CN110066820A - 一种荧光菌株E.coli C600及构建方法与应用 - Google Patents

一种荧光菌株E.coli C600及构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种荧光菌株E.coli C600及构建方法与应用。通过构建含有R6k复制子、以两个ISApl1夹着Lux基因簇和亚碲酸盐耐药基因形成的转座单元以及RP4接合转移基因的重组质粒，将所述重组质粒转入其能够复制的宿主菌中得到重组菌株，再将所述的重组菌株与E.coli C600混合培养，即可筛选得到所述的荧光菌株E.coli C600。所述的荧光E.coli C600获得外援DNA的能力不受影响，稳定性强，能够稳定遗传，荧光不会随着细菌传代而丢失，可作为接合实验的受体菌。所述的荧光E.coli C600在质粒接合转移相关领域中能够更高效、直观地鉴别受体菌和接合子，具有良好的应用前景。

Description

一种荧光菌株E.coli C600及构建方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及荧光标记技术，特别涉及一种荧光菌株E.coli C600及构建方法与应用。
背景技术
质粒是一种小的环状双链DNA分子，可以独立地复制。它不但可以在细菌之间传播，也可以在别的生物之间传播，例如古生菌和真菌。质粒上携带的基因通常给予宿主生物特殊的能力，如：抗生素耐药性、重金属耐药性或病菌因素。质粒经常可以自然地传播到别的细菌中。即使在不同的种属之间也可以传播，这使得它们能够轻易地高速传播。通过接合实验研究临床质粒的接合性和移动性，进而研究相关基因的传播机制以及机制基因传播的化合物是分子生物学中常用的方法。如GEtino等通过利用接合的方法筛选抑制质粒传播的化合物(GEtino and Cruz)；如邱等发现纳米材料可以提高质粒传播的效率(Qiu Et al.,2015)；又如孙艺璇等通过接合实验研究压抑菌浓度抗生素对质粒传播的影响(孙艺璇Etal.,2016)。质粒传播给不同细菌的效率不同，为了高效获得临床接合子，就必须需要一株能够高效率获得外源DNA的细菌作为受体菌。
E.coli C600不能分解利用乳糖，因此在麦康凯琼脂上长出的菌落为白色，且其耐链霉素；而大多数大肠杆菌能够利用乳糖代谢，在麦康凯上长红色。此外，由于其是一株天然感受态细胞，和其他F+供体菌细菌经菌毛连接后，可高效获得供体菌的质粒，被广泛应用于接合实验相关研究。
但另一部分大肠杆菌与所有沙门氏菌等细菌，由于无法利用乳糖，因此在麦康凯琼脂上仍长出白色菌落，这为筛选获得外源质粒的E.coli C600(接合子)带来了一定的困难，而现有的鉴定接合子与供体菌的主要方法是通过细菌基因组重复序列PCR(ERIC PCR)的方法鉴定接合子和供体菌。ERIC PCR耗时耗力，且需要大量工作。如果供体菌和接合子的ERIC PCR产物的电泳谱型一致，则通过ERIC PCR的方法也无法有效确定为接合。此外，有的受体菌不可以在麦康凯琼脂培养基上生长，则无法采用麦康凯选择培养基筛选接合子，这严重影响接合子筛选的精确性和准确性，增加了科研工作量。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种荧光菌株E.coliC600的构建方法。
本发明的另一目的在于提供通过所述的构建方法得到的荧光菌株E.coli C600。
本发明的另一目的在于提供通过所述的构建方法或通过所述的构建方法得到的荧光菌株E.coli C600的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种荧光菌株E.coli C600的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建含有R6k复制子、以两个ISApl1夹着Lux基因簇和亚碲酸盐(tpm)耐药基因形成的转座单元以及RP4接合转移基因的重组质粒；
(2)将步骤(1)构建得到的重组质粒转入能提供π蛋白的宿主菌中得到重组菌株，所述的重组质粒可在所述的宿主菌进行复制；
(3)将所述的重组菌株与E.coli C600混合后再进行培养，得到孵育物；
(4)将步骤(3)所述的孵育物涂布在含有亚碲酸钠的LB琼脂培养基中培养，然后对所述的含有亚碲酸钠的LB琼脂培养基上的菌落的荧光情况进行观察，呈现荧光的菌株即为所述的荧光菌株E.coli C600。
步骤(1)中所述的片段在重组质粒中的连接顺序优选为ISApl1-tpm耐药基因-LuxCDABE-ISApl1-R6k复制子-RP4接合转移基因。
步骤(1)中所述的Lux基因簇优选为LuxC-LuxD-LuxA-LuxB-LuxE基因片段。
步骤(1)中所述的自杀型R6k复制子的核苷酸序列优选为如GenBank登陆号为MH626522.1.的序列自5’末端第504至892位核苷酸所示；
所述的Lux基因簇的核苷酸序列优选为如GenBank登陆号为KX670548.1.的序列自5’末端第3429至9187位核苷酸所示；
ISApl1插入序列的核苷酸序列优选为如GenBank登陆号为MH924589.1.的序列自5’末端第219,280至220,203位核苷酸所示；
亚碲酸盐耐药基因(tpm)的核苷酸序列优选为如GenBank登陆号为KX397287.1.的序列自5’末端第4,473至5,126位核苷酸所示；
RP4接合转移基因的核苷酸序列优选为如GenBank登陆号为AJ868289.1.的序列自5’末端第147至1,876位核苷酸所示。
步骤(1)的重组质粒的具体构建方法为：
①将pUC19-tpm质粒通过Afl II和Xho I双酶切，得到片段大小为3380bp酶切产物I；将pUC19-RP4质粒通过Afl II和Xho I双酶切，得到片段大小为4603bp酶切产物II；然后将酶切产物I和酶切产物II连接，得到pTFX-RP4质粒；所述的连接优选为用连接酶连接；
②将步骤①中得到的pTFX-RP4质粒通过EcoR I和Spe I双酶切，得到片段大小为5897bp酶切产物III；将pBBR1MCS4-LuxCDABE质粒通过EcoR I和Spe I双酶切，得到片段大小为7332bp酶切产物IV；然后连接酶切产物III和酶切产物IV，得到所述的重组质粒；所述的连接优选为用连接酶连接。
步骤(2)中所述的能提供π蛋白的宿主菌优选营养缺陷型细菌；进一步优选为E.coli WM3064。
步骤(3)中所述的重组菌株与E.coli C600的混合比例优选为按体积比1:(1～10)进行混合；进一步优选为按体积比1:1进行混合。
当所述的重组菌株的出发菌株为E.coli WM3064时，步骤(3)中所述的培养为在含有二氨荃庚二酸(DAP)的LB琼脂培养基上进行培养；所述的含有二氨荃庚二酸的LB琼脂培养基中的二氨荃庚二酸浓度优选为50μg/mL。
步骤(3)中的重组菌株和/或E.coli C600优选为生长对数期的重组菌株和/或E.coli C600。
当步骤(3)中所述的重组菌株的出发菌株为E.coli WM3064时，优选在终浓度为50μg/mL二氨荃庚二酸的LB肉汤培养基培养至生长对数期。
步骤(3)中E.coli C600优选在LB肉汤培养基培养至生长对数期。
步骤(3)中所述的培养的时间优选为2～8h，进一步优选为4h。
步骤(3)中所述的培养优选为静置培养。
步骤(4)中所述的含有亚碲酸钠的LB琼脂培养基中的亚碲酸钠浓度优选为25μg/mL。
步骤(4)中所述的培养为培养至可观察到直径2mm左右单菌落；所述的培养的时间优选为16～24h，进一步优选为20h；所述的培养优选在37±2℃下培养。
步骤(4)中所述的对所述的LB琼脂培养基上的菌落的荧光情况进行观察，优选为通过活体生物荧光成像技术进行观察；进一步优选采用小动物活体成像仪进行。
通过所述的构建方法得到的荧光菌株E.coli C600。
所述的荧光菌株E.coli C600菌落形态特征为在LB琼脂板上呈米白色，在麦康凯琼脂板上呈白色，在tpmR抗性琼脂板上呈黑色。
所述的LB琼脂板配方为胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，pH值7±0.2。
所述的麦康凯琼脂板配方为蛋白胨20g/L，乳糖10g/L，牛胆盐5g/L，氯化钠5g/L，中性红0.03g/L，琼脂14g/L，pH值7.1±0.2。
tpmR抗性琼脂板配方为即在LB琼脂板和麦康凯琼脂板中加入25μg/mL亚碲酸钠。
所述的荧光菌株E.coli C600的构建方法和/或通过所述的构建方法得到的荧光菌株E.coli C600在质粒接合转移相关领域中的应用；所述的荧光菌株E.coli C600作为受体菌。
所述的应用优选为：将所述的荧光菌株E.coli C600与供体菌进行接合转移实验，培养后通过活体生物荧光成像技术对菌落进行观察，呈现荧光的菌株即为获得供体菌质粒(接合子)的荧光菌株E.coli C600。
本发明(步骤(1))的重组质粒为自杀型质粒，转入含有pir基因能够提供质粒复制的必须π蛋白的宿主(如E.coli WM3064)中，该重组质粒可以在不同革兰氏阴性菌之间进行接合转移，所述的重组质粒含有一个转座单元，该转座单元由两个ISApl1转座单元夹着一个亚碲酸钠耐药基因(tpm)和一个Lux基因簇(LuxA、B、C、D、E)，形成一个转座子。由于E.coli C600不能编码π蛋白，故该质粒通过自然接合转移的方式进入E.coli C600内后不能复制会随之凋亡，而转座就会发生，两个ISApl1夹着亚碲酸钠耐药基因(tpmR)和一个Lux基因簇(LuxA、B、C、D、E)形成的转座单位会高效率的随机插入E.coli C600的基因组中，由于ISApl1转座单元有AT偏好性，即该转座单位会优先整合入E.coli C600基因组中富含AT序列附近，因此通过我们的方法可以获得含有Lux基因簇的荧光E.coli C600突变株。
本发明巧妙地将自杀型R6k复制子，Lux基因簇，ISApl1插入序列，亚碲酸盐耐药基因(tpm)，RP4接合转移基因结合了起来，构建了一个新的质粒pISApl1-RP4-lux。优选的，将该质粒转入营养缺陷性细菌E.coli WM3064中，构成一个荧光标记细菌的体系。将含有pISApl1-RP4-lux的E.coli WM3064和E.coli C600进行接合实验，通过药板筛选即可得到能表达荧光的E.coli C600。
所述的重组E.coli WM3064，转入上携带tpmR耐药基因的pISApl1-RP4-lux质粒，该细菌为营养缺性型细菌，只有在培养环境中加入一种氨基酸，即二氨荃庚二酸(DAP)，该菌便可以增殖。而通常培养基中不含有这一氨基酸，故在不含这一氨基酸的环境中，该细菌不可增殖。
由于原始E.coli C600不含有tpmR耐药基因也不含有pir基因，故只要pISApl1-RP4-lux质粒转入E.coli C600后，pISApl1-RP4-lux无法存在，只能以两个ISApl1夹着lux基因簇和tpm耐药基因串联形成的转座子的形式插入目标E.coli C600的染色体中使得目标菌株由tpmS菌突变为tpmR菌，并能生物发光。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明得到的荧光E.coli C600在细菌传代培养实验过程中，荧光稳定存在，反映出所述的荧光E.coli C600稳定性强，能够稳定遗传，荧光不会随着细菌传代而丢失，可以作为接合实验的受体菌。与不含荧光的E.coli C600相比，本发明的能表达荧光E.coliC600获得外援DNA的能力不受影响，在含有链霉素耐药基因的基础上增加了亚碲酸钠耐药基因(tpmR)作为筛选标记，此外最主要的区别是构建的荧光E.coli C600含有Lux基因簇，能表达荧光。而野生质粒不含有Lux基因簇，因此临床菌(供体菌)不含荧光，接合实验通过双药板筛到有荧光的单菌落即可分辨出其不是供体菌。
(2)在鉴别受体菌和接合子的研究实验中，本发明的荧光E.coli C600相比于非荧光E.coli C600而言，原方法(E.coli C600)需耗时约20小时提取待测菌株基因组，并耗时约7小时进行ERIC PCR，此外需要耗时约1小时进行琼脂糖电泳实验，仔细根据电泳图谱鉴别原菌和接合子。而本发明提供的荧光菌株E.coli C600不用通过以上步骤，只需通过活体生物荧光成像技术(例如利用小动物活体成像仪)观察荧光菌株，能够更加直观的鉴别受体菌和接合子；且该方法高效，不受供体菌影响，节省能源原材料、有利于环保、降低劳动强度、大大缩短鉴定质粒接合子的时间。
附图说明
图1是本发明构建荧光E.coli C600-1的方法示意图。
图2是本发明构建pTFX-RP4-lux质粒技术路线图。
图3是本发明pISApl1-RP4-lux质粒的图谱图。
图4是本发明构建的荧光E.coli C600-1的菌落生长形态照片图。
图5是本发明构建的荧光E.coli C600-1在小动物活体成像仪下的成像照片图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
除非特别说明，以下实施例中采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂、培养基、生物材料等均可通过市售途径获得。
实施例1荧光E.coli C600-1的构建
基于ISApl1插入序列转座突变技术构建E.coli C600-1的方法，具体如图1所示。
1.pTFX-RP4-lux质粒的构建
本发明将自杀型R6k复制子(GenBank登陆号：MH626522.1.(504...892))，Lux基因簇(GenBank登陆号：KX670548.1.(3429...9187))，ISApl1插入序列(GenBank登陆号：MH924589.1.(219,280..220,203))，亚碲酸盐耐药基因(tpm)(GenBank登陆号：KX397287.1.(4,473..5,126))，RP4接合转移基因(GenBank登陆号：AJ868289.1.(147..1,876))结合了起来，构建了一个新的质粒pTFX-RP4-lux。
以下为其中一种可实现的构建方法，但不限于此：
如图2所示，本发明包含的pTFX-RP4-lux质粒的构建过程主要为：
用NEB公司Afl II和Xho I酶分别酶切pUC19-tpm质粒和pUC19-RP4质粒(所述质粒均购自上海吉凯基因科技有限公司)，酶切片段分别为3380bp、4603bp；电泳酶切产物，采用TAKARA公司胶回收试剂盒纯化酶切片段，纯化后的酶切产物经TAKARA公司T4DNA连接酶的催化，过夜连接为pTFX-RP4质粒。将pTFX-RP4质粒化转进入TAKARA公司的大肠杆菌DH5α化转感受态细胞大量增殖pTFX-RP4质粒，并按照天根生化科技有限公司的质粒小提试剂盒使用说明书，从转化子中提取pTFX-RP4质粒。用EcoR I酶和Spe I酶双酶切切割pTFX-RP4质粒和pBBR1MCS4-LuxCDABE质粒(pBBR1MCS4-LuxCDABE质粒购自广州成康生物科技有限公司)，采用以上TAKARA公司胶回收试剂盒纯化酶切产物(回收的酶切片段大小分别5897bp、7332bp)，回收的酶切产物经T4DNA连接酶的催化作用下形成如图3所示的pTFX-RP4-lux质粒，其中，相关基因片段的连接顺序为ISApl1-tpm耐药基因-LuxCDABE-ISApl1-R6k复制子-RP4接合转移基因。将pTFX-RP4-lux质粒转化进入DH5α化转感受态细胞(购自TAKARA公司)大量增殖pTFX-RP4-lux质粒。
2.E.coli WM3064化转感受态细胞的制备
将所述的pTFX-RP4-lux质粒转化入营养缺陷性细菌E.coli WM3064(购自广州成康生物科技有限公司)，得到荧光标记的E.coli WM3064(pTFX-RP4-lux)。
(1)E.coli WM3064转化感受态细胞的制备
①挑E.coli WM3064单菌落于3～5mL LB肉汤培养基中(培养基购自上海源叶生物科技有限公司，并添加终浓度为50μg/mL的二氨荃庚二酸(DAP))，37℃过夜培养；
②按体积比1:50～100转接至100mL LB肉汤培养基中(添加终浓度为50μg/mL的二氨荃庚二酸(DAP)，37℃培养2～3h，至OD600约0.5；
③菌液分装于50mL离心管，冰上预冷10min，4℃，4000g，15min；同时提前将0.1mol/L CaCl2溶液置于冰上预冷；
④弃上清，加入10mL(约0.2倍菌液体积)预冷的CaCl2溶液，轻轻地充分悬浮细胞；
⑤4℃，4000g，离心10min，弃上清；
⑥加入4mL预冷的含15％(v/v)甘油的CaCl2溶液，轻悬细胞，冰上放置10min；
⑦分装100μL于1.5mL离心管，-80℃保存。
(2)转化过程
①在100μL E.coli WM3064感受态细胞中加入100ng pTFX-RP4-lux质粒(体积小于10μL)；
②混匀后，冰浴30min；
③42℃水浴45s；
④冰浴3min，加入890μL SOB培养基或LB肉汤培养基(培养基中添加终浓度为50μg/mL的二氨荃庚二酸(DAP))，37℃培养1h；
⑤取100μL菌液涂布于含有终浓度为50μg/mL的二氨荃庚二酸(DAP)以及25μg/mL亚碲酸钠的LB琼脂培养基中(同时以没有转化的感受态细胞为阴性对照)，37℃培养16～24小时，培养基上长出的黑色菌落经小动物活体成像仪(即Perkinelmer IVIS小动物活体光学成像系统，IVIS)以及PCR鉴定，IVIS鉴定有荧光且PCR鉴定无误则表示pTFX-RP4-lux质粒成功转化至E.coli WM3064，构成一个荧光标记细菌的体系，即E.coli WM3064(pTFX-RP4-lux)。
3.接合转移
将E.coli WM3064(pTFX-RP4-lux)和需要改造的目标菌株E.coli C600(购自上海源叶生物科技有限公司)分别用LB肉汤增菌培养至生长对数期，其中E.coli WM3064(pTFX-RP4-lux)的培养条件中添加终浓度为50μg/mL二氨荃庚二酸(DAP)(购自上海源叶生物科技有限公司)。
将生长对数期的E.coli WM3064(pTFX-RP4-lux)和目标菌株(E.coli C600)按体积比1:1混合后滴在LB琼脂培养基(含50μg/mL的二氨荃庚二酸(DAP))上，静置培养4小时。
4.结果观察与筛选
将步骤3中静置培养后的所有孵育物用1mL生理盐水重悬后，取100μL涂布于含有终浓度为25μg/mL亚碲酸钠的LB琼脂培养基中，37℃培养20小时后，将所述的LB琼脂培养基长出的单菌落用小动物活体成像仪照射，可见有荧光的菌落，即改造成功的荧光菌株E.coli C600，即荧光E.coli C600-1。
E.coli WM3064(pISApl1-RP4-lux)和E.coli C600进行接合转移实验，由于pISApl1-RP4-lux(图3)无法在目标菌(E.coli C600)内复制，质粒上携带的ISApl1插入序列，夹着lux基因簇和tpm耐药基因筛选标记整合在目标菌(E.coli C600)的染色体上，选择性培养基上长出的单菌落通过小动物活体成像仪的照射下具有荧光的菌落即为构建成功的荧光E.coli C600-1。
本发明所述的荧光E.coli C600-1，能够为我们提供一个研究耐药元件和耐药基因的新方法。
实施例2荧光菌株E.coli C600-1的形态观察
将实施例1得到的E.coli C600-1在tpmR抗性LB琼脂板进行培养20小时后，在tpmR抗性LB琼脂板上长出的形态如图4所示，长出大小不规则的黑色菌落。
所述的tpmR抗性LB琼脂板的配方为胰蛋白胨10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，氯化钠10.0g/L，琼脂15.0g/L，pH值7.0±0.2，终浓度25μg/mL亚碲酸钠。
将图4所述琼脂板经小动物活体成像仪，可见细菌产生物荧光，如图5。
将实施例1得到的E.coli C600-1在LB琼脂板(配方为胰蛋白胨10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，氯化钠10.0g/L，琼脂15.0g/L，pH值7.0±0.2)上进行培养，菌落呈米白色。
将实施例1得到的E.coli C600-1在麦康凯琼脂板(配方为蛋白胨20.0g/L，乳糖10.0g/L，牛胆盐5.0g/L，氯化钠5.0g/L，中性红0.03g/L，琼脂14.0g/L，pH值7.1±0.2)上进行培养，菌落呈现白色。
实施例3验证E.coli C600-1获得外源DNA的能力
将实施例1得到的E.coli C600-1(受体菌)和12株临床质粒介导的MCR-1黏菌素耐药大肠杆菌(供体菌，详见表1)，所述的供体菌已在文献中公开：Sun J,Fang L X,Wu Z,etal.Genetic Analysis of the IncX4Plasmids:Implications for a Unique Pattern inthe mcr-1Acquisition[J].Scientific Reports,2017,7(1):424.
表1细菌标记情况统计表
分别接单菌落至4mL LB试管肉汤中，37℃震荡培养至生长对数期后供体菌与受体菌按体积比1:1混合，分别取20μL滴于24孔板中(每孔灌注900μL LB琼脂)，37℃静置培养4小时后，用生理盐水将混合培养的孵化物稀释合适梯度(该梯度上的菌落数为最适菌落数20～200CFU)，取100μL孵化物涂布含2μg/mL黏菌素和2000μg/mL链霉素的双药板，将双药板倒置37℃培养18～24h后，用小动物活体成像仪照荧光。将荧光菌株采用菌落PCR测定mcr-1基因，mcr-1接合子鉴别方法参考文献“董念,向莹,胡晓丰,田赛,杜昕颖,邱少富,宋宏彬,孙岩松.一株mcr-1阳性多重耐药宋内志贺菌的鉴定和药物敏感性特征分析[J/OL].疾病监测:1-7[2019-04-05]”。
结果表明：12株接合实验中，采用E.coli C600作为受体菌，用时5天成功获得10株供体菌的质粒(接合子)；采用荧光E.coli C600-1作为受体菌，用时2天成功获得10株供体菌的质粒(接合子)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种荧光菌株E.coli C600的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建含有R6k复制子、以两个ISApl1夹着Lux基因簇和亚碲酸盐耐药基因形成的转座单元以及RP4接合转移基因的重组质粒；
(2)将步骤(1)构建得到的重组质粒转入能提供π蛋白的宿主菌中得到重组菌株，所述的重组质粒能在所述的宿主菌进行复制；
(3)将所述的重组菌株与E.coli C600混合后进行培养，得到孵育物；
(4)将步骤(3)所述的孵育物涂布在含有亚碲酸钠的LB琼脂培养基中培养，然后对所述的LB琼脂培养基上的菌落的荧光情况进行观察，呈现荧光的菌株即为所述的荧光菌株E.coli C600。
2.根据权利要求1所述的荧光菌株E.coli C600的构建方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的Lux基因簇为LuxC-LuxD-LuxA-LuxB-LuxE基因片段；
步骤(1)中所述的片段在重组质粒中的连接顺序为ISApl1-tpm耐药基因-LuxCDABE-ISApl1-R6k复制子-RP4接合转移基因；
步骤(1)中所述的自杀型R6k复制子的核苷酸序列为如GenBank登陆号为MH626522.1.的序列自5’末端第504至892位核苷酸所示；
所述的Lux基因簇的核苷酸序列为如GenBank登陆号为KX670548.1.的序列自5’末端第3429至9187位核苷酸所示；
ISApl1插入序列的核苷酸序列为如GenBank登陆号为MH924589.1.的序列自5’末端第219,280至220,203位核苷酸所示；
亚碲酸盐耐药基因的核苷酸序列为如GenBank登陆号为KX397287.1.的序列自5’末端第4,473至5,126位核苷酸所示；
RP4接合转移基因的核苷酸序列为如GenBank登陆号为AJ868289.1.的序列自5’末端第147至1,876位核苷酸所示。
3.根据权利要求1所述的荧光菌株E.coli C600的构建方法，其特征在于：
步骤(1)的重组质粒的具体构建方法为：
①将pUC19-tpm质粒通过Afl II和Xho I双酶切，得到片段大小为3380bp酶切产物I；将pUC19-RP4质粒通过Afl II和Xho I双酶切，得到片段大小为4603bp酶切产物II；然后连接酶切产物I和酶切产物II，得到pTFX-RP4质粒；
②将步骤①中得到的pTFX-RP4质粒通过EcoR I和Spe I双酶切，得到片段大小为5897bp酶切产物III；将pBBR1MCS4-LuxCDABE质粒通过EcoR I和Spe I双酶切，得到片段大小为7332bp酶切产物IV；然后连接酶切产物III和酶切产物IV，得到所述的重组质粒。
4.根据权利要求1所述的荧光菌株E.coli C600的构建方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的能提供π蛋白的宿主菌为营养缺陷型细菌；
步骤(3)中所述的培养为静置培养；
步骤(4)中所述的含有亚碲酸钠的LB琼脂培养基中的亚碲酸钠浓度为25μg/mL。
步骤(4)中所述的培养为培养至能够观察到直径2mm单菌落。
5.根据权利要求1所述的荧光菌株E.coli C600的构建方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的能提供π蛋白的宿主菌为E.coli WM3064；
步骤(3)中所述的重组菌株与E.coli C600的混合比例为按体积比1:(1～10)进行混合；
步骤(3)中所述的培养的时间为2～8h；
当所述的重组菌株的出发菌株为E.coli WM3064时，步骤(3)中所述的培养为在含有二氨荃庚二酸的LB琼脂培养基上进行培养；
步骤(3)中的重组菌株和/或E.coli C600为生长对数期的重组菌株和/或E.coliC600；
步骤(4)中所述的培养的时间为16～24h。
6.根据权利要求5所述的荧光菌株E.coli C600的构建方法，其特征在于：
所述的含有二氨荃庚二酸的LB琼脂培养基中的二氨荃庚二酸浓度为50μg/mL；
步骤(3)中所述的重组菌株与E.coli C600的混合比例为按体积比1:1进行混合；
当步骤(3)中所述的重组菌株的出发菌株为E.coli WM3064时，在终浓度为50μg/mL二氨荃庚二酸的LB肉汤培养基培养至生长对数期；
步骤(3)中E.coli C600在LB肉汤培养基培养至生长对数期；
步骤(4)中所述的对所述的LB琼脂培养基上的菌落的荧光情况进行观察为通过活体生物荧光成像技术进行观察。
7.根据权利要求1所述的荧光菌株E.coli C600的构建方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的培养的时间为4h；
步骤(4)中所述的培养的时间为20h；所述的培养在37±2℃下培养；
步骤(4)中所述的对所述的LB琼脂培养基上的菌落的荧光情况进行观察采用小动物活体成像仪进行。
8.一种荧光菌株E.coli C600，其特征在于：
通过权利要求1～7任一项所述的构建方法得到。
9.权利要求1～7任一项所述的荧光菌株E.coli C600的构建方法和/或权利要求8所述的荧光菌株E.coli C600在质粒接合转移相关领域中的应用；所述的荧光菌株E.coli C600作为受体菌。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：
将所述的荧光菌株E.coli C600与供体菌进行接合转移实验，培养后通过活体生物荧光成像技术对菌落进行观察，呈现荧光的菌株即为获得供体菌质粒的荧光菌株E.coliC600。
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