CN108251415B - 一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，由阴离子多肽聚合物通过柔性linker连接到生物纳米磁珠的膜蛋白上融合表达而成，所述柔性linker的氨基酸残基为GCVA(DLGGV)2GVC(GA)3MADEGAG，在生物纳米磁珠表面展示特定阴离子多肽结构，提供的作为修饰位点的功能基团数量多，结合抗体量大，磁珠的生物活性好，特异性较高，实用性好。

Description

一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠及其制备方法
技术领域
本发明涉及纳米磁珠应用和医学检测领域，具体是涉及阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠及其制备方法。
背景技术
生物纳米磁珠是趋磁细菌生产的一种磁性纳米颗粒，也称为细菌磁颗粒，内核是Fe3O4晶体，外面有一层磷脂生物膜包被，粒径在30-120nm之间。同一种趋磁细菌生产的生物纳米磁珠，它们的粒径大小和晶体晶型基本一致，磁学性质均一，有天然生物膜包被，具有很好的水溶性质和胶体性质。此外，细菌磁颗粒是生物制备来源，因此具有较好的生物相容性。生物纳米磁珠表面膜上带有大量的功能基团，可通过化学修饰和双功能偶联剂连接不同的功能大分子，如抗体，从而具有不同的特殊功能。细菌磁颗粒最独特的地方在于它可以通过基因工程的方法在表面膜上表达特殊的蛋白质及多肽分子，成为具有特殊生物活性的功能性生物纳米磁珠。
纳米磁性颗粒是应用前景非常广阔的一类功能材料，但是裸露的纳米颗粒容易集聚、对生物体具有毒性及生物相容性较差，这些缺点限制了其广泛应用，尤其是在生物医学领域的应用。因此，对纳米材料进行表面的化学修饰，使其带上反应性功能基团(如-COOH，-NH2，-OH等)，或者包裹生物相容性材料(如油酸、SiO2，聚乙二醇等)，一直是研究的热点以及纳米颗粒应用于生物医学领域的重要前提条件之一。化学共沉淀法、水热法、溶胶-凝胶法、微乳液法等一直是化学制备纳米材料并在表面修饰生物相容性物质的常用方法，已经实现通过多代嫁接的方法，在纳米材料表面修饰树状大分子的多聚物。但现有技术中公开的纳米磁性颗粒修饰后的改性生物纳米磁珠性能差异较大，结合抗体量较低，且嫁接修饰大分子后的生物纳米磁珠稳定性较差，非常容易失活，导致难以推广，实用性不强。另一方面，基因改造方法较容易的获得类似化学合成的生物纳米磁珠，表面膜上可以天然带有各种功能基团，但在通过基因改造对于改性生物纳米磁珠的制备过程中，对条件要求非常严格，且DNA转化表达成功率非常低，菌株成活率和纳米磁珠的产率均较低，抑制其广泛的应用。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠及其制备方法。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，所述阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠由嫁接有聚乙二醇的阴离子多肽聚合物通过柔性linker连接到生物纳米磁珠的膜蛋白上融合表达而成，所述柔性linker的氨基酸残基为GCVA(DLGGV)2GVC(GA)3MADEGAG。其中G等字母均为氨基酸的缩写，例G为甘氨酸Gly的缩写，C为半胱氨酸Cys的缩写等。
进一步地，离子多肽序列以聚谷氨酸(PGA)或聚天冬氨酸(PASP)为主，具有天然富谷氨酸蛋白或人工合成γ-PGA或PASP及其衍生物的特点，分别命名为YR-APE1，YR-APD2。
YR-APE1的氨基酸残基序列如SEQ.ID.No.1所示，为：
Figure GDA0002320573350000021
YR-APD2的氨基酸残基序列如SEQ.ID.No.2所示，为：
Figure GDA0002320573350000031
针对趋磁细菌MSR-Ⅰ对阳离子多肽基因序列优化如下：
YR-APE1的基因序列如SEQ.ID.No.3所示，为
Figure GDA0002320573350000032
Figure GDA0002320573350000033
YR-APD2基因序列如SEQ.ID.No.4所示，为
Figure GDA0002320573350000034
Figure GDA0002320573350000035
本发明所提供的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，给定的柔性linker于阴离子多肽聚合物相适配，在生物纳米磁珠表面展示特定阴离子多肽结构，提供的作为修饰位点的功能基团数量多，结合抗体量大，磁珠的生物活性好，特异性较高。且可以作为零代纳米材料，易于进行后续的其他功能修饰和大分子多代嫁接，实用性高。
进一步地，所述阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠由如下步骤制备而成：
A、构建细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC或mamF缺失的突变体菌株，得到一级重组菌株；
B、通过DNA合成的方法制备阴离子多肽，将阴离子多肽与细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC或mamF通过柔性linker进行融合形成基因融合表达载体；
C、将步骤B得到的表达载体导入到步骤A得到的一级重组菌株中，筛选出表达阴离子多肽的二级重组菌株；
D、将步骤C得到的二级重组菌种进行发酵培养，生产表达展示阴离子多肽的改性生物纳米磁珠；
E、采用多聚物糖基化聚乙二醇PEG对步骤D所得到的改性生物纳米磁珠进行嫁接修饰形成具有壳结构的所述阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠。
优选地，所述步骤所述步骤A的具体方法包括如下步骤：
(a-1)基因敲除：扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC或mamF基因左右两侧共两个长均为300-700bp的同源DNA片段，将所述DNA片段克隆在噬菌体病毒AAV-del微载体上，即得一条基于噬菌体病毒的微载体序列AAV-del-mac或AAV-del-maf；
(a-2)基因转移：获取AAV-del-mac或AAV-del-maf的核酸序列产物，调节核酸序列产物的浓度为1-3mg/ml，通过电转化的方式转入MSR-Ⅰ野生菌株中；
(a-3)菌株筛选：经过梯度筛选，获得mamc或mamf缺失突变的重组菌株，验证后即得一级重组菌株MSRⅠ-dC。
阴离子多肽与mamC或mamF的基因融合表达载体的构建方法、筛选菌种的方法、载体导入的方法均可以通过现有技术所公开的方法进行操作，本发明不做具体解释。
采用基因工程改造方法得到的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，进一步提高了磁珠结合抗体性能，且得到的纳米磁珠活性高，稳定性好，保质期长，抗环境影响能力好，实用性强。
另一方面，本发明还提供了一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠的制备方法，包括如下步骤：
A、构建细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC或mamF缺失的突变体菌株，得到一级重组菌株；
B、通过DNA合成的方法制备阴离子多肽，将阴离子多肽与细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC或mamF通过柔性linker进行融合形成基因融合表达载体；
C、将步骤B得到的表达载体导入到步骤A得到的一级重组菌株中，筛选出表达阴离子多肽的二级重组菌株；
D、将步骤C得到的二级重组菌种进行发酵培养，分离纯化生产表达展示阴离子多肽的改性生物纳米磁珠；
E、采用多聚物糖基化聚乙二醇PEG对步骤D所得到的改性生物纳米磁珠进行嫁接修饰形成具有壳结构的所述阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠。
采用上述基因重组的方法进行阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠的制备，细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC或mamF的单基因缺失对纳米磁珠产量不会产生影响，构建它们的双突变体有利于充分发挥这个蛋白作为新融合蛋白表达骨架的作用，(MamC或MamF)骨架+linker+目的蛋白可以更好的拿到重组菌种，得到的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠活性好，稳定性高。
进一步地，所述菌株选择MSR-Ⅰ野生型菌株，所述步骤A的具体方法包括如下步骤：
(a-1)基因敲除：扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC或mamF基因左右两侧共两个长均为300-700bp的同源DNA片段，将所述DNA片段克隆在噬菌体病毒AAV-del微载体上，即得一条基于噬菌体病毒的微载体序列AAV-del-mac或AAV-del-maf；
(a-2)基因转移：获取AAV-del-mac或AAV-del-maf的核酸序列产物，调节核酸序列产物的浓度为1-3mg/ml，通过电转化的方式转入MSR-Ⅰ野生菌株中；
(a-3)菌株筛选：经过梯度筛选，获得mamc或mamf缺失突变的重组菌株，验证后即得一级重组菌株MSRⅠ-dC或MSRⅠ-dF。
优选地，所述电转化的具体方案为：采用方波电脉冲，电压为3100V-3200V，电脉冲时间是3.1-3.3ms，电脉冲次数是1-2次。
采用噬菌体AAV-del作为微载体，电穿孔转化的方式进行一级重组菌株的构建，得到的重组菌株成活率高，产量较高，性能好；
进一步地，所述步骤D包括如下具体步骤：
d-1、预培养：将步骤C得到的二级重组菌株接种到经过灭菌后的第一培养基中培养14-18h后得到预培养菌株，预培养条件为：温度35-38℃，通气量为每分钟每1mL培养基通入0.3-0.5mL的气体，所述气体为5％-10％O2和90％-95％N2的混合气体；
d-2、将所得的预培养菌株接种至装有灭菌第二培养基的发酵罐中进行深层培养3-4天后得到深层培养物，所述深层培养条件为：温度34-37℃，通气量为每分钟每1mL培养基通入0.4-0.6mL的气体，所述气体为5％O2、1％H2和94％N2的混合气体；
d-3、将得到的深层培养物依次进行菌体粉碎、磁力吸附和梯度纯化不步骤，最终得到所述表达展示阴离子多肽的改性生物纳米磁珠。
优选地，所述第一培养基由重量份数为1-2份腐胺二盐酸盐、0.1-0.2份多氯化胆碱、7-8份D-葡萄糖、1-2份亚油酸、2-3份硫代甘油、0.5-1份乙酸钠、3-5琼脂和1-2份海藻酸铵组成；所述第二培养基由重量份数为2-3份右旋糖酐、2-3份吐温80、0.3-0.5份甲砜霉素、7-8份D-葡萄糖、1-2份亚油酸、2-3份海藻糖和1-2份硫代甘油组成。
采用上述培养方法对二级重组菌株进行培养，有效促进合成纳米磁珠的生长代谢，在发酵培养过程中，合理设置通气量和气体成分，大大提高了纳米磁珠的产量。
更进一步地，所述步骤E由如下分步骤构成：
e-1、取20-30mg的生物纳米磁珠溶于10-12mL磷酸缓冲液中，优选浓度为0.2-0.3％，加入1-1.5mL浓度为9mM的N乙酰羧基糖(UDP-GalNAc)，室温搅拌30min；
e-2、加入N乙酰羧基糖转移酶(GalNAc-T2)，至终浓度35-45mU，室温搅拌3-5h，得到UDP-GalNAc定点修饰的生物纳米磁珠；
e-3、将步骤e-2得到的生物纳米磁珠采用磁力架分离纯化，洗涤后，重新溶于10-12mL磷酸缓冲液中，加入1-2mL浓度为2.5mM的唾液酸活化PEG(CMP-SiaPEG-20K)，搅拌混匀；然后加入唾液酸转移酶(ST6GalNAc-I)，至终浓度200-280mU，于32℃，以50-80rpm的速度，轻轻摇晃反应24-48小时，催化形成具有PEG聚合物外壳的生物纳米磁珠；
e-4、将步骤e-3得到的生物纳米磁珠用25％乙醇洗涤2-3次，即得所述具有壳结构的生物纳米磁珠。
采用上述方法对阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠的表面进行进一步修饰，可以将天然微生物磁颗粒表面的化学基团进行封闭，仅暴露linker连接的阴离子多肽在核壳结构之外，对生物功能分子有很好的保护效果，延长其半衰期，进一步提高生物纳米磁珠试剂的稳定性。
本发明所提供的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，阴离子多肽通过特定适宜的linker连接在纳米磁珠的膜蛋白上，三者相互结合性好，产生的可结合羧基基位点数量多，结合抗体量高，1mg纳米磁珠可以结合120μg以上的抗体，实用性好；同时具有稳定性高，环境耐受性好的特点，在37℃条件下在14天后依旧保持原有活性的75％左右，在常规保存条件下有效期超过一年半，具有较好的经济效益。本发明所提供的制备阴离子多肽羧基化生物那纳米磁珠的方法，菌株成活率高于80％，同时DNA转化表达成功率高于60％，得到的生物纳米磁珠量大，可以广泛应用。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，不能用来限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围，本发明没有做具体限定的技术特征均可以通过现有技术公开的常规技术进行操作。
实施例1
一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，由嫁接有聚乙二醇的阴离子多肽聚合物通过柔性linker连接到生物纳米磁珠的膜蛋白上融合表达而成，所述柔性linker的氨基酸残基为GCVA(DLGGV)2GVC(GA)3MADEGAG；所述阴离子多肽聚合物的氨基酸残基为
Figure GDA0002320573350000081
Figure GDA0002320573350000082
实施例2
一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，由嫁接有聚乙二醇的阴离子多肽聚合物通过柔性linker连接到生物纳米磁珠的膜蛋白上融合表达而成，所述柔性linker的氨基酸残基为GCVA(DLGGV)2GVC(GA)3MADEGAG；所述阴离子多肽聚合物的氨基酸残基为
Figure GDA0002320573350000091
Figure GDA0002320573350000092
实施例3
一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，由嫁接有聚乙二醇的阴离子多肽聚合物通过柔性linker连接到生物纳米磁珠的膜蛋白上融合表达而成，所述柔性linker的氨基酸残基为GCVA(DLGGV)2GVC(GA)3MADEGAG；所述阴离子多肽聚合物的氨基酸残基为
Figure GDA0002320573350000093
Figure GDA0002320573350000094
制备方法：
A、构建细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC或mamF缺失的突变体菌株，得到一级重组菌株；
B、通过DNA合成的方法制备阴离子多肽，将阴离子多肽与细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC或mamF通过柔性linker进行融合形成基因融合表达载体；
C、将步骤B得到的表达载体导入到步骤A得到的一级重组菌株中，筛选出表达阴离子多肽的二级重组菌株；
D、将步骤C得到的二级重组菌种进行发酵培养，生产表达展示阴离子多肽的改性生物纳米磁珠；
E、采用多聚物糖基化聚乙二醇PEG对步骤D所得到的改性生物纳米磁珠进行嫁接修饰形成具有壳结构的所述阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠。
其中，制备膜蛋白基因mamC或mamF缺失的突变体菌株的方法，基因融合表达载体的制备方法，表达载体的导入、菌株的筛选、菌种的发酵培养和从菌种中得到生物纳米磁珠的方法均可采用现有技术来实现，本实施例不做具体限定。
实施例4
一种制备如实施例1所提供的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠的方法，所述菌株选择MSR-Ⅰ野生型菌株，包括如下步骤：
(a-1)基因敲除：扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC基因左右两侧共两个长均为300bp的同源DNA片段，将所述DNA片段克隆在噬菌体病毒AAV-del微载体上，即得一条基于噬菌体病毒的微载体序列AAV-del-mac；
(a-2)基因转移：获取AAV-del-mac的核酸序列产物，调节核酸序列产物的浓度为1mg/ml，通过电转化的方式转入MSR-Ⅰ野生菌株中；采用方波电脉冲，电压为3100V，电脉冲时间是3.1ms，电脉冲次数是2次；
(a-3)菌株筛选：经过梯度筛选，获得mamc缺失突变的重组菌株，验证后即得一级重组菌株MSRⅠ-dC；
B、通过DNA合成的方法制备阴离子多肽，将阴离子多肽与细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC通过柔性linker进行融合形成基因融合表达载体；
C、将步骤B得到的表达载体导入到步骤A得到的一级重组菌株MSRⅠ-dC中，筛选出表达阴离子多肽的二级重组菌株；
D、将步骤C得到的二级重组菌种进行发酵培养，分离纯化生产表达展示阴离子多肽的改性生物纳米磁珠；
E、采用多聚物糖基化聚乙二醇PEG对步骤D所得到的改性生物纳米磁珠进行嫁接修饰形成具有壳结构的所述阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠。
实施例5
一种制备如实施例1和实施例2所提供的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠的方法，所述菌株选择MSR-Ⅰ野生型菌株，包括如下步骤：
(a-1)基因敲除：扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamF基因左右两侧共两个长均为700bp的同源DNA片段，将所述DNA片段克隆在噬菌体病毒AAV-del微载体上，即得一条基于噬菌体病毒的微载体序列AAV-del-maf；
(a-2)基因转移：通过质粒提取及酶切方法获取AAV-del-maf的核酸序列产物，调节核酸序列产物的浓度为3mg/ml，通过电转化的方式转入MSR-Ⅰ野生菌株中；采用方波电脉冲，电压为3200V，电脉冲时间是3.3ms，电脉冲次数是1次；
(a-3)菌株筛选：经过梯度筛选，获得mamf缺失突变的重组菌株，验证后即得一级重组菌株MSRⅠ-dF；
B、通过DNA合成的方法制备阴离子多肽YR-APE1和YR-APD2的表达基因序列，将阴离子多肽YR-APE1和YR-APD2与细菌磁颗粒膜蛋白基因mamF通过柔性linker进行融合形成基因融合表达载体pmamF-APE1和pmamF-APD2；
C、将pmamF-APE1和pmamF-APD2，克隆到表达载体pBRC上，分别得到两个表达质粒pBRC-pmamF-APE1，pBRC-pmamF-APD2两个新的融合基因片段，通过三亲本接合的方式分别将pBRC-pmamF-APE1，pBRC-pmamF-APD2，分别转入一级重组菌MSRⅠ-dF中，验证正确后得到表达不同阴离子多肽的重组菌株，即二级重组菌株，分别命名为：MSRⅠ-dF/APE1，MSRⅠ-dF/APD2；
D、将步骤C得到的二级重组菌种进行发酵培养，分离纯化生产表达展示阴离子多肽的改性生物纳米磁珠；
E、采用多聚物糖基化聚乙二醇PEG对步骤D所得到的改性生物纳米磁珠进行嫁接修饰形成具有壳结构的所述阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠。
实施例6
一种制备阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠的方法，包括如下步骤：
(a-1)基因敲除：扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC基因左右两侧共两个长均为500bp的同源DNA片段，将所述DNA片段克隆在噬菌体病毒AAV-del微载体上，即得一条基于噬菌体病毒的微载体序列AAV-del-mac；
(a-2)基因转移：获取AAV-del-mac的核酸序列产物，调节核酸序列产物的浓度为2mg/ml，通过电转化的方式转入MSR-Ⅰ野生菌株中；采用方波电脉冲，电压为3100V，电脉冲时间是3.2ms，电脉冲次数是2次；
(a-3)菌株筛选：电转化后菌株通过蔗糖和庆大霉素梯度浓度压力筛选，获得mamc缺失突变的重组菌株，经过测序验证后即得一级重组菌株MSRⅠ-dC；
B、通过DNA合成的方法制备阴离子多肽YR-APE1的表达基因序列，将阴离子多肽YR-APE1与细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC通过柔性linker进行融合形成基因融合表达载体pmamC-APE1；
C、将pmamC-APE1克隆到表达载体pBRC上，得到两个表达质粒pBRC-pmamC-APE1新的融合基因片段，通过电转化的方式将pBRC-pmamF-APE1转入一级重组菌MSRⅠ-dC中，验证正确后得到表阴离子多肽的重组菌株，即二级重组菌株命名为：MSRⅠ-dC/APE1；
d-1、预培养：将步骤C得到的二级重组菌株接种到经过灭菌后的第一培养基中培养14h后得到预培养菌株，预培养条件为：温度35℃，通气量为每分钟每1mL培养基通入0.5mL的气体，所述气体为5％和95％N2的混合气体；
d-2、将所得的预培养菌株接种至装有灭菌第二培养基的发酵罐中进行深层培养3天后得到深层培养物，所述深层培养条件为：温度37℃，通气量为每分钟每1mL培养基通入0.4mL的气体，所述气体为5％O2、1％H2和94％N2的混合气体；
d-3、将得到的深层培养物依次进行菌体粉碎、磁力吸附和梯度纯化步骤，最终得到所述表达展示阴离子多肽的改性生物纳米磁珠；
E、采用多聚物糖基化聚乙二醇PEG对步骤d-3所得到的改性生物纳米磁珠进行嫁接修饰形成具有壳结构的所述阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠。
实施例7
一种制备阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠的方法，与实施例4的区别在于，步骤D包括如下具体步骤：
d-1、预培养：将步骤C得到的二级重组菌株接种到经过灭菌后的第一培养基中培养18h后得到预培养菌株，预培养条件为：温度37℃，通气量为每分钟每1mL培养基通入0.3mL的气体，所述气体为10％O2和90％N2的混合气体；
d-2、将所得的预培养菌株接种至装有灭菌第二培养基的发酵罐中进行深层培养4天后得到深层培养物，所述深层培养条件为：温度37℃，通气量为每分钟每1mL培养基通入0.6mL的气体，所述气体为5％O2、1％H2和94％N2的混合气体；
d-3、将得到的深层培养物依次进行菌体粉碎、磁力吸附和梯度纯化步骤，最终得到所述表达展示阴离子多肽的改性生物纳米磁珠。
实施例8
一种制备阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠的方法，与实施例4的区别在于，步骤D包括如下具体步骤：
d-1、预培养：将步骤C得到的二级重组菌株接种到经过灭菌后的第一培养基中培养16h后得到预培养菌株，预培养条件为：温度38℃，通气量为每分钟每1mL培养基通入0.4mL的气体，所述气体为7％O2和93％N2的混合气体
d-2、将所得的预培养菌株接种至装有灭菌第二培养基的发酵罐中进行深层培养4天后得到深层培养物，所述深层培养条件为：温度34℃，通气量为每分钟每1mL培养基通入0.5mL的气体，所述气体为5％O2、1％H2和94％N2的混合气体；
d-3、将得到的深层培养物依次进行菌体粉碎、磁力吸附和梯度纯化步骤，最终得到所述表达展示阴离子多肽的改性生物纳米磁珠。
所述第一培养基由重量份数为1份腐胺二盐酸盐、0.2份多氯化胆碱、8份D-葡萄糖、2份亚油酸、2份硫代甘油、1份乙酸钠、3琼脂和2份海藻酸铵组成；所述第二培养基由重量份数为3份右旋糖酐、2份吐温80、0.5份甲砜霉素、8份D-葡萄糖、2份亚油酸、3份海藻糖和1份硫代甘油组成。
实施例9
一种制备阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠的方法，与实施例8的区别在于，所述第一培养基由重量份数为2份腐胺二盐酸盐、0.1份多氯化胆碱、7份D-葡萄糖、1份亚油酸、3份硫代甘油、0.5份乙酸钠、5琼脂和1份海藻酸铵组成；所述第二培养基由重量份数为2份右旋糖酐、3份吐温80、0.3份甲砜霉素、7份D-葡萄糖、1份亚油酸、2份海藻糖和2份硫代甘油组成。
实施例10
一种制备阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，与实施例4的区别在于，述步骤E包括如下具体步骤：
e-1、取20mg的生物纳米磁珠溶于10mL磷酸缓冲液中，优选浓度为0.2％，加入1.5mL浓度为9mM的N乙酰羧基糖，室温搅拌30min；
e-2、加入N乙酰羧基糖转移酶，至终浓度45mU，室温搅拌3h，得到UDP-GalNAc定点修饰的生物纳米磁珠；
e-3、将步骤e-2得到的生物纳米磁珠采用磁力架分离纯化，洗涤后，重新溶于10mL磷酸缓冲液中，加入1mL浓度为2.5mM的唾液酸活化PEG，搅拌混匀；然后加入唾液酸转移酶，至终浓度200mU，于32℃，以80rpm的速度，轻轻摇晃反应24小时，催化形成具有PEG聚合物外壳的生物纳米磁珠；
e-4、将步骤e-3得到的生物纳米磁珠用25％乙醇洗涤2次，即得所述具有壳结构的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠。
实施例11
一种制备阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，与实施例7的区别在于，述步骤E包括如下具体步骤：
e-1、取30mg的生物纳米磁珠溶于12mL磷酸缓冲液中，优选浓度为0.3％，加入1mL浓度为9mM的N乙酰羧基糖，室温搅拌30min；
e-2、加入N乙酰羧基糖转移酶，至终浓度35mU，室温搅拌5h，得到UDP-GalNAc定点修饰的生物纳米磁珠；
e-3、将步骤e-2得到的生物纳米磁珠采用磁力架分离纯化，洗涤后，重新溶于12mL磷酸缓冲液中，加入2mL浓度为2.5mM的唾液酸活化PEG，搅拌混匀；然后加入唾液酸转移酶，至终浓度280mU，于32℃，以50rpm的速度，轻轻摇晃反应48小时，催化形成具有PEG聚合物外壳的生物纳米磁珠；
e-4、将步骤e-3得到的生物纳米磁珠用25％乙醇洗涤3次，即得所述具有壳结构的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠。
实施例12
一种制备阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，与实施例8的区别在于，述步骤E包括如下具体步骤：
e-1、取25mg的生物纳米磁珠溶于10mL磷酸缓冲液中，优选浓度为0.3％，加入1mL浓度为9mM的N乙酰羧基糖，室温搅拌30min；
e-2、加入N乙酰羧基糖转移酶，至终浓度40mU，室温搅拌4h，得到UDP-GalNAc定点修饰的生物纳米磁珠；
e-3、将步骤e-2得到的生物纳米磁珠采用磁力架分离纯化，洗涤后，重新溶于10mL磷酸缓冲液中，加入1mL浓度为2.5mM的唾液酸活化PEG，搅拌混匀；然后加入唾液酸转移酶，至终浓度250mU，于32℃，以70rpm的速度，轻轻摇晃反应36小时，催化形成具有PEG聚合物外壳的生物纳米磁珠；
e-4、将步骤e-3得到的生物纳米磁珠用25％乙醇洗涤3次，即得所述具有壳结构的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠。
对照例1
一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，由嫁接有聚乙二醇的阴离子多肽聚合物通过柔性linker连接到生物纳米磁珠的膜蛋白上融合表达而成，所述柔性linker的氨基酸残基为GCVADLGGVGVCGAMADEGAG；所述阴离子多肽聚合物的氨基酸残基为
Figure GDA0002320573350000171
Figure GDA0002320573350000172
对照例2
一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，由嫁接有聚乙二醇的阴离子多肽聚合物通过柔性linker连接到生物纳米磁珠的膜蛋白上融合表达而成，所述柔性linker的氨基酸残基为GCVADLGAGAMGVGVCGGVDLGGAADEGAG；所述阴离子多肽聚合物的氨基酸残基为
Figure GDA0002320573350000173
Figure GDA0002320573350000174
对照例3
一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，由嫁接有聚乙二醇的阴离子多肽聚合物通过柔性linker连接到生物纳米磁珠的膜蛋白上融合表达而成，所述柔性linker的氨基酸残基为GCVA(DLGGV)2GVC(GA)3M(ADEGAG)2；所述阴离子多肽聚合物的氨基酸残基为
Figure GDA0002320573350000181
Figure GDA0002320573350000182
对照例4
一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，由嫁接有聚乙二醇的阴离子多肽聚合物通过柔性linker连接到生物纳米磁珠的膜蛋白上融合表达而成，所述柔性linker的氨基酸残基为GCVA(DLGGV)2GVC(GA)3M(ADEGAG)2；所述阴离子多肽聚合物的氨基酸残基为
Figure GDA0002320573350000183
Figure GDA0002320573350000184
对照例5
一种制备如实施例1所提供的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠的方法，所述菌株选择MSR-Ⅰ野生型菌株，与实施例4的区别在于，步骤(a-2)获取AAV-del-mac的核酸序列产物，通过亲本结合的方式转入MSR-Ⅰ野生菌株中。
对照例6-11
制备如实施例1所提供的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠的方法，与实施例4的区别在于，所述电转化的具体参数如表1。
表1各对照例的电转化具体参数
Figure GDA0002320573350000185
Figure GDA0002320573350000191
对照例12-16
制备如实施例1所提供的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠的方法，与实施例7的区别在于，所述培养的具体参数如表2。
表2各对照例的发酵培养具体参数
Figure GDA0002320573350000192
试验例1阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠的生物纳米磁珠载量试验
1.1试验分组
取实施例1-3和对照例1-11所提供的生物纳米磁珠(任意相同的常规方法制备而成)以及实施例4的制备方法所得到的生物纳米磁珠进行试验。
1.2试验方法
将每组的生物纳米磁珠通过磁力吸附后吸干水分称量重量M0，加入保存液重悬磁珠，使磁珠的浓度为1mg/mL。
购买FITC-Ab-EDC抗体，调节好浓度为1mg/mL，按照1/10的梯度系列稀释，通过荧光分析仪计算每个梯度的荧光强度，制作荧光强度标准曲线；
另取0.5mL浓度为0.1mg/mL的FITC-Ab-EDC抗体，加入100μL纳米磁珠，混匀，37℃温育15min，其间混匀3-5次；用磁力吸附磁珠，吸取上清，检测上清的FITC荧光强度，同时对磁珠进行数次洗涤，去掉结合不牢固的抗体，重悬磁珠后检测溶液中的荧光强度；
最后通过标准曲线可计算荧光强度对应的抗体数量，通过间接和直接两种方法，测量纳米磁珠实际标记上抗体的载量，结果见表3，其中结合抗体量为1mg生物纳米磁珠结合的抗体量。
表3各组1mg生物纳米磁珠的抗体结合量
Figure GDA0002320573350000201
1.3结果
由上述试验结果可知，本发明所提供的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，阴离子多肽通过特定适宜的linker连接在纳米磁珠的膜蛋白上，三者相互结合性好，产生的可结合羧基基位点数量多，结合抗体量高，实用性好；其中通过实施例4提供的方法制备的生物纳米磁珠，结合抗体量最高，性能最好。对照例1-4所提供的生物纳米磁珠，对柔性Linker和结合的蛋白进行考察，结果可知linker的微小改变对得到的生物纳米磁珠的载量具有较大影响；对照例6-11提供的方法制备的生物纳米磁珠可知，本发明所限定的制备方法具有突出的效果，可以有效提高产品的载量和性能。
试验例2阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠的稳定性试验(高温加速试验)
2.1试验方法
取实施例1-4和对照例1-11经过试验例1得到的FITC-Ab-EDC抗体偶联的生物纳米磁珠，每组均分为14支，共同至于37℃条件下，每天每组分别取出1支，用PBS洗涤数次，磁力吸附后重悬，检测其FITC荧光强度，每次均与正常4℃保存的试剂荧光强度进行比较，最后得到纳米磁珠试剂荧光强度的衰减曲线，以衰减>35％为企业内部标准，设为试剂失效的保存时间，结果见表4。
表4各组生物纳米磁珠的高速加速试验结果
Figure GDA0002320573350000211
注：“--”表明第14天时依旧保持70％以上的活性。
2.2结果
通常37摄氏度放置1天约为4℃保存40天，试剂正常保存有效期使用期限为1年。由上述试验结果可知，本发明所提供的生物纳米磁珠一般在14天依旧能保持原有活性的60％左右，而通过实施例3和实施例4的制备方法得到的生物纳米磁珠，在14天后依旧保持原有活性的75％左右，而对照例提供的生物纳米磁珠稳定性较差；本发明提供的生物纳米磁珠稳定性高，对环境的耐受性好，具有较好的经济效益。
试验例3阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠产量及菌株活性试验
3.1试验分组
取实施例4、7、8和对照例5-16的制备方法所得到的生物纳米磁珠进行试验。
3.2试验方法
在实施例4、7、8和对照例5-16的(a-2)步骤中，每次电转化107个细菌数目，转化1μg量的DNA(大小约5kbp)作为标准实验，检测电转化完毕的细菌成活率(％)，在步骤(a-3)之后，检测DNA转化表达成功率(％)，取十分之一进行稀释涂平板，检测到每块单克隆菌落数目>300个；另外在步骤D(d-3)结束后，检测每升发酵液所得到的改性生物纳米磁珠量，结果见表5。
表5各组生物纳米磁珠的活性及产量
Figure GDA0002320573350000221
3.3结果
由上述试验结果可知，通过本发明提供的制备方法制备过程中菌株成活率高，同时DNA转化表达成功率高，得到的生物纳米磁珠量大，与对照组具有显著性差异；其中，实施例7得到的生物纳米磁珠产量较实施例4高，实施例8的产量最高；对照例5-11是以实施例1为基础，对基因转移的方式进行考察，可以看出对照例5的磁珠活率较高，但是DNA转化表达率成功率很低，导致得到的磁珠数量也较少；对照例6-11的电转化条件的改变，对MSR-Ⅰ菌株的适应性较差，转化成功率和菌株成活率不能同时达到最优；而对照例12-16与实施例7相比较，发现发酵培养过程中的气体通入量与通入的成分，对于菌株的成活，纳米磁珠的产量具有较大影响，本发明通过对发酵过程中通入气体进行改进，在提高纳米磁珠产量上具有突出的实际效果。
序列表
<110> 北京中科圆融生物科技发展有限公司
<120> 一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠及其制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ala Gln Glu Lys Asn Glu Glu Glu Glu Thr Ala Thr Glu Glu Thr Glu
1 5 10 15
Glu Glu Gly Ala Glu Gly Ala Glu Ala Glu Glu Glu Glu Glu Thr Ala
20 25 30
Glu Gly Ala Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Glu Asp Gly Ser Gly Ser
35 40 45
Gln Glu His Glu Glu Asp Glu Glu Thr Glu Glu Thr Glu Glu Gly Ala
50 55 60
Glu Gly Glu Ala Glu Glu Ala Glu Asp Glu Ala Glu Glu Glu Asp Pro
65 70 75 80
Gly Glu Glu Glu Asp Ala Gln Glu Glu Glu Glu Glu Gly Ser Gly Ser
85 90 95
Glu Glu Glu Glu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Asp Glu
100 105
<210> 2
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Gly Glu Phe Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Phe Asp Glu Glu
1 5 10 15
Phe Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Gly Asp Asp Lys Asp Asp
20 25 30
Asp Leu Asp Gly Asp Asp Asp Asp Asp Asn Asp Gly Ser Asp Glu Gly
35 40 45
Ser Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Gly Asp Asp Glu His
50 55 60
His Asp Asp Asp Gly Asp Asp Asp Pro Asp His Asp Asp Asp His Asp
65 70 75 80
Asp Asn Asn Asp Asp His Asp Asp Asp Asp Asn Asp His His Asp Thr
85 90 95
Asp Asp Pro Asp His Asp Asp Asp His Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asn
100 105 110
Asn Asp Asp Asp Asn Asp Asp Asp Asp Asp
115 120
<210> 3
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcccaggaga agaatgaaga agaagagaca gccacagaag agacggaaga agagggtgcg 60
gaaggggcgg aagccgagga ggaggaagaa actgcagaag gagcagaaga cgaagatgag 120
gatgaggaag atggctccgg ctcccaagag catgaagaag atgaggagac tgaagaaaca 180
gaggagggag cagaaggaga agcagaggaa gcagaggacg aagctgaaga agaagaccca 240
ggagaagaag aagatgcaca ggaggaggaa gaagagggct ccggctccga ggaagaagaa 300
gaggcccagg aagaagagga cgag 324
<210> 4
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggcgaatttg atgacgatga tgacgatgat gatgactttg atgaagaatt tgatgatgat 60
gatgacgatg atgatgatgg cgatgataaa gatgatgatt tagatggtga tgacgatgat 120
gataacgatg gtagtgacga gggtagtgac gacgaggatg atgacgatga cgacgacggc 180
gacgacgagc atcatgacga cgacggcgac gacgatcctg atcacgacga cgatcatgac 240
gacaacaacg atgaccatga cgacgacgac aacgaccacc atgacactga cgacccggac 300
cacgacgatg accacgacga cgacgacgac gacaataacg acgatgataa tgacgacgac 360
gacgac 366

Claims (9)

1.一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，其特征在于，所述阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠由嫁接有聚乙二醇的阴离子多肽聚合物通过柔性linker连接到生物纳米磁珠的膜蛋白上融合表达而成，所述柔性linker的氨基酸残基为GCVA(DLGGV)2GVC(GA)3MADEGAG。
2.如权利要求1所述的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，其特征在于，所述阴离子多肽聚合物的氨基酸残基为
Figure FDA0002320573340000011
Figure FDA0002320573340000012
3.如权利要求1所述的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠，其特征在于，所述阴离子多肽聚合物的氨基酸残基为
Figure FDA0002320573340000013
Figure FDA0002320573340000014
4.一种权利要求1所述的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A、构建细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC或mamF缺失的突变体菌株，得到一级重组菌株；
B、通过DNA合成的方法制备阴离子多肽，将阴离子多肽与细菌磁颗粒膜蛋白基因mamC或mamF通过柔性linker进行融合形成基因融合表达载体；
C、将步骤B得到的表达载体导入到步骤A得到的一级重组菌株中，筛选出表达阴离子多肽的二级重组菌株；
D、将步骤C得到的二级重组菌种进行发酵培养，分离纯化生产表达展示阴离子多肽的改性生物纳米磁珠；
E、采用多聚物糖基化聚乙二醇对步骤D所得到的改性生物纳米磁珠进行嫁接修饰形成具有壳结构的所述阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述菌株选择MSR-Ⅰ野生型菌株，所述步骤A的具体方法包括如下步骤：
(a-1)基因敲除：扩增细菌磁颗粒膜蛋白mamC或mamF基因左右两侧共两个长均为300-700bp的同源DNA片段，将所述DNA片段克隆在噬菌体病毒AAV-del微载体上，即得一条基于噬菌体病毒的微载体序列AAV-del-mac或AAV-del-maf；
(a-2)基因转移：获取AAV-del-mac或AAV-del-maf的核酸序列产物，调节核酸序列产物的浓度为1-3mg/ml，通过电转化的方式转入MSR-Ⅰ野生菌株中；
(a-3)菌株筛选：经过梯度筛选，获得mamc或mamf缺失突变的重组菌株，验证后即得一级重组菌株MSRⅠ-dC或MSRⅠ-dF。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述电转化的具体方案为：采用方波电脉冲，电压为3100V-3200V，电脉冲时间是3.1-3.3ms，电脉冲次数是1-2次。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤D包括如下具体步骤：
d-1、预培养：将步骤C得到的二级重组菌株接种到经过灭菌后的第一培养基中培养14-18h后得到预培养菌株，预培养条件为：温度35-38℃，通气量为每分钟每1mL培养基通入0.3-0.5mL的气体，所述气体为5％-10％O2和90％-95％N2的混合气体；
d-2、将所得的预培养菌株接种至装有灭菌第二培养基的发酵罐中进行深层培养3-4天后得到深层培养物，所述深层培养条件为：温度34-37℃，通气量为每分钟每1mL培养基通入0.4-0.6mL的气体，所述气体为5％O2、1％H2和94％N2的混合气体；
d-3、将得到的深层培养物依次进行菌体粉碎、磁力吸附和梯度纯化步骤，最终得到所述表达展示阴离子多肽的改性生物纳米磁珠。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述第一培养基由重量份数为1-2份腐胺二盐酸盐、0.1-0.2份多氯化胆碱、7-8份D-葡萄糖、1-2份亚油酸、2-3份硫代甘油、0.5-1份乙酸钠、3-5琼脂和1-2份海藻酸铵组成；所述第二培养基由重量份数为2-3份右旋糖酐、2-3份吐温80、0.3-0.5份甲砜霉素、7-8份D-葡萄糖、1-2份亚油酸、2-3份海藻糖和1-2份硫代甘油组成。
9.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤E由如下分步骤构成：
e-1、取20-30mg的生物纳米磁珠溶于10-12mL磷酸缓冲液中，加入1-1.5mL浓度为9mM的N乙酰羧基糖，室温搅拌30min；
e-2、加入N乙酰羧基糖转移酶，至终浓度35-45mU，室温搅拌3-5h，得到UDP-GalNAc定点修饰的生物纳米磁珠；
e-3、将步骤e-2得到的生物纳米磁珠采用磁力架分离纯化，洗涤后，重新溶于10-12mL磷酸缓冲液中，加入1-2mL浓度为2.5mM的唾液酸活化PEG，搅拌混匀；然后加入唾液酸转移酶，至终浓度200-280mU，于32℃，以50-80rpm的速度，轻轻摇晃反应24-48小时，催化形成具有PEG聚合物外壳的生物纳米磁珠；
e-4、将步骤e-3得到的生物纳米磁珠用25％乙醇洗涤2-3次，即得所述具有壳结构的阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030211494A1 (en) * 2002-05-03 2003-11-13 Prokaria, Ltd. Retrieval of genes and gene fragments from complex samples
US7727969B2 (en) * 2003-06-06 2010-06-01 Massachusetts Institute Of Technology Controlled release nanoparticle having bound oligonucleotide for targeted delivery
CN102617810B (zh) * 2012-02-27 2014-09-24 重庆医科大学 用两端带羧基的直链亲水聚合物包被纳米磁芯制备微纳米磁性材料的方法及其应用
CN104316683B (zh) * 2014-10-14 2016-05-11 南昌大学 针对全血的卵巢癌细胞检测试剂盒
CN105524141B (zh) * 2015-11-12 2019-11-26 中山大学 一种FAPa激活式肿瘤诊断多肽磁珠复合物的制备与应用
CN105624082B (zh) * 2016-03-17 2021-08-24 北京中科圆融生物科技发展有限公司 表达单链抗体scFV或多肽适配体的功能化细菌磁颗粒及其应用
CN105572396B (zh) * 2016-03-17 2017-12-08 北京中科圆融生物科技发展有限公司 表达重组蛋白g的细菌磁颗粒及其应用
CN106366194A (zh) * 2016-08-26 2017-02-01 上海交通大学 一种用于外周血淋巴细胞分离的免疫磁珠及其制备与应用
CN107045061B (zh) * 2017-06-05 2019-03-05 吉林大学 基于磁性分离和量子点标记的副溶血性弧菌检测试剂盒
CN107202884B (zh) * 2017-06-16 2019-03-19 吉林大学 基于免疫磁珠和MnO2纳米粒子检测副溶血性弧菌试剂盒
CN108251415B (zh) * 2018-01-22 2020-05-15 北京中科圆融生物科技发展有限公司 一种阴离子多肽羧基化生物纳米磁珠及其制备方法

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