JPS58500589A - ポリオウイルスｃＤＮＡ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の名称〕 ＲＮＡウィルス配列表現ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ〔技術分野〕 本発明は微生物学分野に関し、更に特定すれば遺伝学的処理をなされた微生物を 生産するための組換体ＤＮＡ技術に関する。

〔背景技術〕

人ピコルナウィルスの一種であるポリオウィルスは重大な人間の病気の原因なの で幅広く研究されている。これらの研究によればポリオウィルスは直径が２５〜 ６０ｎｍの小さな二十面体からなり、ＶＰｌ、ＶＦ６．ＶＦ６゜ＶＦ６と呼ばれ る４種のポリイプチドから構成される。

この蛋白コート内に分子量が２．７Ｘ１０６ダルトンの病原性陽ストランド化Ｒ ＮＡの１本のストランド８が封入されている。このサイズは約２５００のアミノ 酸をコートゝ−・きる約７５００個の塩基に等しい。

ポリオウィルスに関しては幅広い研究がなされているが、このウィルスの研究、 検出、生産に利用できる現在の技術にはポリオウィルスに対する抗体を生産する に使う技術と同様に依然多くの問題がある。例えば、ポリオウィルスＲＮＡをポ リオウィルス検出に実際には使用できないことが認識される時に検出技術改良の 必要がわかる。実際に使用できないのはポリオウィルスＲＮＡが供給不足で、不 安定で、通常は他ポリオウィルスＲＮＡに結合しないからである。

今日、ポリオウィルスの存在を検出するための主要分析法はサンプルを、人細胞 系を用いてウィルスの存在を検出するプラーク分析法で分析する生物学的技術で ある。

Ｄｕｌｂｅｃｃｏ、　Ｒ１とＶｏｇｔ、　Ｍ、との’Ｊ、　ＥｘｐｔｌｏＭｅｄ 、”　９９　＋１６７頁（１９５４）を参照されたい。この方法は比較的時間を とり、かつ高価である。

その多くがポリオウィルス程には幅広く研究されていない他ＲＮＡウィルスは研 究、検出、生産或は、ワクチンや抗体の生産においてはポリオウィルスの場合に 似た、或はそれ以上のやっかいな問題を提示している。

〔本発明の開示〕

本発明はＲＮＡウィルス配列表現相補型ＤＮＡ（ＲＮＡウィルスｃＤＮＡ）の生 産とかかるＲＮＡウィルスｃＤＮＡの使用法に関する。

一態様においてはウィルスＲＮＡを逆転移し、生成ｃＤＮＡ分子を組換体ＤＮＡ −＜フタ−に挿入することでＲＮＡウィルスｃＤＮＡを生産する。ついで適当な 細胞を組換体ＤＮＡベクターで変異させ、クローニングし、ＲＮＡウィルスｃＤ ＮＡの生産に充分な条件で増殖させる。ついでこのｃＤＮＡをクローニング細胞 培地から取り出してそのまま使うか、特定用途のために更に変異できる。

−特定態様では細菌を遺伝学的処理技術で転換させてポリオウイルス二重ストラ ンド化相補型ＤＮＡ（ｄｓｃＤＮＡ）を生産できる様にする。この方法ではポリ オウィルス単ストランドゝ化（ｓｓ）ＲＮＡを逆転写してポリオウィルスｓｓ　 ｃＤＮＡを提供し、これを伸張してｄｓｃＤＮＡとし、ついで細菌シラスミドに 挿入してキメラプラスミドを作り出す。ｄｓ　ｃＤＮＡを含むこのキメラプラス ミドをついで、細菌細胞をキメラプラスミドで形質転換することにより細菌細胞 に挿入する。この様に形質転換された細菌細胞をつし・でクローニングし、クロ ーナル細胞系を細胞培地で増殖させてキメラプラスミドを複製する。ポリオウィ ルスｄｓ　ｃＤＮＡは複製キメラプラスミドの酵素開裂で回収できる。

この方法で、比較的多量のＦＩＮＡウィルスｃＤＮＡを合理的コストで微生物学 的に生産できる。一方、ＲＮＡウィルスｃＤＮＡはウィルスＲＮＡに特異結合す るのでポリオウィルス等のＲＮＡウィルスの検出のための分析に使用できる。か かる分析は急速かつ容易に達成でき、ＲＮＡウィルス検出に極度に高感度である 可能性を持′つ。

ＲＮＡウィルスｃＤＮＡはより多くのＲＮＡウィルス抗原やかかる抗原に対する 抗体の生産にも使用できる。これら方法でウィルスＲＮＡに対するｃＤＮＡは前 述の如く生産される。抗原生産には抗原生産を刺激できるｃ　ＤＮＡを選んで、 抗原生産できる細胞に挿入し、その後に細胞を抗原生産に適当な条件で培養し、 ついで抗原を採取する。抗体生産には採取抗原を用いて、用いられた原ウィルス に対する抗体を生産できる宿主を免疫にする。モノクロナール抗体は抗体生産細 胞を用いて宿主から既知技４ 術、例えば交雑細胞系の形成、で生産できる。

驚くべきことには、本明細書記載の方法で生産され、細胞にトランスフェクショ ンされたポリオウィルスＲＮＡ分子自体が盛染性であることが発見された。かか る感染性ｃ　ＤＮＡ分子はウィルス系の抗原、抗体、ワクチンの生産においてそ の片割れであるＲＮＡ分子にまさる可能性を秘めている。例えばｃＤＮＡ分子は 既知組換体ＤＮＡ技術で突然変異化できる。この突然変異化ｃＤＮＡは培養細胞 トランスフェクションすることができ、生成ウィルス粒子は所望変異を含む。か かるＲＮＡウィルス粒子はワクチン生産においてその野生型のものより顕著な利 点を提供できる。

〔図面の簡単な説明〕

第１図はポリオウィルスａｓ　ｃＤＮＡを含む細菌キメラプラスミドの生産を例 示する略図である。

第２図は本明細書記載の方法で生産できたポリオウィルスｃＤＮＡを用いる分析 の一態様を示すノロツク図である。

第６図は本発明で生産された分離４１ＪオウイルスｄｓｃＤＮＡの全長を示す略 図である。

第４図は２種のポリオウィルスｄｓ　ｃＤＮＡ（ｐＶＲ１０４とｐＶＲｌｏ５） を接合して１つの同寸ポリオウィルスｄｓｃＤＮＡ（ｐＶＲｌｏ（Ｓ）を生産す るに用いる方法を例示する略図である。

〔本発明を実施するために最良の態様〕５特’ｆ＜ＦＵａ　５８−５００５８９ 　（４）本明細書において用語″′ポリオウィルスＲＮＡ”、１ポリオウイルス ｃ　ＤＮＡ”、６ピコルナウイルスＲＮＡ”、６ピコルナウイルスｃ　ＤＮＡ” 、”ウィルスＲＮＡ”等はＲＮＡ又はＤＮＡ分子の全体かその有意部分を意味す る。

即ち、用語６ポリオウイルスｃ　ＤＮＡ″はポリオウィルスＲＮＡ分子の有意部 分を補足する全ポリオウィルスＲＮＡ又はＤＮＡを補足するＤＮＡを意味するた めに使月されている。

ウィルスＲＮ　Ａ　ｃＤＮＡ生産用の本明細書に記載の方法では科学文献記載の 基本的な遺伝子接合技術を用いる。

例えば、１９８０年１２月２日に５ｔａｎｌｅｙ　Ｎ、　ＣｏｈｅｎとＨｅｒｂ ｅｒｔ　Ｗ、Ｂｏｙｅｒ　とに交付されたアメリカ特許４２２７２２４号の公報 にはこれら技術のうちの多くが述べられている。それ故、ＣｏｈｅｎとＢｏｙｅ ｒとの特許発明の教示内容を参照により本明細書に含める。

ポリオウィルスｄｓ　ｃＤＮＡ生産に用いることのできる技術を、これら技術を 例示して℃・る略図である第１図を参照しながら更に特定して記述する。

ポリオウィルス１型を用いる。かかるウィルスは浮遊液培地で上皮細胞を増殖さ せ、培地にポリオウィルス１型を感染させることで得ることができる。ついで感 染細胞を洗浄剤で溶菌してウィルス粒子を放出させ、遠心精製する。

ポリオウィルス５ｓＲＮＡはこの精製ウィルス粒子からフェノール−クロロホル ム抽出で抽出できる。抽出ＳＳＲＮＡをついでエタノール沈殿で沈殿させる。

このポリオウィルス５ｓＲＮＡをついで、例示した如（ポリオウィルスｄｓ　ｃ ＤＮＡの合成に使う。まず、ポリオウィルス５ｓＲＮＡをＲＮＡ−依存ＤＮＡポ リメラーゼである酵素である逆転写酵素を使って逆転写する。

Ｋａｃｉａｎ、　Ｄ、Ｌ、とＭｙｅｒｓとのＪ、Ｃ，（１９７６）　ＰＮＡＳ　 ７３：２１９１〜５を参照されたい。典型的にはトリス−ＨＣＪ緩衝剤、ｐＨ８ ，６，マグネシウムイオン（Ｍｇ＋＋）、ジチオスレイトール、４種のデオキシ ヌクレオシド８　トリホスフェート（ａＡＴＰ、ａｃＴＰ、ａＧＴＰ、ＴＴＰ） 、生成物をモニターするための少くとも１種の被標織化デオキシヌクレオシドト リホスフェートを反応混合物に加える。ポリオウィルスＲＮＡの４　＋）（８） 末端に交雑して逆転写開始部位を提供するプライマーとしてオリ−ｒ（ａＴ）も 加える。

反応混合物を、酵素にゲノムの６′ポリ（Ａ）から出発して５′末端に続く相補 型ｓｓ　ＤＮＡ：＝＋２−を合成させる条件下で培養する。反応はエチレンジア ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）添加で停止できる。

ついでアルカリでＲＮＡ型を除き、シュクロース密度勾配の利用でｓｓ　ｃＤＮ Ａ分子を分画する。典型的には大分子が保持される。ついでこれら大分子を、ト リス−Ｈ（Ｊ緩衝剤、ｐ　Ｈ７，５、Ｍｇ＋＋、ジチオスレイトール、４−デオ キシヌクレオシド　トリホスフェート、ＤＮＡ、ｎリメラーゼエのフレノウ（Ｋ ｌｅｎｏｗ）フラグメントを含む別の反応混合物に入れる。この反応混合物を、 ＤＮＡ、ｎリメラーゼＩに分子の６′末端に形成された中衛でのｃＤＮＡ分子開 始重合を成長させるに充分な条件に維持する。−典型例では反応混合物を、例示 の如く第２の相補型ＤＮＡストランドの形成に普通充分な約３０分間６７゜で培 養する。Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ等の（１９７８）　Ｎｕｃｌｅｉｃ分を開く。Ｂｈ ａｔ、とＰｉａｔｉｇｏｒｓｋｙ　（１９７５）の円セ上。

７６：５２９９〜６３０６を参照されたい。

ついで、末端トランスフェラーゼとａｃ’ｒｐを用いてｄｓ　ｃＤＮＡの６′末 端にオリゴ（ｄＣ）をつける。Ｂｏｙｅｒ等（１９７７）の”　Ｒｅｃｏｍｂｉ ｎａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅＳ：　Ｉｍｐａｃｔ　ｏｎＳｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ 　５ｏｃｉｅｔｙ”（Ｒ，Ｆ、　ＢｅｅｒｓとＥ、　Ｇ、　Ｂａ５ｓｅｔｔ＋ｅ ｄｓ、）　９’−２０頁、Ｒａｖｅｎ、　Ｎ、　Ｙ、を参照されたい。有用ｄｓ ＤＮＡはアガロースゲルで電気泳動でき、ついで最大フラグメントを電気泳動で ゲルスライスから溶出させる。これにより組換体ＤＮＡ分子を形成するために、 両端に開裂細菌プラスミドに結合される゛粘性”末端として役立つポリ（Ｃ）を 有するｄｓ　ｃＤＮＡを残留させる。

プラスミｒＰＢＲ３２２を使ってキメラシラスミド形成を例示できる。プラスミ ｒＰＢＲ３２２は被選択性マーカーを含むことを知られている良く特性化された シラスミドである。このシラスミドはテトラサイクリン耐性をコードする一遺伝 子とアンピシリン耐性をコードする一遺伝子とを含む。ポリオウィルスｄｓ　ｃ ＤＮＡ配列がア８ ンビシリン耐性遺伝子に挿入されるので、首尾よく形質転換された細菌細胞はア ンピシリン感受性（Ａｍｐ”’）　、テトラサイクリン／耐性（Ｔｅｔ、Ｒ）で あり、後者が形質転換された細胞のマーカーとなる。

制限酵素Ｐｓｔ　Ｉを使いアンピシリン／耐性コード遺伝子でプラスミ）”ｐＢ Ｒ３２２を切る。ついで生成直線シラスミド８に末端転移酵素とｄＧＴＰとを使 いオリゴ（ａＧ）の尾をつけて直線開裂プラスミド鎖に６粘性”末端を生成する 。これらプラスミド鎖はフェノール抽出で精製できる。

ついでオリゴ（ｄＧ）の尾のついたプラスミドＤＮＡとオリ−ｆｆ′（ａＣ）の 尾のついたポリオウィルスｄｓ　ｃＤＮＡとを溶解交雑する。これは、これらＤ ＮＡ種を０．　Ｉ　ＭＮａＣＪ中で等モル比で混合し、６８°で２分加熱し、４ ５°で６〜４時間培養することで達成できる。ボイヤー等の１９７７年の論文を 参照されたい。

ついで、ＰｓｔＩ部位を再生し、プラスミドＤＮＡを増殖し、組換体プラスミド を含むクーロンを確認するために交雑プラスミド−ポリオウィルスｄｓ　ｃＤＮ Ａを大腸菌に挿入する。Ｄａｇｅｒｔ、　Ｍ、とＥｈｒｌｉｃｈ、　Ｓ、　Ｄ、 　（１９７９）の−、２６〜２８頁を参照されたい。この交雑分子が挿入される と単ストランド化ギャップは細菌により修復される。この再生により、Ｐｓｔ　 Ｉ酵素が追って認識して切り、複製プラスミドのためのポリオウィルスｄｓ　ｃ ＤＮＡ配列を分離できるＰｓｔＩ部位が提供される。

９　長表Ｂａ　５８−５００５８９　（５）ついで、交雑分子で形質転換された 大腸菌をテトラサイクリン存在下で選択し、追ってアンピシリン感受性スクリー ニングにかけることができる。ついで、ＴｅｔｒＡｍｐＳとして確認されたクー ロンを、単離クーロン中に特異的ポリオウィルス配列を検出するためにコロニー 交雑で分析できる。ＧｒｕｎｓｔｅｉｎとＨｏｇｎｅｓｓ　（、ｊ　９７７　） のＰＮＡＳ　７２：３９６１〜５を参照されたい。

ＴｅｔｒＡｍｐ８は寒天培地表面のニトロセルロースフィルター上で増殖できる 。このニトロセルロース上でコロニーを溶菌させてＤＮＡをフィルターに固定す る。ついでフィルター上のＤＮＡを密閉ポリエチレンバッグ中で３２ｐ−被標識 化ポリオウィルスｃＤＮＡと交雑する。フィルターを洗い、乾燥して自動放射線 写真をとればどのコロニーが特異的ポリオウィルス配列を含むかが明らかになる 。これらコロニーからのＤＮＡは被標識化ポリオウィルスｃＤＮＡに交雑し、フ ィルターをＸ線フィルムに暴露すると暗色スポットとして現われるからである。

陽クローンからのプラスミ）”ＤＮＡは既知技術で得ることができる。例えばＭ ｅａｇｈｅｒ等（１９７７）、ｃｕｅｒｒｙ等（１９７３）の論文を参照された い。

ＤＮＡはＰｓｔ、　Ｉでの消化後にアガロースゲルでの電気泳動分析に付すこと ができる。ｐＢＲ３２２と陽クローンから得られた交雑プラスミドの消化パター ンを比較すると挿入Ｄ−ＮＡの長さが示される。

当業者ならば当然、以上の態様で特定して述べた材料、０ 条件以外の材料、条件も使用できることがわかる。例えば、ポリオウィルス１型 を用いたが所望なら２型も６型も使用できると考えられる。更に、大腸菌以外の 細菌細胞も使用できることは明白である。例えば枯草菌も多くの細組菌株と同様 に使用できる。

当業者に明らかな如く、以上に述べた方法はポリオウィルス、に限定されず、他 ＲＮＡウィルスでも等しく適用できる。当然の事ながらこれはＲＮＡの単−陽ス トラント８から形成されたゲノムを持つＲＮＡウィルスに対しては特に真実であ る。これらにはポリオウィルス以外のピコルナウィルス、例えばコクサラキーウ ィルス、リノウイルス、ロ蹄疫つィルス等：トガウイルス、例えばＡ型（アルフ ァウィルス）とＢ型（フラビウイルス）；が該当する。

同様に、細菌プラスミドをポリオウィルスｃＤＮ’Ａ配列の生産に用いたが、他 の組換体ＤＮＡベクターも使用できた。他相換体ＤＮＡベクターの例はファージ 、動物ウィルス、イーストである。組換体ＤＮＡベクターの増殖を可能にする宿 主を当然選択する。

本発明により生産されたＲＮＡウィルスｃＤＮＡ、例えばポリオウィルスｃＤＮ Ａ、０１つの有意な用途はＦｉＮＡウィルスの存在を検出するだめの分析である 。典型的な４　＋）オウイルス分析では患者からのサンプル、例えば脳を髄液、 を第２図に例示の如く分析できる。患者からのサンプルのＲＮＡ画分をまず単離 するが、これはフェノール抽出とエタノール沈殿とで達成できる。このＲＮＡ画 分は純粋である必要はないが、ポリオウィルスが原サンプル中に存在するならば ポリオウィルスＲＮＡを含む両分でなげればならない。、ｄ　＋）オウィルスｃ ＤＮＡをまず例えばトリチウム、ヨウ素、３２ｐ等の放射性物質で標識化し、つ いで、被標識化ｈｏ　ｖオウィＷスｃＤＮＡを存在するポリオウィルスＲＮＡに 結合させる条件下でＲＮＡ画分と共に培養する。培養後に未結合の被標識化ポリ オウィルスｃ　ＤＮＡを分離し、ついで結合した被標識化ｃＤＮＡポリオウィル スをシンチレーション計数器その他の手段で検出・する。

血清や生検等の他患者サンプルも当然用いてもよい。

更に、本分析は下水等のポリオウィルスを含む他液体サンプルでも達成できる。

同様にポリオウィルス以外のＲＮＡウィルスにも本分析は使用できる。

例示されてはいないが同相分析も達成できる。更に、標識は放射性同位体である 必要はなく、酵素、光学的標識等でもよい。

本発明により生産されるＲＮＡウィルスＣＤＮＡの第２の有意な用途はＲＮＡウ ィルス又はウィルス粒子に対する抗体の生産である。

抗体はウィルスＲＮＡを逆転写してｃ　ＤＮＡを提供し、このｃＤＮＡを組換体 ＤＮＡベクターに挿入し、該組換体ＤＮＡ×クター＝が増殖できる細胞の形質転 換することにより生成できた。っ℃・でこの形質転換細胞をクローニン１２ グしてｃＤＮＡを複製できる細胞系を生産し、この細胞系をｃＤＮＡ生産に充分 な条件で培養し、ついでｃＤＮＡを細胞培地から採取できた。細胞内で抗原合成 を指示できる特異的ｃＤＮＡを選択、単離し、ついで抗原を生成する様に細胞に 挿入できた。ついで動物等の宿主をこの抗原で免疫にして宿主に原ＲＮＡウィル ス又はその一部に対する抗体を生産させた。

実験によりＲＮＡウィルスｃＤＮＡが病原性であることが示されたが、これは驚 （べき発見である。これら実験は細菌プラスミドｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位で 構成されたポリオウィルスのＲＮＡゲノムの同寸のクローン化ｃＤＮＡコピーを 用いて行った（後記実施例を参照せよ）。

これら交雑プラスミドでトランスフェクションされた培養哺乳動物細胞から病原 性ポリオウィルスが生産された。

別のポリオウィルスｃＤＮＡクローンでトランスフェクションされた細胞はポリ オウィルスゲノムの最初の１１５の塩基対を欠き、ウィルスは生産しなかった。

この発見は、細胞をＲＮＡウィルスに対するｃ　ＤＮＡでトランスフェクション し、ウィルス生産に適当な条件で細胞を培養し、ついでＲＮＡウィルス粒子を採 取することでＲＮＡウィルス粒子の生産が可能なことを意味する。

それは又、ＲＮＡウィルス研究にワクチン生産とに対する様々な新しい端緒とな る可能性のある、ＲＮＡでは不可能な遺伝的操作が可能であることを意味する。

例えば、現在のワクチン種から生産されるワクチンと１３　持表明５８−５００ ５８９　（６）は別の特性を持つワクチンをｃＤＮＡから次の如くして製造でき た。まず、ＲＮＡゲノムのｃＤＮＡコピーを本明細書記載の如く生産し、このｃ ＤＮＡを組換え体ＤＮＡ技術を用いて突然変異させることができた。ついで、Ｒ ＮＡウィルスを生産できる細胞をｃＤＮＡでトランスフェクションし、変更ウィ ルス生産に充分な条件で培養し、ついでワクチン生産で使用できた。

一つの特異的方法では組換え体ＤＮＡ技術を使いウィルスゲノムの特異的領域を ｃＤＮＡから除去できる。ついで変更ｃＤＮＡを含むプラスミドを哺乳動物細胞 等の細胞にトランスフェクションできた。これら細胞で生産されたウィルス粒子 は回収され、適当な宿主で弱毒化が分析される。

細胞へのトランスフェクションは既知技術で達成できる。例えば、元々Ｇｒａｈ ａｍとＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂとにより記載されたリン酸カルシウムＤＮＡ共沈技 術が適当である。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２　、４５６　（１９７３）を参照されたい。

同様に、元々ＭｃＣ；ｕｔｃｈｅｏｎとＰａｇａｎＯにより記載されたＤＮＡ／ ＤＥＡＥ−デキストラン法も適している。Ｊ、Ｎａｔ’１　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ ５ｔ、　４　ｉｓ　３５１　（１９６８）を参照されたい。

当業者なら他の適当なトランスフェクション技術を知っているし、或はルーチン な実験を使い発見できるであろう。

以下の実施例で本発明を更により特定的に例示する。

４ 標準法（Ｆｌａｎｅｇａｎ等、１９７７、ＰＮＡＳ　７４：９６１）を使いポリ オウィルスＲＮＡを得た。ＨｅＬａ細胞を浮遊液培地で増殖させて４×１０５個 ／ｍｌ　の密度とし、遠心分離し、１０の感染多重度（ＭＯＩ）でポリオウィル ス１型ストツクで感染させた。感染を６７°で６時間進行させ、終了後細胞を遠 心分離した。ウィルスを洗浄剤で細胞から放出し、塩化セシウム均衡遠心分離で 細胞質かう精製した。ついでフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿で ＲＮＡをウィルスから抽出した。

（Ｆｌａｎｅｇａｎ等の１９７７年の論文を参照されたい）ポリオウィルスＲＮ Ａ　１５０ｐ！９／ｍｌ）、５　Ｑ　ｍＭのトリ、ｘ、　ＨＣＩ　（ｐＨ８，３ ）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２．５０　ｍＭのＫＣｌ、Ｑ、４ｍＭのジチオスレイト ール、３０μ９／ゴのオリゴ（デオキシチミジレート）、４ｍＭのピロリン酸ナ トリウム、各Ｑ、５ｍＭのａＡＴＰ、　ｄｃＴＰ、ａＧＴＰ及びａＴＴＰ。

１００　ｐｈ１／ｍｌのａ−３２Ｐ−ａ、ｃＴＰ、　１５０Ｕの逆転写酵素を含 む０，５ｄの反応混合物中でポリオウィルスｃＤＮＡを合成した。混合物を４２ °で６０分培養し、ＥＤＴＡ添加で停止した。反応混合物をフェノール抽出し、 エタノール沈殿’Ｌ、、生成ヘレットを［１，３ＮのＮａＯＨ１０，７ＭのＮａ ＣＪ、５ｍＭのＥＤＴＡを含む０．２ｍｌの緩衝液に再浮遊させた。反応生成物 をベックマンｓｗ４１０−タで２０゜で５５０００　ｒｐｍでアルカリ性シュク ローズ勾配沈殿に付した。各０，２Ｍの画分を採集し、アルカリ性アガロースゲ ル電気泳動で分析した。完全ポリオウィルスｃＤＮＡを含む画分をプールし、エ タノール沈゛殿し、０．０５７ｄの水に再浮遊させた。

ｂ、第２ストランドゝ合成 １０ｍＭのトリスＨＧｌ（ｐＨ７，５）、５ｍＭのＭｇＣ１、，５ｍＭのジチオ スレイトール、ＤＮＡＪリメラーゼエのフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント （０，００３Ｕ／ｎｇｃＤＮＡ）を含む反応混合物で完全ポリオウィルスｃＤＮ Ａ（約０．５μｇ）を培養した。混合物を３７°で３０分培養し、フェノール抽 出で停止した。０．１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリ、ｘ、　ＨＣＩ　（ｐＨ７ ，５）、１　ｍＭのＥＤＴＡで平衡にされた１ｘｌｏｃｍのセファデックスＧ− １００カラムに適用し、同一緩衝液で展開した。カラムのボイド画分をプ前述の 如くして生成した二重ストランド化ポリオウィルスｃＤＮＡを１．０〜ｉ、５ｍ ｌに入れた。これを、最終濃度がＮａＣ７０，３Ｍ　、　Ｎａ０Ａｃ　３０　ｍ Ｍ（ｐＨ４，５）、Ｚ　ｎ　Ｇ　ｌ　２３ｍＭ、グリセリン５％となる様に緩衝 液とあわせた。

ついでヌクレアーゼＳ１を、前もって定めた量で混合物に加えて、分子残部を刻 むことな（ｃＤＮＡ複式の一端の１６ ループ部分を切り開いた。フェノール抽出で反応を停止し、５ｍＭのトリスＨＣ Ｉ　（ｐＨ７，５）とＱ、５ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝液で水相を透析した。透 析後にｃ　ＤＮＡをエタノールで２度沈殿させ、０．２−の水に再浮遊させた。

カコジル酸、ｉｍＭのＣｏ　Ｃｌ　２、Ｑ、　２　ｍＭのジチオスレイトール、 ５０μｍ／Ｉｄの牛血清アルブミン、０．１５　ｍＭのａｃＴＰを含む０．１威 の反応混合物に加えた。過剰の末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ （６Ｕ）を加え、反応を室温で２０分進行させた。２０分経過時に反応混合物を フェノール抽出し、２度エーテル抽出し、エタノール沈殿させた。最終深レット を０．０５−００，１Ｍ　ＮａＣ／、１０ｍＭのトリスＨＣＩ　（ｐＨ７，５） 、１　ｍＭ　（１）ＥＤ’Ｉ’Ａからなる０、０５−に再浮遊させた。この物質 をＣ尾ポリオウィルスｃｌｓ　ｃＤＮＡと呼ぶ。

プラスミド”ｐ　Ｂ　Ｒ３２２のＤＮＡをＤＮＡ　（５００ｐ１１／ｍｌ）、１ ５ｍＭ）すｘＨＣ／（ｐＨ，７，５）、５ｍＭのＭｇＣＪ２．５０　ｍＭのＮａ Ｃ１、過剰酵素を含む０．１−の反応混合物中で制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ Ｉで開いた。

３７°で１時間培養し、フェノール抽出で停止した。プラスミ）”ＤＮＡをエタ ノール沈殿し、０．０２ｍ１の水に再１７　１ＡＢｏ５８−５（１０５８９（７ ）浮遊させた。

上記２（ｄ）記載の方法でポリ（デオキシグアニレート）をプラスミ）”ＤＮＡ の６′末端に付加した。違いは（１）ｄｃＴＰの代わりにａＧＴＰを使った；（ ２）反応容量を０３ｄに増した；（３）反応を２０Ｃで６０へ４・０抄造行させ た；点であった。

反応後に混合物をフェノール抽出し、１０ｍＭのＮａＣＡ’＋　１　ｍＭのトリ スＨＣｚ　（ｐＨ７，４）＋　０．１　ｍＭのＥＤＴＡ中の１ｃｍＸ１０Ｃｒｆ ＬセフアデツクスＧ−１００カラムでクロマトグラフィーした。全両分をプール し、Ｎガス流下で１０倍に濃縮した。この物質をパＧ−尾ｐＢＲ３２２ＤＮＡ” と呼ぶ。

１μ９／ｒｒｔｌのＧ−尾ｐＢＲ３２２ＤＮＡ、適量のポリオウィルスＣＤＮＡ 、０．１　ＭのＮ　ａ　Ｇ　ｌ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ１、ｐＨ７，５）、１ 　ｍＭのＥＤＴＡを含ム緩衝液中テ等モル量ノＧ−尾ｐＢＲ３２２ＤＮＡとＣ− 尾ポリオウイルスｄｓ　ｃＤＮＡを混合した。混合物を６８°迄（（２分加熱し 、ついで４５°で５〜４時間保持した。この期間後に、アニールされた物質を形 質転換感受性４°で貯蔵した。

Ｃ９形質転換 大腸菌細胞を次法で形質転換感受性とした。１０ＭのＬ−肉汁中で細胞を増殖さ せて５５０　ｎｍでの光学的密度を０．１どした。細胞を遠心分離し、２０７ｄ の冷０．１８ Ｍ　ＣａＣ１！２に再浮遊させ、２５分間氷上に置いた。ついで細胞を遠心分離 し、１．　Ｑ　ｍｌの冷Ｑ、　ｉ　Ｍ　Ｃａ　Ｃ７２に再浮遊させ、２４時間氷 上に保持した。

上記６（ｂ）からのアニーリングしたＤＮＡ（０，００１μｇ）をＱ、　ｉ　ｍ ｌの感受性大腸菌に加え、氷上で１５分培養した。

この混合物をついで３７°として５分間保ち、ついで１ｄのＬ−肉汁を加え、混 合物を６７°で１時間振とうした。この期間経過後に３ｍｌの軟質寒天を加え、 １５μｇ／ｄのテトラサイクリンを含むＬ−寒天プレートに注いだ。

細菌コロニーが肉眼で見える迄（普通１８時間）３７゜で培養した。

ｄ、ポリオウィルス特異性クローンの確認テトラサイクリン平板上の細菌コロニ ーを５Ｄμ９／ｆｎｌのアンピシリン含有の１つのＬ−寒天平板ともう１つのテ トラサイクリン含有寒天平板上にある配列でつまようじで移した。アンピシリン 感受性、テトラサイクリン耐性と確認されたコロニーを新しいテトラサイクリン 平板上にある配列でつまようじで取り出し、６７°で１８時間増殖させた。つい でこれらコロニーをＧｒｕｎｓｔｅｉｎとＨｏｇｎｅｓｓとのコロニー交雑技術 （１９７５，ＰＮＡＳ　７２：３９６１〜５）を使いポリオウィルスＤＮＡ検出 のためスクリーニングした。略述すれば、コロニーをニトロセルロースフィルタ ーに移し、細菌をフィルター上で溶菌し、細菌ＤＮＡをニトロセルロースに固定 した。ついでフィルターを同位体液標識化ポリオウィルスｃＤＮＡプローノ９ に交雑し、洗い、自動放射線写真に付した。放射能プローブを保持したコロニー をポリオウィルスＤＮＡ検出を含むと確認した。

プラスミ＋１ＮＡを単離し、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで開き、アガロー スゲルでの電気泳動によりポリオウィルスＤＮＡ挿入体のサイズを決定すること により多（の陽クローンを調べた。最長挿入体（４，０〜＜Ｓ、５Ｋｂｐ）を含 むプラスミドをヌクレオトート配列分析と制限酵素遺伝地図作成技術を使ってウ ィルスゲノム上に一列とした。

実施例１に略述した方法を用いて挿入長が４，０Ｋｂｐ、６．５Ｋｂｐ　の２つ のポリオウィルスｃＤＮＡを発生させた。

これらＤＮＡのダイヤ図を第ろ図に示す。第６図でそれらはｐＶＲ１０２、ｐＶ Ｒ１０３で示されている。比較目的で完全ポリオウィルスＲＮＡ鎖も例示されて いる。

両プラスミドｐＶＲ１［１２、ｐＶＲ１０３）Ｄ　Ｎ　Ａヲ、１５ｍＭのトリス ＨＣＡ！　（ｐＨ７，４）、５ｍＭのＭｇＣＡ’　２．５０　ｍＭのＮａＣ１， Ｄ　Ｎ　Ａ　（５００１’ｇ／ｍｌ　）　、制限エンド８ヌクレアーゼＥｃｏＲ ■とＢｇｌ　１１との混合物を含む０．１　Ｈの反応混合物中で６７°で培養す ることにより開裂した。６０分後に混合物をフェノール抽出し、エタノール沈殿 させ、１％アガロースゲルで電気泳動させた。この消化で生じた両クローンの最 大フラグメントをゲルから溶離させて加 ０．０１−のＨ２Ｏに再浮遊させた。これらＤＮＡの各々を０．００２ｍ、５０ 　ｍＭ　のトリスＨＣＩ（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭ（１）ＭｇＣ，１２，１， ０ｍＭ　＜７）ＡＴＰ、３００単位のファージＴ４ＤＮＡリガーゼを含む混合物 に加えた。反応混合物を１５°で１６時間培養した。ついで０．００２ＴＩＬｌ の混合物を前述の如く使って大腸菌を形質転換した。生成テトラサイクリン耐性 コロニーを、プラスミドＤＮＡを前述の如く単離することにより調べた。様々な 制限酵素でのシラスミ）ＳＤＮＡの開裂とアガロースゲルでの消化物の分析とに より、はぼ完全なポリオウィルスｃＤＮＡクローンが構成されていたことが示さ れた。このクローン（ｐＶＲ１０４）は第６図に例示される如くポリオウィルス ＲＮＡの６′ポリ仏）配列で始まり、全内部配列を含み、ウィルスＲＮＡの５′ 末端から１１５番目の塩基で終っている。

寒墓ガー五 プラスミド５ｐｖＲ１０５の １、　−／之４：＝三１１服 ポリオウィルスＲＮＡの５′末端を表現するプラスミド８を構成するためにプラ イマー拡張技術を用いた。シラスミドｐＶＲ１０３を使って次法でプライマーを 単離した。

プラスミド″′Ｄ　Ｎ　Ａ　（１００１１１１）ｐＶＲ１０３）ヲ制限−１−ン ドヌクレアーゼＢａｍ　Ｈｉ、Ｂｇｌ　Ｍで消化した。消化生成物をポリアクリ ルアミドゲル電気泳動で分離し、ゲルから最遅移住フラグメントを抽出した。こ のＤＮＡフラグメントはＰｓｔ■部位でポリオウィルスゲノムの塩基１１６〜２ ２０を表現するＤＮＡに結合した塩基′５７５〜３６０７から構成されるが、牛 アルカリ性ホスファターゼでの処理により５′−末端ホスフェートを除去した。

ついでこのＤＮＡをτ−”２Ｐ−ＡＴＰ　と沿→゛ヌクレオチドキナーゼとを使 いその５′末端で３２ｐでホスホリル化した。このホスホリル化フラグメントを ついで制限エンドヌクレアーゼＲｓａ　Ｉで開裂し、開裂生成物をポリアクリル アミドゲル電気泳動で分離した。Ｂａｍ　Ｈ■部位（位置２２０）からＲｓａ　 ■部位（位置１４９）への７４−塩基フラグメントをゲルから精製した。このフ ラグメントはＢａｍＨＩ部位でのみ３２ｐを含み、末端被標識化プライマ次法で 被標識化プライマーを２μｇの精製ポリオウィルスＲＮＡと交雑した。プライマ ーとウィルスＲＮＡとを０．００５−の全容量であわせ、２分間沸騰させ、ト９ ライアイス中で急冷した。混合物をついで０．　ＯＩ　Ｍ　Ｐｉｐｅｓ、’ＨＣ ＪでｐＨ６，４に調整し、０．４　Ｍ　ＮａＣ／、２ｍＭのＥＤＴＡ、８０％ホ ルムアミドを全容量０．０５１１Ｌｌで加えた。

この混合物を４２°で４時間保持し、ついで水で０．２　ｍに希釈し、３倍容量 のエタノールで沈殿させた。混合物をエタノールで更に３度沈殿させて残留ホル ムアミドを除いた。

最終エタノールペレットを５０　ｍＭ　（１）　）　リ、ＸＨＣ＃（ｐＨ８゜３ ）、５０　ｍＭのＫＣｌ、０．５　ｍＭ　Ｏ’）ジチオスレイトール（ＤＴＴ） 、１０ｍＭのＭｇＣＡ’　２．４０ｐｌ／ｍｌのアクチノマイシンＤ、各０．５ 　ｍＭのデオキシアデノシントリホスフェート、デオキシシチジントリホスフェ ート、テオキシクアノシントリホスフエート及びデオキシチミジントリホスフェ ートを含むｏ、ｏｓｍｚの反応混合物に再浮遊させた。逆転写酵素（ＲＮＡ−依 存ＤＮＡポリメラーゼ）を加え、混合物を４２°で６０分培養した。ついで混合 物をＮａＯＨで０．６Ｎとし、３７°で３時間培養し、中和し、反応内容物をエ タノールで沈殿させた。反応生成物を、６Ｍ尿素を含む８％ポリアクリルアミド ゝゲルで分離した。このゲルを自動放射線写真にとったら７４−　ｂｐゾライマ ーが２２０塩基長に拡張されておることが明らかにされ、逆転写酵素が恐らくは ウィルスＲＮＡの第１塩基に拡張されていることが示された。このプライマー拡 張物質のヌクレオチドゝ配列分析により拡張生成物がウィルスＲＮＡの正に５′ 末端に達していることが確認さプライマー拡張パン）”２２０塩基を除去し、８ ％ポリアクリルアミドゲルから精製した（前記参照）。このフラグメントをエタ ノール沈殿し、１ｍＭのＧ　ｏ　Ｃ１２，０，１４Ｍのカコジル酸、０．２　ｍ ＭのＤＴＴ、０．１５　ｍＭのａｃＴＰ、０．３４値　の牛血清アルブミン、末 端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ酵素を含む０．１　ｍｌの混合物 に浮遊させた。室温で２０分培養後に反応混合物をフェノールで抽出し、エタノ ール沈殿させた。この処理により１筋のｄ０残渣をプライマー拡張フラグメント の３′末端に付加した。

このオリゴｄ０が尾部に付いたフラグメンＩＪをついで、オリゴｄＤ）□２−□ ８のプライマーとＤＮＡポリメラーゼ■（フレノウ）を使い二重ストランド化し た。このフラグメントを０．１　ＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７，５）、０．２Ｍの ＭｇＣＪ　２．０．１ＭのＤＴＴ、各１ｍＭのｄｃＴＰ、　ａＡＴＰ。

ａＴＴＰ、　ｄＧＴＰ、２０ｐＦ／１ｎｌＶのオリゴｄｌｃ）、ＤＮＡポリメラ ーゼ■のフレノウフラグメントを含むｏ、　ｉ　ｙの混合物中で培養した。６７ °で６０分培養後に反応混合物をフェノールで抽出し、０．５ｃＩｒＬＸ５ｃｍ のセファデックスＧ−１００カラムに適用し、０．１ＭのＮａ（Ｊ、１０ｍＭの トリスＣ１（ｐＨ７，５）、１　ｍＭのＥＤＴＡで平衡、展開した。

ボイド分画をプールし、エタノール沈殿した。生成物を末端トランスフェラーゼ 反応（前述）に付して数筋のオリゴｄΩをその６′末端に付加した。これらの尾 部付加分子をついで実施例１記載の技術を使いシラスミ）ｐＢＲ６２２のＰｓｔ 　■部位中にクローニングした。オリ−！ｄ０の尾部を使いこのフラグメントを クローニングすることにより、プライマー拡張のためにホスホリル化されていた ＢａｍＨ１部位を回復した。それ故この物質の大腸菌への形質転換で得たテトラ サイクリン耐性コロニーをＢａｍＨ（での開裂の点からスクリーニングした。Ｐ ｓｔ　Ｉス ＋ＢａｍＨＩで除去される約２２０塩基長の挿入物を含む数分子クローンを単離 した。ｐＶＲ１０５と呼ばれる１つのかかるクローンのヌクレオチド配列分析に より、それがウィルスＲＮＡの塩基１〜２２０を表現するＤＮＡを含むことが示 された。シラスミ）’ｐＶＲ１０５は第３図に例示されている。

実施例　４ 完全ポリオウィルスｄｅ　ｃＤＮＡブースミドで　ＶＲ１０６、ｐｖＲ１０６ａ の構成 プラスミドｐｖＲ１０４とｐｖＲ１０５をあわせてｐＢＲ３２２においてポリオ ウィルスｄｓ　ｃＤＮＡの完全コピーを形成するに用いた方法を第４図に示す。

プラスミドｐＶＲ１０４の部分的ＢａｍＨＩ開裂条件はプラスミドを酵素と共に ６７°で長時間培養することにより決定した。消化物を０．６８％アガロースゲ ル中で電気泳動分析し、線状完全分子の存在を調べた。相当収量の線状完全分子 （定義すれば、ＢａｍＨＩにより一度切断された分子の配列である）を使い１０ ０μＩのｐＶＲｌ［］４を消化した。消化生成物を０，６％アガロースゲルで電 気泳動し、線状完全分子を除き、ゲルから回収した。ついでこれら分子をＥｃｏ Ｒ■で開裂し、開裂生成物を０．６％アガロースゲル電気泳動で分離した。ウィ ルスゲノムの塩基２２０から同ゲノムの３′末端を経てｐＢＲ３２２ＥｃｏＲ１ 部位に拡張された８−ＫｂＤＮＡ　フラグメントをそのサイズで確認し、アガロ ースゲルから抽出した。

２５　特表明５８−５００５８９（９）同様に、シラスミ）”ｐＶＲ１０５を線 状完全分子を生産する条件下で、０，６％アガロースゲル電気泳動での判断によ り消化した。線状分子はゲル電気泳動で精製し、ＥｃｏＲＩで開裂した。開裂生 成物を０．６％アＩ−スゲル電気泳動で分離した。ポリオウィルスゲノムの塩基 １〜２２０を表現するＤＮＡに結合したｐＢＲ３２２のヌクレオチド″１〜６６ ０７からなるフラグメントをそのサイズで確認し、精製した。

ｐＶＲ１０４とｐＶＲ１０５とから単離した約ｏ、１ｐｉのＤＮＡフラグメント （前記を参照）を混合し、５０　ｍＭのトリｘＨ（Ｊ（ｐＨ７，８）、１０ｍＭ のＮｇＣＡ’　２．２０　ｍＭのＤＴＴ、１　ｍＭのＡＴＰを含む反応混合物中 で培養した。

Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、１５Ｃで１８時間培養した。

ついでこの被結合ＤＮＡを前述の如く大腸菌Ｃ６００に形質転換した。様々な制 限エンドヌクレアーゼでのプラスミドＤＮＡの開裂により完全ポリオウィルスｃ ＤＮＡクローンの存在をテトラサイクリン耐性コロニーで調べた。

例えば、完全クローンをＫｐｎ　ｉで開裂し、０．６％アガロースゲル電気泳動 で調べたら８２００．２９９８，５９６塩基長のフラグメントが発生すると予想 される。ｐＶＲ１０６、ｐＶＲ１０６＋１として確認された２つのクローンを酵 素Ｂａｍ　ＨＩ、　Ｋｐｎ　１．　Ｐｓｔ　Ｉ、　ＢｇｌＩ、　Ｂｇｌｌ、Ｘｂ ａＩで消化したら完全クローンから予想されるパターンと一致するパターンが得 られた。

ｐＶＲ１０６、ｐＶＲ１０６ａからの挿入体の５′末端のヌ％ クレオチド８配列により、これら分子クローン中にウィルスＲＮＡの５′末端が 存在することが実証された。それ故、ｐＶＲ１０６とｐＶＲ１０６ａとはｐＢＲ ３２２のＰｓｔ　１部位にポリオウィルスゲノムの完全ｃＤＮＡコピーを含んで いた。

プラスミドｐｖＲ１０６を含む細菌細胞系の寄託はＡＴＣｃになされており、Ａ ＴＣｃ受入Ａ３１８４４として確認される。この寄託物は細胞宿主大腸菌ＨＢ１ ’０１中のプラスミド”ｐＶＲ１０６からなる。このプラスミド９はｒｅｃＡ− であるこの細菌株に挿入されてその安定性を維持されている。実施例１の３ａ項 記載の方法を用いて形質転換を達成した。

クローンｐｖＲ１０６へのポリオウィルス特異性挿入体の完全ヌクレオチド配列 を公表技術を使い得た。Ｍａｘａｍ。

Ａ、　Ｍ、とＧ１１ｂｅｒｔ、　Ｗ、　（１９８０）のＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　 Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

Ｇｒｏｓｓｍａｎ、Ｌ＋とＭｏ１ｄａｖｅ、　Ｋ、のｅｄｓ、　、第６５巻、４ ９９〜５５９頁、ニューヨークのアカデミツクプレス発行、を参照されたい。こ の配列は表Ｉに示されている。

５′未翻訳領域では潜在的末端コードンが星印でマークされ、それらが生ずる相 が示されている。未翻訳領域のＡＴＧコードンには下線が付され、それらが生ず る相が示されている。配列は塩基７４３で始まり塩基７３３９を経るアミノ酸に 翻訳される。

ウィルスＲＮＡの５′末端に結合した蛋白であるＶＰｇのコート９領域とアミノ 酸配列とは下線で示されている。

ＶＰｇ　の位置は公表配列に基く。Ｌａｒｓｅｎ、　Ｇ、　Ｒ，。

６２８〜３３５（１９８１）を参照されたい。

ピリオン蛋白の位置はアミノ酸配列データに基づいて２δ ３０ ２？ １ ３ ３ｔＦ 実施例６ １０ｃＩｒＬプラスチック皿でＣＶ−１細胞とＨｅ　Ｌａ細胞とを増殖させて８ ０％集合にした。略述すれば、細胞を１０％牛血清を含むデマルイツコ（Ｄｕｌ ｂｅｃｃｏ　）　改良イーグル培地（ＤＭＥＭ　）で増殖させた。細胞を、５％ Ｃ○２が補充された大気を含む給温インキマベータ内で３７ｔＬ’で維持した。

実施例１記載と同様にして作った、１皿当たり１０μ９のプラスミドＤＮＡか２ μｙのウィルスＲＮＡで細胞をトランスフェクションした。Ｐａｒｋｅｒと５ｔ ａｒｋ　により記載の改良リン酸カルシウム技術を使いトランスフェクションを 達成したＯＢ、Ａ、ＰａｒｋｅｒとＧ、Ｒ，５ｔａｒｋのＪ、Ｖｉｒｏｌ、、　 ３Ｌ３６０（１９７９）を参照されたい。略述すれば、培地を細胞から除き、Ｄ ＮＡなヘベス緩衝塩水でのリン酸カルシウム沈殿物として加えた。室温で２０分 後に細胞を温培地（デュルベツコ改良イーグル培地＋１０％牛血清）で被い、３ ７°で数時間培養した。ついで培地を除′き、細胞を温培地で１度洗い、２．５ ｍ１７皿のへはス緩衝塩水中１５％グリセリンを加えた。６７Ｃで３．５分後に グリセリンを除き、細胞を温培地で１度洗った。ついで、反復器のうちの１枚を 温培地で被い、他は１％マガロース（シグマ）を含む培地で被った。両プレート を６７Ｃで３６ 天を除き、細胞を５０％エタノール中０．１％クリスタルバイオレットで染色し た。液体下で培養した細胞からの培地をＨｅＬａ細胞単層で病原性ポリオウィル スの有無の観点から分析した。

結果は表２１／′ｃ示されており、そこに示されているウィルス力価は典型的実 験での値である。

ＲＮＡ５ｅ処理のために５μ９　の沸騰ノξンクレアチンＲＮＡ５ｅ　（Ｖ　シ アトン）を１０μ夕のＤＮＡ又は２μ９　のＲＮＡに対して使った。

判明する如く、ｐＶＲｌ［１６でトランスフェクションされた細胞からの培地に おいて高つイルスカ価が発見されタカ、ｐＢＲ３２２−）ランスエフシャン細胞 からはウィルスは放出されなかった。細胞をｐＶＲ１０６でトランスフェクショ ンし、寒天下で培養し、クリスタルバイオレットで染色したら、ポリオウィルス 誘発プラークに似たプラークが示された。ｐＢＲ３２２ＤＮＡでトランスフェク ションされた細胞ではプラークは観察されなかった。普通、１０μｙ　のｐＶＲ ｌｏ６でトランスフェクションされた細胞の１００朋プレート１個当たり１０〜 ７０のプラークが観察された。Ｐａｒｌｃｅｒと５ｔａｒｋ　が提示の如くこれ ら細胞のうちの約１０％がＤＮＡを受け入れたならば、感染性病巣は約２〜５ｘ ｉｏ”−”　の率で発生していた。

ｐＶＲ１０６ａ（実施例４参照）と呼ばれる独立して誘導された完全ポリオウィ ルスｃＤＮＡクーロンでトランスフェクションにしても、細胞へのトランスフェ クション後に感染性ウィルスが生じた。

結果を同じく表２に提示した別の実験により、トランスフェクションされた細胞 でのウィルス生産がプラスミドｐＶＲ１［１６で指示されることが示された。シ ラスミドｐＶＲ１０６を４５部位で切断し、ウィルスＲＮＡの感染性を下げない 酵素であるＨｉｎｆ　Ｉで開裂されたｐＶＲｌｏ、！５ＤＮＡでトランスフェク ションされた細胞ではウィルスは検出されなかった。ウィルスＲＮＡの感染性を 損う条件下でのＲＮＡ５　ｅでの処理ではｐＶＲｌｏ６　ＤＮＡの感染性は有意 には下がらなかった。それ故、感染性はｐＶＲ１０６ＤＮＡに混在しているウィ ルスＲ１ＪＡに起因するのではなかった。ｐＶＲ１０６ＤＮＡのフェノール抽出 のみ、或はこれに続（ＲＮＡ５ｅ処理ではプラスミドの感染性は下がらなかった 。従って、ピリオンがｐｖＲ１０６製剤中に存在するとは思われなかった。Ｈｅ Ｌａ細胞単層でのピリオン夾雑をｐＶＲ１０６ＤＮＡ　で直接分析したら感染性 は検出されなかった（データは示されていない）。これら結果は、ｐｖＲ１０６ の感染性がシラスミドＤＮＡに固有であることを示している。

８ 培地でのプラーク　トランスフェクションＣＶ−１細胞 ｐＶＲｌｏ６　１．．２Ｘ１０９　２２ｐＶＲ１０６＋Ｈｉｎｆ　Ｉ　Ｏ０ ｐＶＲ１０６＋ＲＮＡ５ｅ　１．３Ｘ１０９　１０ｐＶＥ（１０６、フェノール 抽出　１×１０９２２ ｐＶＲ１０６、フェノミル 抽出ついでＲＮＡ５禰理　１．４Ｘ１０９　２６ｐＢＲ３２２００ ウイルスＲＮＡ　１．５Ｘ１０９　’　７１ウイルスＲＮＡ＋ＦｔＮＡｓｅ　Ｏ Ｏ ウィルスＲＮＡ＋Ｈｉｎｆ　Ｉ　１．４　Ｘｌ　０９　２０ＨｅＬａ細胞 ｐＶＲｌｏ６　３．７Ｘ１０８　、　６９ｐＢＲ３２２００ 実施例７ ｐＶＲｌｏ６−）ランスフエクション細胞で生産されたウィルスの本体を抗体中 和テストを使い調べた。実施例乙の方法で得られたｐｖＲ１０６トランスフェク ション細胞の培地中に放出された約１００ゾラーク形成単位のウィルスな様々な 希釈度のウサギ抗ポリオウィルス抗血清と混合して感染性を分析した。並行して 、１００ゾラーク形成単位の真正ポリオウィルスの血清による中和を分析した。

両ウィルスを１１５０，０００希訳度の血清で５％に中和したらｐＶＲ１０６誘 導ウィルスが真正ポリオウィルスであることが示された。

実施例８ 上記実施例２に記載の如くして製造したシラスミド。

ｐＶＲｌ　０４は全ポリオウィルスゲノムに対するほぼ完全なｃ　ＤＮＡ配列を 含むがポリオウィルスゲツノ、の初めの１１５の塩基を欠く、シラスミド”ｐＶ Ｒｌｏ４　を実施例乙の方法でＣＶ−１細胞にトランスフェクションしたがウィ ルスは生産されず、ポリオウィルスＲＮＡの５′末端は蛋白をコード化しない（ この領域にはＡ、Ｕ（、コードンはない）が感染性にとり必要であることを示し ている。

〔産業上の利用性〕

本明憚書記載の発明は組換体ＤＮＡ　技術によりポリオウィルスｃＤＮＡ等のＲ ＮＡウィルスｃＤＮＡ　の生産に役立つ。一方ポリオウイルスｃ　ＤＮＡ等の生 産物はかがるウィルスの検出分析、かかるウィルスに対するウィルス系抗原、抗 体の生産等に役立つ。

４０ 当業者ならば本明細書記載の発明の特定態様の多くの均等態様を認識し、或は単 なるルーチンの実験で確認できるであろう。かかる均等態様も次の請求の範囲に 包含される。

阜ｌ　図 隼４図 手続補正書（方式） １、事件の表示 ６、補正をする者 事件との関係　出　願　人 ４、代理人 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、　Ｃ１，３識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｑ　１／７０　６５４３− ４Ｂ ／／Ｃｌ２Ｑ　１／６８　６５４３−４８（Ｃ１２Ｎ　１５１００　７２３５− ４ＢＣ１２Ｒ１／１９　）　６７６０−４８（Ｃ１２Ｐ　２１１００　７２３５ −４ＢＣ１２Ｒ１／１９　）　６７６０−４８（Ｃ１２Ｎ　７１００　７２３５ −４ＢＣ１２Ｒ１／９１　）　６７６０−４Ｂ優先権主張　■１９８１年１１月 １２日■米国（ＵＳ）■３２０５２５

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．　ＲｔＪＡウィルスｃＤＮＡ生産方法において、ａ、ＲＮＡウィルス配列を 逆転写してｃＤＮＡ　を提供し；ｂ、該ｃＤＮＡを組換体ＤＮＡベクターに挿入 し；Ｃ１該組換体ＤＮＡベクターを増殖させる細胞を形質転換し； ｄ、形質転換細胞をクローニングして該ｃＤＮＡを複製できるクロナール細胞系 を生産し； ｅ、該クロナール細胞系をｃＤＮＡ生産条件で培養し；ｆ、該細胞培養物から該 人ｃＤＮＡを採取する；ことからなる方法。 ２、該ＲＮＡウィルス配列が人ピコルナウィルスからのＲＮＡからなる、請求の 範囲１記載の方法。 ６、該ＲＮＡウィルス配列がポリオウィルスＲＮＡからなる、請求の範囲１記載 の方法。 ４、該組換体ＤＮＡベクターが細菌プラスミド、ファージ、動物ウィルス又はイ ーストベクターから選択されるベクターからなる、請求の範囲１．２又は６記載 の方法。 ５、　ポリオウィルスｃＤＮＡの細菌学的生産方法において、ａ、ｙＦ、リオウ イルスＲＮＡを逆転写してＳＳ　ポリオウィルスｃＤＮＡを提供し； Ｃ６該ｄＳ　ポリオウィルスｃＤＮＡを細菌プラスミドに挿入してキメラプラス ミドを創生し； ｆ、該クローナル細菌細胞系をポリオウィルスｄｓｃＤＮＡ生産可能の条件の細 胞培地で培養し；ｇ、該細胞培地から該ポリオウィルスｄｓ　ｃＤＮＡ　を採取 する； ことからなる方法。 ６、該細菌細胞が大腸菌細胞からなる、請求の範囲５記載の方法。 ７　該細菌プラスミドが形質転換細胞に対する選択的マーカーを含む、請求の範 囲６記載の方法。 ８、該選択的マーカーが抗生物質耐性である、請求の範囲７記載の方法。 ９　該細菌プラスミドがプラスミドｐＢＲ３２２からなる、請求の範囲８記載の 方法。 １０、請求の範囲５．６．７．８又は９記載の方法で生産されるポリオウィルス ａｓ　ｃＤＮＡ　。 １１、　’　ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを含む組換体ＤＮＡベクター。 １２、該ＲＮＡウィルスｃＤＮＡｆＪ″−ポリオウィルスｃＤＮＡからなへ請求 の範囲１１記載の組換体ＤＮＡベクター。 １ろ、ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを含むキメラ細胞プラスミド。 １４、該ＲＮＡ　ウィルスｃＤＮＡがポリオウィルスｄｓ４３ ｃＤＮＡからなる、請求の範囲１６記載のキメラ細菌プラスミド。 １５、ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを含む組換体ＤＮＡばフタ−で形質転換されたク ロナール細胞系。 １６、該ＲＮＡウィルスｃＤＮＡがポリオウィルスｄｓ　ＣＤＮＡからなる、請 求の範囲１５記載のクロナール細胞系。 １Ｚ　ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを含むキメラプラスミドで形質転換されたクロナ ール細菌細胞系。 １８、該ＲＮＡウィルスｃＤＮＡがポリオウィルスｄｓ　ｃ耐Ａからなる、請求 の範囲１７記載のクロナール細菌細胞系。 １９、該細菌細胞が形質転換大腸菌細胞からなる、請求の範囲１７又は１８記載 のクロナール細菌細胞系。 ２０、ＡＴＣＣ受入４３１８８４で確認されるクロナール細菌細胞系。 ２１、ＲＮＡウィルスの分析法において、該ＩＡウィルス表表現様標識化ＤＮＡ を用いて該ＲＮＡウィルスに結合させ、その後、該ＲＮＡウィルスに結合した被 標識化ｃＤＮＡを検出することからなる改良法。 ２２、該ＲＮＡウィルスがポリオウィルスからなる、請求の範囲２１記載の改良 法。 ２ろ、サンプル中のＲＮＡ　ウィルスを検出するための分析法において、 ａ、該サンプルのＲＮＡ含有画分を単離し、ここで該ＦＩＮＡ含有画分は該ＲＮ Ａウィルスが該サンプル中に元来存在するならばそれを含む画分であり；４４　 特表明５８−５００５８９（２）ｂ６　該ＲＮＡウィルスに対してｃＤＮＡ　を 標識化し：Ｃ１被標識化ｃＤＮＡがＲＮＡウィルスに結合するに充分な条件下の 培養混合物中で該被標識化ｃＤＮＡを該ＲＮＡ含有画分と共に培養し； ｄ、未結合被標識化ｃＤＮＡを培養混合物から除き；ｅ、残りの結合被標識化ｃ ＤＮＡを検出する；ことからなる分析法。 ２４、該ＲＮＡウィルスがポリオウィルスからなる、請求の範囲２６記載の分析 法。 ２５、該サンプルが人間生理学的サンプルからなる、請求の範囲２４記載の分析 法。 ２６、該人間生理学的サンプルが生検サンプルか脳を髄液からなる、請求の範囲 ２５記載の分析法。 ２Ｚ　該サンプルが下水からなる、請求の範囲２４記載の分析法。 ２８、ウィルスＲＮＡに対する抗体の生産方法において、ａ、該ウィルスＲＮＡ を逆転写してウィルスＲＮＡｃＤＮＡを提供し； ｂ、該ＣＤＮＡを組換体ＤＮＡベクターに挿入し；Ｃ１該組換体ＤｔＪＡ　はフ タ−が増殖できる細胞を形質転換し； ｄ、形質転換細胞をクローニングして該ｃＤＮＡを複製できるクロナール細胞系 を生産し； ｅ、ｃＤＮＡ生産条件で該クロナール細胞系を培養し；ｆ、該細胞培養物から該 ｃＤＮＡを採取し；５ ｇ、細胞でのウィルスＲＮＡ　抗体合成を指示できる特異的ｃＤＮＡを選択、単 離し； ｈ、該特異的ｃＤＮＡを細胞に挿入し；１、ウィルスＲＮＡ抗原生産条件で該細 胞を培養し；ｊ、宿主を該抗原で免疫化して該宿主に抗ウィルスＲＮＡに対する 抗体を生産させる； ことからなる方法。 ２９　該ウィルスＲＩＪＡがポリオウィルスからなる、請求の範囲２８記載の方 法。 ろ０．該ウィルスＲＮＡ　がコクサラキーウィルスからなる、請求の範囲２８記 載の方法。 ６１、該ウィルスＲＮＡ　がリノウイルスからなる、請求の範囲２８記載の方法 。 ６２、ウィルスＲＮＡ　抗原生産方法において、ａ、ウィルスＲｔ、ｌＡ　を逆 転写してウィルスＲＮＡｃＤＮＡを提供し； ｂ、該ｃＤＮＡを組換体ＤＮＡばフタ−に挿入し；Ｃ１該組換体ＤＮＡベクター が増殖できる細胞を形質転換し； ｄ、形質転換細胞をクローニングして該ｃＤＮＡを複製できるクロナール細胞系 を生産し； ｅ、ｃＤＮＡ生産条件で該クロナール細胞系を培養し；ｆ、該細胞培養物から該 ｃＤＮＡを採取し；ｇ、細胞中でのウィルスＩＡ抗原合成を指示できる特異的ｃ 　ＤＮＡを選択、単離し； ｈ、該特異的ｃＤＮＡを細胞に挿入し；ｉ、ウィルスＲｔＪＡ　抗原生産条件で 該細胞を培養し；Ｊ、該抗原を採取する； ことからなる方法。 ６３、シラスミドｐＶＲ１０６゜ ６４、完全ポリオウィルスｃＤＮＡを含む組換体ＤＮＡイクター。 ３５、表Ｉに記載の塩基配列を有すするーポリオウイルスＣＤＮＡと、それと同 一のアミノ酸配列又はその均等配列に対する別のコードンを有するその均等物。 ′５６．感染性Ｒ悼ＡウィルスｃＤＮＡ　。 ６１　感染性ポリオウィルスｃＤＮＡ。 ３８、感染性ＲＮＡウィルスの生産方法において、ａ、細胞を該ＲＮＡ　ウィル スに対する感染性ｃＤＮＡでトランスフェクションし； ｂ、ＲＮＡウィルスの細胞生産に充分な条件で該細胞を培養し； Ｃ０該ＲＮＡ　ウィルスを採取する； ことからなる方法。 ６９　該ＲＮＡ　ウィルスがＩＡ　の単−正ストランドからなるゲノムを有する ウィルスである。請求の範囲６Ｂ記載の方法。 ４０、該ＲＮＡウィルスがポリオウィルスである、請求の範囲６８記載の方法。 ４１、該細胞が哨乳動物細胞からなる、請求の範囲３８、４７ ６９又は４０記載の方法。 ４２、該咄乳動物細胞が人間の細胞である、請求の範囲４１記載の方法。 ４３ＲＮＡ　ウィルス配列からワクチンを生産する方法において、 ａ、該ＲＮＡウィルス配列を逆転写して感染性ＲＮＡウィルスｃＤＮＡを生産し ； ｂ、該感染性Ｒｔ’ＪＡウィルスｃＤＮＡ　を突然変異させ；。、ウィルスＲＮ Ａ　を生産できる細胞を該突然変異感染性ＲＮＡ　ウィルスｃＤＮＡでトランス フェクションし；ｄ、）ランスフエクションした該細胞を、被弱毒化ウィルスＲ ＮＡ生産に充分な条件で培養する；ことからなる方法。 １　Ｈｅ表表明８−５００５８９（３）