞；(C)选择经转染的高产宿主细胞。

另一方面，本发明公开了一种制备重组蛋白药物的方法，包含下列步骤：(a)将所述的新型双启动子结构单元整合至包含目的基因的真核表达载体中；(b)用此表达载体转染真核宿主细胞；(c)选择经转染的高产宿主细胞；(d)在使得该一个或多个目的基因表达的条件下培养该所获得的经转染的高产宿主细胞，(e)收集并纯化目的蛋白质。

另一方面，本发明公开了所述的新型双启动子结构单元在制备药物或药物组合物中的用途。

本发明的启动子结构单元可用在哺乳动物细胞表达载体的构建中，构建好的质粒可以用于哺乳动物细胞的瞬时转染及稳定表达细胞株的构建，本发明的启动子单元比传统CMV启动子有更强的转录效率。

附图说明

图1pOptiVEC质粒图谱；

图2Pcmv，Pcmv-Enhl，Pcmv-HBV333质粒图谱；

图3Pcmv-HBV333，Pcmv-HBV333-Pcmv质粒图谱；

图4Pcmv，Pcmv-Enhl，Pcmv-HBV333质粒Firefly荧光素酶活性检测；

图5Pcmv-HBV333，Pcmv-HBV333-Pcmv质粒Firefly荧光素酶活性检测

图6Pcmv-HBV333-Pcmv-Avastin LC/Pcmv-HBV333-Pcmv-Avastin HC质粒图谱；

图7Pcmv-Avastin LC/Pcmv-Avastin HC质粒图谱；

图8Avastin Western-Blot检测结果；

具体实施方式

在本说明书中所使用的多数词语具有本领域技术人员所理解的这些词的含义。在本说明书中明确定义的词语具有在本发明上下文中作为整体所提供的、并且如本领域技术人员所一般理解的含义。在词语或短语的本领域所理解的定义与该词语或短语的在本说明书中明确发明的定义有矛盾时，以说明书为准。本文所使用的标题仅仅为了方便，并且不理解为以任何方式限制。

如本文所使用的“DNA”指如本领域所理解的以其各种形式的脱氧核糖核酸，诸如基因组DNA、cDNA、分离的核酸分子、载体DNA以及染色体DNA。“核酸”是指任何形式的DNA或RNA(核糖核酸)。如本文所使用的术语“分离的核酸分子”是指已从其自然环境中移去的核酸分子(DNA或RNA)。分离的核酸分子的一些实例是在载体中含有的重组DNA分子、维持在异源宿主细胞中的重组DNA分子、部分或基本上纯化的核酸分子以及合成的DNA分子。“分离的”核酸可以没有这样的序列，即所述序列在该核酸衍生自其中的生物体的基因组DNA中天然地位于该核酸的侧翼(即，位于该核酸5’和3’端的序列)。此外，当通过重组技术产生时，“分离的”核酸分子(诸如cDNA分子)可以基本上没有其它细胞材料或培养基，或当化学合成时其基本上没有化学前体或其它化学物质。

术语“HBV333元件”或“表达增强元件”或“转录增强元件”或“表达或转录增强核酸元件”在本文中以同义使用。此等术语均指调控核酸序列。

特定言之，“HBV333元件”或“表达增强元件”或“转录增强元件”或“表达或转录增强核酸元件”为SEQ ID NO.1(包括其互补序列)，或其任何部分、片段或区域，或序列ID NO.1的衍生物或该衍生物的部分、片段或区域之一，当其稳定整合至染色体中时可使目的基因的转染或表达增加。亦意谓序列IDNO.1的部分、片段、区域或衍生物的任意组合，其是由多个相同或不同的SEQ IDNO.1的部分、片段、区域或衍生物组成，而各组份又可以任意取向且以任意间距彼此相对排列，或可与其他调控序列组合，且可使目的基因的转录或表达增加。术语TE元件可指SEQ ID NO.1本身及其任意片段、部分、区域或衍生物。

片段”或“部分”或“区域”(此等术语以同义使用)意谓序列与SIQID NO.1或其互补序列的部分区域100％一致的核酸分子(单链或双链)。已知克隆通过限制酶消化或通过PCR所制得的片段可引起该片段末端区中的修饰，亦即添加或缺失核苷酸或经由引物另外引入核苷酸，此为填补反应或断裂反应的结果。片段的定义包括片段末端区中的此等变异，即使此等序列区与SEQ ID NO.1的序列同一性小于100％。

在本发明中，“衍生物”意谓与SEQ ID NO.1或其互补序列或与SEQ IDNO.1的部分或片段或区域或SEQ ID NO.1的互补序列具有至少70％的序列同一性，优选至少约80％的序列同一性，优选至少约85％的序列同一性，尤其优选至少约90％的序列同一性，且最佳至少约95％的序列同一性，且经染色体整合后可使目的基因的转录或表达增加的核酸分子(单链或双链)。在一方面，与SEQ ID NO.1的序列差异可基于源自其他生物体的同源内源性核苷酸序列的差异。在另一方面，其亦可基于核苷酸序列的有意修饰，例如至少一或多个核苷酸的取代、插入或缺失。缺失、插入及取代突变体可通过“定点诱变”和/或“基于PCR的诱变技术”来制得。相应方法(例如)已由Lott speich及Zorbas描述(1998；第36.1章及其他参考文献)。序列同一性可使用所谓的标准比对演算法，诸如“BLAST”“(Altschul，S.F.Gish，ff.，Mi ller，ff.，Myers，E.ff.&Lipman，D.J.(1990)“Basiclocal al ignment search tool J.Mo1.Biol.215：403-410；Madden，T.L.，Tatusov，R.L.&Zhang，J.(1996)“Appl ications of network BLASTserver，，Meth.Enzymol.266：131-141；Zhang，J.＆Madden，T.L.(1997)“PowerBLAST：A new network BLASTappl icationfor interactive or automatedsequence analys is and annotation，，Genome Res.7：649-656)，来与参考序列(在此情况下为序列ID NO.1)相符合。序列在其连续性相对应时达成相符且可使用标准比对演算法来鉴别。

“染色体整合”意谓将任意核酸序列整合至细胞的基因组(亦即染色体)中，此整合为视情况以任何所要数目、位置及取向整合至一或多个染色体中。此外，术语“染色体整合”亦包括将任何所要核酸序列整合至合成染色体、人造染色体或微型染色体中。

目的基因：

本发明的表达载体中所包含的目的基因包含编码目的产物的任何长度的核苷酸序列。基因产物或“目的产物”通常为蛋白质、多肽、肽或其片段或衍生物。然而，其亦可为RNA或反义RNA。目的基因可以其全长形式、缩短形式、融合基因形式或经标记基因形式存在。其可为基因组DNA，或优选为cDNA，或相应片段或融合体。目的基因可为天然基因序列，或其可经突变或经另外修饰。该等修饰包括密码子最优化(以适应特定宿主细胞)及人源化。目的基因可(例如)编码分泌型、细胞质、核定位、膜结合或细胞表面结合的多肽。

具有生物药重要性的蛋白质/多肽例如包括(但不限于)抗体、酶、细胞因子、淋巴因子、粘附分子、受体及其衍生物或片段。通常，可使用充当促效剂或拮抗剂和/或具有治疗性或诊断性应用的所有多肽。其他目的蛋白质例如为(但不限于)在所谓的“细胞工程”范围内用于改变宿主细胞特性的蛋白质/多肽，诸如抗细胞凋亡蛋白、伴侣蛋白、代谢酶、糖基化酶及其衍生物或片段。

术语“多肽”是用于氨基酸序列或蛋白质，指具有任何长度的氨基酸聚合物。此术语亦包括通过诸如糖基化、磷酸化、乙酰化或蛋白加工的反应经翻译后修饰的蛋白质。多肽的结构可在保留其生物活性的同时(例如)通过取代、缺失或插入氨基酸及与其他蛋白质融合来修饰。此外，多肽可多聚化且形成同聚体及异聚体。

治疗性蛋白质的实例为胰岛素、胰岛素样生长因子、人类生长激素(hGH)及其他生长因子、受体、组织血纤维蛋白溶解酶原活化因子(tPA)、红细胞生成素(EPO)、细胞因子(例如白细胞介素(IL)，诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18)、干扰素(IFN)-α、干扰素-β、干扰素-Y、干扰素-Ω或干扰素-τ、肿瘤坏死因子(TNF)(诸如TNF-a，TNF-β或TNF-Y)、TRAIL、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1及VEGF。其他实例为单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体及单链抗体及其片段，诸如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc及Fe’片段、免疫球蛋白轻链(L)及重链(H)及其恒定区、可变区或高变区以及Fv及Fd片段(Chamov等人，1999)。抗体可为人类或非人类起源。人源化抗体及嵌合抗体亦可。

在另一实施例中，本发明的表达载体含有与目的基因在功能上连接的编码荧光蛋白的基因。优选地，两种基因在单一异源启动子控制下转录，使得目的蛋白质/产物与荧光蛋白由双顺反子mRNA编码。此使得可藉助于荧光蛋白的表达率鉴别大量产生目的蛋白质/产物的细胞。或者，编码荧光蛋白的基因的转录可在其自身启动子的控制下进行。

荧光蛋白可为(例如)绿色、蓝绿色、蓝色、黄色或其他颜色的荧光蛋白。一特定实例为自水母(Aequorea victoria)或海肾(Renilla reniformis)获得的绿色突光蛋白(GFP)及由其所形成的突变体；例如参见Bennet等人，1998；Chalfie等人，1994；WO01/04306及其中所引用的文献。

荧光蛋白所发射的荧光使得可(例如)通过流式细胞计数法使用荧光活化细胞分选仪(FACS)或通过荧光显微法检测蛋白质。

其他调控元件：

表达载体含有至少一种异源启动子，其使得目的基因可表达且优选亦使得荧光蛋白可表达。

术语“启动子”表示允许且控制与其在功能上联接的基团或序列的转录的聚核苷酸序列。启动子含有结合RNA聚合酶的识别序列及转录起始位点。为在特定细胞类型或宿主细胞中表达所要序列，必须选择适当的功能性启动子。本领域技术人员熟悉各种来源的多种启动子，包括组成性启动子、诱导性启动子及可抑制性启动子。其保藏于诸如GenBank的资料池中，且可以单独元件或克隆于聚核苷酸序列内的元件的形式自商业或个人来源获得。在诱导性启动子中，启动子的活性可回应于信号而减弱或增强。诱导性启动子的一实例为四环素(HBV333t)启动子。此启动子含有可由四环素调控的反式活化蛋白(tTA)诱导的四环素操纵子序列(HBV333tO)。在四环素存在下，tTA与HBV333tO的结合受到抑制。其他诱导性启动子的实例为jun、fos、金属硫蛋白及热休克启动子(亦参见Sambrook等人，1989；Gossen等人，1994)。

尤其适用于在真核细胞中促成高表达的启动子包括(例如)仓鼠的遍在蛋白/S27a启动子(WO97/15664)、SV40早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-1启动子、劳斯(Rous)肉瘤病毒的长末端重复区、人类巨细胞病毒的早期启动子。其他异源哺乳动物启动子的实例为肌动蛋白、免疫球蛋白或热体克启动子。

相应异源启动子可与其他调控序列在功能上联接，用以增强/调控表达序列盒中的转录活性。

举例而言，启动子可与增强子序列在功能上连接，用以增强转录活性。对此，可使用一或多个增强子和/或增强子序列的数个拷贝，例如CMV或SV40增强子。因此，在另一实施例中，本发明的表达载体含有一或多个增强子/增强子序列，优选为CMV或SV40增强子。

术语增强子表示以顺式方位作用于启动子活性且从而刺激与此启动子在功能上联接的基因的转录的聚核苷酸序列。与启动子不同，增强子的作用不依赖于位置及取向，且因此其可定位于转录单元之前或之后、内含子内或甚至编码区内。增强子可定位于紧邻转录单元，也可远离启动子。其亦可与启动子具有实体性及功能性重叠。本领域技术人员了解来自各种来源的多种增强子(及保藏于诸如GenBank的资料库中的增强子，例如SV40增强子、CMV增强子、多瘤病毒增强子、腺病毒增强子)，该等增强子可以独立元件或克隆于聚核苷酸序列内的元件的形式获得(例如保藏于ATCC或来自商业及个人来源)。多种启动子序列亦含有增强子序列，诸如常用的CMV启动子。人类CMV增强子是迄今为止所鉴别的最强增强子之一。诱导性增强子的一实例为金属硫蛋白增强子，其可由糖皮质激素或重金属刺激。

其他可能的修饰例如为引入多个Sp1结合位点。亦可使启动子序列与控制/调控转录活性的调控序列组合。因此，可使得启动子具有可抑制性/诱导性。此可(例如)通过与为上调或下调转录因子的结合位点的序列连接来完成。举例而言，上述转录因子Sp1对转录活性具有正面作用。另一实例为活化蛋白AP1的结合位点，活化蛋白AP1可对转录起到正面与负面作用。AP1的活性可由各种因子(诸如生长因子、细胞因子及血清)控制(Faisst等人，1992及其中所引用的参考文献)。亦可如下增加转录效率：通过使一处、两处、三处或三处以上碱基突变(取代、插入或缺失)来改变启动子序列，且接着以报导基因测定判定此突变是否增强启动子活性。

额外调控元件主要包括异源启动子、增强子、终止信号及多聚腺苷酸化信号及其他表达控制元件。用于各种细胞类型的诱导性及组成性调控序列均为已知的。

“转录调控元件”通常包含待表达基因序列上游的启动子、转录起始位点及终止位点及多聚腺苷酸化信号。

术语“转录起始位点”是指构筑体中与并入初级转录物(亦即mRNA前体)中的第一核酸相对应的核酸。转录起始位点可与启动子序列重叠。

术语“转录终止位点”是指通常位于目的基因或待转录基因部分的3’端且使经由RNA聚合酶的转录终止的核苷酸序列。

“多聚腺苷酸化信号”为在真核mRNA3’端的特定位点处引起断裂、且在断裂的3’端转录后并入约100-200个腺嘌呤核苷酸的序列(polyA尾)的信号序列。多聚腺苷酸化信号包含断裂位点上游约10-30个核苷酸处的序列AATAAA及位于下游的序列。已知多种多聚腺苷酸化元件，诸如tk polyA、SV40晚期及早期polyA或BGH polyA(例如US5，122，458中所述)。

“翻译调控元件”包含用于各待表达多肽的翻译起始位点(AUG)、终止密码子及PolyA信号。对达成最佳表达合理的是移除、添加或改变待表达核酸序列的5’-和/或3’-未翻译区，以消除任何潜在不适当的额外翻译起始密码子或其他可能在转录量或表达量上影响表达的序列。或者，为促进表达，可在起始密码子的上游紧邻插入核糖体共有结合位点。为产生分泌型多肽，目的基因通常含有信号序列，其编码将合成多肽转运至且穿过ER膜的信号前体肽。信号序列通常但不总是位于分泌型蛋白质的氨基末端，且在蛋白质穿过ER膜后由信号肽酶裂解。基因序列通常但非必定含有其自身信号序列。若不存在天然信号序列，则可以已知方式引入异源信号序列。多种此类信号序列已为本领域技术人员所知且保藏于诸如GenBank及EMBL的序列资料库中。

另一种调控元件为内部核糖体进入位点(IRES)。IRES元件包含独立于5’-端甲基鸟苷帽(帽结构)及上游基因而在功能上活化翻译起始、且在动物细胞中使得可自单一转录物翻译两个顺反子(开放阅读框架)的序列。IRES元件提供独立的核糖体进入位点用于翻译紧邻位于下游的开放阅读框架。与可为多顺反子性的细菌mRNA(亦即，其可编码由mRNA相继翻译的多种不同多肽或产物)相比，大部分动物细胞的mRNA为单顺反子的且仅编码一种蛋白质或产物。在真核细胞中的多顺反子转录物的情况下，翻译可自上游最近的翻译起始位点起始且由第一个终止密码子终止，之后转录物可自核糖体中释放。因此，在翻译期间仅产生由mRNA编码的第一个多肽或产物。相比而言，具有与转录物中的第二或后续开放阅读框架在功能上连接的IRES元件的`多顺反子转录物允许随后翻译位于IRES元件下游的开放阅读框架，从而在真核细胞中产生两种或两种以上由相同转录物编码的多肽或产物。

IRES元件可具有多种长度及多种来源且可(例如)源自脑心肌炎病毒(EMCV)或其他小核糖核酸病毒。多种IRES序列及其在载体构筑中的用途已描述于文献中，例如参见Pelletier等人，1988；Jang等人，1989；Davies等人，1992；Adam等人，1991；Morgan等人，1992；Sugimoto等人，1994；Ramesh等人，1996；Mosser等人，1997。

使位于下游的基因序列与IRES元件的3’端在功能上连接，亦即将间距选择成使得基因的表达不受影响或仅受微小影响或对于预定目的而言具有足够的表达。IRES元件与位于其下游的基因的起始密码子之间的可允许足够表达的最佳距离可通过简单实验通过改变间距且使用报导基因检定测定随间距变化的表达率来判定。

本发明的表达载体的制备

本发明的表达载体理论上可通过此项技术中已知的习知方法，例如Sambrook等人(1989)所述的方法来制备。Sambrook亦描述载体的功能性组份，例如适当的启动子(除仓鼠遍在蛋白/S27a启动子外)、增强子、终止信号及多聚腺苷酸化信号、抗生素耐性基因、可选择标记、复制起点及剪接信号。可使用习知克隆载体制备该表达载体，例如质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒或病毒载体(诸如杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒及单纯疱疹型病毒)以及合成或人造染色体/微型染色体。真核表达载体通常亦含有原核序列，诸如使得载体可在细菌中复制及选择的复制起点及抗生素耐性基因。已知多种含有用于引入聚核苷酸序列的多克隆位点的真核表达载体，且有些载体可购自各公司，诸如Stratagene，La Jolla，CA，USA；Invitrogen，Carlsbad，CA，USA；Promega，Madison，WI，USA或BDBiosciences ClonHBV333ch，Palo Alto，CA，USA。

举例而言，可以本领域技术人员熟悉的方式将异源启动子、目的基因、可选择标记及任选编码荧光蛋白的基因、额外调控元件(诸如内部核糖体进入位点(IRES)、增强子、多聚腺苷酸化信号及诸如HBV333元件的其他顺式活性元件)引入表达载体。本发明的表达载体至少含有异源启动子、目的基因及HBV333元件。优选地，表达载体亦含有编码荧光蛋白的基因。根据本发明尤其优选使用本发明所述双启动子结构单元作为异源启动子。异源启动子、目的基因及其他调控元件元件在功能上连接在一起或在功能上连接的表达载体尤其优选。

在本说明书的范围内，术语“功能性连接”或“在功能上连接”是指两个或两个以上核酸序列或部分序列，其定位成使其可执行各自预定功能。举例而言，启动子/增强子、启动子/HBV333元件/启动子或启动子/HBV333元件与编码基因序列若能够以顺式位置控制或调节连接基因序列的转录，则其在功能上连接。通常(但非必定)，功能上连接的DNA序列靠近在一起，且若两个编码基因序列连接或在分泌信号序列的情况下处于相同阅读框架中。尽管功能上连接的启动子通常位于编码基因序列的上游，但其并非必须靠近该序列。增强子或HBV333元件同样不必靠近，限制条件为其应有助于基因序列的转录或表达。为此目的，增强子或HBV333元件可位于基因序列的上游与下游，任选与该序列相隔一定距离。多聚腺苷酸化位点当其以一定方式位于基因序列的3’端使得转录经由编码序列前进至多聚腺苷酸化信号，则其与基因序列在功能上连接。可根据习知重组方法实现连接，例如通过PCR技术、通过适当限制性切割位点处的接合或通过剪接。若无适当的限制性切割位点可用，则可以本身已知的方式使用合成性寡核苷酸连接子或衔接子。

表达载体内基因的表达基本上可自一或多个转录单元起始进行。术语转录单元定义为含有一或多个待转录基因的区域。转录单元内的基因以一定方式在功能上彼此连接，使得该单元内的所有基因均处于相同启动子、启动子/增强子或启动子/HBV333元件/启动子的转录控制下。由于此基因转录连接，可由转录单元转录一种以上蛋白质或产物，且从而使其得以表达。各转录单元含有其中所含基因序列的转录及翻译所必需的调控元件。各转录单元可含有相同或不同的调控元件。IRES元件或内含子可用于转录单元内基因的功能性连接。

表达载体可含有用于表达目的基因、可选择标记及可选择的编码荧光蛋白的基因的单一转录单元。或者，此等基因亦可排列于两个或两个以上转录单元中。基因在转录单元内可具有各种组合。在本发明的另一实施例中，可将一个以上由一个、两个或两个以上转录单元组成的表达载体通过共转染或以任何所要顺序相继转染插入宿主细胞中。可选择各载体上调控元件与基因的任何组合，只要能确保转录单元的足够表达。若需要，可将其他调控元件(诸如HBV333元件)及基因(例如，其他目的基因或可选择标记)安置于表达载体上。

根据本发明，彼等表达载体亦优选，其含有一或多个启动子/HBV333元件/启动子且位于目的基因5端。

宿主细胞：

对于用本发明的表达载体转染而言，使用真核宿主细胞，优选为哺乳动物细胞且更尤其为啮齿动物细胞，诸如小鼠、大鼠及仓鼠细胞系。用本发明的表达载体成功转染相应细胞可产生经转化经基因修饰的重组或转基因细胞，其亦为本发明的目标。

用于本发明的目的的优选宿主细胞为仓鼠细胞，诸如BHK21、BHKTK_、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX BI及CHO-DG44细胞或此等细胞系的衍生物/子代。尤其优选为CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-KI及BHK21细胞，尤其是CHO-DG44及CHO-DUKX细胞。小鼠骨髓瘤细胞，优选NSO及Sp2/0细胞及此等细胞系的衍生物/子代亦适用。

可根据本发明使用的仓鼠及小鼠细胞的实例提供于下表I中。然而，此等细胞的衍生物及子代、其他哺乳动物细胞(包括但不限于人类、小鼠、大鼠、猴、啮齿动物的细胞系)或真核细胞(包括但不限于酵母、昆虫、鸟类及植物细胞)亦可用作产生生物药蛋白质的宿主细胞。

用聚核苷酸或本发明的表达载体之—转染真核宿主细胞可通过习知方法来进行(Sambrook等人，1989；Ausubel等人，1994)。适当的转染方法包括(例如)脂质粒介导的转染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、聚阳离子(例如DEAE葡聚糖)介导的转染、原生质体融合、显微注射及病毒感染。根据本发明，优选进行稳定转染，其中构筑体整合至宿主细胞的基因组中或人造染色体/微型染色体中，或以稳定方式游离地包含于宿主细胞中。可获得最佳转染频率及所述宿主细胞内异源基因的表达的转染方法优选。根据定义，插入宿主细胞内的每个序列或每个基因均称为相对于宿主细胞的“异源序列”或“异源基因”。即使待引入的序列或待引入的基因与宿主细胞的内源序列或内源基因一致，此定义亦适用。

根据本发明，优选为已经本文中所述的本发明的表达载体之一转染的重组哺乳动物细胞，优选啮齿动物细胞，最佳仓鼠细胞，诸如CHO或BHK细胞。

本发明，优选在无血清条件下，任选在不含动物蛋白质/肽的培养基中建立、调适及培养宿主细胞。市售培养基的实例包括Ham’s F12(Sigma，Deisenhofen，DE)、RPMl-1640(Sigma)、DulbeccoJ s经改良Eagle’s培养基(DMEM；Sigma)、最低必需培养基(MEM；Sigma)、IscoveJ s经改良Dulbecco，s培养基(IMDM；Sigma)、CD-CHO(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)、CHO-S-SFMII(Invitrogen)、无血清CHO-培养基(Sigma)及无蛋白质CHO-培养基(Sigma)。此等培养基各自可视情况补充有多种化合物，例如激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、运铁蛋白、表皮生长因子、胰岛素样生长因子)、盐(例如氯化钠、钙盐、镁盐、磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷(例如腺苷、胸苷)、谷氨酰胺、葡萄糖或其他等效营养物、抗生素和/或痕量元素。尽管根据本发明无血清的培养基优选，但亦可使用已混有适量血清的培养基培养宿主细胞。为选择表达一或多种可选择标记基因的经基因修饰的细胞，可将一或多种选择剂添加至培养基中。

术语“选择剂”是指一种影响缺乏所述可选择标记基因的宿主细胞的生长或存活的物质。在本发明的范围内，优选使用遗传霉素(geneticin)(G418)作为培养基添加剂用于选择带有野生型或优选经修饰的新霉素磷酸转移酶基因的异源宿主细胞。培养基中的所用G418浓度优选介于100与800μg/mL之间，最佳为200至400微克G418/毫升培养基。若将用多种表达载体转染宿主细胞，例如若将数种目的基因单独引入宿主细胞中，则其通常具有不同的可选择标记基因。

可选择标记基因是一种使得可通过向培养基中添加相应选择剂来特定选择含有此基因的细胞的基因。举例而言，可使用抗生素耐性基因作为阳性可选择标记。仅已经此基因转化的细胞能够在相应抗生素存在下生长且从而得以选择。另一方面，未经转化的细胞不能在此等选择条件下生长或存活。存在阳性、阴性及双功能性可选择标记。阳性可选择标记通过赋予选择剂耐性或通过弥补宿主细胞中的新陈代谢或分解代谢缺陷而允许选择且由此富集经转化的细胞。相比之下，接收阴性可选择标记的基因的细胞可经由阴性可选择标记被选择性清除。其实例为单纯疱疹型病毒的胸苷激酶基因，同时添加阿昔洛韦(acyclovir)或更昔洛韦(gancyclovir)时该基因在细胞中表达可导致清除该等细胞。本发明中所使用的可选择标记(包括可扩增的可选择标记)包括经基因修饰的突变体及变异体、片段、功能等效物、衍生物、同源物及与其他蛋白质或肽的融合体，其限制条件为可选择标记保留其选择特性。该等衍生物在被认为具有选择性的区域或结构域的氨基酸序列中展现相当大的同源性。文献中描述了大量的可选择标记基因，包括双功能(阳性/阴性)标记(例如参见WO92/08796及WO94/28143)。通常用于真核细胞中的可选择标记的实例包括氨基糖苷磷酸转移酶(A P H)、潮霉素磷酸转移酶(HYG)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶、天冬酰胺合成酶的基因以赋予新霉素(G418)、嘌呤霉素(puromycin)、组氨醇D、博莱霉素(bleomycin)、腐草霉素(phleomycin)及争光霉素(zeocin)耐性的基因。

术语“经修饰的新霉素磷酸转移酶”(NPT)涵盖WO2004/050884中所述的所有突变体，尤其是突变体D227G(Asp227Gly)，其特征为氨基酸位置227处的天冬氨酸(Asp，D)被甘氨酸(Gly，G)取代；且尤其优选为突变体F240I(Phe240Ile)，其特征为氨基酸位置240处的苯丙氨酸(Phe，F)被异亮氨酸(lie，I)取代。

因此，本发明包括一种制备及选择重组哺乳动物细胞的方法，其包含以下步骤：

(i)用编码至少一种目的蛋白质/产物及新霉素磷酸转移酶(优选经修饰)的基因转染宿主细胞，其中为增强转录或表达，使至少目的基因与至少一个HBV333元件在功能上连接；(ii)在能够使不同基因得到表达的条件下培养该等细胞；及(lii)通过在诸如G418的选择剂存在下培养该等细胞来选择此等经共整合的基因。优选地，在无血清的培养基中培养经转染的细胞。优选地，G418的浓度为至少200μg/mL。然而，浓度亦可为至少400μg/mL。

可扩增的可选择标记基因：

此外，本发明的细胞亦可视情况经历一或多个基因扩增步骤，其中将其在可使得可扩增的可选择标记基因扩增的选择剂存在下培养。

先决条件为宿主细胞另外经编码可扩增的可选择标记的基因转染。可使编码可扩增的可选择标记的基因存在于本发明的表达载体之一上或藉助于另一载体引入宿主细胞中。

可扩增的可选择标记基因通常编码真核细胞在特定培养条件下生长所需的酶。举例而言，可扩增的可选择标记基因可编码二氢叶酸还原酶(DHFR)。在此情况下，若在选择剂甲氨蝶呤(MTX)存在下培养用此基因转染的宿主细胞，则此基因可扩增。

哺乳动物细胞(优选小鼠骨髓瘤及仓鼠细胞)为对于使用DHFR作为可扩增的可选择标记而言的优选宿主细胞。细胞系CHO-DUKX(ATCCCRL-9096)及CHO-DG44(Urlaub等人，1983)尤其优选，因为其因突变而本身不具有DHFR活性。为能够亦在具有自身内源DHFR活性的其他细胞类型中利用DHFR诱导的扩增，可在转染过程中使用编码对甲氨蝶呤具有低敏感性的蛋白质的突变DHFR基因(Simonson等人，1983；Wigler等人，1980；Haber等人，1982)。

当使用DHFR阴性基本细胞(诸如CHO-DG44或CHO-DUKX)时，DHFR标记尤其适用于选择及后续扩增，因为此等细胞不表达内源DHFR且从而不能生长于无嘌呤的培养基中。因此，在此可使用DHFR基因作为主导选择标记且在无次黄嘌呤/胸苷的培养基中选择所转化的细胞。

本发明包括一种制备及选择重组哺乳动物细胞的方法，其包含以下步骤：

(i)用编码至少一种目的蛋白质/产物及可扩增的可选择标记DHFR的基因转染宿主细胞，其中为增强转录或表达，使至少目的基因与至少一个HBV333元件在功能上连接；(ii)在能够使不同基因得到表达的条件下培养该等细胞；及(iii)通过在使得至少可扩增的可选择标记基因可扩增的选择剂(诸如甲氨蝶呤)存在下培养该等细胞来使此等经共整合的基因扩增。优选地，在无血清存在下在无次黄嘌呤/胸苷的培养基中且添加递增浓度的MTX来培养经转染的细胞。优选地，第一扩增步骤中MTX的浓度为至少100nM。然而，MTX的浓度亦可为至少250nM且可逐步增至1μM。在个别情况下，亦可使用超过1μM的浓度。

基因表达及高产宿主细胞的选择：

术语基因表达是指异源基因序列在宿主细胞中的转录和/或翻译。表达率通常可基于存在于宿主细胞中的相应mRNA的量或基于由目的基因编码所产生的基因产物的量来测定。所选核苷酸序列经转录而产生的mRNA的量可(例如)通过Northern印迹杂交、核糖核酸酶-RNA-保护、细胞RNA的原位杂交或通过PCR方法(例如定量PCR)来测定(Sambrook等人，198；Ausubel等人，1994)。由所选核苷酸序列编码的蛋白质亦可通过多种方法来测定，诸如ELISA、蛋白质A HPLC、WesHBV333rn印迹、放射免疫测定、免疫沉淀、检测蛋白质的生物活性、先将蛋白质免疫染色再执行FACS分析或荧光显微法、通过FACS分析或荧光显微法直接检测突光蛋白(Sambrook等人，1989；Ausubel等人，1994)。此等方法可用以(例如)研究本发明的SEQ ID NO.1的HBV333元件或其任何部分、片段或区域或其衍生物或组合是否可使得目的基因的转录或表达增加。

“表达、转录或产率增强”意谓与对照相比，引入宿主细胞内的异源序列(例如编码治疗性蛋白质的基因)的表达或合成增强。若通过本文中所述的本发明的方法培养本发明的细胞且若此细胞比产率升高至1.3倍或1.5倍或优选具有两倍的比产率，则存在表达、转录或产率的增强。若本发明的细胞具有至少三倍的比产率，则亦存在表达、转录或产率的增强。若本发明的细胞具有至少四倍的比产率，则存在表达、转录或产率的显著增强。若本发明的细胞具有至少五倍的比产率，则存在表达、转录或产率的显著增强。若本发明的细胞具有至少六倍的比产率，则存在表达、转录或产率的显著增强。若本发明的细胞具有至少七倍的比产率，则存在表达、转录或产率的显著增强。

可通过使用本发明的的表达载体之一且使用本发明的方法之一达成增强的表达、转录或产率。

可将相应方法与经FACS辅助的对重组宿主细胞的选择相组合，该等宿主细胞含有作为额外可选择标记的一或多种突光蛋白(例如GFP)或细胞表面标记。其他用于获得表达增加的方法(其中也可能使用不同方法的组合)例如基于使用操控染色体结构的顺式活性元件(例如LCR、UCOE、EASE、隔离子、S/MAR、STAR元件)，基于使用(人造)转录因子，用天然或合成药剂处理细胞以上调内源或异源基因表达，改良mRNA或蛋白质的稳定性(半衰期)，改良mRNA翻译的起始，通过使用游离型质粒增加基因剂量(基于使用病毒序列作为复制起点，例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、EBV或BPV)，使用扩增促进序列(Hemann等人，1994)或基于DNA多联体的活体外扩增系统(Monaco等人，1996)。

因此，在另一实施例中，本发明亦是关于用于获得及选择表达至少一种目的异源基因的重组哺乳动物细胞的方法，且该方法的特征在于：(i)将重组哺乳动物细胞用本发明的表达载体及可扩增的可选择标记基因转染；(ii)将该等哺乳动物细胞在使得目的基因、经修饰的新霉素磷酸转移酶基因及编码荧光蛋白的基因可表达的条件下培养；(iii)在至少一种选择性作用于哺乳动物细胞的生长且使表达新霉素磷酸转移酶基因的那些细胞优先生长的选择剂存在下培养该等哺乳动物细胞；(iv)通过流式细胞分析分选荧光蛋白呈高表达的哺乳动物细胞；(V)将分选出的细胞在可扩增的可选择标记基因可表达的条件下培养′及(vi)将使可扩增的可选择标记基因扩增的选择剂添加至培养基中。

根据本发明，将制造性细胞复制且用以制备目的编码基因产物的方法亦优选。为此，优选将所选高产细胞在使得目的基因可表达的条件下培养于无血清的培养基中且优选培养于悬浮液培养物中。目的蛋白质/产物优选是以分泌型基因产物的形式自细胞培养基获得。然而，若蛋白质是在无分泌信号的情况下表达，则亦可自细胞溶胞物中分离基因产物。

为了有效地分离纯化或分泌目标蛋白，常常还可利用便于分离纯化的标签蛋白或标签多肽(Tag。)常用的有谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase，GST)、六聚组氨酸肽(His.Tag)、蛋白质A(protein A)和纤维素结合位点(cellulose binding domain)等。通过特殊性蛋白或多肽与目标蛋白构成融合蛋白的形式，表达后利用所述的标签蛋白或标签多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。如His.Tag与Ni-Chelating Sepharose柱特异性结合。所述的标签蛋白或标签多肽可以在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列，如可用凝血酶、肠激酶和Xa因子等，以获得目标蛋白。

通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的所述融合蛋白较为有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、疏水电荷作用层析和凝集素层析。在一些实施方案中，可使用高效液相层析(HPLC)进行纯化。

在一些实施方案中，可使用上述的一种或多种层析方法纯化本发明的所述融合蛋白。在其它实施方案中，可使用下述的一种或多种层析柱纯化本发明的所述融合蛋白，所述层析柱有：Q Sepharose FF柱、SP Sepharose FF柱、QSepharose High Performance柱、Blue Sepharose FF柱、Blue柱、PhenylSepharose FF柱、DEAE Sepharose FF、Ni-Chelating Sepharose FF柱或Methyl柱等。

另外，可使用国际公开号WO00/44772(全文列入本文作为参考)中描述的方法纯化本发明的融合蛋白。本领域技术人员可以容易地改动其中所述的方法以用于纯化本发明的融合体蛋白。可以从包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞的原核或真核宿主经重组技术产生的产物中回收本发明的融合蛋白。

此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。亦参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献.以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、不同启动子对GFP表达的影响

应用本发明的启动子单元和传统CMV启动子分别构建报告基因质粒，从而评价该启动子单元启动蛋白表达的效率。该报告基因质粒分别命名为：Pcmv，Pcmv-Enhl，Pcmv-HBV333，Pcmv-HBV333-Pcmv质粒图谱见图2，图3，报告基因为Firefly荧光素酶基因。分别将质粒转染CHO细胞，检测荧光素酶活性数值。具体步骤如下：

(1)将4μl脂质体Lipofactamine2000加入150μl Opti-MEM培养基中。

(2)将2.5μg质粒加入150μl Opti-MEM培养基中。

(3)将上述轻轻溶液混合，室温放置10分钟。

(4)将上述混合液加入到6孔细胞培养板中(CHO细胞50％覆盖率)。

(5)继续培养48小时，进行荧光素酶活性检测。

结果见图4，结果显示Pcmv-HBV333转染的CHO细胞与Pcmv转染的细胞相比较，其荧光素酶活性增强70％，而Pcmv-Enhl转染细胞荧光素酶活性未见显著提高。图5显示，Pcmv-HBV333-Pcmv转染的CHO细胞与Pcmv-HBV333转染的细胞相比较，其荧光素酶活性提高1倍以上。表明本发明的Pcmv-HBV333-Pcmv双启动子结构单元比传统CMV、Pcmv-Enhl启动子有更强的转录效率。

实施例2、不同启动子对Avastin抗体表达的影响

将该发明的启动子结构单元构建表达载体，在其下游插入商业化单克隆抗体药物Avastin基因序列，见图6。同时，将传统单CMV启动子构建表达载体，在其下游插入Avastin基因序列，见图7。把含有Avastin轻链、重链的两个质粒电转染CHO细胞，具体过程如下：

(1)准备2×10⁷指数生长期的CHO细胞，加入到两个电击杯中，每个电极杯含有10⁷细胞，体积为0.7ml.

(2)加入100μl含40μg质粒DNA(轻、重链质粒各20μg)至电击杯中，电压300V，电容900μF，电阻设置为无穷大，在该条件下进行电转染。

(3)将转染后的细胞接至20ml CD CHO培养基中，继续在二氧化碳培养箱中培养，转速125rpm，温度37℃。

(4)三天后，收集细胞上清，进行Western-Blot检测。

Western-Blot检测结果见图8，图中1：商业化单克隆抗体药物Avastin标准品；2、3：Pcmv-Avastin转染的细胞上清样品；4：未转染质粒的细胞上清样品；5、6：Pcmv-HBV333-Pcmv-Avastin转染的细胞上清样品；

结果表明：Pcmv-HBV333-Pcmv-Avastin转染的CHO细胞上清比Pcmv-Avastin转染的细胞上清中，Avastin抗体表达量更高，表明本发明的启动子单元比传统CMV启动子有更强的转录效率，从而外源蛋白表达量更高。

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

Claims (10)

1.一种新型双启动子结构单元，其包含2个核酸序列如SEQ ID NO.2所示的CMV启动子和一段核酸序列如SEQ ID NO.1所示的序列，该双启动子结构单元在经染色体整合后使得表达系统中目的基因的转录或表达增加。

2.如权利要求1所述的新型双启动子结构单元，其特征在于所述新型双启动子结构单元为SEQ ID NO.3、或与SEQ ID NO.3互补的核苷酸序列。

3.一种真核表达载体，其特征在于其包含如权利要求1或2所述的新型双启动子结构单元。

4.一种真核宿主细胞，其特征在于其包含如权利要求3所述的真核表达载体。

5.如权利要求4所述的真核宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

6.如权利要求5所述的真核宿主细胞，其特征在于所述哺乳动物细胞为CHO、NSO、Sp2/0-Ag14、BHK21、BHK TK′HaK、2254-62.2、V79、B14AF28-G3、或CHL细胞。

7.如权利要求6所述的真核宿主细胞，其特征在于所述CHO细胞为CHO-K1、CHO-DUKX，CHO-DUKX B1、CHO-DG44、或CHO Pro-5细胞。

8.一种形成经稳定转染的高产真核宿主细胞系的方法，其包括下列步骤：

(a)将如权利要求1或2所述的新型双启动子结构单元整合至包含目的基因的真核表达载体中；(b)用此表达载体转染真核宿主细胞；(c)选择经转染的高产宿主细胞。

9.一种制备重组蛋白药物的方法，包含下列步骤：(a)将如权利要求1或2所述的新型双启动子结构单元整合至包含目的基因的真核表达载体中；(b)用此表达载体转染真核宿主细胞；(c)选择经转染的高产宿主细胞；(d)在使得该一个或多个目的基因表达的条件下培养该所获得的经转染的高产宿主细胞；(e)收集并纯化目的蛋白质。

10.权利要求1或2所述的新型双启动子结构单元在制备药物或药物组合物中的用途。