CN106442685B - 一种快速低成本筛选蛋白质表达条件的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速低成本筛选蛋白质表达条件的方法,步骤如下:(1)对表达菌株分组并进行生长培养,制得诱导前菌液样品;(2)对诱导前菌液样品再次分组并进行诱导培养,制得诱导后菌液样品;(3)取诱导前菌液样品和诱导后菌液样品经固液分离,重悬菌体,制得菌体重悬液;取菌体重悬液与上样缓冲液混合,检测,得到A1和B1;(4)取菌体重悬液与裂解液混合均匀,超声破碎、固液分离,吸附后检测,得到C1;固液分离后的固体与上样缓冲液混合均匀,检测,得到D1;(5)经过数据分析,筛选培养条件。本发明无需昂贵设备投入,实验结果准确,大幅度减少培养基用量、培养瓶清洗和设备使用频率,大大缩短实验准备时间和结果分析时间。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速低成本筛选蛋白质表达条件的方法,属于生物技术技术领域。
背景技术
众所周知,大肠杆菌表达蛋白简单快捷费用低。许多生命科学或基础医学实验室经常会使用大肠杆菌来表达人类或其他哺乳动物蛋白[1]。纯化出的重组蛋白可用于验证蛋白质间的相互关系,也可用于制备高特异性抗体,大量高纯度的蛋白还可用于蛋白质结晶实验,获得蛋白质的三维结构信息。
为了方便纯化目的蛋白,通常我们会在目的蛋白的氮端或碳端添加标签蛋白,再使用亲和层析柱特异性吸附标签蛋白,从而达到分离纯化重组目的蛋白的效果[2]。标签蛋白也可以在随后的实验过程中使用相应的蛋白酶去除。然而,由于重组蛋白由原本的真核表达系统转变为原核表达系统,其表达水平大多并不理想。这可能是因为一定比例的重组蛋白会以非可溶状态存在于大肠杆菌内包涵体中。而包涵体中的蛋白大多处于蛋白质变性和功能失活的状态。纯化这样的蛋白需要经过复杂且成功率不高的蛋白质复性实验。因此,绝大多数实验室在纯化蛋白的时候,仅针对于包涵体外的可溶性的蛋白采用亲和层析技术进行纯化。为了能更有效率的获得足够量的目的蛋白,不仅需要提高蛋白的总表达量,还需要提高其中可溶性蛋白所占的比例。
影响蛋白质可溶性表达量的因素有很多,包括标签蛋白种类、诱导剂(如IPTG、l-arabinose等)浓度、诱导前菌液浓度、培养基种类、诱导温度、添加剂(如葡萄糖、NaCl等)等,如表1-3所示:
表1
表2
表3
上述这些因素相互组合可构成十几到几十种不同的表达条件。但是,如果要针对这些条件一一筛选,按传统方法则需要根据每一种条件分别摇菌,再逐个分析,这样的分析过程耗时耗力。因此,绝大多数实验室通常并不会筛选如此多的条件,这往往会错过目的蛋白的最优表达条件,造成获得的可溶性蛋白量不足,从而影响后续实验安排。
发明内容
本发明针对现有技术的不足,提供一种快速低成本筛选蛋白质表达条件的方法。
本发明技术方案如下:
一种快速低成本筛选蛋白质表达条件的方法,包括如下步骤:
(1)按照生长条件对表达菌株分组并进行生长培养,制得诱导前菌液样品;
(2)按照诱导条件对诱导前菌液样品再次分组并进行诱导培养,制得诱导后菌液样品;
(3)取步骤(1)制得的诱导前菌液样品和步骤(2)制得的诱导后菌液样品经固液分离获得菌体,然后用菌体裂解液重悬菌体,制得菌体重悬液;取部分菌体重悬液与上样缓冲液混合,然后在95~100℃加热12~18min,经检测,得到诱导前菌液样品蛋白总量(A1)和诱导后菌液样品蛋白总量(B1);
(4)取步骤(3)制得的剩余的菌体重悬液与裂解液混合均匀,冰浴中经超声破碎、固液分离,分离出的液体中含有携带标签的目的蛋白,经相应的亲和吸附珠吸附后,经检测,得到诱导后可溶性蛋白量(C1);超声破碎固液分离后的固体与上样缓冲液混合均匀,在95~100℃加热12~18min,经检测,得到诱导后非可溶性蛋白量(D1);
(5)根据步骤(3)获得的诱导前菌液样品蛋白总量(A1)和诱导后菌液样品蛋白总量(B1)数据,以及步骤(4)获得的诱导后可溶性蛋白量(C1)和诱导后非可溶性蛋白量(D1),按照如下公式计算诱导效率和表达效率,筛选最优的培养条件:
根据本发明优选的,所述步骤(1)中,所述生长条件包括:菌株培养条件、培养基成分、菌液浓度。
根据本发明优选的,所述步骤(1)中,所述表达菌株包括:大肠杆菌感受态细胞种类、 目的蛋白携带的标签种类。
根据本发明优选的,所述步骤(2)中,所述诱导条件包括:诱导剂种类、诱导剂浓度、添加剂种类、添加剂浓度、诱导培养条件。
根据本发明优选的,所述步骤(3)中,所述固液分离为在6000rpm的条件下离心10min。
根据本发明优选的,所述步骤(3)中,菌体裂解液组分如下:
25mM氯化钠(NaCl),1mg/ml溶菌酶(Lysozyme),1mM苯甲基磺酰氟(PMSF),25mMTris-HCl(pH8.0),裂解液现用现配。
根据本发明优选的,所述步骤(3)中,诱导前菌液样品或诱导后菌液样品与裂解液的体积比为10:(0.8~1.2)。
根据本发明优选的,所述步骤(3)中,上样缓冲液为NuPAGE LDS Sample Buffer,浓度为4×,购自Life Technologies。
根据本发明优选的,所述步骤(3)中,所述部分菌体重悬液与上样缓冲液的体积比为10:(3~3.5)。
根据本发明优选的,所述步骤(3)和(4)中,检测为采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,借助扫描仪和软件Quantity One,获得目的蛋白条带的光密度读数,去除背景读数,即得。
进一步优选的,所述聚丙烯酰胺凝胶电泳的条件为80V恒压,20min后调至120V电泳100~140min。该条件下电泳后上样缓冲液中的染料条带到达凝胶底部。
根据本发明优选的,所述步骤(4)中,超声破碎条件为:超声波功率750W,强度30%,超声时间6s,间隔时间6s,超声破碎两个周期。
根据本发明优选的,所述步骤(4)中,所述固液分离为在4℃、12000rpm的条件下离心20min。
根据本发明优选的,所述步骤(4)中,亲和吸附珠吸附分离,具体步骤如下:
将菌体重悬液经超声破碎、固液分离后获得的上层液体与亲和吸附珠按体积比(50~60):1混合均匀,在4℃条件下反应40~50min,4000rpm、4℃离心5min,取沉淀,再向沉淀中加入上样缓冲液,95~100℃加热4~6min,即得。
根据本发明优选的,所述步骤(4)中,固体与上样缓冲液的质量体积比为1:(10~20),单位mg/ml,上样缓冲液为NuPAGE LDS Sample Buffer(浓度为1×)。
有益效果
本发明所述方法可按照表达菌株的生长条件和诱导条件分组,仅通过1ml菌液即可进行重组蛋白的诱导效率和表达效率的分析,为后续大规模蛋白分离纯化提供重要参考信息。在保证实验结果准确性的前提下,相比于传统的摇菌技术,本方法不仅可以减少至少5~20倍的培养基用量、相关培养瓶的清洗和灭菌和相关设备的使用频率,还可大大缩短实验准备时间和结果分析时间。相较于现有的自动化高通量筛选技术,本方法可以节省昂贵的设备投入和耗材损耗。
附图说明
图1是实施例1中的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果照片;
图中:A1、诱导前总蛋白量,B1、诱导后总蛋白量,C1、诱导后可溶性蛋白量,D1、诱导后非可溶性蛋白量;
图2是实施例1中采用软件Quantity One去除背景影响的过程照片;
图3是实施例2中的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果照片;
图中:A2、诱导前总蛋白量,B2、诱导后总蛋白量,C2、诱导后可溶性蛋白量,D2、诱导后非可溶性蛋白量;
图4、是BL21(DE3)感受态细胞表达出的目的蛋白为多聚体的色谱图;
图5、是pLysS(DE3)感受态细胞表达出的目的蛋白为多聚体和单体混合物的色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述,但本发明所保护范围不限于此。
溶菌酶(Lysozyme)购自BBI Life Sciences公司;
苯甲基磺酰氟(PMSF)购自BBI Life Sciences公司;
亲和吸附珠Ni Sepharose High Performance、Glutathione Sepharose 4B、Dextrin Sepharose High Performance均购自GE公司;
上样缓冲液为NuPAGE LDS Sample Buffer(4X),购自Life Technologies公司。
菌体裂解液组分如下:
25mM氯化钠(NaCl),1mg/ml溶菌酶(Lysozyme),1mM苯甲基磺酰氟(PMSF),25mMTris-HCl(pH8.0)。
超声破碎仪(Sonics vibra cells)购自美国SONICS公司,型号VCX750,净输出功率频率为750W/20KHz。
实施例1筛选诱导前菌液浓度和诱导剂浓度
第一步:将含有目的基因TIPE1的表达质粒(pRsfduet,带氮端His-MBP标签蛋白)转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,获得单克隆菌落;
第二步:使用LB培养基培养25ml表达菌液,按照表4中的条件安排筛选,在OD600读数分别为0.6、0.8和1.0时,依次转移出1ml菌液到1.5ml Ep管,Ep管内已事先加入不同浓度的IPTG溶液。这样每一个Ep管中的1ml菌液分别在不同的菌液浓度下经不同浓度的IPTG诱导,共21种条件;
表4
第三步:菌液在20℃摇床内过夜培养,第二天分别取1ml的未经IPTG诱导的和经IPTG诱导的菌液,经过6000rpm 10min离心,获得菌体沉淀。再分别用100μl的菌体裂解液将菌体重悬,涡旋震荡5s。各取10μl重悬菌体加入相应体积的上样缓冲液,并将保存好的样品放置于99℃的热台上,加热15min。此步骤中的样品分别为诱导前和诱导后的总蛋白量。高温加热可使DNA断裂,样品溶液不再粘稠,便于后续上样。将处理好的保存的样品全部上样,序号A1、B1。
第四步:在剩余的90μl的诱导后的重悬菌体再加入1ml裂解液,使用移液器吹打混匀。将处理好的样品转移至2.0ml的EP管中(圆底管,便于进行超声破碎实验)。
第五步:将上一步处理好的样品进行超声破碎,超声破碎仪(Sonics vibracells)的强度设置为30%,超声时间6s,间隔时间6s,共超声两个周期。超声过程中需要将2.0mlEP管放置于已经加入冰块的15ml离心管中,再放到试管架上固定。超声破碎所产生的温度升高可能会降低蛋白质的稳定性。
第六步:将超声后的样品放入离心机中,12000rpm,离心20min,4℃。离心后,样品会出现明显的沉淀和上清的分离。
将上清溶液(含可溶性蛋白)转移到1.5ml EP管中,加入20μl的亲和吸附珠NiSepharose High Performance或其他类型的亲和吸附柱(视标签蛋白的种类所定)。放置于冷房中的摇床上(或放于冰箱中,反应中混匀几次)。反应45min后,带有标签的目的蛋白和亲和吸附珠结合。将样品放入离心机中,4000rpm离心5min后,目的蛋白聚集在沉淀(亲和吸附珠)中,弃上清。再向亲和吸附珠中加入100μl上样缓冲液(1×),于99℃热台加热5min,保存样品。处理好的样品取溶液总体积的1/10上样,标记序号C1。
在离心沉淀(含非可溶性蛋白)中加入相应体积的上样缓冲液,于99℃热台加热5min,保存样品。上样时取样品溶液总体积的1/10,标记序号D1。因样品C1、D1中蛋白浓度很高,为了和A1、B1在同一块胶上进行比较,所以仅需要1/10的样品量上样。
第七步:进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳条件为80V恒压20min,然后调至120V电泳120min,此时上样缓冲液中的染料条带到达凝胶底部。结果如图1所示,其中A1、诱导前总蛋白量,B1、诱导后总蛋白量,C1、诱导后可溶性蛋白量,D1、诱导后非可溶性蛋白量。
第八步:经过染色、脱色后的聚丙烯酰胺凝胶可直观分析比较不同条件下的总蛋白、可溶性、非可溶性蛋白的表达量。如需要分析不同条件下的蛋白诱导效率和表达效率,则可借助扫描仪和软件Quantity One,获得目的蛋白条带的光密度读数。
使用软件Quantity One打开聚丙烯酰胺凝胶扫描图片,使用Volumn菜单下VolumnRect Tool框出目的蛋白条带U1,同时复制这个框拖至背景处U2,如图2所示。使用Reports菜单下Volumn analysis report获得条带的光密度读数。因为经过染色脱色的凝胶背景的光密度读数不为零,框的大小不同所对应的背景读数也不相同。如图2所示,该目的蛋白条带矫正后的光密度读数应为U1-U2。根据此方法依次获得A1、B1、C1、D1中目的蛋白的光密度读数和相应背景读数如表5所示:
表5
校正后的读数为目的蛋白条带的光密度读数减去背景读数,即分别为(A1)=U1-U2、(B1)=U3-U4、(C1)=U5-U6、(D1)=U7-U8。
其中A1、B1、C1、D1中目的蛋白所对应条带的光密度读数(校正后)分别为1161.5、4542.7、3080.9、2044.3。
经校正后数据运用以下公式计算目的蛋白的诱导效率和表达效率:
经过计算TIPE的诱导效率为3.9,表达效率为60.1%。
这表明在该条件下(OD600读数为0.6,IPTG浓度为0.5mM),TIPE1诱导后的总蛋白表达量是诱导前的3.9倍,并且表达的蛋白中有60.1%为可溶性蛋白。经过分析发现,针对该目的蛋白的表达,不同的诱导前菌液浓度对蛋白诱导效率和表达效率影响不大,但是不同浓度的诱导剂所带来的差异可达到20%。
采用最优条件后,每升菌液可以获得约2mg的带标签的目的蛋白,重组蛋白的表达纯化效果非常好。
实施例2:筛选培养基种类和IPTG浓度
第一步:将含有目的基因DDB1的表达质粒(pGEX4T1,带有氮端Gst标签蛋白)转入大肠杆菌BL21Rosetta(DE3)感受态细胞,并获得单克隆菌落;
第二步:分别使用LB、TB、SOB培养基培养8ml表达菌液,共24ml,按照表6中的条件安排筛选,在OD600读数为0.6时,依次转移出1ml菌液到1.5ml Ep管,Ep管内已事先加入不同浓度的IPTG溶液。这样每一个Ep管中的1ml菌液分别在不同的菌液浓度下经不同浓度的IPTG诱导,共21种条件;
表6
第三步至第六步与实施例1中的相应步骤相同,采用的亲和吸附珠为GlutathioneSepharose 4B、20μl,样品的编号改为A2、B2、C2、D2。
第七步:进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳条件为80V恒压20min,然后调至120V电泳115min,此时上样缓冲液中的染料条带到达凝胶底部。结果如图3所示。其中A2、诱导前总蛋白量,B2、诱导后总蛋白量,C2、诱导后可溶性蛋白量,D2、诱导后非可溶性蛋白量。
第八步:聚丙烯酰胺凝胶扫描分析数据采集与实施例1中的第八步相同。
校正后的读数为目的蛋白条带的光密度读数减去背景读数,即分别为(A2)=U1-U2、(B2)=U3-U4、(C2)=U5-U6、(D2)=U7-U8;其中A2、B2、C2、D2中目的蛋白所对应条带的光密度读数(校正后),分别为780.4、1904.3、389.6、2282.8。原始数据如表7所示:
表7
计算该重组蛋白的诱导效率和表达效率,公式如下:
经过公式计算DDB1的诱导效率为2.4,表达效率为14.6%。
这表明在该条件下(TB培养基、OD600读数0.6、IPTG浓度0.05mM),DDB1经诱导后的总蛋白表达量为诱导前的2.4倍,但表达的蛋白中仅14.6%为可溶性蛋白。经分析其他浓度诱导剂和其他类型的培养基的诱导效果,所计算出的蛋白诱导效率和表达效率上下浮动不大,在5%以内。这说明采用大肠杆菌表达系统,通过添加氮端Gst标签蛋白的方式并不适合表达该目的蛋白。
后续发明人又将该条件应用于大规模DDB1蛋白表达实验。实验结果显示,一升菌液仅获得0.3mg的重组蛋白,表达和纯化效果并不理想。因此,对于该目的蛋白的表达情况,今后的实验需要考虑采用其他标签蛋白(如MBP、DsbA、Sumo等)或其他表达菌株(如pLysS、CodonPlus、Origami等)来提高蛋白的诱导效率和表达效率。
实施例3:筛选标签蛋白种类和感受态细胞种类
第一步:将含有目的基因HBx的四种表达质粒(pGEX4T1,带有氮端Gst标签蛋白;pRsfduet,带有氮端His标签蛋白;pMal-c5x,带有氮端MBP标签蛋白)分别转入大肠杆菌BL21(DE3)、BL21pLysS(DE3)和BL21Rosetta(DE3)感受态细胞中,获得单克隆菌落;
第二步:分别使用LB培养基培养8ml表达菌液,共32ml,按照表8中的条件安排筛选,在OD600读数为0.6时,依次转移出1ml菌液到1.5ml Ep管,Ep管内已事先加入相同量的IPTG溶液(终浓度0.2mM)。这样每一个Ep管中的1ml菌液分别在不同的感受态细胞中,经相同浓度的IPTG诱导带有不同标签蛋白的目的蛋白,共9种条件;
表8
第三步至第八步的实验步骤和数据分析方法与实例1、2中的相应步骤相同。针对不同的标签蛋白选择相应的亲和吸附珠,如Gst/Glutathione Sepharose 4B、His/NiSepharose High Performance、MBP/Dextrin Sepharose High Performance,用量均为20μl。
发明人首先在BL21(DE3)感受态细胞中,分析不同的标签蛋白对目的蛋白诱导效率和表达效率的影响。数据显示,在氮端添加MBP标签蛋白不仅可以提高诱导效率约3倍,还可以将可溶性蛋白的表达效率提高至60%。结果如表9所示:
表9
随后我们考察MBP标签蛋白在不同的感受态细胞BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、pLysS(DE3)中对目的蛋白诱导效率和表达效率的影响。经数据分析,我们发现不同的感受态细胞对这个目的蛋白的诱导和表达效率影响不明显。结果如表10所示:
表10
尽管该目的蛋白的诱导效率和表达效率相差不大,但是后续实验发现,不同的感受态细胞可能会影响表达蛋白的分子状态。根据分子体积排除色谱(Superdex200,GE)的结果显示,BL21(DE3)感受态细胞表达出的蛋白为多聚体,分子量大于200KDa。pLysS(DE3)感受态表达出的蛋白除了一部分为多聚体,还有一部分为单体,约55KDa,如图4、图5所示。
实施例4:筛选培养温度、培养基种类和添加剂的种类和浓度
第一步:将含有突变型目的基因HBx的表达质粒(pMal-c5x,带有氮端MBP标签蛋白)转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,并获得单克隆菌落;
第二步:分别使用LB、TB、SOB培养基培养12ml表达菌液,共36ml,按照表11中的条件安排筛选,在OD600读数为0.6时,依次转移出1ml菌液到1.5ml Ep管,Ep管内已事先加入相同量的IPTG溶液(终浓度为0.2mM)。这样每一个Ep管中的1ml菌液分别在不同的培养基条件下和不同浓度的添加剂的情况下,经IPTG分别在37℃和20℃条件下进行诱导4h和过夜16h,共30种条件;
表11
第三步至第八步的实验步骤和数据分析方法与实例1、2中的相应步骤相同,亲和吸附珠采用的是Dextrin Sepharose High Performance、20μl。
经分析在无添加剂的条件下,不同的诱导温度对目的蛋白诱导效率和表达效率的影响。数据显示,20℃过夜培养获得的可溶性蛋白较多。结果如表12所示:
表12
诱导温度 | 诱导效率 | 表达效率 |
LB 37℃ | 1.7 | 21.6% |
LB 20℃ | 1.8 | 29.3% |
随后考察在20℃条件下,不同的培养基对目的蛋白诱导效率和表达效率所产生的影响。经数据分析发现,使用TB培养基可以提高该目的蛋白的诱导效率和表达效率。结果如表13所示:
表13
培养基种类 | 诱导效率 | 表达效率 |
LB 20℃ | 1.8 | 29.3% |
TB 20℃ | 2.7 | 44.4% |
SOB 20℃ | 1.8 | 34.1% |
最后发明人考察了不同的添加剂对蛋白表达效果的影响情况。经数据分析发现,不同浓度的添加剂葡萄糖对该目的蛋白的诱导效率和表达效率均有明显的提高。此外,据报道葡萄糖还可以抑制大肠杆菌内源性MBP蛋白的表达[3],因此使用该添加剂可以简化后期蛋白纯化过程和提高目的蛋白的纯化量和纯度。据报道氯化钠的使用可以减少蛋白质多聚体的产成[4],但是针对该目的蛋白,氯化钠会影响该蛋白的诱导效率,因此并不适合使用在该目的蛋白的表达过程中。结果如表14所示:
表14
添加剂种类和浓度 | 诱导效率 | 表达效率 |
无添加剂 | 1.8 | 29.3% |
Glucose 0.2% | 5.0 | 52.1% |
Glucose 0.4% | 3.9 | 44% |
NaCl 0.5M | 1.7 | 44.9% |
NaCl 1M | 1 | 39.7% |
通过上述实验和数据分析,均可快速简便的计算出在各种表达条件下,目的蛋白的诱导效率和表达效率,从而筛选出最适宜目的蛋白大肠杆菌表达的条件,大大缩短了实验准备的 时间和结果分析的时间。
采用筛选出的最优条件进行后续实验,不仅可以减少大量培养基的消耗、灭菌仪器的使用频率,还可以降低相关实验人员的工作量。
此外,利用计算出的诱导效率和表达效率数值,结合实施例1、2中的数据分析和后续大规模蛋白质纯化实验结果,还可以估计某蛋白在进行大规模菌液生长和蛋白质分离纯化后所能获得的纯化蛋白量。假设不同蛋白诱导前的蛋白量大致相同,可溶性蛋白量的预测值约等于诱导效率乘以表达效率,如表15所示:
表15
参考文献
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Claims (13)
1.一种快速低成本筛选蛋白质表达条件的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)按照生长条件对表达菌株分组并进行生长培养,制得诱导前菌液样品;
(2)按照诱导条件对诱导前菌液样品再次分组并进行诱导培养,制得诱导后菌液样品;
(3)取步骤(1)制得的诱导前菌液样品和步骤(2)制得的诱导后菌液样品经固液分离获得菌体,然后用菌体裂解液重悬菌体,制得菌体重悬液;取部分菌体重悬液与上样缓冲液混合,然后在95~100℃加热12~18min,经检测,得到诱导前菌液样品蛋白总量A1和诱导后菌液样品蛋白总量B1;
所述菌体裂解液组分如下:
25mM氯化钠,1mg/ml 溶菌酶,1mM苯甲基磺酰氟,25mM Tris-HCl,pH8.0;
(4)取步骤(3)制得的剩余的菌体重悬液与裂解液混合均匀,冰浴中经超声破碎、固液分离,分离出的液体中含有携带标签的目的蛋白,经相应的亲和吸附珠吸附后,经检测,得到诱导后可溶性蛋白量C1;超声破碎固液分离后的固体与上样缓冲液混合均匀,在95~100℃加热12~18min,经检测,得到诱导后非可溶性蛋白量D1;
(5)根据步骤(3)获得的诱导前菌液样品蛋白总量A1和诱导后菌液样品蛋白总量B1数据,以及步骤(4)获得的诱导后可溶性蛋白量C1和诱导后非可溶性蛋白量D1,按照如下公式计算诱导效率和表达效率,筛选最优的培养条件:
。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,所述生长条件包括:菌株培养条件、培养基成分、菌液浓度。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,所述表达菌株包括:大肠杆菌感受态细胞种类、目的蛋白携带的标签种类。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,所述诱导条件包括:诱导剂种类、诱导剂浓度、添加剂种类、添加剂浓度、诱导培养条件。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中,所述固液分离为在6000rpm的条件下离心10min。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中,诱导前菌液样品或诱导后菌液样品与裂解液的体积比为10:(0.8~1.2)。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中,所述部分菌体重悬液与上样缓冲液的体积比为10:(3~3.5)。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)和(4)中,检测为采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,借助扫描仪和软件Quantity One,获得目的蛋白条带的光密度读数,去除背景读数,即得。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述聚丙烯酰胺凝胶电泳的条件为80V恒压,20min后调至120V电泳100~140min。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(4)中,超声破碎条件为:超声波功率225W,超声时间6s,间隔时间6s,超声破碎两个周期。
11.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(4)中,所述固液分离为在4℃、12000rpm的条件下离心20min。
12.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(4)中,亲和吸附珠吸附分离,具体步骤如下:
将菌体重悬液经超声破碎、固液分离后获得的上层液体与亲和吸附珠按体积比(50~60):1混合均匀,在4℃条件下反应40~50min,4000rpm、4℃离心5min,取沉淀,再向沉淀中加入上样缓冲液,95~100℃加热4~6min,即得。
13.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(4)中,固体与上样缓冲液的质量体积比为1:(10~20),单位mg/ml,上样缓冲液为NuPAGE LDS Sample Buffer,浓度为1倍浓度。
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