JPS6269982A - 侵入性微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 微生物の多くの種について、哺乳類細胞への侵入及びそ
こでの生存が、好結果の宿主−寄生体関係の確立への中
心である。宿主細胞内でのこの局在が微生物を宿主の防
御から保護し、そして微生物が上皮障壁を越えそして全
身に分配されること全可能にする。＆１７ｍが宿主組織
に入るための梢確な機構は不明でめった。病原体の侵入
性は、宿主細胞の健康及び生存にとって有害であるが、
分子及び凝集体が無傷の細胞層を横切って移行する機構
を提供する。従って、没入性を無害の微生物株に移すこ
とができれば、この株は、注目の分子を宿主細胞の細胞
質及びオルガネラＶＣ４１ｄｌ送するためのビヒクルと
して機能することができるであろう。

さらに、微生物が哺乳類細胞への遺伝物質の移行をもた
らすことができることが考慮される。この方法によシ、
新しい遺伝的能力が宿主細胞に付与され得るであろう。

注目される１つの能力は、病原体の表面膜蛋白質又はエ
ンベローｆ蛋白質の合成である。

次に、これらの蛋白質は、宿主が該病原体による感染の
効果に罹ることなく、強い免疫反応をもたらす抗原とし
て機能するであろう。

以下全白 〔従来の技術〕 上ｆｆ１ａｌ胞へのイエルシニア・シュードラペルクロ
ーシス（　Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｐｓｕｅｄｏｔｕｂｅｒ
ｅｌｏｓｉｓ　）の侵入がＢｏｖａｌｌｉｕｓ及びＮｉ
１ｍ５ｏｎ　（　１　９　７　５　）Ｃａｎ．　Ｊ．　
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２１　：　１　９　９　７　−
　２００７、及びＢｏｌｌｎ等（　１　９８　２　）　
Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　３７二５０６−５１２
によシ報告されている。シグラ（　Ｓｈｉｇｅｌｌａｅ
）の侵入性に関連する因子がＨｅ１ａ等（１９８３　）
　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｍ．　４０：３４０−３５
０Ｖｃよシ記載されている。Ｓａｎ＋ｓｏｎ＠ｔｔｉ　
　等、前掲（１９８３）３９：１３９２−１４０２、及
びＭａｕｒ＠１１１等、前掲（１９８５）４９：１６４
−１７１は侵入のために必須の機能をコードするシグラ
におけるプラスミドの操作全記載している。

〔発明が解決しようとする問題点及び問題点を解決するための手段〕

この発明は、ビヒクルとして微生物を使用して外来性分
子金哺乳類細胞宿主に導入するための手段を提供する。

この方法は、侵入性微生物から侵入の遺伝的能力を単離
し、そして侵入能力全付与する移入された遺伝子を自然
には有しない受容体単細胞微生物に前記遺伝的能力を移
送し、適当であればこの修飾された受容体細胞において
追加の修飾を行い、そしてこの修飾された微生物による
侵入に感受性の哺乳類細胞を該修飾された単細胞微生物
と接触せしめることを含む。侵入と関連する遺伝子領域
を同定するためのスクリーニング方法が提供され、この
領域は受容体微生物に直接に導入されるか、又は導入に
先立ってさらに修飾される。この受容体微生物は、種々
の分子、特に巨大分子全侵入に対して感受性の哺乳類宿
主に導入するためのビヒクルとして使用することができ
る。

考慮すべきこの発明の第１の観点は、侵入の遺伝的能力
を同定するための選択方法であろう。侵入性単細胞微生
物を選択し、機械的に、又は１もり．＜は複数の制限酵
素による部分消化もしくは完全消化によ）、ｒツムを断
片化し、そしてこの断片を適当な複製系に連結して非侵
入性単細胞微生物に導入する。複製系はプラスミド又は
ウィルスに由来することができ、好ましくは、１又はそ
れより大きなコピー数を有するベクターを得る。コピー
数は２００以上であることができる。

ベクターは宿主に対して致命的であってはならないのみ
ならず、生存性の過度の低下をもたらしてはならない。

好ましくは、ベクターは、該ベクターを含む受容体単細
胞微生物の選択を可能にするマーカー金有すべきである
。糧々のマーカー、例えは殺生物剤耐性、例えば抗生物
質耐性又は重金属耐性、栄養費求宿主に原栄養性を付与
する遺伝子、免疫性等を用いることができる。

ベクターに挿入されたｒツム断片は通常、約２ｋｂ以上
であって約５０　ｋｂ以下であり、一般に約５〜２０　
ｋｂ　の範囲にある。便利には、パッケージの要件に基
いて望所の範囲の断片の選択をもたらすウィルスベクタ
ーを用いることができる。ベクターを受理している微生
物を選択することは必須ではないが、受容体単細胞微生
物ｔ−選択することが好ましい。好ましくは、ベクター
は安定なエピゾーム性維持が可能であるべきであシ、又
はゲノムへの組込が可能であるべきである０組込が用い
られる場合、遺伝子の増幅が好ましい。

侵入性単細胞微生物のゲノムを機械的に剪断するか、又
は１もしくは複数の制限酵毒により部分消化もしくは完
全消化して、約２〜２０　ｋｂｐの範囲の断片を得る。

次に、この断片を、適当なベクター、例えはウィルス性
ベクター、例えばコスミド、又はプラスミドベクター、
例えばｐＢＲ３２２に挿入する。非侵入性単細胞微生物
を前記ベクターによシトランスフェクトするか又は形質
転換し、そして修飾された生物をマーカー、例えは抗生
物質耐性によシ選択する。次に、目的とするクローンを
次の方法により礫縮する。

生存している生物をクローン化し、適当な栄養培地に懸
濁し、そして侵入感受性哺乳類細胞のコンフルエント層
に導入する。細胞を十分な時間、通常約１時間以上であ
って約１２時間以下、便利には約２〜６時間、細胞の生
存を維持する条件下でインキュベートする。次に、細胞
を非付着受容体微生物を除去する条件下で厳重にしかし
注意深く洗浄し、こうして付着微生物のみが哺乳類細胞
単層に結合しｆｃ″１ま残るようにする。次に、吸収さ
れた細胞を、水性媒体中一般に約０．１〜２％、さらに
便利には約０．５〜１．５％の範囲の濃度の穏和な洗剤
、例えは非イオン性洗剤で処理することによって単層か
ら遊離せしめる。

侵入能力を破壊するトランスポゾン挿入を同定するため
にトランスデシンマツピングを用いることができる。こ
うして、構造遺伝子をその関連する制御シグナルと共に
断片上の特定の部位にマツプすることができる。他の技
法は、部分消化の使用、侵入能力のクローニング及びス
クリーニ７式並びにこれに続く、構造遺伝子及びその関
連する制御配列ケ示すものとしての、転写及び翻訳に開
運する特定の配列の配列決定及び同定を含む。

所望によ勺、制御シグナル、特に転写開始シグナルを、
天然転写開始シグナル領域に他の遺伝子に関連する転写
シグナル領域を伺加するか又はこれにより置換すること
により１、変形することができる。温度感受性で、ある
もの、種々の代謝産物又は栄養の存在によシ誘導される
もの等の釉々の転写開始領域又はプロモーターを用いる
ことができる。従って、単細胞微生物宿主により制御さ
れる転写開始領域を用いることができ、そして微生物宿
主の環境を物理的又は化学的に変化せしめることによシ
侵入能力を活性化又は不活性化することができる。すな
わち、栄養又は代謝産物、例えばグルコース、トリプト
ファン、ヒスチジン、ガラクトース、ラクトース等を用
いて侵入遺伝子（ｉｎｖ）の発埃を誘導又は抑制するこ
とができる。誘導性転写制御領域は、哺乳類宿主に従っ
て、コインデューサー又はコレデレッサーが哺乳類宿主
中に天然に存在するか、又は宿主に供給し得るかに依存
して選択することができる。

次に、適当な単細胞微生物宿主に侵入能力を導入するた
めに使用され得る造成物ヲ調製することができる。侵入
の目的に依存して、広範囲の種類の細菌宿主又は真核性
微生物宿主を用いることができる。この発明の方法は哺
乳類細胞へのＤＮＡ能力の導入をもたらし、この方法に
おいては哺乳類細胞にα執の能力を導入するためのビヒ
クルとして単細胞微生物？用いる。例えば、哺乳類細胞
中及び単細胞微生物中で複製する能力を有するシャトル
ベクター金侵入性微生物中に与えることができ、この場
合、シャトルベクターはエピゾーム要素として存在する
ことができ、又は補乳類ダノムに組込まれることができ
る。この方法において、クローニングのための単細胞宿
主を、哺乳類細胞宿主へのＩＩ（Ａの高頻度での移行の
ために直接使用することができる。すなわち、広範囲の
種類の遺伝的能力、例えばリンホカイン、ホルモン、酵
素、及び表面膜蛋白質等、例えばインターフェロン、イ
ンターロイキン、成長因子、ヒドロラーゼ、オキシドレ
ダクターゼ、リセデター、抗体、Ｍｉ織適合性抗原等の
発現の能力を哺乳類宿主に導入することができる。

侵入性生物を使用することができる第２の態様はワクチ
ンとしてである。この目的のため、侵入の遺伝的能力に
加えて、表面膜蛋白質、キャプシド蛋白質又はエンベロ
ープ蛋白質、あるいはこれらの組合わせをコードする遺
伝子を侵入性の修飾された生物に導入し、これ金哺乳類
に注射して免疫反応を誘導することができる。抗原をコ
ードする遺伝子は広範囲の種類の病原体、例えばウィル
ス、原核性生物、例えは細菌、真核性生物、例えはカビ
、原生生物等、又はクラミゾアのごとき中間的種から得
ることができる。多くの場合において、注目の遺伝子は
知られておりそして入手可能であシ、あるいは容易に単
離することかできる。

知られていない場合には、目的とする抗ＪＱをコードす
る遺伝子を同定するために、特定の構造遺伝子を同定す
るために一般に用いられる技法を用いることができる。

侵入性生物を使用することができる第３の態様は、分子
、特に巨大分子を踊乳類細胞性宿主にインビトロ又はイ
ンビデで導入するためのビヒクルとしてである。例えば
、酵素によシ提供される細胞毒性耐性を細胞に移入する
ことができ、又は微生物に対しては細胞毒性でない細胞
毒性剤、例えばアミノグリコシド、ヒプリトキシン等ヲ
補乳類細胞に移入することができる。細胞の様子全可視
化するために色素又は他のコントラスト剤を細胞に導入
することができる。ラベルされた抗体ｔｍ胞に導入して
特定の抗原の位を全決定することができる。

多数の哺乳類複製系及びベクター、特にウィルス複製糸
、特に５Ｖ−４０，アデノウィルス、ウシ乳頭願ウィル
ス等を使用することができる。例を参照のこと。

１つの技法は、極意しておシ、特に注目の病原体による
感染を受けている哺乳類宿主からの抗血清を用層ること
を含む。培養物中の＠原体を溶菌し、セして哺乳類宿主
からの抗血清により免疫沈澱し、そして電気泳動するこ
とができた。ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーを病原体
から調製することができた。免疫沈澱した蛋白質を少な
くとも部分的に配列決定することにより、アミノ酸配列
を同定し、これをプローグに翻訳することができた。

次に、このプローブを使用して前記ライブラリーをスク
リーニングし、そして該プローブに対して相補的な配列
全使用することができた。プローブとハイブリダイズす
る配列を同定した。ここで、制御配列は原核性宿主によ
り認識され、該原核性宿主全該配列によって形質転換し
、そして発現生成物を同定することができる。構造遺伝
子の発現が原核性宿主によって認識されない場合、特定
の抗原をコードする配列を同定しそして該配列を適当な
発現ベクターに挿入するために幾つかの操作が必要とさ
れる。多数の発現ベクターが存在し、そして構造遺伝子
を切断して余分のＤＮＡ配列、物に構造遺伝子の５′へ
の配列を除去するために九々の技法を使用することがで
きる。Ｂａｔ　３１による切り出し、プライマー修復、
及びインビトロ変異誘発による便利な制限部位の導入の
ごとき技法はいずれも好結果に使用された。

注目の抗原は、広範囲の種類の起原、例えば細菌、例え
ばボルダテラ（Ｂｏｒｄａｔｓｌｌｍ　）　、サルモリ
ステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉｍ　）、ミコバクテリウム（
Ｍｙｃｏｂａｃｔ＠ｒｉｕｍ　）等；ウィルス、例えば
ＨＴＬＶ−１、−Ｉ［、及び−■、Ｆ＊ＬＶ　、　Ｈ８
Ｖ　−１及び−２、アデノウィルス、バリセラ、ワクチ
ニア、肝炎ウィルス、インフルエンザ、麻珍ウィルス、
ｉ疹つィルス、天然痘ウィルス、腸チフスウィルス、黄
熱病ウィルス；カビ、例えばキャンディダ（Ｃａｎｄｌ
　ｄａ）　。

（Ｐｈｙｃｏｍｙｅｅ、ｔｅａ　）、スポロトラックス
（５ｐｏｒｏｔｏｒａｘ）、の病原性微生物、例えばク
ラミジア（Ｃｈｌｍｍｙｄｉｍ）、ギアルディア（Ｇｉ
ａｒｄｉａ　）等から得ることができる。

微生物は任意の便利な形態でワクチンとして投与するこ
とができる。通常、生理的に許容される担体、例えば脱
イオン水、リン酸緩衝化塩浴液ＣＰＢＳ　）　、水酸化
アルミニウム、糖等を使用することができる。通常、投
与量は経験的に決定され、約１０〜１０　釉胞がヒト宿
主に投与され、そして大きさに比例した量が他の哺乳類
宿主に適用される。一般に、第１投与を行い、次に２〜
６週間の間隔で１回又は複数回の投与を行う。投与され
る特定の倉は多くの因子、例えば、宿主中での侵入微生
物の生存性、ｈａ体の表面上での抗体の濃度、存在する
異る抗原の数、特定の抗原に対する免疫反応のレベル等
に依存するであろう。投与は経口投与であることができ
、又は注射による静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、
腹腔内投与であることかできる。生ワクチンを投与する
だめの方法はよく確立されており、そしてＢａ５ｉｃ　
ａｎｄＣＩｉｎｉｅａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　＊　
５ｔｉｔｖｓ　、　　５ｔｏｂｏ。

Ｆｕｄｅｎｂ＠ｒｇ及びＷ＠ｌ　ｌ　ｍ編、　Ｌａｎｇ
ｅ　Ｍ＠ｄｉｃａｌＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　＊ロス
アルトス、カナダ、１９８２　　　’のどとき底有に記
載されている。

侵入の遺伝的能力をコードする遺伝子は任意の便利な分
離源から得られる。かなりの数の微生物、例えばイエル
シニア（Ｙｅｒｓｉｎｉｍ　）、クラミジア（Ｃｈｌａ
ｍｙｄｉａ）、レジオネラ・ニューモフイラミコバクテ
リウム・ツベｈクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔ＠ｒｉｕ
ｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｌｓ　）、ミコバクテリウム・
レデレｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ　）　、ヒストプラズマ・
カプスレショダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌ
ｂｉｃａｎｇ）、トリ等が侵入性を有することが知られ
ている。そして、生物は細菌、カビ又は原生動物である
ことができる。好ましい生物は、侵入能力をもたらす単
一遺伝子を提供するものである。唾乳類宿主すセデター
に対する親和性は約０．１以上であるべきである。

特に興味あるのは、侵入性生物の典型的なものとして実
験の部に示すイエルシニアである。この能力を提供する
遺伝子ｆ：　ｉｎｖと称し、その表現型をＩＮＶと標示
する。

侵入性となるように修飾される非侵入性宿主は原核性で
も真核性でもよく、そしてその最終目的に依存して退択
される。生物が、培養された踊乳知細胞へのＤＮＡの移
入のためのビヒクルである場合、任意の便利な生物、特
に移送すべきＤＮＡをクローニングするために使用する
ことがでさる生物を用いることができる。従って、Ｅ、
コリの多くの株、例えばに１２株を侵入性になるように
修飾するだめの受容体微生物として用いることができる
。

修飾された微生物宿主をワクチンとして使用する場合、
宿生は一般に、無毒（非病原性）であるように、長期間
にわたって、好筐しくは予防免疫注射された宿主中で３
日以上、細胞外で生存できるように、そして予防免疫注
射された宿主中にすでにある除去機構にかけられるよう
に選択される。

好唸しくけ、修飾された受容体微生物はノヤイロジエン
、毒性又は他の病気の症状を生じさせる因子金倉まない
であろう。無毒とは、投与量及び投与経路にかかわらず
免疫適格宿主についていかなる病気も観察されないこと
を意味する。病原性微生物、特に弱毒性病原微生物を使
用することができるが、病原性ＶＣ復帰する可能性が存
在するため、これらは好ましくない。侵入性を有するよ
うに修飾することができる微生物宿主には、Ｅ、コリの
ほかに、スタフィロコッカス（５ｔａｐｈｉｌｏｅｏｃ
ｃｕｓ）、ニューモコッカス（Ｐｎ＊ｕｍｏｃｏｃｃｕ
＋ｓ　）、ストレゾタンス（ｍｏｔａｎａ　）、ナイゼ
リア（Ｎｉ　５ｓｅｒｉａ　）、例えはカタルハリス（
ｅａｔａｒｒｈａｌｌｍ）、バイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏ
ｎｅｌｌａ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ
ｌｉ）、コリネバクサリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　）　、クチロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅ
ａバアクチノミセーテス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ＋
ｓ　）　、スピロヘータ（Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔａ）、マ
イコゾラズマ（Ｍｉｃｏｐｌａｓｍａ　）等が含まれる
。

受容体微生物に侵入性のための遺伝的能力を導入する方
法は、形質転換、例えにカルシウム沈娠ＤＮＡ法、トラ
ンスフェクション、形質導入、接合、融合等を含む任意
の常法でよい。過用することができる技法はＭａｎｉａ
ｔｌｓ等＋　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　
、コールドスプリングハーバーラ？ラトリー、コールド
スフリングハーバ−、ニューヨーク、１９８２に記載さ
れている。すでに記載したように、侵入の遺伝的能力を
受理した微生物の込択奮可能にするマーカーが存在する
であろう。次に、生物を適当な栄養培地中で垢殖せしめ
、そして必要に応じて使用する。

侵入性微生物を用いて受動免疫のための抗血清（ｉｌ−
調製することができる。すなわち、広範囲の病原体に対
する及び特定の病原体の株に対する抗体を有するγ−グ
ロブリンｔｈｍすることができる。

仇酸アンモニウム沈澱及び既卸の技法に従う分画によっ
て、γ−グロブリンを血渭から単離しそして精製するこ
とができる。哺乳類宿主への投与は、任意の生理的に許
容される担体中−叡に５０〜５００　ｖｒｔｐ／ｋｇ宿
主の−である。投与は通常、注射、例えは静脈内注射に
よる。イし飾された受容体微生物￥′ｉまた、該修飾さ
れた微生物にとって外米性の抗原に対する抗体又は抗原
それ自体の存在を検出するためのアッセイにおいて使用
することができる。これらはまた侵入性微生物との競争
において使用することができ、従って医療において有用
である。

さらに、この発明の微生物はｉｎｖ遺伝子により発現さ
れる。蛋白質の発現のために使用することができる。特
に、高コピー数ベクターを手にすることによシ、修飾さ
れた外来性微生物を集−し、溶菌し、そして常法により
、例えはアフィニティークロマトダラフィー、電気泳動
、クロマトグラフィー等により、ｉｎｖ抗ｉｔ車離する
ことかできる。

実験 次に、例によりこの発明をさらに具体的に説明する。但
し、これによシこの発明の９！、１全限定するものでは
ない。

侵入性表現型の濃縮 Ｙ、シュードラベルクローシス（Ｙ。

４３ニア２−７８：］から単離された染色体ＤＮＡの５
ａｕ３ＡＩ消化物のサイズ分画物を、アンピシリン耐性
をコードしそしてさらにその低コピー数（５−８）によ
υ特徴付けられるコスミドクローニングベクターである
ｐＲＥＧ　１５３　（Ｒ，Ｇ１１ｌ博士から入手可＊ｌ
：　）のＢａｍＨＩ部位に連結することによりコスミド
パンクを造成したＣ　Ｈａｈｎ　、　Ｍｅｔｈｏｄｓｉ
ｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　　（１９７９）　６８　
　：　　２９９−ＵＳＡ（１９８２）７９ニア８８１−
７８８５）。

連結混合物のアリニー）ｔλフ了−ジヘッドにＭＭＳＡ
　３４５　（Ｆ、５ｔａｈｌ博士から入＋司能）からり
４製した抽出物と共にインビトロ−パッケージし［Ｅｎ
ｑｕｉｓｔ及びＳｔ＠ｒｎｂｅｒｇ　、　Ｍ＠ｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　（１９７９）　６８　
：　２８１−２９８）。

そして次ＫＥ、コリに１２株ＨＢ　１０１　（Ｍａｎｉ
ａｔｉａ等、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕ
ａｌ　）に感染せしめ、アンピシリン耐性形ＪＪ！導入
体を選択した。ゾールされた細ｂｔ培地中で一夜増殖せ
しめ、無耐ＰＢＳ８　、 中で２回洗かし、そして５×１０　細菌／−の密度に再
懸濁した。次に、洗浄した細ｋ（２ｄ）を、ＲＰＭＩ　
１６４０４地（イルビン・バイオロジカルス）中に増殖
した１×１０のＨＥｐ　−２細ＩｉＬ！ｌｔ−含むコン
フルエント単層に導入し、そして５％ＣＯ２の雰囲気中
で３６℃にて３時間インキ−ベートした１次に、単層を
無菌ＰＢＳで１０回洗浄して未付着細−を除去した。Ｘ
Ｌ膓に付着したままのａ醜りローンを脱イオン水中１％
トリトン×１００で遊離せしめ、そして個々のコロニー
に分けるためにａｍ培地上にプレートした。

侵入性培養物のスクリーニング 形質転換された細菌の飽和培養物を２８℃にて増殖せし
め、ＰＢＳ中で２回洗浄し、そして３×１０８細ｉ％１
／ｄに濃縮した。各株のアリコート（５ｏμｔ）ｉ、Ｒ
ＰＭ１１６４０培地中ミクロタ培地−ミクロタイターウ
ェルフェルコン３０４フミクロタイター皿）当シ２×１
０動物細胞の濃度で接種したＨＥｐ　−２細胞の単層培
養物に加えた。＃Ｉ珈全６００×ｇで遠心して単海上に
沈澱せしめ（Ｄｅｖｅｎｉｓｈ及びＳｃｈｉｅｍａｎｎ
　ａ　Ｉｎｆ＠ｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　（１９８１）３
２：４８−５５）、そして感染した培養物を５％ＣＯ２
雰囲気中で３６℃にて３時間インキュベートし、細菌の
結合及び侵入を可能にした。無菌ＰＢＳで３回洗浄する
ことにより禾付着細銅を単層から除去し、そして４０μ
＆−のゲンタマイシン（シグマ・ケミカル）を含有する
ＲＰＭＩ培地を各ミクロタイターウェルにガロえた。抗
生物質の存在下でインキーペーションを３６℃にて２時
間続け、その後車１ｉ　’ｉ　ＰＢＳにより２回洗浄し
た。次に、１チのトリトンメ１００ｆｊ！−添加するこ
とによシ、取シ込まれた細菌を単層から遊離せしめ、そ
してＬ寒天プレート上でタイトレートした（　Ｍｉｌｌ
＠ｒ　。

Ｅｘｐ＠ｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｇｅｎｅｔｌｓｅ−コールドスプリングハーパーラボラ
トリース、コールドスプリングハーバ−、ニー−ヨーク
（１９７２）：］。

次の表に結果を示す。

第１表 −（ａ） ＹＰＩＩＩ（Ｐ　）　　　　　９．０ ＨＢＩＯＩ（ｂ’　　　　　　　　　　０．００５ＨＢ
　１０１　（ｐＩＮＶＡ２）”　　　　　８．３ＨＢＩ
　０１　（ｐＩＮＶＡ７）　　　７．９ＨＢ１０１　（
ｐＩＮＶＧＩＯ）　　　８．７ＨＢ１０１　（ｐＲＩ２
０３）　　　９．２（ａ）イエルシニア・シュードラペ
ルクローシス株（Ｂｏｌｌｎ等、前掲）。

（ｂ）　　Ｅ、コリに１２株ＨＢ　１０１（ｅ）　　カ
ッコ内に示したコスミドを含有するＨＢ１０１株。

（ｄ）　　ＨＥｐ　−２単層に加えた細菌に対するゲン
タマイシンによる処理に耐性を有する細菌のチ。

濃縮に対して生存した２２の候補株の内１２が侵入性で
あった。細菌の侵入に等しい、ｒンタマイシン処理から
のがれる効率は、ＤＮＡ供与体として使用したＹ、シュ
ードラペルクローシス株について見られるそれと類似し
ていた。

単離された細菌紡導体が培養動物細胞に侵入できたか否
か全決定するため、幾つかの細菌株釦暴露されたＪｓＬ
層細胞の超薄切片を電子顕微鏡で分析したＩ：　Ｈｏｒ
ｗｉｔｚ　、　Ｊ、　ＥＸｌ）、　Ｍｅｄ、（１９８３
）１５８：１３１９−１３３１）。ＲＰＭＩ　１６４０
中８Ｘ１０　　ＨＥｐ−２細胞ｔ−接種された組織培養
細胞（７ｗ＃：１ン３０４６　、６ウ工Ａ／皿）ｔ−６
Ｘ１０細菌の存在下で３６℃にて３時間インキュベート
した。次に、単ＮをＰＢＳにより１０回洗浄し、そして
０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含有するＰＢＳの存在下で３
７℃にて１０分間インキュベートした。単層を、ＥＤＴ
Ａの存在下ＰＢＳにより再度洗浄し、１−のＰＢＳ　Ｋ
懸濁し、そして６００：’ｌにて１０分間ペレット化し
た。細胞ペレットを、０．ＩＭカコノル酸緩衛液Ｃ−７
，４）中２頭グルタルアルデヒド及び２％四ｆｆｆヒオ
スミウムで次々と固定し１次に酢酸ウラニルにより染色
した。エタノール中で脱水したサンプルをスデルス（５
ｐｕｒｒｓ　）　（ポリサイエンス）中に包埋し、薄片
化し、１％酢酸ウラニル及び酢酸鉛により次々に染色し
［Ｒ＠ｙｎｏｌｄｓ　＋Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏ１．（１
９６３）１７：２０８−２１３〕、そしてフィリップ２
０１Ｃ電子顕微鏡により可視化した。Ｅ、コＩＪ　Ｋ　
１２株ＨＢ　１０１はＨＥｐ　−２細胞に入ることがで
きない。これに対して、無傷のｉｎｎ床座担持する同じ
細菌株は動物絽胞に結びついた多数の細菌を示した。こ
れらの細菌は、細胞の外側に結合しているもの、及び大
細胞内小胞中に存在するものの両者である。さらに、無
傷のｊｎｖ座を有するｐＲＩ　２０３プラスミドを担持
するＥ、コＩＪ　ＨＢ　ｌ　０１細胞全使用する場合侵
入が観察され、他方、ｉｎマ座中にＴｎ５挿入変異を有
するプラスミドｐＲＩ２０３．１４：：Ｔｎ５　ｆ担持
する同じａ菌については侵入が観察されなかった。

従って、侵入性は機能的に無傷の１ｎマ座についてのみ
勧察される。細胞内細菌の数は実質的に減少し、そして
入浸された細胞は生存し続ける。

ｉｎマ遺伝子の座は次のようにして確立した。ニスミド
ＤＮＡ中にＴｎ５挿入変異を生じさせ、分析される各変
異が独立事象の結果であると過程して、１つのプラスミ
ドｐ　Ｉ　ＮＶＡ　２　ｋ分析した。ｄｅＢｒｕｉｊｎ
及びＬｕｐｓｋｉ　、Ｇ＠ｎｅ　　（１９８４）２７　
：　３１３−ンスポジションを介して、カナマイシン耐
性トランスポゾンＴｎΣにより変異を誘導した。コスミ
ドへの挿入について選択するため、カナマイシン耐性コ
ロニーを一緒にプールし、そしてλ１ａｃ５ｉｍｍ２１
ｃｔｍによシ溶薗感染させた。生ずる溶菌物を用いてＨ
Ｂ　１０１株はカナマイシン耐性及びアンピシリン耐性
に、同時的に形質導入した。これらの形質導入株は、ゴ
スミド上のランダム部位にＴｎ５の挿入１含んでいた。

数百個のこれらの形質導入株全前に記載したようにして
侵入性について分析し、そして侵入性を除去した２０個
の変異株及び侵入表現型に形番を与えなかりた２０個の
挿入体のマツプ位置を決定した。各挿入が独立している
ことを確認するため、各プールからの複数の変異の物理
的位置を分析した。侵入表現型の挿入失活に対する感受
性を隣接する３、２ｋｂ領域にマツプした。この領域は
、標準としてミオシン、β−ガラクトシダーゼ及びホス
ホリパーゼＧｉ用いる電気ｔｉＦ、動によって１０８ｋ
ｄａｌであると示される１つの大玉白質ヲニードするこ
とが示された。

上記のデータは、侵入（匣）の遺伝的能力は１つの宿主
から他の宿主に移行することができ、その結果、その表
現型が特定の表現型を欠く微生物イン主に移され得るこ
とを示している。さらに、哺乳類細胞は、表面膜上のｊ
ｎｖによりコードされる特定の構造の存在に基いて全体
ａ胞を取り込むことができる。このようにして、非侵入
性微生物を、侵入性微生物になるように変性することが
でき、この能力を種々の目的、例えはＩ＋南乳類宿主へ
の異種■仏又は他の分子の導入のため、ワクチンとして
有用なように病原体と関連する１又は多数の抗原に対す
る免疫反応の誘導のため、病原体のスペクトルに対する
抗体のスペクトルを有する抗血清の製造のため、及び哺
乳類宿主地胞への病原体の侵入を阻害するために使用さ
れ得る蛋白質の製造のために、使用することができる。

以上、理解を明瞭にするために説明及び例によりこの発
明の詳細な説明したが、この発明の範囲内で釉々の変法
を行うことができよう。

以１−ｊミ白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、単細胞微生物への外来性ＤＮＡの導入の結果として
   、侵入のために必要とされる単一の膜蛋白質の発現をも
   たらす、侵入表現型を有する単細胞微生物及びその子孫
   。 ２、前記微生物が、侵入感受性哺乳類宿主に感染するこ
   とができる少なくとも１種類の病原体のエンベロープ蛋
   白質、キャプシド蛋白質、又は表面膜蛋白質を発現する
   少なくとも１つの追加の外来性遺伝子を有する、特許請
   求の範囲第１項に記載の微生物。 ３、前記微生物がＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、特
   許請求の範囲第１項に記載の微生物。 ４、前記微生物が哺乳類複製系を有するプラスミドを含
   有する、特許請求の範囲第１項に記載の微生物。 ５、前記プラスミドが哺乳類蛋白質を発現することがで
   きる遺伝子を含有する、特許請求の範囲第４項に記載の
   微生物。 ６、前記微生物中に天然には見出されない、前記膜蛋白
   質以外の化学物質を含有する、特許請求の範囲第１項に
   記載の微生物。 ７、単細胞微生物への外来性ＤＮＡの導入の結果として
   、侵入のために必要とされる単一膜蛋白質の発現をもた
   らす、侵入表現型を有する単細胞微生物及びその子孫で
   あって、侵入感受性哺乳類宿主に感受することができる
   少なくとも１種類の病原体のエンベロープ蛋白質、キャ
   プシッド蛋白質、又は表面膜蛋白質を発現する少なくと
   も１つの追加の外来性遺伝子を有するものの、免疫適格
   感受性哺乳動物宿主からの免疫反応をもたらすのに十分
   な量を、生理的に許容される担体と共に含んで成るワク
   チン。 ８、前記単細胞微生物がＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）であ
   る特許請求の範囲第７項に記載のワクチン。 ９、特許請求の範囲第６項に記載のワクチンの有効量を
   免疫適格性侵入感受性宿主に投与することを含んで成る
   免疫反応の誘導方法。 １０、イエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）からのｉｎｖ
   −フェノタイプをコードする遺伝子を含有するＥ．コリ
   株。 １１、イエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）ｉｎｖ遺伝子
   の発現生成物の製造方法であって、及び 発現することができるイエルシニアｉｎｖ遺伝子のコピ
   ーを含有するＥ．コリを栄養培地中で増殖せしめること
   により前記発現生成物を生成せしめ；前記Ｅ．コリを回
   収し；そして、 この回収されたＥ．コリを溶菌しそして前記発現生成物
   を単離する； ことを含んで成る方法。 １２、特許請求の範囲第６項に記載のワクチンによる免
   疫感作に反応して生産される抗血清。