TWI321152B - Expression vector, methods for the production of heterologous gene products and for the selection of recombinant cells producing high levels of such products - Google Patents

Description

1321152 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於篩選高-生產力之重組細胞的方法，製備異 種基因產物和表現載體的方法，以及可在這些製程中使 用’已經以其轉移感染的宿主細胞。 【先前技術】 哺乳動物細胞是較佳的宿主細胞，用來產製複雜的生物 樂干蛋白貝’因為在轉澤後進行的修改’在功能和藥物動 力學上可與人類相容。在商業上相關的細胞類型是融合 瘤、骨髓瘤CHO(中國倉鼠卵巢）細胞和βηκ(幼倉鼠腎臟） 細胞。在不含血清和蛋白質的生產條件下，逐漸進行宿主 細胞的培養《這些的理由是伴隨而升的成本降低、降低在 純化重組蛋白質上的干擾，並降低導入病原（例如普恩蛋白 (prion)和病毒）的可能。應用CH〇細胞作為宿主細胞變得較 廣泛，是因為這些細胞適應在不含血清和蛋白質的培養基 中懸浮生長，並亦為管理當局視為和接受作為安全的生產 細胞。 為了產生表現感興趣之異種基因的穩定哺乳動物細胞 株’通常藉著轉移感染’將異種基因連同可選擇標記基因， 例如新黴素磷酸轉移酶一起，插入想要的細胞株内。可由 單一载體一起，或由被共同轉移感染的不同載體，表現異 種基因和可選擇標記基因。在轉移感染之後2至3天，將細 胞移至含有選擇劑，例如在使用新黴素磷酸轉移酶基因時 為G418的培養基中，並在這些選擇條件下培養數週。然後

O:\89\89114.DOC 1321152 可分離出現抗藥性的細胞，並調查想要之基因產物的表 現。由於隨機且不受指揮地整合至宿主細胞基因組内，所 獲得的細胞族群具有完全不同比例的異種基因表現。這些 亦可包括不表現的細胞，其中表現可選擇標記，但不表現 感興趣之基因。為了確認具有感興趣之異種基因的極高表 現的細胞純種系，因此必須檢查並測試大量的純種系，這 是耗費時間、勞力密集且昂貴的。 基因擴大是在動物細胞培養中很普及的現象，用來產製 重組的生物藥學蛋白質。基因擴大徹底地改善了許多哺乳 動物細胞株一開始相對上較低的生產力。一種廣泛使用的 擴大技術是以二氫葉酸還原酶（DHFR)為基礎之基因擴大 系統，常常使用在DHFR-缺陷的中國倉鼠卵巢（CHO)細胞 中。利用適當的載體系統，其編碼DHFR和感興趣的蛋白 質’轉移感染DHFR-缺陷的CHO細胞，例如CHO-DUKX(ATCC CRL-9096)或 CHO-DG44(Urlaub 等人，1983)。然後在無甘胺 酸、次黃嗓呤和胸腺核嘗的培養基中篩選轉移感染物。藉 著逐漸加入胺甲碟呤（MTX)，二氫葉酸還原酶的抑制劑 (Kaufman等人，1982;美國專利第4,656，134號），達成高生產 力之細胞株的擴大，並因此建立之。所獲得之高生產力細 胞的後續篩選，亦易受機會主義影響，並以可能性為基礎， 結果該篩選步驟是高度勞力密集的，並耗費時間。 為了監視基因轉化，以及更好和更迅速的表現，已經發 展出各種方法。這些包括，其中第一個是使用報告者分子， 如氯黴素-乙醯轉移酶、蟲螢光素酶、半乳糖甞酶，或含

O:\89\89114.DOC 有冷半乳糖甘酶或蟲螢光素酶之密碼區的融合蛋白質。這 些報告者基因測定的缺點是細胞已經被固定或溶解，且已 經與外源添加的受質和辅-因子—起培養。因此，經過分析 之=胞的進—步培養根本*必討論。最近的mx大腸 桿菌酵素心半乳糖苷酶的共同-表現為基礎，確實容許使用 FACS裝置（Nolan等人，1988)挑選已經溶解的細胞，但需要 低張的預先處理，以便將螢光團受質裝載於細胞中。該活 性在以FACS-為基礎的分類之前，亦已經受到抑制。 藉著導入得自維多利亞水母（Aequ〇rea vict〇ria)之綠螢光 蛋白（GFP)，.以及從其發展出之GFp突變種作為報告者分 子，使確認表現異種基因的細胞變得更容易。GFp的共同· 表現，容許在活體内即時分析，並以其螢光為基礎，挑選 轉移感染物，不需要額外的受質或輔·因子。已經在各種公 開案中，描述使用GFP作為報告者分子來監視的基因轉 移。在美國專利第5,491，084號和6，146,826號中，Chalfie等 人描述了篩選表現感興趣之蛋白質之細胞的方法。該方法 包括藉著含有感興趣蛋白質之密碼序列的DNA分子，以及 編碼GFP-基因的第二個DNA分子，共同·轉移感染細胞。然 後篩選表現GFP的細胞。Gubin等人（1997)調查在缺乏選擇 性生長條件下，GFP表現在CHO細胞中的穩定性。以含有 GFP和新黴素磷酸轉移酶兩者的質體轉移感染細胞。Mosser 等人（1997)使用含有二順反子表現卡匣的質體，其編碼GFp 和標靶基因（亦稱為感興趣之基因），來確認和篩選表現可誘 導產物的細胞。該標靶基因係在可調整之啟動基因的控制

O:\89\89U4.DOC 1321152 之下。使用病毒IRES(内部核糖體進入位置）元件，達成GFP 和標靶基因表現的偶聯，結果表現編碼GFP和感興趣之蛋 白質的二順反子mRNA。所使用之質體本身不含任何可選擇 標記基因。因此，可藉著第二個質體以共同-轉移感染，或 以後續之轉移感染將其導入。相反的，Levenson等人（1998) 使用帶有二順反子表現卡匣的逆轉錄病毒載體，其中可將 感興趣之基因選殖到IRES序列之前。換句話說，在IRES序 列之後的序列編碼可選擇標記基因，這是賦與對G418、嘌 羅黴素、潮黴素B、组織胺醇D或腐草黴素抗藥性的標記， 或它是GFP。 業已描述含有得自細小核糖核酸病毒家族之IRES元件的 載體，該IRES元件係位在產物基因和可選擇標記基因之間 (Pelletier等人，1988 ; Jang等人，1989 ; Davies等人，1992)。 亦已經成功地將GFP與抗藥性標記基因融合。例如， 66111161^等人（1998)描述〇??/里歐黴素（2 60111>^11)融合蛋白 質。成功地使用該雙重功能的可選擇標記，確認並篩選經 過轉移感染的哺乳動物細胞。另一方面，Primig等人（1998) 使用GFP之融合蛋白質和新黴素磷酸轉移酶，進行其促進 子之研究。 在Meng等人（2000)的公開案和國際專利申請案W001/04306 中，使用其中使感興趣之基因與得自單一載體之可擴大可 選擇標記基因DHFR和GFP基因一起表現的表現系統，篩選 和確認高度表現該重組蛋白質的細胞。將這三個基因混合 在一個轉錄單位中，或分開在兩個單位之間。預期所有三

O:\89\S91M.DOC 1321152 個基因在單一表現載體中的空間和轉錄連接，增加其在選 擇壓力下共同_擴大的可能性，並因此確認和篩選高產製的 純種系。藉著使用組合選擇，藉著可擴大DHFR選擇標記和 以GFP為基礎之FACS挑選表現感興趣之蛋白質，以不超過 母個細胞每天3至4.5微微克的放大率，分離最佳的純種 系。利用黏附細胞並在含有血清之培養基中進行實驗即 利用細胞並在已知實質上較強健，且其特徵在於較高之基 礎生產力的條件下。 【發明内容】 f此，本.發明之目標是發展具有增加生產力之重組細胞 的篩選系統’其遭遇下列的需求·· ⑴降低發展高生產細胞，產生生物藥學蛋白質所花費的時 間，同時較低發展成本； (2) 以高輸貫量和低成本效益來篩選高生產細胞； (3) 使用"發酵_強健的，，高生產細胞，其顯示出例如在增加胺 甲碟呤濃度時對生長有較低的損害； (4) 轉移❹、筛選和培養適㈣浮液的細胞，最好是在不 含血清的培養基中； (5) 降低所需之基因擴大步驟。 本發明更進一步的目標是提供表現載體和以其轉移感染 的宿主細胞，其可用在該純種系筛選系統中，以及使用這 些宿主細胞製備異種基因產物的製程。 根據本發明的一項觀點，藉著使包括編碼感興趣蛋白質 之基因（在後文中亦稱為”感興趣之基因，|)的表現載體，在功 1321152 能上與倉鼠泛素/S27a啟動基因和編碼螢光蛋白質的基因 連接，而達成這些目標。 表現載體最好亦含有可擴大的選擇標記基因，例如二氫 葉酸還原酶（DHFR)基因《較佳的表現載體亦含有其他的調 節凡件’例如在功能上與啟動基因連接的促進子。此外， 表現載體最好亦含有内部核糖體進入位置（IRES)，其容許 編碼螢光蛋白質之基因和感興趣之基因的二順反子表現。 本發明亦關於基礎載體，其以那樣的基因，即具有多個 核酸内切限制酶之切開位置的序列區，代替具有多個選殖 位置的感興趣基因。 在本發明的另一項觀點中，係關於已經利用一種所提及 之表現載體轉移感染的宿主細胞。這些為真核生物細胞， 最好是哺乳動物細胞，而嗡齒動物細胞，如倉鼠細胞，尤 其是CHO細胞或BHK細胞是特佳的.。 在本發明的另一項觀點中，係關於製備異種基因產物的 製程，其巾在容許該基因產物表現的條件下，培養以根據 本發明之表現㈣轉移感染的宿主細胞，並從培養物或培 養基中分離該基因產物。 染宿主細胞 在本發明-個特定的具體實施例中，以根據本發明之表 現載體，並額外地以-或多個帶有編碼—或多個其他感興 MSI㈣體’轉移感染’最好是共同-轉移感 在該關係中，本發明提供塑 Α ^ 风货I備異種二聚體蛋白質的g 程，其中在容許該異種二聚許疋A 全 來體蛋白質表現的條件下，培^

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丄J厶丄1JZ 、類^的#主細胞’其已經利用編碼該異種二聚體蛋白質 不同人單元的表現載體共同-轉移感染，並從培養物或培 養基中分離該異種二聚體蛋白質。這類製成的一個特殊應 用是產製抗體及其次單元。 在另項觀點中，本發明係關於篩選表現感興趣蛋白質 、胞的過程，其中在容許該感興趣之蛋白質和螢光 貝的條件下，培養已經以根據本發明之表現載體轉移 感木的伯主細胞族群，並確認和篩選顯示出螢光蛋白質之 最高表現率的細胞或細胞們。最好是使用螢光-激活細胞分 類器（FACS)進行篩選。 处驚人的是，已經發現使用根據本發明提供之系統，有可 能在極短的時間中分離細胞集合，其表現出超過15微微克 的平均比生產力（單鏈蛋白質）或每個細胞每天1〇微微克（人 類化抗體)的重組蛋白質，不需基因擴大的步驟。藉著單一 的以DHFR-為基礎之基因擴大步驟 可使該比生產力增加 至每個細胞每天30微微克以上。如此在細胞集合中達到的 生產力，比迄今已公開之最佳細胞純種系的最大生產力更 高8至1 〇的係數。 驚人的是，在感興趣之蛋白質與螢光蛋白質之間的表 現，亦有極佳的關連。這在共同-轉移感染的案例中是更加 真實的，若·像是用來表現抗體-兩個分別藉其自己之載體表 現的免疫球蛋白鏈，並在FACS中可僅對—個鏈的表現進^ 分類篩選’因為其轉錄與螢光蛋白質偶聯。螢光蛋白質的 高表現率，對於細胞的生長和存活沒有任何負面的影響。 O:\89\g91I4.DOC -12* 1321152 此外，與傳統逐步的基因擴策 傾a來％相比較’亦可降低篩選 高生產細胞的發育時間至少一丰，社 牛'，、°果明顯地降低了發展 效能和成本。 【實施方式】 根據本發明之表現載體含有編碼感興趣之蛋白質的基因 ("感興趣之基因"），在功能上與倉鼠泛素助3啟動基因， 以及編碼螢光蛋白質的基因連接。該表現載體最好亦含有 可擴大的可選擇標記基因。 倉鼠-泛素/S27a啟動其闵 倉鼠的泛.素/S27a啟動基因是有力的同種啟動基因，在 W0 97/15664中描述之。這類啟動基因最好具有至少一個下 列的特徵··富含GC之序列區、Spl結合位置、聚_元件、 缺乏TATA盒子。特佳的是具有Spl結合位置但缺乏TATA盒 子的啟動基因。較佳的還有在本質上是激活的且特別是 在含有血清、低血清和不含血清培養條件下具有相等活性 的啟動基因。在另一個具體實施例中，它是可誘導的啟動 基因’特別是由移除血清而激活的啟動基因。 特別有利的啟動基因是具有如同在w〇 97/15664之圖5中 所含有的核甞酸序列的啟動基因。特佳的是含有得自圖5之 位置-161至-45的啟動基因序列。 在本發明說明書之實例中使用的啟動基因，分別含有具 有從附錄之序列一覽表之序列第1號的位置1923至24〇6之 序列的DNA分子。該序列相當於得自w〇 97/15664之圖5的 片段-372至+1Π，並代表較佳的啟動基因，即應該併入該 O:\89\89114.DOC -13· 1321152 序列區之較佳的啟動基因。其他適當的啟動基因片段含有 得自位置2134至2406的序列（相當於W0 97/15664之圖5中 的-161至+111)。僅含有得自位置2251至24〇6之序列的啟動 基因不再具有功能（相當於WO 97/15664之圖5中位置-45至 + 111)。有可能在5'方向從位置2143開始擴展啟動基因序列。 亦可能使用完整倉鼠泛素/S27a啟動基因序列的功能亞 片段，以及其亞片段之完整序列的功能突變種/變體，其已 經藉著例如取代、插入或刪除而加以修改。在後文中亦將 相當的亞片段、突變種或變體稱為"經過修改的啟動基因"。 經過修改的啟動基因，可視需要與其他調節元件混合， 最好具有轉錄活性，其符合得自在序列第1號中提供之核甞 酸序列位置1923至2406的啟動基因片段（得自w〇 97/15664 之圖5的-372至+111 )。經過修改的啟動基因被發現可用在本 發明之目的上，若其在比較報告者基因測定中具有轉錄活 性，該活性為1923至2406片段（_372至+111片段）的至少 50%，較佳的是至少80%，更佳的是至少9〇%，而最佳的是 至少10 0 %。特佳的是經過修改的啟動基因，其對倉鼠泛素 /S27a啟動基因之野外型序列序列第i號具有至少8〇%，較佳 的疋至少85%，更佳的是至少9〇%，再更佳的是至少95〇/〇， 而最佳的是至少97〇/〇的最低序列同種性，並在比較報告者 基因測定中具有一致的啟動基因活性。 在相對應的比較報告者基因測定中，欲測試之啟動基因 片段包括選殖到無啟動基因之報告者基因之前的參考序 列，該報告者基因編碼例如蟲螢光素酶、分泌性鹼性磷酸 O:\89\89114.DOC -14· 1321152 酶或綠營光蛋白質（GFP)。隨後藉著轉移感染，將這些構築 體（啟動基因序列+報告者基因）導入受試細胞，例如 CHO-DG44内，並藉著測量報告者基因之蛋白質内含量，判 定由正在討論之啟動基因片段誘導的報告者基因表現。在 例如 Ausubel 等人，Current Pr0tocols in 腕咖心 Bi〇1〇gy , 1994 ’更新版中發現相當的測試。 倉鼠泛素/S27a啟動基因的啟動基因序列和經過修改的 啟動基因，亦可包括例如5,不轉譯區或其選出之片段，以及 泛素/S27a基因或其選出之片段，可由具有在w〇 97/15664 中描述之序列的知識的熟諸此藝者，使用❹在 等人，1989; Ausubel等人，1994中描述的各種標準方法獲 得。例如，可從在W 〇 9 7 /丨5 6 6 4中描述的序列開始，選擇適 當的片段，並以化學方式合成含有該溶離份之序列的寡核 甞酸探針。例如，可使用這類探針，例如藉著雜交作用從 倉鼠基因組中選殖泛素/S27a基因或5,不轉譯區或其其他片 段。使用上述的報告者基因測定，熟練者的工作不需費任 何力氣便可確認具有啟動基因活性的片段，並為了本發明 之目的使用它們。可藉著PCR擴大，利用得自基因組dna 或基因組庫的相當引子，輕易地獲得5，不轉譯區或其獨特片 段。亦可藉著限制核酸外切酶π消化，從較大的DNa片段 中獲得5’不轉譯區的片段。亦可以化學方式合成這類簡a 刀子，或藉著連接從以化學方式合成的片段中產製。 可藉著”指定位置之突變生成作用”及/或"以pcR為基礎 之犬變生成作用技術"，產製刪除、插入和取代突變種。在例

O:\89\89114.DOC 15 1321152 如Lottspeich和Zorbas 1998第36.1章中提及相當的方法，作 為進一步的參考。 藉著利用得自倉鼠泛素/S27a基因之5,不轉譯區或得自倉 鼠泛素S27a基因之S27a部分之探針的交又-雜交作用亦可 能從其他，最好是哺乳動物之相當的同種基因中，確認和 分離適當的啟動基因序列。在例如L〇ttspeicl^a z〇rbas 1998 第23章中描述了適當的技術。為了本發明，若基因之核苷 酸序列對與其同種之基因的核：y：酸序列顯露出至少7〇%， 較佳的是至少80%，更佳的是至少9〇%，再更佳的是至少 95%，且最佳的是至少97%的一致性，則該基因是，，同種的 感興趣之篡闵 在根據本發明之表現載體中所含有的感興趣基因，包括 編瑪感興趣產物之任何長度的核苷酸序列。基因產物或"感 興趣產物’I通常是蛋白f、多肽、肽或其片段杨生物。然 而，它亦可以是RNA或反義RNAe感興趣之基因可以其全 2、縮短之形4，融合基因或已標示之基因的形式存在。 匕可以疋基因組DNA，或最好是⑶财或相當的融合片段。 感興趣之基因可以是天然的基因序％，或可以是突變或另 行修改的。這類修改包括適應特殊宿主細胞的密嫣子最優 1人類化作用。感興趣之基因’例如可編碼分泌性 '細 胞貝的位在核中、與膜結合或與細胞表面結合的多狀。 核芽酸序列"或”核酸序列”一詞代表寡核芬酸、核芬酸、 ^ ^甘心及其片#又，以及基因叙或合成來源的dna或 RNA’其以單或雙股出現，並可代表基因的密碼或非-密碼

O:\89\89114.DOC -16- 1321152 股。可使用標準技術，如指定位置之突變生成作用或PCR 調解之突變生成作用（例如在Sambrook等人，1989或 Ausubel等人，1994中描述的），修改核酸序列。 "編碼”意指在核酸中特定序列之核苷酸的特性或性能， 例如在染色體或mRNA中的基因，在生物製程中作為基質， 用來合成其他的聚合物和大分子，例如rRNA、tRNA、 mRNA、其他的RNA分子' cDNA或多肽。因此，若藉著mRNA 之轉錄和後續的轉譯，在細胞或其他生物系統中產製想生 的蛋白質，則基因編碼蛋白質。可將其核苷酸序列與mRNA 序列相同，.且正常亦在序列資料銀行，例如EMBL或 GenBank中提供的密碼股，還有作為轉錄基質之基因或 cDNA的非密碼股兩者，稱為用來編碼產物或蛋白質。編碼 蛋白質之核酸，亦包括以簡併遺傳密碼為基礎，具有不同 順序之核钻酸序列，但結果產生相同胺基酸序列之蛋白質 的核酸。編碼蛋白質之核酸序列亦可含有插入序列。 cDNA—詞代表脫氧核糖核酸，藉著逆轉錄，並由mRNA 或其他從基因中產生之RNA合成第二股DNA來製備。若 cDNA以雙股DNA分子之形式出現，其含有密碼和非密碼股 兩者。 插入序列一詞代表任何長度的非-密碼核苷酸序列。它們 天然出現在許多真核生物基因中，並藉著稱為拼接的過 程，從先前轉錄之mRNA前驅物中移除。這需要在5'和3'端 精確地切開插入序列，並正確地連接所得的mRNA末端，而 得以產生成熟加工的mRNA，具有可供成功地合成蛋白質之 O:\89\89H4.DOC -17- 1321152 正確的編閱架構。許多接合捐贈者和接合接受者位置涉及 該拼接過程’即直接位在表現序列-插入序列或插入序列_ 表現序列^面，已經以特徵的序列。關於總論，參見 Ohshima等人，1987 ° ^ 感興趣之蛋白f 素 具有生物藥學重要性的蛋白質/多肽，包括例如抗體 '酵 、細胞素、淋巴激動素'料分子、受體及其衍生物或 片段，但不限於此。通常’所有作為激動劑或括抗劑，並/ 或具有治療或診斷用途的多肽均是有價值的。 "多肽詞係供胺基酸序列或蛋白質使用，並意指任 何長度之胺基酸的聚合物。該詞亦包括已經在轉譯後，藉 著像糖基化作肖、磷酸化作用、乙酿化作用或蛋白質加工 之反應修改的蛋白質^藉著例如取代、刪除或插入胺基 酸，以及與其他蛋白質融合，同時仍保留其生物活性，= 修改蛋白質的結構。 治療性蛋白質的實例為胰島素、類騰島素生長因子 '人 類生長荷爾蒙（hGH)和其他生長因子、組織灰纖維蛋白溶酶 原激活劑（tPA)、紅&球生成素（Ep〇)、細胞素，例如介白素 (IL)，如 IL_2、IL-3、α·4、IL5 ' 、iL7 n 因子（TNF)，如 TNF_a、歧 p TRAa、g csf、、 M-CSF、MCP_^VEGF。其他的實例為單株、多株、多專 一性和單鏈抗體，及其片段，像是例如Fab、Fab,、F(ab，）2、

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Fc和Fc'片段、輕（L)和重（H)免疫球蛋白鏈，及其恆定、可 變或高變區，以及Fv*Fd片段（Cham〇v等人，1999)。該抗 體可以是人類或非-人類來源的。人類化和嵌合型抗體亦是 可能的。

Fab片段（抗原結合片段=Fab)由兩個鏈的可變區組成，其 藉著相鄰的恆定區維持在一起。例如可藉著以蛋白酶處 理，如木瓜蛋白酶，或藉著DNA選殖，從傳統的抗體中產 生它們。其他抗體片段為F(ab，）2片段，其可藉著利用胃蛋 白酶的蛋白水解消化產生。 亦可能藉著基因選殖，製備縮短的抗體片段，其僅由重 (VH)和輕鏈（VL)的可變區組成。在這些Fv片段中，不可能 經由恆定鏈的半胱胺酸基團共價結合，通常藉著一些其他 的方法使其穩定。為了該目的，通常藉著大約1〇至3〇個胺 基酸，最好是15個胺基酸的短肽片段，將重和輕鏈的可變 區連接在一起。這產生其中藉著肽交聯劑連接在一起的單 多肽鏈。亦將這類抗體片段稱為單鏈卜片段（scFv)。“π 抗體的實例是已經並已被描述的，參照，例如Hust〇n等人， 1988。 近年來，已經發展出各種產製多聚體scFv衍生物的策 略。企圖產製具有改良之藥物動力學特性，並增加結合之 抗體親抗原性的重組抗體。為了達到scFv片段的多聚化作 用（nmUimedsation)，可以帶有多聚化功能部位之融合蛋 白質的形式產製它們。多聚作用功能部位可以是例如 之CH3區或螺旋結構（"卷曲螺旋結構"），如亮胺酸-拉鍊 1321152 功能部位。在其他策略中，使用在scFv片段之VH和 區之間的交互作用來進行多聚化作用（例如微型雙功能抗 體（diabodies)、微型三功能抗體（trib〇dies)和微型五功能抗 體（pentabodies))。 在此項技藝中使用的微型雙功能抗體一詞，代表二價的 同一聚體scFv衍生物。在scFv分子中將肽交聯劑縮短至 個胺基酸，結果藉著使VH/VL鏈超重疊，形成同二聚體。 可藉著插入二硫橋，使微型雙功能抗體更穩定。可在例如 Perisic等人，1994中找到微型雙功能抗體的實例。 在此項技藝中使用的微抗體（minibody)，代表二價的同二 聚體scFv衍生物。它由融合蛋白質組成，其含有作為二聚 化作用區之免疫球蛋白，較佳的是][gG，最好是1§(}1的€113 區。藉著鉸鏈區，亦屬於IgG，和交聯劑區與scFv連接。由 Hu等人，1996描述了這類微抗體的實例。 在此項技藝中使用的微型三功能抗體，代表三價的同三 聚體scFv衍生物（Kortt等人，1997)。VH-VL的直接融合不 需使用交聯劑序列，導致三聚體的形成。 在此項技藝中已知為迷你抗體（mini antibody)的片段，其 具有二-、三-或四價的結構，亦為scFv片段的衍生物。藉著 二-、三-或四聚體的卷曲螺旋結構，達成多聚化作用（Pack 等人，1993和 1995 ; Lovejoy等人，1993)。 誨碼螢光漂白皙的其田 根據本發明之表現載體含有編碼螢光蛋白質之基因，在 功能上與感興趣之基因連接，並在倉鼠-泛素/S27a啟動基

O:\89\891I4.DOC -20- 1321152 因、經過修改之倉鼠-泛素/S27a啟動基因或其同系物的控制 之下。 螢光蛋白質可以是例如綠、淺藍色、藍色、黃色或其他 顏色的螢光蛋白質。一個特定的實例為獲自維多利亞水母 或腎形水母（Renilla reniformis)的綠螢光蛋白（GFP) ’以及 從其中發展出的突變種；參見例如Bennet等人，1998 ; Chalfie等人，1994 ; WO 01/04306及其中提及的文獻。 在 WO 00/34318、WO 00/34326、WO 00/34526和 WO 01/27150 中 描述了其他的螢光蛋白質和編碼它們的基因，以引用的方 式併入本文中。這些螢光蛋白質是物種珊蝴綱（Anthozoa)， 例如馬哈諾珊蝴（Anemonia majano)、羽珊蝴（Clavularia sp.)、紐扣珊湖（Zoanthus sp.) I 、钮扣珊蝴Π、海葵 (Discosoma striata)、香兹珊蝴（Discosoma sp.)"紅色"、香兹 珊瑚”綠色"、香菇珊蝴"紫紅色"皺摺海葵（Anemonia sulcata) 之非-生物發光生物的螢光團。 除了野外-型蛋白質之外，根據本發明使用之螢光蛋白質 亦包含天然或以遺傳方式設計的突變種和變體、其片段、 衍生物或變體，其已經例如與其他的蛋白質或肽融合。·所 使用之突變，例如可改變激發或發射光譜、發色團的形成、 該蛋白質之消光係數或穩定性。此外，可藉著密碼子最優 化作用，改善在哺乳動物或其他物種中的表現。根據本發 明，亦可使用與可選擇標記融合的螢光蛋白質，較佳的是 可擴大的可選擇標記，如二氫葉酸還原酶（DHFR)。 藉著螢光蛋白質放出的螢光，使其得以檢測到該蛋白 O:\89\89114.DOC -21- =例如藉著具有f光激活細胞分類（FACS)的通流細胞儀 或稭著螢光顯微鏡。 調節元侔 . π可在功能上將倉鼠.泛素/S27a啟動基因與其他調節序列 此合’以便增加/調節在表現卡E令的轉錄活性。 例如，可在功能上將啟動基因與促進子序列連接，以便 曰轉錄活/ 生。為了這個，可使用一或多個促進子及/或促 進子序列的數個副本，例如CMV或sV40促進子。 促進子一詞代表多核甞酸序列，其以順向位置作用在啟 因的活性上，並因此刺激在功能上與該啟動基因連結 之基因的轉錄。不像啟動基因，促進子的影響與位置和方 位無關，並因此可將它們放在轉錄單位之前或之後，在插 入序列内，或甚至是在密碼區内。促進子可緊鄰轉錄單位， 亚離啟動基因一段相當遠的距離。’亦T能與啟動基因有物 理及功能上的重疊。熟諳此藝者將知曉得自各種來源的許 夕促進子（並存放在資料銀行中，如GenBank，例如s V40促 進子、CMV促進子、多瘤病毒促進子、腺病毒促進子），可 以獨立元件或選殖到多核苷酸序列内之元件的形式獲得 (例如存放在ATCC，獲得自商業和工業來源）。許多啟動基 因序列亦含有促進子序列，如經常使用的CMV啟動基因。 人類CMV促進子是迄今確認之最強的促進子之一。一個可 誘導之促進子的實例為金屬硫肽促進子，可藉著糖皮質激 素或重金屬刺激之。 其他可能的修改是’例如多個Sp 1結合位置的導入。啟動 O:\89\89IU.DOC -22- 1321152 2因序列亦可與調節序列混合，其容許轉錄活性的控制/調 卽。因此，可將啟動基因製成可壓抑的/可誘導的。例如， 可藉著將屬於結合位置之序列與向上_或下·調節之轉錄因 連接來進行之。上文提及的轉錄因子Spl，例如對轉錄 活性具有正面的影響。另一個實例為活化劑蛋白質AP1之結 合位置，其可正面和負面地作用在轉錄作用上。可藉著所 有種類的因子來控制A p 1之活性，例如生長因子、細胞素和 /月（Faisst專人，1992及其中的參考文獻）。亦可藉著經由 一二或更多個驗基之突變（取代、插入或刪除），改變 啟動基因序列，來增加轉錄效力，然後在報告者基因測定 中判定’這是否增加了啟動基因活性。 基本上，額外的調節元件包括倉鼠-泛素/S27a啟動基因以 外的啟動基因、促進子、中止和聚腺苷酸化作用信號，以 及’、他的表現控制元件。已知適合各種細胞類型之可誘導 和在組成上的調節序列。"轉錄_調節元件"通常包括在待表 現之基因序列上游的啟動基因、轉錄開始和中止位置，以 及聚腺苷酸化作用信號。 啟動基因一詞代表多核苷酸序列，其容許並控制在功能 上與其連接之基因或序列的轉錄。啟動基因含有與RNA聚 合酶結合的認知序列，以及轉錄的開始位置（轉錄開始位 置）°為了在某些細胞類型或宿主細胞中表現想要的序列， 必須選擇具有適當功能的啟動基因。熟諳此藝者熟悉得自 各種來源的各種啟動基因，包括在組成上的、可誘導的和 可抑的啟動基因。它們被存放在資料銀行，例如

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GenBank，並可以個別的元件，或撰 次選殖到得自商業或工業來 源的多核嘗酸序列内之元件的形式獲得。在可誘導的啟動 基因中，可反應㈣而降低或增加啟動基因的活性。一個 可誘導之啟動基因的實例，是四環素_啟動基因。該啟 動基因含有四環素操縱基因序列(叫可藉著四環素調 節的轉活化劑蛋白質（叫誘導它。當出現四環素時，抑制 了 tTA與tet0的結合。其他可誘導之啟動基因的實例為細、 、金屬硫肽和熱休克啟動基因（亦參等人， 1989; G〇Ssen等人，1994)。特別適合在真核生物中高度表 現的啟動基因，例如有SV40早期啟動基因、腺病毒主要晚 期啟動基因、老鼠金屬硫肽-：[啟動基因、勞氏肉瘤病毒的 長終端重複區和人類細胞巨大病毒的早期啟動基因。其他 異種哺乳動物啟動基因的實例，是肌動蛋白、免疫球蛋白 或熱休克啟動基因（們）。 "轉錄開始位置”一詞意指在構築體中的核酸，其與被併 入主要轉錄本’即mRN A也驅物的第一個核酸一致。轉錄開 始位置可與啟動基因序列重疊。 "轉錄中止位置"一詞意指正常在感興趣基因或待轉錄之 基因段之3,端的核苷酸序列’且其藉著rna聚合酶引起轉錄 的中止。 "聚腺苷酸化作用信號”是在真核生物mRN A之3'端的特 定位置，引起切開的信號序列’並在轉錄後在被切開的3, 端併入大約100-200個腺嘌呤核：y：酸（聚A尾）。聚腺苷酸化 作用信號包括序列AATAAA ’在切開位置的大約1 〇-3〇個核 O:\89\89U4.DOC 24- 1321152 苷酸上游，以及位在下游的序列。已知各種聚腺苷酸化作 用元件，如tk聚A、SV40晚期和早期聚A或A(在例如 美國專利第5，122,458號中描述）。 在本發明較佳的具體實施例中，每個轉錄單位均具有啟 動基因或啟動基因/促進子元件、感興趣之基因及/或標記基 因以及轉錄中止元件。在另一個較佳的具體實施例中， 轉錄單位含有兩個更進一步的轉譯調節單位。 ’’轉譯調節元件"對於每個待表現之多肽而言，包括轉譯 開始位置（AUG) '中止密碼子和聚A信號。至於最佳表現， 移除、添力σ.或改變待表現之核酸序列的5，-及/或3 不轉譯 區可此是明智的，以便排除任何可能不適當的額外轉譯 開始密碼子，或其他可能影響在轉譯時之表現或表現程度 的序列。為了促進表現，可將核糖體一致結合位置另行插 入緊接在起始密碼子的上游^為了產生分泌性多肽，通常 感興趣之基因含有信號序列，其編碼信號前驅物肽，將已 經合成的多肽運送並通過ER膜。信號序列通常，但並非總 是位在分泌性多肽的胺基終端，並可在已經將該蛋白質插 入通過ER膜之後，藉著信號肽酶切開。基因序列通常但不 一定含有它自己的信號序列。若天然的信號序列並未出 現，則可以已知的方式，導入異種的信號序列。熟諳此藝 者知道該種類的許多信號序列，並存放在序列資料銀行 中，如GenBank和EMBL。 根據本發明一個重要的調節元件，是内部核糖體進入位 置（IRES)。IRES元件包括不依賴基因上游5，_終端甲基鳥脅

O:\89\89114.DOC • 25- 1321152 呤核甞鑌（guanosinium)帽（CAP結構）的在功能上激活轉譯 開始之序列，並在動物細胞中容許從單一轉錄本中轉譯兩 個順反子。該IRES元件替緊接在下游之開放編閱架構的轉 譯，提供了獨立的核糖體進入位置。與細菌的mRNA相反， 其可以是多順反子的’即它可編碼許多不同的多肽或產 物’藉著mRNA在另一個之後轉譯一個，大多數得自動物細 胞的mRNA是單順反子的，並僅編碼一個蛋白質或產物。在 真核生物細胞中之多順反子轉錄本的案例中，轉譯將從最 接近上游的轉譯開始位置開始，並將由第一個中止密碼子 中止，隨後將從核糖體中釋放出轉錄本。因此，在轉譯期 間將僅產生由mRNA編碼的第一個多肽或產物。相反的，具 有IRES元件的多順反子轉錄本，該IRES在功能上與在轉錄 本中第二個或後續的開放編閱架構連接，容許位在其下游 之開放編閱架構的後續轉譯’而得以在真核生物細胞中， 產生二或多個由相同轉錄本編碼的多肽或產物》 IRES元件可具有各種長度和各種來源，並可起源自例如 腦心肌炎病毒（EMCV)或其他細小核糖核酸病毒。在文獻令 描述了各種IRES序列及其在建構載體上的用途，參見例如

Pelletier等人 ’ 1988 ; Jang等人，1989 ; Davies等人，1992 ; Adam等人，1991 ; Morgan等人，1992 ; Sugimoto 等人，1994 ;

Ramesh等人，1996 ; Mosser等人，1997。 位在下游的基因序列在功能上與IRES元件的3'端連接， 即選擇間隔距離，以致於不影響或僅稍微影響基因的表 現，或為了想要的目的而有充分的表現。可藉著簡單的實 0:\89\89114.£>0C -26· 丄川152 驗，藉著改變間隔，並使用報告者基因測定，以間隔為函 數判定表現速率，來判定在IRES元件和位在其下游之基因 的起始密碼子之間，可供充分表現的最佳許可距離。 精著所述之測量值，有可能獲得最佳表現卡匣，其對於 異種基因產物表現相當有價值。因此，藉著一或多個這類 測$所獲得的表現卡匣，是本發明更進—步的目標。 的可選欉楹纪基因 根據本發明之較佳載體，額外地含有可擴大的可選擇標 s己基因，其容許可擴大之可選擇標記的擴大，且最好是由 倉鼠·泛素/S27a基因、感興趣之基因和螢光蛋白質之基因所 組成之轉錄單位的共同-擴大。關於此點，在適當之選擇劑 的存在下，培養以相當之表現載體轉移感染的宿主細胞， 使得只有至少具有可擴大之可選擇標記基因的許多基因副 本的那些宿主細胞能夠複製（被複製）(>這最好是在漸增含量 之選擇劑的存在下，藉著逐步培養細胞而達成。 可擴大的可選擇標記基因通常編碼真核生物細胞在某些 。養條件下生長所需的酵素。例如，可擴大的可選擇標記 基因可編碼二氫葉酸還原酶（DHFR)e在該案例中，若在選 擇劑胺甲碟彳（MTX)的存在下培養以其轉移感染的宿主細 胞，則擴大該基因。 下列的表1提供其他可擴大之可選擇標記基因和相關選 擇劑的實例，可根據本發明使用之，並在Kaufman，Methods inEnzymology，185:537_566(199〇)的總論中描述。 1321152 ^-1 · 可選擇標記基因 ------M :¾ 评你 記基因 su签㈡ 登錄號碼 選擇劑 一氣葉吸還原酶 M19869(倉鼠） E00236(老鼠） 胺曱碟呤(MTX) 金屬^1狀^ D10551(倉鼠） M13003(人類） Ml 1794(大鼠） 锡 CAD(胺甲醯基磷酸合成 酶：天冬胺酸轉胺甲醯酶： '一風乳清酸酶） M23652(倉鼠） D78586(人類） N-磷乙醯基-L-天冬胺 酸酶 腺苷脫胺酶 K02567(人類） Μ10319(老鼠） Xyl-A-或腺:y：， 2'脫氧助間黴素 amp(腺嗓呤核:y：酸)_脫胺 酶 D12775(人類） J02811(大鼠） 腺嘌呤，重氮絲胺酸， 助間型黴素 UMP-合成酶 J03626(人類） 6-氮尿菩，P比β坐吱η南 IMP 5’-脫氫酶 J04209(倉鼠） J04208(人類） M33934(老鼠） 黴酚酸 黃嗓吟素-鳥嗓吟-轉填酸核 糖基酶 X00221(大腸桿菌） 黴酚酸與有限的黃嘌 吟素 突變的HGPRT酶或突變的 胸腺核嘗-激酶 J00060(倉鼠） M13542， K02581(人類） J00423 ， Μ68489(老鼠） Μ63983(大鼠） Μ36160(疮疹病 毒） 次黃嗓吟、胺基蝶吟和 胸腺核甞(HAT) 胸苷酸-合成酶 D00596(人類） Μ13019(老鼠） L12138(大鼠） 5-氟脫氧尿苷 P-糖蛋白 170(MDR1) AF016535(人類） J03398(老鼠） 數種藥物，例如亞德里 亞黴素、長春新驗、秋 水仙素 O:\89\89114.DOC -28- 1321152 核糖核苷酸還原酶 Μ 啡23， Κ02927(老鼠） 阿非迪黴素 (aphidicoline) 縠胺醯胺-合成酶 AF 150961(倉鼠） U09114 ， M60803(老鼠） M29579(大鼠） 甲硫胺酸颯亞胺 (sulphoximine)(MSX) 天冬胺酸-合成酶 M27838(倉鼠） M27396(人類） U38940(老鼠） U07202(大鼠） /3-天冬胺醯基異羥肟 酸，合歡氨酸，5'氮胞 嘗 精胺基號ίό酸合成酶 X01630(人類） M31690(老鼠） M26198(牛） 刀豆氮酸 鳥胺酸-脫羧酶 M34158(人類） J03733(老鼠） M16982(大鼠） α-二氟甲基烏胺酸 HMG-CoA-還原酶 L00183 ， M12705(倉鼠） Ml 1058(人類） 密實菌素(compactin) N-乙醯胺基葡萄糖基-轉移 酶 M55621(人類） 突尼卡黴素 棘胺酿基-tRNA-合成酶 M63180(人類） 疏螺體素 Na+K+-ATP 酶 J05096(人類） M14511(大鼠） 烏本菩 根據本發明，所使用之可擴大的可選擇標記基因最好是 編媽具有DHFR功能之多肽的基因，例如DHFR或來自螢光 蛋白質與DHFR之融合蛋白質。DHFR為嘌呤之生物合成所 必須的。缺乏DHFR基因之細胞不能在嘌呤-缺陷培養基中 生長。因此DHFR是有用的可選擇標記，在培養在不含嘌呤 之培養基的細胞中，用來篩選和擴大基因。與DHFR基因一 起使用的選擇介質為胺甲碟呤（MTX)。因此，本發明包括 O:\89\89114.DOC •29- 1321152 製備高生產力之重組宿主細胞的方法，其含有下列步驟： ⑴以編碼至少一個感興趣之蛋白質、螢光蛋白質和DHFR 的基因轉移感染宿主細胞；（ii)在容許各種基因表現的條件 下培養該細胞，並（iii)藉著在容許擴大至少一個可擴大之可 選擇標記基因的選擇劑，如胺甲碟呤的存在下培養細胞， 擴大共同-整合的基因。較佳的是在不含次黃嘌呤/胸腺核苷 之培養基中，在缺乏血清下，並添加漸增濃度的MTX，來 培養經過轉移感染的細胞。在第一個擴大步驟中，MTX的 濃度最好是至少200 nM，而在更佳的具體實施例中，為至 少500 nM，並可逐步增力口至1 μΜ。在個別的案例中，可使 用超過1 μΜ的濃度。 哺乳動物細胞，最好是老鼠骨趙瘤和倉鼠細胞，是使用 DHFR作為可擴大之可選擇標記的較佳宿主細胞。細胞株 CHO-DUKX(ATCC CRL-9096)和 CHO-GD44(Urlaub 等人， 1983)是特佳的，因為它們由於突變的結果，本身沒有DHFR 活性。為了能夠在其他具有它們自己内源之DHFR活性的細 胞類型中，使用DHFR-誘導之擴大作用，可能在轉移感染 的過程中使用突變的DHFR基因，其編碼具有降低對胺甲碟 吟之敏感性的蛋白質（Simonson等人，1983 ; Wigler等人， 1980 ; Haber等人，1982)。 根攄本發明之表現載體的Μ備 在理論上，可藉著此項技藝中已知的傳統方法，例如由 Sambrook等人（1989)描述的，來製備根據本發明之表現載 體。Sambrook亦描述載體的功能性組份，例如適當的啟動 O:\89\891I4.DOC -30- 1321152 基因（除了倉鼠泛素/S27a啟動基因之外）、促進子、中止和 斌腺％•酸化作用信號、抗生素抗藥性基因、可選擇標記、 设製起點和拼接信號。可使用傳統的選殖载體來產製它 們，例如質體、噗菌體、嗟菌體質體、粘接質體或病毒載 體，如桿狀病毒、逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒伴隨病毒 和早純疱疹病毒，以及人造的染色體/迷你染色體。真核生 物的表現載體，通常亦含有原核生物序列，例如複製起點 和柷生素抗藥性基因，其容許載體在細菌中複製和篩選。 已关許夕3有夕個用來導入多核芬酸序列之選殖位置的真 核生物表現载體，且有些可購自各種公司，如Stratagene， la CA，USA，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA ; ega Madison ’ Wl，USA或 BD Biosciences Clontech， Palo Alto，CA，USA。 以熟諳此藝者熟悉之方式，將倉鼠-泛素/S27a啟動基因、 感/、趣之基因、編碼螢光蛋白質之基因，最好還有可擴大 的可選擇標記基因，例如二氫葉酸還原酶，可視需要有額 外的調節元件’如内部核糖體進入位置（ires)、促進子或 聚腺苷酸化作用信號，導入表現載體内。根據本發明之表 現載體’最少含有泛素/s27a啟動基因、感興趣之基因，以 及編碼螢光蛋白質之基因。表現載體最好亦含有可擴大的 可選擇标„己基因。根據本發明，亦可使用經過修改的泛素 狂啟動基因’例如在本發明中描述之經過修改的泛素 /S27a啟動基因。特佳的是其巾在功能上將泛素啟動基因、 感-趣之基因和編碼螢光蛋白質之基因連接在—^的表現

O:\89\i91M.DOC 1321152 載體。 在本說明之範圍内，"在功能上連接”或"以功能連接"一巧 意==酸序列或部分序列，安置它們使其得以執 :例如’若啟動基因/促進子能夠以 位置，控制或調節已連接之基因序 上與密碼基因序列連接β通常，但不—則其在功能 的DNA序列緊靠在一起，且若 在功能上連接 在分泌信號序列的案例中，是在：碼基因序列’或 在功能上連接的啟動基因通常㈣卜雖然 、也x ^ k常疋位在密碼基因序列的上 游，但匕不.一定必須靠近它。促進子不必靠近任-個，立 限制條件為它們協助基因序列的轉錄。為了該目的，它們 ==上游和下游’可能離它-段距離。聚腺答 1仙位置在功能上與基因序料接，若將它安置在基 ιΙΓ/’以這種方式，轉錄經由密碼序列進行至聚腺 二：技ΤΓ根據傳統的重組方法發生連接，例如 二接二右著在適當限制切開位置處的連接，或藉 :拼接右_利用的適當切開位置，則可以已知的方 ,用合成的寡核芬酸交聯劑或接合體本身。根據本發 明’表好不經由插人序列發生在功能上的連接。 在所述的-個具體實施例中，在功能上將泛素/S27a啟動 土或改形式、感興趣之基因和編碼營光蛋白質的基 2接在一起。這意指例如，從相同的泛素助a啟動基因 乂改开V式中，開始表現感興趣之基因和編碼螢光蛋白 因在特佳的具體實施例中，經由IRES元件發生該

O:\89\89114.DOC -32- 1321152 功能上的連接，而得以從兩個基因合成二順反子爪職。根 據本發明之表現載體，可額外地含有促進子元件，其在功 能上對一或多個啟動基因發揮作用。特佳的是其中將泛素 /S27a啟動基因或其修改形式與促進子元件，例如sv仂促進 子或CMV促進子元件連接的表現載體。 基本上’在表現載體内之基 錄單位開始發生。將轉錄單位定義為含有__或多個待轉轉 之基因的區域。在轉錄單位内之基因’在功能上與另—個 連接，以這種方式使所有在這類單位中的基因，均在相同 啟動基因或啟動基晴進子的轉錄控制之下。該基因之 錄連接的結果，是可從一個轉錄單位中轉錄一種以上的蛋 2質或產物，並藉此表現之。每個轉錄單位均含有其中所 基因序列的轉錄和轉譯所需之調節元件。每個轉錄 :位均可含有相同或不同的調節元件。可使軸元件或 入序列進行在轉錄單位中之基因的功能連接。 = 見載體可含有用來表現感興趣之基因、營光蛋白質之 广：擴大之可選擇標記基因的單—轉錄單位。或者， 中因安排在二或多個轉錄單位中。在轉錄單位 施財==可能的。在本發明的另-個具體實 連續轉移^ ❹，或在按照任何想要順序的 成的表現載^插將個以上’由―、二或多個轉錄單位組 疋件和基因的㈣組合，其 載體上調即 分表現。若需要’可將其他的調節：=錄單位的充 孝基因，例如額外

0··細 9114.DOC •33· 1321152 的感興趣基因或可選擇標記，安置在表現載體上。 因此’根據本發明之表現載體可在一 j仕個或在兩個分開的 轉錄早位中，含有編碼螢光蛋白質之基因和可擴大之可選 擇標記基因。每個轉錄單位可轉錄並表現一或多個基因產 物。若在-個轉錄單位上含有兩個基因，其在相同的啟動 基因或啟動基因/促進子的控制之下，而最好是使用刪來 確保所有組份的功能連接。若是在兩個分開的轉錄單位中 含有編碼螢光蛋白質和可擴大之可選擇標記基因，則其可 在相同或不同啟動基因/促進子的控制之下。然而，對^可 選擇標記基.因而言，最好是使用其天然或較弱的異種啟動 基因，例如SV40早期啟動基因，且最好不使用促進子。在 本發明之範圍中，帶有兩個分開的轉錄單位的表現载體是 較佳的。一個（二順反子）轉錄單位含有感興趣之基因和編碼 螢光蛋白質之基因，而另一個轉錄單位則含有可擴大之可 選擇標記基因。較佳的是藉著編碼聚Α信號，最好是汰聚A、 BGH聚A或SV40聚A的序列，將每個轉錄單位限制在3,端。 根據本發明，較佳的還有那些代替感興趣之基因，只有 一個多重選瘦位置的載體，其容許經由核酸内切限制酶之 認知序列’選殖感興趣的基因。從先前技藝中知道所有種 類之核酸内切限制酶’以及相關之核酸内切限制酶的許多 認知序列。最好是使用作為認知序列，由至少六個核芬酸 組成的序列。可在例如Sambrook等人，1989中找到適當之 認知序列的一覽表。 宿主細胞 O:\89\89I14.DOC •34- 1321152 為了以根據本發明之表現載體轉移感染，使用真核生物 宿主細胞，最好是哺乳動物細胞，且更特定而言是嚅齒動 物細胞，如老鼠、大鼠和倉鼠細胞株。以根據本發明之表 現載體成功地轉移感染相當的細胞，結果產生經過轉化、 在遺傳上經過修改、重組或基因轉殖的細胞，其亦為本發 明的目標。 為了本發明，較佳的宿主細胞是倉鼠細胞，如BHK2 1、 ΒΗΚ TK·、CHO、CH0-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1 和CHO-DG44細胞，或這些細胞株的衍生物/子孫。特佳的 是CHO-DG44、CHO-DUKX、CH0-K1 和 BHK21細胞，特別 是CHO-DG44和CHO-DUKX細胞。得自老鼠的骨髓瘤細胞 也是適合的，較佳的是NSO和Sp2/0細胞，以及這些細胞株 的衍生物/子孫。 在下列的表2中提供了可根據本發明來使用之倉鼠和老 鼠細胞的實例。然而，亦可使用這些細胞的衍生物和子孫、 其他的哺乳動物細胞，包括但不限於人類、老鼠、大鼠、 猴子、嗡齒動物的細胞株，或真核生物細胞，包括但不限 於酵母菌、昆蟲和植物細胞，作為產製生物藥學蛋白質的 宿主細胞。 表2 :倉鼠和老鼠生產細胞株 細胞株 登錄編號 NSO ECASS第85110503號 Sp2/0-Agl4 ATCC CRL-1581 BHK21 ATCC CCL-10 O:\89\89II4.DOC -35- 1321152 BHKTK' ECACC 第 85011423 號 HaK ATCC CCL-15 2254-62.2(BHK-21 -衍生物） ATCC CRL-8544 CHO ECACC 第 8505302號 CH0-K1 ATCC CCL-61 CHO-DUKX (=CHO duk' * CHO/dhfr ) ATCC CRL-9096 CHO-DUKX B1 ATCC CRL-9010 CHO-DG44 Urlaub等人； Cell 32[2]，405-412，1983 CHO Pro-5 ATCC CRL-1781 V79 ATCC CCC-93 B14AF28-G3 ATCC CCL-14 CHL ECACC 第 87111906號 藉著傳統的方法（Sambrook等人，1989 ; Ausubel等人，1994)， 進行以多核苷酸或一個根據本發明之表現載體轉移感染真 核生物宿主細胞的作用。轉移感染的適當方法包括例如微 脂粒-調解之轉移感染、磷酸鈣共同沉澱、電穿透作用、聚 陽離子-(例如DEAE葡聚糖）調解之轉移感染、原生質體融 合、顯微注射和病毒感染。根據本發明，最好進行穩定的 轉移感染’其中將構築體整合到宿主細胞的基因組，或人 造染色體/迷你染色體内，或以穩定的方式，以附加體之形 式包含在宿主細胞内。提供最佳轉移感染效率，並在所討 O:\89\89114.DOC •36· 1321152 論之：主細胞中表現異種基因的轉移感染方法是較佳的。 按…、疋義將被插入伯主細胞中的每個序列或每個基因稱 為相對於宿主細胞的”異種戽， "禋序列或，，異種基因”。即使欲導入 之序列或欲導入之基因盥兮迨 一 ^伤主細胞的内源序列或内源基 因相同，亦適用。例如，將会& 將倉乳肌動蛋白基因導入倉鼠宿 主細胞中，按照定義亦是異種的基因。 在異種二聚體蛋白質，例如單株抗體（⑽）的重組產製 中’在理論上可藉著兩種不同的方法，進行適當宿主細胞 的轉移感染。該種類的mAb,s由許多次單元、重和輕鍵组 成。可將編碼這些次單元的基因收容在在單一質體上之獨 立的或多順反子的轉錄單位中，然後用該質體轉移感染宿 、-胞這止圖在整合至宿主細胞基因組内之後，確保基 因的化學計算表現。然而，在獨立轉錄單位的案例中，必 須藉此確保編碼不同蛋白質的mRNA展現出相同的穩定 性，以及轉錄和轉譯效力。在第二個案例中，藉著單一的 啟動基因’在多順反子之轉錄單位中發生基因的表現，並 僅形成一個轉錄本。藉著使用IRES元件，在第二和後續的 順反子中獲得基因的高效率内部轉譯抑制。然而，這些順 反子的表現速率比第—個順反子的更低，其藉著所謂的"加 帽依賴性前-開始複合物的轉譯開始，實質上比IRES-依賴 性轉譯開始更有效。為了達到順反子真正等莫耳的表現， 可導入額外的順反子間元件，例如其與IRES元件一起確保 均一的表現速率（WO 94/05785)。 v、他同產製許多異種蛋白質，其最妤係根據本發明的

O:\89\89U4.DOC •37· 1321152 可能路徑，是共同轉移感染，其中將基因分別整合至不同 的表現載體中。這具有可互相調整基因和基因產物之某些 比例的優點，藉此平衡在mRN A穩定性，以及在轉錄和轉譯 效力上的任何差異。此外，該表現載體是較穩定的，因為 它們的尺寸較小，且在選殖和轉移感染期間内較容易操作。 因此，在本發明一個特殊的具體實施例中，以一或多個 具有編碼一或多個其他感興趣蛋白質之基因的載體，額外 地轉移感染，最好是共同轉移感染宿主細胞。用來共同轉 移感染的其他載體或載體們，在相同的啟動基因/促進子組 合的控制之下，編碼例如其他感興趣之蛋白質或蛋白質 們，以及至少一個其他的可選擇標記，例如新黴素磷酸轉 移酶。 根據本發明，最好建立適應並在不含血清的條件下培養 的宿主細胞，可視需要在不含動物蛋白質/肽的培養基中培 養。可購得之培養基的實例，包括Ham's F12(Sigma，Deisenhofen， DE)、RPMI-1640(Sigma)、杜貝可氏（Dulbecco's)經過修改的 鷹式（Eagle’s)培養基（DMEM; Sigma)、最低營養需求培養基 (MEM; Sigma)、艾司可夫（Iscove's)經過修改的杜貝可氏培 養基（IMDM; Sigma)、CD-CHO(Invitrogen. Carlsbad，CA， USA)、CHO-S-SFMII(Invitrogen)、不含血清之 CHO-培養 基（Sigma)和不含蛋白質的CHO-培養基（Sigma)。可視需要 分別以各種化合物補充這些培養基，例如荷爾蒙及/或其他 的生長因子（例如胰島素、鐵傳遞蛋白、表皮生長因子、類 胰島素生長因子）、鹽類（例如氯化鈉、妈、鎮、碌酸鹽）、 O:\S9\S9114.DOC -38- 1321152 緩衝溶液（例如HEPES)、核甞（例如腺嘌呤核苷、胸腺核 甘）、穀胺醯胺、葡萄糖或其他相等的營養物、抗生素及/ 或微量元素。雖然根據本發明，不含血清的培養基是較佳 的，但亦可使用已經與適量血清混合的培養基來培養宿主 細胞。為了篩選表現一或多個可選擇標記基因的經過遺傳 修改之細胞，將一或多個選擇劑加至該培養基中。 選擇劑”一詞意指影響缺乏所討論之可選擇標記基因 的宿主細胞生長和存活的物質。例如，為了對表現抗生素 抗藥性基因，如新黴素磷酸轉移酶的存在來進行篩選，最 好使用抗生素選擇試劑（G418)作為培養基添加物。若所使 用之基因為可擴大的可選擇標記基因（參見奉丨），則選擇劑 也可以是誘發可選擇標記基因之擴大的物質。例如，胺甲 碟呤是選擇介質，其適合用來擴大DHFR基因。在表丨中列 舉了其他誘發擴大之選擇劑的實例。 可選擇標記基因是容許藉著在培養基中加入相符之選擇 劑’專一地篩選含有該基因之細胞的基因。舉例來說，可 使用抗生素抗藥性基因作為肯定的可選擇標記。只有已經 以該基因轉化的細胞，才能夠在相符之抗生素的存在下生 長，並因此筛選該細胞。換句話說，未經轉化的細胞不能 在這些選擇條件下生長或存活。有肯定的、否定的和雙重 功能的可選擇標記。肯定的可選擇標記允許藉著賦與對選 擇砌之抗藥性，或藉著補償在宿主細胞中之代謝或降解缺 陷’篩選經過轉化的細胞，並因此增強之。相反的，可藉 著否定的可選擇標記，選擇性地排除已經接受可選擇標記

O:\89\89114.DOC •39· 1321152 之基因的細豸其實例為單純疮療病毒的胸腺核替激酶基 因〃在,·.田胞中的表現與阿昔洛韋㈤和更昔洛拿 (gancycl〇vir)的同時加入，導致其之排除。在本發明中使用 的可選擇標記’包括可擴大的可選擇標記，包括以遺傳方 式修改的突變種和變體、片段、功能^物、衍生物、同 系物以及與其他蛋自冑或肽的融合，其限制條件為該可 選擇標記保留其選擇性質。這類衍生物在胺基酸序列中， 在視為有l擇I·生之區域或功能部位中展現出相當大的同種 文獻相述了許夕可選擇標記基因，包括雙重功能的（肯 定/否定的）標記（參見，例如w〇 92/〇8796和觸94/28143)。 *用在真核生物細胞中之可選擇標記的實例，包括胺基 糖答磷酸轉移酶（APH)、潮黴素磷酸轉移酶（hyg)、二氣葉 S夂還原酶（DHFR)、胸腺核答激酶（τκ)、榖胺醯胺合成酶、 天冬醢胺合成酶的基因，以及賦與對新徵素（G4i8)、 黴素、組織胺醇D、博签 .^ ' 得未黴素、腐草黴素和利歐辛（ze〇ci 之抗藥性的基因。 ） 亦可能藉著螢光_勒。、 踅尤激活細胞分類（FACS)來篩選經過 的細胞。關於此點，可 面標記或Μ蛋” ^ 料酶、細胞表 夕 蛋質（例如綠螢光蛋白質（GFP)及其得自維 夕利亞水母和腎形水母或其他物種的變體、紅螢光蛋白質 和其他顏色螢光的蛋白督，男丄 香兹珊，、級槽海參二付非生物發光生物(例如 經過轉化之細胞。 在明令，碁,- 疋使用DHFR基因來篩選以遺傳方式終

O:\89W9U4.DOC 1321152 改的（重組的）宿主細胞，作為可擴大的可選擇標記基因。在 使用DHFR陰性之基礎細胞，如ch〇_DG44或Ch〇DUkx 時，該標記特別適合用來篩選和後續的擴大，因為這些細 胞不表現内源的DHFR，並因此在不含嘌呤的培養基中;會 生長。結果，可使用這裡的DHFR*因作為優勢可選擇標 記，並在不含次黃嘌呤/胸腺核誓的培養基中筛選經過轉化 的細胞。為了獲得DHFR·調解之基因擴大，使用胺甲碟呤 (MXT)。藉著加入ΜΤχ，決定性地影響了生長特性。在細 胞的發酵強健性中，隨著ΜΤΧ濃度和擴大步驟的增加，觀 察到實質上的惡化》然而，驚人的是已經發現使用根據本 發明的純種系篩選系統’可增強重組的宿主細胞，其在高 濃度ΜΤΧ的存在下，展現出多很多的強健行為（參見圖7)。 因此，能夠在500 ηΜ ΜΤΧ的存在下，最好是在工μΜ Μτχ 的存在下，培養並擴大已經使用螢光_激活細胞分類（FAcS) 確認和挑選的宿主細胞，結果明顯地增加了生產力。因此， 認為篩選高生產力之宿主細胞的方法，特別根據本發明， 右以根據本發明之表現載體轉移感染宿主細胞，並表現至 少一個感興趣之基因，則藉著FACS分類來挑選螢光蛋白質 和DHFR基因’並在至少5〇〇 nM ’最好是1 μΜ MTX的存在 下經歷基因擴大步驟。 '發酵強健性"一詞意指細胞的生長特性，例如維持某種 生長速率’對"按比例放大"（較大尺寸的生物反應器）的強健 性’並在維持儲存中達到高細胞計數和活力，以便在按比 例放大時應付工業產製速率。

O:\89\891I4.DOC -41- 1321152 表現 表現5司係關於異種基因序列在宿主細胞中的轉錄及/ 或轉譯。通常以出現在宿主細胞中相當之mRNA的量為基 礎，或以所產生之由感興趣基因編碼之基因產物的量為基 礎判疋表現速率。例如，藉著北方墨點雜交、核糖核酸 酶RNA-保濩、細胞RNA之就地雜交或藉著pCR法 (Sambrook 等人，1989 ; Ausubel 等人，1994)，判定藉著轉 錄選出之核甞酸序列所產生之mRNA的量。亦可藉著各種方 法判定由所選出之核甞酸序列編碼的蛋白質，例如 ELISA、西方墨點法、放射性免疫測定、免疫沉澱法、檢 測蛋白質之生物活性，或藉著蛋白質之免疫染色，接著是 FACS 刀析（Sambrook等人，1989 ; Ausubel 等人，1994)。 同表現程度（速率）、高表現、增加表現或高生產力"一詞 意指長期持續和足以高度表現或合成被導入宿主細胞内的 異種序列，例如編碼治療性蛋白質的基因。若藉著根據在 本文中描述之本發明的方法之一培養根據本發明之細胞， 且若該細胞每天產生至少超過大約5微微克想要基因產物 (5微微克/天/細胞），則出現增加或高表現，或高表現程度 或速率，或高生產力。若根據本發明之細胞每天產生至少 超過大約10微微克想要基因產物（丨〇微微克/天/細胞），則亦 出現增加或南表現，或高表現程度或速率，或高生產力。 特別是若根據本發明之細胞每天產生至少超過大約丨5微微 克想要基因產物（15微微克/天/細胞），則出現增加或高表 現，或向表現程度或速率，或高生產力。特別是若根據本 O:\89\89ll4.DOC -42· 發明之細胞每天產生至少超過大約2 〇微微克想要基因產物 (20微微克/天/細胞），則出現增加或高表現，或高表現程度 或速率，或高生產力。特別是若根據本發明之細胞每天產 生至少超過大約30微微克想要基因產物（3〇微微克/天/細 胞）’則出現增加或高表現，或高表現程度或速率，或高生 產力。 可以各種方式達到本發明之高度或增加的表現、高生產 力或高表現程度或速率。例如，經由感興趣基因與可擴大 之可選擇標記基因的共同表現，有可能篩選並確認表現異 種基因達高程度的細胞。可擴大之可選擇標記不僅容許篩 k穩疋轉移感染的伯主細胞，亦容許感興趣之異種基因的 基因擴大。可將核駿的額外副本整合至宿主細胞的基因組 内，至人造/迷你·染色體内，或至以附加體形式安置的多核 %•馱内。可將該程序與FACS — 協助之重組宿主細胞的篩選混 合，該宿主係包含有作為額外之可選擇標記的一或多個螢 光蛋白質（例如GFP)或細胞表面標記。獲得增加表現的其他 方法，亦可使用不同方法的組合，係以例如使用（人造的） 轉錄因子、以向上調節内源或異種基因表現的天然或合成 氣劑來處理細胞、改善mRNA或蛋白質的穩定性、改善 mRNA轉譯的開始、藉著使用附加體質體（以使用病毒序列 作為複製起點為基礎，例如S V4〇、多瘤病毒、腺病毒、EBV 或BPV)來增加基因劑量、使用促進擴大的序列（Hemann等 人’ 1994)，或以DNA連環為基礎的活體外擴大系統（M〇nac〇 等人，1996)為基礎。

O:\89\89U4.DOC -43· 根據本發明，進行感興趣之基因和編碼螢光蛋白質之基 因的偶聯轉錄。所得的二順反子mRNA表現感興趣之蛋白質 和螢光蛋白質。以該感興趣蛋白質和螢光蛋白質的偶聯表 現為基礎，有可能輕易地根據本發明，藉著所表現之螢光 蛋白質’例如藉著使用螢光激活細胞分類器（FAcS)分類， 篩選和分離高-生產的重組宿主細胞。 師選展現出高活力，並增加想要之基因產物的表現速率 的重組宿主細胞，是多個階段的過程。至少針對編碼螢光 蛋白質，並與感興趣基因偶聯之基因的表現，調查已經以 根據本發明之表現載體轉移感染，或可視需要以其他載體 共同轉移感染的宿主細胞，以便確認和篩選展現出最高之 螢光蛋白質表現率的細胞們/細胞族群。最好是僅挑選出屬 於具有最高螢光蛋白質表現率之細胞的1〇%的細胞，並進 一步培養。實際上，這意指挑選出最亮的1〇%細胞，並進 步培養。因此，亦可挑選出細胞混合物中最亮的5%，較 佳的是最亮的3%或甚至是最亮的1%螢光細胞，並複製之。 在特佳的具體實施例中，僅挑選出最亮的〇 5%或最亮的 0 · 1 %螢光細胞，並複製之。 為了該目的，在選擇培養基中培養之前已經以根據本發 明之表現載體轉移感染的細胞，該培養基可視需要含有可 擴大可選擇標δ己特定的選擇劑。可使用逐步增加選擇劑的 濃度，施加逐漸增加的選擇愿力。 可在細胞集合上進行篩選步驟，或使用預先·分類的細胞 集合/細胞純種系。可進行一或多個，最好是二或多個，且

O:\89\89H4.DOC -44- 特別是三或多個挑蓉 培養和複製^ 料挑選步驟之間’可 週。“胞—段特定的時間，在集合的案射大約2 便至…：細胞經歷一或多個基因擴大步驟1 本數：感興趣之基因和可擴大之可選擇標記基因的副 使用胺f碟吟逐步擴大基因的過程，係按照在例 如^專利第5，179，Q17號中的描述。根據本發明，可達到 /產力ϋ不欠限於大量的基因副本。寧可在高效率 ，種系中’疋增加穩定性的表現和發酵強健性。因此有可 能降低所需之基因擴大步驟的數目，並僅進行例如單一的 基因擴大。 因此，本發明係關於筛選細胞的方法，其包括下列步驟： (I) 至少以一個根據本發明之質體轉化適當的宿主細胞， 其中最好將表現載體的DNA穩定地併入宿主細胞基因組 内’或人造的染色體/迷你染色體内； (II) 在容許感興趣基因和螢光蛋白質表現的條件下，培養 經過轉化的細胞； (iii) 在至少一個選擇劑的存在下，培養該細胞，而得以複 製只有能夠在選擇劑之存在下生長的那些細胞； (iv) 從細胞混合物中挑選展現出最高螢光蛋白質表現率 的細胞’檢測細胞，並藉著螢光激活細胞分類器（FACSm^ 選； (v)培養所挑選出具有最高螢光蛋白質表現率的細胞。 可視需要重複步驟ii)_v)一或多次，並根據步驟v)獲得細 O:\89\89114.DOC -45- 1321152 胞。此外，亦可視需要藉著在選擇劑的存在下培養，使經 過轉化的細胞經歷一或多個基因擴大步驟，其導致可擴大 之可選擇標記基因的擴大。可利用尚未挑選過的細胞，並 亦可利用業已預先·挑選過一或多次的細胞，進行該步驟。 本發明亦關於其中複製經過—致分類的細胞，並用來製 備感興趣之編碼基因產物的製程。最好在不含血清的培養 基中培養所選出之高生產細胞，且最好在懸浮培養基中， 在容許感興趣之基因表現的條件下。最好是從細胞培養基 中’以分泌性基因產物之形式’獲得感興趣的蛋白質。然 而，當表現無分泌信號的蛋白質時，亦可從細胞溶胞產物 中分離基因產物°》了獲得純的均質的產物，其實質上不 含其他的重組蛋白質和宿主細胞蛋白質，進行傳統的純化 步驟H冑常從培養基或溶胞產物中移除細胞和細胞 碎層》然後可藉著例如在免疫親和力和離子交換管柱上分 級分離、乙醇沉殿法、在交聯葡聚糖、石夕膠或陽離子交換 樹脂，如ΜΑΕ上的逆相肌c或層析法，使想要的細胞產 物不含污染的可溶性@ ^ ^ ^ J岭！生蛋白質、多肽和核酸。純化由重組細 胞表現之異種蛋白f的方法，為熟諸此藝者所知的，並描 述在文獻中’例如HaiTis等人（1995)^SeGpes⑽8)。 在後文中，藉著參考一些非-限制性、作為範例之具體實 施例，更完整地解釋本發明。 實例 縮寫 AP :驗性鱗酸酶

O:\89\89114.DOC •46· 1321152 bp :驗基對 CHO :中國倉鼠卵巢 DHFR :二氫葉酸還原酶 ELISA :酵素-連結之免疫吸附測定 FACS:螢光-激活細胞分類器 FAP :纖維母細胞-激活蛋白質 GFP :綠螢光蛋白 HBSS:漢克氏（Hanks)平衡鹽溶液 HT :次黃嘌呤/胸腺核苷 HRPO :辣根過氧化酶 IRES :内部核糖體進入位置 kb :千驗基 mAb :單株抗體 MTX :胺甲碟呤 PCR :聚合酶連鎖反應 sICAM :可溶性細胞内黏連分子 方法 1.細胞培養和轉移感染 在37°C下，在潮濕的氣壓和5%C02中，在細胞培養燒瓶 中，以懸浮細胞之形式，在補充有次黃°票呤和胸腺核芬的 不含血清之 CHO-S-SFMII培養基（Invitrogen GmbH，Karlsruhe， DE)中，永久地培養細胞CHO-DG44/dhfr-/-(Urlaub等人， 1983)。利用 CASY1細胞計數器（Schaerfe System，DE)，或 藉著錐蟲藍染色，判定細胞計數和存活力，然後以1-3x105/ O:\89\89114.DOC -47- 1321152 毫升之濃度播種，並每2-3天進行一次。 使用脂染胺正號試劑（Invitrogen GmbH)轉移感染CHO-DG44。 對於每一個轉移感染混合物，根據製造者的說明，將總共1 微克質體-DNA、4微升脂染胺和6微升正號試劑混合在一 起’並以200微升之體積加至在〇·8毫升補充有ht之 CHO-S-SFMII培養基中的6xl05個越來越快速生長的 CHO-DG44細胞中。在37t下，在細胞恆溫箱中培養3小時 之後，加入2毫升補充有HT的CHO-S-SFMII培養基。至於以 DHFR-為基礎，篩選穩定轉移感染的CHO-DG44細胞，在轉 移感染之後.2天，將細胞移至未加次黃嘌呤和胸腺核：y：的 CHO-S-SFMII培養基内，每隔3至4天更換培養基。在以 DHFR-和新黴素罐酸轉移酶為基礎的篩選中，在其中一個 表現載體含有DHFR而另一個表現載體含有新黴素·磷酸轉 移酶可選擇標記的共同-轉移感染之案例中，亦以400微克/ 毫升的濃度，將G418(Invitrogen)加至培養基中》 藉著在不含HT之CHO-S-SFMII培養基中，加入濃度 5-2000 nM的選擇劑 MTX(Sigma，Deisenhofen，DE)，獲得 經過整合之異種基因的以DHFR-為基礎之基因擴大。 2.表現載體 欲分析表現，使用真核生物表現載體，其以pAD-CMV載體 (Werner等人，1998)為基礎，並藉著CMV促進子/倉鼠泛素 /S27a啟動基因的組合，調解異種基因的組合表現（W0 97/15664)。而基本的載體pBID含有DHFR迷你基因，其係擔任 可擴大的可選擇標記（參見，例如歐洲專利第0 393 438號）， O:\89\89114.DOC -48- 1321152 在載體pBIN中’已經藉著新黴素抗藥性基因置換dhFR迷你 基因（圖2)。為了該目的，從市售的質體pBK_CMV(Stratagene， LaJolla ’ USA)，為1640個鹼基對Bsu36I片段中，分離可選擇 標記新黴素-磷酸轉移酶，包括SV40早期啟動基因和TK-聚 腺#酸化作用信號。在反應之後，以Klenow-DNA·聚合酶 填滿片段的末端’將該片段與載體pBID之3750個鹼基對的 Bsu36I/StuI片段連接，後者亦利用Kien〇w-DNA-聚合酶處 理。 在二順反子的基本載體pBIDG (圖2)中，從載體pIRES2-EGFP (Clontech ’ Palo Alto，CA，USA)中分離 IRES-GFP基因區，並在 載體pBID中之CMV促進子/啟動基因的控制之下，而得以保 留在啟動基因區和IRES-元件之間的多重選殖位置。使用下 列的程序。在PCR突變生成作用中，其中質體piRES2-EGFP 作為模板，一方面藉著使用致突變之引子，將在IRES序列 内之Hindlll切開位置AAGCTT轉變為序列ATGCTT，並因此 排除之。另一方面藉著與IRES序列之5'端互補的引子，插 入Xbal切開位置，或藉著與GFP序列之Y端互補的引子，導 入Spel切開位置。以Xbal和Spel消化所得的PCR片段，其含 有完整的IRES和GFP序列，並選殖到在載體pBID之多重選 殖位置3'端的獨特Xbal切開位置内。 從pAD-sICAM中，以Hindlll/Sall片段之形式，分離人類 的sICAM基因（Werner等人，1998)，並選殖到載體pBIGD之 相當的切開位置内，結果為載體pBIDG-sICAM(圖3)。

為了表現單株人類化F19抗體，從質體pGlD105F19HC O:\S9\S91I4.DOC •49- 1321152 (NAGENESEQ:AAZ32786)申，以 1.5kbNaeI/HindIII片段之 形式，分離重鏈，並選殖到以EcoRI (以Klenow-DNA-聚合 酶填滿）和Hindlll消化過的載體pBIDG内，結果產生載體 pBIDG-F19HC (圖 3)。另一方面，從質體 pKN100F19LC (NAGENESEQ:AAZ32784)中，以 1.3 kb Hindlll/EcoRI片段 之形式，分離輕鏈，並選殖到載體pBIN之相當的切開位置 内，產生載體PBIN-F19LC(圖3)。

3. FACS 利用Coulter Epics Altra裝置進行流動細胞計數分析和分 類。安裝氦-氬激光的FACS具有488毫微米之激發波長。使 在波長處吸收的螢光強度與螢光蛋白質相符，並藉著附接 的軟體Coulter Expo32處理。以8000-10000個事件/秒的速度 進行挑選。離心懸浮的細胞（以180xg 5分鐘），並在HBSS中 調整至1-1.5χ107/毫升的細胞濃度。然後根據其螢光蛋白質 信號挑選細胞。將細胞溶解在業已含有培養基的試管中， 然後依據所挑選之細胞的數目，離心並播種在適當的培養 容器中。

4. ELISA 藉著ELIS A，根據標準程序（Ausubel等人，1 994，更新 版），一方面使用山羊抗人類IgG Fc片段（Dianova，Hamburg， DE)，另一方面使用AP-共軛的山羊抗人類輕鏈抗體 (Sigma)，定量在穩定轉移感染之CHO-DG44細胞上清液中 的sICAM力價。使用經過純化的F19抗體作為標準物。 藉著公式微微克/((Ct-C〇)t/In(Ct-C〇))計算生產力（微微克/ a\89\89M4.DOC -50· 1321152 細胞/天），其中c〇和ct分別為在播種和收穫時的細胞計數， 且t為培養時間。 實例1 :比較CMV與倉鼠-泛素/S27a-啟動基因活性 為了比較倉鼠-泛素/S27a-啟動基因的活性與經常用在真 核生物表現載體中之CMV啟動基因的活性，以各種重組載 體轉移感染CHO-DG44細胞。在CMV-啟動基因的控制之 下，或在倉鼠-泛素/S27a啟動基因的控制之下，表現異種基 因產物，一方面是溶酶體酵素，另一方面是IgGl-抗體。兩 個啟動基因均在功能上與CMV-促進子連接。使用BGH聚A 作為異種基因的中止信號。含有CMV啟動基因的表現載體 是以經過修改的 pcDNA3(”CMVlM，Invitrogen)或 pBluescript 載體（"CMV2"，Stratagene)為基礎，並額外地編碼可擴大之 可選擇標記二氩葉酸還原酶。另一方面，具有倉鼠啟動基 因的表現載體是以pAD-CVM載體（Werner等人，1998)為基 礎。為了表現抗體的重和輕鏈，以含有作為可選擇標記之 新黴素抗藥性基因的第二個載體進行共同轉移感染。然 而，亦可以SV40促進子取代CMV促進子。 藉著在轉移感染之後，在96孔培養盤中的限制稀釋，在 不含HT之培養基中篩選和分離細胞純種系（在共同-轉移感 染的案例中，添加400微克/毫升G418)。藉著從5 nM，經由 5 0 nM、5 00 nM至2 μΜ逐步地增加胺曱碟呤濃度，連同在 每個案例中的稀釋選殖，使對於重組蛋白質而言具有最高 生產力的細胞純種系，經歷逐步的以DHFR-為基礎之基因 擴大。在每個擴大階段，選出大約20至30個具有最高生產 O:\89\89114.DOC -51 · 1321152 力的純種系。 一般而言，發現倉鼠啟動基因具有最高的效力。在溶酶 體酵素的表現以及抗體的表現兩者中，其所獲得的生產力 或力價，比利用其中在CMV啟動基因的控制之下，表現異 種基因之細胞所獲得的那些更高2至5倍。圖1舉例顯示，在 特定擴大階段，最佳細胞純種系之相對力價和相對比生產 力，將以CMV啟動基因為基礎之特定異種基因的表現設定 為1CCMV1為溶酶體酵素，CMV2為抗體）。 實例2:藉著以GFP為基礎FACS分類，分離高度表現sICAM 的細胞 細胞間黏連分子ICAM1的可溶形式，sICAM是感冒的可 能治療，因為它和ICAM受體競爭與鼻病毒的結合，且該方 式可降低，或甚至可防止其與ICAM受體的交互作用，此為 進入細胞内及後續感染的先決條件（Bella等人，1999 ; Marlin等人，1990)。 可按照在CHO細胞中表現單-鏈蛋白質（480個胺基酸）的 實例，選出sICAM。為此，以pBIDG-sICAM轉移感染 CHO-DG44(圖3)。GFP在pBIDG-sICAM轉移感染之細胞中 的額外表現，使其有可能使用以FACS-為基礎的篩選策略。 藉著二順反子轉錄單位，連帶地表現治療蛋白質sICAM和 GFP，並藉著分開的轉錄單位表現DHFR。在不含HT之 CHO-S-SFMII培養基中第一次篩選之後2至3週，挑選出具 有最高GFP螢光的5%細胞。在大約2週的培養之後，再度分 離出具有最高GFP螢光的5%細胞。該連續挑選總共進行6 O:\89\89114.DOC -52- 1321152 次。可在sICAM生產力和GFP螢光之間，證實良好的關聯（圖 4)。僅藉著FACS-協助之篩選，不需任何MTX擴大步驟，在 極短的時間内分離出具有高達16微微克/細胞/天之高比生 產力的細胞集合（圖5)。藉著組合以GFP為基礎之篩選與單 一後續的MTX擴大步驟，甚至有可能增加生產力至30微微 克/細胞/天以上（圖6)。在利用500 nM MTX的第四次挑選之 後，利用集合的擴大，以及亦在利用2 μΜ MTX的第六次挑 選之後，在集合的擴大之後，皆達到這些生產力。與通常 從範圍在5-20 nM ΜΤΧ之極低ΜΤΧ濃度開始的逐步擴大相 反，其必須使用較高的MTX濃度開始，才能達到擴大的效 果。因此，在得自第四次挑選之細胞中加入5或50 nM MTX，或是在得自第六次挑選之細胞中加入500 nM MTX， 結果在生產力上都沒有顯著的增加（圖6)。顯然在開始之集 合中DHFR的含量已經是如此地高，以致於僅可利用高劑量 之MTX達成總DHFR的抑制。此外，儘管MTX的高起始劑 量，但預先-挑選之細胞集合在篩選期間的存活仍改善很 多，即在比傳統逐步之基因擴大策略更短的時間内，獲得 高活力的細胞族群（圖7)。 實例3:藉著以GFP為基礎之FACS分類，分離高度表現mAb F19的細胞 在共同轉移感染中，以質體組合PBIDG-F19HC和pBIN-F19LC (圖3)轉移感染CHO-DG44細胞。所表現之人類化抗體F19， 直接對抗表面分子FAP，其係由反應性基質纖維母細胞合成 (亦參見歐洲專利0 95 3 639)。在載體組態中，使用由它自 O:\89\89114.DOC -53- 1321152 己的載體表現之抗體的兩個蛋白質鏈，其亦額外地在分開 的轉錄單位中，編碼DHFR或新黴素-磷酸轉移酶可選擇標 記。此外，另一個可選擇標記GFP，則被納入載體pBIDG-F19HC 内。藉著經由IRES元件之GFP和重鏈表現的轉錄連接，以 載體 pBIDG-F19HC/pBIN-F19LC共同轉移感染 CHO-DG44，可藉 著使用連續FACS分類篩選具有高GFP内含量的細胞，迅速 單獨地分離高度表現抗體F19的細胞。為此，在前2-至3-週 之後，在添加400微克/毫升G418的不含HT之CHO-S-SFMII 培養基中篩選經過轉移感染的細胞集合，藉著FACS挑選出 5%具有最高GFP螢光的細胞。總共進行該挑選最多6次，在 每次挑選之間大約2週的期間繼續培養。驚人的是，在F19 生產力和GFP螢光之間發現良好的關連（圖8)，雖然從它們 自己的載體表現兩個蛋白質鏈，且在以GFP為基礎之FACS 分類中，僅可能篩選重鏈的表現，因為它與GFP—起轉錄。 藉著單一後續的MTX擴大步驟，從第五次挑選的細胞集合 開始，藉著將1000 nM MTX加至選擇培養基中，可使生產 力增加至10微微克/細胞/天（圖9)，並進一步增加至平均37 微微克/細胞/天。亦可藉著在功能上使倉鼠啟動基因與代替 CMV促進子之SV40促進子連接，獲得比較數據。同時，與 傳統的逐步基因擴大策略相比較，其通常包括四個擴大階 段，利用漸增含量的MTX，可降低篩選高生產細胞的發展 時間一半至大約120天，並在發展效能和成本上伴隨有明顯 地降低。 0:\89\89U4,D0C -54- 1321152

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Werner, R.G. et al., Arzneim.-F〇rsch./Drug.Res. 1998, 48, 870 - 880 Wigler, M. et al., Proc NaU Acad Sci USA 1980, 77, 3567 - 3570 【囷式簡單說明】 圖1顯示以重組細胞純種系所獲得之表現程度的比較，其 中在CMV啟動基因的控制之下，或在倉鼠泛素/S27a啟動基 因的控制之下’表現異種基因產物。兩個啟動基因在功能 上連接CMV促進子和中止序列，BGH聚A，其在每個案例 中是相同的。在CMV1的案例中，表現載體是以pcDNA3-為 基礎的（Invitrogen，Kalsruhe，DE)，在 CMV2 中，其為以 pBluescript-為基礎的表現載體（stratagene，La Jolla，CA， us) ’而在CHO的案例中，其為以paD-CMV-為基礎的表現 載體（Werner等人，1998)。在溶酶體酵素的表現中，所有的 表現栽體含有可擴大之可選擇標記二氫葉酸還原酶 (DHFR) ’並已經藉著後續的擴大步驟，利用胺曱碟呤（MTX) 增加異種基因的表現^為了表現抗體（Ab)的兩個鏈，已經 -56- 1321152 利用第二個含有作為可選擇標記之新黴素_抗藥性基因的 載體進行共同-轉移感染。以相對於以CMV啟動基因為基礎 的表現來提供所得之力價或比生產力，將其設定為1(CMyl 為酵素，CMV2為Ab)。 圖2顯示用來在〇«〇_1)(}44細胞中表現重組蛋白質之基礎 载體的圖解表現。，·Ρ/Ε，，為CMV促進子和倉鼠·泛素助沒 動基因的組合，在它自己上的”p"代表啟動基因元件，而"丁” 為轉錄的中止號’其為經過轉錄之灿财的聚腺芬酸化作 用所必需的。以箭頭指出每個轉錄單位中開始轉錄的位置 和方向。至於選殖異種基因，在啟動基因元件之後插入具 有多個核酸内切限制酶之切開位置的序列區(多重選殖： 置-叫。將可擴大之可選擇標記二氫葉酸還原酶縮寫為 "dhfr" ’並將可選擇標記新黴素填酸轉㈣縮寫為"_"。 "刪"元件來自腦心肌炎病#，在二順反子轉錄單位中擔 任内部核糖料人位置，並能_輕續㈣螢終白質 · -Μ _ .. 口圖3為真核生物表現载體的圖解說明，其分別編碼生物藥 品蛋白質，並已經用來轉移感染⑶⑽⑽細胞。為 ⑽促進子和倉鼠·泛素助a啟動基因的組合，在它自: 上的"P"代表啟動基因元件’而"T”為轉錄的中止作號，1 為經過轉錄之mRNA的聚腺#酸化作用所必需的。以箭頭指 出每個轉錄單位中開始轉錄的位置和方向。將可擴大之可 選擇標，己二氫葉酸還原酶縮寫為"咖"，並將可選擇標記新 黴素鱗酸轉移酶縮寫為” ne。,、"删，，轉來自腦心肌炎病

O:\89\89U4.DOC •57- 1321152 毒，在二順反子轉錄單位中擔任内部核糖體進入位置，並 能夠轉譯後續的綠螢光蛋白質”GFP”。"sICAM”編碼可溶性 細胞内黏連分子（美國專利第5,412,216號），而"F19HC”和 ”F19LC"分別編碼人類化抗體F1 9的重和輕鏈（歐洲專利第 953 639號）° 圖4顯示在sICAM生產力和GFP螢光之間的關連，採用細 胞集合ZB 1作為實例。該細胞集合係獲自利用載體 pBIDG-sICAM的轉移感染，其中藉著二順反子轉錄單位連 帶地表現治療蛋白質sICAM和GFP。使該集合經歷連續的以 GFP為基礎之FACS分類。在每個挑選步驟（挑選）之後，藉 著ELISA判定在集合之細胞培養上清液中的sICAMs濃度， 並計算每個細胞每天的比生產力（微微克/細胞*天）。每個資 料點為至少三個培養週期的平均值。總共進行六次挑選。 圖5顯示藉著以GFP為基礎之FACS分類，分離高度-表現 的sIC AM細胞，採用細胞集合ZB 1作為實例。該細胞集合係 獲自利用載體pBIDG-sICAM的轉移感染，其中藉著二順反 子轉錄單位一起表現治療蛋白質sICAM和GFP。使集合經歷 連續的以GFP為基礎之FACS分類。在每次挑選之後，藉著 ELISA判定在集合之細胞培養上清液中的sICAMs濃度，並 計算每個細胞每天的比生產力（微微克/細胞*天）。每個資料 點代表至少三個培養週期的平均值。總共進行六次挑選。 圖6顯示藉著混合以GFP為基礎之篩選與MTX擴大步 驟，所達成之在sICAM生產力上的增加，採用細胞集合ZB1 作為實例。該細胞集合，獲自利用載體pBIDG-sICAM的轉 O:\89\89114.DOC •58· 1321152 移感染，並經歷連續的以GFP為基礎之FACS分類。在第四 次挑選和第六次挑選之後，藉著在培養基十加入胺甲碟呤 (MTX)(5 nM，50 nM，500 nM或 2 μΜ MTX)，進行 DHFR-調解之基因擴大。藉著ELISA判定在集合之細胞培養上清 液中的sICAMs濃度，並計算每個細胞每天的比生產力（微微 克/細胞*天）。每個資料點代表至少三個培養週期的平均值。 圖7顯示在培養基中加入不同劑量的胺曱碟呤之後，細胞 集合的存活圖案。使藉著利用載體pBIDG-sICAM之轉移感 染而獲得的細胞集合ZB1(圖3)，經歷連續的以GFP為基礎之 FACS分類。‘在第四次挑選和第六次挑選之後，藉著在培養 基中加入胺甲碟呤（MTX)，進行DHFR-調解之基因擴大。在 篩選期間，藉著以錐蟲藍染色，並在許多天内監視培養， 判定細胞數目和存活能力。 圖8顯示在抗體生產力（mAb F19)和GFP螢光之間的關 連，採用細胞集合ZB 1作為實例。該細胞集合，獲自利用載 體組合PBIDG-F19HC和pBIN-F19LC的轉移感染（圖3)。使該 集合經歷連續的以GFP為基礎之FACS分類。在每次挑選之 後，藉著ELISA判定在集合之細胞培養上清液中抗體F19的 濃度，並計算每個細胞每天的比生產力（微微克/細胞*天）。 每個資料點代表至少三個培養週期的平均值。總共進行六 次挑選。 圖9顯示藉著以GFP為基礎之篩選，使用FACS，分離高度 表現之mAbF 19細胞集合，採用細胞集合ZB 1作為實例。使 藉著以載體PBIDG-F19HC和pBIN-F19LC轉移感染（圖3)而 O:\89\89114.DOC •59- 1321152 獲得的該細胞集合，經歷連續的以GFP為基礎之FACS分 類。在每次挑選之後，藉著ELISA判定在集合之細胞培養 上清液中抗體F19的濃度，並計算每個細胞每天的比生產力 (微微克/細胞*天）。每個資料點代表至少三個培養週期的平 均值。 O:\89\89114.DOC -60- 1321152 序列表

<110> BOEHRINGER INGELHBIM PHARMA KG <12〇>表現載體，產製異種基因產物及篩選可產製高量 該等產物之重組細胞的方法 <130> 案例 1-1412 <140> 092133164 <141> 200~3Tl-26 <160> 1 <170> Patentln 版本· 2.1

<210> 1 <211> 2406 <212> DNA <213>中國倉鼠 <300> <310> PCT/EP/96/04631 <311> 1996-10-24 <312> 1997-05-01 <400> 1 gatctccagg acagccatgg ctattacaca gagaaaccct gtctggaaaa acaaaaaatt 60 agtgtccatg tgtaaatgtg tggagtatgc ttgtcatgcc acatacagag gtagagggca 120 gtttatggga gtcagttcct attcttcctt tatgggggac ctggggactg aactcaggtc 180 atcaggcttg gcagaaagtg cattagctca cggagcctta tcattggcga aagctctctc 240 aagtagaaaa tcaatgtgtt tgctcatagt gcaatcatta tgtttcgaga ggggaagggt 300 acaatcgttg gggcatgtgt. ggtcacatct gaatagcagt agctccctag gagaattcca 360 agttctttgg tggtgtatca atgcccttaa aggggtcaac aactttt.tt:t. ccctctgaca 420 - aaactatctt cttatgtcct tgtccctcat atttgaagta ttttattctt tgcagtgttg 480 aatatcaatt ctagcacctc aga.catgtta ggtaagtacc ctacaactca ggttaactaa 540 tttaatttaa ctaatttaac cccaacactt tttctttgtt tatccacatt tgtggagtgt 600 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgc 660 gcgcgcgcgc gcgctcggat cattctacct tttgtttaaa aaatgttagt ccaggggtgg 720 ggtgcactgt gaaagtctga gggtaacttg ctggggtcag ttctttccac tataggacag 780 aactccaggt gtcaactctt tactgacaga accatccaaa tagccctatc taattttagt 840 tttttattta tttatttttt gtttttcgag acagggtttc tctgtggctt tggaggctgt 900

O:\S9\89lt4.DOC 1321152 cctggaacta gctcttgtag 960 ctcctgagtg ctgggattaa 1020 agagattgtg tgtcacaagg 1080 aaaaaaaaaa acttcactga 1140 agctctaggg agtctcctgt 1200 ggggttacaa cacaggtttt 1260 aatgtgtatt ttggaggcag 1320 ttattaggaa gataagcatc 1380 ctacctttag ggatggaaga 1440 gtgaggtgga ggactgggag 1500 tggggacagc acatgttcct 1560 gtcgaggact acagtcattt 1620 gtgaccatta accgtttcac 1680 agggccagga gggggctaca 1740 gcttcagctg gctgagacgc 1800 ttccggccca taacccttcc 1860 cattcggccc catcccccgg 1920 actataacca gatagcccgg 1980 aagaaagcga cgaaaaacta 2040 "* aaacaagccc cctttaaagg 2100 ttgaaacatt ttaatgttgg 2160 aaacggagcg cccgagctag 2220 aggcacttgc gtggacgcct 2280 gcggctcttc ctttccgatc 2340 gcttggggct tcccgcgtcg 2400 atgtag 2406 accaggctgg tctcgaactc aggcatgcgc caccaacgct gtgtcatgtc gccetgcaac agctgaagca cgatgatttg caaacagaat ctcaacaggc tgcatatcag gcattttatc cagagctaat agattaaaat ttctttatat aaaacaaaac aaagacattt agagggtgca agggcgcaac cgctttaact atttttccca ggatgggcaa tgcaggtttc cttactgtat gctgggaggg cacgtgcggc cggaagaggc cacacccgca cccagcaggc tcctcggcta cttctaggca tttccggcga tcctcacctg aatctctaac atgtgtggaa ctgcatcttg caattcccag acagacttgt aaagcccctc ttagtcgcat gcacaccgtt tcgaggaccg tctggcactg cgttagacag aaggggcggg tctttcggcc cgccatccgt ggtgagtgtg ctctcaccct ggtcggcggc agagatccac ctgcctctgc tggctctacc taattttaaa cacccccccc ccaaaaaaaa gttactctgg ctggccaatg gcagcagtct tttttaaagt taagctattt cccagccaaa gagggaagag cccacacagg caaaccaaac tggaggaggt atagaaaggg cactgagttt gtcctgtttt gcctattttt. tctccacgtc caaacttgcg ggcttttaaa acgtgcaaag tcagatgctt cctctgactg cttgggaaga ctcgatttgg caccttcagc cccgaatgcc ggacccaccc tcgcgccaaa tctgactcca gagtttagag ggacgagtag ttttagcaaa gttacctctc ttctcatgct cgactg.tgta agaaaggcgt aaatgagaaa gagcataggg ccgcggtcgt tgcagcgggc gggaagcccc gttggtccgc tgctgcgggc tgccgctccg tctaatccgt ctcttttcga 0:>£9V89U4.D0C -2-

Claims (1)

1321152

日修(更)正本 第092I33I64號專利申請案 中文申請專利範圍替換 拾、申請專利範 其包 1. 一種篩選表現所欲蛋白質/產物之宿主細胞的方法 括： a) 提供一表現载體，其包含編碼所欲蛋白質/產物的基 因，該基因係功能上連接至⑴倉鼠·泛素/S27a•啟動 子，及（II)編碼螢光蛋白質之基因，其中該倉鼠-泛素 /S27a-啟動子係位於編碼序狀上游，且其^編碼序 列係自相同倉鼠-泛素/S27a-啟動子開始表現， b) 以根據步驟a)之表現載體轉染一真核寄主細胞， Ο在容許表現所欲蛋白質/產物和螢光蛋白質的條件下培 養該宿主細胞的族群， d)分離-細胞庫’在無須基因擴大步驟情況下，該等細 胞每天每個細胞表現超過15微微克⑽之平均比生產 力（specific reproductivity)(單鏈蛋白質）或ι〇微微克（人 類化抗體）重組蛋白質， e)鑑別及/或筛選螢光蛋白質之最大表現量之細胞。 根據申請專利範圍第旧之方法，其特徵在於使用螢光潔 活細胞分類器（FACS)來進行篩選。 根據申請專利11圍第1項之方法，其特徵在於將步驟d)所 得之經分離細胞庫經歷-或多個額外的基因擴大步驟。 根據申請專利範圍第3項之方法，其特徵在於該可擴大之 可選擇標記是DHFR，且_大劑為胺甲碑吟。 根據申請專利範圍第】至4項中任—項之方法，其特徵在 於使用不含血清之培養基。 2. 3. 5. 89M4-980227.doc 1321152 6. 根據申請專利範圍第〗至4項中任一項之方法，其特徵在 於該寄主細胞係適於懸浮培養。 7. 根據申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其特徵在 於該方法進一步包括一異種基因產物之製備，其中 f)在容許表現該基因產物的條件下培養寄主細胞系，且 其中 g)自培養物或培養基中分離該基因產物。 8. 根據申請專利範圍第7項之方法，其特徵在於該異種基因 產物係雜聚肽（heteromeric)蛋白質/產物，其中該寄主細 胞已經編碼該雜聚肽蛋白質/產物之不同次單元的表現載 體共同轉染。 9. 根據申請專利範圍第8項之方法，其特徵在於該雜聚狀蛋 白質/產物係一抗體。 10. 根據申請專利範圍第丨至4項中任一項之方法，其特徵在 於該寄主細胞係一 CHO細胞。 89114-980227.doc