KR20050085203A

KR20050085203A - 발현 벡터, 이종성 유전자 생성물의 제조 방법 및 고생산성재조합 세포의 선별 방법

Info

Publication number: KR20050085203A
Application number: KR1020057009693A
Authority: KR
Inventors: 바르바라 에넨켈; 위르겐 피더; 랄프 오토; 슈테파노스 그라마티코스
Original assignee: 베링거 잉겔하임 파르마 게엠베하 운트 코 카게
Priority date: 2002-11-29
Filing date: 2003-11-25
Publication date: 2005-08-29
Also published as: BR0316510A; CA2507714A1; TWI321152B; AR042244A1; WO2004050879A1; CN1717486A; MXPA05005482A; KR100820035B1; EP1567648A1; TW200502388A; DE10256083A1; AU2003292102A1; JP2006507829A

Abstract

본 발명은 햄스터 유비퀴틴/S27a 프로모터에 기능적으로 결합된 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자 및 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 진핵 세포용 발현 벡터에 관한 것이다. 바람직하게, 당해 발현 벡터는 또한 증폭가능한 선별 마커 유전자를 포함한다. 또한 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 세포 및 이종성 유전자 생성물을 제조하는 방법 및 고생산성 세포를 선별하는 방법에 관한 것이다.

Description

발현 벡터, 이종성 유전자 생성물의 제조 방법 및 고생산성 재조합 세포의 선별 방법{Expression vector, methods for the production of heterologous gene products, and selection method for high-producing recombinant cells}

본 발명은 고생산성 재조합 세포의 선별 방법, 이종성 유전자 생성물의 제조 방법 및 발현 벡터 및 이것으로 형질감염되고 이들 과정에 사용될 수 있는 숙주 세포에 관한 것이다.

포유동물 세포는 해독후 진행되는 변형이 기능적으로 및 약리역학적으로 둘다 사람과 화합성인 복잡한 생물약제학적 단백질의 제조를 위해 바람직한 숙주 세포이다. 시판되는 관련 세포 유형은 하이브리도마, 골수종 CHO(차이니즈 햄스터 난소) 세포 및 BHK (베이비 햄스터 신장) 세포이다. 당해 숙주 세포의 배양은 무혈청 및 단백질 부재 조건하에 수행하는 추세에 있다. 그러한 이유는 부수적으로, 비용을 절감하고 재조합 단백질의 정제시 방해요소를 감소시키며 병원체(예를 들어, 프리온 및 바이러스)가 도입될 가능성을 감소시키기 위한 것이다. 숙주 세포로서 CHO 세포의 사용은 이들 세포가 무혈청 및 단백질 부재 배지에서 현탁 성장하는데 적합하고 규제 기관이 안전한 생산 세포로서 받아들이고 있기 때문에 보다 널리 보급되고 있다.

목적하는 이종성 유전자를 발현하는 안정한 포유동물 세포주를 작제하기 위해, 이종성 유전자는 일반적으로 선별 마커 유전자(예를 들어, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제)와 함께 바람직한 세포주로 형질감염에 의해 삽입된다. 이종성 유전자 및 선별 마커 유전자는 단일 벡터 또는 동시형질감염되는 별도의 벡터들에 의해 발현될 수 있다. 형질감염시킨 후 2 내지 3일째에, 세포를, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제-유전자를 사용하는 경우 G418과 같은 선별제를 함유하는 배지로 옮기고 이들 선별 조건하에 몇주동안 배양한다. 출현하는 내성 세포를 이어서 분리할 수 있고 목적하는 유전자 생성물의 발현을 조사한다. 숙주 세포 게놈으로 무작위로 비방향적으로 통합된 결과로서, 완전히 상이한 비율로 이종성 유전자를 발현하는 세포 집단을 수득한다. 이들은 또한 선별 마커가 발현되지만 목적하는 유전자를 발현하지 않는 비발현 세포를 포함할 수 있다. 따라서 목적하는 이종성 유전자의 발현이 매우 높은 세포 클론을 동정하기 위해서는 다수의 클론을 조사하고 시험할 필요가 있고 이는 시간 소모적이면서 많은 노동과 비용을 초래한다.

유전자 증폭은 재조합 생물약제학적 단백질을 제조하는데 사용되는 동물 세포 배양에서 보편화된 작업이다. 유전자 증폭은 다수의 포유동물 세포주의 본래 상대적으로 낮은 생산성을 급격하게 개선시킨다. 광범위하게 사용되는 하나의 증폭 기술은 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 계열의 유전자 증폭 시스템이고 이는 DHFR-결핍 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에 매우 흔히 사용된다. DHFR-결핍 CHO 세포, 예를 들어, CHO-DUKX(ATCC CRL-9096) 또는 CHO-DG44(문헌참조: Urlaub et al., 1983)을 DHFR 및 목적하는 단백질을 암호화하는 적합한 벡터 시스템으로 형질감염시킨다. 이어서, 형질감염체를 글라이신, 하이포산틴 및 티미딘 부재의 배지에서 선별한다. 증폭 및 이에 따른 고생산성 세포주의 확립은 디하이드로폴레이트 리덕타제의 억제제(문헌참조: Kaufman et al., 1982; 미국 특허 제4,656,134호)인 메토트렉세이트(MTX)를 점진적으로 첨가함에 의해 성취된다. 이어서 수득되는 고생산성 세포의 선별은 또한, 기회 원칙에 적용되고 개연성을 기준으로 하여 이러한 선별 단계의 결과는 고도로 노동 집약적이고 시간 소모적이다.

유전자 형질전환 및 발현을 보다 우수하고 신속하게 모니터하기 위한 모든 종류의 방법이 개발되었다. 이들 방법은 무엇보다, 클로로람페니콜-아세틸트랜스퍼라제, 루시퍼라제, β-갈락토시다제 또는 β-갈락토시다제 또는 루시퍼라제의 암호화 영역을 포함하는 융합 단백질과 같은 리포터 분자의 사용을 포함한다. 이들 리포터 유전자 분석의 단점은 세포가 고정되거나 용해되어야만 하고 외부에서 기질 및 조인자를 첨가하여 배양되어야만 한다는 것이다. 따라서, 분석된 세포의 추가의 배양은 불가능하다. 이. 콜리 효소 β-갈락토시다제의 동시 발현을 기본으로 하는 보다 최근의 방법은 실질적으로 용해된 세포가 FACS 장치(문헌참조: Nolan et al., 1988)를 사용하여 분류될 수 있도록 하지만 세포에 형광성 기질을 부과하기 위해서는 저장성 전처리가 요구된다. 당해 형광성은 FACS를 사용한 분류전에 억제되어야만 한다.

아에쿠오레아 빅토리아(Aequorea victoria) 기원의 유전자 형광성 단백질(GFP) 및 이로부터 개발된 GFP 돌연변이를 리포터 분자로서 도입함으로써 이종성 유전자를 발현하는 세포를 동정하기가 훨씬 수월해졌다. GFP의 동시 발현은 생체내 실시간 분석을 가능하게 하고 추가의 기질 또는 조인자를 첨가할 필요 없이 이의 형광성을 기초로 형질감염체를 분류할 수 있도록 한다. 유전자 전달을 모니터하기 위한 리포터 분자로서의 GFP의 사용은 다양한 공보에 기재되어 있다. 챨피(Chalfie)등의 미국 특허 제5,491,084호 및 제6,146,826호는 목적하는 단백질을 발현하는 세포를 선별하는 방법을 기재하고 있다. 이러한 방법은 목적하는 단백질에 대한 암호화 서열을 함유하는 DNA 분자와 GFP-유전자를 함유하는 제2 DNA 분자로 세포를 동시 형질감염시킴을 포함한다. 이어서, GFP-발현 세포를 선별한다. 구빈(Gubin et al. 1997)등은 선택적 성장 조건의 부재하에서 CHO 세포에서의 GFP 발현 안정성을 연구하였다. 당해 세포는 GFP 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 둘다를 함유하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 모세(Mosser et al. 1997)등은 GFP 및 표적 유전자(목적하는 유전자로서 또한 공지됨) 둘다를 암호화하는 이시스트론성(bicistronic) 발현 카세트를 함유하는 플라스미드를 사용하여 유도성 생성물을 발현하는 세포를 동정하고 선별하였다. 표적 유전자는 조절 프로모터의 통제하에 있다. GFP와 표적 유전자 발현은 바이러스 IRES(내부 리보솜 진입 부위) 요소를 사용하여 커플링시켜 이의 결과로서 GFP와 목적하는 단백질을 암호화하는 이시스트론성 mRNA를 발현시켰다. 사용되는 플라스미드 자체는 임의의 선별 마커 유전자를 함유하지 않는다. 따라서, 동시 형질감염 또는 후속 형질감염으로 제2 플라스미드가 도입된다. 대조적으로, 레벤슨(Levenson et al. 1998)은 목적하는 유전자가 IRES 서열 전방에 클로닝될 수 있는 이시스트론성 발현 카세트를 갖는 레트로바이러스 벡터를 사용하였다. 한편 IRES 서열 후방의 서열은 G418, 푸로마이신, 하이그로마이신 B, 히스티디놀 D 또는 플레오마이신에 대한 내성을 부여하는 선별 마커 유전자를 암호화하거나 GFP이다.

벡터는 또한 피코르나 바이러스 계열 기원의 IRES 요소, 생성물 유전자와 선별 마커 유전자 사이에 위치하는 IRES 요소를 함유하는 것으로 이미 보고되었다[문헌참조: Pelletier et al., 1988; Jang et al., 1989; Davies et al., 1992].

GFP는 또한 성공적으로 내성 마커 유전자와 융합되었다. 예를 들어, 베넷(Bennett et al. 1998)은 GFP/제오마이신 융합 단백질을 기술하고 있다. 이러한 이작용성 선별 마커는 형질감염된 포유동물 세포를 동정하고 선별하는데 성공적으로 사용되었다. 한편, 프리미그(Primig et al. 1988)등은 이의 인핸서 연구를 위해 GFP와 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 융합 단백질을 사용하였다.

멘(Meng et al. 2000)등에 의한 공보 및 국제 특허원 WO 제01/04306호에서는 목적하는 유전자가 단일 벡터 기원의 증폭가능한 선별 마커 유전자 DHFR과 GFP 유전자와 함께 발현되는 발현 시스템을 사용하여 재조합 단백질의 발현이 높은 세포를 선별하고 동정하였다. 3개의 유전자는 하나의 전사 단위로 조합되거나 2개의 단위로 분할된다. 단일 발현 벡터내에 모든 3개의 유전자를 당해 공간적 및 전사적으로 연결시키는 것은 선별 압력하에 동시 증폭의 가능성을 증가시켜 고생산 클론을 동정하고 선별하고자 하는 것이다. 증폭가능한 DHFR 선별 마커와 GFP 기초 FACS 분류를 수단으로 조합된 선별 방법을 사용하여 분리된 가장 우수한 클론은 1일 세포당 3 내지 4.5pg 이하 정도로 목적하는 단백질을 발현시켰다. 실험은 접착 세포와 함께 혈청 함유 배지에서, 즉, 실질적으로 보다 강력하고 기본적 생산성이 보다 높은 것으로 공지된 조건하에서 세포와 함께 수행하였다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 따라서, 하기의 요구조건을 충족시키는, 생산성이 높은 재조합 세포에 대한 선별 시스템을 개발하는 것이다:

(1) 생물약제학적 단백질을 생산하는 고생산성 세포를 개발하는데 소요되는 시간을 단축시킴과 동시에 개발 비용 절감;

(2) 저비용으로 능력에 대해 고생산성 세포를 선별하기 위한 고속 처리;

(3) 예를 들어, 증가된 메토트렉세이트 농도에서 예를 들어, 성장의 손상이 저하된 것으로 나타나는 "발효-왕성한" 고생산성 세포의 사용;

(4) 바람직하게는 무혈청 배지에서 현탁에 적합한 세포의 형질감염, 선별 및 배양;

(5) 요구되는 유전자 증폭 단계의 단축.

본 발명의 추가의 목적은 당해 클론 선별 시스템에 사용될 수 있는 발현 벡터 및 이것으로 형질감염된 숙주 세포 뿐만아니라 당해 숙주 세포를 사용한 이종성 유전자 생성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

당해 목적은, 본 발명의 한 측면에 따라, 햄스터 유비퀴틴/S27a 프로모터 및 형광성 단백질을 암호화하는 유전자에 기능적으로 연결된 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자(이후부터 또한 "목적하는 유전자"로서 언급됨)를 함유하는 발현 벡터를 사용하여 성취된다.

발현 벡터는 바람직하게, 또한 증폭가능한 선별 마커 유전자, 예를 들어, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)을 함유한다. 바람직한 발현 벡터는 또한 기타 조절 요소들, 예를 들어, 프로모터와 기능적으로 연결된 인핸서를 함유한다. 추가로, 발현 벡터는 또한 바람직하게 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 함유하여 형광성 단백질을 암호화하는 유전자와 목적하는 유전자를 이시스트론성으로 발현시킨다.

본 발명은 또한 목적하는 유전자 대신 당해 유전자의 도입을 위한 다중 클로닝 부위, 즉 제한 엔도뉴클레아제에 대한 다중 절단 부위를 갖는 서열 영역을 갖는 기본 벡터에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 언급된 발현 벡터중 하나로 형질감염된 숙주 세포에 관한 것이다. 이들은 진핵 숙주 세포, 바람직하게는, 포유동물 세포이고 햄스터 세포 및 특히, CHO 세포 또는 BHK 세포와 같은 설치류 세포가 특히 바람직하다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포가 유전자 생성물을 발현시키는 조건하에 배양되고 당해 유전자 생성물이 배양물 또는 배양 배지로부터 분리되는, 이종성 유전자 생성물의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 하나의 특정 양태에서, 숙주 세포는 본 발명에 따른 발현 벡터 및 추가로 목적하는 하나 이상의 기타 단백질을 암호화하는 유전자들을 갖는 하나 이상의 벡터로 형질감염되고, 바람직하게는 동시 형질감염된다.

이와 관련하여, 본 발명은 이종이량체성 단백질의 상이한 서브유니트를 암호화하는 발현벡터로 형질감염된 당해 종류의 숙주 세포가 이종이량체성 단백질을 발현시키는 조건하에 배양되고 당해 이종이량체성 단백질이 배양물 또는 배양 배지로부터 분리되는, 이종이량체성 단백질의 제조 방법을 제공한다. 당해 방법에 대한 한가지 특정 응용은 항체 및 이의 서브유니트를 제조하는 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포 집단을 목적하는 단백질 및 형광성 단백질을 발현시키는 조건하에 배양하고 가장 높은 비율로 형광성 단백질을 발현시키는 세포 또는 세포들을 동정하고/하거나 선별하는, 목적하는 단백질을 발현시키는 숙주 세포를 선별하는 방법에 관한 것이다. 당해 선별은 형광 활성화된 세포 분류기(FACS)를 사용하여 수행된다.

놀랍게도, 본 발명에 따라 제공된 시스템을 사용하여, 유전자 증폭 단계 없이 매우 단시간내에 1일당 및 세포당 재조합 단백질을 15pg(단일쇄 단백질) 또는 10pg(사람화된 항체) 이상의 평균 비생산성(specific productivity)으로 발현시키는 세포 풀을 분리시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 비생산성은 단일 DHFR를 기초로한 유전자 증폭 단계에 의해 1일 세포당 30pg 이상으로 증가될 수 있다. 따라서 세포 풀에서 성취된 생산성은 지금까지 8 내지 10의 계수로 보고된 최상의 클론의 최대 생산성보다 높다.

놀랍게도, 목적하는 단백질과 형광성 단백질의 발현간에는 또한 매우 양호한 연관성이 있다. 이것은 심지어, 발현된 항체에서와 같이, 2개의 면역글로불린 쇄가 각각 그들 자신의 벡터로 발현되고 FACS 분류에서, 형광성 단백질과 전사적으로 커플링되어 있기때문에 하나의 쇄의 발현에 대해 선별될 수 있는 동시 형질감염의 경우에도 사실이다. 형광성 단백질의 고발현율은 세포의 성장 및 생존성 어떠한 것에도 부정적 효과를 갖지 않는다. 추가로, 고생산성 세포를 선별하기 위한 개발 시간은 통상적인 단계적 유전자 증폭 전략과 비교하여 절반 이상 절약될 수 있고 이는 개발 능력 및 비용을 상당히 감소시킨다.

도 1은, 이종성 유전자 생성물이 CMV 프로모터의 통제하에 또는 햄스터-유비퀴틴/S27a 프로모터의 통제하에서 발현되는 재조합 세포 클론들로부터 수득되는 발현 수준을 비교한 것이다. 2개의 프로모터는 기능적으로 CMV 인핸서에 연결되어 있고 종결 서열인 BGH 폴리 A는 모든 경우에 동일하다. CMV¹의 경우에, 발현 벡터는 pcDNA3 계열(Invitrogen, Kalsruhe, DE)이고 CMV²의 경우에는 p블루스크립트 계열 발현 벡터(Stratagene, La Jolla, CA, US)이고 CHO의 경우에는 pAD-CMV-계열 발현 벡터(Werner et al., 1998)이다. 리소좀 효소의 발현에서, 모든 발현 벡터는 증폭가능한 선별 마커 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)를 포함하고 이종성 유전자의 발현은 메토트렉세이트(MTX)를 사용한 후속 증폭 단계에 의해 증가된다. 2개의 쇄의 항체(Ab)를 발현하기 위해, 동시-형질감염은 선별 마커로서 네오마이신-내성 유전자를 포함하는 제2 벡터로 수행되었다. 수득되는 역가 또는 비생산성은 1로 설정된 CMV 프로모터 기본 발현에 대해 주어진 것이다(효소에 대해서는 CMV¹, Ab에 대해서는 CMV²).

도 2는 CHO-DG44 세포에서 재조합 단백질을 발현시키는데 사용되는 기본 벡터를 도시한 것이다. "P/E"는 CMV 인핸서와 햅스터-유비퀴틴/S27a 프로모터의 조합이다. "P" 자체는 프로모터 요소를 지적하고 "T"는 전사된 mRNA의 폴리아데닐화를 위해 필요한 전사 종결 시그날이다. 각각의 전사 단위체내에서 전사 개시 부위 및 방향은 화살표로 나타낸다. 이종성 유전자를 클로닝하기 위해, 제한 엔도뉴클레아제에 대한 다중 절단 부위(다중 클로닝 부위-mcs)를 갖는 서열 영역은 프로모터 요소 후방에 삽입된다. 증폭가능한 선별 마커 디하이드로폴레이트 리덕타제는 "dhfr"로 축약되고 선별 마커 네오마이신 포스포트랜스퍼라제는 "neo"로 축약된다. 뇌신근염 바이러스 기원의 "IRES" 요소는 이시스트론성 전사 단위체내에 내부 리보솜 진입 부위로서 작용하여 하기의 녹색 형광 단백질 "GFP"를 해독시킬 수 있다.

도 3은 생물약제학적 단백질을 암호화하고 CHO-DG44 세포를 형질감염시키는데 사용된 진핵 발현 벡터를 도시한 것이다. "P/E"는 CMV 인핸서 및 햄스터-유비퀴틴/S27a 프로모터의 조합이고 "P" 자체는 프로모터 요소를 지적하고 "T"는 전사된 mRNA의 폴리아데닐화를 위해 필요한 전사 종결 시그날이다. 각각의 전사 단위체내에서 전사 개시 부위 및 방향은 화살표로 나타낸다. 증폭가능한 선별 마커 디하이드로폴레이트 리덕타제는 "dhfr"로 축약되고 선별 마커 네오마이신 포스포트랜스퍼라제는 "neo"로 축약된다. 뇌신근염 바이러스 기원의 "IRES" 요소는 이시스트론성 전사 단위체내에 내부 리보솜 진입 부위로서 작용하여 하기의 녹색 형광 단백질 "GFP"를 해독시킬 수 있다. "sICAM"은 가용성 세포내 접착 분자를 암호화하는 반면(미국 특허 제5,412,216호) "F19HC" 및 "F19LC"는 각각 사람화된 항체 F19의 중쇄 및 경쇄를 암호화한다(유럽 특허 제953 639호).

도 4는 특정 예로서 세포 풀 ZB1을 선택하여 sICAM 생산성과 GFP 형광성간의 상관관계를 보여준다. 당해 세포 풀은, 치료학적 단백질 sICAM과 GFP이 이시스트론성 전사 단위체에 의해 공동으로 발현되는 벡터 pBIDG-sICAM로 형질감염시켜 수득된다. 풀은 GFP를 기초로 한 FACS 연속 분류에 적용된다. 각각의 분류 단계 후, 풀의 세포 뱅양 상등액중의 sICAM의 농도는 ELISA로 측정하고 1일 세포당 비생산성(pg/c^*d)을 계산한다. 각각의 데이타는 3회 이상 배양한 것에 대한 평균값이다. 총 6개의 분류를 수행한다.

도 5는 특정 예로서 세포 풀 ZB1을 선택하여 GFP를 기초로 하는 FACS 분류에 의한 고발현성 sICAM 세포의 분리를 보여준다. 당해 세포 풀은 치료학적 단백질 sICAM과 GFP이 이시스트론성 전사 단위체에 의해 공동으로 발현되는 벡터 pBIDG-sICAM로 형질감염시켜 수득된다. 풀은 GFP를 기초로 한 FACS 연속 분류에 적용된다. 각각의 분류 단계 후, 풀의 세포 뱅양 상등액중의 sICAM의 농도는 ELISA로 측정하고 1일 세포당 비생산성(pg/c^*d)을 계산한다. 각각의 데이타는 3회 이상 배양한 것에 대한 평균값이다. 총 6개의 분류를 수행한다.

도 6은 특정 예로서, 세포 풀 ZB1을 선택하여, MTX 증폭 단계와 GFP를 기초로 한 선별 방법과 조합하여 성취된 sICAM 생산성의 증가를 보여준다. 벡터 pBIDG-sICAM으로 형질감염시켜 수득된 당해 세포 풀은 GFP를 기초로 한 FACS 분류에 적용된다. 4회 분류 및 6회 분류 후, DHFR 매개 유전자 증폭은 메토트렉세이트(MTX)를 배양 배지(5nM, 50nM, 500nM 또는 2μM MTX)에 첨가하여 수행한다. 풀의 세포 배양 상등액중의 sICAM의 농도는 ELISA로 측정하고 1일 세포당 비생산성(pg/c^*d)을 계산한다. 각각의 데이타는 3회 이상의 배양을 수행한 것에 대한 평균값이다.

도 7은 상이한 용량의 메토트렉세이트를 배양 배지에 첨가한 후 세포 풀의 생존 패턴을 보여준다. 벡터 pBIDG-sICAM으로 형질감염시켜 수득한 세포 풀 ZB1(도 3)은 GFP를 기초로 한 FACS 연속 분류에 적용한다. 4회 및 6회 분류 후, DHFR 매개 유전자 증폭은 메토트렉세이트(MTX)를 배양 배지에 첨가하여 수행한다. 세포 수 및 생존성은 선별 단계동안에 트립탄 블루로 염색하여 측정하고 수일에 걸쳐 배양물에서 모니터한다.

도 8은 특정 예로서 세포 풀 ZB1을 선택하여, 항체 생산성(mAb F19)와 GFP 형광성간의 상관관계를 보여준다. 당해 세포 풀은 pBIDG-F19HC와 pBIN-F19LC의 벡터 조합으로 형질감염시켜 수득된다. 당해 풀은 GFP를 기초로 한 FACS 분류에 적용된다. 각각의 분류 후, 풀의 세포 배양 상등액에서 항체 F19의 농도는 ELISA로 측정하ㅗ 1일 세포당 비생산성(pg/c^*d)을 계산한다. 각각의 데이타는 3회 이상 배양한 것에 대한 평균 값이다. 총 6개의 분류를 수행한다.

도 9는 특정 예로서 세포 풀 ZB1을 선택하여 FACS를 사용하는 GFP를 기초로 하는 선별법에 의해 고발현성 mAbF19 세포 풀의 분리를 보여준다. 벡터 pBIDG-F19HC와 pBIN-F19LC로 동시 형질감염시켜 수득한 당해 세포 풀(도 3)은 GFP를 기초로 한 FACS 연속 분류에 적용한다. 풀의 세포 배양 상등액중의 항체 F19의 농도는 각각의 분류 후 ELISA로 측정하고 1일 세포당 비생산성(pg/c^*d)을 계산한다. 각각의 데이타는 3회 이상 배양한 것에 대한 평균 값이다.

본 발명에 따른 발현 벡터는 햄스터 유비퀴틴/S27a 프로모터에 기능적으로 연결된 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자("목적하는 유전자") 및 형광성 단백질을 암호화하는 유전자를 포함한다. 바람직하게, 발현 벡터는 또한 증폭가능한 선별 마커 유전자를 포함한다.

햄스터-유비퀴틴/S27a 프로모터

햄스터의 유비퀴틴/S27a 프로모터는 WO 97/15664에 기재된 강력한 상동성 프로모터이다. 당해 프로모터는 바람직하게 하기의 특징중 적어도 한 특징을 갖는다: GC-풍부 서열 영역, Sp1 결합 부위, 폴리피리미딘 요소, TATA 박스의 부재. 특히, Sp1 결합 부위를 갖지만 TATA 박스를 갖지 않는 프로모터가 바람직하다. 또한, 항상성으로 활성화되고 혈청 함유, 저농도 혈청 및 무혈성 세포 배양 조건하에서도 균등하게 활성인 프로모터가 바람직하다. 또 다른 양태에서, 유도성 프로모터, 특히, 혈청을 제거하여 활성화되는 프로모터가 있다.

특히 유리한 양태는 WO 97/15664의 도 6에 도시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 프로모터이다. 도 5의 -161번 내지 -45번의 서열을 포함하는 프로모터 서열이 특히 바람직하다.

당해 특허 명세서 각각의 실시예에서 사용된 프로모터는 첨부된 서열 목록의 서열번호 1의 1923번 내지 2406번의 서열을 갖는 DNA 분자를 포함한다. 당해 서열은 WO 97/15664의 도 5로부터 단편 -372번 내지 +111번에 상응하고 바람직한 프로모터이다. 즉 바람직한 프로모터는 당해 서열 영역이 도입된 것이어야만 한다. 또 다른 적합한 프로모터 단편은 2134번 내지 2406번의 서열(WO 97/15664의 도 5에서 -161번 내지 +111번에 상응함)을 포함한다. 2251번 내지 2406번의 서열만을 포함하는 프로모터는 더 이상 기능성이 아니다. 프로모터 서열은 2134번으로부터 출발하여 5' 방향으로 연장될 수 있다.

또한, 예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실에 의해 변형된, 서브단편의 완전환서열의 기능성 돌연변이/변이체 뿐만 아니라 완전한 햄스터 유비퀴틴/S27a 프로모터 서열의 기능성 서브단편을 사용할 수 있다. 상응하는 서브단편, 돌연변이 또는 변이체는 또한 이후에 "변형된 프로모터"로서 언급된다.

임의로, 기타 조절 요소들과 조합된 변형된 프로모터는 바람직하게, 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열 1923번 내지 2406번(WO 97/15664의 도 5에 기재된 -372번 내지 +111번)의 프로모터 단편의 활성에 상응하는 전사 활성을 갖는다. 변형된 프로모터는 이것이 비교 리포터 유전자 분석에서 1923번 내지 2406번 단편(-372번 내지 +111번의 단편)의 활성을 기준으로 활성이 50% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 및 가장 바람직하게는 100% 이상인 전사활성을 갖는 경우, 본 발명의 목적을 위해 유용한 것으로 입증된다. 특히, 햄스터 유비퀴틴/S27a 프로모터의 야생형 서열 서열번호 1과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상 및 가장 바람직하게는 97%이상의 최소 서열 상동성을 갖고 비교 리포터 유전자 분석에서 상응하는 프로모터 활성을 갖는 변형된 프로모터가 바람직하다.

상응하는 비교 리포터 유전자 분석에서, 참조 서열을 포함하는, 시험될 프로모터 단편은 예를 들어, 루시퍼라제, 분비된 알칼린 포스파타제 또는 녹색 형광성 단백질(GFP)를 암호화하는 프로모터 부재 리포터 유전자의 전방에 클로닝된다. 이들 작제물(프로모터 서열 + 리포터 유전자)을 이어서, 형질감염에 의해 시험 세포, 예를 들어, CHO-DG44에 도입하고 미지의 프로모터 단편에 의한 리포터 유전자 발현의 유도는 리포터 유전자의 단백질 함량을 측정함에 의해 측정한다. 상응하는 시험은 예를 들어, 문헌[참조: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1994, updated]에 기재되어 있다.

햄스터 유비퀴틴/S27a 프로모터 및 변형된 프로모터의 프로모터 서열은 또한 예를 들어, 5' 비해독되는 영역 또는 이의 선택된 단편 및 유비퀴틴/S27a 유전자 또는 이의 선택된 단편의 암호화 영역을 포함할 수 있고 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994]에 기재된 바와 같은 다양한 표준 방법을 사용하여 WO 97/15664에 기재된 바와 같은 서열을 인지하는 당업자에 의해 수득될 수 있다. WO 97/15664에 기재된 서열로부터 개시하여, 예를 들어, 적합한 단편이 선택될 수 있고 당해 단편 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열은 화학적으로 합성될 수 있다. 당해 부류의 프로브는 예를 들어, 햄스터 게놈의 라이브러리로부터 하이브리드화함에 의해 유비퀴틴/S27a 유전자 또는 5' 비해독 영역 또는 이의 다른 단편을 클로닝하는데 사용될 수 있다. 상기된 리포터 유전자 분석을 사용하여, 당업자는 큰 노력 없이 프로모터-활성 단편을 동정하고 본 발명의 목적을 위해 이들을 사용할 수 있다. 5' 비해독 영역 또는 이의 특정 단편은 게놈 DNA 또는 게놈 라이브러리 기원의 상응하는 프라이머를 사용하여 PCR을 증폭시킴으로써 용이하게 수득될 수 있다. 5' 비해독 영역의 단편은 또한 보다 큰 DNA 단편으로부터 제한 엔도뉴클레아제 III 분해에 의해 수득될 수 있다. 당해 DNA 분자는 또한 화학적으로 합성된 단편을 연결시켜 화학적으로 합성되거나 제조될 수 있다.

결실, 삽입 및 치환 돌연변이는 "부위-특이적 돌연변이 유발" 및/또는 "PCR 기본 돌연변이 유발 기술"에 의해 생성될 수 있다. 상응하는 방법은 예를 들어, 추가의 참조와 함께 문헌[참조: Lottspeich and Zorbas 1998 Chapter 36.1]에 기재되어 있다.

햄스터 유비퀴틴/S27a 유전자의 5' 비해독 영역 또는 햅스터 유비퀴틴 S27a 유전자 기원의 프로브와 교차 하이브리드화 시킴에 의해, 바람직하게는 기타 포유동물 종의 상응하는 상동성 유전자로부터 적합한 프로모터 서열을 동정하고 분리할 수 있다. 적합한 기술은 문헌[참조: Lottspeich and Zorbas 1998 Chapter 23]에서 예를 통해 기재되어 있다. 유전자는, 이들의 뉴클레오타이드 서열이 상동성 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상 및 가장 바람직하게는 97% 이상 일치하는 경우 본 발명의 목적을 위해 "상동성"이다.

목적하는 유전자

본 발명에 따른 발현 벡터에 포함되는 목적하는 유전자는 목적하는 생성물을 암호화하는 임의의 길이의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 유전자 생성물 또는 "목적하는 생성물"은 일반적으로 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 이의 단편 또는 유도체이다. 그러나, 이것은 또한 RNA 또는 안티센스 RNA일 수 있다. 목적하는 유전자는 전장, 단축된 형태, 융합 유전자 또는 표지된 유전자로서 존재할 수 있다. 이는, 게놈성 DNA 또는 바람직하게 cDNA 또는 융합체의 상응하는 단편일 수 있다. 목적하는 유전자는 순수한 유전자 서열이거나 돌연변이되거나 달리 변형될 수 있다. 당해 변형은 특정 숙주 세포 및 사람화에 적용하기 위한 코돈 최적화를을 포함한다. 목적하는 유전자는 예를 들어, 분비되는 세포질 핵 위치된 막 결합 또는 세포 표면 결합 폴리펩타이드를 암호화한다.

용어 "뉴클레오타이드 서열" 또는 "핵산 서열"은 일본쇄 또는 이본쇄로서 존재하고 유전자의 암호화 쇄 또는 비암호화 쇄일 수 있는 게놈 또는 합성 오리진의 DNA 또는 RNA 뿐만 아니라 이의 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편을 의미한다. 핵산 서열은 부위 특이적 돌연변이 유발 또는 PCR 매개 돌연변이 유발[예를 들어, 문헌(참조: Sambrook et al., 1989 또는 Ausubel et al., 1994)]과 같은 표준 기술을 사용하여 변형될 수 있다.

암호화란 기타 중합체 및 거대 분자, 예를 들어, 생물학적 과정에서 rRNA, tRNA, mRNA, 기타 RNA 분자, cDNA 또는 폴리펩타이드의 합성을 위해 매트릭스로서 작용하는, 염색체내 유전자 또는 mRNA와 같은 핵산내 특정 서열의 뉴클레오타이드의 성질 또는 능력을 의미한다. 따라서, 유전자는, 목적하는 단백질이 mRNA의 전사 및 이어서 해독에 의해 세포 또는 기타 생물학적 시스템내에서 제조되는 경우 단백질을 암호화한다. 핵산 서열이 mRNA 서열과 동일하고 또한 일반적으로 서열 정보은행에 주어진 암호화 쇄, 예를 들어, EMBL 또는 진뱅크(GenBank) 및 전사를 위한 매트릭스로서 작용하는 유전자 또는 cDNA의 비암호화쇄는 생성물 또는 단백질을 암호화하는 것으로서 언급될 수 있다. 단백질을 암호화하는 핵산은 또한 축퇴성 유전자 코드를 기준으로상이한 정도의 뉴클레오타이드 서열을 갖지만 단백질의 아미노산 서열이 동일한 핵산을 포함한다. 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 또한 인트론을 포함할 수 있다.

용어 cDNA는 mRNA 또는 유전자로 부터 생성된 기타 RNA 기원의 제2 DNA 쇄의 역전사 및 합성에 의해 제조되는 데옥시리보핵산을 의미한다. cDNA가 이본쇄 DNA 분자로서 존재하는 경우, 암호화 및 비암호화 쇄 둘다를 포함한다.

용어 인트론은 임의의 길이의 비암호화 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이들은 천연적으로, 수많은 진핵 유전자에 존재하고 스플라이싱으로서 공지된 과정에 의해 이전에 전사된 mRNA 전구체로부터 제거된다. 이것은 5' 및 3' 말단에서 인트론이 정확하게 절단되고 수득한 mRNA가 정확히 연결되어 성공적인 단백질 합성을 위해 정확한 판독 프레임을 갖는 성숙한 가공된 mRNA가 생성되어야만 한다. 당해 스플라이싱 과정에 관여하는 많은 스플라이싱 공여체 및 스플라이싱 수용체 부위, 즉, 엑손-인트론 또는 인트론-엑손 접촉면에 위치한 서열의 특징이 분석되었다[문헌참조: Ohshima et al., 1987].

목적하는 단백질

생물약제학적으로 중요한 단백질/폴리펩타이드는 예를 들어, 항체, 효소, 사이토킨, 림포킨, 접착 분자, 수용체 및 이의 유도체 또는 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 효능제 또는 길항제로서 작용하고/하거나 치료학적 또는 진단학적 용도를 갖는 모든 폴리펩타이드는 가치가 있다.

용어 "폴리펩타이드"는 아미노산 서열 또는 단백질에 대해 사용되고 임의의 길이의 아미노산 중합체를 언급한다. 당해 용어는 또한 당화, 인산화, 아세틸화 또는 단백질 가공과 같은 반응에 의해 해독후 변형된 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드의 구조는 이의 생물학적 활성을 유지하면서 예를 들어, 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입 및 기타 단백질과 융합으로 변형될 수 있다.

치료학적 단백질의 예는 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자, 사람 성장 호르몬(hGH) 및 기타 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화인자(tPA), 에리트로포이에틴(EPO), 사이토킨, 예를 들어, 인터류킨(IL), 예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 인터페론(IFN)-알파, -베타, -감마, -오메가 또는 -타우, 종양 괴사인자(TNF), 예를 들어, TNF-알파, 베타 또는 감마, TRAIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 및 VEGF이다. 기타 예는 모노클로날, 폴리클로날, 다중특이적 및 단일쇄 항체 및 이의 단편, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')₂, Fc 및 Fc' 단편, 면역글로불린 경쇄(L) 및 면역글로불린 중쇄(H) 및 이의 불변, 가변 또는 초가변 영역 뿐만 아니라 Fv 및 Fd 단편이다(문헌참조: Chamov et al., 1999). 항체는 사람 또는 사람외 기원일 수 있다. 사람화된 항체 및 키메라 항체가 또한 가능하다.

Fab 단편(단편 항원 결합 = Fab)은 서로 인접한 불변 영역에 의해 유지되고 있는 양 쇄의 가변영역으로 이루어진다. 이들은 예를 들어, 파파인과 같은 프로테아제로 처리하거나 DNA 클로닝에 의해 통상적인 항체로부터 제조될 수 있다. 기타 항체 단편은 펩신으로 단백질 분해에 의해 제조될 수 있는 F(ab')₂ 단편이다.

또한 유전자 클로닝에 의해, 단지 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL)로 이루어진 단축된 항체 단편을 제조할 수 있다. 이들은 Fv 단편(가변 단편 = 가변 부분의 단편)으로서 공지되어 있다. 불변 쇄의 시스테인 그룹을 통한 공유 결합은 이들 Fv 단편에서 가능하지 않기 때문에, 이들은 흔히, 몇몇 기타 방법에 의해 안정화된다. 이러한 목적을 위해, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 흔히 약 10 내지 30개 아미노산, 바람직하게는 15개의 아미노산의 단축 펩타이드 단편에 의해 함께 연결되어 있다. 이것은 VH 및 VL이 펩타이드 링커에 의해 함께 연결된 단일 폴리펩타이드 쇄를 생성시킨다. 당해 항체 단편은 또한 단일 쇄 Fv 단편(scFv)로서 언급된다. scFv 항체의 예는 공지되어 있고 예를 들어, 문헌[참조: Huston et al., 1988]에 기재되어 있다.

과거에, 다량체성 scFv 유도체를 제조하기 위한 다양한 전략이 개발되어 왔다. 이의 의도는 약리역학적 성질이 개선되고 결합력(avidity)이 증가된 재조합 항체를 제조하는 것이다. scFv 단편의 다량체화를 성취하기 위해, 이들은 다량체화 도메인을 갖는 융합 단백질로서 제조된다. 다량체화 도메인은 예를 들어, IgG의 CH3 영역 또는 류신 지퍼 도메인과 같은 헬릭스 구조("나선형 고리 구조")일 수 있다. 또 다른 전략에서, scFv 단편의 VH와 VL 영역간의 상호작용은 다량체화(예를 들어, 이특이적 항체 단편, 삼특이적 항체 단편 및 오특이적 항체 단편)를 위해 사용된다.

기술분야에 사용되는 용어 이특이적 항체 단편은 2가의 동종이량체 scFv 유도체를 지칭한다. scFv 분자내 펩타이드 링커가 5 내지 10개의 아미노산으로 단축되면 VH/VL 쇄가 서로 포개지면서 동종이량체를 형성한다. 이특이적 항체 단편은 추가로, 삽입된 디설파이트 브릿지에 의해 안정화될 수 있다. 이특이적 항체 단편의 예는 문헌[참조: Perisic et al., 1994]에서 찾을 수 있다.

용어 "소형 항체 단편"은 당해 기술 분야에서 2가의 동종 이량체 scFv 유도체를 언급하는데 사용된다. 이는 이량체화 영역으로서 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 가장 바람직하게는 IgG1의 CH3 영역을 포함하는 융합 단백질로 구성된다. 이것은 또한 힌지 영역을 통해 IgG의 scFv 단편과 링커 영역을 연결시킨다. 당해 소형 항체 단편의 예는 문헌[참조: Hu et al., 1996]에 기재되어 있다.

용어 "삼특이적 항체 단편"은 당해 기술 분야에서 3가의 동종 삼량체 scFv 유도체를 언급하는데 사용된다(문헌참조: Kortt et al., 1997). 링커를 사용하지 않고 VH VL을 직접 융합시켜 삼량체를 형성한다.

소형 항체로서, 2가, 3가 또는 4가의 구조를 갖는 당해 기술분야에 공지된 단편은 또한 scFv 단편의 유도체이다. 2가, 3가 또는 4가의 나선형 고리 구조를 통해 다량체화된다[문헌참조: Pack et al., 1993 and 1995; Lovejoy et al., 1993].

형광 단백질을 암호화하는 유전자

본 발명에 따른 발현 벡터는 햄스터-유비퀴틴/S27a 프로모터, 변형된 햄스터-유비퀴틴/S27a 프로모터 또는 이의 유사체의 조절하에 목적하는 유전자와 기능적으로 연결된 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 포함한다.

형광 단백질은 예를 들어, 녹색, 청녹색, 청색, 황색 또는 기타 색상의 형광 단백질일 수 있다. 하나의 특정 예는 아에쿠오레아 빅토리아 또는 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis) 및 이들로부터 생성된 돌연변이체로부터 수득한 녹색 형광 단백질(GFP)이다[문헌참조: Bennet et al., 1998; Chalfie et al., 1994; WO 01/04306 및 본원에 인용된 문헌].

이들을 암호화하는 기타 형광 단백질 및 유전자는 본원에 참조로서 인용된 WO 00/34318, WO 00/34326, WO 00/34526 및 WO 01/27150에 기재되어 있다. 이들 형광 단백질은 안토조아(Anthozoa) 종의 비-생발광 유기체, 예를 들어, 아네모니아 마야노(Anemonia majano), 클라불라리아 종(Clavularia sp)., 조안투스 종 I(Zoanthus sp. I), 조안투스 종 II(Zoanthus sp. II), 디스코소마 스트리아타(Discosoma striata), 디스코소마 종(Discosoma sp). "레드", 디스코소마 종 "그린", 디스코소마 종. "마겐타(Magenta)", 아네모니아 슐카타(Anemonia sulcata)의 형관단이다.

본 발명에 따라 사용되는 형광 단백질은 천연 야생형 단백질 또는 유전학적으로 조작된 돌연변이체 및 변이체 뿐만 아니라 예를 들어, 기타 단백질 또는 펩타이드와 융합된 유도체 또는 변이체를 포함한다. 사용되는 당해 돌연변이체는 예를 들어, 여기 또는 방출 스펙트럼, 형광단의 형성, 흡광 계수 또는 단백질의 안정성을 변화시킬 수 있다. 더욱이, 포유동물 세포 또는 기타 종에서의 발현은 코돈의 최적화에 의해 개선될 수 있다. 본 발명에 따라, 형광 단백질은 또한 선별 마커, 바람직하게는, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)과 같은 증폭가능한 선별 마커와 융합하여 사용될 수 있다.

형광 단백질에 의해 방출되는 형광은 예를 들어, 형광 활성화된 세포 분류기(FACS)를 갖는 유체통과 세포측정기 또는 형광 현미경에 의한 단백질의 검출을 가능하게 한다.

기타 조절 요소들

햄스터-유비퀴틴 27a 프로모터는 기능적으로 기타 조절 서열과 조합되어 발현 카세트내에서 전사 활성을 증가시키거나/조절할 수 있다.

예를 들어, 프로모터는 인핸서 서열과 기능적으로 연결되어 전사 활성을 증가시킬 수 있다. 이를 위해, 하나 이상의 인핸서 및/또는 여러 카피수의 인핸서 서열, 예를 들어, CMV 또는 SV40 인핸서를 사용할 수 있다.

용어 인핸서는 시스 위치에서 프로모터의 활성에 작용함에 따라서 당해 프로모터에 기능적으로 연결된 유전자의 전사를 자극하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 프로모터와는 다르게, 인핸서의 효과는 위치 및 배향과 무관하여 따라서 인트론 또는 심지어 암호화 영역내의 전사 단위체의 전방 또는 후방에 위치할 수 있다. 인핸서는 전사 단위체에 바로 인접한 영역 및 프로모터와 상당히 이격된 영역 모두에 위치할 수 있다. 또한, 물리적으로 및 기능적으로 프로모터와 중복될 수 있다. 당업자는 독립적인 요소로서 또는 폴리뉴클레오타이드 서열내에 클로닝된 요소로서 가용한(예를 들어, ATCC에 기탁되어 있거나 상업적 공급원 및 개인 공급원)다양한 공급원으로부터 다수의 인핸서(진뱅크)와 같은 정보은행에 기탁된 인핸서, 예를 들어, SV40 인핸서, CMV 인핸서, 폴리오마 인핸서, 아데노바이러스 인핸서)를 인지할 것이다. 다수의 프로모터 서열은 또한 흔히 사용되는 CMV 프로모터와 같은 인핸서 서열을 포함한다. 사람 CMV 인핸서는 지금까지 동정된 것중에서 가장 강력한 인핸서중 하나이다. 유도성 인핸서의 한 예는 글루코코르티코이드 또는 중금속에 의해 자극될 수 있는 메탈로티오네인 인핸서이다.

또 다른 가능한 변형은 예를 들어, 다중 Sp1 결합 부위의 도입이다. 프로모터 서열은 또한 전사 활성을 통제하고 조절하는 조절 서열과 조합될 수 있다. 이것은 예를 들어, 상향 또는 하향 조절 전사 인자에 대한 결합 부위인 서열과 연결시켜 수행될 수 있다. 상기 언급된 전사 인자 Sp1은 예를 들어, 전사 활성에 양성 효과를 갖는다. 또 다른 예는 전사에 양성적으로 및 음성적으로 모두 작용할 수 있는 활성화 단백질 AP1에 대한 결합 부위이다. AP1의 활성은 모든 종류의 인자, 예를 들어, 성장 인자, 사이토킨 및 혈청에 의해 통제될 수 있다[문헌참조: Faisst et al., 1992 및 본원에 인용된 참조문헌]. 전사 효율은 또한 하나 이상의 염기의 치환, 삽입 똔느 결실에 의한 돌연변이에 의해 프로모터 서열을 변화시킴에 이어서 리포터 유전자 분석에서 이것이 프로모터 활성을 증가시키는지의 여부를 결정함에 의해 증가될 수 있다.

기본적으로, 추가의 조절 요소들은 햄스터-유비퀴틴/S27a 프로모터 이외의 프로모터, 인핸서, 종결 및 폴리아데닐화 시그날을 포함한다. 유도성 및 항상성 조절 서열은 다양한 세포 유형에서 공지되어 있다. "전사-조절 요소들"은 일반적으로 발현될 유전자 서열의 프로모터 업스트림, 전사 개시 및 종결 부위 및 폴리아데닐화 시그날을 포함한다.

용어 프로모터는 유전자들을 전사시키고 이를 통제하는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이와 기능적으로 결합된 서열을 언급한다. 프로모터는 RNA 폴리머라제에 결합하기 위한 인지 서열 및 전사를 위한 개시 부위(전사 개시 부위)를 포함한다. 특정 세포 유형 또는 숙주 세포에서 목적하는 서열을 발현하기 위해, 적합한 기능성 프로모터가 선택되어야만 한다. 당업자는 항상성, 유도성 및 억제성 프로모터를 포함하는, 다양한 공급원 기원의 다양한 프로모터에 친숙할 것이다. 이들은 예를 들어, 진뱅크와 같은 정보은행에 기탁되고 분리된 요소들 또는 상업적 공급원 또는 개인 공급원으로부터의 폴리뉴클레오타이드 서열내에 클로닝된 요소들로서 수득될 수 있다. 유도성 프로모터에서, 프로모터의 활성은 시그날에 응답하여 감소되거나 증가될 수 있다. 유도성 프로모터의 한 예는 테트라사이클린(tet) 프로모터이다. 이것은 테트라사이클린 조절된 트랜스활성화 단백질(tTA)에 의해 유도될 수 있는 테트라사이클린 작동인자 서열(tetO)을 포함한다. 테트라사이클린 존재하에, tTA의 tetO로의 결합은 억제된다. 기타 유도성 프로머터의 예는 jun, fos, 메탈로티오네인 및 열 쇼크 프로모터(문헌참조: Sambrook et al., 1989; Gosen et al., 1994)이다. 진핵 세포에서 고발현용으로 특히 적합한 프로모터중에는 예를 들어, SV40 어얼리 프로모터, 아데노바이러스 메이져 레이트 프로모터, 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터, 라우스 사코마 바이러스의 장 말단 반복 영역 및 사람 사이토메갈로바이러스의 어얼리 프로모터가 있다. 기타 이종성 포유동물 프로모터의 예는 액틴, 면역글로불린 또는 열 쇼크 프로모터이다.

용어 "전사 개시 부위"는 1차 전사체(즉, mRNA 전구체)에 삽입된 제1 핵산에 상응하는 작제물내 핵산을 언급한다. 전사 개시 부위는 프로모터 서열과 중복될 수 있다.

용어 "전사 종결 부위"는 전사될 유전자 부분 또는 목적하는 유전자의 3' 말단에 정상적으로 존재하여 RNA 폴리머라제에 의한 전사 종결을 일으키는 뉴클레오타이드 서열을 언급한다.

"폴리아데닐화 시그날"은 진핵 mRNA의 3' 말단에서 특정 부위를 절단시키고 절단된 3' 말단에 약 100 내지 200개의 아데닌 뉴클레오타이드(폴리A 테일)의 서열을 해독후 도입하는 시그날 서열이다. 폴리아데닐화 시그날 서열은 절단 부위의 약 10 내지 30 뉴클레오타이드 업스트림에 위치한 서열 AATAAA 및 다운스트림에 위치한 서열을 포함한다. tk 폴리A, SV40 레이트 및 어얼리 폴리A 또는 BGH 폴리A(예를 들어, 미국 특허 제5,122,458호에 기재된 바와 같음)와 같은 다양한 폴리아데닐화 요소들이 공지되어 있다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 각각의 전사 단위체는 전사 종결 요소 뿐만 아니라 프로모터 또는 프로모터/인핸서 요소, 목적하는 유전자 및/또는 마커 유전자를 갖는다. 또 다른 바람직한 양태에서, 전사 단위체는 2개의 추가의 해독 조절 단위체를 포함한다.

"해독 조절 요소들"은 발현될 각각의 폴리펩타이드에 대한 해독 개시 부위(AUG), 종료 코돈 및 폴리A 시그날을 포함한다. 최적의 발현을 위해, 발현될 핵산 서열의 5' 및/또는 3' 비해독 영역을 제거하거나 부가하거나 변화시켜 전사 또는 발현 단계에서 발현에 영향을 미칠 수 있는 임의의 잠재적으로 비적합한 추가의 해독 개시 코돈 또는 기타 서열들을 제거할 필요가 있을 수 있다. 발현을 촉진시키기 위해, 리보솜 보존성 결합 부위는 또한 개시 코돈의 바로 업스트립에 삽입될 수 있다. 분비된 폴리펩타이드를 생산하기 위해, 목적하는 유전자는 일반적으로 합성된 폴리펩타이드를 ER 막으로 및 ER을 통과하도록 수송하는 시그날 전구체 펩타이드를 암호화하는 시그날 서열을 포함한다.

시그날 서열은 흔히 분비된 단백질의 아미노 말단에 위치하지만 항상 그러한 것은 아니고 단백질이 ER 막을 통해 삽입된 후 시그날 펩티다제에 의해 절단된다. 유전자 서열은 일반적으로 자신의 시그날 서열을 포함하지만 반드시 그러한 것은 아니다. 천연 시그날 서열이 존재하지 않는 경우, 이종성 시그날 서열이 공지된 방식으로 도입될 수 있다. 이러한 종류의 많은 시그날 서열들이 당업자에게 공지되어 있고 진뱅크 및 EMBL과 같은 서열 정보 은행에 기탁되어 있다.

본 발명에 따른 한가지 중요한 조절 요소는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)이다. IRES 요소는 독립적으로 유전자의 5'말단 메틸구아노시늄 캡(CAP 구조) 업스트림의 해독 개시를 기능적으로 활성화시키고 동물 세포에서는 단일 전사체로부터 2개의 시스트론(개방 판독 프레임)을 해독하는 서열을 포함한다. IRES 요소는 바로 다운스트림에 위치하는 개방 판독 프레임의 해독을 위한 독립적인 리보솜 진입 부위를 제공한다. 다시스트론성(multicistron), 즉, mRNA에 의해 차례로 해독되는 많은 상이한 폴리펩타이드 또는 생성물을 암호화할 수 있는 세균성 mRNA와는 대조적으로, 동물 세포 기원의 다수의 mRNA는 일원성이고 단지 하나의 단백질 또는 생성물을 암호화한다. 진핵 세포에서 다시스트론성 전사체의 경우, 해독은, 업스트림에 가장 근접되어 있는 해독 개시로부터 개시되고 제1 종료 코돈에 의해 종료되며 이후에 전사체는 리보솜으로부터 방출된다. 따라서, mRNA에 의해 암호화된 단지 하나의 폴리펩타이드 또는 생성물이 해독동안에 생산된다. 대조적으로, 전사체에서 제2 또는 후속 개방 판독 프레임과 기능적으로 연결된 IRES 요소를 갖는 다시스트론성 전사체는 다운스트림에 위치한 개방 판독 프레임을 후속적으로 해독하여 동일한 전사체에 의해 암호화된 2개 이상의 폴리펩타이드 또는 생성물이 진핵 세포에서 생산된다.

IRES 요소는 길이 및 공급원이 다양할 수 있고 예를 들어, 뇌신근염 바이러스(EMCV) 또는 기타 피코르나 바이러스로부터 기원할 수 있다. 벡터이 작제에 있어서 다양한 IRES 서열 및 이들의 용도는 문헌[참조: Pelletier et al., 1988; Jang et al., 1989; Davies et al., 1992; Adam et al., 1991; Morgan et al., 1992; Sugimoto et al., 1994; Ramesh et al., 1996; Mosser et al., 1997]에 기재되어 있다.

다운스트림에 위치한 유전자 서열은 기능적으로 IRES 요소의 3' 말단에 기능적으로 연결되는데 즉, 유전자의 발현이 영향받지 않거나 단지 최소로 영향받거나 의도된 목적을 위해 충분히 발현될 수 있는 공간이 선택된다. 충분한 발현을 위한 IRES 요소와 이의 다운스트림에 위치한 유전자의 개시 코돈사이의 최적의 허용가능한 거리는 공간을 다양화하고 리포터 유전자 분석을 사용한 공간의 함수로서 발현율을 측정함에 의해 측정될 수 있다.

상기 방법에 의해, 이종성 유전자 생성물의 발현을 위해 유효한 최적의 발현 카세트를 수득할 수 있다. 하나 이상의 상기 방법을 수단으로 수득된 발현 카세트는 따라서 본 발명의 추가의 과제이다.

증폭가능한 선별 마커 유전자

본 발명에 따른 바람직한 벡터는 증폭가능한 마커 유전자를 증폭시키고 바람직하게는 햄스터-유비퀴틴/S27a 유전자, 목적하는 유전자 및 형광 단백질에 대한 유전자로 이루어진 전사 단위체를 동시 증폭시키는 증폭가능한 선별 마커 유전자를 포함한다. 이를 위해, 상응하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포는 적합한 선별 제제의 존재하에 배양하여 적어도 증폭가능한 선별 마커 유전자의 많은 유전자 카피를 갖는 숙주 세포들만이 증식할 수(증식될 수) 있도록 한다. 바람직하게, 이것은 증가하는 양의 선별 제제의 존재하에 세포를 단계적으로 배양하여 성취된다.

증폭 가능한 마커 유전자는 일반적으로 특정 배양 조건하에 진핵 세포의 성장에 필요한 효소를 암호화한다. 예를 들어, 증폭가능한 선별 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)를 암호화할 수 있다. 이 경우에, 유전자는, 형질감염된 숙주 세포가 선별 제제인 메토트렉세이트(MTX)의 존재하에 배양되는 경우 증폭된다.

하기의 표 1은 기타 증폭가능한 선별 마커 유전자 및 본 발명에 따라 사용될 수 있는 연합된 선별 제제에 대한 예를 제공하고 문헌[참조: Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-566(1990)]에 기재되어 있다.

본 발명에 따라 사용되는 증폭 가능한 선별 마커 유전자는 바람직하게, DHFR의 기능을 갖는 폴리펩타이드, 예를 들어, DHFR 또는 형광 단백질과 DHFR의 융합 단백질을 암호화하는 유전자이다. DHFR은 퓨린의 생합성을 위해 필요하다. DHFR 유전자가 부재인 세포는 퓨린 결핍 배지에서 성장할 수 없다. DHFR 유전자는 따라서, 퓨린 부재 배지에서 배양된 세포에서 유전자를 선별하고 증폭시키기 위해 유용한 선별 마커이다. DHFR 유전자와 연계하여 사용되는 선별 배지는 메토트렉세이트(MTX)이다. 따라서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 고생산성 재조합 숙주 세포를 제조하는 방법을 포함한다: (i) 목적하는 단백질, 형광 단백질 및 DHFR을 하나 이상 암호화하는 유전자로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계; (ii) 다양한 유전자를 발현시키는 조건하에 세포를 배양하는 단계 및 (iii) 하나 이상의 증폭가능한 선별 마커 유전자를 증폭시키는 메토트렉세이트와 같은 선별 제제의 존재하에 세포를 배양하여 동시 통합된 유전자를 증폭시키는 단계. 바람직하게, 형질감염된 세포는 혈청의 부재하에 증가하는 농도의 MTX의 첨가와 함께 하이포산틴/티미딘 부재 배지에서 배양한다. 바람직하게, 제1 증폭 단계에서 MTX의 농도는 200nM 이상이고 보다 바람직한 양태에서, 이것은 500nM 이상이고 단계적으로 1μM까지 증가될 수 있다. 각각의 경우, 1nM 이상의 농도가 사용될 수 있다.

포유동물 세포, 바람직하게는 마우스 골수종 및 햄스터 세포는 증폭가능한 선별 마커로서 DHFR을 사용하기 위해 바람직한 숙주 세포이다. 세포주 CHO-DUKX(ATCC CRL-9096) 및 CHO-GD44(Urlaub et al., 1983)는 특히, 이들 자신이 돌연변이의 결과로서 어떠한 DHFR 활성을 갖지 않기 때문에 바람직하다. 뿐만 아니라 자신의 내인성 DHFR 활성을 갖는 기타 세포 유형에서 DHFR 유도된 증폭을 사용할 수 있기 위해서는, 형질감염 과정에 메토트렉세이트에 대한 감수성이 감소된 단백질을 암호화하는 돌연변이된 DHFR 유전자를 사용할 수 있다[문헌참조: Simonson et al., 1983; Wigler et al., 1980; Haber et al., 1982].

본 발명에 따른 발현 벡터의 작제

본 발명의 발현 벡터는 이론적으로 예를 들어, 문헌[참조: Sambrook et al. (1989)]에 기재된 바와 같이 당해 기술 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 샘브룩(Sambrook)은 또한 벡터의 기능성 성분, 예를 들어, 적합한 프로모터(햄스터 유비퀴틴/S27a 프로모터에 추가로), 인핸서, 종결 및 폴리아데닐화 시그날, 항생제 내성 유전자, 선별 마커, 복제 개시점 및 스플라이싱 시그날을 기재하고 있다. 인공 염색체/소형 염색체 뿐만 아니라 플라스미드, 박테리오파아지, 파지미드, 코스미드 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 바쿨로바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연합 바이러스 및 헤르페스 심플렉스 바이러스)와 같은 통상적인 클로닝 벡터는 이들을 생산하는데 사용될 수 있다. 진핵 발현 벡터는 전형적으로 또한 세균에서 벡터를 복제시키고 선별하는 복제 오리진 및 항생제 내성 유전자와 같은 원핵 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 서열의 도입을 위한 다중 클로닝 부위를 포함하는 다수의 진핵 발현 벡터는 공지되어 있고 몇몇 벡터는 제조원[Stratagene, La Jolla, CA, USA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; Promega, Madison, WI, USA or BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA]과 같은 다양한 회사에서 구입할 수 있다.

햄스터-유비퀴틴/S27a 프로모터, 목적하는 유전자, 형광 단백질을 암호화하는 유전자 및 바람직하게 또한 증폭가능한 선별 마커 유전자, 예를 들어, 디하이드로폴레이트 리덕타제 및 임의로 추가의 조절 요소, 예를 들어, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 인핸서 또는 폴리아데닐화 시그날을 당업자에게 친숙한 방식으로 발현 벡터에 도입한다. 본 발명에 따른 발현 벡터는 최소한, 유비퀴틴/S27a 프로모터, 목적하는 유전자 및 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 포함한다. 바람직하게, 발현 벡터는 또한 증폭가능한 선별 마커 유전자를 포함한다. 본 발명에 따라, 본원에 기재된 변형된 유비퀴틴/S27a 프로모터, 예를 들어, 변형된 유비퀴틴/S27a 프로모터가 또한 사용된다. 특히, 유비퀴틴 프로모터, 목적하는 유전자 및 형광 단백질을 암호화하는 유전자가 함께 기능적으로 연결되어 있거나 기능적으로 연결되어 있는 발현 벡터가 바람직하다.

본 발명의 범위내에서, 용어 "기능적 연결" 또는 "기능적으로 연결된"은 2개 이상의 핵산 서열 또는 부분 서열을 의미하고 이들은 이들의 의도된 기능을 수행할 수 있는 위치에 존재한다. 예를 들어, 시스 위치에 연결된 유전자의 서열의 전사를 통제하거나 조절할 수 있는 경우 프로모터/인핸서는 기능적으로 암호화 유전자 서열에 연결되어 있다. 반드시 그러한 것은 아니지만 일반적으로, 기능적으로 연결된 DNA 서열은 함께 인접해 있고 2개의 암호화 유전자 서열이 연결되어 있거나 또는 분비 시그날 서열의 경우에는 동일한 판독 프레임에 존재한다. 기능적으로 연결된 프로모터가 일반적으로 암호화 유전자 서열의 업스트림에 위치하고 있지만 반드시 인접해 있어야만 하는 것은 아니다. 인핸서는, 이들이 유전자 서열의 전사를 보조하는 경우에 인접해 있을 필요가 없다. 이 때문에 이들은 유전자 서열의 업스트림 및 다운스트림 둘다에 존재할 수 있고 능히 이로부터 서로 약간 떨어져 존재할 수 있다. 폴리아데닐화 부위가, 잔사가 암호화 서열을 통해 폴리아데닐화 시그날로 진행하는 방식으로 유전자 서열의 3' 말단에 위치하는 경우 이는 기능적으로 유전자 서열에 연결되어 있다. 예를 들어, PCR 기술에 의해, 적합한 제한 절단 부위에서의 연결 또는 스플라이싱에 의해 통상적인 재조합 방법에 따라 연결시킬 수 있다. 어떠한 적합한 제한 절단 부위가 유용하지 못한 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 링커 또는 어댑터 자체는 공지된 방식으로 사용될 수 있다. 본 발명에 따라, 기능적 연결은 바람직하게 인트론 서열을 통해 일어나지 않는다.

기재된 양태중 하나에서, 유비퀴틴/S27a 프로모터 또는 이의 변형된 형태, 목적하는 유전자 및 형광 단백질을 암호화하는 유전자는 기능적으로 함께 연결된다. 이것은 예를 들어, 목적하는 유전자 및 형광 단백질을 암호화하는 유전자 둘다가 동일한 유비퀴틴/S27a 프로모터 또는 이의 변형된 형태로부터 개시하여 발현됨을 의미한다. 특히 바람직한 양태에서, 기능적 연결은 IRES 요소를 통해 일어나 이시스트론성 mRNA는 2개의 유전자로부터 합성된다. 본 발명에 따른 발현 벡터는 추가로 기능적으로 하나 이상의 프로모터에 작용하는 인핸서 요소들을 포함할 수 있다. 특히, 유비퀴틴/S27a 프로모터 또는 이의 변형된 형태가 인핸서 요소(예를 들어, SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서 요소)인 발현 벡터가 바람직하다.

기본적으로, 발현 벡터내 유전자는 하나 이상의 전사 단위체로부터 개시하여 발현될 수 있다. 용어 전사 단위체는 전사될 하나 이상의 유전자를 포함하는 영역으로서 정의된다. 전사 단위체내의 유전자는 당해 단위체내 모든 유전자들이 동일한 프로모터 또는 프로모터/인핸서의 전사 조절하에 있도록 기능적으로 서로 연결되어 있다. 이러한 유전자들이 전사적으로 연결되어 있는 결과로서, 하나 이상의 단백질 또는 생성물이 전사 단위체로부터 전사될 수 있고 따라서 발현된다. 각각의 전사 단위체는 동일하거나 상이한 조절 요소들을 포함할 수 있다. IRES 요소들 또는 인트론은 전사 단위체내에 유전자들을 기능적으로 연결시키기 위해 사용될 수 있다.

발현 벡터는 목적하는 유전자, 형광 단백질에 대한 유전자 및 증폭 가능한 선별 마커를 발현하기 위한 단일 전사 단위체를 포함할 수 있다. 또한, 이들 유전자들은 2개 이상의 전사 단위체로 배열될 수 있다. 전사 단위체내 유전자들의 다양한 조합이 가능하다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 하나 이상의 전사 단위체로 이루어진 하나 이상의 발현 벡터는 동시 형질감염 또는 임의의 목적하는 순서로 연속적인 형질감염으로 숙주 세포에 삽입될 수 있다. 각각의 벡터상의 조절 요소 및 유전자들의 조합은, 전사 단위체의 적당한 발현이 보장된다면 선택될 수 있다. 경우에 따라, 기타 조절 요소들 및 유전자, 예를 들어, 목적하는 추가의 유전자 또는 선별 마커가 발현 벡터상에 위치할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 발현 벡터는 하나 또는 2개의 별도의 전사 단위체내에서 형광 단백질 및 증폭가능한 선별 마커 유전자를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 각각의 전사 단위체는 하나 이상의 유전자 생성물을 전사시키고 발현시킬 수 있다. 2개의 유전자가 하나의 전사 단위체에 포함되는 경우, 이들은 동일한 프로모터/프로모터/인핸서의 통제하에 있지만 바람직하게 모든 성분들의 기능적 연결을 보장하기 위해 IRES 요소가 사용된다. 형광 단백질 및 증폭가능한 선별 마커 유전자를 암호화하는 유전자가 2개의 별도의 전사 단위체에 포함되는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 프로모터/인핸서의 통제하에 있을 수 있다. 그러나, 바람직하게, 이의 천연 또는 보다 약한 이종성 프로모터, 예를 들어, SV40 어얼리 프로모터는 선별 마커 유전자를 위해 사용되고 바람직하게는 어떠한 인핸서도 사용되지 않는다. 본 발명의 범위내에서 2개의 별도의 전사 단위체를 갖는 발현 벡터가 바람직하다. 하나의 (이시스트론성) 전사 단위체는 목적하는 유전자 및 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 반면, 기타 전사 단위체는 증폭가능한 선별 마커 유전자를 포함한다. 바람직하게, 각각의 전사 단위체는 폴리A 시그날, 바람직하게는 tk 폴리A, BGH 폴리A 또는 SV40 폴리A를 암호화하는 서열에 의해 3'말단에서 제한되어 있다.

본 발명에 따라, 목적하는 유전자 대신에 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인지 서열을 통해 목적하는 유전자가 클로닝되도록 하는 다중 클로닝 부위를 갖는 벡터가 바람직하다. 연합된 제한 엔도뉴클레아제 뿐만 아니라 모든 종류의 제한 엔도뉴클레아제에 대한 다수의 인지 서열은 선행 기술 분야에 공지되어 있다. 바람직하게, 인지 서열로서 6개 이상의 뉴클레오타이드로 이루어진 서열이 사용된다. 적합한 인지 서열 목록은 예를 들어, 문헌[참조: Sambrook et al., 1989]에서 찾을 수 있다.

숙주 세포

본 발명에 따른 발현 벡터로 형질감염시키기 위해, 진핵 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 세포 및 보다 바람직하게는 설치류 세포, 마우스, 랫트 및 햄스터 세포주가 사용된다. 본 발명에 따른 발현 벡터를 사용하여 상응하는 세포를 성공적으로 형질감염시킴으로써, 또한 본 발명의 과제인 형질전환되거나, 유전학적으로 변형된 재조합 또는 유전자 전이 세포를 수득한다.

본 발명의 목적을 위해 바람직한 숙주 세포는 BHK21, BHK TK^-, CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 및 CHO-DG44와 같은 햄스터 세포 또는 이들 세포주의 유도체/자손이다. 특히, CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 및 BHK21 세포가 바람직하고 특히, CHO-DG44 및 CHO-DUKX 세포가 바람직하다. 또한, 마우스 기원의 골수종 세포, 바람직하게는 NS0 및 Sp2/0 세포 및 이들 세포주의 유도체/자손이 적합하다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 햄스터 및 마우스 세포의 예는 하기의 표 2에 주어진다. 그러나, 이들 세포의 유도체 및 자손, 사람, 마우스, 랫트, 원숭이 또는 설치류의 세포주를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기타 포유동물 세포 또는 효모, 곤충 및 식물 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 진핵 세포는 또한 생물약제학적 단백질 생산용 숙주 세포로서 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 하나 이상의 발현 벡터를 사용한 진핵 숙주 세포의 형질감염은 통상적인 방법[문헌참조: Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994]으로 수행한다. 형질감염시키는 적합한 방법은 예를 들어, 리포좀 매개 형질감염, 인산칼슘 공침전, 전기천공, 다가양이온(예를 들어, DEAE 덱스트란)-매개 형질감염, 원형질체 융하브 미세주사 및 바이러스 감염을 포함한다. 본 발명에 따른 적합한 형질감염은 바람직하게, 작제물이 숙주 세포의 게놈내로 또는 인공 염색체/소형염색체로 통합되거나 적합한 방식으로 숙주 세포에서 에피좀으로 포함되는 방식으로 수행된다. 미지의 숙주 세포에서 최적의 이종성 유전자가의 형질감염 횟수 및 최적의 이종성 유전자의 발현을 제공하는 형질감염 방법이 바람직하다. 정의에 따르면, 숙주 세포에 삽입되는 모든 서열 또는 모든 유전자는 숙주 세포와 관련하여 "이종성 서열" 또는 "이종성 유전자"로서 언급된다. 이것은 심지어 도입될 서열 또는 도입될 유전자가 숙주 세포의 내인성 서열 또는 내인성 유전자와 동일한 경우에도 적용된다. 예를 들어, 햄스터 숙주 세포로 도입된 햄스터 액틴 유전자는 이종성 유전자로 정의된다.

모노클로날 항체(mAb)와 같은 이종이량체 단백질의 재조합 생산에서, 적합한 숙주 세포의 형질감염은 이론적으로 2개의 상이한 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 종류의 mAb는 다수의 서브유니트, 중쇄 및 경쇄로 구성된다. 이들 서브유니트를 암호화하는 유전자들은 숙주 세포를 형질감염시키는 단일 플라스미드상의 독립적이거나 다시스트론성 전사 단위체내에 수용될 수 있다. 이것은 숙주 세포의 게놈으로 통합된 후의 화학양론적인 유전자들이 확실히 제공되도록 하기 위한 것이다. 그러나, 독립적인 전사 단위체의 경우에, 이것은 상이한 단백질을 암호화하는 mRNA가 동일한 안정성 및 전사 및 해독 효율을 나타내도록 보장되어야만한다. 제2 경우에, 유전자는 단일 프로모터를 사용하여 다시스트론성 전사 단위체내에서 발현되고 단지 하나의 전사체가 형성된다. IRES 요소들을 사용하여, 유전자들의 고도로 효율적인 내부 해독 개시는 제2 및 후속 시스트론에서 수득된다. 그러나, 이들 시스트론에 대한 발현율은 제1 시스트론의 발현율 보다는 낮고 소위 "캡"-의존성 사전 개시 복합체를 사용한 이의 해독 개시는 실질적으로 IRES-의존성 해독 개시 보다 효율적이다. 실질적으로 동몰의 시스트론이 발현되도록 하기 위해서는 추가의 상호 시스트론 요소들이 도입될 수 있고 이것은 IRES 요소들과 연계하여 균일한 발현율을 보장한다[문헌참조: WO 94/05785].

본 발명에 따라 바람직한, 다수의 이종성 단백질을 동시에 생산할 수 있는 방법은 유전자들이 별도로 상이한 발현 벡터내에 통합되어 있는 동시 형질감염이다. 이것은 유전자 및 유전자 생성물간의 특정 비율이 조절됨에 의해 mRNA 안정성 및 전사 및 해독 효율에서의 임의의 차이를 균등하게 할 수 있다는 장점을 갖는다. 추가로, 크기가 작기 때문에 발현 벡터는 보다 안정하고 클로닝 동안 및 형질감염 동안에 취급하기가 더욱 용이하다.

따라서, 본 발명의 하나의 특정 양태에서, 숙주 세포는 추가로 목적하는 하나 이상의 기타 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는 하나 이상의 벡터로 추가로 형질감염되거나 바람직하게는 동시에 형질감염된다. 동시형질감염을 위해 사용되는 기타 벡터 또는 벡터들은 예를 들어, 동일한 프로모터/인핸서 조합체의 조절하에 있는 목적하는 기타 단백질 또는 단백질들을 암호화하고 하나 이상의 기타 선별 마커, 예를 들어, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 암호화한다.

본 발명에 따른 숙주 세포는 바람직하게 무혈청 조건, 임의로 동물 단백질/펩타이드가 부재인 배지에서 확립되고 순응되고 배양된다. 시판되는 배지의 예는 Ham's F12 (Sigma, Deisenhofen, DE), RPMI-1640 (Sigma), 듈베코 변형 이글 배지 (DMEM; Sigma), 최소 필수 배지 (MEM; Sigma), 이스코베 변형 듈베코 배지(IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), CHO-S-SFMII (Invitrogen), 무혈청 CHO-배지 (Sigma) 및 단백질 부재 CHO-배지 (Sigma)를 포함한다. 이들 배지 각각에는 임의로 다양한 화합물, 예를 들어, 호르몬 및/또는 기타 성장 인자(예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 상피 성장 인자, 인슐린형 성장 인자), 염(예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 포스페이트), 완충제(예를 들어, HEPES), 뉴클레오사이드(예를 들어, 아데노신, 티미딘), 글루타민, 글루코스 또는 기타 등가의 영양물, 항생제 및/또는 미량 원소들이 보충될 수 있다. 무혈청 배지가 본 발명에 따라 바람직하지만, 숙주 세포는 또한 적당한 양의 혈청과 혼합된 배지를 사용하여 배양될 수 있다. 하나 이상의 선별 마커 유전자를 발현하는 유전학적으로 변형된 세포를 선별하기 위해, 하나 이상의 선별 제제가 배지에 첨가된다.

용어 "선별 제제"는 미지의 선별 마커 유전자가 결핍된 숙주 세포의 성장 또는 생존에 영향을 미치는 물질을 언급한다. 예를 들어, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제와 같은 항생제 내성 유전자가 발현된 것을 선별하기 위해, 항생제 제네티신(G418)이 바람직하게 배지 첨가제로서 사용된다. 선별 제제는 또한 사용되는 유전자가 증폭가능한 선별 마커 유전자(표 1 참조)인 경우, 선별 마커 유전자를 증폭시키는 물질일 수 있다. 예를 들어,메토트렉세이트는 DHFR 유전자를 증폭시키는데 적합한 선별 배지이다. 증폭을 유발하는 기타 선별 제제의 예는 표 1에 열거되어 있다.

선별 마커 유전자는 상응하는 선별 제제를 배양 배지에 첨가함에 의해 당해 유전자를 포함하는 세포를 특이적으로 선별하는 유전자이다. 한 예로서, 항생제 내성 유전자는 양성 선별 마커로서 사용될 수 있다. 당해 유전자로 형질전환되는 세포만이 상응하는 항생제의 존재하에 성장할 수 있고 따라서 선별될 수 있다. 한편, 형질전환되지 않은 세포는 이들 선별 조건하에 성장하거나 생존할 수 없다. 양성, 음성 및 이작용성 선별 마커가 있다. 양성 선별 마커는 선별 제제에 내성을 부여함에 의해 또는 숙주 세포에서 대사 또는 동화작용의 결손을 보상함에 의해 형질전환된 세포가 선별되도록하고 따라서 이를 집적시킨다. 대조적으로, 선별 마커 유전자를 취득한 세포는 음성 선별 마커에 의해 선택적으로 제거될 수 있다. 이러한 예는 헤르페스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나제 유전자이고 아시클로비르 또는 강시클로비르가 동시 첨가된 세포에서의 이의 발현은 이를 제거한다. 본 발명에 사용되는 선별 마커는 증폭가능한 선별 마커를 포함하고 유전학적으로 변형된 돌연변이 및 변이체, 단편, 기능성 등가물, 유도체, 동족체 및 기타 단백질 또는 펩타이드들의 융합체이고 단, 선별 마커는 이의 선별 성질을 보유한다. 이러한 유도체들은 선별적인 것으로 간주되는 영역 또는 도메인에서 아미노산 서열이 상당히 상동성임을 나타낸다. 문헌은 이작용성(양성/음성) 마커를 포함하는 다수의 선별 마커 유전자를 기재하고 있다[문헌참조: WO 92/08796 및 WO 94/28143]. 진핵 세포에서 일반적으로 사용되는 선별 마커의 예는 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제(APH), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(HYG), 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR), 티미딘 키나제(TK), 글루타민 신테타제 아스파라긴 신테타제에 대한 유전자 및 네오마이신(G418), 푸로마이신, 히스티디놀 D, 블레오마이신, 플레오마이신 및 제오신에 내성을 부여하는 유전자를 포함한다.

또한, 형광 활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 형질전환된 세포를 선별할 수 있다. 이를 위해, 세균성 γ-갈락토시다제, 세포 표면 마커 또는 형광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP) 및 아에쿠오레아 빅토리아 및 레닐라 레니포르미스 또는 기타 종 기원의 변이체, 적색 형광 단백질 및 기타 색상으로 발광하는 단백질 및 예를 들어, 디스코소마 종, 아네모니아 종, 클라불라리아 종, 조안투스 종과 같은 비생물발광 유기체 기원의 변이체)은 형질전환된 세포를 선별하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명에서, DHFR 유전자의 사용은 증폭가능한 선별 마커 유전자로서 유전학적으로 변형된(재조합) 숙주 세포를 선별하기 위해 바람직하다. 이러한 마커는 특히, CHO-DG44 또는 CHO-DUKX와 같은 DHFR 음성 기본 세포를 사용하는 경우, 이들 세포는 내인성 DHFR을 발현하지 않고 따라서 퓨린 부재 배지에서는 성장할 수 없기때문에 선별에 이어서 증폭시키기 위해 적합하다. 결과적으로, DHFR 유전자는 여기에서 우성 선별 마커로서 사용될 수 있고 형질전환된 세포는 하이포산틴/티미딘 부재 배지에서 선별된다. DHFR-매개 유전자 증폭을 성취하기 위해 메토트렉세이트(MTX)가 사용된다. 성장 성질은 MTX 첨가에 의해 상당한 영향을 받는다. 일반적으로, MTX 농도 및 증폭 단계가 증가함으로써 세포의 발효 효능이 실질적으로 약화되는 것으로 관찰된다. 그러나 놀랍게도, 본 발명에 따른 클론 선별 시스템을 사용하여 고농도의 MTX 존재하에 보다 강한 작용을 나타내는 재조합 숙주 세포가 집적될 수 있는 것으로 밝혀졌다(도 7 참조). 따라서 형광 활성화된 세포 분류기(FACS)를 사용하여 동정되고 분류된 숙주 세포는 500nM의 존재하에, 바람직하게는 1μM의 MTX 존재하에 배양되고 증폭될 수 있고 이는 생산성을 크게 증가시킨다. 따라서, 고생산성 숙주 세포를 선별하는 방법은, 숙주 세포가 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질감염되고 목적하는 하나 이상의 유전자를 발현하고 형광 단백질 및 DHFR 유전자가 FACS 분류에 의해 분류되고 500nM 이상, 바람직하게는 1μM의 MTX의 존재하에 유전자 증폭 단계에 적용되는 경우, 본 발명에 따르는 것으로 간주된다.

발효력이란 예를 들어, 업스케일에 대한 산업적 생산 속도를 충족시키기 위한, 특정 성장 속도의 유지, "업스케일"(대형 크기의 생반응기)에 대한 효력 및 높은 세포수의 성취 및 스톡의 유지에서의 생존성과 같은 세포의 성장 특성을 의미한다.

발현

용어 발현은 숙주 세포에서 이종성 유전자 서열의 전사 및/또는 해독에 관한 것이다. 발현율은 일반적으로 숙주 세포에 존재하는 상응하는 mRNA의 양을 기준으로 또는 목적하는유전자가 암호화하는 생산된 유전자 생성물의 양을 기준으로 측정될 수 있다. 선별된 뉴클레오타이드 서열의 전사에 의해 생산되는 mRNA의 양은 노던 블롯 하이브리드화, 리보뉴클레아제-RNA-보호, 세포 RNA의 동일계 하이브리드화에 의해 또는 PCR 방법에 의해 측정될 수 있다[문헌참조: Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994]. 선별된 뉴클레오타이드 서열이 암호화하는 단백질은 또한 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, 방사선면역분석, 면역침전, 단백질의 생물학적 활성의 검출과 같은 다양한 방법 또는 단백질의 면역 염색에 이어서 FACS 분석에 의해 측정될 수 있다[문헌참조: Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994].

용어 "고발현 수준(또는 비율), 고발현, 증가된 발현 또는 고생산성"은 예를 들어, 숙주 세포로 도입되는 치료학적 단백질을 암호화하는 유전자의 이종성 서열을 오랫동안 지속적으로 충분히 발현시키거나 합성하는 것을 언급한다. 증가되거나 고발현 또는 고발현 수준 또는 비율 또는 고생산성은 본 발명에 따른 세포가 본원에 기재된 본 발명에 다른 방법들중 하나에 의해 배양되는 경우 및 당해 세포가 1일 목적하는 유전자 생성물을 대략 5pg(5pg/1일/세포) 이상으로 생산하는 경우 존재한다. 증가되거나 고발현 또는 고발현 또는 비율 또는 고생산성은 또한, 본 발명에 따른 세포가 1일 목적하는 유전자를 대략 10pg 이상(10pg/1일/세포) 생산하는 경우 존재한다. 증가되거나 고발현 또는 고발현 수준 또는 비율 또는 고생산성은 특히, 본 발명에 따른 세포가 1일 목적하는 유전자 생성물을 대략 15pg 이상(15pg/1일/세포) 생산하는 경우 특히 존재한다. 증가되거나 또는 고발현 또는 고발현 수준 또는 비율 또는 고생산성은 특히, 본 발명에 따른 세포가 1일 목적하는 유전자 생성물을 대략 20pg 이상(20pg/1일/세포) 생산하는 경우 존재한다. 특히, 증가되거나 또는 고발현 또는 특히 고발현 수준 또는 비율 또는 특히 고생산성은 본 발명에 따른 세포가 1일 목적하는 유전자 생성물을 대략 30pg 이상(30pg/1일/세포) 생산하는 경우 존재한다.

본 발명에 따른 고발현 또는 증가된 발현, 고생산성 또는 고발현 수준 또는 비율은 다양한 방식으로 성취될 수 있다. 예를 들어, 증폭가능한 선별 마커에 대한 유전와 목적하는 유전자를 동시 발현시켜 고도로 이종성 유전자를 발현하는 세포를 선별하고 동정할 수 있다. 증폭가능한 선별 마커는 안정적으로 형질감염된 숙주 세포를 선별하게하고 또한 목적하는 이종성 유전자의 유전자 증폭을 허용한다. 추가 핵산의 카피는 숙주 세포의 게놈내로, 추가의 인공/소형 염색체로 또는 에피좀에 위치한 폴리뉴클레오타이드로 통합될 수 있다. 당해 과정은 추가의 선별 마커로서 하나 이상의 형광 단백질(예를 들어, GFP) 또는 세포 표면 마커를 함유하는 재조합 숙주 세포를 FACS를 사용하여 선별하는 방법과 조합될 수 있다. 발현을 증가시키는 기타 방법과 조합된 상이한 방법들이 또한 사용될 수 있고 예를 들어, (인공) 전사 인자를 기초로, 세포를 내인성 또는 이종성 유전자 발현을 상향조절하기 위한 천연 또는 합성 제제로 처리하여 mRNA 또는 단백질의 안정성(반감기)을 개선시키고 mRNA의 해독의 개시를 개선시키며 에피좀 플라스미드(복제 오리진으로서 바이러스(예를 들어, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, EBV 또는 BPV)의 서열의 용도를 기초로 함)의 사용, 증폭 촉진 서열의 사용(문헌참조: Hemann et al., 1994) 또는 DNA 컨캐터머(concatemer)를 기초로하는 시험관내 증폭 시스템(문헌참조: Monaco et al., 1996)을 사용하여 유전자 투여량을 증가시키는 것이다.

본 발명에 따라, 목적하는 유전자 및 형광 단백질을 암호화하는 유전자의 커플링된 전사를 수행한다. 수득한 이시스트론성 mRNA는 목적하는 단백질 및 형광 단백질 둘다를 발현한다. 목적하는 단백질과 형광 단백질의 발현을 커플링시킴으로써 본 발명에 따라 발현된 형광 단백질을 수단으로, 예를 들어, 형광 활성화된 세포 분류기(FACS)를 사용하여 분류함에 의해 고생산성 재조합 숙주 세포를 용이하게 선별하고 분리할 수 있다.

생존력이 높고 목적하는 유전자 생성물의 발현이 증가된 재조합 숙주 세포의 선별은 다단계 과정이다. 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질감염되거나 임의로 또 다른 벡터로 동시 형질감염된 숙주 세포는 형광 단백질을 암호화하고 목적하는 유전자와 커플링된 유전자의 발현을 위해 연구되어 형광 단백질의 최고 발현율을 나타내는 세포/세포 집단을 동정하고 선별한다. 바람직하게, 형광 단백질의 최고 발현율을 나타내는 세포중 10%에 속하는 세포만이 분류되고 추가 배양된다. 실질적으로 이것은 가장 밝은 형광 세포의 10%가 분류되고 추가로 배양된다. 따라서, 혼합 세포의 형광 세포중에서 형광 세포가장 밝은 5%, 바람직하게 가장 밝은 3% 또는 심지어 가장 밝은 1%가 또한 분류되고 증식될 수 있다. 특히 바람직한 양태에서, 형광 세포중에서 가장 밝은 0.5% 또는 가장 밝은 0.1%가 분류되고 증식된다.

당해 목적을 위해, 이전에 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질감염된 세포를 임의로 또한 증폭가능한 선별 마커에 대해 특이적인 선별 제제를 함유하는 선별 배지에서 배양한다. 단계적으로 증가하는 선별 제제의 농도를 사용하여 선압을 점차적으로 증가시킬 수 있다.

선별 단계는 세포 풀상에서 또는 미리 분류된 세포 풀/세포 클론에 대해 수행될 수 있다. 하나 이상, 바람직하게는, 2개 이상 및 특히 3개 이상의 분류 단계가 수행될 수 있고 각각의 분류 단계 사이에 세포를 특정 시간(예를 들어, 풀의 경우에 약 2주)동안 배양하고 증식시킬 수 있다.

경우에 따라, 숙주 세포는 하나 이상의 유전자 증폭 단계에 적용되어 하나 이상의 목적하는 유전자 및 증폭가능한 선별 마커 유전자의 카피수를 증가시킬 수 있다. 메토트렉세이트를 사용한 단계적 유전자 증폭을 위한 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,179,017호에 기재되어 있다. 본 발명에 따라, 성취될 수 있는 고생산성은 많은 유전자 카피수와는 관련이 없다. 차라리, 이것은 고수행능 클론에서 안정성의 증가 및 발효 효력이 증가되어 나타난다. 따라서, 요구되는 유전자 증폭 단계의 수를 감소시키고 예를 들어, 단일 유전자 증폭을 수행할 수 있다.

따라서, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하는 세포 선별 방법에 관한 것이다:

(i) 발현 벡터의 DNA가 바람직하게 숙주 세포 게놈 또는 인공 염색체/소형염색체에 안정적으로 도입된, 본 발명에 따른 벡터중 하나 이상으로 적합한 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;

(ii) 형질전환된 세포를, 목적하는 유전자 및 형광 단백질의 유전자를 발현시키는 조건하에서 배양하는 단계;

(iii) 당해 세포를, 하나 이상의 선별 제제의 존재하에 배양하여 선별 제제의 존재하에서만 성장할 수 있는 세포들만을 증식시키는 단계;

(iv) 형광 단백질의 최고 발현율을 나타내는 세포를 형광 활성화된 세포 분류기(FACS)의 수단으로 검출하고 분류함에 의해 혼합 세포로부터 분리하는 단계 및

(v) 형광 단백질에 대한 최고의 발현율을 나타내는 분류된 세포를 배양하는 단계.

임의로, 단계 ii) 내지 v)는 단계 v)에 따라 수득된 세포와 함께 1회 이상 반복될 수 있다. 더욱이, 형질전환된 세포는 또한 임의로, 증폭가능한 선별 마커 유전자를 증폭시키는 선별 제제의 존재하에 배양시킴에 의해 하나 이상의 유전자 증폭 단계에 적용된다. 당해 단계는 아직 분류되지 않은 세포 및 또한 이미 1회 이상 분류된 세포 모두와 함께 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 상응하게 분류된 세포를 증식시키고 목적하는 암호화 유전자 생성물을 제조하기 위해 사용되는 방법에 관한 것이다. 선별된 고생산성 세포는 바람직하게, 무혈청 배양 배지 및 바람직하게는 목적하는 유전자를 발현시키는 조건하에 현탁 배양물에서 배양한다. 목적하는 단백질은 바람직하게, 분비된 유전자 생성물로서 세포 배양 배지로부터 수득한다. 그러나 단백질이 분비 시그날 없이 발현되는 경우, 유전자 생성물은 또한 세포 용해물로부터 분리될 수 있다. 실질적으로 기타 재조합 단백질 및 숙주 세포 단백질이 없는 순수하고 균일한 생성물을 수득하기 위해 통상적인 정제 단계를 수행한다. 무엇보다, 일반적으로, 세포 및 세포 파편이 배양 배지 또는 용해물로부터 제거된다. 목적하는 유전자 생성물은 이어서 예를 들어, 면역친화성 및 이온 교환 칼럼, 에탄올 침전, 역상 HPLC 또는 세파덱스, 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지상의 크로마토그래피로 분획하여 오염 가용성 단백질, 폴리펩타이드 및 핵산으로부터 분리될 수 있다. 재조합 세포에 의해 발현되는 이종성 단백질을 정제하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있고 문헌[참조: Harris et al.(1995) and Scopes (1988)]에 기재되어 있다.

이후부터 본 발명은 몇몇 비제한인 예시 양태를 참조로 보다 완전하게 설명된다.

방법

1. 세포 배양 및 형질감염

세포 CHO-DG44/dhfr-/-(문헌참조: Urlaub et al., 1983)을, 습한 대기 및 5% CO₂에서 37℃에서 세포 배양 플라스크내에서 하이포산틴 및 티미딘(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, DE)이 보충된 무혈청 CHO-S-SFMII 배지에서 현탁 세포로서 계속적으로 배양하였다. 세포수 및 생존력은 CASY1 세포 쿨터 계수기(Schaerfe System, DE) 또는 트립탄 블루 염색으로 측정하고 이어서 당해 세포를 1 내지 3 x 10⁵/mL의 농도로 분주하고 2 내지 3일마다 수행한다.

리포펙타민 플러스 시약(Invitrogen GmbH)을 CHO-DG44를 형질감염시키는데 사용하였다. 각각의 형질감염 혼합물에 대해, 총 1㎍의 플라스미드-DNA, 4㎕의 리포펙타민 및 6㎕의 플러스 시약을 함께 제조업자의 지침에 따라 혼합하고 200㎕의 용적으로 0.8ml의 HT-보충된 CHO-S-SFMII 배지에서 대수적으로 성장하는 6 x 10⁵의 CHO-DG44에 첨가하였다. 세포 배양기중에서 37℃에서 3시간 배양 한 후, 2ml의 HT 보충된 CHO-S-SFMII 배지를 첨가하였다. 안정하게 형질감염된 CHO-DG44의 DHFR을 사용한 선별을 위해, 세포를 형질감염시킨지 2일 후 하이포산틴 및 티미딘이 첨가되지 않은 CHO-S-SFMII 배지(3 내지 4일 마다 교환)로 옮겼다. 하나의 발현 벡터가 DHFR을 함유하고 기타 발현 벡터가 네오마이신-포스포트랜스퍼라제 선별 마커를 함유하는 형질감염의 경우에 DHFR- 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기반 선별에서, G418(Invitrogen)을 또한 400㎍/ml의 농도로 배지에 첨가하였다.

통합된 이종성 유전자의 DHFR 기반 유전자는 5 내지 2000nM의 농도로 선별 제제 MTX(Sigma, Deisenhofen, DE)를 HT 부재 CHO-S-SFMII 배지에 첨가하여 증폭시켰다.

2. 발현 벡터

발현을 분석하기 위해, pAD-CMV 벡터(Werner et al., 1998)을 기초로하고 조합된 CMV 인핸서/햄스터 유비퀴틴/S27a 프로모터(WO 97/15664)에 의한 이종성 유전자의 항상성 발현을 매개하는 진핵 발현 벡터를 사용하였다. 기본 벡터 pBID는 증폭가능한 선별 마커(참조: EP 0 393 438)로서 작용하는 DHFR 소형유전자를 함유하지만 벡터 pBIN에서, DHFR 소형유전자는 네오마이신 내성 유전자로 대체되었다(도 2). 당해 목적을 위해, SV40 어얼리 프로모터 및 TK-폴리아데닐화 시그날을 포함하는 선별 마커 네오마이신-포스포트랜스퍼라제는 1640 bp의 Bsu361 단편으로서 시판되는 플라스미드 pBK-CMV(Stratagene, La Jolla, CA, USA)로부터 분리하였다. 클레노우-DNA-폴리머라제를 사용하여 단편의 말단을 채우는 반응 후, 단편을, 또한 클레노우-DNA-폴리머라제로 처리된 벡터 pBID의 3750 bp Bsu36I/StuI 단편에 연결시켰다.

이시스트론성 기본 벡터 pBIDG(도 2)에서, IRES-GFP 유전자 영역을 벡터 pIRES2-EGFP(Clontech, Palo Alto, CA, USA)로부터 분리하고 프로모터 영역과 IRES-요소 사이의 다중 클로닝 부위가 보유되도록 벡터 pBID의 CMV 인핸서/프로모터의 통제를 받게하였다. 하기의 과정을 사용하였다. 한편, 플라스미드 pIRES2-EGFP가 주형으로서 작용하는 PCR 돌연변이에서는 IRES 서열내 HindIII 절단 부위 AAGCTT를 돌연변이 유발 프라이머를 사용하여 서열 ATGCTT로 전환시키고 이어서 제거하였다. 한편, Xbal 절단 부위는 IRES 서열의 5' 말단에 상응하는 프라이머를 수단으로 삽입하거나 SpeI 절단 부위는 GFP 서열의 3' 말단에 상응하는 프라이머를 사용하여 도입하였다. 완전한 IRES 및 GFP 서열을 포함하는 수득한 PCR 단편은 XbaI 및 SpeI로 분해하고 벡터 pBID의 다중 클로닝 부위의 3' 말단에서 단일 Xbal 절단 부위에 클로닝시켰다.

사람 sICAM 유전자는 pAD-sICAM(Werner et al., 1998)로부터 HindIII/SaII 단편으로서 분리하고 벡터 pBIDG의 상응하는 절단 부위로 클로닝시켜 벡터 pBIDG-sICAM(도 3)을 수득하였다.

모노클로날 사람화된 F19 항체를 발현하기 위해, 중쇄를 플라스미드 pG1D105F19HC(NAGENESEQ: AAZ32786)으로부터 1.5kb의 NaeI/HindIII 단편으로서 분리하고 EcoRI 및 HindIII로 분해된(클레노우-DNA-폴리머라제로 보충됨) 벡터 pBIDG에 클로닝시켜 벡터 pBIDG-F19HC(도 3)을 수득하였다. 한편, 경쇄는 플라스미드 pKN100F19LC (NAGENESEQ: AAZ32784)로부터 1.3kg HindIII/EcoRI 단편으로서 분리하고 벡터 pBIN의 상응하는 절단 부위에 클로닝하여 벡터 pBIN-F19LC(도 3)를 작제하였다.

3. FACS

유동-세포측정 분석 및 분류는 쿨터 에픽스 알트라 장치(Coulter Epics Altra device)를 사용하여 수행하였다. FACS는 여기파장이 488nm인 헬륨 아르곤 레이져를 장착하고 있다. 형광 강도는 소프트웨어 쿨터 Expo32가 부착되어 있어 형광 단백질 및 과정에 적합한 파장에서 흡수된다. 초당 8000 내지 10000회의 비율로 분류하였다. 현탁된 세포를 원심분리(180x에서 5분)하고 세포 농도를 HBSS중에서 1 내지 1.5 x 10⁷/ml로 조정하였다. 이어서, 세포를 형광 단백질 시그날에 따라 분류하였다. 세포를 이미 배양 배지를 포함하는 시험 튜브에 넣고 이어서 원심분리하고 분류된 세포수에 다라 적합한 배양 용기에 분주한다.

4. ELISA

안정하게 형질감염된 CHO-DG44 세포의 상등액중의 sICAM 역가는, 한편으로는 염소 항 사람 IgG Fc 단편(Dianova, Hamburg, DE)를 사용하고 또 다른 한편으로는 AP 접합된 염소 항 사람 카파 경쇄 항체(Sigma)를 사용하는 표준 방법[문헌참조: Ausubel et al., 1994, updated)에 따라 ELISA로 정량하였다. 정제된 F19 항체를 표준물로서 사용하였다.

생산성(pg/세포/1일)은 수학식 pg/((Ct-Co)t/In(Ct-Co))[여기서, Co 및 Ct는 각각, 분주 및 수거시 세포수이고 t는 배양 시간이다)으로 계산하였다.

실시예 1: CMV 및 햄스터-유비퀴틴/S27a-프로모터 활성의 비교

햄스터-유비퀴틴/S27a-프로모터의 활성과 진핵 발현 벡터에 흔히 사용되는 CMV 프로모터의 활성을 비교하기 위해, CHO-DG44 세포를 다양한 재조합 벡터로 형질감염시켰다. 한쪽에는 리소좀 효소 또 다른 한쪽에는 IgG-1 항체인 이종성 유전자 생성물을 CMV-프로모터 또는 햄스터-유비퀴틴/S27a-프로모터의 통제하에 발현시켰다. 2개의 프로모터를 기능적으로 CMV-인핸서에 연결시켰다. BGH 폴리A를 이종성 유전자의 종결 시그날로서 사용하였다. CMV-프로모터를 포함하는 발현 벡터는 변형된 pcDNA3("CMV¹", Invitrogen) 또는 pBluescript 벡터("CMV²", Stratagene)를 기본으로 하고 추가로 증폭가능한 선별 마커 디하이드로폴레이트 리덕타제를 암호화하고 있다. 한편, 햄스터 프로모터를 갖는 발현 벡터는 pAD-CVM 벡터를 기본으로 한다(문헌참조: Werner et al., 1998). 항체의 중쇄 및 경쇄를 발현하기 위해, 선별 마커로서 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 제2 벡터를 사용하여 동시 형질감염시켰다. 그러나 CMV 인핸서는 또한 SV40 인핸서로 대체될 수 있다.

형질감염 후 96웰 플레이트중에서 제한 희석에 의해 세포 클론을 HT 부재 배지(동시 형질감염의 경우 400㎍/mL의 첨가와 함께)에서 선별하고 분리하였다. 재조합 단백질에 대해 최고의 생산성을 갖는 세포 클론을, 각각의 경우 희석 클로닝과 연계하여, 단계적으로 메토트렉세이트 농도를 5nM에서 50nM, 500nM을 거쳐 2μM까지 증가시키면서 단계적 DHFR 기본 유전자 증폭에 적용하였다. 각각의 증폭 단계에서, 최고의 생산성을 갖는 약 20 내지 30개 클론을 선별하였다.

일반적으로, 햄스터 프로모터는 최고의 수행능을 갖는 것으로 밝혀졌다. 리소좀 효소의 발현 및 또한 항체의 발현 모두에서, 생산성 또는 역가는 이종성 유전자가 CMV 프로모터의 통제하여 발현되는 세포에서 수득되는 것 보다 2 내지 5배 높았다. 도 1은 예를 들어, 당해 특정 증폭 단계에서 최고의 세포 클론의 상대적 역가 및 상대적 비생산성, 1로 설정된 CMV 프로모터(리소좀 효소에 대해서는 CMV¹, 항체에 대해서는 CMV²)를 기준으로 특정 이종성 유전자의 발현을 보여준다.

실시예 2

GFP 기본 FACS 분류에 의한 고발현 sICAM 세포의 분리

세포내 접착 분자 ICAM1의 가용성 형태인 sICAM은 리노바이러스와 ICAM 수용체에 결합하기 위해 경쟁함으로써, 세포에 진입하고 이어서 감염시키는 데 있어서 전제조건인 당해 바이러스와 ICAM 수용체와의 상호작용을 감소시키거나 또는 심지어 차단하여 감기 치료제로서 가능하다[문헌참조: Bella et al., 1999; Marlin et al., 1990].

sICAM은 CHO 세포에서 단일쇄 단백질(480개 아미노산)의 발현을 위한 예로서 선택하였다. 이를 위해, CHO-DG44를 pBIDG-sICAM(도 3)으로 형질감염시켰다. pBIDG-sICAM 형질감염된 세포에서 GFP의 추가의 발현은 FACS 기본 선별 전략의 사용을 가능하게 하였다. 치료학적 단백질 sICAM 및 GFP는 공동으로 이시스트론성 전사 단위체에 의해 발현되고 DHFR은 별도의 전사 단위체에 의해 발현된다. TH 부재 CHO-S-SFMII 배지에서 처음 선별한지 2 내지 4주 후, 최고의 GFP 형광을 나타내는 5%의 세포를 분류하였다. 약 2주 배양 후, 최고의 GFP 형광을 나타내는 5%의 세포를 다시 분리하였다. 이러한 연속 분류는 총 6회 실시하였다. 우수한 상관관계가 sICAM 생산성과 GFP 형광성간에서 입증될 수 있었다(도 4). 임의의 MTX 증폭 단계 없이 단독의 FACS 원조 선별에 의해, 16pg/세포/1일의 높은 비생산성을 갖는 세포 풀을 매우 단시간에 분리하였다(도 5). GFP 기반 선별과 단일 연속 MTX 증폭 단계를 조합하여 심지어 생산성을 30pg/세포/1일까지 증가시킬 수 있었다(도 6). 이들 생산성은 500nM MTX를 사용한 제4 분류 후 풀의 증폭과 또한 2μM MTX를 사용한 제6 분류 후 풀의 증폭 둘다를 사용하여 성취되었다. 일반적으로 MTX 5 내지 20nM 범위에서 매우 낮은 MTX 농도를 사용하여 개시되는 단계적 증폭과는 반대로, 증폭 효과를 성취하기 위해서는 고농도의 MTX가 처음부터 사용되어야만 한다. 따라서, 제4 분류 기원의 세포에 5 또는 50nM의 MTX의 첨가 결과로서 또는 제6 분류 기원의 세포에 500nM의 첨가 결과로서의 생산성은 그다지 증가하지 않았다(도 6). 명백하게, 개시 풀중의 DHFT의 수준은 이미 너무 높아 총 DHFR은 고용량의 MTX를 사용해서만이 억제될 수 있다. 더욱이, 미리 분류된 세포 풀은 높은 개시 용량의 MTX에도 불구하고 선별 단계에서 보다 우수하게 생존하는데, 즉, 생존력이 높은 세포 집단은 통상적인 단계적 유전자 증폭 전략에서 보다 단축된 시간내에 수득된다(도 7).

실시예 3

GFP 기반 FACS 분류에 의한, mAb F19이 고발현되는 세포의 분리

동시 형질감염에서, CHO-DG44 세포는 플라스미드 pBIDG-F19HC 및 pBIN-F19LC의 조합으로 형질감염시켰다(도 3). 발현된 사람화된 항체 F19는 간질 섬유아세포에 의해 합성되는 표면 분자 FAP에 대해 유도된 것이다(EP 0 953 639 참조). 사용되는 벡터 배향에서, 항체의 2개의 단백질 쇄는 이의 자신의 벡터에 의해 발현되고 이는 추가로 또한 별도의 전사 단위체에서 DHFR 또는 네오마이신-포스포트랜스퍼라제 선별 마커를 암호화하고 있다. 추가로, 또 다른 선별 마커인 GFP는 벡터 pBIDG-F19HC에 포함된다. CHO-DG44의 벡터 pBIDG-F19HC-F19LC로의 동시형질감염에서, IRES 요소를 사용하여 GFP와 중쇄의 발현을 전사적으로 연결시킴으로써, 항체 F19가 고발현되는 세포는 연속 FACS 분류를 사용하여 GFP 함량이 높은 세포를 선별함에 의해 신속하게 분리될 수 있었다. 이를 위해, 400㎍/ml의 G418이 첨가된 HT 부재 CHO-S-SFMII 배지에서 형질감염된 세포 풀을 처음 2주 내지 3주 선별한 후, 최고의 GFP 형광성을 갖는 5%의 세포를 FACS로 분류하였다. 이러한 분류를 총 6회 이하까지 실시하여 각 분류 사이에 배양 기간이 약 2주가 된다. 2개의 단백질 쇄가 이들 자신의 벡터로부터 발현되었지만 F19 생산성과 GFP 형광성간의 우수한 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌고(도 8) GFP 기반 GACS에서, GFP와 전사적으로 커플링시키는 결과로서 중쇄를 선별할 수 있었다. 생산성은 10pg/세포/1일까지 증가될 수 있고(도 9) 추가로 후속적인 1회 MTX 증폭 단계에 의해, 제5 분류의 세포 풀로부터 개시하여 1000nM MTX를 선별 배지에 첨가함에 의해 평균 37pg/세포/1일까지 증가될 수 있었다. 비교 데이타는 또한 CMV 인핸서 대신 SV40 인핸서와 햄스터 프로모터를 기능적으로 연결시킴에 의해 수득될 수 있다. 동시에, 일반적으로 MTX의 양을 증가시키면서 4회의 증폭 단계를 포함하는 통상적인 단계적 유전자 증폭 전략과 비교하여 고생산성 세포를 선별하기 위한 시간은 절반 내지 약 120일까지로 감소될 수 있어 이와 동시에 개발 용량 및 비용을 상당히 감소시킨다.

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Claims

햄스터-유비퀴틴/S27a-프로모터에 기능적으로 연결된 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자 및 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터.
제1항에 있어서, 증폭가능한 선별 마커 유전자를 포함함을 특징으로 하는 발현 벡터.
제1항 또는 제2항에 있어서, 프로모터 또는 프로모터들에 기능적으로 연결된 하나 이상의 인핸서를 포함함을 특징으로 하는 발현 벡터.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 단백질을 암호화하는 유전자 및 목적하는 단백질/생성물을 암호화하는 유전자를 이시스트론성(bicistronic)으로 발현시키는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함함을 특징으로 하는 발현 벡터.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 단백질을 암호화하는 유전자 및 증폭가능한 선별 마커 유전자가 하나의 전사 단위체 또는 2개의 별도의 전사 단위체에 위치함을 특징으로 하는 발현 벡터.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 기능적 연결이 인트론 서열을 통해 일어나지 않음을 특징으로 하는 발현 벡터.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭가능한 선별 마커 유전자가 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 또는 형광 단백질과 DHFR의 융합 단백질을 암호화함을 특징으로 하는 발현 벡터.
제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인핸서가 CMV 또는 SV40 인핸서임을 특징으로 하는 발현 벡터.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리아데닐화 시그날을 추가로 포함함을 특징으로 하는 발현 벡터.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 목적하는 단백질/생성물을 암호화하는 유전자 대신, 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자의 도입을 위한 다중 클로닝 부위를 포함함을 특징으로 하는 발현 벡터.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터로 형질감염된 진핵 숙주 세포.
제11항에 있어서, 포유동물 세포, 바람직하게는 CHO 세포임을 특징으로 하는 숙주 세포.
제11항 또는 제12항에 있어서, 목적하는 하나 이상의 단백질/생성물 및 하나 이상의 기타 선별 마커를 암호화하는 유전자를 갖는 하나 이상의 벡터로 추가로 형질감염됨을 특징으로 하는 숙주 세포.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를, 유전자 생성물을 발현시키는 조건하에 배양하고 유전자 생성물을 배양물 또는 배양 배지로부터 분리하는, 이종성 유전자 생성물을 제조하는 방법.
이종성 단백질/생성물의 상이한 서브유니트를 암호화하는 발현 벡터로 동시 형질감염된 제13항에 따른 숙주 세포를, 이종성 단백질/생성물을 발현시키는 조건하에서 배양시키고 이종성 단백질/생성물을 배양물 또는 배양 배지로부터 분리하는, 이종성 단백질/생성물을 제조하는 방법.
제15항에 있어서, 이종성 단백질이 항체임을 특징으로 하는 방법.
제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포를 하나 이상의 유전자 증폭 단계에 적용함을 특징으로 하는 방법.
제17항에 있어서, 증폭가능한 선별 마커가 DHFR이고 증폭 제제가 메토트렉세이트임을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 숙주 세포를, 메토트렉세이트를 사용한 단지 하나의 유전자 증폭 단계에 적용시킴을 특징으로 하는 방법.
제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 무혈청 배양 배지에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포를 현탁 배양물에서 배양함을 특징으로 하는 방법.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포 집단을, 목적하는 단백질/생성물 및 형광 단백질을 발현시키는 조건하에서 배양시키고 형광 단백질의 최고 발현 수준을 보여주는 세포/세포들을 동정하고/하거나 선별하여, 목적하는 단백질/생성물을 발현하는 숙주 세포를 선별하는 방법.
제22항에 있어서, 선별이 형광-활성화된 세포 분류기(FACS)를 사용하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제22항 또는 제23항에 있어서, 상응하게 선별된 숙주 세포를 하나 이상의 추가의 유전자 증폭 단계에 적용시킴을 특징으로 하는 방법.
제24항에 있어서, 증폭가능한 선별 마커가 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)이고 증폭 제제가 메토트렉세이트임을 특징으로 하는 방법.