CN108220283A - 阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠及其制备方法，该阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠由嫁接有阳离子聚合物的阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成，本发明提供的磁珠对抗体等生物活性物质的载量高，并且具有非常好的高温稳定性。

Description

阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠及其制备方法
技术领域
本发明涉及功能性纳米磁珠及其制备应用领域，具体是涉及一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠及其制备方法。
背景技术
细菌磁颗粒是细菌生产的一种磁性纳米颗粒，也称为微生物纳米磁颗粒，内核是Fe3O4晶体，外面有一层磷脂生物膜包被，粒径在30-120nm之间。同一种细菌生产的细菌磁颗粒，它们的粒径大小和晶体晶型基本一致，磁学性质均一，有天然生物膜包被，具有很好的水溶性质和胶体性质。此外，细菌磁颗粒是生物制备来源，因此具有较好的生物相容性。细菌磁颗粒表面膜上带有大量的功能基团，可通过化学修饰和双功能偶联剂连接不同的功能大分子，如抗体，从而具有不同的特殊功能。细菌磁颗粒最独特的地方在于它可以通过基因工程的方法在表面膜上表达特殊的蛋白质及多肽分子，成为具有特殊生物活性的功能性生物纳米磁珠。
细菌磁颗粒是应用前景非常广阔的一类功能材料，但是裸露的细菌磁颗粒容易集聚、对生物体具有毒性及生物相容性较差，这些缺点限制了其广泛应用，尤其是在生物医学领域的应用。因此，对纳米材料进行表面的化学修饰，使其带上反应性功能基团(如-COOH，-NH2，-OH等)，或者包裹生物相容性材料(如油酸、SiO2，聚乙二醇等)，一直是研究的热点以及细菌磁颗粒应用于生物医学领域的重要前提条件之一。化学共沉淀法、水热法、溶胶-凝胶法、微乳液法等一直是化学制备纳米材料并在表面修饰生物相容性物质的常用方法，已经实现通过多代嫁接的方法，在纳米材料表面修饰树状大分子的多聚物。在这过程中，零代纳米材料的制备最为关键，涉及到纳米材料的形状、大小以及表面最初的功能基团的修饰和选择。功能蛋白与细菌磁颗粒结合形成的零代纳米材料长存在结合不牢固，或者中间的linker刚性不够，进而制备的生物纳米磁珠载量低、高温稳定性差。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠，该阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠具有结合牢固、高温稳定性好的效果。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠，该阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠由嫁接有阳离子聚合物的阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成，所述linker的氨基酸残基为AlaPheAla2Gly2Ser(AlaCysGly2LeuAla)2(Gly2Leu2AlaSer Gly2Ala2)2SerGly2Ala2PheAla。
进一步的改进，阳离子聚合物为聚乙烯亚胺(PEI)，所述阳离子多肽选自YR-CP1、YR-CP2、YR-CP3或YR-CP4的一种，其中，所述YR-CP1的多肽序列为：PRRRRASRRVRRRRRPRVSRRRRRGGRRRRSSRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRRR；所述YR-CP2的多肽序列为：CYRQRQTSRRRRRRSCQTQRRAMRCRRRNRLRRRKHRRRYGSRRRRRRYG；所述YR-CP3的多肽序列为：YRVRRSRRRHCSRRRLKRIHRRQRSCRRRKRRSRHRRRHRRGRRKRTCRR；所述YR-CP4的多肽序列为：KNLKKLKKLKCSRRPVRRRRPRVSRKKLKKLSKLVSRRRRRGGRRRCKKL。
本发明另一方面提供一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
A.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC或mamF的缺失突变体菌株，称为一级重组菌株；
B.将阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白mamC或mamF融合构建基因表达载体，并将构建的基因表达载体导入到一级重组菌株中，筛选表达阳离子多肽的二级重组菌株；
C.对步骤B获得的二级重组菌株进行培养发酵，生成表达阳离子多肽的生物纳米磁珠；
D.以步骤C获得的表达阳离子多肽的生物纳米磁珠为种子，用阳离子多聚物进行嫁接暴露阳离子多肽表面，形成阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠。
进一步的改进，步骤A具体方法为：
A-1：设计两对引物分别扩增mamC或mamF基因两侧约500bp的同源DNA片段，通过分子克隆构建一条基于噬菌体病毒的微载体序列AAV-del-mamC或AAV-del-mamF；
A-2：AAV-del-mamC或AAV-del-mamF通过质粒提取及酶切步骤得到足够量的核酸序列产物，调节浓度为2mg/mL，通过电转化的方式同时转入MSR-I野生型菌株中；
A-3：电转化后的MSR-I野生型菌株通过洗脱液梯度洗脱，筛选双交换突变菌株，经测序技术验证后，获得mamC或mamF缺失突变的重组菌株，即一级重组菌株。
细菌磁颗粒膜上的蛋白有5-6种，其中MamA，MamB是和细菌磁颗粒合成有直接密切的关系，缺少这两个蛋白，细菌磁颗粒的合成会受到严重影响。此外，其他3-4个蛋白MamC，MamD，MamE(MSR-I菌株中可能没有)、MamF单独缺失突变并不会影响细菌磁颗粒的合成，但是若同时缺失2-3个或者全部缺失，会影响细菌磁颗粒的产量，例如全部缺失，会使细菌磁颗粒产量下降到野生型(未突变)磁珠产量的20％左右。
经过突变研究和产量分析，最后发现MamC和MamF两个蛋白同时缺失部分膜外蛋白，并不会造成细菌磁颗粒产量的显著下降(约为野生型产量的85％-90％)，而且这两个蛋白的表达水平相近，估计是和它们主要作为结构支撑蛋白有关，构建它们的双突变体有利于充分发挥这个蛋白作为新融合蛋白表达骨架的作用。
mamC和mamF的基因敲除载体，本发明中有提到使用噬菌体AAV-del微载体，它和传统质粒的区别在于，质粒是可以在染色体之外单独存在，能自我复制，可在细胞中长期存在，不易丢失；微载体则不能在染色体之外单独自我复制，只有整合到染色体中才能长期存在，较易丢失，因此用来进行基因敲除，遗传背景比较干净，没有太多外来基因的干扰和污染。
进一步的改进，步骤A-2电转化条件为：方波脉冲，电压3100V-3200V，电脉冲时间3.1-3.3ms，电脉冲次数1-2次。
一般细菌间基因转移是通过接合的方式(亲本接合)，这容易造成转移基因的缺少，特别是对大片段基因的质粒。电转化方法，是通过瞬时电流在细胞上形成孔洞，使得溶液中的DNA基因片段能够通过孔洞进入细胞内，完成转化。本发明在进行进一步的研究过程中对电转化的条件进行优化，该电转化条件可以显著提高菌株成活率和电转化成功率。
进一步的改进，步骤A-3所述的洗脱液由如下重量份的成分组成：
蔗糖25-30 庆大霉素10-15 吐温80 2-3
磷酸盐缓冲液50-60 磷脂酰乙醇胺5-10。
通过对洗脱液的优化，可以显著提高菌株成活率。
进一步的改进，步骤B具体方法为：
B-1：将阳离子多肽的基因序列通过linker与mamC基因或mamF基因进行融合，得到新的融合基因片段；
B-2：将新的融合基因片段克隆到表达载体pBRC上，分别得到基因表达载体；
B-3：通过电转化的方式分别将基因表达载体导入一级重组菌中，验证正确后筛选表达阳离子多肽的重组菌株，即二级重组菌株。
进一步的改进，步骤C培养发酵的具体步骤包括：
C-1：在发酵罐中加入第一培养基，对步骤B获得的二级重组菌株进行预培养，培养条件为：5-10％氧气和90-95％氮气的混合气体，培养时间16h，培养温度为37℃，优选地，通气量为每分钟每1L第一培养基通入0.3-0.5L的混合气体；
C-2：将步骤B获得的二级重组菌株转接到含有第二培养基的发酵罐中进行深层培养，培养条件为：5％O2、1％H2和94％氮气混合气体，培养时间3-4天，培养温度37℃，获得深层培养物；优选地，通气量为每分钟每1L第二培养基通入0.4-0.6L的混合气体；
C-3：将深层培养物粉碎，通过磁装置吸附，利用磷酸缓冲液洗涤2-3次；
C-4：进一步用超声波及蛋白酶缓冲液进行梯度处理，最终得到表达阳离子多肽的生物纳米磁珠。
进一步的改进，所述第一培养基由如下重量份的各成分组成：
芝麻粉1-3 二异丙醇胺2-5 麦芽糖醇5-10
木糖醇酐单硬脂酸酯2-5 硫酸镁1-3 氯化硒1-3
海藻酸钠5-10 胆固醇棕榈酸酯1-3；
所述第二培养基由如下重量份的各成分组成：
麦芽糖醇5-10 魔芋粉2-5 氯化钙1-3
磷酸二氢钾2-5 海藻酸钠5-10 维生素E 1-3
硬脂醇1-3 蛋氨酸2-5。
通过选择特殊的培养条件和培养基，有利于提高生物纳米磁珠产量。
进一步的改进，步骤D具体方法为：
D-1：取150-300mg表达阳离子多肽的生物纳米磁珠溶于100mL 50％乙醇溶液中，超声处理10min，超声功率为35-50W，每次超声时间4-6s，间隔10-12s，室温搅拌反应6小时；
D-2：磁力架吸附，洗涤，纯化，重悬于150mL甲醇溶液中，加入1.5mL丙烯酸丁酯，密封后，置于超声水浴中分散1小时；
D-3：配置2％浓度的PEI溶液，取15mL，滴加到反应瓶中，200rpm，振荡反应48小时；
D-4：磁力架分离纯化，重新溶于150mL甲醇中，并加入3mL羟胺，密封超声处理1小时，200rpm，继续振荡反应24-48小时，磁性分离提纯后得到阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠。
通过PEI修饰的生物纳米磁珠可以写提高纳米磁珠对抗体的载量。
本发明提供的阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠表面表达展示阳离子多肽聚合物，阳离子多肽聚合物通过柔性linker连接到细菌磁颗粒膜蛋白上，阳离子多肽侧链主要提供-NH2氨基化修饰位点；生物纳米磁珠可以进一步嫁接阳离子聚合物，优选的是聚乙烯亚胺PEI，进而制得的阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠可通过多聚阳离子相互作用吸附核酸，应用于核酸提取及核酸载体等方面，并且本发明选择的linker刚性适中，进而提高了该阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠对抗体等生物活性物质的载量，提高了该阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠的高温稳定性。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，不能用来限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠
该阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠由嫁接有阳离子聚合物的阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成，所述linker的氨基酸残基为AlaPheAla2Gly2Ser(AlaCysGly2LeuAla)2(Gly2Leu2AlaSer Gly2Ala2)2SerGly2Ala2PheAla，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺PEI，所述阳离子多肽为YR-CP1，所述YR-CP1的多肽序列为：PRRRRASRRVRRRRRPRVSRRRRRGGRRRRSSRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRRR。
实施例2一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠
该阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠由嫁接有阳离子聚合物的阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成，所述linker的氨基酸残基为AlaPheAla2Gly2Ser(AlaCysGly2LeuAla)2(Gly2Leu2AlaSer Gly2Ala2)2SerGly2Ala2PheAla，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺PEI，所述阳离子多肽为YR-CP2，所述YR-CP2的多肽序列为：CYRQRQTSRRRRRRSCQTQRRAMRCRRRNRLRRRKHRRRYGSRRRRRRYG。
实施例3一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠
该阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠由嫁接有阳离子聚合物的阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成，所述linker的氨基酸残基为AlaPheAla2Gly2Ser(AlaCysGly2LeuAla)2(Gly2Leu2AlaSer Gly2Ala2)2SerGly2Ala2PheAla，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺PEI，所述阳离子多肽为YR-CP3，所述YR-CP3的多肽序列为：YRVRRSRRRHCSRRRLKRIHRRQRSCRRRKRRSRHRRRHRRGRRKRTCRR。
实施例4一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠
该阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠由嫁接有阳离子聚合物的阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成，所述linker的氨基酸残基为AlaPheAla2Gly2Ser(AlaCysGly2LeuAla)2(Gly2Leu2AlaSer Gly2Ala2)2SerGly2Ala2PheAla，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺PEI，所述阳离子多肽为YR-CP4，所述YR-CP4的多肽序列为：KNLKKLKKLKCSRRPVRRRRPRVSRKKLKKLSKLVSRRRRRGGRRRCKKL；
该阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠的制备方法为：
A.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamF的缺失突变体菌株，称为一级重组菌株；
B.将阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白mamF融合构建基因表达载体，并将构建的基因表达载体导入到一级重组菌株中，筛选表达阳离子多肽的二级重组菌株；
C.对步骤B获得的二级重组菌株进行培养发酵，生成表达阳离子多肽的生物纳米磁珠；
D.以步骤C获得的表达阳离子多肽的生物纳米磁珠为种子，用阳离子多聚物进行嫁接暴露阳离子多肽表面，形成阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠。
实施例5一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠
该阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠由嫁接有阳离子聚合物的阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成，所述linker的氨基酸残基为AlaPheAla2Gly2Ser(AlaCysGly2LeuAla)2(Gly2Leu2AlaSer Gly2Ala2)2SerGly2Ala2PheAla，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺PEI，所述阳离子多肽为YR-CP1，所述YR-CP1的多肽序列为：PRRRRASRRVRRRRRPRVSRRRRRGGRRRRSSRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRRR；
该阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠的制备方法为：
A.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC的缺失突变体菌株，称为一级重组菌株，具体方法如下：
A-1：设计两对引物分别扩增mamC基因两侧约500bp的同源DNA片段，通过分子克隆构建一条基于噬菌体病毒的微载体序列AAV-del-mamC；
A-2：AAV-del-mamC通过质粒提取及酶切步骤得到足够量的核酸序列产物，调节浓度为2mg/mL，通过电转化的方式同时转入MSR-I野生型菌株中，电转化条件为：方波脉冲，电压3100V，电脉冲时间3.2ms，电脉冲次数1次；
A-3：电转化后的MSR-I野生型菌株通过洗脱液梯度洗脱，筛选双交换突变菌株，经测序技术验证后，获得mamC缺失突变的重组菌株，即一级重组菌株，洗脱液由如下重量份的成分组成：
蔗糖25 庆大霉素10 吐温80 2
磷酸盐缓冲液50 磷脂酰乙醇胺5；
B.将阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白mamC融合构建基因表达载体，并将构建的基因表达载体导入到一级重组菌株中，筛选表达阳离子多肽的二级重组菌株，具体方法为：
B-1：将阳离子多肽的基因序列通过linker与mamC基因进行融合，得到新的融合基因片段；
B-2：将新的融合基因片段克隆到表达载体pBRC上，分别得到基因表达载体；
B-3：通过电转化的方式分别将基因表达载体导入一级重组菌中，验证正确后筛选表达阳离子多肽的重组菌株，即二级重组菌株；
C.对步骤B获得的二级重组菌株进行培养发酵，生成表达阳离子多肽的生物纳米磁珠，具体方法为：
C-1：在发酵罐中加入第一培养基，对步骤B获得的二级重组菌株进行预培养，培养条件为：7％氧气、93％氮气，培养时间16h，培养温度为37℃，所述第一培养基由如下重量份的各成分组成：
芝麻粉2 二异丙醇胺3 麦芽糖醇7
木糖醇酐单硬脂酸酯3 硫酸镁2 氯化硒2
海藻酸钠7 胆固醇棕榈酸酯2；
C-2：将步骤B获得的二级重组菌株转接到含有第二培养基的发酵罐中进行深层培养，培养条件为5％O2、1％H2和94％氮气，培养时间3天，培养温度37℃，获得深层培养物；第二培养基由如下重量份的各成分组成：
麦芽糖醇7 魔芋粉3 氯化钙2
磷酸二氢钾4 海藻酸钠7 维生素E 2
硬脂醇2 蛋氨酸4；
C-3：将深层培养物粉碎，通过磁装置吸附，利用磷酸缓冲液洗涤2次；
C-4：进一步用超声波及蛋白酶缓冲液进行梯度处理，最终得到表达阳离子多肽的生物纳米磁珠；
D.以步骤C获得的表达阳离子多肽的生物纳米磁珠为种子，用阳离子多聚物进行嫁接暴露阳离子多肽表面，形成阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠，具体方法为：
D-1：取200mg表达阳离子多肽的生物纳米磁珠溶于100mL 50％乙醇溶液中，超声处理10min，超声功率为40W，每次超声时间5s，间隔10s，室温搅拌反应6小时；
D-2：磁力架吸附，洗涤，纯化，重悬于150mL甲醇溶液中，加入1.5mL丙烯酸丁酯，密封后，置于超声水浴中分散1小时；
D-3：配置2％浓度的PEI溶液，取15mL，滴加到反应瓶中，200rpm，振荡反应48小时；
D-4：磁力架分离纯化，重新溶于150mL甲醇中，并加入3mL羟胺，密封超声处理1小时，200rpm，继续振荡反应24小时，磁性分离提纯后得到阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠。
实施例6一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠的制备方法
该制备方法包括如下步骤：
A.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamF的缺失突变体菌株，称为一级重组菌株；
B.将阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白mamF融合构建基因表达载体，并将构建的基因表达载体导入到一级重组菌株中，筛选表达阳离子多肽的二级重组菌株；
C.对步骤B获得的二级重组菌株进行培养发酵，生成表达阳离子多肽的生物纳米磁珠；
D.以步骤C获得的表达阳离子多肽的生物纳米磁珠为种子，用阳离子多聚物进行嫁接暴露阳离子多肽表面，形成阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠。
实施例7一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠的制备方法
该制备方法包括如下步骤：
A.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC的缺失突变体菌株，称为一级重组菌株，具体方法为：
A-1：设计两对引物分别扩增mamC基因两侧约500bp的同源DNA片段，通过分子克隆构建一条基于噬菌体病毒的微载体序列AAV-del-mamC；
A-2：AAV-del-mamC通过质粒提取及酶切步骤得到足够量的核酸序列产物，调节浓度为2mg/mL，通过电转化的方式同时转入MSR-I野生型菌株中，电转化条件为：方波脉冲，电压3100V，电脉冲时间3.1ms，电脉冲次数1次；
A-3：电转化后的MSR-I野生型菌株通过洗脱液梯度洗脱，筛选双交换突变菌株，经测序技术验证后，获得mamC缺失突变的重组菌株，即一级重组菌株，洗脱液由如下重量份的成分组成：
蔗糖30 庆大霉素15 吐温80 3
磷酸盐缓冲液60 磷脂酰乙醇胺10；
B.将阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白mamC融合构建基因表达载体，并将构建的基因表达载体导入到一级重组菌株中，筛选表达阳离子多肽的二级重组菌株；
C.对步骤B获得的二级重组菌株进行培养发酵，生成表达阳离子多肽的生物纳米磁珠；
D.以步骤C获得的表达阳离子多肽的生物纳米磁珠为种子，用阳离子多聚物进行嫁接暴露阳离子多肽表面，形成阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠。
实施例8一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠的制备方法
该制备方法包括如下步骤：
A.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamF的缺失突变体菌株，称为一级重组菌株，具体方法为：
A-1：设计两对引物分别扩增mamF基因两侧约500bp的同源DNA片段，通过分子克隆构建一条基于噬菌体病毒的微载体序列AAV-del-mamF；
A-2：AAV-del-mamF通过质粒提取及酶切步骤得到足够量的核酸序列产物，调节浓度为2mg/mL，通过电转化的方式同时转入MSR-I野生型菌株中，电转化条件为：方波脉冲，电压3200V，电脉冲时间3.3ms，电脉冲次数2次；
A-3：电转化后的MSR-I野生型菌株通过洗脱液梯度洗脱，筛选双交换突变菌株，经测序技术验证后，获得mamF缺失突变的重组菌株，即一级重组菌株，洗脱液由如下重量份的成分组成：
蔗糖25 庆大霉素10 吐温80 2
磷酸盐缓冲液50 磷脂酰乙醇胺5；
B.将阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白mamF融合构建基因表达载体，并将构建的基因表达载体导入到一级重组菌株中，筛选表达阳离子多肽的二级重组菌株，具体方法为：
B-1：将阳离子多肽的基因序列通过linker与mamF基因进行融合，得到新的融合基因片段；
B-2：将新的融合基因片段克隆到表达载体pBRC上，得到基因表达载体；
B-3：通过电转化的方式分别将基因表达载体导入一级重组菌中，验证正确后筛选表达阳离子多肽的重组菌株，即二级重组菌株；
C.对步骤B获得的二级重组菌株进行培养发酵，生成表达阳离子多肽的生物纳米磁珠；
D.以步骤C获得的表达阳离子多肽的生物纳米磁珠为种子，用阳离子多聚物进行嫁接暴露阳离子多肽表面，形成阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠。
实施例9一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠的制备方法
该制备方法包括如下步骤：
A.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamF的缺失突变体菌株，称为一级重组菌株，具体方法为：
A-1：设计两对引物分别扩增mamF基因两侧约500bp的同源DNA片段，通过分子克隆构建一条基于噬菌体病毒的微载体序列AAV-del-mamF；
A-2：AAV-del-mamF通过质粒提取及酶切步骤得到足够量的核酸序列产物，调节浓度为2mg/mL，通过电转化的方式同时转入MSR-I野生型菌株中，电转化条件为：方波脉冲，电压3150V，电脉冲时间3.2ms，电脉冲次数2次；
A-3：电转化后的MSR-I野生型菌株通过洗脱液梯度洗脱，筛选双交换突变菌株，经测序技术验证后，获得mamF缺失突变的重组菌株，即一级重组菌株，洗脱液由如下重量份的成分组成：
蔗糖27 庆大霉素12 吐温80 2.5
磷酸盐缓冲液55 磷脂酰乙醇胺7.5；
B.将阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白mamF融合构建基因表达载体，并将构建的基因表达载体导入到一级重组菌株中，筛选表达阳离子多肽的二级重组菌株，具体方法为：
B-1：将阳离子多肽的基因序列通过linker与mamF基因进行融合，得到新的融合基因片段；
B-2：将新的融合基因片段克隆到表达载体pBRC上，得到基因表达载体；
B-3：通过电转化的方式分别将基因表达载体导入一级重组菌中，验证正确后筛选表达阳离子多肽的重组菌株，即二级重组菌株；
C.对步骤B获得的二级重组菌株进行培养发酵，生成表达阳离子多肽的生物纳米磁珠，具体方法为：
C-1：在发酵罐中加入第一培养基，对步骤B获得的二级重组菌株进行预培养，培养条件为含5％氧气、95％氮气，培养时间16h，培养温度为37℃，通气量为每分钟每1L第一培养基通入0.3L的氧气和氮气混合气体；第一培养基由如下重量份的各成分组成：
芝麻粉1 二异丙醇胺2 麦芽糖醇5
木糖醇酐单硬脂酸酯2 硫酸镁1 氯化硒1
海藻酸钠5 胆固醇棕榈酸酯1；
C-2：将步骤B获得的二级重组菌株转接到含有第二培养基的发酵罐中进行深层培养，培养条件为5％O2、1％H2和94％氮气，通气量为每分钟每1L第二培养基通入0.4L的氧气、氢气和氮气的混合气体，培养时间3天，培养温度37℃，获得深层培养物，第二培养基由如下重量份的各成分组成：
麦芽糖醇5 魔芋粉2 氯化钙1
磷酸二氢钾2 海藻酸钠5 维生素E 1
硬脂醇1 蛋氨酸2；
C-3：将深层培养物粉碎，通过磁装置吸附，利用磷酸缓冲液洗涤2次；
C-4：进一步用超声波及蛋白酶缓冲液进行梯度处理，最终得到表达阳离子多肽的生物纳米磁珠；
D.以步骤C获得的表达阳离子多肽的生物纳米磁珠为种子，用阳离子多聚物进行嫁接暴露阳离子多肽表面，形成阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠。
实施例10一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠的制备方法
该制备方法包括如下步骤：
A.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamF的缺失突变体菌株，称为一级重组菌株，具体方法为：
A-1：设计两对引物分别扩增mamF基因两侧约500bp的同源DNA片段，通过分子克隆构建一条基于噬菌体病毒的微载体序列AAV-del-mamF；
A-2：AAV-del-mamF通过质粒提取及酶切步骤得到足够量的核酸序列产物，调节浓度为2mg/mL，通过电转化的方式同时转入MSR-I野生型菌株中，电转化条件为：方波脉冲，电压3150V，电脉冲时间3.2ms，电脉冲次数2次；
A-3：电转化后的MSR-I野生型菌株通过洗脱液梯度洗脱，筛选双交换突变菌株，经测序技术验证后，获得mamF缺失突变的重组菌株，即一级重组菌株，洗脱液由如下重量份的成分组成：
蔗糖27 庆大霉素12 吐温80 2.5
磷酸盐缓冲液55 磷脂酰乙醇胺7.5；
B.将阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白mamF融合构建基因表达载体，并将构建的基因表达载体导入到一级重组菌株中，筛选表达阳离子多肽的二级重组菌株，具体方法为：
B-1：将阳离子多肽的基因序列通过linker与mamF基因进行融合，得到新的融合基因片段；
B-2：将新的融合基因片段克隆到表达载体pBRC上，得到基因表达载体；
B-3：通过电转化的方式分别将基因表达载体导入一级重组菌中，验证正确后筛选表达阳离子多肽的重组菌株，即二级重组菌株；
C.对步骤B获得的二级重组菌株进行培养发酵，生成表达阳离子多肽的生物纳米磁珠，具体方法为：
C-1：在发酵罐中加入第一培养基，对步骤B获得的二级重组菌株进行预培养，培养条件为含10％氧气、90％氮气，培养时间16h，培养温度为37℃，通气量为每分钟每1L第一培养基通入0.5L的氧气和氮气混合气体，第一培养基由如下重量份的各成分组成：
芝麻粉3 二异丙醇胺5 麦芽糖醇10
木糖醇酐单硬脂酸酯5 硫酸镁3 氯化硒3
海藻酸钠10 胆固醇棕榈酸酯3；
C-2：将步骤B获得的二级重组菌株转接到含有第二培养基的发酵罐中进行深层培养，培养条件为5％O2、1％H2和94％氮气，通气量为每分钟每1L第二培养基通入0.6L的氧气、氢气和氮气的混合气体，培养时间4天，培养温度37℃，获得深层培养物，第二培养基由如下重量份的各成分组成：
麦芽糖醇10 魔芋粉5 氯化钙3
磷酸二氢钾5 海藻酸钠10 维生素E 3
硬脂醇3 蛋氨酸5；
C-3：将深层培养物粉碎，通过磁装置吸附，利用磷酸缓冲液洗涤1次；
C-4：进一步用超声波及蛋白酶缓冲液进行梯度处理，最终得到表达阳离子多肽的生物纳米磁珠；
D.以步骤C获得的表达阳离子多肽的生物纳米磁珠为种子，用阳离子多聚物进行嫁接暴露阳离子多肽表面，形成阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠，具体方法为：
D-1：取300mg表达阳离子多肽的生物纳米磁珠溶于100mL 50％乙醇溶液中，超声处理10min，超声功率为50W，每次超声时间6s，间隔12s，室温搅拌反应6小时；
D-2：磁力架吸附，洗涤，纯化，重悬于150mL甲醇溶液中，加入1.5mL丙烯酸丁酯，密封后，置于超声水浴中分散1小时；
D-3：配置2％浓度的PEI溶液，取15mL，滴加到反应瓶中，200rpm，振荡反应48小时；
D-4：磁力架分离纯化，重新溶于150mL甲醇中，并加入3mL羟胺，密封超声处理1小时，200rpm，继续振荡反应24小时，磁性分离提纯后得到阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠。
实施例11一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠的制备方法
该制备方法包括如下步骤：
A.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamF的缺失突变体菌株，称为一级重组菌株，具体方法为：
A-1：设计两对引物分别扩增mamF基因两侧约500bp的同源DNA片段，通过分子克隆构建一条基于噬菌体病毒的微载体序列AAV-del-mamF；
A-2：AAV-del-mamF通过质粒提取及酶切步骤得到足够量的核酸序列产物，调节浓度为2mg/mL，通过电转化的方式同时转入MSR-I野生型菌株中，电转化条件为：方波脉冲，电压3150V，电脉冲时间3.2ms，电脉冲次数2次；
A-3：电转化后的MSR-I野生型菌株通过洗脱液梯度洗脱，筛选双交换突变菌株，经测序技术验证后，获得mamF缺失突变的重组菌株，即一级重组菌株，洗脱液由如下重量份的成分组成：
蔗糖27 庆大霉素12 吐温80 2.5
磷酸盐缓冲液55 磷脂酰乙醇胺7.5；
B.将阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白mamF融合构建基因表达载体，并将构建的基因表达载体导入到一级重组菌株中，筛选表达阳离子多肽的二级重组菌株，具体方法为：
B-1：将阳离子多肽的基因序列通过linker与mamF基因进行融合，得到新的融合基因片段；
B-2：将新的融合基因片段克隆到表达载体pBRC上，得到基因表达载体；
B-3：通过电转化的方式分别将基因表达载体导入一级重组菌中，验证正确后筛选表达阳离子多肽的重组菌株，即二级重组菌株；
C.对步骤B获得的二级重组菌株进行培养发酵，生成表达阳离子多肽的生物纳米磁珠，具体方法为：
C-1：在发酵罐中加入第一培养基，对步骤B获得的二级重组菌株进行预培养，培养条件为含7.5％氧气、92.5％氮气，培养时间16h，培养温度为37℃，通气量为每分钟每1L第一培养基通入0.4L的氧气和氮气混合气体，第一培养基由如下重量份的各成分组成：
芝麻粉2 二异丙醇胺3.5 麦芽糖醇7.5
木糖醇酐单硬脂酸酯3.5 硫酸镁2 氯化硒2
海藻酸钠7.5 胆固醇棕榈酸酯2；
C-2：将步骤B获得的二级重组菌株转接到含有第二培养基的发酵罐中进行深层培养，培养条件为5％O2、1％H2和94％氮气，通气量为每分钟每1L第二培养基通入0.5L的氧气、氢气和氮气的混合气体，培养时间3.5天，培养温度37℃，获得深层培养物，第二培养基由如下重量份的各成分组成：
麦芽糖醇7.5 魔芋粉3.5 氯化钙2
磷酸二氢钾3.5 海藻酸钠7.5 维生素E 2
硬脂醇2 蛋氨酸3.5；
C-3：将深层培养物粉碎，通过磁装置吸附，利用磷酸缓冲液洗涤1次；
C-4：进一步用超声波及蛋白酶缓冲液进行梯度处理，最终得到表达阳离子多肽的生物纳米磁珠；
D.以步骤C获得的表达阳离子多肽的生物纳米磁珠为种子，用阳离子多聚物进行嫁接暴露阳离子多肽表面，形成阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠，具体方法为：
D-1：取150mg表达阳离子多肽的生物纳米磁珠溶于100mL 50％乙醇溶液中，超声处理10min，超声功率为35W，每次超声时间4s，间隔10s，室温搅拌反应6小时；
D-2：磁力架吸附，洗涤，纯化，重悬于150mL甲醇溶液中，加入1.5mL丙烯酸丁酯，密封后，置于超声水浴中分散1小时；
D-3：配置2％浓度的PEI溶液，取15mL，滴加到反应瓶中，200rpm，振荡反应48小时；
D-4：磁力架分离纯化，重新溶于150mL甲醇中，并加入3mL羟胺，密封超声处理1小时，200rpm，继续振荡反应24小时，磁性分离提纯后得到阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠。
对照例1一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠
该阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠由嫁接有阳离子聚合物的阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成，所述linker的氨基酸残基为AlaPheAla2Gly2SerAlaCysGly2LeuAlaGly2Leu2AlaSer Gly2Ala2SerGly2Ala2PheAla，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺PEI，所述阳离子多肽为YR-CP1，所述YR-CP1的多肽序列为：PRRRRASRRVRRRRRPRVSRRRRRGGRRRRSSRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRRR。
对照例2一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠
该阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠由嫁接有阳离子聚合物的阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成，所述linker的氨基酸残基为AlaPheAla2Gly2Ser(Gly2Leu2AlaSerGly2Ala2)2SerGly2AlaPheAla，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺PEI，所述阳离子多肽为YR-CP1，所述YR-CP1的多肽序列为：PRRRRASRRVRRRRRPRVSRRRRRGGRRRRSSRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRRR。
对照例3一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠
该阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠由嫁接有阳离子聚合物的阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成，所述linker的氨基酸残基为Ala3Gly2Ser(AlaCysGly3Ala)2(Gly2AlaSer Gly2Ala2)2SerGly2Ala3，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺PEI，所述阳离子多肽为YR-CP1，所述YR-CP1的多肽序列为：PRRRRASRRVRRRRRPRVSRRRRRGGRRRRSSRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRRR。
对照例4一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠
该阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠由嫁接有阳离子聚合物的阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成，所述linker的氨基酸残基为(Ala3GlySer)3(Gly3Ser)5(GlySerAla3)3，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺PEI，所述阳离子多肽为YR-CP1，所述YR-CP1的多肽序列为：PRRRRASRRVRRRRRPRVSRRRRRGGRRRRSSRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRRR。
对照例5一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠
该阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠由嫁接有阳离子聚合物的阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成，所述linker的氨基酸残基为(GlyGlyAlaSerLeuAlaGlyAlaSerLeu)3，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺PEI，所述阳离子多肽为YR-CP1，所述YR-CP1的多肽序列为：PRRRRASRRVRRRRRPRVSRRRRRGGRRRRSSRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRRR。
对照例6一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠
该阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠由嫁接有阳离子聚合物的阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成，所述linker的氨基酸残基为AlaPheAlaGly3Ser(Ala2Cys3Gly3LeuAla)3Gly2LeuAla2Ser Gly2Ala2SerGly3AlaPheAla，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺PEI，所述阳离子多肽为YR-CP1，所述YR-CP1的多肽序列为：PRRRRASRRVRRRRRPRVSRRRRRGGRRRRSSRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRRR。
对照例7一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠
该阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠由阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成，所述linker的氨基酸残基为AlaPheAla2Gly2Ser(AlaCysGly2LeuAla)2(Gly2Leu2AlaSer Gly2Ala2)2SerGly2Ala2PheAla，所述阳离子多肽为YR-CP1，所述YR-CP1的多肽序列为：PRRRRASRRVRRRRRPRVSRRRRRGGRRRRSSRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRRR。
对照例8-对照例13
阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠制备方法中采用不同的电转化条件组成的制备方法对照例见表1，其余的制备方法同实施例11。
表1各对照例电转化具体参数
对照例14-对照例17
阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠制备方法中采用不同的洗脱液组成的制备方法对照例见表2，其余的制备方法同实施例11。
表2各对照例不同洗脱液列表
注意“--”表示没有该成分。
对照例18-对照例24
阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠制备方法中采用不同的发酵培养条件的制备方法对照例见表3，其余的制备方法同实施例11。
表3各对照例的发酵培养条件具体参数
注意“--”表示没有该步骤或该成分。
对照例25-对照例32
阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠制备方法中采用不同的培养基的制备方法对照例见表4和表5，其余的制备方法同实施例11。
表4各对照例的不同第一培养基列表
注意“--”表示没有该步骤或该成分。
表5各对照例的不同第二培养基列表
注意“--”表示没有该步骤或该成分。
试验例1阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠载量试验
1.1试验分组
取实施例1-5和对照例1-7所提供的阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠进行试验。
1.2试验方法
将各组阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠通过磁力吸附后吸干水分称量重量M0，加入保存液重悬磁珠，使磁珠的浓度为1mg/mL。
购买荧光标记的FITC-LS-NHS用于偶联伯氨基，调节好浓度为1mg/mL，按照1/10的梯度系列稀释，通过荧光分析仪计算每个梯度的荧光强度，制作荧光强度标准曲线；另取0.5mL浓度为0.1mg/mL的FITC-LS-NHS，加入100μL阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠，混匀，37℃温育15min，其间混匀3-5次；用磁力吸附，吸取上清，检测上清的FITC荧光强度，同时对磁珠进行数次洗涤，去掉结合不牢固的抗体，重悬磁珠后检测溶液中的荧光强度；最后通过标准曲线可计算荧光强度对应的抗体数量，通过间接和直接两种方法，测量阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠实际标记上抗体的载量，结果见表6，其中结合抗体量为1mg生物纳米磁珠结合的抗体载量。
表6各组1mg阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠的抗体载量
1.3结果
由上述试验结果可知，本发明所提供的阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠，阳离子多肽通过特殊的linker连接在细菌磁颗粒的膜蛋白上，并且嫁接了PEI，使得制备的阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠对氨基偶联结合抗体具有非常高的载量，与普通纳米磁珠相比载量提高40％以上。对照例1-7通过对linker的考察，可知linker的微小改变对得到的生物纳米磁珠的载量具有较大影响。
试验例2阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠的高温加速试验
2.1试验方法
取实施例1-5和对照例1-7经过试验例1得到的FITC标记抗体的标记磁珠，每组均分为12支，共同至于37℃条件下，每天每组分别取出1支，用PBS洗涤数次，磁力吸附后重悬，检测其FITC荧光强度，每次均与正常4℃保存的试剂荧光强度进行比较，最后得到纳米磁珠试剂荧光强度的衰减曲线，以衰减>35％为企业内部标准，设为试剂失效的保存时间，结果见表7。
表7各组生物纳米磁珠的高速加速试验结果
注：“--”表明第12天时依旧保持70％以上的活性。
2.2结果
通常37摄氏度放置1天约为4℃保存40天，试剂正常保存有效期使用期限为1年。由上述试验结果可知，本发明所提供的生物纳米磁珠一般在12天依旧能保持原有活性的70％以上，而对照例提供的生物纳米磁珠稳定性较差；本发明提供的生物纳米磁珠高温试验稳定性好。
试验例3阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠的转化效率考察
在实施例11和对照例8-17的步骤中，每次电转化107个菌株数目，转化1μg量的DNA(大小约5kbp)作为标准实验，检测电转化完毕的菌株成活率(％)，DNA表达转化的成功率(％)，取十分之一进行稀释涂平板，检测到每块单克隆菌落数目>300个；检测结果见表8。
表8各组生物纳米磁珠的活性及产量
由上述试验结果可知，通过本发明提供的制备方法制备过程中菌株成活率高，同时DNA转化表达成功率高。
试验例4阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠的培养效率考察
在实施例11和对照例18-32的步骤中，考察培养条件和培养基对阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠产量的影响，检测平均每升培养基可获得的阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠产量，检测结果见表9。
表9各组生物纳米磁珠的产量
从以上试验可以看出，本发明提供的发酵培养条件和发酵培养基可以显著提高阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠的产量。

Claims (10)

1.一种阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠，其特征在于，所述阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠由嫁接有阳离子聚合物的阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白融合表达而成，所述linker的氨基酸残基为AlaPheAla2Gly2Ser(AlaCysGly2LeuAla)2(Gly2Leu2AlaSer Gly2Ala2)2SerGly2Ala2PheAla。
2.如权利要求1所述的阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠，其特征在于，所述阳离子聚合物为PEI，所述阳离子多肽选自YR-CP1、YR-CP2、YR-CP3或YR-CP4的一种，其中，所述YR-CP1的多肽序列为：
PRRRRASRRVRRRRRPRVSRRRRRGGRRRRSSRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRRR；所述YR-CP2的多肽序列为：
CYRQRQTSRRRRRRSCQTQRRAMRCRRRNRLRRRKHRRRYGSRRRRRRYG；所述YR-CP3的多肽序列为：
YRVRRSRRRHCSRRRLKRIHRRQRSCRRRKRRSRHRRRHRRGRRKRTCRR；所述YR-CP4的多肽序列为：
KNLKKLKKLKCSRRPVRRRRPRVSRKKLKKLSKLVSRRRRRGGRRRCKKL。
3.一种权利要求1所述的阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A.构建细菌磁颗粒膜蛋白mamC或mamF的缺失突变体菌株，称为一级重组菌株；
B.将阳离子多肽通过linker与细菌磁颗粒膜蛋白mamC或mamF融合构建基因表达载体，并将构建的基因表达载体导入到一级重组菌株中，筛选表达阳离子多肽的二级重组菌株；
C.对步骤B获得的二级重组菌株进行培养发酵，生成表达阳离子多肽的生物纳米磁珠；
D.以步骤C获得的表达阳离子多肽的生物纳米磁珠为种子，用阳离子多聚物进行嫁接暴露阳离子多肽表面，形成阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤A具体方法为：
A-1：设计两对引物分别扩增mamC或mamF基因两侧约500bp的同源DNA片段，通过分子克隆构建一条基于噬菌体病毒的微载体序列AAV-del-mamC或AAV-del-mamF；
A-2：AAV-del-mamC或AAV-del-mamF通过质粒提取及酶切步骤得到足够量的核酸序列产物，调节浓度为2mg/mL，通过电转化的方式同时转入MSR-I野生型菌株中；
A-3：电转化后的MSR-I野生型菌株通过洗脱液梯度洗脱，筛选双交换突变菌株，经测序技术验证后，获得mamC或mamF缺失突变的重组菌株，即一级重组菌株。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤A-2电转化条件为：
方波脉冲，电压3100V-3200V，电脉冲时间3.1-3.3ms，电脉冲次数1-2次。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤A-3所述的洗脱液由如下重量份的成分组成：
蔗糖25-30 庆大霉素10-15 吐温80 2-3
磷酸盐缓冲液50-60 磷脂酰乙醇胺5-10。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤B具体方法为：
B-1：将阳离子多肽的基因序列通过linker与mamC基因或mamF基因进行融合，得到新的融合基因片段；
B-2：将新的融合基因片段克隆到表达载体pBRC上，分别得到基因表达载体；
B-3：通过电转化的方式分别将基因表达载体导入一级重组菌中，验证正确后筛选表达阳离子多肽的重组菌株，即二级重组菌株。
8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤C培养发酵的具体步骤包括：
C-1：在发酵罐中加入第一培养基，对步骤B获得的二级重组菌株进行预培养，培养条件为含5-10％氧气的氮气，培养时间16h，培养温度为37℃；
C-2：将步骤B获得的二级重组菌株转接到含有第二培养基的发酵罐中进行深层培养，培养条件为5％O2、1％H2和94％氮气，培养时间3-4天，培养温度37℃，获得深层培养物；
C-3：将深层培养物粉碎，通过磁装置吸附，利用磷酸缓冲液洗涤2-3次；
C-4：进一步用超声波及蛋白酶缓冲液进行梯度处理，最终得到表达阳离子多肽的生物纳米磁珠。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述第一培养基由如下重量份的各成分组成：
芝麻粉1-3 二异丙醇胺2-5 麦芽糖醇5-10
木糖醇酐单硬脂酸酯2-5 硫酸镁1-3 氯化硒1-3
海藻酸钠5-10 胆固醇棕榈酸酯1-3；
所述第二培养基由如下重量份的各成分组成：
麦芽糖醇5-10 魔芋粉2-5 氯化钙1-3
磷酸二氢钾2-5 海藻酸钠5-10 维生素E 1-3
硬脂醇1-3 蛋氨酸2-5。
10.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤D具体方法为：
D-1：取150-300mg表达阳离子多肽的生物纳米磁珠溶于100mL 50％乙醇溶液中，超声处理10min，超声功率为35-50W，每次超声时间4-6s，间隔10-12s，室温搅拌反应6小时；
D-2：磁力架吸附，洗涤，纯化，重悬于150mL甲醇溶液中，加入1.5mL丙烯酸丁酯，密封后，置于超声水浴中分散1小时；
D-3：配置2％浓度的PEI溶液，取15mL，滴加到反应瓶中，200rpm，振荡反应48小时；
D-4：磁力架分离纯化，重新溶于150mL甲醇中，并加入3mL羟胺，密封超声处理1小时，200rpm，继续振荡反应24-48小时，磁性分离提纯后得到阳离子多肽氨基化修饰生物纳米磁珠。
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