RU2811106C2 - Способ получения частиц бактериофагов семейства levivirus - Google Patents
Способ получения частиц бактериофагов семейства levivirus Download PDFInfo
- Publication number
- RU2811106C2 RU2811106C2 RU2021134970A RU2021134970A RU2811106C2 RU 2811106 C2 RU2811106 C2 RU 2811106C2 RU 2021134970 A RU2021134970 A RU 2021134970A RU 2021134970 A RU2021134970 A RU 2021134970A RU 2811106 C2 RU2811106 C2 RU 2811106C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- particles
- levivirus
- bacteriophages
- family
- rna
- Prior art date
Links
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 79
- 241000714216 Levivirus Species 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 title claims abstract description 36
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 claims abstract description 11
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 21
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 20
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 18
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 16
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 10
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 claims description 9
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 8
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 8
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 150000003475 thallium Chemical class 0.000 claims description 6
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 claims description 5
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 5
- -1 ruthenium nitrosonitroamine Chemical compound 0.000 claims description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 5
- UYPYRKYUKCHHIB-UHFFFAOYSA-N trimethylamine N-oxide Chemical compound C[N+](C)(C)[O-] UYPYRKYUKCHHIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 3
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 3
- CHPZKNULDCNCBW-UHFFFAOYSA-N gallium nitrate Inorganic materials [Ga+3].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O CHPZKNULDCNCBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims description 3
- 229940015977 teferrol Drugs 0.000 claims description 3
- UCGZDNYYMDPSRK-UHFFFAOYSA-L trisodium;gold;hydroxy-oxido-oxo-sulfanylidene-$l^{6}-sulfane Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Au].OS([S-])(=O)=O.OS([S-])(=O)=O UCGZDNYYMDPSRK-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N zinc nitrate Chemical class [Zn+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 2
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 claims description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 2
- 150000003681 vanadium Chemical class 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 108091027551 Cointegrate Proteins 0.000 claims 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 15
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 15
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 25
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 17
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 8
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 8
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical group [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 241000709744 Enterobacterio phage MS2 Species 0.000 description 6
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000012552 review Methods 0.000 description 4
- 229910052716 thallium Inorganic materials 0.000 description 4
- YHTTWXCDIRTOQX-FQJIPJFPSA-N (6S,9S,15S,18R,23R,26S,29S)-18-amino-6-(4-aminobutyl)-9,26-bis(carboxymethyl)-15-[3-(diaminomethylideneamino)propyl]-2,5,8,11,14,17,25,28-octaoxo-20,21-dithia-1,4,7,10,13,16,24,27-octazabicyclo[27.3.0]dotriacontane-23-carboxylic acid Chemical compound NCCCC[C@@H]1NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)CNC1=O)C(O)=O YHTTWXCDIRTOQX-FQJIPJFPSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229960005540 iRGD Drugs 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 208000006178 malignant mesothelioma Diseases 0.000 description 3
- 201000005282 malignant pleural mesothelioma Diseases 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- BKVIYDNLLOSFOA-UHFFFAOYSA-N thallium Chemical compound [Tl] BKVIYDNLLOSFOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588780 Bordetella parapertussis Species 0.000 description 2
- 241000589567 Brucella abortus Species 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 2
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 2
- 241000589601 Francisella Species 0.000 description 2
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 2
- IDQNVIWPPWAFSY-AVGNSLFASA-N His-His-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O IDQNVIWPPWAFSY-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 2
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 125000003460 beta-lactamyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 229940056450 brucella abortus Drugs 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- JOPOVCBBYLSVDA-UHFFFAOYSA-N chromium(6+) Chemical compound [Cr+6] JOPOVCBBYLSVDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 2
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- YCOFRPYSZKIPBQ-UHFFFAOYSA-N penicillic acid Natural products COC1=CC(=O)OC1(O)C(C)=C YCOFRPYSZKIPBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- VOUGEZYPVGAPBB-UHFFFAOYSA-N penicillin acid Natural products OC(=O)C=C(OC)C(=O)C(C)=C VOUGEZYPVGAPBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 150000003378 silver Chemical class 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 229940098232 yersinia enterocolitica Drugs 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- OPEGYZAATHKDEM-HCWXCVPCSA-N (2r,4s)-2-[(r)-carboxy(formamido)methyl]-5,5-dimethyl-1,3-thiazolidine-4-carboxylic acid Chemical compound CC1(C)S[C@H]([C@H](NC=O)C(O)=O)N[C@H]1C(O)=O OPEGYZAATHKDEM-HCWXCVPCSA-N 0.000 description 1
- VOTJUWBJENROFB-UHFFFAOYSA-N 1-[3-[[3-(2,5-dioxo-3-sulfopyrrolidin-1-yl)oxy-3-oxopropyl]disulfanyl]propanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)CCSSCCC(=O)ON1C(=O)C(S(O)(=O)=O)CC1=O VOTJUWBJENROFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- AAQGRPOPTAUUBM-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AAQGRPOPTAUUBM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- YEVZMOUUZINZCK-LKTVYLICSA-N Ala-Glu-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O YEVZMOUUZINZCK-LKTVYLICSA-N 0.000 description 1
- PVQLRJRPUTXFFX-CIUDSAMLSA-N Ala-Met-Gln Chemical compound CSCC[C@H](NC(=O)[C@H](C)N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O PVQLRJRPUTXFFX-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- XWFWAXPOLRTDFZ-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XWFWAXPOLRTDFZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HCBKAOZYACJUEF-XQXXSGGOSA-N Ala-Thr-Gln Chemical compound N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)O HCBKAOZYACJUEF-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- AETQNIIFKCMVHP-UVBJJODRSA-N Ala-Trp-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AETQNIIFKCMVHP-UVBJJODRSA-N 0.000 description 1
- 102000000546 Apoferritins Human genes 0.000 description 1
- 108010002084 Apoferritins Proteins 0.000 description 1
- BEXGZLUHRXTZCC-CIUDSAMLSA-N Arg-Gln-Ser Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N)CN=C(N)N BEXGZLUHRXTZCC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- QBQVKUNBCAFXSV-ULQDDVLXSA-N Arg-Lys-Tyr Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 QBQVKUNBCAFXSV-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- OOWSBIOUKIUWLO-RCOVLWMOSA-N Asn-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OOWSBIOUKIUWLO-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- CDGHMJJJHYKMPA-DLOVCJGASA-N Asn-Phe-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N CDGHMJJJHYKMPA-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- BKFXFUPYETWGGA-XVSYOHENSA-N Asn-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O BKFXFUPYETWGGA-XVSYOHENSA-N 0.000 description 1
- NJSNXIOKBHPFMB-GMOBBJLQSA-N Asn-Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CC(=O)N)N NJSNXIOKBHPFMB-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- OOXUBGLNDRGOKT-FXQIFTODSA-N Asn-Ser-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O OOXUBGLNDRGOKT-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- AMRANMVXQWXNAH-ZLUOBGJFSA-N Asp-Cys-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O AMRANMVXQWXNAH-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- LBOVBQONZJRWPV-YUMQZZPRSA-N Asp-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O LBOVBQONZJRWPV-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 208000031872 Body Remains Diseases 0.000 description 1
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- CEZSLNCYQUFOSL-BQBZGAKWSA-N Cys-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O CEZSLNCYQUFOSL-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- NDNZRWUDUMTITL-FXQIFTODSA-N Cys-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NDNZRWUDUMTITL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 206010013700 Drug hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- KZKBJEUWNMQTLV-XDTLVQLUSA-N Gln-Ala-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O KZKBJEUWNMQTLV-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 1
- LVSYIKGMLRHKME-IUCAKERBSA-N Gln-Gly-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N LVSYIKGMLRHKME-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- QFXNFFZTMFHPST-DZKIICNBSA-N Gln-Phe-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N QFXNFFZTMFHPST-DZKIICNBSA-N 0.000 description 1
- CQIIXEHDSZUSAG-QWRGUYRKSA-N Gly-His-His Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 CQIIXEHDSZUSAG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N Gly-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- XHVONGZZVUUORG-WEDXCCLWSA-N Gly-Thr-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN XHVONGZZVUUORG-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- HVCRQRQPIIRNLY-IUCAKERBSA-N His-Gln-Gly Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)NCC(=O)O)N HVCRQRQPIIRNLY-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- HQEPKOFULQTSFV-JURCDPSOSA-N Ile-Phe-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N HQEPKOFULQTSFV-JURCDPSOSA-N 0.000 description 1
- PXKACEXYLPBMAD-JBDRJPRFSA-N Ile-Ser-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N PXKACEXYLPBMAD-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- NJGXXYLPDMMFJB-XUXIUFHCSA-N Ile-Val-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N NJGXXYLPDMMFJB-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N L-isoleucyl-L-alanine Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- AAORVPFVUIHEAB-YUMQZZPRSA-N Lys-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O AAORVPFVUIHEAB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YUAXTFMFMOIMAM-QWRGUYRKSA-N Lys-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O YUAXTFMFMOIMAM-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- RIPJMCFGQHGHNP-RHYQMDGZSA-N Lys-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O RIPJMCFGQHGHNP-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- WXHHTBVYQOSYSL-FXQIFTODSA-N Met-Ala-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WXHHTBVYQOSYSL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- SJDQOYTYNGZZJX-SRVKXCTJSA-N Met-Glu-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SJDQOYTYNGZZJX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- NGNNPLJHUFCOMZ-FXQIFTODSA-N Pro-Asp-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 NGNNPLJHUFCOMZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- WOIFYRZPIORBRY-AVGNSLFASA-N Pro-Lys-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O WOIFYRZPIORBRY-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- XDKKMRPRRCOELJ-GUBZILKMSA-N Pro-Val-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 XDKKMRPRRCOELJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- MMGJPDWSIOAGTH-ACZMJKKPSA-N Ser-Ala-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O MMGJPDWSIOAGTH-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- WTWGOQRNRFHFQD-JBDRJPRFSA-N Ser-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O WTWGOQRNRFHFQD-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- IOVHBRCQOGWAQH-ZKWXMUAHSA-N Ser-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O IOVHBRCQOGWAQH-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- PLQWGQUNUPMNOD-KKUMJFAQSA-N Ser-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PLQWGQUNUPMNOD-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- YLXAMFZYJTZXFH-OLHMAJIHSA-N Thr-Asn-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)O YLXAMFZYJTZXFH-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 1
- NIEWSKWFURSECR-FOHZUACHSA-N Thr-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NIEWSKWFURSECR-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- AHOLTQCAVBSUDP-PPCPHDFISA-N Thr-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O AHOLTQCAVBSUDP-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- YJCVECXVYHZOBK-KNZXXDILSA-N Thr-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N YJCVECXVYHZOBK-KNZXXDILSA-N 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- ZLFHAAGHGQBQQN-GUBZILKMSA-N Val-Ala-Pro Natural products CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O ZLFHAAGHGQBQQN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- CGGVNFJRZJUVAE-BYULHYEWSA-N Val-Asp-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N CGGVNFJRZJUVAE-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- UEHRGZCNLSWGHK-DLOVCJGASA-N Val-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O UEHRGZCNLSWGHK-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- PIFJAFRUVWZRKR-QMMMGPOBSA-N Val-Gly-Gly Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)NCC([O-])=O PIFJAFRUVWZRKR-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N Val-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C(C)C)N VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N Val-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 238000001479 atomic absorption spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003592 biomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- ZLFRJHOBQVVTOJ-UHFFFAOYSA-N dimethyl hexanediimidate Chemical compound COC(=N)CCCCC(=N)OC ZLFRJHOBQVVTOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010054812 diprotin A Proteins 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000000705 flame atomic absorption spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005048 flame photometry Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010078326 glycyl-glycyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical group [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CBMIPXHVOVTTTL-UHFFFAOYSA-N gold(3+) Chemical class [Au+3] CBMIPXHVOVTTTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000001871 ion mobility spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108010044374 isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000002307 isotope ratio mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010016686 methionyl-alanyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 229940031182 nanoparticles iron oxide Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- FYWSTUCDSVYLPV-UHFFFAOYSA-N nitrooxythallium Chemical compound [Tl+].[O-][N+]([O-])=O FYWSTUCDSVYLPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 201000005354 penicillin allergy Diseases 0.000 description 1
- 108010091617 pentalysine Proteins 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 108700010839 phage proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 239000004038 photonic crystal Substances 0.000 description 1
- 238000011197 physicochemical method Methods 0.000 description 1
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000007142 ring opening reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- TUTGPIFPKMTGAP-UHFFFAOYSA-N thallium vanadium Chemical class [V].[Tl] TUTGPIFPKMTGAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000816 toxic dose Toxicity 0.000 description 1
- 231100000721 toxic potential Toxicity 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложены способ получения частиц бактериофагов семейства Levivirus и способ биоминерализации указанных частиц бактериофагов семейства Levivirus. Изобретение может быть использовано для адресной доставки частиц к клеткам злокачественной опухоли, обогащённым интегрином ανβ3, позволяющим кардинально снижать их общую токсичность. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 табл., 8 пр.
Description
Группа изобретений относится к медицине и биологии и касается технологически простого метода создания частиц бактериофагов семейства Levivirus (MS2-подобных), лишённых LPS-токсичности, и способа их биоминерализации, что дает предпосылки к исследованию их применения для адресной доставки к клеткам злокачественной опухоли (в том числе клеткам эндотелия патологической кровеносной сети), обогащёнными интегрином α ν β 3, позволяющим кардинально снижать их общую токсичность.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Фагоподобные частицы (VLP) получают с иммунологическими целями [US Patent Application 201700008778; US Patent Application 20190315807], а также с целью клинического применения в качестве систем адресной доставки лекарств [US Patent 8324149]. Руководствуясь указанными задачами, разработаны способы получения VLP в больших количествах, которые базируются на генно-инженерных методах [US Patent 5534257; WO9306921; US Patent Application 20190307819] при этом используются различные клеточные культуры (бактерии, микроскопические грибы, клетки насекомых или животных, а также линии клеток человека).
Вирусоподобные частицы (VLP) - мультимерные наноструктуры, собранные из нативных вирусных структурных белков, но лишенные какого-либо генетического материала. VLPs состоят из высокоплотных дисплеев вирусных поверхностных белков и как таковые являются высокоадаптивным инструментом для различных применений (например, разработка антител, система доставки, экспрессия мембранного белка). VLPs также могут обеспечить тканеспецифический таргетинг, поскольку они происходят от собственного вируса. С другой стороны, поверхность частиц восприимчива к реакции химической конъюгации, которая позволяет создать на её поверхности тканеспецифический лиганд. В этом случае VLP частица становиться, по выражению разработчиков, дисплеем, экспонирующим свою способность находить клеточные «мишени».
В ранних работах с бактериофагами [Zeltins A. Construction and characterization of virus-like particles: a review//Mol Biotechnol. 2013; v.53(№1), pp.92-107], были описаны генно-инженерные методы создания VLP частиц Lentivirus, которые получены путем последовательных операций: клонирования кДНК геномных РНК последовательностей этих бактериофагов, экспрессии их в бактериальных клетках E.coli, а затем выделения частиц с применением методов детоксикации.
Дальнейшее развитие метода получения VLP частиц Lentivirus было направлено на применение различных систем экспрессии генетических структур [Blazeck J., Alper H.S. Promoter engineering: recent advances in controlling transcription at the most fundamental level//Biotechnol J. 2013; v.8(№1),pp.46-58], в которые были внесены новые генно-инженерные «новинки» в виде клонирования тандемов гена оболочки, содержащие, с целью получения желательного иммунологического ответа, дополнительные кодирующие ДНК фрагменты [Zhai L., J. Peabody, Y.-Y. S. Pang, J. Schiller, B. Chackerian, E. Tumban. A Novel Candidate MS2 Phage VLP Vaccine Displaying a tandem HPV L2 Peptide offers Similar Protection in Mice to Gardasil-9// Antiviral Res. 2017 Nov; 147: 116–123].
Несколько патентов, касающихся раскрытых указанных выше способов получения VLP частиц Lentivirus, в числе которых US Patents 4722840; 5534257; 7494656; 8324149, а также US Patent Applications 20130224828; 20140302593; 20160090403; 20160208221, и содержание которых систематизированы в публикациях [P. Pumpens et al. The True Story and Advantages of RNA Phage Capsids as Nanotools//Intervirology 2016;v.59(2), pp.74–110; Rohovie M.J., Nagasawa M., Swartz1 J.R. Virus-like particles: Next-generation nanoparticles for targeted therapeutic delivery// Bioengineering & Translational Medicine 2017; v.2(1), pp. 43–57], имеют общим недостатком значительный перечень методов получения, требующих высокой квалификации работников и энергозатрат. Кроме того, использование в качестве клеток-хозяина бактерий с токсичным для человека и животных LPS-антигеном вызывает необходимость применения дорогостоящих сорбентов на этапе выделения.
Химическая модификация поверхности VLP частиц Lentivirus, необходимая для придания «мишенности» и получения из них дисплеев, разработана как метод конъюгации и как метод получения капсидных белков с дополнительными пептидными последовательностями, аналогично методу фагового дисплея [Smith G.P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface//Science 1985; v.228(№4705), pp.1315-1317 ], упомянутого выше. Введение в структуру каписидного В-белка проводили с учётом данных [van Meerten D., R. C. L. Olsthoorn, J. van Duin, R. M. D. Verhaert. Peptide display on live MS2 phage: restrictions at the RNA genome level//Journal of General Virology 2001, v.82(№7), pp.1797–1805].
Из всего разнообразия химических, генетических и физико-химических методов привлекает внимание простая реакция конъюгации пенициллинов с белками. Пенициллины представляют собой большое семейство соединений, общей структурной основой которых является β-лактамное кольцо. β-лактамное кольцо является мишенью для нуклеофильной атаки свободных аминогрупп белков, приводящей к открытию кольца и ковалентному амидному связыванию пенициллоильной группы. Пенициллоильная конфигурация, в которой гаптен-детерминант ковалентно связан с ε-аминогруппами лизиновых остатков белков, составляет более 90% продуктов реакции конъюгации с белками. Другие продукты конъюгации могут образовываться путем деградации пенициллина в растворе до пеницилленовой или пенициллоиновой кислоты, которые образуют дисульфидные связи с сульфгидрильными группами цистеина, продуцирующими соответственно пенициллен - и пеницилламин-белковые конъюгаты [Weltzien H.U., E. Padovan. Molecular Features of Penicillin Allergy//Journal of investigative dermatology 1998, v.110(3), pp. 203–206].
Единственным дополнением к получению указанных конъюгатов является предварительный синтез пептидных производных 6-амино пенициллиновой кислоты, получение которых раскрыто в патентах [US Patents 3957764; 4229348; 4810777; DE 69731747].
Заполнение полученных VLP фагов семейства Lentivirus металлопрепаратами (фармацевтический препарат, имеющий центр активности, содержащий атом металла) обеспечивает геномная РНК или её фрагменты [Liu L., Pu X., Yin G., Chen X., Yin J., Wu Y. Biomimetic Mineralization of Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Mediated by Bi-Functional Copolypeptides//Molecules 2019; v.24(№7), pp. 1-16], а также «внутренние»-лиганды, вводимые в структуру капсида VLP частиц Lentivirus, после получения последних. В настоящее время в медицине применяют 89 металлопрепаратов [Barry N.P., Sadler P.J. Exploration of the medical periodic table: towards new targets//Chem Commun (Camb). 2013, v.49 (№45), pp.5106-5131], которые, зачатую имеют низкий «терапевтический индекс» (Therapeutic ratio) или «терапевтическое окно» (соотношение двух доз лекарства, где первая - вызывает побочные эффекты при заболевании, а вторая - тяжесть введения, не связанная с целевым показанием). Например, отношение токсической дозы в 50 % случаев, TD 50 к дозе, при которой лекарство проявляет желаемый фармакологический эффект, действенная доза в 50 % случаев, ED 50 ). Очевидно, что адресная доставка «расширяет терапевтическое окно» за счёт создания высокой локальной концентрации лекарственного препарата. Ранее, была установлена принципиальная возможность применения упомянутой технологии, применимо к фагу MS2, наполненному солями одновалентного таллия [Firsov I.S., Sivov I.G. Remission in the Patient with Malignant Pleural Mesothelioma: A Case Report// J Clin Case Rep 2019, v. 9(№2), pp. 1214-1217]. Уровень токсичности препаратов, приготовленных на основе солей одновалентного таллия в этом случае, был снижен в 10000 раз.
РАСКРЫТИЕ ГРУППЫ ИЗОБРЕТЕНИЙ
Технический результат заявленной группы изобретений заключается в разработке технологически простого метода создания частиц бактериофагов семейства Levivirus (MS2-подобных), лишённых LPS-токсичности, и способа их биоминерализации, что дает предпосылки к исследованию их применения для адресной доставки к клеткам злокачественной опухоли (в том числе клеткам эндотелия патологической кровеносной сети), обогащёнными интегрином α ν β 3, позволяющим кардинально снижать их общую токсичность.
Техничский результат достигается за счет способа получения частиц бактериофагов семейства Levivirus, включающего этапы:
(a) получения линии псевдолизогенных клеток-хозяина, размножающихся при температуре ≤ 23 о С, лишённых токсического липополисахарида и содержащих:
- последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей фазмиду Т7 с фрагментом геномов бактериофагов семейства Levivirus;
- последовательность нуклеиновой кислоты фазмиды Т7, кодирующей белки капсида частиц бактериофагов семейства Levivirus;
- последовательность нуклеиновой кислоты фазмиды Т7, кодирующей белки ДНК- и РНК-полимеразы фага Т7 и лишённой генов морфогенеза;
(b) инициирования гиперэкспрессии генов, кодирующих белки капсида частиц бактериофагов семейства Levivirus при повышении температуры ≥ 28 о С;
(c) получения частиц бактериофагов семейства Levivirus с одновременным разрушением клеток-хозяина, при этом указанные частицы бактериофагов имеют морфологическое сходство с природными частицами фага.
Кроме того, техничский результат, а именно существенно снизить общую токсичность нагруженных металлопрепаратами частиц, достигается за счет способа биоминерализации частиц бактериофагов семейства Levivirus, включающего этапы:
(а) полного удаления РНК из частиц бактериофагов семейства Levivirus;
(б) получения комплекса металлопрепаратов со шпилечной РНК (shRNA), связывающих не менее 200 катионов;
(в) «загрузки» комплекса металлопрепаратов со шпилечной РНК (shRNA), связывающих не менее 200 катионов, в «разрыхлённые» триметиламин N-оксидом частицы бактериофагов семейства Levivirus, лишённых РНК;
(г) неферментативного присоединения лиганда к биоминерализованным частицам, пригодного для создания системы адресной доставки к клеткам злокачественной опухоли, в том числе клеткам, обогащённым интегрином α ν β 3 ;
(д) определение специфичности доставки и чувствительности на модели смеси линии клеток РС3, одна из которых обогащёна интегрином α ν β 3 .
Далее заявленная группа изобретений будет описана более подробно только в качестве иллюстрации нижеследующих примеров. Предполагается, что примеры служат для иллюстрации группы изобретений и не должны рассматриваться как ограничивающие универсальность раскрытия описания в данном источнике [US Patent Application 20180250331].
В производстве фагов рода Lentivirus, поражающего «мужские» штаммы бактерий, основной трудностью является сохранение чувствительности, которую клетки бактерий, в присутствии бактериофага, быстро теряют [Spengler G, Molnár A, Schelz Z, Amaral L, Sharples D, Molnár J. The mechanism of plasmid curing in bacteria//Curr Drug Targets. 2006; v.7(№7); pp.823-41; Getino M., D.J. Sanabria-Ríos, R. Fernández-López, J. Campos-Gómez, J.M. Sánchez-López, A. Fernández, N.M. Carballeira, F. de la Cruz. Synthetic Fatty Acids Prevent Plasmid-Mediated Horizontal Gene Transfer//mBio. 2015; v.6(№5), pp. e01032-15]. На генетическом уровне это явление выражается в элиминации «мужских» плазмид из популяции, а на уровне биотехнологическом – к нестабильному «урожаю» фага. Этим объясняется разница в продажной стоимости лечебных фагов (около 10 руб/мл) и одного из фагов рода Lentivirus – MS2 (14000 руб/мл). Следует указать, что количество инфекционных частиц в первом случае превышает аналогичный показатель в случае MS2 в 1000 раз.
Снижение стоимости препаратов фагов рода Lentivirus авторы группы изобретений видят в применении явления псевдолизогении [Большакова Т.Н., Добрынина О.Ю. Каратаев Г.И., Сивов И.Г. Псевдолизогения у фага Т7 и ее использование (в рамках Научно-практическая конференция с международным участием «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности»)//Москва, 2016, Россия]. Геном дефектных фагов Т7, способных вызвать псевдолизогению, содержит строго-полярную мутацию. Строго-полярная мутация картирована за промотором А3, что приводит к значительному снижению частоты транскрипции генома фага (< 10 2 ). При заражении бактерий псевдолизогенных клонов фагом-помощников Т7 в потомстве фагов получали соотношение частиц фага и частиц, способных вызвать псевдолизогению, равно 1:1 (Hft-лизаты). Выбор фага Т7 в качестве модели псевдолизогении основан на его свойстве вызывать заражение широкого круга бактерий-хозяев (Escherichia coli, Salmonella enterica Typhimurium, Shigella flexnery, Bordetella parapertussis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Erwinia carotovorum, Yersinia enterocolitica, Francisella spp, Brucella abortus), ряд из которых содержит не токсичный для человека LPS-антиген.
Для повышения эффективности и снижения общей токсичности, химиопрепараты инкапсулируют, например, в вирионы фагов рода Lentivirus [US Patent 5677124, 6159728, US Patent Application 20100167981; Carlee Ε. Ashley et al. Cell-Specific Delivery of Diverse Cargos by Bacteriophage MS2 Virus-Like Particles//ACS Nano. 2011; 5(7): 5729-5745].
В полноценных вирионах фагов рода Lentivirus капсиды содержат конусовидные поры: входной диаметр 5-7 нм и внутренний – 1,5 - 2 нм [Michel T. Dedeo, Daniel T. Finley, Matthew B. Francis. Chapter 8 - Viral Capsids as Self-Assembling Templates for New Materials//page 366. In book “Molecular Assembly in Natural and Engineered Systems” (Edited by S. Howorka) 2011, v. 103, pp. 1-401]. Успех минерализации зависит от сохранения свойства кристаллизации [Aljabali A. A., Sachin N. Shah, Richard Evans-Gowing, George P. Lomonossoff, David J. Evans. Chemically-coupled- peptide -promoted virus nanoparticle templated mineralization// Integr. Biol., 2011, 3, 119-125], когда вирионы очищают от геномной ssРНК либо полностью, либо частично [Hooker J. M., E. W. Kovacs, M. B. Francis. Interior Surface Modification of Bacteriophage MS2//J. AM. CHEM. SOC. 2004, v. 9(№12), pp. 3718-3719]. В случае получения частиц с укороченным РНК геномом, способным к разнообразной упаковке [Sun L.-Z., D. Zhang, S.-J. Chen. Theory and Modeling of RNA Structure and Interactions with Metal Ions and Small Molecules//Annu Rev Biophys. 2017; v.46 (№ 1), pp. 227–246], можно, на основании соответствующих расчётов, предсказать увеличение числа дуплексных петель, связывающих катионы тяжёлых металлов [Bonilla S., C. Limouse, N. Bisaria, M. Gebala, H. Mabuchi, D. Herschlag. Single-Molecule Fluorescence Reveals Commonalities and Distinctions among Natural and in Vitro-Selected RNA Tertiary Motifs in a Multistep Folding Pathway// J. Am. Chem. Soc. 2017, v.139 (№ 51), pp.18576−18589].
В случае полного гидролиза геномной ssРНК и получения VLPs, генетически изменённую внутреннюю поверхность вириона подвергают химической модификации, позволяющей присоединять молекулы металлопрепаратов [US Patent 8187607; US Patent Application 20110286971].
Представителем фагов рода Lentivirus - бактериофагом MS2, нагруженным солями тяжёлых металлов, имеет основание для безопасного применения в медицинской практике, что показано практическим применением iRGD-MS2 дисплея [US Patent Application 20140106982; Ashley C. E. , Eric C. Carnes, Genevieve K. Phillips, Paul N. Durfee, Mekensey D. Buley, Christopher A. Lino, David P. Padilla, Brandy Phillips, Mark B. Carter, Cheryl. L. Willman, C. Jeffrey Brinker, Jerri do Carmo Caldeira, Bryce Chackerian, Walker Wharton, David S. Peabody. Cell-Specific Delivery of Diverse Cargos by Bacteriophage MS2 Virus-Like Particles// ACS Nano. 2011 Jul 26; 5(7): 5729–5745; Diaz D. , Andrew Care, Anwar Sunna. Bioengineering Strategies for Protein-Based Nanoparticles//Genes (Basel). 2018; v.9 (№7), pp. 370-400], в том числе и в случае наполнения частиц нитратом одновалентного таллия [Патент РФ 2599462, Колесанова Е. Ф., Мельникова М. В., Большакова Т. Н., Рыбалкина Е. Ю., Сивов И.Г. Бактериофаг MS2 – средство доставки для таргетной химиотерапии солидных опухолей //Acta Naturae. 2019. V. 11. № 2 (41). Стр. 98 -101; Firsov I.S., Sivov I.G. Remission in the Patient with Malignant Pleural Mesothelioma: A Case Report// J Clin Case Rep 2019, v. 9(№2), pp. 1214-1217]. Концентрация Tl +1 в дозе упомянутого в патенте РФ препарата меньше в 5 раз меньше DLM для солей указанного иона. На примере адресной доставки одновалентного иона таллия уже показана возможность снижения токсичности до уровней по значениям ниже тех, что является допустимыми [TOXICOLOGICAL REVIEW OF THALLIUM AND COMPOUNDS // U.S. Environmental Protection Agency, 2009].
В настоящей группе изобретений цисплатин (цис-дихлородиамминплатин) (II) или гексахлороплатинат (IV) аммония; рутения нитрозонитроамин, ауротиосульфат, гидроксид полимальтозата железа, нитраты серебра, меди или цинка, а так же тринитрат галлия, соли ванадия и соли таллия различной валентности были введены в состав VLPs фагов семейства Lentivirus.
В одном аспекте настоящей группы изобретений по аналогии с раскрытым способом в [US Patent Applications 20090092538; 20180103645; 20170071211] наполнение проводили:
- в случае с цисплатином методами, раскрытыми [US Patent 7594884; US Patent Application 20190350871] с модификациями, но применительно к структурам VLPs фагов семейства Lentivirus;
- в случае с гексахлороплатинат (IV) аммония методами раскрытыми [US Patent 7569606; EP 2958553] с модификациями, но применительно к структурам VLPs фагов семейства Lentivirus;
- в случае с рутения нитрозонитроамином, ауротиосульфатом, гидроксид полимальтозата железом, нитратами серебра, меди или цинка, тринитратом галлия, солями ванадия таллия методом раскрытым [US Patent 7594884; US Patent Application 20190350871] с модификациями, но применительно к структурам VLPs фагов семейства Lentivirus;
Ещё в одном аспекте группы изобретений «пустые» вирионы получали временным температурным разрушением и сборкой в присутствии триметиламина N-оксида (ТМAО), аналогично [US Patent Application 20040152181; WO1995031476; Патент РФ 2599462].
В соответствии с ещё одним аспектом группы изобретений, частицы фагов рода Lentivirus могут содержать «наружный» лиганд, обеспечивающий его взаимодействие с рецептором, присутствующим на клетке-мишени и способный формировать «дисплей», за счёт неферментативной реакции взаимодействия радикала 6-пептидилопенициллиновой кислоты с поверхностными радикалами аминокислот лизина или цистеина [N.F. Adkinson, Jr; L. M. Mendelson; C. Ressler; J. C. Keogh. Penicillin minor determinants//Ann Allergy Asthma Immunol. 2018; v.121; pp.537−544]. При введении такого препарата фагового дисплея, полученного в реакциях с лизилом или цистеилом, можно избежать иммунологической реакции, так как раскрыто в описании к заявке [WO 2020030954].
Токсичность металлопрепаратов, имеющих в структуре атом платины, связан с нейротоксичностью, которая вызвана образованием аддуктов с ДНК [O. Kanat, Hulya Ertas, Burcu Caner. Platinum-induced neurotoxicity: A review of possible mechanisms// World J Clin Oncol 2017; v.8(4), pp. 329-335]. В соответствии с возможными побочными эффектами препаратов платины, минимальные терапевтические дозы находятся в пределах значений 10-100 мкг/м 2 [US Patent Application 20180078551]. Токсичность металлопрепаратов, имеющих в структуре атом золота описана, где указана его переносимость в пределах значений 1-500 мг/кг [US Patent Application 20180303954]. Соединения золота (III) по изобретению [US Patent Application 20150182489] обладают противоопухолевой активностью. Другие металлопрепараты, имеющие противоопухолевый потенциал с приемлемым уровнем токсичности, упомянуты в US Patent 10098952.
Ранее был предложен способ адресной доставки к клеткам солидных опухолей солей [Патент РФ 2599462; метод получения таких частиц – минерализация] одновалентного таллия – иона, имеющий высочайший токсический потенциал [Toxicological review of thallium and compounds//U.S. Environmental Protection Agency, Washington, DC. September 2009]. Кроме того, предложены способы диагностики на основе адресной доставки к клеткам солидных опухолей 99m Tc [US Patent Application 20150125533] или пероральной доставки терапевтических и выявляемых агентов к больной ткани [US Patent Application 20180000949], а также к сосудистой сети опухоли [US Patent Application 20190022170].
Однако, вопрос адресной доставки металлопрепаратов и снижения их токсического воздействия на организм реципиента, остаётся не решённым [Topcul M, Cetin I. Endpoint of cancer treatment: targeted therapies//Asian Pac J Cancer Prev. 2014; v.15(11); pp. 4395-403; Maeda H, Khatami M. Analyses of repeated failures in cancer therapy for solid tumors: poor tumor-selective drug delivery, low therapeutic efficacy and unsustainable costs//Clin Transl Med. 2018; v.7(1); pp.11 - 30].
Таким образом, из уровня техники известны способы минерализации при получении наночастиц с медицинскими целями у апоферритина [US Patent 9,925,592], а также у вируса табачной мозаики (ВТМ) [US Patent Application 20180256758].
Ранее, было установлена принципиальная возможность применения упомянутой технологии, применимо к фагу MS2, наполненному солями одновалентного таллия [Firsov I.S., Sivov I.G. Remission in the Patient with Malignant Pleural Mesothelioma: A Case Report// J Clin Case Rep 2019, v. 9(№2), pp. 1214-1217]. В описанном случае, уровень токсичности препаратов, приготовленных на основе солей одновалентного таллия, был снижен более чем в 10000 раз, что позволяет с оптимизмом ожидать подобного результата и с Cr(VI), для которого DCL=50-150 мг/кг. Эксперты Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) рекомендуют максимально допустимую концентрацию 50 мкг на литр хрома (VI) в питьевой воде. Металлопрепараты вводили в состав VLP, «пустых» вирионов и других методов «нагрузки» препаратами, как варианты известных способов минерализации [US Patent Application 20140377289].
В одном аспекте группы изобретений VLPs получали с помощью системы псевдолизогении бактериофага Т7 [Большакова Т.Н., Добрынина О.Ю. Каратаев Г.И., Сивов И.Г. Псевдолизогения у фага Т7 и ее использование (в рамках Научно-практическая конференция с международным участием «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности»)//Москва, 2016, Россия];
В другом аспекте группы изобретений «пустые» вирионы с необходимыми точечными заменами аминокислот каписидного белка у фагов рода Levivirus, получали прямым гидролизом геномной ssRNA из «нормальных» вирионов, аналогично [EP 1736538];
В одном варианте, связывающий металлолекарство агент получали аналогично [US Patent Application 20140377289]. В соответствии с этим аспектом настоящей группы изобретений предлагаются пептиды общей структуры (HHQG) n , которые встраивали в последовательности, кодирующие поверхность В-белка, которая обращена во внутреннюю часть капсида.
В контексте данной группы изобретений термин «введение» и варианты этого термина, включая «введение», включают в себя контактирование. Для любого конкретного случая подходящее «эффективное количество» может быть определено специалистом в данной области с использованием только рутинных экспериментов.
Вышеуказанные и другие задачи, особенности, преимущества, а также техническая значимость данной группы изобретений будут более понятны из нижеследующего подробного описания со ссылками на сопровождающие фигуры.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На фигуре 1 представлена структура коинтегратов T7::pMS3,6∇Rep (или изолятов fr; M12; DL1; DL16; J20; ST4; R17 – SEQ ID NO 2) или T7::pGA2,6∇Rep (или изолятов KU1; T72; DL10; DL20– SEQ ID NO 1).
На фигуре 2 представлено получение и показан анализ частиц фагов рода Livirus (приведены типичные результаты).
На фигуре 3 представлено определение структуры полученных VLPs.
На фигуре 4 показано изменение размеров полученных VLPs после наполнения их AgNO 3 (концентрация 25 мМ).
На фигуре 5 представлена АСМ (атомносиловая микроскопия) MS2 бактериофага и полученных фагов рода Levivirus, обработанных анти-poly-lysin IgG1 антителами.
На фигуре 6 представлена модификация частиц фагов рода Levivirus пептидом (HHQG) 4 (SEQ ID NO 8), которое вызывает изменение размера частиц с вставкой poly-lysin.
На фигуре 7 представлена неферментативная конъюгация пептидил-6APA с В белком частиц Levivirus.
На фигуре 8 представлен изотопный анализ обнаружения стабильного изотопа.
На фигуре 9 представлены результаты определения точности доставки методом проточной флуориметрии со смеси клеток, обогащённых интегрином ανβ3 и лишённых такового (линии PC3 и HEK293).
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ГРУППЫ ИЗОБРЕТЕНИЙ
На фигуре 1 представлена структура коинтегратов T7::pMS3,6∇Rep (или изолятов fr; M12; DL1; DL16; J20; ST4; R17 – SEQ ID NO 2) или T7::pGA2,6∇Rep (или изолятов KU1; T72; DL10; DL20– SEQ ID NO 1).
1 A. Сайт интеграции расположен во 0,5kb фрагменте BsaBI-BstBI и после промотора A3, что затрудняет любую транскрипцию в направлении ORF РНК-полимеразы фага Т7. Вставка фланкирована прямыми полноразмерным IS 481 и тетрануклеотидом CTAG копиями. Последовательности в местах «стыков» отображаются в прямоугольниках, показанных пунктиром. Секвенсы получены путем анализа продуктов ПЦР полученных с праймеров с приведённой на фигуре структурой.
1 B. ПЦР-амплификация экспериментальных данных. Направление электрического поля справа налево. ПЦР амплификационная смесь с использованием праймерных олигонуклео-тидов (* F T7 - TAAGCGCACCACGGCACATAAGG (SEQ ID NO 3);
* R IS481 – GCGGCGCAGCTCCACGATA (SEQ ID NO 4);
* L IS481 - GCACCGCTTTACCCGACCTTA (SEQ ID NO 5);
* R T7 - TGCTCCTTCCACTGCTTCATCTG) (SEQ ID NO 6).
Праймеры для проведения ПЦР добавляли в конечной концентрации 1,5 мM. Верхняя линия-продукты ПЦР (медленные ~ 4B, быстрые ~ 0<5B); средняя линия-маркеры с размером фрагмента 10, 9, 7, 5, 3, 1 (B); нижняя линия-маркеры с размером фрагмента 1000, 900, 800, 700, 600, 500 и 400 (b). Последовательность ДНК проводили по методике 373 Automatic Automatic Sequencer Guidance (Applied Biosystems, США) с использованием набора для секвенирования Dye Doing Terminator ABI с Taq-полимеразой FS (Perkin Elmer, США). Файлы экспериментальных данных (формат EMBL) сравнили с последовательностями (acc. № J02518) базового GenBank.
На фигуре 2 представлено получение и показан анализ частиц фагов рода Livirus (приведены типичные результаты).
2A. Градиентное центрифугирование наночастиц фагов рода Levivirus: стрелками с обозначениями указаны скопления частиц с известной для специалистов плавучей плотностью. VLP (скопления расположенные выше, так как более лёгкие), а фаговые частицы (скопления расположенные ниже, так как более тяжёлые).
2В. Микроскопические фотографии частиц фага MS2 (с наполнением солями серебра; темные частицы размером до 30 нм, просвечивающая микроскопия) или наполнением солями серебра; частицы размером до 25 нм, просвечивающая микроскопия).
2С. Результат гидролиза геномной РНК в бактериофагах с изменёнными последовательнос-тями основного белка оболочки. Нижняя дорожка – время гидролиза 20 минут, Самая верхняя – 4 часа. «Nothern дот блот-гибридизацию» (Yadetie F., A.K. Sandvik, H. Bergum, K. Norsett, A. Laegreid. Miniaturized fluorescent RNA dot blot method for rapid quantitation of gene expression// BMC Biotechnology 2004, v.4(№12), pp. 472-480) с 3-ОН меченным олигонуклеотидом со структурой ACATGAGGATTACCCATGT (SEQ ID NO 7) использовали для выявления положения фрагментов фаговых геномных РНК.
2D. Гиперэкспрессия генов клонированных генов бактериофагов семейства Levivirus.
ПААГ-элктрофорез лизатов прогретых клеток (слева направо, через каждые 5 часов от начала прогрева). Нижняя полоса – капсидный белок MS2.
2E. Результат определения ЛПС (LAL тест) в псевдолизогенных клетках. Лизат клеток Limulus amebocytis вызвает образование геля в присутствии ЛПС (> 1пг/мл). Рукодство по проведению теста утверждено FDA USA (Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers, JUNE 2012).
На фигуре 3 представлено определение структуры полученных VLPs.
3А. Методом SPR (поверхностный плазмон). Поверхность стеклянного чипа обработанного анти-poly-lysin IgG1 антителами кролика (небольшое неспецифическое связывание с контрольными частицами фагов – ОD = 0,0020 и связывание высокоспецифичное с анти-poly-lysin IgG1 - OD = 0,230).
3В. Методом HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография высокого давления). Рассчётная молекулярная масса В-белка фагов рода Levivirus (контроль - 13866.58 ) и полученных VLPs (опыт - 14457.38).
На фигуре 4 показано изменение размеров полученных VLPs после наполнения их AgNO 3 (концентрация 25 мМ).
На фигуре 5 представлена АСМ (атомносиловая микроскопия) MS2 бактериофага (верхняя пара фигур) и полученных фагов рода Levivirus, обработанных анти-poly-lysin IgG1 антителами (нижняя пара фигур).
На фигуре 6 представлена модификация частиц фагов рода Levivirus пептидом (HHQG) 4 (SEQ ID NO 8), которое вызывает изменение размера частиц с вставкой poly- lysin.
На фигуре 7 представлена неферментативная конъюгация пептидил-6APA с В белком частиц Levivirus.
Предлагаемый способ получения частиц фагов рода Levivirus реализуют на базе существующего уровня техники следующей последовательностью действий.
Первоначально производят подготовительные процедуры для получения высоких титров и последующее очищение образцов фага MS2 или VLPs фагов рода Levivirus, а также осуществляют синтез необходимых лигандов в виде органических соединений, используемых для модификации внутренней поверхности полости капсидов. Для наполнения, указанными выше соединениями, их используют в виде растворов, подобно описанным, например, в патентах и патентных заявках (US Patent Applications 20190255088; 20190255087; 20190201547; 20190167584; 20190240186; 20190170742; 20180071399; 20190117561; 20190091165; 20190015526; 20190015320; 20180353613; 20180344849; 20180243440; 20180243229; 20180133343; 20180028683; 20180021265; 20180021259; 20170239369; 20150157571) и которые, в соответствии с настоящей группой изобретений, рассматриваются в качестве ядра модифицированных VLPs фагов рода Levivirus.
Контроль указанных операций осуществляют с помощью методов:
- выделения геномных РНК;
- расчёта праймеров для проведения ОТ-ПЦР (обратная транскрипция, сопряжённая с ПЦР);
- обратной транскрипции и клонирование кДНК;
- электрофорез ДНК в агарозе;
- просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ);
- атомно-силовой микроскопии (АСМ);
- поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (V.N. Konopsky et al. Photonic Crystal Biosensor Based on Optical Surface Waves // Sensors 2013, 13(20), pp. 25662578);
- флуоресцентной спектроскопии проб содержащих различные металлопрепараты, для определения эффективности упаковки и интенсивности вымывания (манипуляции проводились с учетом письма Главного государственного санитарного врача РФ от 2004.01.06 №2510/92-04-32);
- изотопный анализ для облегчения обнаружения иона, как при оценке эффективности упаковки, так и для оценки интенсивности вымывания;
- пламенной атомной фотометрии (ПАФ);
- ферментативного картирования с трипсином (ТФК);
- высоко-эффективной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ);
- время пролётной масс-спектроскопии (МС) и масс-спектроскопии MADI-TOF.
Группа изобретений поясняется следующими примерами.
Пример 1. Получение частиц фага MS2 и модифицированных VLPs рода Levivirus.
Плазмиды переносили в клетки Pseudomonas putida, при помощи Hft трансдукции бактериофагом Т7 (Большакова Т.Н., Добрынина О.Н., Каратаев Г.И., Сивов И.Г. Псевдолизогения у фага Т7 и ее использование // Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности. Третья международная научная конференция, Москва, 2016). Контроль инфекционности частиц проводили по методу (Княжев В.А., Сергиенко В.И., Сивов И.Г. РНК-трансдукция неинфекционными вирионами фага MS2// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2002, № 3, стр. 56 -63). Полученный электрофоретически чистые частицы хранили при +4оС.
На фигуре 1 показана структура коинтегратов, а в Таблице 1 показана эффективность переноса структуры между представителями семейства Enterobacteriaceae.
Таблица 1
T7::pMS3,6∇Rep или T7::pGA2,6∇Rep трансдукция Грам-отрицательных бактерий
| № | T7::pMS3,6∇Rep | T7::pGA2,6∇Rep | Вид |
| частота (х 10 6 ) | частота (х 10 6 ) | ||
| 1 – 1,5 | 1 – 1,5 | Escherichia coli | |
| 1 | 1 | Salmonella enterica биовар Typhimurium | |
| 0,5 | 0,5 | Shigella flexnery | |
| 1 | 1 | Bordetella parapertussis | |
| 0,3 | 0,3 | Pseudomonas aeruginosa | |
| 0,7 | 0,7 | Pseudomonas putida | |
| 0,2 | 0,2 | Erwinia carotovorum | |
| 0,05 | 0,05 | Yersinia enterocolitica | |
| 0,005 | 0,005 | Francisella spp | |
| 0,05 | 0,05 | Brucella abortus |
Пример 2. Получение частиц фагов рода Levivirus с полностью гидролизованной РНК.
Частицы бактериофага обрабатывают диэтиламином (ДЭА 1,5%, вызывает в течение 2-х суток инкубации при 37 о С полный гидролиз геномной РНК). Контроль снижения молекулярной массы геномной РНК проводили электрофоретически (в 2% агарозном геле). Полученные частицы концентрировали центрифугированием в градиенте плотности CsCl (как известно специалистам), а так же проводили контроль чистоты препаратов просвечивающей электронной микроскопией по методу (US Patent 10446366). Хранили частицы при +4 о С в условиях, известных специалистам.
Пример 3. Получение VLPs частиц с (HHQG) 4.
3А. Проводили согласно ранее описанному методу [Hooker J.M., E.W. Kovacs, M.B. Francis. Interior Surface Modification of Bacteriophage MS2. Supporting Information//J. AM. CHEM. SOC. 2004, v.126 (12), pp. 3718-3719] с модификацией Tyr 85 → Cys в последовательности В-белка (SEQ ID NO 9).
3В. Пептиды получали методом автоматического твердофазного синтеза исходя из 9-флуо-ренил(метоксикарбонил)-аминокислот («ChemPep», США) (синтезатор 433А, Applied Biosystems, метод FastMoc). Формирование S-S-мостика проводили путем окисления I2 [10]. Пептид очищали ВЭЖХ на обращенной фазе (колонка C18 Triart, 21х250 мм, 10.0 мкм, «YMC», Швейцария, рабочая станция Agilent 1100, «Agilent», США) в градиенте концентрации CH3CN («BioSolve», Израиль) в воде в присутствии 0,1% уксусной кислоты. По данным аналитической ВЭЖХ на обращенной фазе (колонка C18 Triart, 2.1х50 мм, 2.0 мкм («YMC»), рабочая станция Agilent 1200) с УФ- и масс-спектрометрической детекцией чистота препарата пептида не ниже 95%.
3C. Неферментативная реакция присоединения iRGD-6APA (SEQ ID NO 10)
Конъюгацию пептида с капсидным В-белком VLPs рода Levivirus, проводили с использованием гомобифункционального реагента диметиладипимидата (ДМАИ, «Sigma», США) в молярном соотношении белок фага: пептид: ДМАИ 1:20:80 по методу [US Patents 6080383; 6468503; 10576144 и DE Patent 000069731747] в 40% диметилсульфоксиде (ДМСО). VLPs отделяли от избытка реагентов осаждением 25%-ным раствором полиэтиленгликоля 6000 («Диа-М», Россия) с 1М NaCl. Осажденные VLPs суспендировали в деионизованной воде.
Пример 4. Биоминерализация частиц.
На предварительном этапе желательную структуру shRNA (для связывания с максимальным количеством катионов; не менее 200) расчитывали с помощью программы Ошибка! Недопустимый объект гиперссылки. и синтезировали по методу [Chris B. Moore, E. H. Guthrie, M. Tze-Han Huang, D. J. Taxman. Short Hairpin RNA (shRNA): Design, Delivery, and Assessment of Gene Knockdown//Methods Mol Biol. 2010 ; 629: 141–158]. Введение shRNA в комплексе с солями проводили с ТМАО [Патент РФ 2599462] и с учётом расчётов, полученных ранее [Farafonov V.S., Nerukh D. MS2 bacteriophage capsid studied using all-atom molecular dynamics//Interface Focus. 2019 Jun 6;9(3): pp. 81 - 85]. «Разрыхлённые» частицы переносили из рН = 4,5 в буфер карбоната натрия (0,5М, рН= 10,0). Соли и металлопрепараты переносили в раствор в концентрации не менее 1/50 штоковых растворов (<1 мг/мл) в соотношении 100 мкг белка. Далее инкубировали в течение 30 мин, с мягким перемешиванием на магнитной мешалке. Затем смесь диализовали в предварительно охлажденной стеклянной пробирке на льду, оставляли на 10 мин на льду, а затем 5 мин на комнатной температуре. Остатки солей и металлопрепаратов удаляли из образцов путем гель-фильтрации с использованием Сефадекса G-50. Препараты добавляли в колонки с сефадексом. Разделение повторяли дважды. Конечные концентрации инкапсулированных в наночастицы солей оценивали с помощью пламенного фотометра (PFP-7/C, Jenway, Англия). Результаты сравнивали с кривой концентраций соединений в диапазоне длин волн 280-800 нм. Размер нагруженных частиц измеряли с помощью анализатора размера частиц (IG-1000 Plus, Shimadzu, Япония).
Анализ проводили согласно прописям руководства по аналитическому методу пламенной фотометрии [Flame Atomic Absorption Spectrometry. Analytical Methods / /Fourteenth edition, 2017 Agilent Technologies Australia (M) Pty, Ltd.]. Контроль связывания катионов металлов с В-белком проводили с помощью программы «Metal Detector v.2.0». Контрольные измерения концентрации веществ давали линейную зависимость с r > 0,98. Полученные результаты сведены в таблицу известную специалистам [Analytical Methods for Atomic Absorption Spectroscopy. Manual Perkin Elmer. 1996].
Пример 5. Атомно-силовая микроскопия частиц фагов рода Levivirus.
Проводили по схеме, описанной ранее [Kuznetsov Y.G., Sheng-Chieh Chang, A. McPherson. Investigation of bacteriophage T4 by atomic force microscopy//Bacteriophage. 2011 May-Jun; 1(3): 165–173; A. Ramanaviciene, V. Snitka, R. Mieliauskiene, R. Kazlauskas, A. Ramanavicius. AFM study of complement system assembly initiated by antigen-antibody complex//Central European Journal of Chemistry 2006, v.4(1), pp 194–206]. Результаты суммированы на фигурах 5А и 5В.
5а. Подготовка чипа.
Для изготовления чипов использовали слюду (Structure Probe, Inc., West Chester, PA, USA), которую сиализировали в парах 3-аминопропилтриетоксисилана (APTES), как известно специалистам. Поверхность силизированных слюдяных субстратов активировали 0,12 мМ раствором DTSSP в 10 мМ PBSD (pH 7,4) в течение 10 мин, промывали 1 мл 50% абсолютого этанола в течение 10 мин при 10 о С и затем сушили в токе азота немедленно использовали для иммобилизации. Инкубационные растворы (~ 1 мкл) осторожно капали на поверхность активированного субстрата, инкубировали полчаса при комнатной температуре (25 о C) во влажной камере.
5в. АСМ сканирование проводилось с использованием титанового атомно-силового микроскопа (НТ-МДТ, Зеленоград, Москва, Россия). НТ-МДТ имеет резонансную частоту 47–150 кГц, радиус кривизны острия кантилевера 10 нм). Данные АСМ оценивали по двум критериям: первый «качественный», который основывался на очевидном увеличении высоты комплексов по сравнению с высотой неровностей чипа. Использовали треугольные датчики с широкими ножками 13μm и общей длиной 100μm. Заявленную постоянную силы (0,21Н/м) проверяли с точностью до 20% путем измерения прогиба кантилевера при прижатии к кварцевому волокну известной жесткости. Сканирующая головка была откалибрована в направлениях x,y и z с использованием полистирол-латексных подставок, как известно специалистам. Существует некоторое неконтролируемое изменение от запуска к запуску, которое может быть связано со сканерами, и это вводит систематическую ошибку в размерах до ±2,5%. Эксперименты проводились в жидкостной ячейке, с использованием воздуха, деионизованной воды. Высота и ширина изображения измеряли с помощью программного обеспечения, доступного на рабочей станции NanoScope Im. По меньшей мере, 40 молекул были измерены в 5 точках вдоль их контуров для каждого приведенного здесь материала. Результаты анализировали программой KaleidaGraph.
Измерения силы производили с помощью дисплея силы на АСМ (График зависимости напряжения, приложенного к контролю высоты образца, связанного с положением образца, Zs, через известную калибровку высоты, от сигнала отклонения, связанного с силой через отклонение наконечника, ZT и постоянной пружины кантилевера, kH). Адгезия может значительно варьироваться, поскольку она зависит от неконтролируемой геометрии наконечника и от загрязнения. Приводим усреднённые значения и диапазон, который отражает типичные условия эксперимента (см. фигуры 5A и 5B). В Таблице 2 приведены результаты измерения с помощью АСМ.
Таблица 2
| VLPs рода Levivirus | |||
| Воздух | Вода | 40% спирт | |
| Длина (нм) | 25.5±2.3 | 22.6±4.5 | 23±7 |
| Ширина (нм) | 27±1.3 | 26±3 | 26±5.6 |
| VLPs рода Levivirus c наполнением | |||
| Воздух | Вода | 40% спирт | |
| Длина (нм) | 122.5±22.3 | 122.6±28.5 | 103±72 |
| Ширина (нм) | 127±21.3 | 156±32.6 | 126±35.3 |
Пример 6. Изотопный анализ обнаружения стабильного изотопа (см. фигуру 8A и 8B).
Изотопный анализ обнаружения иона проводили согласно (Good Practice Guide for isotope ratio mass spectrometry 2011, first edition; а также Park S.K., Venable J.D., Tao Xu, John R. Yates III. A quantitative analysis software tool for mass spectrometry– based proteomics//Nat Methods. 2008; v.5(№4), pp. 319–322 и Ilbeigi V., Y. Valadbeigi, M. Tabrizchi. Ion Mobility Spectrometry of Heavy Metals//Anal. Chem. 2016, v.88 (№14), pp. 7324-7328).
Пример 7. Токсичность (мг/кг) препаратов и солей металлов определяли для мышей (DCL; согласно ISO/IEC 17025:2017 [General requirements for the competence of testing and calibration laboratories] и ГОСТ ИСО/МЭК 17025- 2009), а так же для культур клеток (d aggl ). Токсичность препаратов и солей металлов для мышей приведена в Таблице 3.
Таблица 3
| Препарат | DCL (мкг/дл) | in 10 8 particles (нг/дл) | Therapeutic ratio х 10 -7 | d aggl (пг/дл) | dCL/ d aggl |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| цисплатин (цис-Pt(NH 3 ) 2 Cl 2 ) | 3,5 | 0, 5 | 7 | 2 | 5 |
| (NH 4 ) 2 [PtCl 6 ] | 0,1 | 0,02 | 5 | 0,5 | 2 |
| Ru(NO 3 ) 3 | 2,0 | 0,03 | 67 | 1 | 1 |
| AuH 2 Na 3 O 6 S 4 | 0,5 | 0,01 | 50 | 10 | 5 |
| Fe(C 12 H 22 O 11 ) 3 | 25 | 0,01 | 250 | 1 | 5 |
| AgNO 3 | 9 | 0,05 | 180 | 2 | 1 |
| Cu(NO 3 ) 2 | 15 | 0,6 | 25 | 3 | 1 |
| Zn(NO 3 ) 2 | 5 | 0,1 | 50 | 1 | 0,5 |
| Ga(NO 3 ) 3 | 35 | 3,8 | 9,2 | 20 | 8 |
| NaVO 3 | 2,0 | 0,03 | 67 | 1 | 1 |
| Tl 2 (CO 3 ) 3 | 19 | 1,3 | 14,6 | 9 | 0,5 |
| Tl 2 CO 3 | 21 | 1,6 | 13,1 | 12 | 2 |
Пример 8. Адресная доставка частиц фагов рода Levivirus.
Точность доставки качественно определяли методом проточной флуориметрии со смеси клеток, обогащённых интегрином α ν β 3 и лишённых такового (линии PC3 и HEK293). С этой целью готовили смеси клеток с интегрином и без него в различных соотношениях (1:10; 1:20 и 1:40) в титре 10 7 /мл. К клеткам добавляли VLPs рода Levivirus c наполнением, а через 3 часа флуоресцентный краситель 4’,6-диамиидно-2-фенилиндол (DAPI) для окрашивания мёртвых клеток. Полученные результаты суммированы на фигуре 9 и в Таблице 4. Расчётные коэффициенты корреляции летальным эффектом частиц VLPs рода Levivirus c наполнением так же приведены в Таблице 4.
Таблица 4
| Препарат наполнения и коэффициент корреляции, полученный в экспериментах с линией РС3 в смеси с лигандом iRGD + 6APA |
Соотношение log титров клеток PC3/HEK293 | % гибели НЕК293 в смеси с лигандом iRGD + 6APA | % гибели РС3 в смеси с лигандом iRGD + 6APA | % гибели НЕК293 в смеси с лигандом 6APA | % гибели РС3 в смеси с лигандом 6APA |
| цисплатин (цис-Pt(NH 3 ) 2 Cl 2 ) R= 0,90 |
1 | 7±5 | 95 | 7±5 | 10±5 |
| 2 | 88 | ||||
| 3 | 82 | ||||
| (NH 4 ) 2 [PtCl 6 ] R= 0,92 |
1 | 95 | |||
| 2 | 92 | ||||
| 3 | 90 | ||||
| Ru(NO 3 ) 3 R = 0,75 |
1 | 85 | |||
| 2 | 70 | ||||
| 3 | 55 | ||||
| AuH 2 Na 3 O 6 S 4 R = 0,72 |
1 | 75 | |||
| 2 | 70 | ||||
| 3 | 56 | ||||
| Fe(C 12 H 22 O 11 ) 3 R = 0,65 |
1 | 60 | |||
| 2 | 45 | ||||
| 3 | 22 | ||||
| AgNO 3 R = 0,82 |
1 | 80 | |||
| 2 | 75 | ||||
| 3 | 65 | ||||
| Cu(NO 3 ) 2 R = 0,85 |
1 | 85 | |||
| 2 | 82 | ||||
| 3 | 65 | ||||
| Zn(NO 3 ) 2 R = 0, 6 |
1 | 50 | |||
| 2 | 35 | ||||
| 3 | 20 | ||||
| Ga(NO 3 ) 3 R = 0,75 |
1 | 90 | |||
| 2 | 82 | ||||
| 3 | 75 | ||||
| NaVO 3 R = 0, 65 |
1 | 70 | |||
| 2 | 55 | ||||
| 3 | 40 | ||||
| Tl 2 (CO 3 ) 3 R =0,92 |
1 | 95 | |||
| 2 | 92 | ||||
| 3 | 89 | ||||
| Tl 2 CO 3 R =0,90 |
1 | 95 | |||
| 2 | 85 | ||||
| 3 | 80 |
--->
Перечень последовательностей
<110> СФ БИОТЕХ ЛАБОРАТУВАР ДАНИШМАНЛИК АНОНИМ ШИРКЕТИ
(SF BIOTECH LABORATUVAR DANISMANLIK ANONIM SIRKETI)
<120> СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧАСТИЦ БАКТЕРИОФАГОВ СЕМЕЙСТВА LEVIVIRUS
<130> P1688RU00
<160> 10
<210> 1
<211> 25464
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7::pGA2,6delRep
<400> 1
ctctcacagt gtacggacct aaagttcccc catagggggt acctaaagcc cagccaatca 60
cctaaagtca accttcggtt gaccttgagg gttccctaag ggttggggat gacccttggg 120
tttgtctttg ggtgttacct tgagtgtctc tctgtgtccc tatctgttac agtctcctaa 180
agtatcctcc taaagtcacc tcctaacgtc catcctaaag ccaacaccta aagcctacac 240
ctaaagaccc atcaagtcaa cgcctatctt aaagtttaaa cataaagacc agacctaaag 300
accagaccta aagacactac ataaagacca gacctaaaga cgccttgttg ttagccataa 360
agtgataacc tttaatcatt gtctttatta atacaactca ctataaggag agacaactta 420
aagagactta aaagattaat ttaaaattta tcaaaaagag tattgactta aagtctaacc 480
tataggatac ttacagccat cgagagggac acggcgaata gccatcccaa tcgacaccgg 540
ggtcaaccgg ataagtagac agcctgataa gtcgcacgaa aaacaggtat tgacaacatg 600
aagtaacatg cagtaagata caaatcgcta ggtaacacta gcagcgtcaa ccgggcgcac 660
agtgccttct aggtgactta agcgcaccac ggcacataag gtgaaacaaa acggttgaca 720
acatgaagta aacacggtac gatgtaccac atgaaacgac agtgagtcac cacactgaga 780
atcataggtt gtatgcatgg ttcatccgaa ccggatttga gaaactggaa atcgccaacc 840
ccccagttca ctcaaggagc ccggccggat gaacacccat aagcatgccc gattgacctt 900
cctacgtcga ctcgaaatgg tccagcaatt gatcgcccat caagtttgtg tgcctgaagc 960
ggcccgcgcc tatggggtca ccgcgccgac tgtgcgcaaa tggctgggcc gcttcctggc 1020
tcagggccag gcgggcttgg ccgatgcgtc ctcgcgcccg acggtctcgc cccgagcgat 1080
tgcgccggcc aaggcgctgg ctatcgtgga gctgcgccgc aagcggctga cccaagcgcg 1140
catcgcccag gcgctgggcg tgtcagccag caccgtcagc cgcgtcctgg cccgcgccgg 1200
tctgtcgcac ctggccgacc tggagccggc cgagccggtg gtgcgctacg agcatcaggc 1260
ccccggcgat ctgctgcaca tcgacatcaa gaagctggga cgtatccagc gccctggcca 1320
ccgggtcacg ggcaaccgac gcgataccgt tgagggggcc ggctgggact tcgtcttcgt 1380
ggccatcgat gaccacgccc gcgtggcctt caccgacatc caccccgacg agcgcttccc 1440
cagcgccgtc cagttcctca aggacgcagt ggcctactac cagcgcctgg gcgtgaccat 1500
ccagcgcttg ctcaccgaca atggctcggc ctttcgcagc cgcgccttcg ccgcgctgtg 1560
ccatgagctg ggcatcaagc accgctttac ccgaccttac cgcccacaga ccaatggcaa 1620
ggccgaacgc ttcatccagt cggccttgcg tgagtgggct tacgctcaca cctaccagaa 1680
ctcccaacac cgagccgatg ccatgaaatc ctggctacac cactacaact ggcatcgacc 1740
ccaccaaggc atcgggcgcg ctgtacccat ctccagactc aacctggacg aatacaacct 1800
attgaatctt cacagctagt cggattagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg 1860
aggggttttt tgcccgggta ccgagctcga attcactggc cgtcgtttta cgggtaccga 1920
gctcgaattc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa 1980
ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga 2040
gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt 2100
gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct 2160
cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 2220
cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 2280
acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 2340
ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 2400
ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 2460
gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 2520
gcgtggcgct ttctcaaagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 2580
ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 2640
actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 2700
gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 2760
ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 2820
ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 2880
gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 2940
tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttac gtttcggtga 3000
tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc 3060
ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg 3120
ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga 3180
aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct 3240
gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 3300
agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 3360
ttgtaaaacg acggccagtg ccaagcttgc atgcctgcag gtcgactcta gaggatcccc 3420
caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcttgcatg cctgcaggtc gactctagac 3480
tcccgcgaaa ttaatacgac tcactatagg atgatggaga cggtcgggtc caggatcgct 3540
aggaatggtt tgcataagcg gcttaattct gcagtcgttc caccatgccg ttaggtttag 3600
gtgacggtat gtccacatac cggaggatct atgtttccga agtcaaatat agacagaaat 3660
tacaaggtta aacttatatc ttacgacaag aaagggaagc ttgtttccga cgactctttt 3720
gagcaagtcg aaaactatct ctttcaaaat cgttcgacta cgtataaacc tggttacatc 3780
cgtcgtgact ttcgaagacc aacgaacttc tggaacggct atcgctgttt caatcagcca 3840
gttggtacct tcactcggaa actctctgat ggtgggagac aagtcgctga ttatggtatc 3900
gtaaacccta ataagtttac tgccaatagc cagcacttgg gggataacat ggtaatttac 3960
cctggtccct tttctataaa tattgatcag cgtgcttccg ttgaagtcct caacaagctc 4020
tcgcaatcta acctcaatat tggggttgca attgctgaag ccaagatgac tgcttcgtta 4080
ctcgctaaac aatctatagc tctcatcaga gcctacactg ctgcaaagcg cggtaattgg 4140
cgagaggtgc tttctcagct cctcatctcc gaacaccgtt tcagagctcc tgctaaggat 4200
ctcggaggtc gatggctcga actgcagtac ggctggctac cccttatgag tgatttgaaa 4260
gctgcatatg atttgcttac gcaaaccaaa ttgcctgctt tcatgccctt aagggttacc 4320
cgcaccgttg gcggaacgca caattacaaa gtgcgcaacg tcgaatctgc aggggatact 4380
tggtcctata ggcaccgctt gtcggtgaat taccgaatat ggtatttcat ttccgacccg 4440
cgcctcgcat gggctagttc cctcgggctt cttaaccctt tagaaatcta ttgggagaag 4500
acgccctggt cgttcgttgt tgactggttc ttacctgtcg gtaatcttat agaagccatg 4560
agtaatcctc ttggcctcga tattatttcc ggcacgaaga cttggcaact cgaatcaaaa 4620
cttaatgcga cgcttccggc ttcgggttgg tctggaactg caaagttgac tgcatacgcg 4680
aaagcatatg acagatcgac tttctattcc tttcccactc ctttgccgta cgtgaaatcc 4740
ccacttagtg ggcttcactt agcgaatgca ttagccttaa tcaaccaacg cctgaaaagg 4800
taattacgga gttagccata tggcaacttt acgcagtttc gtactcgtcg ataatggcgg 4860
tacggggaat gttactgtcg ttcctgttag caatgccaac ggcgtcgctg agtggctttc 4920
taataactcg cgcagtcagg cttatcgcgt gactgccagt tatcgtgcgt caggcgcgga 4980
caagcgcaaa tatgccatta aacttgaagt accgaaaatc gttacccaag ttgtaaatgg 5040
tgttgagctg cctggttccg catggaaggc ttatgcctct atcgacctga ccatccctat 5100
ctttgctgca accgacgacg tgactgttat ttccaagtcg ctcgccggcc tgttcaaagt 5160
tgggaaccct atcgctgaag ctatctcttc acagagtggc ttctacgcgt aatgggtctg 5220
aaagcaaaac ataaggaaaa cctatgttcc gattcagaga gatcgaaaag actctatgta 5280
tggatcgcac tcgcgattgt gctgtccgat tttaggatct aggtgtgaag atgtgttatg 5340
agccatattc aacgggaaac gtcttgctcg aggccgcgat taaattccaa catggatgct 5400
gatttatatg ggtataaatg ggctcgcgat aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat 5460
cgattgtatg ggaagcccga tgcgccagag ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt 5520
gccaatgatg ttacagatga gatggtcaga ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt 5580
ccgaccatca agcattttat ccgtactcct gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc 5640
cccgggaaaa cagcattcca ggtattagaa gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt 5700
gatgcgctgg cagtgttcct gcgccggttg cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt 5760
aacagcgatc gcgtatttcg tctcgctcag gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt 5820
gatgcgagtg attttgatga cgagcgtaat ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa 5880
atgcataagc ttttgccatt ctcaccggat tcagtcgtca ctcatggtga tttctcactt 5940
gataacctta tttttgacga ggggaaatta ataggttgta ttgatgttgg acgagtcgga 6000
atcgcagacc gataccagga tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga gttttctcct 6060
tcattacaga aacggctttt tcaaaaatat ggtattgata atcctgatat gaataaattg 6120
cagtttcatt tgatgctcga tgagtttttc taatcagaat cataggttgt atgcatggtt 6180
catccgaacc ggatttgaga aactggaaat cgccaacccc ccagttcact caaggagccc 6240
ggccggatga acacccataa gcatgcccga ttgaccttcc tacgtcgact cgaaatggtc 6300
cagcaattga tcgcccatca agtttgtgtg cctgaagcgg cccgcgccta tggggtcacc 6360
gcgccgactg tgcgcaaatg gctgggccgc ttcctggctc agggccaggc gggcttggcc 6420
gatgcgtcct cgcgcccgac ggtctcgccc cgagcgattg cgccggccaa ggcgctggct 6480
atcgtggagc tgcgccgcaa gcggctgacc caagcgcgca tcgcccaggc gctgggcgtg 6540
tcagccagca ccgtcagccg cgtcctggcc cgcgccggtc tgtcgcacct ggccgacctg 6600
gagccggccg agccggtggt gcgctacgag catcaggccc ccggcgatct gctgcacatc 6660
gacatcaaga agctgggacg tatccagcgc cctggccacc gggtcacggg caaccgacgc 6720
gataccgttg agggggccgg ctgggacttc gtcttcgtgg ccatcgatga ccacgcccgc 6780
gtggccttca ccgacatcca ccccgacgag cgcttcccca gcgccgtcca gttcctcaag 6840
gacgcagtgg cctactacca gcgcctgggc gtgaccatcc agcgcttgct caccgacaat 6900
ggctcggcct ttcgcagccg cgccttcgcc gcgctgtgcc atgagctggg catcaagcac 6960
cgctttaccc gaccttaccg cccacagacc aatggcaagg ccgaacgctt catccagtcg 7020
gccttgcgtg agtgggctta cgctcacacc taccagaact cccaacaccg agccgatgcc 7080
atgaaatcct ggctacacca ctacaactgg catcgacccc accaaggcat cgggcgcgct 7140
gtacccatct ccagactcaa cctggacgaa tacaacctat tgaatcttca cagctagctg 7200
aaaggtgatg cggtctaacg aaacctgacc taagacgctc tttaacaatc tggtaaatag 7260
ctcttgagtg catgactagc ggataactca agggtatcgc aaggtgccct ttatgatatt 7320
cactaataac tgcacgaggt aacacaagat ggctatgtct aacatgactt acaacaacgt 7380
tttcgaccac gcttacgaaa tgctgaaaga aaacatccgt tatgatgaca tccgtgacac 7440
tgatgacctg cacgatgcta ttcacatggc tgccgataat gcagttccgc actactacgc 7500
tgacatcttt agcgtaatgg caagtgaggg cattgacctt gagttcgaag actctggtct 7560
gatgcctgac accaaggacg taatccgcat cctgcaagcg cgtatctatg agcaattaac 7620
gattgacctc tgggaagacg cagaagactt gctcaatgaa tacttggagg aagtcgagga 7680
gtacgaggag gatgaagagt aatgtctact accaacgtgc aatacggtct gaccgctcaa 7740
actgtacttt tctatagcga catggtgcgc tgtggcttta actggtcact cgcaatggca 7800
cagctcaaag aactgtacga aaacaacaag gcaatagctt tagaatctgc tgagtgatag 7860
actcaaggtc gctcctagcg agtggccttt atgattatca ctttacttat gagggagtaa 7920
tgtatatgct tactatcggt ctactcaccg ctctaggtct agctgtaggt gcatcctttg 7980
ggaaggcttt aggtgtagct gtaggttcct actttaccgc ttgcatcatc ataggaatca 8040
tcaaaggggc actacgcaaa tgatgaagca ctacgttatg ccaatccaca cgtccaacgg 8100
ggcaaccgta tgtacacctg atgggttcgc aatgaaacaa cgaatcgaac gccttaagcg 8160
tgaactccgc attaaccgca agattaacaa gataggttcc ggctatgaca gaacgcactg 8220
atggcttaaa gaaaggttat atgcccaatg gcacactata cgctgcaaat cggcgaatag 8280
tgagaacttg gcgagagaac aacctcgaac gccgcaagga caagagaggg cggcgtggca 8340
tagacgaaag gaaaaggtta aagccaagaa actcgccgca cttgaacagg cactagccaa 8400
cacactgaac gctatctcat aacgaacata aaggacacaa tgcaatgaac attaccgaca 8460
tcatgaacgc tatcgacgca atcaaagcac tgccaatctg tgaacttgac aagcgtcaag 8520
gtatgcttat cgacttactg gtcgagatgg tcaacagcga gacgtgtgat ggcgagctaa 8580
ccgaactaaa tcaggcactt gagcatcaag attggtggac taccttgaag tgtctcacgg 8640
ctgacgcagg gttcaagatg ctcggtaatg gtcacttctc ggctgcttat agtcacccgc 8700
tgctacctaa cagagtgatt aaggtgggct ttaagaaaga ggattcaggc gcagcctata 8760
ccgcattctg ccgcatgtat cagggtcgtc ctggtatccc taacgtctac gatgtacagc 8820
gccacgctgg atgctatacg gtggtacttg acgcacttaa ggattgcgag cgtttcaaca 8880
atgatgccca ttataaatac gctgagattg caagcgacat cattgattgc aattcggatg 8940
agcatgatga gttaactgga tgggatggtg agtttgttga aacttgtaaa ctaatccgca 9000
agttctttga gggcatcgcc tcattcgaca tgcatagcgg gaacatcatg ttctcaaatg 9060
gagacgtacc atacatcacc gacccggtat cattctcgca gaagaaagac ggtggcgcat 9120
tcagcatcga ccctgaggaa ctcatcaagg aagtcgagga agtcgcacga cagaaagaaa 9180
ttgaccgcgc taaggcccgt aaagaacgtc acgaggggcg cttagaggca cgcagattca 9240
aacgtcgcaa ccgcaaggca cgtaaagcac acaaagctaa gcgcgaaaga atgcttgctg 9300
cgtggcgatg ggctgaacgt caagaacggc gtaaccatga ggtagctgta gatgtactag 9360
gaagaaccaa taacgctatg ctctgggtca acatgttctc tggggacttt aaggcgcttg 9420
aggaacgaat cgcgctgcac tggcgtaatg ctgaccggat ggctatcgct aatggtctta 9480
cgctcaacat tgataagcaa cttgacgcaa tgttaatggg ctgatagtct tatcttacag 9540
gtcatctgcg ggtggcctga ataggtacga tttactaact ggaagaggca ctaaatgaac 9600
acgattaaca tcgctaagaa cgacttctct gacatcgaac tggctgctat cccgttcaac 9660
actctggctg accattacgg tgagcgttta gctcgcgaac agttggccct tgagcatgag 9720
tcttacgaga tgggtgaagc acgcttccgc aagatgtttg agcgtcaact taaagctggt 9780
gaggttgcgg ataacgctgc cgccaagcct ctcatcacta ccctactccc taagatgatt 9840
gcacgcatca acgactggtt tgaggaagtg aaagctaagc gcggcaagcg cccgacagcc 9900
ttccagttcc tgcaagaaat caagccggaa gccgtagcgt acatcaccat taagaccact 9960
ctggcttgcc taaccagtgc tgacaataca accgttcagg ctgtagcaag cgcaatcggt 10020
cgggccattg aggacgaggc tcgcttcggt cgtatccgtg accttgaagc taagcacttc 10080
aagaaaaacg ttgaggaaca actcaacaag cgcgtagggc acgtctacaa gaaagcattt 10140
atgcaagttg tcgaggctga catgctctct aagggtctac tcggtggcga ggcgtggtct 10200
tcgtggcata aggaagactc tattcatgta ggagtacgct gcatcgagat gctcattgag 10260
tcaaccggaa tggttagctt acaccgccaa aatgctggcg tagtaggtca agactctgag 10320
actatcgaac tcgcacctga atacgctgag gctatcgcaa cccgtgcagg tgcgctggct 10380
ggcatctctc cgatgttcca accttgcgta gttcctccta agccgtggac tggcattact 10440
ggtggtggct attgggctaa cggtcgtcgt cctctggcgc tggtgcgtac tcacagtaag 10500
aaagcactga tgcgctacga agacgtttac atgcctgagg tgtacaaagc gattaacatt 10560
gcgcaaaaca ccgcatggaa aatcaacaag aaagtcctag cggtcgccaa cgtaatcacc 10620
aagtggaagc attgtccggt cgaggacatc cctgcgattg agcgtgaaga actcccgatg 10680
aaaccggaag acatcgacat gaatcctgag gctctcaccg cgtggaaacg tgctgccgct 10740
gctgtgtacc gcaaggacaa ggctcgcaag tctcgccgta tcagccttga gttcatgctt 10800
gagcaagcca ataagtttgc taaccataag gccatctggt tcccttacaa catggactgg 10860
cgcggtcgtg tttacgctgt gtcaatgttc aacccgcaag gtaacgatat gaccaaagga 10920
ctgcttacgc tggcgaaagg taaaccaatc ggtaaggaag gttactactg gctgaaaatc 10980
cacggtgcaa actgtgcggg tgtcgataag gttccgttcc ctgagcgcat caagttcatt 11040
gaggaaaacc acgagaacat catggcttgc gctaagtctc cactggagaa cacttggtgg 11100
gctgagcaag attctccgtt ctgcttcctt gcgttctgct ttgagtacgc tggggtacag 11160
caccacggcc tgagctataa ctgctccctt ccgctggcgt ttgacgggtc ttgctctggc 11220
atccagcact tctccgcgat gctccgagat gaggtaggtg gtcgcgcggt taacttgctt 11280
cctagtgaaa ccgttcagga catctacggg attgttgcta agaaagtcaa cgagattcta 11340
caagcagacg caatcaatgg gaccgataac gaagtagtta ccgtgaccga tgagaacact 11400
ggtgaaatct ctgagaaagt caagctgggc actaaggcac tggctggtca atggctggct 11460
tacggtgtta ctcgcagtgt gactaagcgt tcagtcatga cgctggctta cgggtccaaa 11520
gagttcggct tccgtcaaca agtgctggaa gataccattc agccagctat tgattccggc 11580
aagggtctga tgttcactca gccgaatcag gctgctggat acatggctaa gctgatttgg 11640
gaatctgtga gcgtgacggt ggtagctgcg gttgaagcaa tgaactggct taagtctgct 11700
gctaagctgc tggctgctga ggtcaaagat aagaagactg gagagattct tcgcaagcgt 11760
tgcgctgtgc attgggtaac tcctgatggt ttccctgtgt ggcaggaata caagaagcct 11820
attcagacgc gcttgaacct gatgttcctc ggtcagttcc gcttacagcc taccattaac 11880
accaacaaag atagcgagat tgatgcacac aaacaggagt ctggtatcgc tcctaacttt 11940
gtacacagcc aagacggtag ccaccttcgt aagactgtag tgtgggcaca cgagaagtac 12000
ggaatcgaat cttttgcact gattcacgac tccttcggta ccattccggc tgacgctgcg 12060
aacctgttca aagcagtgcg cgaaactatg gttgacacat atgagtcttg tgatgtactg 12120
gctgatttct acgaccagtt cgctgaccag ttgcacgagt ctcaattgga caaaatgcca 12180
gcacttccgg ctaaaggtaa cttgaacctc cgtgacatct tagagtcgga cttcgcgttc 12240
gcgtaacgcc aaatcaatac gactcactat agagggacaa actcaaggtc attcgcaaga 12300
gtggccttta tgattgacct tcttccggtt aatacgactc actataggag aaccttaagg 12360
tttaacttta agacccttaa gtgttaatta gagatttaaa ttaaagaatt actaagagag 12420
gactttaagt atgcgtaact tcgaaaagat gaccaaacgt tctaaccgta atgctcgtga 12480
cttcgaggca accaaaggtc gcaagttgaa taagactaag cgtgaccgct ctcacaagcg 12540
tagctgggag ggtcagtaag atgggacgtt tatatagtgg taatctggca gcattcaagg 12600
cagcaacaaa caagctgttc cagttagact tagcggtcat ttatgatgac tggtatgatg 12660
cctatacaag aaaagattgc atacggttac gtattgagga caggagtgga aacctgattg 12720
atactagcac cttctaccac cacgacgagg acgttctgtt caatatgtgt actgattggt 12780
tgaaccatat gtatgaccag ttgaaggact ggaagtaata cgactcagta tagggacaat 12840
gcttaaggtc gctctctagg agtggcctta gtcatttaac caataggaga taaacattat 12900
gatgaacatt aagactaacc cgtttaaagc cgtgtctttc gtagagtctg ccattaagaa 12960
ggctctggat aacgctgggt atcttatcgc tgaaatcaag tacgatggtg tacgcgggaa 13020
catctgcgta gacaatactg ctaacagtta ctggctctct cgtgtatcta aaacgattcc 13080
ggcactggag cacttaaacg ggtttgatgt tcgctggaag cgtctactga acgatgaccg 13140
ttgcttctac aaagatggct ttatgcttga tggggaactc atggtcaagg gcgtagactt 13200
taacacaggg tccggcctac tgcgtaccaa atggactgac acgaagaacc aagagttcca 13260
tgaagagtta ttcgttgaac caatccgtaa gaaagataaa gttcccttta agctgcacac 13320
tggacacctt cacataaaac tgtacgctat cctcccgctg cacatcgtgg agtctggaga 13380
agactgtgat gtcatgacgt tgctcatgca ggaacacgtt aagaacatgc tgcctctgct 13440
acaggaatac ttccctgaaa tcgaatggca agcggctgaa tcttacgagg tctacgatat 13500
ggtagaacta cagcaactgt acgagcagaa gcgagcagaa ggccatgagg gtctcattgt 13560
gaaagacccg atgtgtatct ataagcgcgg taagaaatct ggctggtgga aaatgaaacc 13620
tgagaacgaa gctgacggta tcattcaggg tctggtatgg ggtacaaaag gtctggctaa 13680
tgaaggtaaa gtgattggtt ttgaggtgct tcttgagagt ggtcgtttag ttaacgccac 13740
gaatatctct cgcgccttaa tggatgagtt cactgagaca gtaaaagagg ccaccctaag 13800
tcaatgggga ttctttagcc catacggtat tggcgacaac gatgcttgta ctattaaccc 13860
ttacgatggc tgggcgtgtc aaattagcta catggaggaa acacctgatg gctctttgcg 13920
gcacccatcg ttcgtaatgt tccgtggcac cgaggacaac cctcaagaga aaatgtaatc 13980
acactggctc accttcgggt gggcctttct gcgtttataa ggagacactt tatgtttaag 14040
aaggttggta aattccttgc ggctttggca gctatcctga cgcttgcgta tattcttgcg 14100
gtataccctc aagtagcact agtagtagtt ggcgcttgtt acttagcggc agtgtgtgct 14160
tgcgtgtgga gtatagttaa ctggtaatac gactcactaa aggaggtaca caccatgatg 14220
tacttaatgc cattactcat cgtcattgta ggatgccttg cgctccactg tagcgatgat 14280
gatatgccag atggtcacgc ttaatacgac tcactaaagg agacactata tgtttcgact 14340
tcattacaac aaaagcgtta agaatttcac ggttcgccgt gctgaccgtt caatcgtatg 14400
tgcgagcgag cgccgagcta agatacctct tattggtaac acagttcctt tggcaccgag 14460
cgtccacatc attatcaccc gtggtgactt tgagaaagca atagacaaga aacgtccggt 14520
tcttagtgtg gcagtgaccc gcttcccgtt cgtccgtctg ttactcaaac gaatcaagga 14580
ggtgttctga tgggactgtt agatggtgaa gcctgggaaa aagaaaaccc gccagtacaa 14640
gcaactgggt gtatagcttg cttagagaaa gatgaccgtt atccacacac ctgtaacaaa 14700
ggagctaacg atatgaccga acgtgaacaa gagatgatca ttaagttgat agacaataat 14760
gaaggtcgcc cagatgattt gaatggctgc ggtattctct gctccaatgt cccttgccac 14820
ctctgccccg caaataacga tcaaaagata accttaggtg aaatccgagc gatggaccca 14880
cgtaaaccac atctgaataa acctgaggta actcctacag atgaccagcc ttccgctgag 14940
acaatcgaag gtgtcactaa gccttcccac tacatgctgt ttgacgacat tgaggctatc 15000
gaagtgattg ctcgttcaat gaccgttgag cagttcaagg gatactgctt cggtaacatc 15060
ttaaagtaca gactacgtgc tggtaagaag tcagagttag cgtacttaga gaaagaccta 15120
gcgaaagcag acttctataa agaactcttt gagaaacata aggataaatg ttatgcataa 15180
cttcaagtca accccacctg ccgacagcct atctgatgac ttcacatctt gctcagagtg 15240
gtgccgaaag atgtgggaag agacattcga cgatgcgtac atcaagctgt atgaactttg 15300
gaaatcgaga ggtcaatgac tatgtcaaac gtaaatacag gttcacttag tgtggacaat 15360
aagaagtttt gggctaccgt agagtcctcg gagcattcct tcgaggttcc aatctacgct 15420
gagaccctag acgaagctct ggagttagcc gaatggcaat acgttccggc tggctttgag 15480
gttactcgtg tgcgtccttg tgtagcaccg aagtaatacg actcactatt agggaagact 15540
ccctctgaga aaccaaacga aacctaaagg agattaacat tatggctaag aagattttca 15600
cctctgcgct gggtaccgct gaaccttacg cttacatcgc caagccggac tacggcaacg 15660
aagagcgtgg ctttgggaac cctcgtggtg tctataaagt tgacctgact attcccaaca 15720
aagacccgcg ctgccagcgt atggtcgatg aaatcgtgaa gtgtcacgaa gaggcttatg 15780
ctgctgccgt tgaggaatac gaagctaatc cacctgctgt agctcgtggt aagaaaccgc 15840
tgaaaccgta tgagggtgac atgccgttct tcgataacgg tgacggtacg actaccttta 15900
agttcaaatg ctacgcgtct ttccaagaca agaagaccaa agagaccaag cacatcaatc 15960
tggttgtggt tgactcaaaa ggtaagaaga tggaagacgt tccgattatc ggtggtggct 16020
ctaagctgaa agttaaatat tctctggttc catacaagtg gaacactgct gtaggtgcga 16080
gcgttaagct gcaactggaa tccgtgatgc tggtcgaact ggctaccttt ggtggcggtg 16140
aagacgattg ggctgacgaa gttgaagaga acggctatgt tgcctctggt tctgccaaag 16200
cgagcaaacc acgcgacgaa gaaagctggg acgaagacga cgaagagtcc gaggaagcag 16260
acgaagacgg agacttctaa gtggaactgc gggagaaaat ccttgagcga atcaaggtga 16320
cttcctctgg gtgttgggag tggcagggcg ctacgaacaa taaagggtac gggcaggtgt 16380
ggtgcagcaa taccggaaag gttgtctact gtcatcgcgt aatgtctaat gctccgaaag 16440
gttctaccgt cctgcactcc tgtgataatc cattatgttg taaccctgaa cacctatcca 16500
taggaactcc aaaagagaac tccactgaca tggtaaataa gggtcgctca cacaaggggt 16560
ataaactttc agacgaagac gtaatggcaa tcatggagtc cagcgagtcc aatgtatcct 16620
tagctcgcac ctatggtgtc tcccaacaga ctatttgtga tatacgcaaa gggaggcgac 16680
atggcaggtt acggcgctaa aggaatccga aaggttggag cgtttcgctc tggcctagag 16740
gacaaggttt caaagcagtt ggaatcaaaa ggtattaaat tcgagtatga agagtggaaa 16800
gtgccttatg taattccggc gagcaatcac acttacactc cagacttctt acttccaaac 16860
ggtatattcg ttgagacaaa gggtctgtgg gaaagcgatg atagaaagaa gcacttatta 16920
attagggagc agcaccccga gctagacatc cgtattgtct tctcaagctc acgtactaag 16980
ttatacaaag gttctccaac gtcttatgga gagttctgcg aaaagcatgg tattaagttc 17040
gctgataaac tgatacctgc tgagtggata aaggaaccca agaaggaggt cccctttgat 17100
agattaaaaa ggaaaggagg aaagaaataa tggctcgtgt acagtttaaa caacgtgaat 17160
ctactgacgc aatctttgtt cactgctcgg ctaccaagcc aagtcagaat gttggtgtcc 17220
gtgagattcg ccagtggcac aaagagcagg gttggctcga tgtgggatac cactttatca 17280
tcaagcgaga cggtactgtg gaggcaggac gagatgagat ggctgtaggc tctcacgcta 17340
agggttacaa ccacaactct atcggcgtct gccttgttgg tggtatcgac gataaaggta 17400
agttcgacgc taactttacg ccagcccaaa tgcaatccct tcgctcactg cttgtcacac 17460
tgctggctaa gtacgaaggc gctgtgcttc gcgcccatca tgaggtggcg ccgaaggctt 17520
gcccttcgtt cgaccttaag cgttggtggg agaagaacga actggtcact tctgaccgtg 17580
gataattaat tgaactcact aaagggagac cacagcggtt tccctttgtt cgcattggag 17640
gtcaaataat gcgcaagtct tataaacaat tctataaggc tccgaggagg catatccaag 17700
tgtgggaggc agccaatggg cctataccaa aaggttatta tatagaccac attgacggca 17760
atccactcaa cgacgcctta gacaatctcc gtctggctct cccaaaagaa aactcatgga 17820
acatgaagac tccaaagagc aatacctcag gactaaaggg actgagttgg agcaaggaaa 17880
gggagatgtg gagaggcact gtaacagctg agggtaaaca gcataacttt cgtagtagag 17940
atctattgga agtcgttgcg tggatttata gaactaggag ggaattgcat ggacaattcg 18000
cacgattccg atagtgtatt tctttaccac attccttgtg acaactgtgg gagtagtgat 18060
gggaactcgc tgttctctga cggacacacg ttctgctacg tatgcgagaa gtggactgct 18120
ggtaatgaag acactaaaga gagggcttca aaacggaaac cctcaggagg taaaccaatg 18180
acttacaacg tgtggaactt cggggaatcc aatggacgct actccgcgtt aactgcgaga 18240
ggaatctcca aggaaacctg tcagaaggct ggctactgga ttgccaaagt agacggtgtg 18300
atgtaccaag tggctgacta tcgggaccag aacggcaaca ttgtgagtca gaaggttcga 18360
gataaagata agaactttaa gaccactggt agtcacaaga gtgacgctct gttcgggaag 18420
cacttgtgga atggtggtaa gaagattgtc gttacagaag gtgaaatcga catgcttacc 18480
gtgatggaac ttcaagactg taagtatcct gtagtgtcgt tgggtcacgg tgcctctgcc 18540
gctaagaaga catgcgctgc caactacgaa tactttgacc agttcgaaca gattatctta 18600
atgttcgata tggacgaagc agggcgcaaa gcagtcgaag aggctgcaca ggttctacct 18660
gctggtaagg tacgagtggc agttcttccg tgtaaggatg caaacgagtg tcacctaaat 18720
ggtcacgacc gtgaaatcat ggagcaagtg tggaatgctg gtccttggat tcctgatggt 18780
gtggtatcgg ctctttcgtt acgtgaacga atccgtgagc acctatcgtc cgaggaatca 18840
gtaggtttac ttttcagtgg ctgcactggt atcaacgata agaccttagg tgcccgtggt 18900
ggtgaagtca ttatggtcac ttccggttcc ggtatgggta agtcaacgtt cgtccgtcaa 18960
caagctctac aatggggcac agcgatgggc aagaaggtag gcttagcgat gcttgaggag 19020
tccgttgagg agaccgctga ggaccttata ggtctacaca accgtgtccg actgagacaa 19080
tccgactcac taaagagaga gattattgag aacggtaagt tcgaccaatg gttcgatgaa 19140
ctgttcggca acgatacgtt ccatctatat gactcattcg ccgaggctga gacggataga 19200
ctgctcgcta agctggccta catgcgctca ggcttgggct gtgacgtaat cattctagac 19260
cacatctcaa tcgtcgtatc cgcttctggt gaatccgatg agcgtaagat gattgacaac 19320
ctgatgacca agctcaaagg gttcgctaag tcaactgggg tggtgctggt cgtaatttgt 19380
caccttaaga acccagacaa aggtaaagca catgaggaag gtcgccccgt ttctattact 19440
gacctacgtg gttctggcgc actacgccaa ctatctgata ctattattgc ccttgagcgt 19500
aatcagcaag gcgatatgcc taaccttgtc ctcgttcgta ttctcaagtg ccgctttact 19560
ggtgatactg gtatcgctgg ctacatggaa tacaacaagg aaaccggatg gcttgaacca 19620
tcaagttact caggggaaga agagtcacac tcagagtcaa cagactggtc caacgacact 19680
gacttctgac aggattcttg atgactttcc agacgactac gagaagtttc gctggagagt 19740
cccattctaa tacgactcac taaaggagac acaccatgtt caaactgatt aagaagttag 19800
gccaactgct ggttcgtatg tacaacgtgg aagccaagcg actgaacgat gaggctcgta 19860
aagaggccac acagtcacgc gctctggcga ttcgctccaa cgaactggct gacagtgcat 19920
ccactaaagt taccgaggct gcccgtgtgg caaaccaagc tcaacagctt tccaaattct 19980
ttgagtaatc aaacaggaga aaccattatg tctaacgtag ctgaaactat ccgtctatcc 20040
gatacagctg accagtggaa ccgtcgagtc cacatcaacg ttcgcaacgg taaggcgact 20100
atggtttacc gctggaagga ctctaagtcc tctaagaatc acactcagcg tatgacgttg 20160
acagatgagc aagcactgcg tctggtcaat gcgcttacca aagctgccgt gacagcaatt 20220
catgaagctg gtcgcgtcaa tgaagctatg gctatcctcg acaagattga taactaagag 20280
tggtatcctc aaggtcgcca aagtggtggc cttcatgaat actattcgac tcactatagg 20340
agatattacc atgcgtgacc ctaaagttat ccaagcagaa atcgctaaac tggaagctga 20400
actggaggac gttaagtacc atgaagctaa gactcgctcc gctgttcaca tcttgaagaa 20460
cttaggctgg acttggacaa gacagactgg ctggaagaaa ccagaagtta ccaagctgag 20520
tcataaggtg ttcgataagg acactatgac ccacatcaag gctggtgatt gggttaaggt 20580
tgacatggga gttgttggtg gatacggcta cgtccgctca gttagtggca aatatgcaca 20640
agtgtcatac atcacaggtg ttactccacg cggtgcaatc gttgccgata agaccaacat 20700
gattcacaca ggtttcttga cagttgtttc atatgaagag attgttaagt cacgataatc 20760
aataggagaa atcaatatga tcgtttctga catcgaagct aacgccctct tagagagcgt 20820
cactaagttc cactgcgggg ttatctacga ctactccacc gctgagtacg taagctaccg 20880
tccgagtgac ttcggtgcgt atctggatgc gctggaagcc gaggttgcac gaggcggtct 20940
tattgtgttc cacaacggtc acaagtatga cgttcctgca ttgaccaaac tggcaaagtt 21000
gcaattgaac cgagagttcc accttcctcg tgagaactgt attgacaccc ttgtgttgtc 21060
acgtttgatt cattccaacc tcaaggacac cgatatgggt cttctgcgtt ccggcaagtt 21120
gcccggaaaa cgctttgggt ctcacgcttt ggaggcgtgg ggttatcgct taggcgagat 21180
gaagggtgaa tacaaagacg actttaagcg tatgcttgaa gagcagggtg aagaatacgt 21240
tgacggaatg gagtggtgga acttcaacga agagatgatg gactataacg ttcaggacgt 21300
tgtggtaact aaagctctcc ttgagaagct actctctgac aaacattact tccctcctga 21360
gattgacttt acggacgtag gatacactac gttctggtca gaatcccttg aggccgttga 21420
cattgaacat cgtgctgcat ggctgctcgc taaacaagag cgcaacgggt tcccgtttga 21480
cacaaaagca atcgaagagt tgtacgtaga gttagctgct cgccgctctg agttgctccg 21540
taaattgacc gaaacgttcg gctcgtggta tcagcctaaa ggtggcactg agatgttctg 21600
ccatccgcga acaggtaagc cactacctaa ataccctcgc attaagacac ctaaagttgg 21660
tggtatcttt aagaagccta agaacaaggc acagcgagaa ggccgtgagc cttgcgaact 21720
tgatacccgc gagtacgttg ctggtgctcc ttacacccca gttgaacatg ttgtgtttaa 21780
cccttcgtct cgtgaccaca ttcagaagaa actccaagag gctgggtggg tcccgaccaa 21840
gtacaccgat aagggtgctc ctgtggtgga cgatgaggta ctcgaaggag tacgtgtaga 21900
tgaccctgag aagcaagccg ctatcgacct cattaaagag tacttgatga ttcagaagcg 21960
aatcggacag tctgctgagg gagacaaagc atggcttcgt tatgttgctg aggatggtaa 22020
gattcatggt tctgttaacc ctaatggagc agttacgggt cgtgcgaccc atgcgttccc 22080
aaaccttgcg caaattccgg gtgtacgttc tccttatgga gagcagtgtc gcgctgcttt 22140
tggcgctgag caccatttgg atgggataac tggtaagcct tgggttcagg ctggcatcga 22200
cgcatccggt cttgagctac gctgcttggc tcacttcatg gctcgctttg ataacggcga 22260
gtacgctcac gagattctta acggcgacat ccacactaag aaccagatag ctgctgaact 22320
acctacccga gataacgcta agacgttcat ctatgggttc ctctatggtg ctggtgatga 22380
gaagattgga cagattgttg gtgctggtaa agagcgcggt aaggaactca agaagaaatt 22440
ccttgagaac acccccgcga ttgcagcact ccgcgagtct atccaacaga cacttgtcga 22500
gtcctctcaa tgggtagctg gtgagcaaca agtcaagtgg aaacgccgct ggattaaagg 22560
tctggatggt cgtaaggtac acgttcgtag tcctcacgct gccttgaata ccctactgca 22620
atctgctggt gctctcatct gcaaactgtg gattatcaag accgaagaga tgctcgtaga 22680
gaaaggcttg aagcatggct gggatgggga ctttgcgtac atggcatggg tacatgatga 22740
aatccaagta ggctgccgta ccgaagagat tgctcaggtg gtcattgaga ccgcacaaga 22800
agcgatgcgc tgggttggag accactggaa cttccggtgt cttctggata ccgaaggtaa 22860
gatgggtcct aattgggcga tttgccactg atacgtagtg tctactcaat ccaatcgtaa 22920
tgcgctcgta gtggcgcaac tgaaaggaga cttcgtggcg ttcctattcg tcttatggaa 22980
ggcgctaaac ctaccggtgc ccactaagtg tcagattgac atggctaagg tgctggcgaa 23040
tggagacaac aagaagttca tcttacaggc tttccgtggt atcggtaagt cgttcatcac 23100
atgtgcgttc gttgtgtggt ccttatggag agaccctcag ttgaagatac ttatcgtatc 23160
agcctctaag gagcgtgcag acgctaactc catctttatt aagaacatca ttgacctgct 23220
gccattccta tctgagttaa agccaagacc cggacagcgt gactcggtaa tcagctttga 23280
tgtaggccca gccaatcctg accactctcc tagtgtgaaa tcagtaggta tcactggtca 23340
gttaactggt agccgtgctg acattatcat tgcggatgac gttgagattc cgtctaacag 23400
cgcaactatg ggtgcccgtg agaagctatg gactctggtt caggagttcg ctgcgttact 23460
taaaccgctg ccttcctctc gcgttatcta ccttggtaca cctcagacag agatgactct 23520
ctataaggaa cttgaggata accgtgggta cacaaccatt atctggcctg ctctgtaccc 23580
aaggacacgt gaagagaacc tctattactc acagcgtctt gctcctatgt tacgcgctga 23640
gtacgatgag aaccctgagg cacttgctgg gactccaaca gacccagtgc gctttgaccg 23700
tgatgacctg cgcgagcgtg agttggaata cggtaaggct ggctttacgc tacagttcat 23760
gcttaaccct aaccttagtg atgccgagaa gtacccgctg aggcttcgtg acgctatcgt 23820
agcggcctta gacttagaga aggccccaat gcattaccag tggcttccga accgtcagaa 23880
catcattgag gaccttccta acgttggcct taagggtgat gacctgcata cgtaccacga 23940
ttgttccaac aactcaggtc agtaccaaca gaagattctg gtcattgacc ctagtggtcg 24000
cggtaaggac gaaacaggtt acgctgtgct gtacacactg aacggttaca tctaccttat 24060
ggaagctgga ggtttccgtg atggctactc cgataagacc cttgagttac tcgctaagaa 24120
ggcaaagcaa tggggagtcc agacggttgt ctacgagagt aacttcggtg acggtatgtt 24180
cggtaaggta ttcagtccta tccttcttaa acaccacaac tgtgcgatgg aagagattcg 24240
tgcccgtggt atgaaagaga tgcgtatttg cgataccctt gagccagtca tgcagactca 24300
ccgccttgta attcgtgatg aggtcattag ggccgactac cagtccgctc gtgacgtaga 24360
cggtaagcat gacgttaagt actcgttgtt ctaccagatg acccgtatca ctcgtgagaa 24420
aggcgctctg gctcatgatg accgattgga tgcccttgcg ttaggcattg agtatctccg 24480
tgagtccatg cagttggatt ccgttaaggt cgagggtgaa gtacttgctg acttccttga 24540
ggaacacatg atgcgtccta cggttgctgc tacgcatatc attgagatgt ctgtgggagg 24600
agttgatgtg tactctgagg acgatgaggg ttacggtacg tctttcattg agtggtgatt 24660
tatgcattag gactgcatag ggatgcacta tagaccacgg atggtcagtt ctttaagtta 24720
ctgaaaagac acgataaatt aatacgactc actataggga gaggagggac gaaaggttac 24780
tatatagata ctgaatgaat acttatagag tgcataaagt atgcataatg gtgtacctag 24840
agtgacctct aagaatggtg attatattgt attagtatca ccttaactta aggaccaaca 24900
taaagggagg agactcatgt tccgcttatt gttgaaccta ctgcggcata gagtcaccta 24960
ccgatttctt gtggtacttt gtgctgccct tgggtacgca tctcttactg gagacctcag 25020
ttcactggag tctgtcgttt gctctatact cacttgtagc gattagggtc ttcctgaccg 25080
actgatggct caccgaggga ttcagcggta tgattgcatc acaccacttc atccctatag 25140
agtcaagtcc taaggtatac ccataaagag cctctaatgg tctatcctaa ggtctatacc 25200
taaagatagg ccatcctatc agtgtcacct aaagagggtc ttagagaggg cctatggagt 25260
tcctataggg tcctttaaaa tataccataa aaatctgagt gactatctca cagtgtacgg 25320
acctaaagtt cccccatagg gggtacctaa agcccagcca atcacctaaa gtcaaccttc 25380
ggttgacctt gagggttccc taagggttgg ggatgaccct tgggtttgtc tttgggtgtt 25440
accttgagtg tctctctgtg tccc 25464
<210> 2
<211> 25452
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7::pMS3,6delRep
<400> 2
tctcacagtg tacggaccta aagttccccc atagggggta cctaaagccc agccaatcac 60
ctaaagtcaa ccttcggttg accttgaggg ttccctaagg gttggggatg acccttgggt 120
ttgtctttgg gtgttacctt gagtgtctct ctgtgtccct atctgttaca gtctcctaaa 180
gtatcctcct aaagtcacct cctaacgtcc atcctaaagc caacacctaa agcctacacc 240
taaagaccca tcaagtcaac gcctatctta aagtttaaac ataaagacca gacctaaaga 300
ccagacctaa agacactaca taaagaccag acctaaagac gccttgttgt tagccataaa 360
gtgataacct ttaatcattg tctttattaa tacaactcac tataaggaga gacaacttaa 420
agagacttaa aagattaatt taaaatttat caaaaagagt attgacttaa agtctaacct 480
ataggatact tacagccatc gagagggaca cggcgaatag ccatcccaat cgacaccggg 540
gtcaaccgga taagtagaca gcctgataag tcgcacgaaa aacaggtatt gacaacatga 600
agtaacatgc agtaagatac aaatcgctag gtaacactag cagcgtcaac cgggcgcaca 660
gtgccttcta ggtgacttaa gcgcaccacg gcacataagg tgaaacaaaa cggttgacaa 720
catgaagtaa acacggtacg atgtaccaca tgaaacgaca gtgagtcacc acactgagaa 780
tcataggttg tatgcatggt tcatccgaac cggatttgag aaactggaaa tcgccaaccc 840
cccagttcac tcaaggagcc cggccggatg aacacccata agcatgcccg attgaccttc 900
ctacgtcgac tcgaaatggt ccagcaattg atcgcccatc aagtttgtgt gcctgaagcg 960
gcccgcgcct atggggtcac cgcgccgact gtgcgcaaat ggctgggccg cttcctggct 1020
cagggccagg cgggcttggc cgatgcgtcc tcgcgcccga cggtctcgcc ccgagcgatt 1080
gcgccggcca aggcgctggc tatcgtggag ctgcgccgca agcggctgac ccaagcgcgc 1140
atcgcccagg cgctgggcgt gtcagccagc accgtcagcc gcgtcctggc ccgcgccggt 1200
ctgtcgcacc tggccgacct ggagccggcc gagccggtgg tgcgctacga gcatcaggcc 1260
cccggcgatc tgctgcacat cgacatcaag aagctgggac gtatccagcg ccctggccac 1320
cgggtcacgg gcaaccgacg cgataccgtt gagggggccg gctgggactt cgtcttcgtg 1380
gccatcgatg accacgcccg cgtggccttc accgacatcc accccgacga gcgcttcccc 1440
agcgccgtcc agttcctcaa ggacgcagtg gcctactacc agcgcctggg cgtgaccatc 1500
cagcgcttgc tcaccgacaa tggctcggcc tttcgcagcc gcgccttcgc cgcgctgtgc 1560
catgagctgg gcatcaagca ccgctttacc cgaccttacc gcccacagac caatggcaag 1620
gccgaacgct tcatccagtc ggccttgcgt gagtgggctt acgctcacac ctaccagaac 1680
tcccaacacc gagccgatgc catgaaatcc tggctacacc actacaactg gcatcgaccc 1740
caccaaggca tcgggcgcgc tgtacccatc tccagactca acctggacga atacaaccta 1800
ttgaatcttc acagctagtc ggattagcat aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga 1860
ggggtttttt gcccgggtac cgagctcgaa ttcactggcc gtcgttttac gggtaccgag 1920
ctcgaattcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat 1980
tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag 2040
ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg 2100
ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc 2160
ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc 2220
agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 2280
catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 2340
tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 2400
gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 2460
ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 2520
cgtggcgctt tctcaaagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 2580
caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 2640
ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 2700
taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 2760
taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 2820
cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 2880
tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 2940
gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttacg tttcggtgat 3000
gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 3060
gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 3120
tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa 3180
ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg 3240
cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa 3300
gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt 3360
tgtaaaacga cggccagtgc caagcttgca tgcctgcagg tcgactctag aggatccccc 3420
aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagact 3480
cccgcgaaat taatacgact cactatagga tgatggagac ggtcgggtcc aggatcgcta 3540
ggaatggttt gcataagcgg cttaattctg cagtcgttcc accatgccgt taggtttagg 3600
tgacggtatg tccacatacc ggaggatctg tgcgagcttt tagtaccctt gatagggaga 3660
acgagacctt cgtcccctcc gttcgcgttt acgcggacgg tgagactgaa gataactcat 3720
tctctttaaa atatcgttcg aactggactc ccggtcgttt taactcgact ggggccaaaa 3780
cgaaacagtg gcactacccc tctccgtatt cacggggggc gttaagtgtc acatcgatag 3840
atcaaggtgc ctacaagcga agtgggtcat cgtggggtcg cccgtacgag gagaaagccg 3900
gtttcggctt ctccctcgac gcacgctcct gctacagcct cttccctgta agccaaaact 3960
tgacttacat cgaagtgccg cagaacgttg cgaaccgggc gtcgaccgaa gtcctgcaaa 4020
aggtcaccca gggtaatttt aaccttggtg ttgctttagc agaggccagg tcgacagcct 4080
cacaactcgc gacgcaaacc attgcgctcg tgaaggcgta cactgccgct cgtcgcggta 4140
attggcgcca ggcgctccgc taccttgccc taaacgaaga tcgaaagttt cgatcaaaac 4200
acgtggccgg caggtggttg gagttgcagt tcggttggtt accactaatg agtgatatcc 4260
agggtgcata tgagatgctt acgaaggttc accttcaaga gtttcttcct atgagagccg 4320
tacgtcaggt cggtactaac atcaagttag atggccgtct gtcgtatcca gctgcaaact 4380
tccagacaac gtgcaacata tcgcgacgta tcgtgatatg gttttacata aacgatgcac 4440
gtttggcatg gttgtcgtct ctaggtatct tgaacccact aggtatagtg tgggaaaagg 4500
tgcctttctc attcgttgtc gactggctcc tacctgtagg taacatgctc gagggcctta 4560
cggcccccgt gggatgctcc tacatgtcag gaacagttac tgacgtaata acgggtgagt 4620
ccatcataag cgttgacgct ccctacgggt ggactgtgga gagacagggc actgctaagg 4680
cccaaatctc agccatgcat cgaggggtac aatccgtatg gccaacaact ggcgcgtacg 4740
taaagtctcc tttctcgatg gtccatacct tagatgcgtt agcattaatc aggcaacggc 4800
tctctagata gagccctcaa ccggagtttg aagcatggct tctaacttta ctcagttcgt 4860
tctcgtcgac aatggcggaa ctggcgacgt gactgtcgcc ccaagcaact tcgctaacgg 4920
ggtcgctgaa tggatcagct ctaactcgcg ttcacaggct tacaaagtaa cctgtagcgt 4980
tcgtcagagc tctgcgcaga atcgcaaata caccatcaaa gtcgaggtgc ctaaagtggc 5040
aacccagact gttggtggtg tagagcttcc tgtagccgca tggcgttcgt acttaaatat 5100
ggaactaacc attccaattt tcgctacgaa ttccgactgc gagcttattg ttaaggcaat 5160
gcaaggtctc ctaaaagatg gaaacccgat tccctcagca atcgcagcaa actccggcat 5220
ctactaatag acgccggcca ttcaaacatg aggattaccc atgtcgaaga caacaaagaa 5280
gttcaactct ttatgtattt aggatctagg tgtgaagatg tgttatgagc catattcaac 5340
gggaaacgtc ttgctcgagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat ttatatgggt 5400
ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga ttgtatggga 5460
agcccgatgc gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta 5520
cagatgagat ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg accatcaagc 5580
attttatccg tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc gggaaaacag 5640
cattccaggt attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag 5700
tgttcctgcg ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg 5760
tatttcgtct cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt 5820
ttgatgacga gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataagcttt 5880
tgccattctc accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat aaccttattt 5940
ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat 6000
accaggatct tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac 6060
ggctttttca aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga 6120
tgctcgatga gtttttctaa tcagaatcat aggttgtatg catggttcat ccgaaccgga 6180
tttgagaaac tggaaatcgc caacccccca gttcactcaa ggagcccggc cggatgaaca 6240
cccataagca tgcccgattg accttcctac gtcgactcga aatggtccag caattgatcg 6300
cccatcaagt ttgtgtgcct gaagcggccc gcgcctatgg ggtcaccgcg ccgactgtgc 6360
gcaaatggct gggccgcttc ctggctcagg gccaggcggg cttggccgat gcgtcctcgc 6420
gcccgacggt ctcgccccga gcgattgcgc cggccaaggc gctggctatc gtggagctgc 6480
gccgcaagcg gctgacccaa gcgcgcatcg cccaggcgct gggcgtgtca gccagcaccg 6540
tcagccgcgt cctggcccgc gccggtctgt cgcacctggc cgacctggag ccggccgagc 6600
cggtggtgcg ctacgagcat caggcccccg gcgatctgct gcacatcgac atcaagaagc 6660
tgggacgtat ccagcgccct ggccaccggg tcacgggcaa ccgacgcgat accgttgagg 6720
gggccggctg ggacttcgtc ttcgtggcca tcgatgacca cgcccgcgtg gccttcaccg 6780
acatccaccc cgacgagcgc ttccccagcg ccgtccagtt cctcaaggac gcagtggcct 6840
actaccagcg cctgggcgtg accatccagc gcttgctcac cgacaatggc tcggcctttc 6900
gcagccgcgc cttcgccgcg ctgtgccatg agctgggcat caagcaccgc tttacccgac 6960
cttaccgccc acagaccaat ggcaaggccg aacgcttcat ccagtcggcc ttgcgtgagt 7020
gggcttacgc tcacacctac cagaactccc aacaccgagc cgatgccatg aaatcctggc 7080
tacaccacta caactggcat cgaccccacc aaggcatcgg gcgcgctgta cccatctcca 7140
gactcaacct ggacgaatac aacctattga atcttcacag ctagctgaaa ggtgatgcgg 7200
tctaacgaaa cctgacctaa gacgctcttt aacaatctgg taaatagctc ttgagtgcat 7260
gactagcgga taactcaagg gtatcgcaag gtgcccttta tgatattcac taataactgc 7320
acgaggtaac acaagatggc tatgtctaac atgacttaca acaacgtttt cgaccacgct 7380
tacgaaatgc tgaaagaaaa catccgttat gatgacatcc gtgacactga tgacctgcac 7440
gatgctattc acatggctgc cgataatgca gttccgcact actacgctga catctttagc 7500
gtaatggcaa gtgagggcat tgaccttgag ttcgaagact ctggtctgat gcctgacacc 7560
aaggacgtaa tccgcatcct gcaagcgcgt atctatgagc aattaacgat tgacctctgg 7620
gaagacgcag aagacttgct caatgaatac ttggaggaag tcgaggagta cgaggaggat 7680
gaagagtaat gtctactacc aacgtgcaat acggtctgac cgctcaaact gtacttttct 7740
atagcgacat ggtgcgctgt ggctttaact ggtcactcgc aatggcacag ctcaaagaac 7800
tgtacgaaaa caacaaggca atagctttag aatctgctga gtgatagact caaggtcgct 7860
cctagcgagt ggcctttatg attatcactt tacttatgag ggagtaatgt atatgcttac 7920
tatcggtcta ctcaccgctc taggtctagc tgtaggtgca tcctttggga aggctttagg 7980
tgtagctgta ggttcctact ttaccgcttg catcatcata ggaatcatca aaggggcact 8040
acgcaaatga tgaagcacta cgttatgcca atccacacgt ccaacggggc aaccgtatgt 8100
acacctgatg ggttcgcaat gaaacaacga atcgaacgcc ttaagcgtga actccgcatt 8160
aaccgcaaga ttaacaagat aggttccggc tatgacagaa cgcactgatg gcttaaagaa 8220
aggttatatg cccaatggca cactatacgc tgcaaatcgg cgaatagtga gaacttggcg 8280
agagaacaac ctcgaacgcc gcaaggacaa gagagggcgg cgtggcatag acgaaaggaa 8340
aaggttaaag ccaagaaact cgccgcactt gaacaggcac tagccaacac actgaacgct 8400
atctcataac gaacataaag gacacaatgc aatgaacatt accgacatca tgaacgctat 8460
cgacgcaatc aaagcactgc caatctgtga acttgacaag cgtcaaggta tgcttatcga 8520
cttactggtc gagatggtca acagcgagac gtgtgatggc gagctaaccg aactaaatca 8580
ggcacttgag catcaagatt ggtggactac cttgaagtgt ctcacggctg acgcagggtt 8640
caagatgctc ggtaatggtc acttctcggc tgcttatagt cacccgctgc tacctaacag 8700
agtgattaag gtgggcttta agaaagagga ttcaggcgca gcctataccg cattctgccg 8760
catgtatcag ggtcgtcctg gtatccctaa cgtctacgat gtacagcgcc acgctggatg 8820
ctatacggtg gtacttgacg cacttaagga ttgcgagcgt ttcaacaatg atgcccatta 8880
taaatacgct gagattgcaa gcgacatcat tgattgcaat tcggatgagc atgatgagtt 8940
aactggatgg gatggtgagt ttgttgaaac ttgtaaacta atccgcaagt tctttgaggg 9000
catcgcctca ttcgacatgc atagcgggaa catcatgttc tcaaatggag acgtaccata 9060
catcaccgac ccggtatcat tctcgcagaa gaaagacggt ggcgcattca gcatcgaccc 9120
tgaggaactc atcaaggaag tcgaggaagt cgcacgacag aaagaaattg accgcgctaa 9180
ggcccgtaaa gaacgtcacg aggggcgctt agaggcacgc agattcaaac gtcgcaaccg 9240
caaggcacgt aaagcacaca aagctaagcg cgaaagaatg cttgctgcgt ggcgatgggc 9300
tgaacgtcaa gaacggcgta accatgaggt agctgtagat gtactaggaa gaaccaataa 9360
cgctatgctc tgggtcaaca tgttctctgg ggactttaag gcgcttgagg aacgaatcgc 9420
gctgcactgg cgtaatgctg accggatggc tatcgctaat ggtcttacgc tcaacattga 9480
taagcaactt gacgcaatgt taatgggctg atagtcttat cttacaggtc atctgcgggt 9540
ggcctgaata ggtacgattt actaactgga agaggcacta aatgaacacg attaacatcg 9600
ctaagaacga cttctctgac atcgaactgg ctgctatccc gttcaacact ctggctgacc 9660
attacggtga gcgtttagct cgcgaacagt tggcccttga gcatgagtct tacgagatgg 9720
gtgaagcacg cttccgcaag atgtttgagc gtcaacttaa agctggtgag gttgcggata 9780
acgctgccgc caagcctctc atcactaccc tactccctaa gatgattgca cgcatcaacg 9840
actggtttga ggaagtgaaa gctaagcgcg gcaagcgccc gacagccttc cagttcctgc 9900
aagaaatcaa gccggaagcc gtagcgtaca tcaccattaa gaccactctg gcttgcctaa 9960
ccagtgctga caatacaacc gttcaggctg tagcaagcgc aatcggtcgg gccattgagg 10020
acgaggctcg cttcggtcgt atccgtgacc ttgaagctaa gcacttcaag aaaaacgttg 10080
aggaacaact caacaagcgc gtagggcacg tctacaagaa agcatttatg caagttgtcg 10140
aggctgacat gctctctaag ggtctactcg gtggcgaggc gtggtcttcg tggcataagg 10200
aagactctat tcatgtagga gtacgctgca tcgagatgct cattgagtca accggaatgg 10260
ttagcttaca ccgccaaaat gctggcgtag taggtcaaga ctctgagact atcgaactcg 10320
cacctgaata cgctgaggct atcgcaaccc gtgcaggtgc gctggctggc atctctccga 10380
tgttccaacc ttgcgtagtt cctcctaagc cgtggactgg cattactggt ggtggctatt 10440
gggctaacgg tcgtcgtcct ctggcgctgg tgcgtactca cagtaagaaa gcactgatgc 10500
gctacgaaga cgtttacatg cctgaggtgt acaaagcgat taacattgcg caaaacaccg 10560
catggaaaat caacaagaaa gtcctagcgg tcgccaacgt aatcaccaag tggaagcatt 10620
gtccggtcga ggacatccct gcgattgagc gtgaagaact cccgatgaaa ccggaagaca 10680
tcgacatgaa tcctgaggct ctcaccgcgt ggaaacgtgc tgccgctgct gtgtaccgca 10740
aggacaaggc tcgcaagtct cgccgtatca gccttgagtt catgcttgag caagccaata 10800
agtttgctaa ccataaggcc atctggttcc cttacaacat ggactggcgc ggtcgtgttt 10860
acgctgtgtc aatgttcaac ccgcaaggta acgatatgac caaaggactg cttacgctgg 10920
cgaaaggtaa accaatcggt aaggaaggtt actactggct gaaaatccac ggtgcaaact 10980
gtgcgggtgt cgataaggtt ccgttccctg agcgcatcaa gttcattgag gaaaaccacg 11040
agaacatcat ggcttgcgct aagtctccac tggagaacac ttggtgggct gagcaagatt 11100
ctccgttctg cttccttgcg ttctgctttg agtacgctgg ggtacagcac cacggcctga 11160
gctataactg ctcccttccg ctggcgtttg acgggtcttg ctctggcatc cagcacttct 11220
ccgcgatgct ccgagatgag gtaggtggtc gcgcggttaa cttgcttcct agtgaaaccg 11280
ttcaggacat ctacgggatt gttgctaaga aagtcaacga gattctacaa gcagacgcaa 11340
tcaatgggac cgataacgaa gtagttaccg tgaccgatga gaacactggt gaaatctctg 11400
agaaagtcaa gctgggcact aaggcactgg ctggtcaatg gctggcttac ggtgttactc 11460
gcagtgtgac taagcgttca gtcatgacgc tggcttacgg gtccaaagag ttcggcttcc 11520
gtcaacaagt gctggaagat accattcagc cagctattga ttccggcaag ggtctgatgt 11580
tcactcagcc gaatcaggct gctggataca tggctaagct gatttgggaa tctgtgagcg 11640
tgacggtggt agctgcggtt gaagcaatga actggcttaa gtctgctgct aagctgctgg 11700
ctgctgaggt caaagataag aagactggag agattcttcg caagcgttgc gctgtgcatt 11760
gggtaactcc tgatggtttc cctgtgtggc aggaatacaa gaagcctatt cagacgcgct 11820
tgaacctgat gttcctcggt cagttccgct tacagcctac cattaacacc aacaaagata 11880
gcgagattga tgcacacaaa caggagtctg gtatcgctcc taactttgta cacagccaag 11940
acggtagcca ccttcgtaag actgtagtgt gggcacacga gaagtacgga atcgaatctt 12000
ttgcactgat tcacgactcc ttcggtacca ttccggctga cgctgcgaac ctgttcaaag 12060
cagtgcgcga aactatggtt gacacatatg agtcttgtga tgtactggct gatttctacg 12120
accagttcgc tgaccagttg cacgagtctc aattggacaa aatgccagca cttccggcta 12180
aaggtaactt gaacctccgt gacatcttag agtcggactt cgcgttcgcg taacgccaaa 12240
tcaatacgac tcactataga gggacaaact caaggtcatt cgcaagagtg gcctttatga 12300
ttgaccttct tccggttaat acgactcact ataggagaac cttaaggttt aactttaaga 12360
cccttaagtg ttaattagag atttaaatta aagaattact aagagaggac tttaagtatg 12420
cgtaacttcg aaaagatgac caaacgttct aaccgtaatg ctcgtgactt cgaggcaacc 12480
aaaggtcgca agttgaataa gactaagcgt gaccgctctc acaagcgtag ctgggagggt 12540
cagtaagatg ggacgtttat atagtggtaa tctggcagca ttcaaggcag caacaaacaa 12600
gctgttccag ttagacttag cggtcattta tgatgactgg tatgatgcct atacaagaaa 12660
agattgcata cggttacgta ttgaggacag gagtggaaac ctgattgata ctagcacctt 12720
ctaccaccac gacgaggacg ttctgttcaa tatgtgtact gattggttga accatatgta 12780
tgaccagttg aaggactgga agtaatacga ctcagtatag ggacaatgct taaggtcgct 12840
ctctaggagt ggccttagtc atttaaccaa taggagataa acattatgat gaacattaag 12900
actaacccgt ttaaagccgt gtctttcgta gagtctgcca ttaagaaggc tctggataac 12960
gctgggtatc ttatcgctga aatcaagtac gatggtgtac gcgggaacat ctgcgtagac 13020
aatactgcta acagttactg gctctctcgt gtatctaaaa cgattccggc actggagcac 13080
ttaaacgggt ttgatgttcg ctggaagcgt ctactgaacg atgaccgttg cttctacaaa 13140
gatggcttta tgcttgatgg ggaactcatg gtcaagggcg tagactttaa cacagggtcc 13200
ggcctactgc gtaccaaatg gactgacacg aagaaccaag agttccatga agagttattc 13260
gttgaaccaa tccgtaagaa agataaagtt ccctttaagc tgcacactgg acaccttcac 13320
ataaaactgt acgctatcct cccgctgcac atcgtggagt ctggagaaga ctgtgatgtc 13380
atgacgttgc tcatgcagga acacgttaag aacatgctgc ctctgctaca ggaatacttc 13440
cctgaaatcg aatggcaagc ggctgaatct tacgaggtct acgatatggt agaactacag 13500
caactgtacg agcagaagcg agcagaaggc catgagggtc tcattgtgaa agacccgatg 13560
tgtatctata agcgcggtaa gaaatctggc tggtggaaaa tgaaacctga gaacgaagct 13620
gacggtatca ttcagggtct ggtatggggt acaaaaggtc tggctaatga aggtaaagtg 13680
attggttttg aggtgcttct tgagagtggt cgtttagtta acgccacgaa tatctctcgc 13740
gccttaatgg atgagttcac tgagacagta aaagaggcca ccctaagtca atggggattc 13800
tttagcccat acggtattgg cgacaacgat gcttgtacta ttaaccctta cgatggctgg 13860
gcgtgtcaaa ttagctacat ggaggaaaca cctgatggct ctttgcggca cccatcgttc 13920
gtaatgttcc gtggcaccga ggacaaccct caagagaaaa tgtaatcaca ctggctcacc 13980
ttcgggtggg cctttctgcg tttataagga gacactttat gtttaagaag gttggtaaat 14040
tccttgcggc tttggcagct atcctgacgc ttgcgtatat tcttgcggta taccctcaag 14100
tagcactagt agtagttggc gcttgttact tagcggcagt gtgtgcttgc gtgtggagta 14160
tagttaactg gtaatacgac tcactaaagg aggtacacac catgatgtac ttaatgccat 14220
tactcatcgt cattgtagga tgccttgcgc tccactgtag cgatgatgat atgccagatg 14280
gtcacgctta atacgactca ctaaaggaga cactatatgt ttcgacttca ttacaacaaa 14340
agcgttaaga atttcacggt tcgccgtgct gaccgttcaa tcgtatgtgc gagcgagcgc 14400
cgagctaaga tacctcttat tggtaacaca gttcctttgg caccgagcgt ccacatcatt 14460
atcacccgtg gtgactttga gaaagcaata gacaagaaac gtccggttct tagtgtggca 14520
gtgacccgct tcccgttcgt ccgtctgtta ctcaaacgaa tcaaggaggt gttctgatgg 14580
gactgttaga tggtgaagcc tgggaaaaag aaaacccgcc agtacaagca actgggtgta 14640
tagcttgctt agagaaagat gaccgttatc cacacacctg taacaaagga gctaacgata 14700
tgaccgaacg tgaacaagag atgatcatta agttgataga caataatgaa ggtcgcccag 14760
atgatttgaa tggctgcggt attctctgct ccaatgtccc ttgccacctc tgccccgcaa 14820
ataacgatca aaagataacc ttaggtgaaa tccgagcgat ggacccacgt aaaccacatc 14880
tgaataaacc tgaggtaact cctacagatg accagccttc cgctgagaca atcgaaggtg 14940
tcactaagcc ttcccactac atgctgtttg acgacattga ggctatcgaa gtgattgctc 15000
gttcaatgac cgttgagcag ttcaagggat actgcttcgg taacatctta aagtacagac 15060
tacgtgctgg taagaagtca gagttagcgt acttagagaa agacctagcg aaagcagact 15120
tctataaaga actctttgag aaacataagg ataaatgtta tgcataactt caagtcaacc 15180
ccacctgccg acagcctatc tgatgacttc acatcttgct cagagtggtg ccgaaagatg 15240
tgggaagaga cattcgacga tgcgtacatc aagctgtatg aactttggaa atcgagaggt 15300
caatgactat gtcaaacgta aatacaggtt cacttagtgt ggacaataag aagttttggg 15360
ctaccgtaga gtcctcggag cattccttcg aggttccaat ctacgctgag accctagacg 15420
aagctctgga gttagccgaa tggcaatacg ttccggctgg ctttgaggtt actcgtgtgc 15480
gtccttgtgt agcaccgaag taatacgact cactattagg gaagactccc tctgagaaac 15540
caaacgaaac ctaaaggaga ttaacattat ggctaagaag attttcacct ctgcgctggg 15600
taccgctgaa ccttacgctt acatcgccaa gccggactac ggcaacgaag agcgtggctt 15660
tgggaaccct cgtggtgtct ataaagttga cctgactatt cccaacaaag acccgcgctg 15720
ccagcgtatg gtcgatgaaa tcgtgaagtg tcacgaagag gcttatgctg ctgccgttga 15780
ggaatacgaa gctaatccac ctgctgtagc tcgtggtaag aaaccgctga aaccgtatga 15840
gggtgacatg ccgttcttcg ataacggtga cggtacgact acctttaagt tcaaatgcta 15900
cgcgtctttc caagacaaga agaccaaaga gaccaagcac atcaatctgg ttgtggttga 15960
ctcaaaaggt aagaagatgg aagacgttcc gattatcggt ggtggctcta agctgaaagt 16020
taaatattct ctggttccat acaagtggaa cactgctgta ggtgcgagcg ttaagctgca 16080
actggaatcc gtgatgctgg tcgaactggc tacctttggt ggcggtgaag acgattgggc 16140
tgacgaagtt gaagagaacg gctatgttgc ctctggttct gccaaagcga gcaaaccacg 16200
cgacgaagaa agctgggacg aagacgacga agagtccgag gaagcagacg aagacggaga 16260
cttctaagtg gaactgcggg agaaaatcct tgagcgaatc aaggtgactt cctctgggtg 16320
ttgggagtgg cagggcgcta cgaacaataa agggtacggg caggtgtggt gcagcaatac 16380
cggaaaggtt gtctactgtc atcgcgtaat gtctaatgct ccgaaaggtt ctaccgtcct 16440
gcactcctgt gataatccat tatgttgtaa ccctgaacac ctatccatag gaactccaaa 16500
agagaactcc actgacatgg taaataaggg tcgctcacac aaggggtata aactttcaga 16560
cgaagacgta atggcaatca tggagtccag cgagtccaat gtatccttag ctcgcaccta 16620
tggtgtctcc caacagacta tttgtgatat acgcaaaggg aggcgacatg gcaggttacg 16680
gcgctaaagg aatccgaaag gttggagcgt ttcgctctgg cctagaggac aaggtttcaa 16740
agcagttgga atcaaaaggt attaaattcg agtatgaaga gtggaaagtg ccttatgtaa 16800
ttccggcgag caatcacact tacactccag acttcttact tccaaacggt atattcgttg 16860
agacaaaggg tctgtgggaa agcgatgata gaaagaagca cttattaatt agggagcagc 16920
accccgagct agacatccgt attgtcttct caagctcacg tactaagtta tacaaaggtt 16980
ctccaacgtc ttatggagag ttctgcgaaa agcatggtat taagttcgct gataaactga 17040
tacctgctga gtggataaag gaacccaaga aggaggtccc ctttgataga ttaaaaagga 17100
aaggaggaaa gaaataatgg ctcgtgtaca gtttaaacaa cgtgaatcta ctgacgcaat 17160
ctttgttcac tgctcggcta ccaagccaag tcagaatgtt ggtgtccgtg agattcgcca 17220
gtggcacaaa gagcagggtt ggctcgatgt gggataccac tttatcatca agcgagacgg 17280
tactgtggag gcaggacgag atgagatggc tgtaggctct cacgctaagg gttacaacca 17340
caactctatc ggcgtctgcc ttgttggtgg tatcgacgat aaaggtaagt tcgacgctaa 17400
ctttacgcca gcccaaatgc aatcccttcg ctcactgctt gtcacactgc tggctaagta 17460
cgaaggcgct gtgcttcgcg cccatcatga ggtggcgccg aaggcttgcc cttcgttcga 17520
ccttaagcgt tggtgggaga agaacgaact ggtcacttct gaccgtggat aattaattga 17580
actcactaaa gggagaccac agcggtttcc ctttgttcgc attggaggtc aaataatgcg 17640
caagtcttat aaacaattct ataaggctcc gaggaggcat atccaagtgt gggaggcagc 17700
caatgggcct ataccaaaag gttattatat agaccacatt gacggcaatc cactcaacga 17760
cgccttagac aatctccgtc tggctctccc aaaagaaaac tcatggaaca tgaagactcc 17820
aaagagcaat acctcaggac taaagggact gagttggagc aaggaaaggg agatgtggag 17880
aggcactgta acagctgagg gtaaacagca taactttcgt agtagagatc tattggaagt 17940
cgttgcgtgg atttatagaa ctaggaggga attgcatgga caattcgcac gattccgata 18000
gtgtatttct ttaccacatt ccttgtgaca actgtgggag tagtgatggg aactcgctgt 18060
tctctgacgg acacacgttc tgctacgtat gcgagaagtg gactgctggt aatgaagaca 18120
ctaaagagag ggcttcaaaa cggaaaccct caggaggtaa accaatgact tacaacgtgt 18180
ggaacttcgg ggaatccaat ggacgctact ccgcgttaac tgcgagagga atctccaagg 18240
aaacctgtca gaaggctggc tactggattg ccaaagtaga cggtgtgatg taccaagtgg 18300
ctgactatcg ggaccagaac ggcaacattg tgagtcagaa ggttcgagat aaagataaga 18360
actttaagac cactggtagt cacaagagtg acgctctgtt cgggaagcac ttgtggaatg 18420
gtggtaagaa gattgtcgtt acagaaggtg aaatcgacat gcttaccgtg atggaacttc 18480
aagactgtaa gtatcctgta gtgtcgttgg gtcacggtgc ctctgccgct aagaagacat 18540
gcgctgccaa ctacgaatac tttgaccagt tcgaacagat tatcttaatg ttcgatatgg 18600
acgaagcagg gcgcaaagca gtcgaagagg ctgcacaggt tctacctgct ggtaaggtac 18660
gagtggcagt tcttccgtgt aaggatgcaa acgagtgtca cctaaatggt cacgaccgtg 18720
aaatcatgga gcaagtgtgg aatgctggtc cttggattcc tgatggtgtg gtatcggctc 18780
tttcgttacg tgaacgaatc cgtgagcacc tatcgtccga ggaatcagta ggtttacttt 18840
tcagtggctg cactggtatc aacgataaga ccttaggtgc ccgtggtggt gaagtcatta 18900
tggtcacttc cggttccggt atgggtaagt caacgttcgt ccgtcaacaa gctctacaat 18960
ggggcacagc gatgggcaag aaggtaggct tagcgatgct tgaggagtcc gttgaggaga 19020
ccgctgagga ccttataggt ctacacaacc gtgtccgact gagacaatcc gactcactaa 19080
agagagagat tattgagaac ggtaagttcg accaatggtt cgatgaactg ttcggcaacg 19140
atacgttcca tctatatgac tcattcgccg aggctgagac ggatagactg ctcgctaagc 19200
tggcctacat gcgctcaggc ttgggctgtg acgtaatcat tctagaccac atctcaatcg 19260
tcgtatccgc ttctggtgaa tccgatgagc gtaagatgat tgacaacctg atgaccaagc 19320
tcaaagggtt cgctaagtca actggggtgg tgctggtcgt aatttgtcac cttaagaacc 19380
cagacaaagg taaagcacat gaggaaggtc gccccgtttc tattactgac ctacgtggtt 19440
ctggcgcact acgccaacta tctgatacta ttattgccct tgagcgtaat cagcaaggcg 19500
atatgcctaa ccttgtcctc gttcgtattc tcaagtgccg ctttactggt gatactggta 19560
tcgctggcta catggaatac aacaaggaaa ccggatggct tgaaccatca agttactcag 19620
gggaagaaga gtcacactca gagtcaacag actggtccaa cgacactgac ttctgacagg 19680
attcttgatg actttccaga cgactacgag aagtttcgct ggagagtccc attctaatac 19740
gactcactaa aggagacaca ccatgttcaa actgattaag aagttaggcc aactgctggt 19800
tcgtatgtac aacgtggaag ccaagcgact gaacgatgag gctcgtaaag aggccacaca 19860
gtcacgcgct ctggcgattc gctccaacga actggctgac agtgcatcca ctaaagttac 19920
cgaggctgcc cgtgtggcaa accaagctca acagctttcc aaattctttg agtaatcaaa 19980
caggagaaac cattatgtct aacgtagctg aaactatccg tctatccgat acagctgacc 20040
agtggaaccg tcgagtccac atcaacgttc gcaacggtaa ggcgactatg gtttaccgct 20100
ggaaggactc taagtcctct aagaatcaca ctcagcgtat gacgttgaca gatgagcaag 20160
cactgcgtct ggtcaatgcg cttaccaaag ctgccgtgac agcaattcat gaagctggtc 20220
gcgtcaatga agctatggct atcctcgaca agattgataa ctaagagtgg tatcctcaag 20280
gtcgccaaag tggtggcctt catgaatact attcgactca ctataggaga tattaccatg 20340
cgtgacccta aagttatcca agcagaaatc gctaaactgg aagctgaact ggaggacgtt 20400
aagtaccatg aagctaagac tcgctccgct gttcacatct tgaagaactt aggctggact 20460
tggacaagac agactggctg gaagaaacca gaagttacca agctgagtca taaggtgttc 20520
gataaggaca ctatgaccca catcaaggct ggtgattggg ttaaggttga catgggagtt 20580
gttggtggat acggctacgt ccgctcagtt agtggcaaat atgcacaagt gtcatacatc 20640
acaggtgtta ctccacgcgg tgcaatcgtt gccgataaga ccaacatgat tcacacaggt 20700
ttcttgacag ttgtttcata tgaagagatt gttaagtcac gataatcaat aggagaaatc 20760
aatatgatcg tttctgacat cgaagctaac gccctcttag agagcgtcac taagttccac 20820
tgcggggtta tctacgacta ctccaccgct gagtacgtaa gctaccgtcc gagtgacttc 20880
ggtgcgtatc tggatgcgct ggaagccgag gttgcacgag gcggtcttat tgtgttccac 20940
aacggtcaca agtatgacgt tcctgcattg accaaactgg caaagttgca attgaaccga 21000
gagttccacc ttcctcgtga gaactgtatt gacacccttg tgttgtcacg tttgattcat 21060
tccaacctca aggacaccga tatgggtctt ctgcgttccg gcaagttgcc cggaaaacgc 21120
tttgggtctc acgctttgga ggcgtggggt tatcgcttag gcgagatgaa gggtgaatac 21180
aaagacgact ttaagcgtat gcttgaagag cagggtgaag aatacgttga cggaatggag 21240
tggtggaact tcaacgaaga gatgatggac tataacgttc aggacgttgt ggtaactaaa 21300
gctctccttg agaagctact ctctgacaaa cattacttcc ctcctgagat tgactttacg 21360
gacgtaggat acactacgtt ctggtcagaa tcccttgagg ccgttgacat tgaacatcgt 21420
gctgcatggc tgctcgctaa acaagagcgc aacgggttcc cgtttgacac aaaagcaatc 21480
gaagagttgt acgtagagtt agctgctcgc cgctctgagt tgctccgtaa attgaccgaa 21540
acgttcggct cgtggtatca gcctaaaggt ggcactgaga tgttctgcca tccgcgaaca 21600
ggtaagccac tacctaaata ccctcgcatt aagacaccta aagttggtgg tatctttaag 21660
aagcctaaga acaaggcaca gcgagaaggc cgtgagcctt gcgaacttga tacccgcgag 21720
tacgttgctg gtgctcctta caccccagtt gaacatgttg tgtttaaccc ttcgtctcgt 21780
gaccacattc agaagaaact ccaagaggct gggtgggtcc cgaccaagta caccgataag 21840
ggtgctcctg tggtggacga tgaggtactc gaaggagtac gtgtagatga ccctgagaag 21900
caagccgcta tcgacctcat taaagagtac ttgatgattc agaagcgaat cggacagtct 21960
gctgagggag acaaagcatg gcttcgttat gttgctgagg atggtaagat tcatggttct 22020
gttaacccta atggagcagt tacgggtcgt gcgacccatg cgttcccaaa ccttgcgcaa 22080
attccgggtg tacgttctcc ttatggagag cagtgtcgcg ctgcttttgg cgctgagcac 22140
catttggatg ggataactgg taagccttgg gttcaggctg gcatcgacgc atccggtctt 22200
gagctacgct gcttggctca cttcatggct cgctttgata acggcgagta cgctcacgag 22260
attcttaacg gcgacatcca cactaagaac cagatagctg ctgaactacc tacccgagat 22320
aacgctaaga cgttcatcta tgggttcctc tatggtgctg gtgatgagaa gattggacag 22380
attgttggtg ctggtaaaga gcgcggtaag gaactcaaga agaaattcct tgagaacacc 22440
cccgcgattg cagcactccg cgagtctatc caacagacac ttgtcgagtc ctctcaatgg 22500
gtagctggtg agcaacaagt caagtggaaa cgccgctgga ttaaaggtct ggatggtcgt 22560
aaggtacacg ttcgtagtcc tcacgctgcc ttgaataccc tactgcaatc tgctggtgct 22620
ctcatctgca aactgtggat tatcaagacc gaagagatgc tcgtagagaa aggcttgaag 22680
catggctggg atggggactt tgcgtacatg gcatgggtac atgatgaaat ccaagtaggc 22740
tgccgtaccg aagagattgc tcaggtggtc attgagaccg cacaagaagc gatgcgctgg 22800
gttggagacc actggaactt ccggtgtctt ctggataccg aaggtaagat gggtcctaat 22860
tgggcgattt gccactgata cgtagtgtct actcaatcca atcgtaatgc gctcgtagtg 22920
gcgcaactga aaggagactt cgtggcgttc ctattcgtct tatggaaggc gctaaaccta 22980
ccggtgccca ctaagtgtca gattgacatg gctaaggtgc tggcgaatgg agacaacaag 23040
aagttcatct tacaggcttt ccgtggtatc ggtaagtcgt tcatcacatg tgcgttcgtt 23100
gtgtggtcct tatggagaga ccctcagttg aagatactta tcgtatcagc ctctaaggag 23160
cgtgcagacg ctaactccat ctttattaag aacatcattg acctgctgcc attcctatct 23220
gagttaaagc caagacccgg acagcgtgac tcggtaatca gctttgatgt aggcccagcc 23280
aatcctgacc actctcctag tgtgaaatca gtaggtatca ctggtcagtt aactggtagc 23340
cgtgctgaca ttatcattgc ggatgacgtt gagattccgt ctaacagcgc aactatgggt 23400
gcccgtgaga agctatggac tctggttcag gagttcgctg cgttacttaa accgctgcct 23460
tcctctcgcg ttatctacct tggtacacct cagacagaga tgactctcta taaggaactt 23520
gaggataacc gtgggtacac aaccattatc tggcctgctc tgtacccaag gacacgtgaa 23580
gagaacctct attactcaca gcgtcttgct cctatgttac gcgctgagta cgatgagaac 23640
cctgaggcac ttgctgggac tccaacagac ccagtgcgct ttgaccgtga tgacctgcgc 23700
gagcgtgagt tggaatacgg taaggctggc tttacgctac agttcatgct taaccctaac 23760
cttagtgatg ccgagaagta cccgctgagg cttcgtgacg ctatcgtagc ggccttagac 23820
ttagagaagg ccccaatgca ttaccagtgg cttccgaacc gtcagaacat cattgaggac 23880
cttcctaacg ttggccttaa gggtgatgac ctgcatacgt accacgattg ttccaacaac 23940
tcaggtcagt accaacagaa gattctggtc attgacccta gtggtcgcgg taaggacgaa 24000
acaggttacg ctgtgctgta cacactgaac ggttacatct accttatgga agctggaggt 24060
ttccgtgatg gctactccga taagaccctt gagttactcg ctaagaaggc aaagcaatgg 24120
ggagtccaga cggttgtcta cgagagtaac ttcggtgacg gtatgttcgg taaggtattc 24180
agtcctatcc ttcttaaaca ccacaactgt gcgatggaag agattcgtgc ccgtggtatg 24240
aaagagatgc gtatttgcga tacccttgag ccagtcatgc agactcaccg ccttgtaatt 24300
cgtgatgagg tcattagggc cgactaccag tccgctcgtg acgtagacgg taagcatgac 24360
gttaagtact cgttgttcta ccagatgacc cgtatcactc gtgagaaagg cgctctggct 24420
catgatgacc gattggatgc ccttgcgtta ggcattgagt atctccgtga gtccatgcag 24480
ttggattccg ttaaggtcga gggtgaagta cttgctgact tccttgagga acacatgatg 24540
cgtcctacgg ttgctgctac gcatatcatt gagatgtctg tgggaggagt tgatgtgtac 24600
tctgaggacg atgagggtta cggtacgtct ttcattgagt ggtgatttat gcattaggac 24660
tgcataggga tgcactatag accacggatg gtcagttctt taagttactg aaaagacacg 24720
ataaattaat acgactcact atagggagag gagggacgaa aggttactat atagatactg 24780
aatgaatact tatagagtgc ataaagtatg cataatggtg tacctagagt gacctctaag 24840
aatggtgatt atattgtatt agtatcacct taacttaagg accaacataa agggaggaga 24900
ctcatgttcc gcttattgtt gaacctactg cggcatagag tcacctaccg atttcttgtg 24960
gtactttgtg ctgcccttgg gtacgcatct cttactggag acctcagttc actggagtct 25020
gtcgtttgct ctatactcac ttgtagcgat tagggtcttc ctgaccgact gatggctcac 25080
cgagggattc agcggtatga ttgcatcaca ccacttcatc cctatagagt caagtcctaa 25140
ggtataccca taaagagcct ctaatggtct atcctaaggt ctatacctaa agataggcca 25200
tcctatcagt gtcacctaaa gagggtctta gagagggcct atggagttcc tatagggtcc 25260
tttaaaatat accataaaaa tctgagtgac tatctcacag tgtacggacc taaagttccc 25320
ccataggggg tacctaaagc ccagccaatc acctaaagtc aaccttcggt tgaccttgag 25380
ggttccctaa gggttgggga tgacccttgg gtttgtcttt gggtgttacc ttgagtgtct 25440
ctctgtgtcc ct 25452
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer T7
<400> 3
taagcgcacc acggcacata agg 23
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> revers primer IS481
<400> 4
gcggcgcagc tccacgata 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer IS481
<400> 5
gcaccgcttt acccgacctt a 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer IS481
<400> 6
tgctccttcc actgcttcat ctg 23
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer IS481
<400> 7
acatgaggat tacccatgt 19
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ligand
<400> 8
His His Gln Gly His His Gln Gly His His Gln Gly His His Gln Gly
1 5 10 15
<210> 9
<211> 138
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> coat protein
<400> 9
Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Thr Lys
1 5 10 15
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly Thr Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser
20 25 30
Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser
35 40 45
Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn
50 55 60
Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr
65 70 75 80
Val Gly Gly Val Ser Leu Pro Val Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn
85 90 95
Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu
100 105 110
Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro
115 120 125
Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile Tyr
130 135
<210> 10
<211> 12
<212> peptide
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> 12
<223> (+)-6-aminopenicillanic acid
<400> 10
Gly Gly Gly Cys Arg Gly Asp Lys Gly Pro Asp Cys
1 5 10
<---
Claims (14)
1. Способ получения частиц бактериофагов семейства Levivirus, включающий этапы:
(a) получения линии псевдолизогенных клеток-хозяина со структурой коинтегратов согласно SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, размножающихся при температуре 23°С, лишённых токсического липополисахарида и содержащих:
- последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей фазмиду Т7 с фрагментом геномов бактериофагов семейства Levivirus;
- последовательность нуклеиновой кислоты фазмиды Т7, кодирующей белки капсида частиц бактериофагов семейства Levivirus;
- последовательность нуклеиновой кислоты фазмиды Т7, кодирующей белки ДНК- и РНК-полимеразы фага Т7 и лишённой генов морфогенеза;
(b) инициирования гиперэкспрессии генов, кодирующих белки капсида частиц бактериофагов семейства Levivirus, при температуре 28°С;
(c) получения частиц бактериофагов семейства Levivirus с одновременным разрушением клеток-хозяина, при этом указанные частицы бактериофагов имеют морфологическое сходство с природными частицами фага.
2. Способ биоминерализации частиц бактериофагов семейства Levivirus, полученных способом по п.1, включающий следующие этапы:
(а) получение частиц бактериофагов рода Levivirus с полностью гидролизованной РНК;
(б) проведение неферментативной реакции присоединения iRGD-6APA к частицам;
(в) получение комплекса металлопрепаратов со шпилечной РНК (shRNA), связывающих не менее 200 катионов;
(г) «загрузка» комплекса металлопрепаратов со шпилечной РНК (shRNA), связывающих не менее 200 катионов, в «разрыхлённые» триметиламин N-оксидом частицы бактериофагов семейства Levivirus с полностью гидролизованной РНК;
(д) определение специфичности доставки и чувствительности на модели смеси линий PC3, обогащенной интегрином ανβ3, и HEK293.
3. Способ по п.2, в котором металлопрепараты выбраны из группы цисплатин (цис-дихлородиамминплатин) (II), гексахлороплатинат (IV) аммония; рутения нитрозонитроамин, ауротиосульфат, гидроксид полимальтозата железа, нитраты серебра, меди или цинка, тринитрат галлия, соли ванадия и соли таллия различной валентности.
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2021134970A RU2021134970A (ru) | 2023-05-30 |
| RU2811106C2 true RU2811106C2 (ru) | 2024-01-11 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2568872C1 (ru) * | 2014-10-15 | 2015-11-20 | Игорь Геннадьевич Сивов | Лекарственное средство для лечения вирусного гепатита с |
| RU2599462C1 (ru) * | 2015-09-22 | 2016-10-10 | Общество с ограниченной ответственностью "БИОТЕХНОЛОГИЯ" (ООО "БИОТЕХНОЛОГИЯ") | Способ полисигнальной активации апоптоза клеток злокачественных солидных опухолей |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2568872C1 (ru) * | 2014-10-15 | 2015-11-20 | Игорь Геннадьевич Сивов | Лекарственное средство для лечения вирусного гепатита с |
| RU2599462C1 (ru) * | 2015-09-22 | 2016-10-10 | Общество с ограниченной ответственностью "БИОТЕХНОЛОГИЯ" (ООО "БИОТЕХНОЛОГИЯ") | Способ полисигнальной активации апоптоза клеток злокачественных солидных опухолей |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| БОЛЬШАКОВА Т.Н. И ДР. Псевдолизогения у фага Т7 и ее использование // Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности: материалы 3-й научно-практической конференции с международным участием: к 100-летию открытия бактериофагов, Москва, 13-15 октября / Федер. служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека [и др.]. - Москва : Медицинское маркетинговое агентство, 2016. - 100 с. См. с. 60 Найдено по адресу: http://www.congress-phages.ru/_pictures/tezis_bf-2016_block.pdf Дата обращения 19.07.2022. КОЛЕСАНОВА Е. Ф. И ДР. Бактериофаг MS2 - средство доставки для таргетной химиотерапии солидных опухолей. Acta Naturae. - 2019. - Т. 11. - N2. - C. 98-101. doi: 10.32607/20758251-2019-11-2-98-101 Найдено по адресу: https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/10856 Дата обращения 19.07.2022. PEABODY J. ET AL. Characterization of a spray-dried candidate HPV L2-VLP vaccine stored for multiple years at room temp * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111139241B (zh) | 抑制新型冠状病毒的小干扰核酸及组合物和应用 | |
| CN112760297B (zh) | 一种冠状病毒假病毒包装系统及其包装方法、冠状病毒假病毒在评估消杀效力中的应用 | |
| KR20200128129A (ko) | 식물 형질전환을 위한 방법 | |
| CN107922944A (zh) | 工程改造的crispr‑cas9组合物和使用方法 | |
| CN107849581A (zh) | 用于植物中的特异性核酸编辑的方法和构建体 | |
| KR20140092851A (ko) | 항-히알루로난 제제 치료를 위한 동반 진단 및 이의 사용 방법 | |
| JPH05503838A (ja) | リボザイム組成物および使用方法 | |
| KR102096592B1 (ko) | 신규한 crispr 연관 단백질 및 이의 용도 | |
| KR20160097297A (ko) | 살모넬라균의 비코딩 rna 및 이의 식별과 응용 | |
| CN113736801A (zh) | mRNA及包含其的新冠病毒mRNA疫苗 | |
| WO2017126604A1 (ja) | 植物細胞へのタンパク質の導入法 | |
| CA2509494A1 (en) | Method of introducing sirna into adipocytes | |
| JP5438259B2 (ja) | カンジダ・アンタークティカ由来リパーゼｂを細胞表層に提示する酵母 | |
| RU2811106C2 (ru) | Способ получения частиц бактериофагов семейства levivirus | |
| CN114369584A (zh) | 重组人源岩藻糖基转移酶变异体及应用 | |
| CN116615533A (zh) | Attb细胞系、源自其的转基因细胞系及其制备方法 | |
| Modh et al. | Specific detection of tetanus toxoid using an aptamer-based matrix | |
| CN113785072A (zh) | 启动子区域分析方法和用于实施该方法的细胞 | |
| WO2023225007A2 (en) | Engineered viral vectors with enhanced packaging capacity and methods of using the same | |
| JP2008195673A (ja) | 延命効果物質、および感染防御効果・ワクチン効果促進物質、前記物質の検定用コンストラクト、並びにそれらの用途 | |
| CN111484560A (zh) | 冠状病毒模型及其应用 | |
| Hale et al. | E. coli RNA polymerase promoters on superhelical SV40 DNA are highly selective targets for chemical modification | |
| CN109806401A (zh) | 抑制znf8蛋白表达量的物质在制备预防和治疗癌症的产品中的应用 | |
| KR101139589B1 (ko) | 생체 내 단백질 상호작용 분석을 위한 황색형광단백질 ｎ-말단 절편 부착 효모 균주 라이브러리 | |
| CN106800600B (zh) | 检测蜱传脑炎病毒感染的系统 |