JP2693948B2 - 侵入性微生物 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
微生物の多くの種について、哺乳類細胞への侵入及び
そこでの生存が、好結果の宿種−寄生体関係の確立への
中心である。宿主細胞内でのこの局在が微生物を宿主の
防御から保護し、そして微生物が上皮障壁を越えそして
全身に分配されることを可能にする。細菌が宿主組織に
入るための精確な機構は不明であった。病原体の侵入性
は、宿主細胞の健康及び生存にとって有害であるが、分
子及び凝集体が無傷の細胞膜を横切って移行する機構を
提供する。従って、侵入性を無害の微生物株に移すこと
ができれば、この株は、注目の分子を宿主細胞の細胞質
及びオルガネラに輸送するためのビヒクルとして機能す
ることができるであろう。 さらに、微生物が哺乳類細胞への遺伝物質の移行をも
たらすことができることが考慮される。この方法によ
り、新しい遺伝的能力が宿主細胞に付与され得るであろ
う。注目される１つの能力は、病原体の表面膜蛋白質又
はエンベロープ蛋白質の合成である。 次に、これらの蛋白質は、宿主が該病原体による感染
の効果に罹ることなく、強い免疫反応をもたらす抗原と
して機能するであろう。 〔従来の技術〕 上皮細胞へのイエルシニア・シュードツベルクローシ
ス（Yersinia psuedotuberclosis）の侵入がBovallius
及びNilsson（1975）Can.J.Microbiol.21:1997−2007、
及びBolin等（1982）Infect.Immun.37:506−512により
報告されている。シゲラ（Shigellae）の侵入性に関連
する因子がHela等（1983）Infect.Immum.40:340−350に
より記載されている。Sansonetti等、前掲（1983）39:1
392−1402、及びMaurelli等、前掲（1985）49:164−171
は侵入のために必須の機能をコードするシゲラにおける
プラスミドの操作を記載している。 〔発明が解決しようとする問題点及び問題点を解決する
ための手段〕 この発明は、ビヒクルとして微生物を使用して外来性
分子を哺乳類細胞宿主に導入するための手段を提供す
る。 この方法は、侵入性微生物から侵入の遺伝的能力を単
離し、そして侵入能力を付与する移入された遺伝子を自
然には有しない受容体単細胞微生物に前記遺伝的能力を
移送し、適当であればこの修飾された受容体細胞におい
て追加の修飾を行い、そしてこの修飾された微生物によ
る侵入に感受性の哺乳類細胞を該修飾された単細胞微生
物と接触せしめることを含む。侵入と関連する遺伝子領
域を同定するためのスクリーニング方法が提供され、こ
の領域は受容体微生物に直接に導入されるか、又は導入
に先立ってさらに修飾される。この受容体微生物は、種
々の分子、特に巨大分子を侵入に対して感受性の哺乳類
宿主に導入するためのビヒクルとして使用することがで
きる。 考慮すべきこの発明の第１の観点は、侵入の遺伝的能
力を同定するための選択方法であろう。侵入性単細胞微
生物を選択し、機械的に、又は１もしくは複数の制限酵
素による部分消化もしくは完全消化により、ゲノムを断
片化し、そしてこの断片を適当な複製系に連結して非侵
入性単細胞微生物に導入する。複製系はプラスミド又は
ウイルスに由来することができ、好ましくは、１又はそ
れより大きなコピー数を有するベクターを得る。コピー
数は200以上であることができる。 ベクターは宿主に対して致命的であってはならないの
みならず、生存性の過度の低下をもたらしてはならな
い。好ましくは、ベクターは、該ベクターを含む受容体
単細胞微生物の選択を可能にするマーカーを有すべきで
ある。種々のマーカー、例えば殺生物剤耐性、例えば抗
生物質耐性又は重金属耐性、栄養要求宿主に原栄養性を
付与する遺伝子、免疫性等を用いることができる。 ベクターに挿入されたゲノム断片は通常、約2kb以上
であって約50kb以下であり、一般に約５〜20kbの範囲に
ある。便利には、パッケージの要件に基いて望所の範囲
の断片の選択をもたらすウイルスベクターを用いること
ができる。ベクターを受理している微生物を選択するこ
とは必須ではないが、受容体単細胞微生物を選択するこ
とが好ましい。好ましくは、ベクターは安定なエピゾー
ム性維持が可能であるべきであり、又はゲノムへの組込
が可能であるべきである。組込が用いられる場合、遺伝
子の増幅が好ましい。 侵入性単細胞微生物のゲノムを機械的に剪断するか、
又は１もしくは複数の制限酵毒により部分消化もしくは
完全消化して、約２〜20kbpの範囲の断片を得る。次
に、この断片を、適当なベクター、例えばウイルス性ベ
クター、例えばコスミド、又はプラスミドベクター、例
えばpBR322に挿入する。非侵入性単細胞微生物を前記ベ
クターによりトランスフェクトするか又は形質転換し、
そして修飾された生物をマーカー、例えば抗生物質耐性
により選択する。次に、目的とするクローンを次の方法
により濃縮する。 生存している生物をクローン化し、適当な栄養培地に
懸濁し、そして侵入感受性哺乳類細胞のコンフルエント
層に導入する。細胞を十分な時間、通常約１時間以上で
あって約12時間以下、便利には約２〜６時間、細胞の生
存を維持する条件下でインキュベートする。次に、細胞
を非付着受容体微生物を除去する条件下で厳重にしかし
注意深く洗浄し、こうして付着微生物のみが哺乳類細胞
単層に結合したまま残るようにする。次に、吸収された
細胞を、水性媒体中一般に約0.1〜２％、さらに便利に
は約0.5〜1.5％の範囲の濃度の隠和な洗剤、例えば非イ
オン性洗剤で処理することによって単層から遊離せしめ
る。 侵入能力を破壊するトランスポゾン挿入を同定するた
めにトランスポゾンマッピングを用いることができる。
こうして、構造遺伝子をその関連する制御シグナルと共
に断片上の特定の部位にマップすることができる。他の
技法は、部分消化の使用、侵入能力のクローニング及び
スクリーニング、並びにこれに続く、構造遺伝子及びそ
の関連する制御配列を示すものとしての、転写及び翻訳
に関連する特定の配列の配列決定及び同定を含む。 所望により、制御シグナル、特に転写開始シグナル
を、天然転写開始シグナル領域に他の遺伝子に関連する
転写シグナル領域を付加するか又はこれにより置換する
ことにより、変形することができる。温度感受性である
もの、種々の代謝産物又は栄養の存在により誘導される
もの等の種々の転写開始領域又はプロモーターを用いる
ことができる。従って、単細胞微生物宿主により制御さ
れる転写開始領域を用いることができ、そして微生物宿
主の環境を物理的又は化学的に変化せしめることにより
侵入能力を活性化又は不活性化することができる。すな
わち、栄養又は代謝産物、例えばグリコース、トリプト
ファン、ヒスチジン、ガラクトース、ラクトース等を用
いて侵入遺伝子（inv）の発現を誘導又は抑制すること
ができる。誘導性転写制御領域は、哺乳類宿主に従っ
て、コインデューサー又はコンプレッサーが哺乳類宿主
中に天然に存在するか、又は宿主に供給し得るかに依存
して選択することができる。 次に、適当な単細胞微生物宿主に侵入能力を導入する
ために使用され得る造成物を調製することができる。侵
入の目的に依存して、広範囲の種類の細菌宿主又は真核
性微生物宿主を用いることができる。この発明の方法は
哺乳類細胞へのDNA能力の導入をもたらし、この方法に
おいては哺乳類細胞にDNAの能力を導入するためのビヒ
クルとして単細胞微生物を用いる。例えば、哺乳類細胞
中及び単細胞微生物中で複製する能力を有するシャトル
ベクターを侵入性微生物中に与えることができ、この場
合、シャトルベクターはエピゾーム要素として存在する
ことができ、又は哺乳類ゲノムに組込まれることができ
る。この方法において、クローニングのための単細胞宿
主を、哺乳類細胞宿主へのDNAの高頻度での移行のため
に直接使用することができる。すなわち、広範囲の種類
の遺伝的能力、例えばリンホカイン、ホルモン、酵素、
及び表面膜蛋白質等、例えばインターフェロン、インタ
ーロイキン、成長因子、ヒドロラーゼ、オキシドレダク
ターゼ、リセプター、抗体、組織適合性抗原等の発現の
能力を哺乳類宿主に導入することができる。 侵入性生物を使用することができる第２の態様はワク
チンとしてである。この目的のため、侵入の遺伝的能力
に加えて、表面膜蛋白質、キャプシド蛋白質又はエンベ
ロープ蛋白質、あるいはこれらの組合わせをコードする
遺伝子を侵入性の修飾された生物に導入し、これを哺乳
類に注射して免疫反応を誘導することができる。抗原を
コードする遺伝子は広範囲の種類の病原体、例えはウイ
ルス、原核性生物、例えば細菌、真核性生物、例えばカ
ビ、原生生物等、又はクラミジアのごとき中間的種から
得ることができる。多くの場合において、注目の遺伝子
は知られておりそして入手可能であり、あるいは容易に
単離することができる。知られていない場合には、目的
とする抗原をコードする遺伝子を同定するために、特定
の構造遺伝子を同定するために一般に用いられる技法を
用いることができる。 侵入性生物を使用することができる第３の態様は、分
子、特に巨大分子を哺乳類細胞性宿主にインビトロ又は
インビボで導入するためのビヒクルとしてである。例え
ば、酵素により提供される細胞毒性耐性を細胞に移入す
ることができ、又は微生物に対しては細胞毒性でない細
胞毒性剤、例えばアミノグリコシド、ヒブリトキシン等
を哺乳類細胞に移入することができる。細胞の様子を可
視化するために色素又は他のコントラスト剤を細胞に導
入することができる。ラベルされた抗体を細胞に導入し
て特定の抗原の位置を決定することができる。 多数の哺乳類複製系及びベクター、特にウイルス複製
系、特にSV−40、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス
等を使用することができる。例えば、Southern及びBer
g.J.Mol.Appl.Genet.（1982）１:327−341;及びMulliga
n及びBerg,Proc.Nati.Acad.Sci.USA（1981）78:2072−2
076を参照のこと。 １つの技法は、罹患しており、特に注目の病原体によ
る感染を受けている哺乳類宿主からの抗血清を用いるこ
とを含む。培養物中の病原体を溶菌し、そして哺乳類宿
主からの抗血清により免疫沈澱し、そして電気泳動する
ことができた。cDNA又はゲノムライブラリーを病原体か
ら調製することができた。免疫沈澱した蛋白質を少なく
とも部分的に配列決定することにより、アミノ酸配列を
同定し、これをプローブに翻訳することができた。次
に、このプローブを使用して前記ライブラリーをスクリ
ーニングし、そして該プローブに対して相補的な配列を
使用することができた。プローブはハイブリダイズする
配列を同定した。ここで、制御配列は原核性宿主により
認識され、該原核性宿主を該配列によって形質転換し、
そして発現生成物を同定することができる。構造遺伝子
の発現が原核性宿主によって認識されない場合、特定の
抗原をコードする配列を同定しそして該配列を適当な発
現ベクターに挿入するために幾つかの操作が必要とされ
る。多数の発現ベクターが依存し、そして構造遺伝子を
切断して余分のDNA配列、物に構造遺伝子の５′への配
列を除去するための種々の技法を使用することができ
る、Bal31による切り出し、プライマー修復、及びイン
ビトロ変異誘発による便利な制限部位の導入のごとき技
法はいずれも好結果に使用された。 注目の抗原は、広範囲の種類の起原、例えば細菌、例
えばボルダテラ（Bordatella）、サルモネラ（Salmonel
la）、ナイゼリア（Neisseria）、ニューモコッカス（P
neumococcus）、シゲラ（Shigellae）、イエルシニア
（Yersinia）、コレラ（Cholera）、メニンゴコッカス
（Meningococcus）、リステリア（Listeria）、ミコバ
クテリウム（Mycobacterium）等；ウイルス、例えばHTL
V−Ｉ、−II、及び−III、FeLV、HSV−１及び−２、ア
デノウイルス、バリセラ、ワクチニア、肝炎ウイルス、
インフルエンザ、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、天然痘
ウイスル、腸チフスウイルス、黄熱病ウイルス；カビ、
例えばキャンディダ（Candida）、ミクロスポルム（Mic
rosporum）、トリコフィトン（Tricophyton）、アース
ロデルマ（Arthroderma）、クリプトコッカス（Cryptoc
occus）、ブラストミセス（Blastomyces）、ヒストプラ
ズマ（Histoplasma）、コシドロイデス（Coccidroide
s）、パラコシドロイデス（Parococcidroides）、アス
ペルギルス（Aspergillus）、フィコミセテス（Phycomy
cetes）、スポロトラックス（Sporotorax）、エピデル
モフィトン（Epidermophyton）等；他の病原性微生物、
例えばクラミジア（Chlamydia）、ギアルディア（Giard
ia）等から得ることができる。 微生物は任意の便利な形態でワクチンとして投与する
ことができる。通常、生理的に許容される担体、例えば
脱イオン水、リン酸緩衝化塩溶液（PBS）、水酸化アル
ミニウム、糖等を使用することできる。通常、投与量は
経験的に決定され、約104〜1010細胞がヒト宿主に投与
され、そして大きさに比例した量が他の哺乳類宿主に適
用される。一般に、第１投与を行い、次に２〜６週間の
間隔で１回又は複数回の投与を行う。投与される特定の
量は多くの因子、例えば、宿主中での侵入微生物の生存
性、病原体の表面上での抗体の濃度、存在する異なる抗
原の数、特定の抗原に対する免疫反応のレベル等に依存
するであろう。投与は経口投与であることができ、又は
注射による静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、腹腔内
投与であることができる。生ワクチンを投与するための
方法はよく確立されており、そしてBasic and Clinical
Immunology,Stites,Stobo.Fudenberg及びWells編,Lang
e Medical Publications,ロスアルトス，カナダ,1982の
ごとき成書に記載されている。 侵入の遺伝的能力をコードする遺伝子は任意の便利な
分離源から得られる。かなりの数の微生物、例えばイエ
ルシニア（Yersinia）、クラミジア（Chlamydia）、レ
ジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophil
a）、リステリア・モノシトゲネス（Listeria monocyto
genes）、ミコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycob
acterium tuberculosis）、ミコバクテリウム・レプレ
（Mycobacterium leprae）、サルモネラ・ティポサ（Sa
lmonella typhosa）、ブルセラ・アボルッス（Brucella
abortus）、クリプトコッカス・ネオホルマンス（Cryp
tococcus neoformans）、ヒストプラズマ・カプスレシ
ョン（Histoplasma capsulation）、キャンディダ・ア
ルビカンス（Candida albicans）、トリパノソーマ・ク
リツエ（Tripanosoma cruze）、トキサプラズマ・ゴン
ディ（Toxaplasma gondi）、レイシュマニア・ドノバニ
（Leishmania donovani）等が侵入性を有することが知
られている。そして、生物は細菌、カビ又は原生動物で
あることができる。好ましい生物は、侵入能力をもたら
す単一遺伝子を提供するものである。哺乳類宿主リセプ
ターに対する親和性は約0.1以上であるべきである。特
に興味あるのは、侵入性生物の典型的なものとして実験
の部に示すイエルシニアである。この能力を提供する遺
伝子をinvと称し、その表現型をINVと標示する。 侵入性となるように修飾される非侵入性宿主は原核性
でも真核性でもよく、そしてその最終目的に依存して選
択される。生物が、培養された哺乳類細胞へのDNAの移
入のためのビヒクルである場合、任意の便利な生物、特
に移送すべきDNAをクローニングするために使用するこ
とができる生物を用いることができる。従って、E.コリ
の多くの株、例えばK12株を侵入性になるように修飾す
るための受容体微生物として用いることができる。修飾
された微生物宿主をワクチンとして使用する場合、宿主
は一般に、無毒（非病原性）であるように、長期間にわ
たって、好ましくは予防免疫注射された宿主中で３日以
上、細胞外で生存できるように、そして予防免疫注射さ
れた宿主中にすでにある除去機構にかけられるように選
択される。好ましくは、修飾された受容体微生物はパイ
ロジエン、毒性又は他の病気の症状を生じさせる因子を
含まないであろう。無毒とは、投与量及び投与経路にか
かわらず免疫適格宿主についていかなる病気も観察され
ないことを意味する。病原性微生物、特に弱毒性病原微
生物を使用することができるが、病原性に復帰する可能
性が存在するため、これらは好ましくない。侵入性を有
するように修飾することができる微生物宿主には、E.コ
リのほかに、スタフィロコッカス（Staphilococcus）、
ニューモコカッス（Pneumococcus）、ストレプトコッカ
ス（Streptococcus）、例えばミュータンス（motan
s）、ナイゼリア（Nisseria）、例えばカタルハリス（c
atarrhalis）、バイロネラ（Veillonella）、ラクトバ
シルス（Lactobacilli）、コリネバクサリウム（Coryne
bacterium）、クロストリジウム（Clostridium）、ヘモ
ファリス・バシルス（Hemophilic bacillus）、バクテ
ロイデス（Bacteroides）、アクチノミセーテス（Actin
omycetes）、スピロヘータ（Spirochete）、マイコプラ
ズマ（Micoplasma）等が含まれる。 受容体微生物に侵入性のための遺伝的能力を導入する
方法は、形質転換、例えばカルシウム沈澱DNA法、トラ
ンスフェクション、形質導入、接合、融合等を含む任意
の常法でよい。適用することができる技法はManiatis
等,A Laboratory Manual,コールドスプリングハーバー
ラボラトリー，コールドスプリングハーバー，ニューヨ
ーク,1982に記載されている。すでに記載したように、
侵入の遺伝的能力を受理した微生物の選択を可能にする
マーカーが存在するであろう。次に、生物を適当な栄養
培地中で増殖せしめ、そして必要に応じて使用する。 侵入性微生物を用いて受動免疫のための抗血清を調製
することができる。すなわち、広範囲の病原体に対する
及び特定の病原体の株に対する抗体を有するγ−グロブ
リンを調製することができる。硫酸アンモニウム沈澱及
び既知の技法に従う分画によって、γ−グロブリンを血
清から単離しそして精製することができる。哺乳類宿主
への投与は、任意の生理的に許容される担体中一般に50
〜500mg/kg宿主の量である。投与は通常、注射、例えば
静脈内注射による。修飾された受容体微生物はまた、該
修飾された微生物にとって外来性の抗原に対する抗体又
は抗原それ自体の存在を検出するためのアッセイにおい
て使用することができる。これらはまた侵入性微生物と
の競争において使用することができ、従って医療におい
て有用である。 さらに、この発明の微生物はinv遺伝子により発現さ
れる。蛋白質の発現のために使用することができる。特
に、高コピー数ベクターを手にすることにより、修飾さ
れた外来性微生物を集菌し、溶菌し、そして常法によ
り、例えばアフィニティークロマトグラフィー、電気泳
動、クロマトグラフィー等により、inv抗原を単離する
ことができる。 実験 次に、例によりこの発明をさらに具体的に説明する。
但し、これによりこの発明の範囲を限定するものではな
い。 侵入性表現型の濃縮 Y.シュードツベルクローシス（Y.pseudotuberculosi
s）YPIII（p-）株〔Bolin及びWolf−Watz,Infect.Immu
n.（1984）43:72−78〕から単離された染色体DNAのSau3
AI消化物のサイズ分画物を、アンピシリン耐性をコード
しそしてさらにその低コピー数（５−８）により特徴付
けられるコスミドクローニングベクターであるpREG153
（R.Gill博士から入手可能）のBamHI部位に連結するこ
とによりコスミドバンクを造成した〔Hohn.Methodsin E
nzymology（1979）68:299−309;Koomey等Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA（1982）79:7881−7885〕。連結混合物のアリ
コートをλファージヘッドにMMSA345（F.Stahl博士から
入手可能）から調製した抽出物と共にインビトローパッ
ケージし〔Enquist及びSternberg,Methods in Enzymolo
gy（1979）68:281−298〕、そして次にE.コリK12株HB10
1（Maniatis等,A Laboratory Mannual）に感染せしめ、
アンピシリン耐性形質導入体を選択した。プールされた
細菌を培地中で一夜増殖せしめ、無菌PBS中で２回洗浄
し、そして５×108細菌/mlの密度に再懸濁した。次に、
洗浄した細菌（2ml）を、RPMI1640培地（イルビン・バ
イオロジカルス）中に増殖した１×107のHEp−２細胞を
含むコンフルエント単層に導入し、そして５％CO2の雰
囲気中で36℃にて３時間インキュベートした。次に、単
層を無菌PBSで10回洗浄して未付着細菌を除去した。単
層に付着したままの細菌クローンを脱イオン水中１％ト
リトン×100で遊離せしめ、そして個々のコロニーに分
けるために細菌培地上にプレートした。 侵入性培養物のスクリーニング 形質転換された細菌の飽和培養物を28℃にて増殖せし
め、PBS中で２回洗浄し、そして３×108細菌/mlに濃縮
した。各株のアリコート（50μｌ）を、RPMI1640培地中
ミクロタイターウエル（24ウエル，ファルコン3047ミク
ロタイター皿）当り２×105動物細胞の濃度で接種したH
Ep−２細胞の単層培養物に加えた。細菌を600×ｇで遠
心して単層上に沈澱せしめ〔Devenish及びSchiemann,In
fect,Immun.（1981）32:48−55〕、そして感染した培養
物を５％CO2雰囲気中で36℃にて３時間イキュベート
し、細菌の結合及び侵入を可能にした。無菌PBSで３回
洗浄することにより未付着細菌を単層から除去し、そし
て40μg/mlのゲンタマイシン（シグマ・ケミカル）を含
有するRPMI培地を各ミクロタイターウエルに加えた。抗
生物質の存在下でインキュベーションを36℃にて２時間
続け、その後単層をPBSにより２回洗浄した。次に、１
％のトリトンメ100を添加することにより、取り込まれ
た細菌を単層から遊離せしめ、そしてＬ寒天プレート上
でタイトレートした〔Miller,Experiments in Molecula
r Genetisc,コールドスプリングハーバーラボラトリー
ス，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク（197
2）〕。 次の表に結果を示す。 濃縮に対して生存した22の候補株の内12が侵入性であ
った。細菌の侵入に等しい、ゲンタマイシン処理からの
がれる効率は、DNA供与体として使用したY.シュードツ
ベルクローシス株について見られるそれと類似してい
た。 単離された細菌誘導体が培養動物細胞に侵入できたか
否かを決定するため、幾つかの細菌株に暴露された単層
細胞の超薄切片を電子顕微鏡で分析した〔Horwitz,J.Ex
p.Med.（1983）158:1319−131〕。RPMI1640中８×105HE
p−２細胞を接種された組織培養細胞（ファルコン3046,
6ウエル皿）を６×10-7細菌の存在下で36℃にて３時間
インキュベートした。次に、単層をPBSにより10回洗浄
し、そして0.1mM EDTAを含有するPBSの存在下で37℃に
て10分間インキュベートした。単層を、EDTAの存在下PB
Sにより再度洗浄し、1mlのPBSに懸濁し、そして600×ｇ
にて10分間ペレット化した。細胞ペレットを、0.1Mカコ
ジル酸緩衝液（pH7.4）中２％グルタルアルデヒド及び
２％四酸化オスミウムで次々と固定し、次に酢酸ウラニ
ルにより染色した。エタノール中で脱水したサンプルを
スプルス（Spurrs）（ポリサイエンス）中に包埋し、薄
片化し、１％酢酸ウラニル及び酢酸鉛により次々に染色
し〔Reynolds,J.Cell.Biol.（1963）17:208−213〕、そ
してフィリップ201c電子顕微鏡により可視化した。E.コ
リK12株HB101はHEp−２細胞に入ることができない。こ
れに対して、無傷のinv座を担持する同じ細菌株は動物
細胞に結びついた多数の細菌を示した。これらの細菌
は、細胞の外側に結合しているもの、及び大細胞内小胞
中に存在するものの両者である。さらに、無傷のinv座
を有するpRI203プラスミドを担持するE.コリHB101細胞
を使用する場合侵入が観察され、他方、inv座中にTn5挿
入変異を有するプラスミドpRI203.4::Tn5を担持する同
じ細菌については侵入が観察されなかった。従って、侵
入性は機能的に無傷のinv座についてのみ勧察される。
細胞内細菌の数は実質的に減少し、そして入侵された細
胞は生存し続ける。 inv遺伝子の座は次のようにして確立した。コスミドD
NA中にTn5挿入変異を生じさせ、分析される各変異が独
立事象の結果であると過程して、１つのプラスミドpINV
A2を分析した。deBruijn及びLupski,Gene（1984）27:31
3−149の方法に従ってλｂ221rex::Tn5cI857０am23Ｐam
80からpINVA2へのトランスポジションを介して、カナマ
イシン耐性トランスポゾンTn５により変異を誘導した。
コスミドへの挿入について選択するため、カナマイシン
耐性コロニーを一緒にプールし、そしてλiac5imm21ｃt
sにより溶菌感染させた。生ずる溶菌物を用いてHB101株
はカナマイシン耐性及びアンピシリン耐性に、同時的に
形質導入した。これらの形質導入株は、コスミド上のラ
ンダム部位にTn５の挿入を含んでいた。数百個のこれら
の形質導入株を前に記載したようにして侵入性について
分析し、そして侵入性を除去した20個の変異株及び侵入
表現型に影響を与えなかった20個の挿入体のマップ位置
を決定した。各挿入が独立していることを確認するた
め、各プールからの複数の変異の物理的位置を分析し
た。侵入表現型の挿入失活に対する感受性を隣接する3.
2kb領域にマップした。この領域は、標準としてミオシ
ン、β−ガラクトシダーゼ及びホスホリパーゼＧを用い
る電気泳動によって108kdalであると示される１つの大
蛋白質をコードすることが示された。 上記のデータは、侵入（inv）の遺伝的能力は１つの
宿主から他の宿主に移行することができ、その結果、そ
の表現型が特定の表現型を欠く微生物宿主に移され得る
ことを示している。さらに、哺乳類細胞は、表面膜上の
invによりコードされる特定の構造の存在に基いて全体
細胞を取り込むことができる。このようにして、非侵入
性微生物を侵入性微生物になるように変性することがで
き、この能力を種々の目的、例えば哺乳類宿主への異種
DNA又は他の分子の導入のため、ワクチンとして有用な
ように病原体と関連する１又は多数の抗原に対する免疫
反応の誘導のため、病原体のスペクトルに対する抗体の
スペクトルを有する抗血清の製造のため、及び哺乳類宿
主細胞への病原体の侵入を阻害するために使用され得る
蛋白質の製造のために、使用することができる。 以上、理解を明瞭にするために説明及び例によりこの
発明を詳細に説明したが、この発明の範囲内で種々の変
法を行うことができよう。
そこでの生存が、好結果の宿種−寄生体関係の確立への
中心である。宿主細胞内でのこの局在が微生物を宿主の
防御から保護し、そして微生物が上皮障壁を越えそして
全身に分配されることを可能にする。細菌が宿主組織に
入るための精確な機構は不明であった。病原体の侵入性
は、宿主細胞の健康及び生存にとって有害であるが、分
子及び凝集体が無傷の細胞膜を横切って移行する機構を
提供する。従って、侵入性を無害の微生物株に移すこと
ができれば、この株は、注目の分子を宿主細胞の細胞質
及びオルガネラに輸送するためのビヒクルとして機能す
ることができるであろう。 さらに、微生物が哺乳類細胞への遺伝物質の移行をも
たらすことができることが考慮される。この方法によ
り、新しい遺伝的能力が宿主細胞に付与され得るであろ
う。注目される１つの能力は、病原体の表面膜蛋白質又
はエンベロープ蛋白質の合成である。 次に、これらの蛋白質は、宿主が該病原体による感染
の効果に罹ることなく、強い免疫反応をもたらす抗原と
して機能するであろう。 〔従来の技術〕 上皮細胞へのイエルシニア・シュードツベルクローシ
ス（Yersinia psuedotuberclosis）の侵入がBovallius
及びNilsson（1975）Can.J.Microbiol.21:1997−2007、
及びBolin等（1982）Infect.Immun.37:506−512により
報告されている。シゲラ（Shigellae）の侵入性に関連
する因子がHela等（1983）Infect.Immum.40:340−350に
より記載されている。Sansonetti等、前掲（1983）39:1
392−1402、及びMaurelli等、前掲（1985）49:164−171
は侵入のために必須の機能をコードするシゲラにおける
プラスミドの操作を記載している。 〔発明が解決しようとする問題点及び問題点を解決する
ための手段〕 この発明は、ビヒクルとして微生物を使用して外来性
分子を哺乳類細胞宿主に導入するための手段を提供す
る。 この方法は、侵入性微生物から侵入の遺伝的能力を単
離し、そして侵入能力を付与する移入された遺伝子を自
然には有しない受容体単細胞微生物に前記遺伝的能力を
移送し、適当であればこの修飾された受容体細胞におい
て追加の修飾を行い、そしてこの修飾された微生物によ
る侵入に感受性の哺乳類細胞を該修飾された単細胞微生
物と接触せしめることを含む。侵入と関連する遺伝子領
域を同定するためのスクリーニング方法が提供され、こ
の領域は受容体微生物に直接に導入されるか、又は導入
に先立ってさらに修飾される。この受容体微生物は、種
々の分子、特に巨大分子を侵入に対して感受性の哺乳類
宿主に導入するためのビヒクルとして使用することがで
きる。 考慮すべきこの発明の第１の観点は、侵入の遺伝的能
力を同定するための選択方法であろう。侵入性単細胞微
生物を選択し、機械的に、又は１もしくは複数の制限酵
素による部分消化もしくは完全消化により、ゲノムを断
片化し、そしてこの断片を適当な複製系に連結して非侵
入性単細胞微生物に導入する。複製系はプラスミド又は
ウイルスに由来することができ、好ましくは、１又はそ
れより大きなコピー数を有するベクターを得る。コピー
数は200以上であることができる。 ベクターは宿主に対して致命的であってはならないの
みならず、生存性の過度の低下をもたらしてはならな
い。好ましくは、ベクターは、該ベクターを含む受容体
単細胞微生物の選択を可能にするマーカーを有すべきで
ある。種々のマーカー、例えば殺生物剤耐性、例えば抗
生物質耐性又は重金属耐性、栄養要求宿主に原栄養性を
付与する遺伝子、免疫性等を用いることができる。 ベクターに挿入されたゲノム断片は通常、約2kb以上
であって約50kb以下であり、一般に約５〜20kbの範囲に
ある。便利には、パッケージの要件に基いて望所の範囲
の断片の選択をもたらすウイルスベクターを用いること
ができる。ベクターを受理している微生物を選択するこ
とは必須ではないが、受容体単細胞微生物を選択するこ
とが好ましい。好ましくは、ベクターは安定なエピゾー
ム性維持が可能であるべきであり、又はゲノムへの組込
が可能であるべきである。組込が用いられる場合、遺伝
子の増幅が好ましい。 侵入性単細胞微生物のゲノムを機械的に剪断するか、
又は１もしくは複数の制限酵毒により部分消化もしくは
完全消化して、約２〜20kbpの範囲の断片を得る。次
に、この断片を、適当なベクター、例えばウイルス性ベ
クター、例えばコスミド、又はプラスミドベクター、例
えばpBR322に挿入する。非侵入性単細胞微生物を前記ベ
クターによりトランスフェクトするか又は形質転換し、
そして修飾された生物をマーカー、例えば抗生物質耐性
により選択する。次に、目的とするクローンを次の方法
により濃縮する。 生存している生物をクローン化し、適当な栄養培地に
懸濁し、そして侵入感受性哺乳類細胞のコンフルエント
層に導入する。細胞を十分な時間、通常約１時間以上で
あって約12時間以下、便利には約２〜６時間、細胞の生
存を維持する条件下でインキュベートする。次に、細胞
を非付着受容体微生物を除去する条件下で厳重にしかし
注意深く洗浄し、こうして付着微生物のみが哺乳類細胞
単層に結合したまま残るようにする。次に、吸収された
細胞を、水性媒体中一般に約0.1〜２％、さらに便利に
は約0.5〜1.5％の範囲の濃度の隠和な洗剤、例えば非イ
オン性洗剤で処理することによって単層から遊離せしめ
る。 侵入能力を破壊するトランスポゾン挿入を同定するた
めにトランスポゾンマッピングを用いることができる。
こうして、構造遺伝子をその関連する制御シグナルと共
に断片上の特定の部位にマップすることができる。他の
技法は、部分消化の使用、侵入能力のクローニング及び
スクリーニング、並びにこれに続く、構造遺伝子及びそ
の関連する制御配列を示すものとしての、転写及び翻訳
に関連する特定の配列の配列決定及び同定を含む。 所望により、制御シグナル、特に転写開始シグナル
を、天然転写開始シグナル領域に他の遺伝子に関連する
転写シグナル領域を付加するか又はこれにより置換する
ことにより、変形することができる。温度感受性である
もの、種々の代謝産物又は栄養の存在により誘導される
もの等の種々の転写開始領域又はプロモーターを用いる
ことができる。従って、単細胞微生物宿主により制御さ
れる転写開始領域を用いることができ、そして微生物宿
主の環境を物理的又は化学的に変化せしめることにより
侵入能力を活性化又は不活性化することができる。すな
わち、栄養又は代謝産物、例えばグリコース、トリプト
ファン、ヒスチジン、ガラクトース、ラクトース等を用
いて侵入遺伝子（inv）の発現を誘導又は抑制すること
ができる。誘導性転写制御領域は、哺乳類宿主に従っ
て、コインデューサー又はコンプレッサーが哺乳類宿主
中に天然に存在するか、又は宿主に供給し得るかに依存
して選択することができる。 次に、適当な単細胞微生物宿主に侵入能力を導入する
ために使用され得る造成物を調製することができる。侵
入の目的に依存して、広範囲の種類の細菌宿主又は真核
性微生物宿主を用いることができる。この発明の方法は
哺乳類細胞へのDNA能力の導入をもたらし、この方法に
おいては哺乳類細胞にDNAの能力を導入するためのビヒ
クルとして単細胞微生物を用いる。例えば、哺乳類細胞
中及び単細胞微生物中で複製する能力を有するシャトル
ベクターを侵入性微生物中に与えることができ、この場
合、シャトルベクターはエピゾーム要素として存在する
ことができ、又は哺乳類ゲノムに組込まれることができ
る。この方法において、クローニングのための単細胞宿
主を、哺乳類細胞宿主へのDNAの高頻度での移行のため
に直接使用することができる。すなわち、広範囲の種類
の遺伝的能力、例えばリンホカイン、ホルモン、酵素、
及び表面膜蛋白質等、例えばインターフェロン、インタ
ーロイキン、成長因子、ヒドロラーゼ、オキシドレダク
ターゼ、リセプター、抗体、組織適合性抗原等の発現の
能力を哺乳類宿主に導入することができる。 侵入性生物を使用することができる第２の態様はワク
チンとしてである。この目的のため、侵入の遺伝的能力
に加えて、表面膜蛋白質、キャプシド蛋白質又はエンベ
ロープ蛋白質、あるいはこれらの組合わせをコードする
遺伝子を侵入性の修飾された生物に導入し、これを哺乳
類に注射して免疫反応を誘導することができる。抗原を
コードする遺伝子は広範囲の種類の病原体、例えはウイ
ルス、原核性生物、例えば細菌、真核性生物、例えばカ
ビ、原生生物等、又はクラミジアのごとき中間的種から
得ることができる。多くの場合において、注目の遺伝子
は知られておりそして入手可能であり、あるいは容易に
単離することができる。知られていない場合には、目的
とする抗原をコードする遺伝子を同定するために、特定
の構造遺伝子を同定するために一般に用いられる技法を
用いることができる。 侵入性生物を使用することができる第３の態様は、分
子、特に巨大分子を哺乳類細胞性宿主にインビトロ又は
インビボで導入するためのビヒクルとしてである。例え
ば、酵素により提供される細胞毒性耐性を細胞に移入す
ることができ、又は微生物に対しては細胞毒性でない細
胞毒性剤、例えばアミノグリコシド、ヒブリトキシン等
を哺乳類細胞に移入することができる。細胞の様子を可
視化するために色素又は他のコントラスト剤を細胞に導
入することができる。ラベルされた抗体を細胞に導入し
て特定の抗原の位置を決定することができる。 多数の哺乳類複製系及びベクター、特にウイルス複製
系、特にSV−40、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス
等を使用することができる。例えば、Southern及びBer
g.J.Mol.Appl.Genet.（1982）１:327−341;及びMulliga
n及びBerg,Proc.Nati.Acad.Sci.USA（1981）78:2072−2
076を参照のこと。 １つの技法は、罹患しており、特に注目の病原体によ
る感染を受けている哺乳類宿主からの抗血清を用いるこ
とを含む。培養物中の病原体を溶菌し、そして哺乳類宿
主からの抗血清により免疫沈澱し、そして電気泳動する
ことができた。cDNA又はゲノムライブラリーを病原体か
ら調製することができた。免疫沈澱した蛋白質を少なく
とも部分的に配列決定することにより、アミノ酸配列を
同定し、これをプローブに翻訳することができた。次
に、このプローブを使用して前記ライブラリーをスクリ
ーニングし、そして該プローブに対して相補的な配列を
使用することができた。プローブはハイブリダイズする
配列を同定した。ここで、制御配列は原核性宿主により
認識され、該原核性宿主を該配列によって形質転換し、
そして発現生成物を同定することができる。構造遺伝子
の発現が原核性宿主によって認識されない場合、特定の
抗原をコードする配列を同定しそして該配列を適当な発
現ベクターに挿入するために幾つかの操作が必要とされ
る。多数の発現ベクターが依存し、そして構造遺伝子を
切断して余分のDNA配列、物に構造遺伝子の５′への配
列を除去するための種々の技法を使用することができ
る、Bal31による切り出し、プライマー修復、及びイン
ビトロ変異誘発による便利な制限部位の導入のごとき技
法はいずれも好結果に使用された。 注目の抗原は、広範囲の種類の起原、例えば細菌、例
えばボルダテラ（Bordatella）、サルモネラ（Salmonel
la）、ナイゼリア（Neisseria）、ニューモコッカス（P
neumococcus）、シゲラ（Shigellae）、イエルシニア
（Yersinia）、コレラ（Cholera）、メニンゴコッカス
（Meningococcus）、リステリア（Listeria）、ミコバ
クテリウム（Mycobacterium）等；ウイルス、例えばHTL
V−Ｉ、−II、及び−III、FeLV、HSV−１及び−２、ア
デノウイルス、バリセラ、ワクチニア、肝炎ウイルス、
インフルエンザ、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、天然痘
ウイスル、腸チフスウイルス、黄熱病ウイルス；カビ、
例えばキャンディダ（Candida）、ミクロスポルム（Mic
rosporum）、トリコフィトン（Tricophyton）、アース
ロデルマ（Arthroderma）、クリプトコッカス（Cryptoc
occus）、ブラストミセス（Blastomyces）、ヒストプラ
ズマ（Histoplasma）、コシドロイデス（Coccidroide
s）、パラコシドロイデス（Parococcidroides）、アス
ペルギルス（Aspergillus）、フィコミセテス（Phycomy
cetes）、スポロトラックス（Sporotorax）、エピデル
モフィトン（Epidermophyton）等；他の病原性微生物、
例えばクラミジア（Chlamydia）、ギアルディア（Giard
ia）等から得ることができる。 微生物は任意の便利な形態でワクチンとして投与する
ことができる。通常、生理的に許容される担体、例えば
脱イオン水、リン酸緩衝化塩溶液（PBS）、水酸化アル
ミニウム、糖等を使用することできる。通常、投与量は
経験的に決定され、約104〜1010細胞がヒト宿主に投与
され、そして大きさに比例した量が他の哺乳類宿主に適
用される。一般に、第１投与を行い、次に２〜６週間の
間隔で１回又は複数回の投与を行う。投与される特定の
量は多くの因子、例えば、宿主中での侵入微生物の生存
性、病原体の表面上での抗体の濃度、存在する異なる抗
原の数、特定の抗原に対する免疫反応のレベル等に依存
するであろう。投与は経口投与であることができ、又は
注射による静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、腹腔内
投与であることができる。生ワクチンを投与するための
方法はよく確立されており、そしてBasic and Clinical
Immunology,Stites,Stobo.Fudenberg及びWells編,Lang
e Medical Publications,ロスアルトス，カナダ,1982の
ごとき成書に記載されている。 侵入の遺伝的能力をコードする遺伝子は任意の便利な
分離源から得られる。かなりの数の微生物、例えばイエ
ルシニア（Yersinia）、クラミジア（Chlamydia）、レ
ジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophil
a）、リステリア・モノシトゲネス（Listeria monocyto
genes）、ミコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycob
acterium tuberculosis）、ミコバクテリウム・レプレ
（Mycobacterium leprae）、サルモネラ・ティポサ（Sa
lmonella typhosa）、ブルセラ・アボルッス（Brucella
abortus）、クリプトコッカス・ネオホルマンス（Cryp
tococcus neoformans）、ヒストプラズマ・カプスレシ
ョン（Histoplasma capsulation）、キャンディダ・ア
ルビカンス（Candida albicans）、トリパノソーマ・ク
リツエ（Tripanosoma cruze）、トキサプラズマ・ゴン
ディ（Toxaplasma gondi）、レイシュマニア・ドノバニ
（Leishmania donovani）等が侵入性を有することが知
られている。そして、生物は細菌、カビ又は原生動物で
あることができる。好ましい生物は、侵入能力をもたら
す単一遺伝子を提供するものである。哺乳類宿主リセプ
ターに対する親和性は約0.1以上であるべきである。特
に興味あるのは、侵入性生物の典型的なものとして実験
の部に示すイエルシニアである。この能力を提供する遺
伝子をinvと称し、その表現型をINVと標示する。 侵入性となるように修飾される非侵入性宿主は原核性
でも真核性でもよく、そしてその最終目的に依存して選
択される。生物が、培養された哺乳類細胞へのDNAの移
入のためのビヒクルである場合、任意の便利な生物、特
に移送すべきDNAをクローニングするために使用するこ
とができる生物を用いることができる。従って、E.コリ
の多くの株、例えばK12株を侵入性になるように修飾す
るための受容体微生物として用いることができる。修飾
された微生物宿主をワクチンとして使用する場合、宿主
は一般に、無毒（非病原性）であるように、長期間にわ
たって、好ましくは予防免疫注射された宿主中で３日以
上、細胞外で生存できるように、そして予防免疫注射さ
れた宿主中にすでにある除去機構にかけられるように選
択される。好ましくは、修飾された受容体微生物はパイ
ロジエン、毒性又は他の病気の症状を生じさせる因子を
含まないであろう。無毒とは、投与量及び投与経路にか
かわらず免疫適格宿主についていかなる病気も観察され
ないことを意味する。病原性微生物、特に弱毒性病原微
生物を使用することができるが、病原性に復帰する可能
性が存在するため、これらは好ましくない。侵入性を有
するように修飾することができる微生物宿主には、E.コ
リのほかに、スタフィロコッカス（Staphilococcus）、
ニューモコカッス（Pneumococcus）、ストレプトコッカ
ス（Streptococcus）、例えばミュータンス（motan
s）、ナイゼリア（Nisseria）、例えばカタルハリス（c
atarrhalis）、バイロネラ（Veillonella）、ラクトバ
シルス（Lactobacilli）、コリネバクサリウム（Coryne
bacterium）、クロストリジウム（Clostridium）、ヘモ
ファリス・バシルス（Hemophilic bacillus）、バクテ
ロイデス（Bacteroides）、アクチノミセーテス（Actin
omycetes）、スピロヘータ（Spirochete）、マイコプラ
ズマ（Micoplasma）等が含まれる。 受容体微生物に侵入性のための遺伝的能力を導入する
方法は、形質転換、例えばカルシウム沈澱DNA法、トラ
ンスフェクション、形質導入、接合、融合等を含む任意
の常法でよい。適用することができる技法はManiatis
等,A Laboratory Manual,コールドスプリングハーバー
ラボラトリー，コールドスプリングハーバー，ニューヨ
ーク,1982に記載されている。すでに記載したように、
侵入の遺伝的能力を受理した微生物の選択を可能にする
マーカーが存在するであろう。次に、生物を適当な栄養
培地中で増殖せしめ、そして必要に応じて使用する。 侵入性微生物を用いて受動免疫のための抗血清を調製
することができる。すなわち、広範囲の病原体に対する
及び特定の病原体の株に対する抗体を有するγ−グロブ
リンを調製することができる。硫酸アンモニウム沈澱及
び既知の技法に従う分画によって、γ−グロブリンを血
清から単離しそして精製することができる。哺乳類宿主
への投与は、任意の生理的に許容される担体中一般に50
〜500mg/kg宿主の量である。投与は通常、注射、例えば
静脈内注射による。修飾された受容体微生物はまた、該
修飾された微生物にとって外来性の抗原に対する抗体又
は抗原それ自体の存在を検出するためのアッセイにおい
て使用することができる。これらはまた侵入性微生物と
の競争において使用することができ、従って医療におい
て有用である。 さらに、この発明の微生物はinv遺伝子により発現さ
れる。蛋白質の発現のために使用することができる。特
に、高コピー数ベクターを手にすることにより、修飾さ
れた外来性微生物を集菌し、溶菌し、そして常法によ
り、例えばアフィニティークロマトグラフィー、電気泳
動、クロマトグラフィー等により、inv抗原を単離する
ことができる。 実験 次に、例によりこの発明をさらに具体的に説明する。
但し、これによりこの発明の範囲を限定するものではな
い。 侵入性表現型の濃縮 Y.シュードツベルクローシス（Y.pseudotuberculosi
s）YPIII（p-）株〔Bolin及びWolf−Watz,Infect.Immu
n.（1984）43:72−78〕から単離された染色体DNAのSau3
AI消化物のサイズ分画物を、アンピシリン耐性をコード
しそしてさらにその低コピー数（５−８）により特徴付
けられるコスミドクローニングベクターであるpREG153
（R.Gill博士から入手可能）のBamHI部位に連結するこ
とによりコスミドバンクを造成した〔Hohn.Methodsin E
nzymology（1979）68:299−309;Koomey等Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA（1982）79:7881−7885〕。連結混合物のアリ
コートをλファージヘッドにMMSA345（F.Stahl博士から
入手可能）から調製した抽出物と共にインビトローパッ
ケージし〔Enquist及びSternberg,Methods in Enzymolo
gy（1979）68:281−298〕、そして次にE.コリK12株HB10
1（Maniatis等,A Laboratory Mannual）に感染せしめ、
アンピシリン耐性形質導入体を選択した。プールされた
細菌を培地中で一夜増殖せしめ、無菌PBS中で２回洗浄
し、そして５×108細菌/mlの密度に再懸濁した。次に、
洗浄した細菌（2ml）を、RPMI1640培地（イルビン・バ
イオロジカルス）中に増殖した１×107のHEp−２細胞を
含むコンフルエント単層に導入し、そして５％CO2の雰
囲気中で36℃にて３時間インキュベートした。次に、単
層を無菌PBSで10回洗浄して未付着細菌を除去した。単
層に付着したままの細菌クローンを脱イオン水中１％ト
リトン×100で遊離せしめ、そして個々のコロニーに分
けるために細菌培地上にプレートした。 侵入性培養物のスクリーニング 形質転換された細菌の飽和培養物を28℃にて増殖せし
め、PBS中で２回洗浄し、そして３×108細菌/mlに濃縮
した。各株のアリコート（50μｌ）を、RPMI1640培地中
ミクロタイターウエル（24ウエル，ファルコン3047ミク
ロタイター皿）当り２×105動物細胞の濃度で接種したH
Ep−２細胞の単層培養物に加えた。細菌を600×ｇで遠
心して単層上に沈澱せしめ〔Devenish及びSchiemann,In
fect,Immun.（1981）32:48−55〕、そして感染した培養
物を５％CO2雰囲気中で36℃にて３時間イキュベート
し、細菌の結合及び侵入を可能にした。無菌PBSで３回
洗浄することにより未付着細菌を単層から除去し、そし
て40μg/mlのゲンタマイシン（シグマ・ケミカル）を含
有するRPMI培地を各ミクロタイターウエルに加えた。抗
生物質の存在下でインキュベーションを36℃にて２時間
続け、その後単層をPBSにより２回洗浄した。次に、１
％のトリトンメ100を添加することにより、取り込まれ
た細菌を単層から遊離せしめ、そしてＬ寒天プレート上
でタイトレートした〔Miller,Experiments in Molecula
r Genetisc,コールドスプリングハーバーラボラトリー
ス，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク（197
2）〕。 次の表に結果を示す。 濃縮に対して生存した22の候補株の内12が侵入性であ
った。細菌の侵入に等しい、ゲンタマイシン処理からの
がれる効率は、DNA供与体として使用したY.シュードツ
ベルクローシス株について見られるそれと類似してい
た。 単離された細菌誘導体が培養動物細胞に侵入できたか
否かを決定するため、幾つかの細菌株に暴露された単層
細胞の超薄切片を電子顕微鏡で分析した〔Horwitz,J.Ex
p.Med.（1983）158:1319−131〕。RPMI1640中８×105HE
p−２細胞を接種された組織培養細胞（ファルコン3046,
6ウエル皿）を６×10-7細菌の存在下で36℃にて３時間
インキュベートした。次に、単層をPBSにより10回洗浄
し、そして0.1mM EDTAを含有するPBSの存在下で37℃に
て10分間インキュベートした。単層を、EDTAの存在下PB
Sにより再度洗浄し、1mlのPBSに懸濁し、そして600×ｇ
にて10分間ペレット化した。細胞ペレットを、0.1Mカコ
ジル酸緩衝液（pH7.4）中２％グルタルアルデヒド及び
２％四酸化オスミウムで次々と固定し、次に酢酸ウラニ
ルにより染色した。エタノール中で脱水したサンプルを
スプルス（Spurrs）（ポリサイエンス）中に包埋し、薄
片化し、１％酢酸ウラニル及び酢酸鉛により次々に染色
し〔Reynolds,J.Cell.Biol.（1963）17:208−213〕、そ
してフィリップ201c電子顕微鏡により可視化した。E.コ
リK12株HB101はHEp−２細胞に入ることができない。こ
れに対して、無傷のinv座を担持する同じ細菌株は動物
細胞に結びついた多数の細菌を示した。これらの細菌
は、細胞の外側に結合しているもの、及び大細胞内小胞
中に存在するものの両者である。さらに、無傷のinv座
を有するpRI203プラスミドを担持するE.コリHB101細胞
を使用する場合侵入が観察され、他方、inv座中にTn5挿
入変異を有するプラスミドpRI203.4::Tn5を担持する同
じ細菌については侵入が観察されなかった。従って、侵
入性は機能的に無傷のinv座についてのみ勧察される。
細胞内細菌の数は実質的に減少し、そして入侵された細
胞は生存し続ける。 inv遺伝子の座は次のようにして確立した。コスミドD
NA中にTn5挿入変異を生じさせ、分析される各変異が独
立事象の結果であると過程して、１つのプラスミドpINV
A2を分析した。deBruijn及びLupski,Gene（1984）27:31
3−149の方法に従ってλｂ221rex::Tn5cI857０am23Ｐam
80からpINVA2へのトランスポジションを介して、カナマ
イシン耐性トランスポゾンTn５により変異を誘導した。
コスミドへの挿入について選択するため、カナマイシン
耐性コロニーを一緒にプールし、そしてλiac5imm21ｃt
sにより溶菌感染させた。生ずる溶菌物を用いてHB101株
はカナマイシン耐性及びアンピシリン耐性に、同時的に
形質導入した。これらの形質導入株は、コスミド上のラ
ンダム部位にTn５の挿入を含んでいた。数百個のこれら
の形質導入株を前に記載したようにして侵入性について
分析し、そして侵入性を除去した20個の変異株及び侵入
表現型に影響を与えなかった20個の挿入体のマップ位置
を決定した。各挿入が独立していることを確認するた
め、各プールからの複数の変異の物理的位置を分析し
た。侵入表現型の挿入失活に対する感受性を隣接する3.
2kb領域にマップした。この領域は、標準としてミオシ
ン、β−ガラクトシダーゼ及びホスホリパーゼＧを用い
る電気泳動によって108kdalであると示される１つの大
蛋白質をコードすることが示された。 上記のデータは、侵入（inv）の遺伝的能力は１つの
宿主から他の宿主に移行することができ、その結果、そ
の表現型が特定の表現型を欠く微生物宿主に移され得る
ことを示している。さらに、哺乳類細胞は、表面膜上の
invによりコードされる特定の構造の存在に基いて全体
細胞を取り込むことができる。このようにして、非侵入
性微生物を侵入性微生物になるように変性することがで
き、この能力を種々の目的、例えば哺乳類宿主への異種
DNA又は他の分子の導入のため、ワクチンとして有用な
ように病原体と関連する１又は多数の抗原に対する免疫
反応の誘導のため、病原体のスペクトルに対する抗体の
スペクトルを有する抗血清の製造のため、及び哺乳類宿
主細胞への病原体の侵入を阻害するために使用され得る
蛋白質の製造のために、使用することができる。 以上、理解を明瞭にするために説明及び例によりこの
発明を詳細に説明したが、この発明の範囲内で種々の変
法を行うことができよう。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
// Ｃ０７Ｋ 14/24 Ｃ０７Ｋ 14/24
Ｃ１２Ｎ 15/09 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．細菌への外来性DNAの導入の結果として、哺乳類細
胞への侵入のために必要とされる単一の膜蛋白質の発現
をもたらす、侵入表現型を有する細菌及びその子孫。 ２．前記細菌が、侵入感受性哺乳類宿主に感染すること
ができる少なくとも１種類の病原体のエンベロープ蛋白
質、キャプシド蛋白質、又は表面膜蛋白質を発現する少
なくとも１つの追加の外来性遺伝子を有する、特許請求
の範囲第１項に記載の細菌。 ３．前記細菌がE.コリ（E.coli）である、特許請求の範
囲第１項に記載の細菌。 ４．前記細菌が哺乳類複製系を有するプラスミドを含有
する、特許請求の範囲第１項に記載の細菌。 ５．前記プラスミドが哺乳類蛋白質を発現することがで
きる遺伝子を含有する、特許請求の範囲第４項に記載の
細菌。 ６．前記細菌中に天然には見出されない、前記膜蛋白質
以外の化学物質を含有する、特許請求の範囲第１項に記
載の細菌。 ７．細菌への外来性DNAの導入の結果として、哺乳類細
胞への侵入のために必要とされる単一膜蛋白質の発現を
もたらす、侵入表現型を有する細菌及びその子孫であっ
て、侵入感受性哺乳類宿主に感染することができる少な
くとも１種類の病原体のエンベロープ蛋白質、キャプシ
ッド蛋白質、又は表面膜蛋白質を発現する少なくとも１
つの追加の外来性遺伝子を有するものの、免疫適格感受
性哺乳動物宿主からの免疫反応をもたらすのに十分な量
を、生理的に許容される担体と共に含んで成るワクチ
ン。 ８．前記細菌がE.コリ（E.coli）である特許請求の範囲
第７項に記載のワクチン。 ９．イエルシニア（Yersinia）からのinv−フェノタイ
プをコードする遺伝子を含有するE.コリ株である特許請
求の範囲第１項に記載の細菌。 １０．イエルシニア（Yersinia）inv遺伝子の発現生成
物の製造方法であって、発現することができるイエルシ
ニアinv遺伝子のコピーを含有する細菌を栄養培地中で
増殖せしめることにより前記発現生成物を生成せしめ； 前記細菌を回収し；そして、 この回収された細菌を溶菌しそして前記発現生成物を単
離する； ことを含んで成る方法。
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