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ECTOR DE EXPRESION, PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE PRODUCTOS GENICOS HETEROLOGOS Y PROCEDIMIENTO DE SELECCION PARA CELULAS RECOMBINANTES DE ALTA PRODUCCION
.Campo de la invención La invención se refiere a un procedimiento de selección para células recombinantes de alta producción, a un procedimiento para la preparación de productos génicos heterólogos, así como a vectores de expresión y a células huésped transfectadas con ellos, que se pueden utilizar en estos procedimientos . Antecedentes de la invención Las células de mamíferos son las células huésped preferidas para la producción de proteínas biofarmacéuticas complejas, dado que las modificaciones llevadas a cabo después de la traducción son compatibles con los seres humanos, tanto desde un punto de vista funcional como también desde un punto de vista farmacocinético . Tipos de células relevantes desde un punto de vista comercial son hibridomas, mielomas, células de CHO (Chínese Hámster Ovary - ovario de hámster chino) y células BHK (Baby Hámster Kidney - riñon de hámster infantil) . El cultivo de las células huésped se efectúa crecientemente bajo condiciones de producción exentas de suero y de proteínas . Motivos para ello son la reducción de costes ligada a ello, la menor interferencia en la purificación de la REF: 163450 2
proteína recombinante, así como la reducción del potencial para la introducción de agentes patógenos (por ejemplo priones, virus) . El empleo de células de CHO como células huésped encuentra en este caso una difusión cada vez mayor, dado que estas células se pueden adaptar al desarrollo en suspensión en medio exento de suero y de proteínas y, además, son consideradas y aceptadas por las Autoridades reguladoras como células de producción seguras . Para la generación de una línea de células de mamífero estable, que expresa un gen heterologo de interés, el gen heterologo se incorpora mediante transíección en la línea de células deseada, por norma general junto con un gen marcador seleccionable tal como, por ejemplo, neomicina-fosfotransfe-rasa. El gen heterologo y el gen marcador seleccionable pueden ser expresados en este caso conjuntamente por un único vector o por vectores en cada caso separados que son co-transfectados . De dos a tres días después de la transfección, las células se transfieren a un medio que contiene un agente de selección, por ejemplo G418 en el caso de utilizar el gen de neomicina-fosfotransferasa, y se cultivan durante algunas semanas bajo estas condiciones selectivas. Las células resistentes de alto desarrollo pueden entonces aislarse e investigarse en relación con la expresión del producto génico deseado. Condicionado por la integración arbitraria y no dirigida en el genoma de la célula huésped se obtiene una 3
población de células que presentan tasas de expresión del gen heterólogo totalmente diferentes. Entre ellas, también pueden estar presentes células no expresantes, en las que ciertamente se expresa el marcador de selección, pero no el gen de interés . Para la identificación de clones celulares que presentan una muy elevada expresión del gen heterólogo de interés, se ha" de examinar y ensayar por lo tanto una pluralidad de clones, lo que resulta en un gasto de tiempo, trabajo y costos elevado. La amplificación génica es un fenómeno muy difundido en cultivos de células animales que se aprovecha para la producción de proteínas biofarmacéuticas recombinantes . Mediante la amplificación génica se mejora drásticamente la productividad relativamente baja en un principio, de muchas líneas de células de mamíferos . Una técnica de amplificación muy difundida la representa el sistema de amplificación génica basado en dihidrofolato-reductasa (DHFR) que encuentra aplicación muy frecuentemente en células de ovario de hámster chino (CHO) deficientes en DHFR. En este caso, las células de CHO deficientes en DHFR, por ejemplo CHO-DUKX (ATCC CRL-9096) o CH0-DG44 (Urlaub et al., 1983) se transfectan con un sistema vectorial adecuado que codifica DHFR y la proteína de interés. Después de ello, los transfectantes se seleccionan en un medio sin glicina, hipoxantina y timidina. La amplificación y, por consiguiente, el establecimiento de líneas celulares de alta 4
producción se alcanza a través de la adición creciente de metotrexato (MTX) , un inhibidor de la dihidrofolato-reductasa (Kaufman et al., 1982; documento US 4.656.134). La subsiguiente selección de las células altamente productoras obtenidas se ve sometida, también en este caso, al principio de aleatoriedad y se basa en probabilidades, con lo que esta etapa de selección es sumamente laboriosa y larga. Para vigilar mejor y de forma más rápida la transformación y expresión de genes se desarrollaron los más diversos métodos. Éstos abarcaban primeramente la utilización de moléculas informadoras tales como, por ejemplo, cloranfenicol-acetiltransferasa, luciferasa, ß-galactosidasa o de proteínas de fusión que contienen las regiones codificadoras de ß-galactosidasa o luciferasa. El inconveniente de estos correspondientes ensayos del gen informador estriba, no obstante, en que las células son fijadas o lisadas y deben ser incubadas con sustratos y co-factores agregados de forma exógena. Por consiguiente, se excluye un cultivo ulterior de las células analizadas. Un método más reciente, basado en la co-expresión de la enzima ß-galactosidasa de E. coli posibilita ciertamente una clasificación de células vivas mediante un aparato FACS (Nolan et al., 1988), pero en este caso se requiere un tratamiento previo hipotonico para la carga de las células con el sustrato fluorógeno. Esta actividad debe ser todavía inhibida por la clasificación basada en FACS.
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Con la introducción de la proteína verde fluorescente (GFP) procedente de Aeguorea. victoria y de los mutantes de GFP desarrollados a partir de ella como molécula informadora se facilitó considerablemente la identificación de células que expresan un gen heterólogo. La co-expresión de GFP posibilitó un análisis en tiempo real in vivo y la clasificación de transfectantes en base a su fluorescencia, sin que se requirieran sustratos ni co-factores adicionales. El empleo de GFP como molécula informadora para vigilar la transferencia de genes se describió en diferentes publicaciones. Chalfie et al. describen en las patentes US 5.491.084 y US 6.146.826 un método para la selección de células que expresan una proteína de interés. Este método abarca la co-transfección de células por parte de una molécula de ADN que contiene la secuencia codificadora de la proteína de interés, y una segunda molécula de ADN que codifica el gen de GFP. Seguidamente se seleccionan las células que expresan GFP. Gubin et al. (1997) investigaron la estabilidad de la expresión de GFP en células CHO en ausencia de condiciones selectivas de desarrollo. En este caso, las células se transfectaron con un plásmido que contenía tanto GFP como también neomicina-fosfotransferasa. Mosser et al. (1997) utilizaron para la identificación y selección de células, que expresaban un producto inducible, un plásmido que contenía una cásete de expresión bicistrónica, que codifica GFP y un gen diana (o también denominado gen de 6
interés) . El gen diana se encontraba en este caso bajo el control de un promotor regulable. El acoplamiento de la expresión de la GFP y del gen diana se alcanzó utilizando un elemento IRES ("Internal Ribosome Entry Site" - "sitio de entrada al ribosoma interno") viral, con lo que se expresó un AR m bicistrónico que codificaba GFP y la proteína de interés. El plásmido utilizado en este caso no contenía por sí mismo ningún gen marcador seleccioriable . Este fue incorporado, por lo tanto, por un segundo plásmido en una co-transfección o en una transfección subsiguiente. Por el contrario, Levenson et al. (1998) utilizaron vectores retrovirales con una cásete de expresión bicistrónica en la que se puede clonar el gen de interés delante de la secuencia IRES. La secuencia que sigue a la secuencia IRES codificaba, por el contrario, un gen marcador seleccionable, tratándose en este caso de un marcador que inducía la resistencia contra G418, puromicina, higromicina B, histidinol D o fleomicina, o de GFP. Ya se describieron también vectores que contenían un elemento IRES de la familia de los picornavirus, estando situado el elemento IRES entre el gen producto y un gen marcador seleccionable (Pelletier et al., 1988; Jang et al., 1989; Davies et al., 1992). GFP fue también fusionada con éxito con genes marcadores de resistencia. Por ejemplo, Bennett et al. (1998) describen una proteína de fusión de GFP/zeomicina. Este marcador de 7
selección bifuncional pudo emplearse con éxito para la identificación y selección de células de mamíferos transfec-tadas . Primig et al. (1998) emplearon, por el contrario, una proteína de fusión a base de GFP y neomicina-fosfotransferasa para sus estudios de intensificador . En la publicación de Meng et al. (2000) y en la solicitud de patente internacional WO 01/04306 se empleó para la selección e identificación de células con elevada expresión de una proteína recombinante un sistema de expresión en el que el gen de interés fue expresado junto con el gen marcador de la selección amplificable DHFR y un gen GFP, por un único vector. En este caso, los tres genes estaban recopilados en una unidad de transcripción o estaban repartidos en dos unidades . Mediante este enlace en el espacio y transcripcional de los tres genes en un único vector de expresión debía aumentarse su probabilidad de una co-amplificación bajo la presión de selección y, por consiguiente, identificarse y seleccionarse clones de alta producción. Los mejores clones que fueron aislados mediante la aplicación de la selección combinada por medio de marcadores de selección DHFR amplificables y clasificación por FACS basada en GFP, expresaron la proteína de interés en un orden de magnitud de como máximo 3 a 4,5 pg por célula y día. En este caso, los experimentos se llevaron a cabo con células adherentes y en medio con contenido en suero, es decir con células y en condiciones que, de manera conocida, 8
son esencialmente más robustas y se distinguen por mayores productividades básicas . Sumario de la invención Por lo tanto, era misión de la presente invención el desarrollo de un sistema de selección para células recombi-nantes con productividad incrementada, que cumpliera los siguientes requisitos: (1) acortamiento del tiempo para el desarrollo de células altamente productoras para la producción de proteínas biofarmacéuticas con simultánea reducción de los costes de desarrollo; (2) elevado rendimiento en la selección de células altamente productoras con escaso gasto de capacidad; (3) empleo de células altamente productoras y "robustas en la fermentación" que, por ejemplo, muestran un menor perjuicio en el desarrollo en el caso de concentraciones incrementadas de metotrexato; (4) transfección, selección y cultivo de las células adaptadas a la suspensión, preferiblemente en medio exento de suero; (5) reducción de las etapas de amplificación génica necesarias . Misión de la invención era, además, la puesta a disposición de vectores de expresión y de células huésped transfec-tadas con los mismos, que son utilizables en este sistema de 9
selección de clones, así como de un procedimiento para la preparación de productos génicos heterólogos utilizando estas células huésped. Estos problemas se resuelven, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, con ayuda de un vector de expresión que abarca un gen que codifica una proteína de interés (en lo que sigue también: "gen de interés") en enlace funcional con un promotor ubiquitina/S27a de hámster y un gen que codifica una proteína fluorescente. El vector de expresión contiene preferiblemente, además, un gen marcador de la selección amplificable, por ejemplo el gen para la dihidrofolato-reductasa (DHFR) . Además, un vector de expresión preferido contiene otros elementos reguladores, por ejemplo un intensificador en enlace funcional con el promotor. Además, el vector de expresión contiene preferiblemente, de manera adicional, un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) que posibilita la expresión bicistrónica del gen que codifica una proteína fluorescente, y el gen de interés . La invención se refiere también a vectores de base que, en lugar del gen de interés, presentan un lugar múltiple de clonación para la incorporación de un gen de este tipo, es decir un tramo de secuencia con múltiples puntos de corte para endonucleasas de restricción. Otro aspecto de la presente invención son células huésped 10
que han sido transfectadas con uno de los vectores de expresión mencionados. En este caso, se trata de células huésped eucarióticas , preferiblemente células de mamíferos, siendo particularmente preferidas células de roedores tales como células de hámster y, en particular, células CHO o células BHK. Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para la preparación de un producto génico heterólogo en el que una célula huésped transfectada con el vector de expresión de acuerdo con la invención se cultiva en condiciones que posibilitan una expresión del producto génico y el producto génico se aisla del cultivo o del medio de cultivo. En una forma de realización particular de la invención, la célula huésped se transfecta, preferiblemente se co-transfecta con el vector de expresión de acuerdo con la invención, así como, adicionalmente, con uno o varios vectores con genes que codifican una o varias otras proteínas de interés . A este respecto, la presente invención pone a disposición un procedimiento para la producción de una proteína heterodímera, en el que se cultiva una célula huésped de este tipo, que ha sido co-transfectada con vectores de expresión que codifican diferentes subunidades de la proteína heterodímera, en condiciones que posibilitan una expresión de la proteína heterodímera, y la proteína heterodímera se aisla del 11
cultivo o del medio de cultivo. Un caso de aplicación especial para un procedimiento de este tipo es la producción de anticuerpos y sus subunidades . Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para la selección de una célula huésped que expresa una proteína de interés en el que se cultiva una población de células huésped, que han sido transfectadas con un vector de expresión de acuerdo con la invención, en condiciones que posibilitan una expresión de la proteína de interés y de la proteína fluorescente, y se identifican y/o seleccionan la o las células que muestran las más altas tasas de expresión de proteína fluorescente. En este caso, la selección se efectúa preferiblemente con ayuda de un aparato clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) . Sorprendentemente, se encontró que con el sistema puesto a disposición de acuerdo con la invención se pueden aislar agrupaciones de células en un tiempo brevísimo que, sin la etapa de amplificación del gen, que expresan productividades específicas medias superiores a 15 pg (proteína de cadena sencilla) o de 10 pg (anticuerpo humanizado) de proteína recombinante por célula y día. Mediante una única etapa de amplificación del gen basada en DHFR se pudieron aumentar las productividades específicas todavía a más de 30 pg por célula y día. Por consiguiente, las productividades alcanzadas en las agrupaciones de células son un factor de 8 a 10 mayores que 12
las productividades máximas de los mejores clones celulares publicados hasta la fecha. Sorprendentemente, existe también una muy buena correlación entre la expresión de la proteína de interés y la de la proteína fluorescente. Ésta se da incluso en el caso de una co-transfección cuando - como en el caso de un anticuerpo expresado - las dos cadenas de inmunoglobulina son expresadas en < cada caso por un vector propio y, en el caso de la clasificación mediante FACS, sólo se puede seleccionar en cuanto a la expresión de una cadena, condicionada por su acoplamiento transcripcional con la proteína fluorescente. Las elevadas tasas de expresión de la proteína fluorescente no tienen en este caso ninguna influencia negativa sobre el desarrollo y la vitalidad de la célula. Además, el tiempo de desarrollo para la selección de células altamente productoras puede reducirse al menos en la mitad en comparación con una estrategia de amplificación génica convencional escalonada, lo cual va acompañado de una significativa reducción de las capacidades y de los costes de desarrollo. Breve Descripción de las figuras La figura 1 muestra una comparación del nivel de expresión alcanzado de clones de células recombinantes , en los que el producto génico heterologo es expresado bajo el control del promotor de CMV o bajo el del promotor ubiquitina/S27a de hámster. En este caso, los dos promotores están enlazados 13
funcionalmente con el reforzador de CMV y la secuencia de terminación, BGH poli A, es en todos los casos idéntica. En el caso de CMV1 se 'trata de un vector de expresión basado en pcDNA3 (Invitrogen, Karlsruhe, DE) , en el caso de CMV2 de un vector de expresión basado en pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.) y en el caso de CHO, de un vector de expresión basado en pAD-CMV (Werner et al., 1998). En el caso de la expresión de la enzima lisosomal, todos los vectores de expresión contienen el marcador de selección amplificable dihidrofolato-reductasa (DHFR) y la expresión del gen heterólogo se elevó mediante subsiguientes etapas de amplificación con metotrexato (MTX) . Para la expresión de las dos cadenas del anticuerpo (Ac) se llevó a cabo una co-transfección con un segundo vector que, como marcador de selección, contiene un gen de resistencia a neomicina. Los títulos o bien productividades específicas alcanzados están indicados en relación con la expresión basada en el promotor de CMV que se estableció como 1 (CMV1 para la enzima, CMV2 para Ac) . La figura 2 muestra una representación esquemática de los vectores de base que se utilizaron para la expresión de las proteínas recombinantes en células CHO-DG44. En el caso de "P/E" se trata de una combinación a base de intensificador de CMV y promotor ubiquitina/S27a de hámster, en el caso de "P" se trata únicamente de un elemento de promotor, y en el caso 14
de "T" se trata de una señal de terminación para la transcripción que se requiere para la poliadenilación del AR m transcrito. La posición y la dirección de la iniciación de la transcripción dentro de cada unidad de transcripción se indica mediante una flecha. Para la clonación de los genes heterólogos, detrás del elemento de promotor está introducido un intervalo de secuencia con múltiples puntos de corte para endonucleasas de restricción (múltiple cloning sites - mes) . El marcador de selección de dihidrofolato-reductasa amplifi-cable está abreviado con "dhfr" y el marcador de selección neomicina-fosfotransferasa está abreviado con "neo" . El elemento IRES procedente del virus de la encefalomiocarditis sirve como punto de entrada al ribosoma interno dentro de la unidad de transcripción bicistrónica y posibilita la traduc-ción de la proteína verde fluorescente "GFP" siguiente. La figura 3 muestra una representación esquemática de los vectores de expresión eucarióticos que codifican en cada caso una proteína biofarmacéutica y que se emplearon para la transfección de células CH0-DG44. En el caso de "P/E" se trata de una combinación de intensificador de CMV y promotor ubiquitina/S27a de hámster, en el caso de "P" se trata únicamente de un elemento promotor y en el caso de "T" se trata de una señal de terminación para la transcripción que se requiere para la poliadenilación del ARNm transcrito. La posición y dirección de la iniciación de la transcripción 15
dentro de cada unidad de transcripción se indica mediante una flecha. El marcador de selección dihidrofolato-reductasa amplificable está abreviado con "dhrf" y el marcador de selección neomicina-fosfotransferasa está abreviado con "neo1". El elemento IRES procedente del virus de la encefalomiocarditis sirve como punto de unión al ribosoma interno dentro de la unidad de transcripción bicistronica y posibilita la traducción de la siguiente proteína verde fluorescente "GFP" . "sICAM" codifica la molécula de adhesión intracelular soluble (documento US 5.412.216), mientras que "F19HC" y "F19LC" codifican la cadena pesada o ligera del anticuerpo F19 humanizado (documento EP 953 639) . La figura 4 muestra la correlación entre la productividad de sICAM y la fluorescencia de GFP en el ejemplo de la agrupación de células ZBl . Esta agrupación de células se obtuvo de la transfección con el vector pBIDG-sICAM, en el que la proteína terapéutica sICAM y GFP son expresadas conjuntamente por una unidad de transcripción bicistronica. La agrupación se sometió a una clasificación por FACS basada en GFP secuencial. Después de cada etapa de clasificación (Sort) se determinó mediante ELISA la concentración de la sICAM en el sobrenadante del cultivo celular de la agrupación y se calculó la productividad específica por célula y día (pg/c*d) . En este caso, cada punto de datos representa la media de al menos tres pasos de cultivo. En conjunto, se llevaron a cabo seis Sorts .
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La figura 5 muestra el aislamiento de células sICAM de alta expresión mediante clasificación por FACS basada en GFP en el ejemplo de la agrupación de células ZBl . Esta agrupación de células se obtuvo de la transfección con el vector pBIDG-sICAM, en el que la proteína sICAM terapéutica y GFP son expresadas conjuntamente por una unidad de transcripción bicistrónica. La agrupación se sometió a una clasificación por FACS secuencial basada en GFP. Después de cada Sort se determinó mediante ELISA la concentración de la sICAM en el sobrenadante del cultivo celular de la agrupación y se calculó la productividad específica por célula y día (pg/c*d) . En este caso, cada punto de datos representa la media de al menos tres pasos de cultivo. En conjunto, se llevaron a cabo seis Sorts.
La figura 6 muestra los aumentos en la productividad de la sICAM conseguidos mediante la combinación de una selección basada en GFP con una etapa de amplificación con MX en el ejemplo de la agrupación de células ZBl. Esta agrupación de células, que se obtuvo de la transfección con el vector pBIDG-slCAM, se sometió a una clasificación por FACS secuencial basada en GFP. Después de la cuarta Sort o de la sexta Sort se llevó a cabo una amplificación del gel inducida por DHFR mediante la adición de metotrexato (MTX) al medio de cultivo (5 nM, 50 nM, 500 nM o 2 µ? de MTX) . La concentración de la sICAM en el sobrenadante del cultivo celular de la agrupación se determinó mediante ELISA y se calculó la productividad 17
específica por célula y día (pg/c*d) . En este caso, cada punto de - datos representa la media de al menos tres pasos de cultivo . La figura 7 muestra el transcurso de la viabilidad de la agrupación de células después de la adición de diferentes dosis elevadas de metotrexato al medio de cultivo. La agrupación de células ZBl, que se obtuvo de la transfección con el vector pBIDG-sICA (figura 3), se sometió a una clasificación por FACS secuencial basada en GFP. Después de la cuarta Sort o de la sexta Sort se llevó a cabo una amplificación del gen inducida por DHFR mediante la adición de metotrexato (MTX) al medio de cultivo. Los números de células, así como la viabilidad, se determinaron durante la fase de selección mediante tinción con azul tripan y se vigiló a lo largo de varios días de cultivo (dic) . La figura 8 muestra la correlación entre la productividad de anticuerpos (acm F19) y la fluorescencia de GFP en el ejemplo de la agrupación de células ZBl. Esta agrupación de células se obtuvo de la transfección con la combinación de vectores pBIDG-Fl9HC y pBIN-Fl9LC (figura 3) . La agrupación se sometió a una clasificación por FACS secuencial basada en GFP. Después de- cada Sort se determinó mediante ELISA la concentración del anticuerpo F19 en el sobrenadante del cultivo celular de la agrupación y se calculó la productividad específica por célula y día (pg/c*d) . En este caso, cada punto 18
de datos representa la media de al menos tres pasos de cultivo. En conjunto se llevaron a cabo seis Sorts. La figura 9 muestra el aislamiento de la agrupación de células del acm F19 de alta expresión mediante selección basada en GFP por medio de FACS en el ejemplo de la agrupación de células ZBl . Esta agrupación de células, que se obtuvo de la co-transfección con los vectores pBIDG-Fl9HC y pBIN-Fl9LC (figura 3), se sometió a una clasificación por FACS secuencial basada en GFP. La concentración del anticuerpo F19 en el sobrenadante del cultivo celular de la agrupación se determinó mediante ELISA después de cada Sort y se calculó la productividad específica por célula y día (pg/c*d) . En este caso, cada punto de datos representa la media a base de al menos tres pasos de cultivo. Descripción detallada de la invención El vector de expresión de acuerdo con la invención contiene un gen que codifica una proteína de interés ("gen de interés"), en enlace funcional con un promotor ubiquitina/S27a de hámster y un gen que codifica una proteína fluorescente. Preferiblemente, el vector de expresión contiene, además, un gen marcador de la selección amplificable . Promotor ubicruitina/S27a de hámster El promotor ubiquitina/S27a de hámster es un fuerte promotor homólogo que se describe en el documento WO 97/15664. Un promotor de este tipo presenta preferiblemente al menos una 19
de las siguientes características: tramo de secuencia rico en GC, punto de unión Spl, elemento de polipirimidina, ausencia de una caja TATA. Se prefiere particularmente un promotor que presenta un punto de unión Spl en ausencia de una caja TATA. Además, se prefiere un promotor que está activado de forma constitutiva y, en particular, que tiene la misma actividad en condiciones de cultivo celular con contenido en suero, pobre en suero y exento en suero. En otra forma de realización, se trata de un promotor inducible, en particular de un promotor que es activado mediante retirada del suero. Una forma de realización particularmente ventajosa es un promotor con una secuencia de nucleótidos que está contenida en la figura 5 del documento WO 97/25664. En este caso, son particularmente preferidas secuencias de promotor en las que está contenida la secuencia desde la posición -161 a -45 de la figura 5. Los promotores utilizados en los ejemplos de la presente memoria de patente contienen en cada caso una molécula de ADN con la secuencia de la posición 1923 a 2406 de la SEQ ID N0:1 del Protocolo de Secuencias adjunto. Esta secuencia corresponde al fragmento -372 a +111 de la figura 5 del documento WO 97/15664 y representa el promotor preferido, es decir un promotor preferido debería abarcar este tramo de secuencia. Otro fragmento de promotor adecuado contiene la secuencia desde la posición 2134 a 2406 (corresponde a -161 a +111 en la 20
figura 5 del documento WO 97/15664) . Un promotor, que contiene únicamente la secuencia desde la posición 2251 a 2406, ya no es funcional (corresponde a la posición -45 a +111 en la figura 5 del documento WO 97/15664) . Es posible una prolongación de la secuencia del promotor en la dirección 5 ' partiendo de la posición 2134. También se pueden emplear subfragmentos funcionales de la secuencia completa del promotor ubiquitina/S27a de hámster, así como mutantes/variantes funcionales de la secuencia completa o subfragmentos de la misma que han sido modificados, por ejemplo, por sustituciones, inserciones o deleciones. Subfragmentos, mutantes o variantes correspondientes se designan en lo que sigue también como "promotor modificado" . Un promotor modificado, eventualmente combinado con otros elementos reguladores, presenta preferiblemente una actividad de transcripción que corresponde a la del fragmento de promotor desde la posición 1923 a 2406 de la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO:l (-372 a +111 de la figura 5 del documento WO 97/15664) . Un promotor modificado se manifiesta como apropiado en el sentido de la invención cuando dispone de una actividad de transcripción que es por lo menos 50%, mejor por lo menos 80%, todavía mejor por lo menos 90% y todavía de modo más preferido por lo menos 100% la actividad del fragmento de 1923 a 2406 (fragmento -372 a +111) en un ensayo del gen informador equiparable. Son particularmente 21
preferidos promotores modificados que presentan una homología mínima de la secuencia con la secuencia de tipo salvaje SEQ ID NO.l del promotor ubiquitina/S27a del hámster de por lo menos 80%, mejor' por lo menos 85%, preferiblemente por lo menos 90%, preferiblemente además por lo menos 95% y de modo particularmente preferido por lo menos 97% y disponen de una correspondiente actividad del promotor en un ensayo comparativo del gen informador. En un correspondiente ensayo comparativo del gen informador, los fragmentos de promotor a ensayar, incluida la secuencia de referencia, se clonan en cada caso delante de un gen informador sin promotor que codifica, por ejemplo, luciferasa, fosfatasa alcalina segregada o proteína verde fluorescente (GFP) . Estas construcciones (secuencia de promo-tor + gen informador) se introducen a continuación mediante transfección en las células de ensayo, por ejemplo CHO-DG44, y se determina la inducción de la expresión del gen informador mediante el correspondiente fragmento del promotor a través de la determinación del contenido proteínico del gen informador. Un ensayo correspondiente se encuentra a título de ejemplo también en Ausubel et al . , Current Protocols in Molecular Biology, 1994, actualizado. La secuencia del promotor ubiquitina/S27a del hámster, así como los promotores modificados que, por ejemplo, también pueden abarcar la región 51 no traducida o bien fragmentos 22
elegidos de la misma, y la región codificadora del gen ubiquitina/S27a o bien fragmentos elegidos del mismo, pueden obtenerse por un experto en la materia conociendo la secuencia descrita en el documento WO 97/15664 con diferentes métodos convencionales tal como, por ejemplo, se describe en Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994. Partiendo de la secuencia descrita en el documento WO 97/15664 se puede elegir, por ejemplo, un fragmento adecuado y sintetizar químicamente una sonda de oligonucleótidos que contiene la secuencia de este fragmento. Con una sonda de este tipo se puede clonar, por ejemplo por hibridación a partir de un banco genómico del hámster, el gen ubiquitina/S27a o su región 5' no traducida ó demás fragmentos . Mediante el ensayo del gen informador antes descrito, el experto en la materia está en condiciones de identificar, sin una complejidad considerable, fragmentos con actividad de promotor y utilizarlos en el sentido de la presente invención. La región 5' no traducida o bien fragmentos especiales de la misma pueden obtenerse también fácilmente mediante amplficación por PCR con correspondientes cebadores procedentes del ADN genómico o de un banco genómico. Fragmentos de la región 51 no traducida pueden también obtenerse por digestión limitante con exonucleasa III a partir de fragmentos de ADN mayores. Moléculas de ADN de este tipo pueden también sintetizarse químicamente o producirse por ligación a partir de f agmentos químicamente sintetizados .
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Mutantes por deleción, inserción y sustitución se pueden crear mediante "mutagénesis especifica del lugar" y/o "técnicas de mutagénesis basadas en PCR" . Métodos correspondientes están recogidos, a título de ejemplo, en Lottspeich y Zorbas (1998) (capítulo 36.1), con indicaciones adicionales. Es también posible identificar y aislar, a través de hibridación cruzada con sondas procedentes de la zona 5 ' no traducida del gen ubiquitina/S27a del hámster o de la porción S27a del gen ubiquitina/S27a del hámster, secuencias de promotor adecuadas a partir de correspondientes genes homólogos de otras especies de mamíferos. Técnicas correspondientes se describen a título de ejemplo en Lottspeich y Zorbas (1998) (capítulo 23) . "Homólogos" en el sentido de la invención son genes en la medida en que su secuencia de nucleotidos muestre una coincidencia de por lo menos 70%, mejor por lo menos 80%, preferiblemente por lo menos 90%, de modo adicionalmente preferido por lo menos 95% y de modo particularmente preferido por lo menos 97% con la secuencia de nucleotidos del gen con la que es homologa. Gen de interés El gen de interés contenido en el vector de expresión de acuerdo con la invención abarca una secuencia de nucleotidos de longitud arbitraria que codifica un producto de interés. El producto génico o también "producto de interés" es, por norma general, una proteína, polipéptido, péptido o fragmento 24
derivado de los mismos. Sin embargo, también puede ser ARN o ARN antisentido. El gen de interés puede presentarse en su longitud completa, en forma acortada, como gen de fusión o gen marcado. Se puede tratar de ADN genómico o, preferiblemente, ADNc o correspondientes fragmentos o fusiones. El gen de interés puede representar la secuencia del gen nativa, mutada o modificada de otra manera. Modificaciones de este tipo incluyen optimizaciones del codón para la adaptación a una determinada célula huésped y una humanización. El gen de interés puede codificar, por ejemplo, un polipéptido secretado, citoplasmático, localizado en el núcleo, ligado a la membrana o ligado a la superficie de la célula. La expresión "secuencia de nucleotidos" o "secuencia de ácidos nucleicos" designa un oligonucleótido, nucleotidos, polinucleótidos y sus fragmentos, así como ADN o ARN de origen genómico o sintético que se presentan como cadena sencilla o cadena doble, y puede representar la hebra codificante o la no codificante de un gen. Para la modificación de secuencias de ácidos nucleicos pueden emplearse técnicas convencionales tales como, por ejemplo, mutagénesis específica del lugar o mutagénesis inducida por PCR (descrita, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989 o Ausubel et al., 1994). Por "codificar" se entiende la propiedad o capacidad de una secuencia específica de nucleotidos en un ácido nucleico, por ejemplo un gen en un cromosoma o un ARNm, de servir como 25
matriz para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas tales como, por ejemplo, ARNr, ARNt, ARNm, otras moléculas de ARN, ADNc o polipéptidos en un proceso biológico. Según ello, un gen codifica una proteína cuando, mediante transcripción y subsiguiente traducción del ARNm, la proteína deseada se produce en una célula o en otro sistema biológico. Tanto la hebra codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de ARNm y, normalmente, también se indica en bancos de datos de secuencias, por ejemplo EMBL o GenBank, como también la hebra de un gen o ADNc no codificante que sirve como matriz para la transcripción puede designarse en este caso como codificante de un producto o proteína. Un ácido nucleico que codifica una proteína incluye también ácidos nucleicos que, en virtud del código genético degenerado, presentan una sucesión de secuencia de nucleótidos distinta, pero dan como resultado la misma secuencia de aminoácidos de la proteína. Secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas pueden contener también intrones . Con el término "ADNc" se designan ácidos desoxirribonu-cleicos que se preparan por transcripción inversa y síntesis de la segunda hebra de ADN a partir de un ARNm producido por un gen u otro ARN. Si el ADNc se presenta en forma de molécula de ADN de doble cadena, entonces contiene tanto una hebra codificante como también una hebra no codificante. Con el término "intrón" se designan secuencias de 26
nucleótidos no codificantes de longitud arbitraria. Se presentan de forma natural en muchos genes eucarióticos y son eliminadas por un precursor de A Nrn previamente transcrito mediante un proceso designado como corte y empalme. Para ello, se requiere una separación por corte exacta del intrón en los extremos 5 ' y 31 y una unión correcta de los extremos de AR m resultantes, con el fin de producir un ARNm maduro procesado con el marco de lectura correcto para la síntesis con éxito de proteínas . Muchos de los lugares de donante de corte y empalme y aceptor de corte y empalme que participan en este proceso de corte y empalme, las secuencias presentes directamente en los límites del exón-intrón o del intrón-exón, han sido caracterizados. Para una perspectiva, véase Ohshima et al., 1987. Proteína de interés Proteínas/polipéptidos biofarmacéuticamente importan-tes abarcan, por ejemplo, anticuerpos, enzimas, citoquinas, linfoquinas, moléculas de adhesión, receptores, así como sus derivados o fragmentos, pero no se limitan a éstos. En general, son importantes todos los polipéptidos que actúan como agonistas o antagonistas y/o pueden encontrar una aplicación terapéutica o diagnóstica. El término "polipéptidp" se utiliza para las secuencias de aminoácidos o proteínas y designa polímeros de aminoácidos de longitud arbitraria. Esta expresión incluye también 27
proteínas que son modificadas después de la traducción mediante reacciones tales como, por ejemplo, glicosilación, fosforilación, acetilación o tratamiento de proteínas. La estructura del polipéptido puede modificarse, por ejemplo, mediante sustituciones, deleciones o inserción con aminoácidos, fusión con otras proteínas conservando su actividad biológica. Ejemplos de proteínas terapéuticas son insulina, factor de crecimiento similar a insulina, hormona del crecimiento humana (hGH) y otros factores de crecimiento, activador del plasminógeno de tejidos (tPA) , eritropoyetina, (EPO) , citoquinas, por ejemplo interleuquinas (IL) tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 , IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, interferón (IFN)-alfa, beta, gamma, omega o tau, factor de necrosis de tumores (TNF) tal como, por ejemplo, TNF-alfa, beta o gamma, TRAIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 y VEGF. Otros ejemplos son anticuerpos monoclonales , policlonales , multiespecíficos y de cadena sencilla (en inglés single chain) y fragmentos de los mismos tales como, por ejemplo, Fab, Fab' , F(ab')2, Fe y Fe', cadenas de inmunoglobulina ligeras (L) y pesadas (H) y sus regiones constantes, variables o hipervariables, así como fragmentos Fv y Fd (Chamov et al., 1999). Los anticuerpos pueden ser de origen humano o no humano. También entran en consideración anticuerpos humanizados o quiméricos.
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Fragmentos Fab (Fragment antigen-binding = Fab) consisten en las regiones variables de las dos cadenas que son mantenidas juntas mediante las regiones constantes limítrofes. Pueden crearse, por ejemplo, mediante tratamiento con una proteasa tal como, por ejemplo, papaína, a partir de anticuerpos convencionales o también mediante clonación de ADN. Otros fragmentos de anticuerpos son fragmentos F(ab')2 Que pueden prepararse mediante digestión proteolítica con pepsina. Mediante la clonación del gen pueden prepararse también fragmentos de anticuerpos acortados que solamente se componen de la región variable de la cadena pesada (VH) y ligera (VL) . Estos se designan como fragmentos Fv (Fragment variable = fragmento de la parte variable) . Dado que en el caso de estos fragmentos Fv no es posible la unión covalente a través de los restos cisterna de las cadenas constantes, estos fragmentos Fv se estabilizan a menudo de otro modo. Para ello, las regiones variables de la cadena pesada y ligera se enlazan entre sí a menudo mediante un fragmento de péptido corto de aproximadamente 10-30 aminoácidos, de modo particularmente preferido 15 aminoácidos. De este modo, se forma una cadena de polipéptidos única en la que VH y VL están unidas entre sí mediante un enlazador de péptidós . Fragmentos de anticuerpo de este tipo se designan también fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) . Ejemplos de anticuerpos scFv son conocidos y están descritos, veáse, por ejemplo, Huston et al. (1988).
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En los pasados años se desarrollaron diferentes estrategias con el fin de producir derivados de scFv multímeros. La intención consiste en la creación de anticuerpos recombinantes con propiedades farmacocinéticas mejoradas y una avidez reforzada por la unión. Para alcanzar la multimerizacion de los fragmentos scFv, éstos se producen como proteínas de fusión con dominios de multimerizacion. Como dominios de multimerizacion pueden funcionar en este caso, por ejemplo, la región CH3 de una IgG o estructuras de hélice ("coiled coil structure") tales como los dominios de cierre de cremallera de leucina. En otras estrategias se aprovecha la interacción entre las regiones VH y VL del fragmento scFv para una multimerizacion (por ejemplo dia-, tri- y penta-cuerpos) . Como "diacuerpo" un experto en la materia designa un derivado de scFv homodímero bivalente. El acortamiento del enlazador peptídico en la molécula de scFv a 5-10 aminoácidos da como resultado la formación de homodímeros mediante transposición de cadenas VH/VL. Los diacuerpos pueden estabilizarse adicionalmente mediante puentes disulfuro introducidos. Ejemplos de diacuerpos se encuentran en la bibliografía, por ejemplo en Perisic et al. (1994). Como "minicuerpo" , el experto en la materia designa un derivado de scFv homodímero bivalente. Se compone de una proteína de fusión que contiene la región CH3 de una inmuno-globulina, preferiblemente IgG, de manera particularmente 30
preferida IgGl como región de dimerización. Ésta une los fragmentos de scFV a través de una región de bisagra, asimismo de IgG y una región de enlazador. Ejemplos de inicuerpos de este tipo se describen en Hu et al. (1996). Como "triacuerpo" , el experto en la materia designa un derivado de scFv homotrímero trivalente (Kortt et al., 1997). La fusión directa de VH-VL sin utilizar una secuencia de enlazador conduce a la formación de trímeros . En el caso de los fragmentos designados por el experto en la materia como mini-anticuerpos, que tienen una estructura bi-, tri- o tetra-valente, se trata asimismo de derivados de fragmentos de scFv. En este caso, la multerización se alcanza a través de estructuras helicoidales "coiled coil" dímeras, trímeras o tetrámeras (Pack et al., 1993 y 1995; Lovejoy et al. , 1993) . Gen que codifica una proteína fluorescente El vector de expresión de acuerdo con la invención contiene un gen que codifica una proteína fluorescente en unión funcional con el gen de interés y bajo el control del promotor de ubiquitina/S27a de hámster, un promotor modificado de ubiquitina/S27a de hámster o un homólogo del mismo. En el caso de la proteína fluorescente se puede tratar, por ejemplo, de una proteína fluorescente verde, azul verdosa, azul, amarilla o de otro color. Un ejemplo especial es la proteína fluorescente verde (GFP) de Aeguorea victoria o 31
Renilla reniformis y mutantes desarrollados a partir de ellas; véase, por ejemplo, Bennet et al. (1998); Chalfie et al. (1994); documento WO 01/04306 y la bibliografía allí citada. Otras proteínas fluorescentes y genes que las codifican se describen en los documentos WO 00/34318, WO 00/34326, WO 00/34526 y WO 01/27150 que se incorporan en esta memoria como referencia. En el caso de estas proteínas fluorescentes se trata de fluoróforos de organismos no bioluminiscentes de las especies Anthozoa, por ejemplo de Anemonia majano, Clavularia sp., Zoanthus sp. I, Zoanthus sp. II, Discosoma striata, Discosoma sp. "rojo", Discosoma sp. "verde", Discosoma sp. "magenta", Anemonia sulcata. Las proteínas de fluorescencia empleadas de acuerdo con la invención contienen, junto a las proteínas de tipo salvaje, también mutantes y variantes naturales o producidos por tecnología genética, sus fragmentos, derivados o, por ejemplo, variantes fusionadas con otras proteínas o péptidos. Las mutaciones incorporadas pueden modificar en este caso, por ejemplo, el espectro de excitación o de emisión, la formación de cromóforos, el coeficiente de extinción o la estabilidad de la proteína. Mediante la optimización del codón se puede mejorar, además, la expresión en células de mamíferos u otras especies . De acuerdo con la invención, la proteína fluorescente puede emplearse también en fusión con un marcador de selección, preferiblemente con un marcador de selección 32
amplificarle tal como, por ejemplo, la dihidrofolato-reductasa (DHFR) . La fluorescencia emitida por las proteínas fluorescentes posibilita la detección de las proteínas, por ejemplo mediante citometría de flujo con un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) o mediante microscopía de fluorescencia . Otros elementos reguladores El promotor ubiquitina/S27a del hámster puede relacio-narse funcionalmente con otras secuencias reguladoras para aumentar/regular la actividad de la transcripción en una cásete de expresión. Por ejemplo, el promotor con secuencias de intensificador pueden enlazarse funcionalmente con el fin de aumentar la actividad de la transcripción. Para ello, pueden utilizarse uno o varios intensificadores y/o varias copias de una secuencia de intensificador, por ejemplo un intensificador de CMV o SV40. Con el término " intensificador" se designa una secuencia de polinucleótidos que interviene en la localización cis, en la actividad de un promotor y, así, estimula la transcripción de un gen enlazado funcionalmente con este promotor. En contraposición a promotores, la acción de los intensificadores es dependiente de la posición y orientación y, por consiguiente, puede posicionarse delante o detrás de una 33
unidad de transcripción, dentro de un intrón o incluso dentro de la región de codificación. En este caso, el intensificador puede localizarse tanto en estrecha proximidad a la unidad de transcripción como también a una distancia considerable con respecto al promotor. También es posible un solapamiento físico y funcional con el promotor. Por el experto en la materia se conocen una pluralidad de intensificadores de diferentes fuentes (y depositados en bancos de datos tales como GenBank, por ejemplo intensificador de SV40, intensifi-cador de CMV, intensificador de polioma, intensificador de adenovirus) y están disponibles como elementos independientes o clonados dentro de secuencias de polinucleótidos (por ejemplo, depositados en ATCC o de fuentes comerciales e individuales) . Una pluralidad de secuencias de promotor contienen también secuencias de intensificador tal como, por ejemplo, el promotor CMV a menudo utilizado. El intensificador de CMV humano pertenece en este caso a los intensificadores hasta ahora más intensamente identificados. Un ejemplo de un intensificador inducible es el intensificador de metalotio-neína que puede ser estimulado mediante glucocorticoides o metales pesados . Otra posible modificación es, por ejemplo, la introducción de múltiples lugares de unión Spl. Las secuencias de promotor pueden combinarse, además, con secuencias reguladoras que permiten un aumento/regulación de la actividad de la 34
transcripción. Así, el promotor puede hacerse reprimible/in-ducible. Esto sucede, por ejemplo, mediante el enlace con secuencias que representan puntos de unión para factores de transcripción de regulación positiva o negativa. El factor de transcripción SP-1 antes mencionado tiene, por ejemplo, una influencia positiva sobre la actividad de la transcripción. Otro ejemplo es el punto de unión para la proteína de activador AP-1 que puede actuar sobre la transcripción tanto desde un punto de vista positivo como también negativo. La actividad de la AP-1 puede controlarse mediante los más diversos factores tales como, por ejemplo, factores de crecimiento, citoquinas y suero (Faisst et al., 1992, y referencias allí citadas) . La eficacia de la transcripción puede también aumentarse modificando la secuencia del promotor mediante mutación (sustitución, inserción o deleción) de una, dos, tres o más bases y luego, en un ensayo de gen informador, se puede determinar si con ello se aumenta la actividad del promotor . Básicamente, los elementos reguladores adicionales abarcan otros promotores que el promotor ubiquitina/S27a del hámster, intensificadores, señales de terminación y de poliadenilación y otros elementos controladores de la expresión. Para los diversos tipos de células son conocidas tanto secuencias inducibles como también reguladoras constitutivas. "Elementos reguladores de la transcripción" abarcan 35
habitualmerite un promotor situado más arriba de la secuencia del gen a expresar, puntos de iniciación y terminación de la transcripción, así como una señal de poliadenilación. Como "promotor" se designa una secuencia de polinucleó-tidos que posibilita y controla la transcripción de los genes o secuencias enlazados funcionalmente con la misma. Un promotor contiene secuencias de reconocimiento para la unión de la AKN-polimerasa y el punto de iniciación de la transcripción (punto de iniciación de la transcripción) . Para la expresión de una secuencia deseada en un determinado tipo de célula o una célula huésped debe elegirse en cada caso un promotor funcional adecuado. El experto en la materia conoce una pluralidad de promotores de diferentes fuentes, incluidos los promotores constitutivos, inducibles y reprimibles. Están depositados en bancos de datos, por ejemplo GenBank, y pueden adquirirse como elementos individuales o clonados dentro de secuencias de polinucleótidos de fuentes comerciales o individuales. En promotores inducibles, la actividad del promotor en la reacción puede reducirse o aumentarse a una señal. Un ejemplo de un promotor inducible lo representa el promotor de tetraciclina (tet) . Éste contiene secuencias de operador de tetraciclina (teto) , que pueden ser inducidas por una proteína ' de transactivador regulada por tetraciclina (tTA) . En presencia de tetraciclina se inhibe la unión de tTa a teto. Ejemplos de otros promotores inducibles son el 36
promotor jun, fos, metalotionina y de choque térmico (véase también Sambrook et al., 1989; Gossen et al., 1994). Entre los promotores que son particularmente bien adecuados para una elevada expresión en organismos eucariotas, se encuentra el promotor temprano de SV40, el promotor tardío principal de adenovirus, el promotor de metalotionina-I de ratón y la región repetitiva terminal larga del virus del sarcoma de Rous y el promotor temprano del virus de la citomegalia humana. Ejemplos de otros promotores de mamíferos heterólogos son el o los promotores de actina, inmunoglobulina o de choque térmico.
La expresión "punto de iniciación de la transcripción" se refiere a un ácido nucleico en la construcción que corresponde al primer ácido nucleico que se incorpora en el elemento transcrito primario, es decir el precursor de AR m. El punto de iniciación de la transcripción puede solaparse con las secuencias de promotor. La expresión "punto de terminación de la transcripción" se refiere a una secuencia de nucleotidos que normalmente está presente en el extremo 3' del gen de interés o del segmento de gen a transcribir y que determina la interrupción de la transcripción por parte de ARN-polimerasa. La "señal de poliadenilación" es una secuencia señal que provoca la separación en un punto específico en el extremo 3 ' del ARNm eucariótico y la incorporación post-transcripcional de una secuencia de aproximadamente 100-200 nucleotidos de 37
adenina (cola poliA) en el extremo 3' separado. La señal de poliadenilación abarca la secuencia AATAAA de aproximadamente 10-30 nucleótidos situada más arriba del, lugar de separación, así como una secuencia dispuesta más abajo. Son conocidos diferentes elementos de poliadenilación, por ejemplo tk poliA, SV40 tardío y poliA temprano o BGH poliA (por ejemplo, descritos en el documento US 5.122.458). En una forma de realización preferida de la presente invención, cada unidad de transcripción dispone de un promotor o de un elemento de promotor/intensificador, un gen de interés y/o un gen marcador, así como de un elemento de terminación de la transcripción. En otra forma de realización preferida, la unidad de transcripción contiene otras unidades reguladoras de la traducción. "Elementos reguladores de la traducción" abarcan un lugar de iniciación de la traducción (AUG) , un codón de terminación y una señal poliA para cada polipéptido a expresar. Para una expresión óptima, puede ser favorable eliminar, agregar o modificar zonas 5 ' y/o 3 ' no traducidas de la secuencia de ácidos nucleicos a expresar con el fin de eliminar potenciales codones de iniciación de la traducción adicionales inadecuados u otras secuencias que pueden perjudicar la expresión al nivel de la transcripción o expresión. Con el fin de fomentar la expresión, se pueden insertar alternativamente puntos de unión de consenso ribosomales directamente más arriba del codón de 38
iniciación. Con el fin de producir un polipeptido secretado, el gen de interés contiene habitualmente una secuencia señal que codifica un péptido precursor de la señal que transporta el polipéptido sintetizado hacia y a través de la membrana ER. La secuencia señal se encuentra a menudo, pero no siempre, en el extremo amino de la proteína secretada y es separada por peptidasas señal, una vez que la proteína haya sido expulsada a través de la membrana ER. La secuencia del gen contendrá habitualmente, pero no necesariamente, una secuencia señal propia. Cuando la secuencia señal nativa no está presente, se puede introducir de manera conocida una secuencia señal heteróloga. El experto en la materia conoce numerosas secuencias señal de este tipo y están depositados en los bancos de datos de secuencias tales como GenBank y EMBL. Un elemento regulador particularmente importante de acuerdo con la invención es el sitio de unión al ribosorna interno (IRES) . El "elemento IRES" abarca una secuencia que lleva a cabo funcionalmente la iniciación de la traducción, independientemente de un casquete de metilguanosinio 5 '-terminal (estructura CAP), así como del gen situado más arriba y posibilita en una célula animal la traducción de dos cistrones (marco de lectura abierto) por parte de un único transcrito. El elemento IRES pone a disposición un lugar de unión al ribosoma independiente para la traducción del marco de lectura abierto situado inmediatamente más abajo. En con- 39
traposición al ARNm bacteriano, que puede ser multicistronico, es decir puede codificar varios polipéptidos o productos diferentes, que son traducidos sucesivamente por el ARNm, la mayoría de los ARNms de células animales son monocistrónicos y codifican únicamente una sola proteína o producto. En el caso de un transcrito multicistrónico en una célula eucariótica, la traducción sería iniciada por el lugar de iniciación de la traducción situado más próximo en la parte de arriba y sería finalizada por un primer codón de terminación, tras lo cual se liberaría el transcrito procedente del ribosoma. En el caso de la traducción se formaría, por consiguiente, solamente el primer polipéptido o producto codificado por el ARNm. Por el contrario, un transcrito multicistrónico con un elemento IRES, el cual está funcionalmente enlazado con el segundo u otros marcos de lectura abiertos en el transcrito, posibilita la subsiguiente traducción del marco de lectura abierto situado más abajo, de modo que en la célula eucariótica se producen dos o más polipéptidos o productos codificados por el mismo transcrito. El elemento IRES puede ser de longitud diferente y de origen diferente y, por ejemplo, puede proceder del virus de la encefalomiocarditis (EMCV) o de otros picornavirus . En la bibliografía están descritas diferentes secuencias IRES y su aplicación en la construcción de vectores; véase, por ejemplo Pelletier et al., 1988; Jang et al., 1989; Davies et al., 40
1992; Adam et al., 1991; Morgan et al., 1992; Sugimoto et al., 1994; Ramesh et al., 1996; Mosser et al., 1997. La secuencia del gen situada más abajo está funcional-mente enlazada con el extremo 3' del elemento IRES, es decir la distancia se elige de modo que la expresión del gen no se vea influenciada o sólo lo sea marginalmente o bien presente una expresión suficiente para el fin. " La distancia óptima y permisible entre el elemento IRES y el codón de iniciación del gen situado más abajo para una expresión todavía suficiente se puede determinar en ensayos sencillos mediante variación de la distancia y determinación de la tasa de expresión como función de la distancia con ayuda de ensayos del gen informador. Mediante las medidas descritas se puede obtener una cásete de expresión optimizada que es de elevada utilidad para la expresión de productos génicos heterólogos . Por lo tanto, es asimismo objeto de la invención una cásete de expresión obtenida mediante una o varias de estas medidas . Gen marcador de selección amplificable Un vector preferido de acuerdo con la invención contiene, adicionalmente, un gen marcador de la selección amplificable que posibilita una amplificación del gen marcador amplificable y, preferiblemente, una co-amplificación de una unidad de transcripción consistente en el gen ubiquitina/S27a del hámster, el gen de interés y el gen para la proteína fluorescente. Para ello, las células huésped transfectadas con 41
un correspondiente vector de expresión se cultivan en presencia de un agente de selección adecuado, de modo que únicamente se reproducen (se pueden reproducir) células huésped que disponen de varias copias de genes, al menos del gen marcador de selección amplificable. Preferiblemente, esto se consigue mediante un cultivo escalonado de las células en presencia de cantidades crecientes de agente de selección. El gen marcador de selección amplificable codifica habitualmente una enzima que es necesaria para el crecimiento de células eucarióticas en determinadas condiciones de cultivo. Por ejemplo, el gen marcador de la selección amplificable puede codificar dihidrofolato-reductasa (DHFR) . En este caso, el gen se amplifica si se cultiva una célula huésped trans-fectada con el mismo en presencia del agente de selección metotrexato (MTX) . En la siguiente Tabla 1 se indican ejemplos de otros genes marcadores de la selección amplificables , utilizables de acuerdo con la invención, y los correspondientes agentes de selección, que se describen en una panorámica en aufman, Methods in Enzymology, 185:537-566 (1990).
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Tabla 1 : Genes marcadores de selección amplif cables
Gen marcador de la selección Número de depósito Agente de selección amplifi-cable Dihidrofolato-reductasa M19869 (hámster) etotrexato (MTX) E00236 (ratón) Metalotioneína D10551 (hámster) Cadmio M13003 (humano) M11794 (rata) CAD (carbamoilfosfato- sintetasa 23652 (hámster) N-fosfoacetil-L-aspartato
: aspartato- transcarbamilasa: D78586 (humano) dihidroorotasa) Adenosina-desaminasa K02567 (humano) Xil-A- o adenosina, M10319 (ratón) 2'desoxicoformicina
AMP (adenilato)-desaminasa D12775 (humano) Adenina, azaserina, J02811 (rata) coformicina U P-sintasa J03626 (humano) 6-azauridina, pirazofurano
IMP 5'-deshidrogenasa J04209 (hámster) Ácido micofenólico J04208 (humano) M33934 (ratón) Xantina-guanina- X00221 (E. coli) Ácido micofenólico con fosforibosiltransfe-rasa xantina limitante HGPRTasa de mutantes o J00060 (hámster) Hipoxantina, aminopterina y timidina-quinasa de mutantes M13542, K02581 timidina (HAT) (humano) J00423, M68489(ratón) 63983 (rata) 36160 (virus Herpes) Timidilato-sintetasa D00596 (humano) 5-fluorodesoxiuri-dina 3019 (ratón) L12138 (rata) 43
Como gen marcador de la selección amplificable se prefiere, de acuerdo con la invención, un gen que codifica un polipéptido con la función de DHFR, por ejemplo codifica DHFR 44
o una proteína de fusión procedente de la proteína fluorescente y -DHFR. DHFR es necesaria para la biosíntesis de puri-nas. Células que carecen del gen DHFR no pueden desarrollarse en medio deficiente en purina. Por lo tanto, el gen de DHFR es un marcador de la selección útil para la selección y amplificación de genes en células que son cultivadas en medio exento de purina. El medio de selección que se utiliza en unión del gen DHFR, es metotrexato (M X) . Por lo tanto, la presente invención incluye un método para la producción de células huésped recombinantes de alta producción, que contiene las siguientes etapas: (i) transfección de las células huésped con genes que codifican al menos una proteína de interés, una proteína fluorescente y DHFR, (ii) cultivo de las células en condiciones que posibilitan una expresión de los diferentes genes, y (iii) la amplificación de estos genes co-integrados mediante cultivo de las células en presencia de un agente de selección que permite la amplificación de al menos el gen marcador seleccionadle amplificable tal como, por ejemplo, metotrexato. Preferiblemente, las células transíectadas se cultivan en este caso en medio exento de hipoxantina/timidina en ausencia de suero y bajo la adición de concentraciones crecientes de MTX. Preferiblemente, la concentración de MTX en la primera etapa de amplificación asciende al menos a 200 nM, en una forma de realización todavía más preferida, al menos a 500 nM y puede aumentarse escalonadamente hasta 1 µ?. En un 45
caso particular, también pueden utilizarse concentraciones superiores a 1 uM. Células de mamifero, preferiblemente células de mieloma de ratón y de hámster son células huésped preferidas para el empleo de DHFR como marcador de la selección amplificable. Son particularmente preferidas las líneas de células CHO-DUKX (ATCC CRL-9096) y CH0-DG44 (Urlaub et al., 1983), ya que, condicionado por la mutación, no presentan ninguna actividad de DHFR propia. Con el fin de poder aplicar la amplificación condicionada por DHFR también en otros tipos de células, que disponen de una actividad de DHFR endógena propia, se puede utilizar en la transfección un gen DHFR mutado que codifica una proteína con una sensibilidad reducida con respecto a metotrexato (Simonson et al., 1983; Wigler et al., 1980; Haber et al. , 1982) . Producción de vectores de expresión de acuerdo con la invención La producción del vector de expresión de acuerdo con la invención puede efectuarse básicamente según métodos habitua- les y conocidos por el experto en la materia tales como, por • ejemplo, se describen en Sa brook et al. (1989) . Allí se encuentra también una descripción de los componentes funcionales de un vector, por ejemplo promotores adecuados (adicio- nalmente al promotor ubiquitina/S27a de hámster) , intensifi- cadores, señales de terminación y de poliadenilación, genes de 46
resistencia a antibióticos, marcadores de selección, puntos de iniciación de la replicación y señales de corte y empalme. Para la producción se pueden utilizar vectores de clonación habituales, por ejemplo plásmidos, bacteriófagos, fagémidos, cósmidos o vectores virales tales como baculovirus, retrovirus, adenovirus, virus asociados a adeno y virus Herpes simplex, pero también cromosomas/minicromosomas artificiales. Los vectores de expresión eucarióticos contienen típicamente también secuencias procarióticas tales como, por ejemplo, el origen de la replicación y genes de resistencia a antibióticos que posibilitan la multiplicación y selección del vector en bacterias . Es conocida una pluralidad de vectores de expresión eucarióticos que contienen múltiples puntos de clonación para la introducción de una secuencia de polinucleótidos, y algunos se pueden adquirir comercialmente en diferentes firmas tales como Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.; Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.; Promega, Madison, WI, EE.UU. o BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, EE.UU. De un modo habitual para el experto en la materia se introducen en el vector de expresión el promotor ubiquiti-na/S27a de hámster, el gen de interés, el gen que codifica una proteína fluorescente, preferiblemente también el gen marcador de la selección amplificable, por ejemplo dihidrofolato-reductasa, así como, eventualmente, elementos reguladores adicionales tales como el lugar de entrada al ribosoma interno 47
(IRES) , intensificadores o una señal de póliadenilación. Un vector de expresión de acuerdo con la invención contiene como mínimo un promotor ubiquitina/S27a, el gen de interés y el gen que codifica una proteína fluorescente. Preferiblemente, el vector de expresión contiene, además, un gen marcador de la selección amplificable. De acuerdo con la invención es en este caso también la utilización de promotores ubiquitina/S27a modificados tal y como los promotores ubiquitina/S2 a modificados descritos en la presente solicitud. Es particu-larmente preferido un vector de expresión, en el que el promotor ubiquitina, el gen de interés y el gen que codifica una proteína fluorescente están enlazados funcionalmente entre sí o se encuentran en unión funcional. En el marco de la presente descripción, la expresión "enlace funcional" o "enlazado funcionalmente" se refiere a dos o más secuencias o secuencias parciales de ácidos nucleicos que están situadas e modo que puedan ejercer su función pretendida. Por ejemplo, un promotor/intensificador está funcionalmente enlazado con una secuencia del gen codificante, cuando en posición cis puede controlar o modular la transcripción de la secuencia del gen enlazada. En general, pero no necesariamente, secuencias de ADN enlazadas funcionalmente se encuentran en estrecha vecindad y, en la medida en que se enlacen dos secuencias de genes codificantes, o en el caso de una secuencia de señal de secreción, se 48
encuentran en el mismo marco de lectura. A pesar de que un promotor enlazado funcionalmente se encuentra en general más arriba de la secuencia del gen codificante, no tiene porque ser necesariamente estrechamente vecino. Los intensificadores tampoco tienen que estar presentes en estrecha vecindad, siempre que favorezcan la transcripción de la secuencia del gen. Para este fin, pueden presentarse tanto más arriba como también más abajo de la secuencia del gen, eventualmente a cierta distancia. Un sitio de poliadenilacion está funcional-mente enlazado con una secuencia del gen cuando en el extremo 3 ' de la secuencia del gen está situado de manera que la transcripción progresa a través de la secuencia codificadora hasta la señal de poliadenilacion. El enlace puede efectuarse según métodos recombinantes habituales, por ejemplo mediante la técnica PCR, mediante ligación en puntos de corte de restricción adecuados o mediante corte y empalme. Cuando no están presentes puntos de corte de restricción adecuados, se pueden utilizar, de manera en sí conocida, enlazadores de oligonucleótidos o adaptadores sintéticos . De acuerdo con la invención, el enlace funcional no se efectúa a través de secuencias de intrones. En una de las formas de realización descritas, el promotor ubiquitina/S27a o una forma modificada del mismo, el gen de interés y el gen que codifica una proteína fluorescente están funcionalmente enlazados entre sí. Esto quiere decir, 49
por ejemplo, que tanto el gen de interés como también el gen que codifica una proteína fluorescente son expresados partiendo del mismo promotor ubiquitina/S27a o de una forma modificada del mismo. En una forma de realización particular-mente preferida, el enlace funcional se efectúa a través de un elemento IRES, de modo que por parte de los dos genes es sintetizado un ARNm bicistrónico . El vector de expresión de acuerdo con la invención puede contener adicionalmente elementos de intensificador que actúan funcionalmente sobre uno o varios promotores . Se prefiere particularmente un vector de expresión en el que el promotor ubiquitina/S27a o una forma modificada del mismo está enlazado con un elemento de intensificador, por ejemplo un intensificador de SV40 o un elemento intensificador de CMV. Básicamente, la expresión de los genes puede efectuarse dentro de un vector de expresión de una o varias unidades de transcripción. Como "unidad de transcripción" se define en este caso una región que contiene uno o varios genes a transcribir. En este caso, los genes se encuentran enlazados funcionalmente entre sí dentro de una unidad de transcripción de modo que todos los genes dentro de una unidad de este tipo se encuentran bajo el control transcripcional del mismo promotor o- promotor/intensificador . Como resultado de este enlace transcripcional de genes se puede transcribir y, por consiguiente, expresar más de una proteína o producto por 50
parte de una unidad de transcripción. En este caso, cada unidad de transcripción contiene los elementos reguladores que son necesarios para la transcripción y la traducción de las secuencias de genes contenidos en dicha unidad. Cada unidad de transcripción puede contener en este caso los mismos o diferentes elementos reguladores . Para el enlace funcional de los genes dentro de una unidad de transcripción pueden utilizarse elementos IRES o intrones . El vector de expresión puede contener una única unidad de transcripción para la expresión del gen de interés, del gen para la proteína de fluorescencia y del marcador de selección amplificable. Alternativamente, estos genes pueden estar dispuestos también en dos o más unidades de transcripción. En este caso, son posibles diferentes combinaciones de los genes dentro de una unidad de transcripción. En una forma de realización adicional de la presente invención, más de un vector de expresión, consistente en una, dos o más unidades de transcripción, puede ser introducido en una célula huésped mediante co-transfección o en transfecciones sucesivas en una secuencia arbitraria. Puede elegirse cualquier combinación de elementos reguladores y genes en cada vector, siempre que se garantice una suficiente expresión de las unidades de transcripción. En caso necesario, pueden posicionarse sobre los vectores de expresión otros elementos reguladores y genes tales como, por ejemplo, genes adicionales de interés o 51
marcadores de selección. Según lo anterior, el vector de expresión de acuerdo con la invención puede contener el gen que codifica una proteína fluorescente y el gen marcador de la selección amplificable en una o en dos unidades de transcripción separadas. Cada unidad de transcripción puede transcribir y expresar uno o varios productos génicos . Cuando están contenidos los dos genes en una unidad de transcripción, éstos se encuentran bajo el control del mismo promotor o promotor/intensificador, utilizándose preferiblemente un elemento IRES con el fin de garantizar el enlace funcional de todos los componentes. Cuando el gen que codifica una proteína fluorescente y el gen marcador de la selección amplificable están contenidos en dos unidades de transcripción separadas, éstas pueden encontrarse bajo el control del mismo o de diferentes promotores/intensi-ficadores . Preferiblemente, sin embargo, se utiliza para el gen marcador de la selección su promotor natural o un promotor heterólogo más débil, por ejemplo el promotor temprano de SV40, y tampoco se emplea preferiblemente ningún intensificador . En el marco de la invención se prefieren vectores de expresión con dos unidades de transcripción separadas. En este caso, una unidad de transcripción (bicis-trónica) contiene el gen de interés y el gen que codifica una proteína fluorescente, mientras que la otra unidad de transcripción contiene el gen marcador de la selección 52
amplificable. Preferiblemente, cada unidad de transcripción está delimitada en el extremo 3 ' por una secuencia que codifica una señal poliA, preferiblemente tk poliA, BGH poliA o SV40 poliA. Se prefieren, de acuerdo con la invención, también aquellos vectores que, en lugar del gen de interés, presentan únicamente un múltiple punto de clonación que posibilita la clonación del gen de interés a través de secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción. En el estado conocido de la técnica se conocen numerosas secuencias de reconocimiento para las más diversas endonucleasas de restricción, así como las endonucleasas de restricción pertenecientes a ellas. Preferiblemente, se utilizan secuencias que consisten en al menos 6 nucleótidos como secuencia de reconocimiento . Un listado de secuencias de reconocimiento adecuadas se encuentra, por ejemplo, en Sambrook et al., (1989) . Células huésped Para la transfección con el vector de expresión de acuerdo con la invención se utilizan células huésped eucarió-ticas, preferiblemente células de mamíferos y, en particular, células de roedores tales como líneas de células de ratón, rata y hámster. La transfección con éxito de las correspondientes células con un vector de expresión de acuerdo con la invención resulta en células transformadas genéticamente 53
modificadas, recombinantes o transgénicas , que son asimismo objeto de la presente invención. Células huésped preferidas en el marco de la invención son células de hámster tales como, por ejemplo, células BH 21, BHK TK", CHO, CH0-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX Bl y CHO-DG44 O derivados/descendientes de estas líneas de células. Son particularmente preferidas las células CHO-DG44, CHO-DUKX, CH0-K1 y BHK21, en particular células CH0-DG44 y CHO-DUKX. Son asimismo adecuadas células de mieloma del ratón, preferible-mente células NSO y Sp2/0, así como derivados/descendientes de estas líneas de células. Ejemplos de células de hámster y de ratón que pueden utilizarse de acuerdo con la invención están indicadas en la siguiente Tabla 2. Sin embargo, también derivados y descen-dientes de estas células, de otras células de mamíferos, incluidas pero no limitadas a líneas de células de seres humanos, ratón, rata, mono, roedores o células eucarióticas, incluidas pero no limitadas a células de levadura, insectos y vegetales pueden utilizarse asimismo como células huésped para la producción de proteínas biofarmacéuticas .
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Tabla 2 : Lineas de células de producción de hámster y ratón
La transfección de las células huésped eucarióticas con un polinucleótido o uno de los vectores de expresión de acuerdo con la invención se efectúa según métodos habituales (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994). Métodos de transfección adecuados son, por ejemplo, la transfección inducida por liposomas, la co-precipitación con fosfato de calcio, electroporación, transfección inducida por policatio-nes (por ejemplo DEAE-dextrano) , fusión de protoplastos , 55
microinyección e infecciones virales. De acuerdo con la invención, se lleva a cabo preferiblemente una transfección estable, integrándose las construcciones en el genoma de la célula huésped o en un cromosoma/minicromosoma artificial o estando contenidas de un modo estable episomalmente en la célula huésped. En este caso, se prefiere el método de transfección que posibilita la frecuencia de transfección y expresión óptimas del gen heterólogo en la célula huésped respectiva. Por definición, toda secuencia o todo gen que es incorporado en una célula huésped se designa, en relación con la célula huésped, como "secuencia heteróloga" o "gen heterólogo" . Incluso cuando la secuencia a incorporar o el gen a incorporar es idéntico a una secuencia endógena o a un gen endógeno de la célula huésped. Por ejemplo, un gen de actina de hámster, que se incorpora en una célula huésped de hámster es, por definición un gen heterólogo. En la producción recombinante de proteínas heterodímeras tales como, por ejemplo, anticuerpos monoclonales (acm) , la transfección de células huésped adecuadas puede efectuarse en principio de dos modos diferentes. Acms de este tipo están constituidos por varias subunidades, las cadenas pesadas y ligeras . Genes · que codifican estas subunidades pueden ser incorporados en unidades de transcripción independientes o en unidades de transcripción multicistrónicas en un iónico plásmido con el que la célula huésped es luego transfectada.
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Esto ha de asegurar la representancia estequiométrica de los genes después de la integración en el genoma de la célula huésped. No obstante, en el caso de unidades de transcripción independientes se ha de garantizar que los ARNms, que codifi-can diferentes proteínas, presenten la misma estabilidad, eficacia de transcripción y de traducción. En el segundo caso, la expresión de los genes se realiza dentro de una unidad de transcripción multicistronica por parte de un único promotor, y sólo se forma un transcrito. Mediante la utilización de elementos IRES se posibilita una iniciación de la traducción de los genes interna ciertamente eficaz en el segundo y los subsiguientes cistrones. Sin embargo, las tasas de expresión para estos cistrones son menores que la del primer cistrón, cuya iniciación de la traducción a través de un denominado complejo de pre-iniciación dependiente de "cap", es esencialmente más eficaz que la iniciación de la traducción dependiente de IRES. Con el fin de alcanzar una expresión ciertamente equimolar del cistrón, pueden introducirse, por ejemplo, además elementos intercistrónicos adicionales que procuran tasas de expresión unitarias en cooperación con los elementos IRES (documento WO 94/05785) . Otra posibilidad y preferida de acuerdo con la invención de la producción simultánea de varias proteínas heterologas es la co-transfección, en la que los genes son integrados por separado en diferentes vectores de expresión. Esto tiene la 57
ventaja de que se pueden ajustar entre sí determinadas relaciones de los genes y productos génicos, con lo cual se pueden compensar diferencias en la estabilidad del ARNm, así como en la eficacia de la transcripción y traducción. Además, los vectores de expresión, en virtud de su menor tamaño, son más estables y más fácilmente manipulables tanto en la clonación como también en la transfección. En una forma de realización particular de la invención se transfectan, preferiblemente co-transfectan las células huésped adicionalmente con uno o varios vectores con genes que codifican una o varias otras proteínas de interés . El o los vectores adicionales utilizados para la co-transfección codifican, por ejemplo, la o las otras proteínas de interés bajo el control de la misma combinación de promotor/intensificador, así como al menos otro marcador de la selección, por ejemplo neomicina-fosfotransferasa. De acuerdo con la invención, las células huésped se establecen, adaptan y cultivan preferiblemente en condiciones exentas de suero, eventualmente en medios que están exentos de proteínas/péptidos animales. Ejemplos de medios ad uiribles en el comercio son F12 de Ham (Sigma, Deisenhofen, DE) , RPMI-1640 (Sigma) , medio de Eagle modificado por Dulbecco (D EM; Sigma) , medio mínimo esencial (MEM; Sigma) , medio de Dulbecco modificado por iscove (IMDM; Sigma) , CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, Ca. , EE.UU.), CHO-S-SFMII (Invitrogen), medio CHO 58
exento de suero (Sigma) y medio CHO exento de proteínas (Sigma) . Cada uno de estos medios puede completarse eventualmente con diferentes compuestos, por ejemplo hormonas y/u otros factores de crecimiento (por ejemplo insulina, transferrina, factor de crecimiento epidemial, factor de crecimiento similar a insulina) , sales (por ejemplo cloruro de sodio, calcio, magnesio, fosfato) , tampones (por ejemplos HEPES) , nucleósidos (por ejemplo adenosina, timidina) , glutamina, glucosa u otras sustancias nutricias equivalentes, antibióticos y/o elementos traza. A pesar de que, de acuerdo con la invención se prefieren medios exentos de suero, también se pueden utilizar para el cultivo de las células huésped medios que se mezclaron con una cantidad adecuada de suero. Para la selección de células genéticamente modificadas que expresan uno o varios genes marcadores de la selección, se agrega al medio uno o varios agentes de selección adecuados . Como "agente de selección" se designa una sustancia que perjudica el crecimiento o la supervivencia de células huésped con una deficiencia para el respectivo gen marcador de la selección. Por ejemplo, para la selección en cuanto a la presencia de un gen de resistencia a antibióticos expresado tal como, por ejemplo, la neomicina-fosfotransferasa, se utiliza el antibiótico geneticina (G418) como aditivo al medio. El agente de selección puede ser también una sustancia que desencadena una amplificación del gen marcador de la 59
selección cuando en el caso del gen utilizado se trata de un marcador de selección amplificable (véase la Tabla 1) . Metotrexato es, por ejemplo, un agente de selección que es adecuado para la amplificación del gen DHFR. En la Tabla 1 están recogidos ejemplos de otros agentes de selección que desencadenan una amplificación. Un "gen marcador de la selección" es un gen que posibilita la selección específica de células que contienen este gen, mediante la adición de un correspondiente agente de selección al medio de cultivo. Con fines explicativos, se puede utilizar como gen marcador de la selección positivo un gen de resistencia a antibióticos. Únicamente las células que fueron transformadas con este gen pueden desarrollarse en presencia del correspondiente antibiótico y, por lo tanto, seleccionarse. Por el contrario, células no transformadas no pueden desarrollarse ni sobrevivir bajo estas condiciones de selección. Existen marcadores de selección positivos, negativos y bifuncionales . Marcadores de selección positivos posibilitan la selección y, con ello, el enriquecimiento de células transformadas mediante la inducción de una resistencia frente al agente de selección o mediante compensación de un defecto metabólico o catabólico de la célula huésped. En contraposición a ello, mediante marcadores de selección negativos se pueden eliminar selectivamente células que han adquirido el gen para el marcador de selección. Un ejemplo de 60
ello es el gen timidina guinasa del virus Herpes simplex, cuya expresión en células con la administración simultánea de aciclovir o ganciclovir conduce a su eliminación. Los marcadores de selección utilizados en esta invención, incluidos los marcadores de selección amplificables, incluyen imitantes y variantes modificados por tecnología genética, fragmentos, equivalentes funcionales, derivados, homólogos y fusiones con otras proteínas o péptidos, siempre que el marcador de la selección conserve sus propiedades selectivas . Derivados de este tipo presentan una homología considerable en la secuencia de aminoácidos en las zonas o dominios a los que se les atribuye la propiedad selectiva. En la bibliografía se describe una pluralidad de genes marcadores de selección, incluidos marcadores bifuncionales (positivos/negativos) (véanse, por ejemplo, los documentos O 92/08796 y O 94/28143) . Ejemplos de marcadores de selección que se utilizan habitualmente en células eucarióticas contienen los genes para aminoglicósido-fosfotransferasa (APH) , higromicina-fosfotransferasa (HYG) , dihidrofolato-reductasa (DHFR) , timidinaquinasa (TK) , glutamina-sintetasa, asparagina-sintetasa y genes que inducen resistencia frente a neomicina (G418) , puromicina, histidinol D, bleomicina, fleomicina y zeocina . Una selección de células transformadas también es posible mediante clasificación de las células activada por 61
fluorescencia (FACS) . Para ello, para la selección de células transformadas se emplean, por ejemplo, ß-galactosidasa bacteriana, marcadores de la superficie de las células o proteínas fluorescentes (por ejemplo proteína fluorescente .verde (GFP) y sus variantes de Aeguorea victoria y Renilla reniformis u otras especies, proteína roja fluorescente y proteínas de fluorescencia de otros colores y sus variantes de organismos no bioluminiscentes tales como, por ejemplo, Discosorna sp. , Anemonia e?. , Clavularia sp., Zoanthus sp.) . En la presente invención, para la selección de células huésped genéticamente modificadas (recombinantes) se prefiere como gen marcador de la selección amplificable el empleo del gen DHFR. Este marcador es particularmente bien adecuado para la selección y subsiguiente amplificación en el caso de utilizar células base DHFR-negativas tales como DHO-DG44 o CHO-DUKX, dado que estas células no expresan ninguna DHFR endógena y, por consiguiente, no se desarrollan en medio exento de purina. Por lo tanto, en este caso el gen DHFR puede emplearse como marcador de la selección dominante y las células transformadas se seleccionan en medio exento de hipoxantina/timidina. Para conseguir una amplificación del gen inducida por DHFR se emplea metotrexato (MTX) . Las propiedades de desarrollo se ven decisivamente influenciadas por la adición de MTX. En este caso, se puede observar habitualmente un esencial empeoramiento de la robustez de la fermentación de 62
las células con concentración creciente de MTX y etapa de amplificación. Sin embargo, sorprendentemente, se encontró que a través del sistema de selección de clones de acuerdo con la invención se pueden enriquecer células huésped recombinantes que muestran un comportamiento considerablemente más robusto frente a elevadas concentraciones de MTX (véase la figura 7) . Asi, se pudieron cultivar y amplificar células huésped que fueron identificadas y clasificadas con ayuda de un aparató • clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) , en presencia de 500 n , preferentemente en presencia de 1 µ? de MTX, lo que condujo a un claro aumento de la productividad. Por consiguiente, un procedimiento para la selección de células huésped de alta producción se considera como particularmente de acuerdo con la invención en el que las células huésped, que son transfectadas con un vector de expresión de acuerdo con la invención y que expresan al menos el gen de interés, la proteína fluorescente y un gen DHFR, son clasificadas a través de clasificación FACS y son sometidas al menos a una etapa de amplificación del gen en presencia de al menos 500 mM, preferiblemente 1 M de MTX. Por "robustez de la fermentación" se entiende en este caso propiedades de crecimiento de las células tales como, por ejemplo, el mantenimiento de determinadas tasas de desarrollo, la robustez frente a un " escalonamiento" (dimensionamiento mayor de los biorreactores) y el logro de elevados números de 63
células y vitalidades en la conservación de la cepa con el fin de ser acorde a las tasas de pasaje industriales en el "escalonamiento" . Expresión El término "expresión" se refiere a la transcripción y/o traducción de una secuencia del gen heteróloga en una célula huésped. En este caso, la tasa de expresión puede determinarse de forma general, en base a la cantidad del correspondiente ARNm que está presente en la célula huésped o en base a la cantidad producida de producto génico que es codificada por el gen de interés. La cantidad del ARNm generado por la transcripción de una secuencia de nucleótidos elegida puede •determinarse, por ejemplo, mediante hibridación de la mancha de Northern, protección con ARN de la ribonucleasa, híbrida- ción in situ de ARN celular o por métodos de PCR (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994). Proteínas que son codificadas por una secuencia de nucleótidos elegida pueden determinarse asimismo mediante diferentes métodos tales como, por ejemplo, mediante ELISA, transferencia de Western, radioinmu- noensayo, inmunoprecipitación, detección de la actividad biológica de la proteína o por inmunotinción de la proteína con subsiguiente análisis por FACS (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994). Con "alto nivel (tasa) de expresión", "alta expresión", "expresión reforzada" o "alta productividad" se designa la 64
expresión o síntesis constante y suficientemente elevada de una secuencia heteróloga incorporada en una célula huésped, por ejemplo de un gen que codifica una proteína terapéutica. Una expresión reforzada o elevada o un elevado nivel (tasa) de expresión o una elevada productividad se presenta cuando una célula de acuerdo con la invención es cultivada según un procedimiento de acuerdo con la invención descrito en esta memoria y cuando esta célula produce al menos más de aproximadamente 5 pg del producto génico deseado por día (5 pg/día/célula) . También se presenta una expresión reforzada o elevada o un elevado nivel (tasa) de expresión o una elevada productividad cuando la célula de acuerdo con la invención produce al menos más de aproximadamente 10 pg del producto génico deseado por día (10 pg/día/célula) . Una expresión reforzada o elevada o un nivel (tasa) de expresión elevado o una elevada productividad se presenta también en particular cuando la célula de acuerdo con la invención produce al menos más de aproximadamente 15 pg del producto génico deseado por día (15 pg/día/célula) . Una expresión reforzada o elevada o un elevado nivel (tasa) de expresión o una elevada productividad se presenta en particular cuando la célula de acuerdo con la invención produce por lo menos más de aproximadamente 20 pg del producto génico deseado por día (20 pg/día/célula) . Una expresión particularmente reforzada o elevado o un nivel (tasa) de expresión particularmente elevada o una 65
particularmente elevada productividad se presenta cuando la célula de acuerdo con la invención produce al menos más de aproximadamente 30 pg del producto génico deseado por día (30 pg/día/célula) . Una expresión elevada o reforzada, una elevada productividad o un nivel (tasa) de expresión elevado en el sentido de la presente invención puede conseguirse de diferentes maneras. Por ejemplo, mediante la co-expresión del gen de interés con un gen para un marcador de la selección amplificable se pueden seleccionar e identificar células que expresan el gen heterólogo en alta medida. El marcador de la selección amplificable posibilita en este caso no sólo la selección de células huésped transfectadas de forma estable, sino también la amplificación génica del gen heterólogo de interés . La integración de las copias adicionales de los ácidos nucleicos puede efectuarse en este caso en el genoma de las células huésped, en mini-cromosomas artificiales adicionales o en polinucleótidos localizados en el episoma. Este modo de proceder puede combinarse con una selección sustentada por FACS de células huésped recombinarítes que como otro marcador de la selección contienen, por ejemplo, una (o varias) proteínas de fluorescencia (por ejemplo GFP) o un marcador de la superficie de las células . Otros métodos para conseguir una expresión reforzada, siendo también posible una combinación de diferentes métodos, se basan por ejemplo en la utilización de 66
factores de transcripción (artificiales) , en el tratamiento de las células con agentes naturales o sintéticos para la regulación elevada de la expresión del gen endógena o heteróloga, la mejora de la estabilidad (tiempo de semivida) del ARNm o de la proteina, mejora de la iniciación de la traducción del ARNm, aumento de la dosis del gen mediante la utilización de plásmidos episomales (basados en la utilización de secuencias virales como origen de la replicación, por ejemplo de SV40, polioma, adenovirus, EBV o BPV) , empleo de secuencias fomentadoras de la amplificación (Hemann et al., 1994) o en sistemas de amplificación in vitro basados en concatámeros de ADN (Monaco et al., 1996). De acuerdo con la invención, es ventajosa una transcripción acoplada del gen de interés y del gen que codifica la proteína fluorescente. Del ARNm bicistrónico resultante se expresan tanto la proteína de interés como también la proteína fluorescente. En virtud de este acoplamiento de la expresión de la proteína de interés y de la proteína fluorescente es fácilmente posible, de acuerdo con la invención, seleccionar y aislar células huésped recombinantes de alta producción a través de la proteína fluorescente expresada, por ejemplo mediante clasificación con ayuda de un aparato clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) . La selección de células huésped recombinantes que muestran una elevada vitalidad y una tasa de expresión 67
incrementada del producto génico deseado, es un proceso de varias etapas. Las células huésped transfectadas con el vector de expresión de acuerdo con la invención o, por ejemplo, co-transfectadas eventualmente con otro vector se investigan, al menos en cuanto a la expresión del gen acoplado con el gen de interés gue codifica una proteína fluorescente, con el fin de identificar y seleccionar células/población de células que muestren las más altas tasas de expresión en proteína fluorescente. Preferiblemente, únicamente se clasifican y continúan cultivando las células que pertenecen al 10% de células con la tasa de expresión más elevada en proteína fluorescente. En la práctica, esto significa que se clasifican y se continúan cultivando el 10% más claro de las células fluorescentes. De manera correspondiente, también se pueden clasificar y multiplicar el 5% más claro, preferiblemente el 3% más claro o también únicamente el 1% más claro de las células fluorescentes de una mezcla de células . En una forma de realización particularmente preferida, únicamente se clasifican y multiplican el 0,5% más claro o bien el 0,1% más claro de las células fluorescentes. Para ello, se cultivan las células previamente transformadas con el vector de expresión de acuerdo con la invención en un medio de selección que contiene eventualmente también un agente de selección específico para el marcador de selección amplificable. En este caso, pueden utilizarse escalonadamente 68
concentraciones incrementadas de agente de selección, con el fin de ejercer una presión de selección incrementada de manera escalonada . La etapa de selección puede llevarse a cabo en agrupa-ciones de células o con agrupaciones de células/clones de células ya previamente clasificados . Se pueden llevar a cabo una o varias, preferiblemente dos o varias y, en particular tres o varias etapas de clasificación, en donde, entre las distintas etapas de clasificación, las células se cultivan y multiplican a lo largo de un espacio de tiempo determinado, por ejemplo aproximadamente dos semanas en el caso de agrupaciones . Eventualmente, las células huésped se pueden someter a una o varias etapas de amplificación del gen, con el fin de aumentar el número de copias de al menos el gen de interés y del gen marcador seleccionable y amplificable. En el documento US 5.179.017 se describen a título de ejemplo procedimientos para la amplificación escalonada del gen con ayuda de metotrexato. De acuerdo con la invención, la elevada produc-tividad alcanzable no está ligada a un número incrementado de copias del gen. Más bien es expresión de una estabilidad incrementada y de una robustez de la fermentación de los clones de alto rendimiento. Por lo tanto, es posible reducir el número de las etapas de amplificación del gen necesarias y, por ejemplo, llevar a cabo únicamente una sola amplificación 69
del gen. Según lo anterior, es de acuerdo con la invención un procedimiento para la selección de células que contiene las siguientes etapas: i) transformación de células huésped adecuadas con al menos uno de los vectores de acuerdo con la invención, incorporándose el ADN de los vectores de expresión preferiblemente de modo estable en el genoma de la célula huésped o en cromosomas/mini-cromosomas artificiales; ii) las células transformadas se cultivan en condiciones que permiten una expresión del gen de interés y de la proteína fluorescente; iii) las células se cultivan ,en presencia de al menos un agente de selección, de modo que únicamente se multiplican aquellas células que pueden desarrollarse en presencia del citado agente de selección; iv) la clasificación de células a partir de una mezcla de células que muestran la tasa de expresión más elevada de proteína fluorescente, detectándose y clasificándose las células con ayuda de un aparato clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) ; v) el cultivo de las células clasificadas con las tasas de expresión más elevadas para la proteína fluorescente. Opcionalmente, las etapas ii)-v) con las células obtenidas según la etapa v) se pueden repetir una o varias 70
veces. Además, las células transformadas pueden también someterse opcionalmente de forma adicional a una o varias etapas de amplificación del gen, cultivándolas en presencia de un agente de selección que conduce a una amplificación del gen marcador seleccionable y amplificable. Esta etapa puede efectuarse tanto con células todavía no clasificadas, como también con células ya previamente clasificadas una o varias veces . Es de acuerdo con la invención, además, un procedimiento en el que se multiplican células correspondientemente clasificadas y se utilizan para la preparación del producto génico codificante de interés. Para ello, las células seleccionadas y de alta producción se cultivan preferiblemente en un medio de cultivo exento de suero y, preferiblemente, en un cultivo en suspensión en condiciones que permiten una expresión del gen de interés . La proteína de interés se obtiene en este caso preferiblemente en forma de producto génico secretado a partir del medio del cultivo celular. En el caso de la expresión de la proteína sin señal de secreción, el producto génico puede aislarse, sin embargo, también a partir de lisados de células. Con el fin de obtener un producto homogéneo y puro, que está esencialmente exento de otras proteínas recombinantes y proteínas de células huésped, se llevan a cabo etapas de purificación habituales. Para ello, a menudo se retiran primeramente células y desechos de células 71
del medio de cultivo o lisado. El producto génico deseado puede entonces liberarse de proteínas, polipéptidos y ácidos nucleicos solubles contaminantes, por ejemplo por fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad y de intercambio de iones, precipitación con etanol, HPLC de fases inversas o cromatografía en Sephadex, sílice o resinas intercambiadoras de cationes tal como DEAE. Métodos que conducen a la purificación de una proteína heterologa expresada por células huésped recombinantes , son conocidos por el experto en la materia y están descritos en la bibliografía, por ejemplo
Harris et al. (1995) y Scopes (1988) . En lo que sigue se explica más detalladamente invención con ayuda de ejemplos de realización no limitantes
EJEMPLOS Abreviaturas AP: fosfatasa alcalina pb: pares de bases CHO: ovario de hámster chino DHFR: dihidrofolato-reductasa ELISA: ensayo de inmunosorbente unido a enzima FACS: clasificador de células activado por fluorescencia
FAP: proteína activada con fibroblastos GFP: proteína verde fluorescente HBSS: solución salina equilibrada de Hanks HT: hipoxantina/timidina 72
HRPO: peroxidasa de rábano picante IRES: sitio de entrada al ribosoma interno kb: kilobase acm: anticuerpo monoclonal TX: metotrexato PCR: reacción en cadena de polimerasa sICAM: molécula de adhesión intracelular soluble Métodos 1. Cultivo celular y transfección Las células CH0-DG44/DHFR-/- (Urlaub et al., 1983) se cultivaron permanentemente en forma de células en suspensión en medio CHO-S-SFMII exento de suero y suplementado con hipoxantina y timidina (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, DE) en frascos de cultivo celulares a 37DC en una atmósfera húmeda y 5% de CO2. Los números de células así como la viabilidad se determinaron con un contador de células CASYl (Schaerfe System, DE) o mediante tinción con azul tripan, y las células se sembraron luego en una concentración de 1-3 x 105/ml y se hicieron pasar cada 2-3 días. Para la transfección de CHO-DG44 se empleó lipofectamina más reactivo (Invitrogen GmbH) . Por cada tanda de transfección se mezclaron en este caso en total 1 µg de ADN de plásmido, 4 µ? de lipofectamina y 6 µ? de un reactivo Plus según los datos del fabricante y se añadieron en un volumen de 200 µ? a 6 x 105 células CHO-DG44 de crecimiento exponencial en 0,8 mi de medio 73
CHO-S-SFMII suplementado con HT. Después de incubación durante tres horas a 37DC en una incubadora de células, se efectuó una adición de 2 mi de medio CHO-S-SFMII suplementado con HT. Para la selección basada en DHFR de CHO-DG44 transfectadas de modo estable, las células se transfirieron 2 días después de la transfección en medio CHO-S-SFMII sin adición de hipoxantina y timidina, cambiándose el medio cada 3 a 4 días. En el caso de una selección basada en DHFR y basada en neomicina-fosfotransferasa en el caso de una có-transfección, en la que uno de los vectores de expresión contenía un marcador de selección de DHFR y el otro vector de expresión contenía un marcador de selección de neomicina-fosfotransferasa, se añadió al medio, además, G418 (Invitrogen) en una concentración de 400 g/ml. Una amplificación del gen basada en DHFR de los genes heterólogos integrados se alcanzó mediante la adición del agente de selección MTX (Sigma, Deisenhofen, DE) en una concentración de 5-2000 nM al medio CHO-S-SFMII exento de HT. 2. Vectores de expresión Para el análisis de la expresión se emplearon vectores de expresión eucarióticos que se basan en el vector pAD-CMV (Werner et al., 1998) e inducen la expresión constitutiva de un gen heterólogo a través de la combinación intensificador de CMV/promotor ubiquitina/S27a de hámster (documento WO 97/15664) . Mientras que el vector base pBID contiene el 74
minigen DHFR, que sirve como marcador de la selección amplificable (véase, por ejemplo, el documento EP 0 393 438) , en el vector pBlN el minigen DHFR ha sido reemplazado por un gen de resistencia a neomicina (figura 2) . Para ello, se aisló el marcador de selección neomicina-fosfotransferasa, incluido el promotor temprano de SV40 y la señal de poliadenilacion de TK, a partir del plásmido comercial pBK-CMV (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.) en forma de un fragmento Bsu36l de 1640 pb. Después de una reacción de relleno de los extremos del fragmento mediante ADN-polimeras de Klenow, el fragmento se ligó con el fragmento Bsu36l/Stul de 3750 pb del vector pBID que se trató asimismo con ADN-polimerasa de Klenow. En el vector base bicistronico pBIDG (figura 2) se aisló la región del gen IRES-GFP a partir del vector pIRES2-EGFP (Clontech, Palo Alto, CA, EE.UU.) y se llevó bajo el control del intensificador/promotor de CMV en el vector pBID de modo que se mantuvo conservado el lugar de clonación múltiple entre la región del promotor y el elemento IRES. En este caso, se procedió como sigue. En una mutagénesis por PCR, en donde el plásmido pIRES2-EGFP servía como plantilla, por una parte el lugar de corte de Hindlll AAGCTT dentro de la secuencia IRES se transformó mediante el empleo de cebadores mutágenos en la sucesión de secuencia ATGCTT y, por consiguiente, se retiró. Por otra parte, mediante un cebador con complementar!edad con el extremo 5' de la secuencia IRES se introdujo un lugar de 75
corte Xbal y con complementariedad con el extremo 3 ' de la secuencia GFP se introdujo un lugar de corte Spel . El fragmento de PCR resultante, que abarcaba la secuencia IRES y GFP completas, se digerió con Xbal y Spel y se clonó en el lugar de corte singular Xbal en el extremo 31 del lugar de clonación múltiple del vector pBID. El gen sICAM humano se aisló como fragmento HindIII/SalI a partir de pAD-sICAM (Werner et al., 1998) y se clonó en los correspondientes lugares de corte del vector pBIDG, resultando el vector pBIDG-sICA (figura 3) . Para la expresión del anticuerpo F19 humanizado monoclo-nal se aisló la cadena pesada en forma de un fragmento Nael/HindIIl de 1,5 kb a partir del plásmido pGlD105F19HC (NAG NESEQ: AAZ32786) y se clonó en el vector pBIDG digerido con EcoRI (rellenado con ADN-polimerasa de Klenow) y Hindlll, resultando el vector pBIDG-Fl9HC (figura 3) . Por el contrario, la cadena ligera se aisló en forma de un fragmento HindIII/EcoRI de 1,3 kb a partir del plásmido pKNl00Fl9LC (NAGENESEQ: AAZ32784) y se clonó en los correspondientes lugares de corte del vector pBIN, resultando el vector pBIN-F19LC (figura 3) . 3. FACS Los análisis citométricos de flujo y de clasificación se llevaron a cabo con un aparato Coulter Epics Altra. El FACS está equipado con un láser de helio-argón con una longitud de 76
onda de excitación de 4S8 nm. La intensidad de la fluorescencia se recoge a una longitud de onda adecuada a la proteína de fluorescencia y se procesa mediante el Software Coulter Expo32 conectado. La clasificación se llevó a cabo con una tasa de 8000-10000 sucesos/segundo. Las células suspendidas se separaron por centrifugación (5 min a 180xg) y, en HBSS, se ajustaron a una concentración de células de 1-1,5 x 10 /ml. A continuación, se efectuó una clasificación de las células correspondiente a su señal de proteína de fluorescencia. Las células se recogieron en tubitos con un medio de cultivo predispuesto, se separaron por centrifugación y, en función del número de células clasificado, se sembraron en correspondientes recipientes de cultivo. 4. ELISA Los títulos sICAM en sobrenadantes de células CHO-DG44 transfectadas de modo estable se cuantificaron mediante ELISA según protocolos convencionales (Ausubel et al., 1994, actualizado) , utilizándose dos acm específicos de sICAM desarrollados por la solicitante (por ejemplo descritos en los documento US 5.284.931 y US 5.475.091). En el caso de uno de los dos anticuerpos se trata de un anticuerpo conjugado con HRPO. Como patrón se empleó proteína sICAM purificada. La cuantificación del acm F19 en los sobrenadantes de células CH0-DG44 transfectadas de modo estable se efectuó mediante ELISA según protocolos convencionales (Ausubel et 77
al., 1994, actualizado), utilizándose por una parte un fragmento Fe de IgG anti- umana de cabra (Dianova, Hamburg, DE) y, por otra parte, un anticuerpo de cadena ligera kappa anti-humano de cabra conjugado con AP (Sigma) . Como patrón servía anticuerpo F19 purificado. En este caso, las productividades (pg/célula/día) se calcularon con la fórmula pg/ ( (Ct-Co)t/ln (Ct-Co) ) , indicando Co y Ct el número de células en la siembra o en la recolección y t la duración del cultivo. Ejemplo 1 : Comparación de la actividad del promotor de CMV y ubiguitina/S27a de hámster Con el fin de comparar la actividad del promotor ubiquitina/S27a de hámster con la del promotor CMV utilizado frecuentemente en vectores de expresión eucarióticos, células CHO-DG44 se transfectaron con diversos vectores recombinantes . El producto génico heterólogo, por una parte una enzima lisosomal, por otra parte un anticuerpo IgGl, se expresó en este caso bajo el control del promotor CMV o bajo el del promotor ubiquitina/S27a de hámster. En este caso, los dos promotores estaban funcionalmente enlazados con el intensifi-cador de CMV. Como señal de terminación para el gen heterólogo se utilizó la BGH poliA. Los vectores de expresión que contenían el promotor de CMV, se basaron en este caso en un vector pcDNA3 ("CMV1", Invitrogen) modificado o en el vector pBluescript ("CMV2", Stratagene) y codificaban adicionalmente el marcador de selección amplificable dihidrofolato-reductasa.
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El vector de expresión con el promotor del hámster se basa, por el contrario, en el vector p )-CVM (Werner et al., 1998). Para la expresión de la cadena pesada y ligera del anticuerpo se llevó a cabo una co-transfección con un segundo vector que contenía un gen de resistencia a neomicina como marcador de la selección. El intensificador de CMV puede reemplazarse, sin embargo, también por el intensificador de SV40. Mediante dilución limitante en placas de 96 pocilios' se seleccionaron y aislaron después de la transfeccion clones de células en medio exento de HT (en el caso de la co-transfec-ción, adición todavía de 400 µg/ml de G418) . Los clones de células con la productividad más alta en relación con la proteína recombinante se sometieron a una amplificación del gen escalonada basada en DHFR mediante incremento escalonado de la concentración de metotrexato de 5 nM a lo largo de 50 nM, 500 nM hasta 2 µ?, en cada caso ligado con una clonación de dilución. En cada etapa de amplificación se eligieron en este caso aproximadamente 20 a 30 clones con la productividad en cada caso más alta. En general, el promotor del hámster se manifestó con un rendimiento más intenso. Tanto en el caso de la expresión de la enzima lisosomal como también de la expresión del anticuerpo se alcanzaron productividades o títulos que se encontraban en un factor 2 a 5 más alto que en el caso de células en las que el gen heterólogo se expresó bajo el 79
control del promotor de CMV. En la figura 1 se representan a título de ejemplo los títulos relativos y las productividades específicas relativas de los clones celulares en cada caso mejores en la respectiva etapa de amplificación, establecién-dose como 1 la expresión basada en el promotor de CMV para el respectivo gen heterólogo (CMV1 para la enzima lisosomal, CMV2 para el anticuerpo) . Ejemplo 2 : Aislamiento de células sICAM de alta expresión mediante clasificación FACS basada en GFP La forma soluble de la molécula de adhesión ICAMl intercelular, sICAM, es un posible agente terapéutico en el caso de enfriamientos, ya que compite con el receptor de ICAM por la unión de rinovirus y, de este modo, puede reducir o incluso impedir su interacción con el receptor de ICAM, premisa para su entrada en las células y su subsiguiente infección (Bella et al., 1999; Marlin et al., 1990). sICAM se eligió como ejemplo para la expresión de una proteína de cadena sencilla (480 aminoácidos) en células CHO. Para ello, se transfectaron CHO-DG44 con pBIDG-SICAM (figura 3) . La expresión adicional de GFP en células transfectadas con pBIDG-sICAM posibilitó la aplicación de una estrategia de selección basada en FACS. La proteína terapéutica sICAM y GFP se expresaron en este caso conjuntamente por una unidad de transcripción bicistrónica, y la DHFR por una unidad de transcripción separada. Dos a tres semanas después de la 80
primera selección en medio CHO-S-SFMII exento de HT, se separó por clasificación el 5% de las células con la fluorescencia de GFP más elevada. Después de un cultivo durante aproximadamente dos semanas se aisló de nuevo el 5% de las células con la fluorescencia de GFP más elevada. En conjunto, esta clasificación secuencial se llevó a cabo seis veces. En este caso, pudo demostrarse una buena correlación entre la productividad de sICAM y la fluorescencia de GFP (figura 4) . Sólo mediante la selección sustentada por FACS, sin ninguna etapa de amplificación con TX, se aislaron de este modo en un tiempo brevísimo agrupaciones de células con elevadas productividades específicas de hasta 16 pg/célula/día (figura 5) . Mediante la combinación de la selección basada en GFP con una única etapa de amplificación con MTX subsiguiente era incluso posible un aumento de la productividad a más de 30 pg/célula/día (figura 6) . Estas productividades se alcanzaron tanto en el caso de una amplificación de una agrupación después de la cuarta clasificación con 500 nM de MTX como también en la amplificación de una agrupación después de la sexta clasificación con 2 µ? de MTX. En contraposición a una amplificación escalonada, en la que, por norma general, se comienza con concentraciones de MTX muy pequeñas en el intervalo de 5-20 nM de MTX, hubo que emplearse aquí, para conseguir un efecto de amplificación, una concentración de MTX mayor desde el principio. Así, a partir de la adición de 5 a 81
50 nM de X a células procedentes de la cuarta clasificación o bien de 500 nM a células procedentes de la sexta clasificación no resultó ningún aumento significativo de la productividad (figura 6) . Evidentemente, el nivel en DHFR presente en las agrupaciones de partida era ya tan elevado que sólo con una elevada dosis de MTX se pudo alcanzar una inhibición completa por DHFR. Además, las agrupaciones de células previamente clasificadas superaron a pesar de la elevada dosis de MTX inicial, la fase de selección mucho mejor, es decir en un tiempo más breve se obtuvo de nuevo una población de células con elevada vitalidad que en el caso de la estrategia de amplificación del gen escalonada convencional (figura 7). Ejemplo 3: Aislamiento de células con elevada expresión del acm F19 mediante clasificación por FACS basada en GFP En una co-transfección se transíectaron células CHO-DG44 con la combinación de plásmidos pBIDG-Fl9HC y pBIN-Fl9LC (figura 3) . El anticuerpo F19 humanizado expresado está dirigido en este caso contra la molécula superficial FAP que es sintetizada por fibroblastos reactivos del estroma (véase para ello también la patente EP 0 953 639) . En las configuraciones de vector empleadas, las dos cadenas de proteínas del anticuerpo son expresadas en cada caso por un vector propio que codifica adicionalmente un marcador de la selección DHFR o de neomicina-fosfotransferasa en una unidad de transcripción 82
separada. Adi ionalmente, en el vector pBIDG-Fl9HC está contenido otro marcador de selección, la GFP. Mediante el enlace transcripcional de la expresión de la GFP y de la cadena pesada mediante un- elemento IRES, en la co-transfección de CH0-DG44 con los vectores pBIDG-Fl9HC/pBIN-Fl9LC se pudieron aislar en corto tiempo células con una elevada expresión del anticuerpo F19 únicamente seleccionando las células con un elevado contenido en GFP mediante clasificación por FACS secuencial. Para ello, después de una selección durante dos a tres semanas de las agrupaciones de células transfectadas en medio CHO-S-SFMII exento de HT, con adición de 400 ug/ml de G418 se separó por clasificación mediante FACS el 5% de las células con la fluorescencia de GFP más elevada. Esta clasificación se llevó a cabo en total hasta seis veces, existiendo entre cada clasificación un período de cultivo de aproximadamente 2 semanas. Sorprendentemente, en este caso se pudo demostrar una buena correlación entre la productividad de F19 y la fluorescencia por GFP (figura 8), a pesar de que las dos cadenas de proteínas fueron expresadas en cada caso por un vector propio y en la clasificación por FACS basada en GFP además solo se pudo realizar la selección en cuanto a la expresión de la cadena pesada, condicionado por su acoplamiento transcripcional con GFP. Las productividades pudieron aumentarse hasta 10 pg/célula/día (figura 9) y aumentarse todavía en promedio a 37 pg/célula/día mediante una 83
única etapa de amplificación por TX subsiguiente, partiendo de la agrupación de células de la quinta clasificación, mediante la adición de 1000 nM de MTX al medio de selección. Datos equiparables pudieron alcanzarse también en el caso de un enlace funcional del promotor de hámster con el intensificador de SV40 en lugar del intensif cador de CMV. Al mismo tiempo, con ello pudo también reducirse a la mitad, hasta aproximadamente 120 días, el tiempo de desarrollo para la selección de células altamente productoras en comparación con una estrategia de amplificación del gen escalonada convencional que, por norma general abarca 4 etapas, lo que va acompañado de una reducción significativa de las capacidades y los costes del desarrollo. BIBLIOGRAFÍA Adam, M.A. et al . , J Virol 1991, 65, 4985 - 4990
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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.