DD143794A1

DD143794A1 - Verfahren zur isolierung langer doppelstrang-cdns-molekuele aus einer heterogenen population

Info

Publication number: DD143794A1
Application number: DD21337679A
Authority: DD
Inventors: Dirck-Hartmut Liebscher; Charles Coutelle
Original assignee: Liebscher Dirck Hartmut; Charles Coutelle
Priority date: 1979-06-01
Filing date: 1979-06-01
Publication date: 1980-09-10

Abstract

Die Erfindung hat das Ziel, ein einfaches und schnell durchführbares Verfahren zur Isolation langer Doppelstrang-cDNS-Moleküle, die vollständige Gene repräsentieren, zu entwickeln. Erfindungsgemäß werden relativ lange homopolymere Einstrangenden von einer durchschnittlichen Längs von 30 bis 60 Nukleotiden mittels terminaler Transferase an die Doppeistrang-cDNS-Mo'eküle polymerisiert. Anschließend wird dieses Material in vitro mit einem linearen Plasrnidvektor, der nach Transferasereaktion homopolymere, komplementäre Einstrangenden mit einer durchschnittlichen Länge von 8 bis 12 Nukleotiden besitzt, über die Enden aneinandergeiagert und in entsprechend vorbehandelte Empfängerzellen, wie mit CaCl2-behandelte E.coli-Bakterien, transferiert.

Description

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Verfahren zur Isolierung langer Doppelstrang-cDNS-Moleküle aus einer heterogenen Population

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein biologisches in-vivo-Selektionsverfahren für lange Doppelstrang-cDHS-MoleküIe aus einer heterogenen Population.

Anwendungsgebiete der Erfindung sind Medizin, Pflanzen- und Tierproduktion sowie die pharmazeutische Industrie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Die bisher bekannten Verfahren der Isolierung langer Doppelstrang-cDNS-Moleküle, die vollständige Gene repräsentieren, beruhen auf der Vorfraktionierung nach Größe mittels Gelelektrophoresen oder.Dichtegradienten (Villa^Komaroff et al., Proc. IJatl. Acad. Sei, USA, 75 (1978), S. 3727 - 3731)· Diese Vorfraktionierung ist arbeitsaufwendig und hat Verluste an eingesetztem Material zur Folge.

Zielstellung der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein einfaches und schnell durchführbares Verfahren zur Isolierung langer Doppelstrang-cDUS-Moleküle, die vollständige Gene repräsentieren, zu finden.

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Darlegung des Wesens der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren geht aus von DoppelstrangcDHS-Molekülen heterogener Länge, die aus der Unikehrtranskription von mRUS, poly (A) -RIiS oder mit rA -geschwänzter einsträngiger RUS auf enzymatischem-Wege gewonnen werden. Erfindungsgemäß werden relativ lange homopolymere Einstrangenden von einer durchschnittlichen Länge von 30 - 60, vorzugsweise 40,.Nukleotiden an die Doppelstrang-cDUS-Moleküle polymerisiert« Die Polymerisation erfolgt mittels terminaler Transferase. Durch die Kinetik dieser'enzymatischem Reaktion "bedingt, werden innerhalb einer Doppelstrang-cDNS-Population von heterogener Länge an die 3'-Enden der langen Doppelstrang-cDUS-Moleküle vorzugsweise kürzere, an die kurzen Doppelstrang-cDUS-Moleküle vorzugsweise längere homopolymere Enden synthetisiert.

Das Plasmid pBR322 wird als Vektor benutzt. Die Plasmid-DNS wird durch die Restriktionsendonuklease Psti nur an einer Stelle gespalten. An das so entstandene lineare Plasmid von definierter Länge v/erden nur kurze komplementäre homopoly- . mere Einstrangenden von durchschnittlicher Länge von 8-12, vorzugsweise 10, Hukleotiden mittels terminaler Transferase synthetisiert (kurzgeschwänzter Vektor). Vektor und Doppelstrang-cDEFS-Moleküle werden danach durch Hybridisation der komplementären homopolymeren Einstrangenden ringförmig miteinander verbunden.und in entsprechend vorbehandelte Empfängerzellen, Z₀ B. mit CaCl₂ behandelte E.coli-Bakterien, transferiert.

Das neue Verfahren führt zu einer hohen Ausbeute an langen Doppelstrang-cDHS-Molekülen. Die Effektivität des Verfahrens kann gezeigt werden durch den Vergleich mit einem parallelen Experiment, allerdings unter Einsatz von Vektormolekülen, an die lange homopolymere Enden von durchsciinittlicher Länge von 65 Uukleotiden synthetisiert wurden (langgeschwänzter Vektor). Überraschend wurde gefunden, daß die erfindungsgemäße Klonierung mit dem kurzgeschwänzten Vektor beträchtlich erfolgreicher ist, gekennzeichnet durch die absolute Zahl

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der Tetrazyklin— resistenten Transf ox^manten, durch die Veränderung der Ampizillinresistenz des Vektors , durch die absolute Zahl der stark hybridisierenden Klone im üHUUSUSällT-HOüiiESS-Verfahren (Grunstein und Hcgness, Proc. Hatl. Acad. Sei· USA, 22 0975)» S. 3961 - 3965) und durch die Hestriktionsanalyse zur Längenverteilung der integrierten ds-cDITS, die aus den stark hybridisierenden Klonen gewonnen wird.

Das neue Verfahren ist einfach zu realisieren und breit anwendbar, wobei die speziellen Bedingungen der terminalen Transferasereaktion je nach eingesetztem Material (ds-cDHS aus der Umkehrtranskription von mHlTS, poly(A)"-HES oder mit rA -geschwänzter einsträngiger EITS) geringfügig variiert werden müssen, um die für das Verfahren notwendigen unterschiedlich langen homopolymeren Enden an der zu selektierenden Doppel-, strang-cD'KS und am Vektor zu erhalten. Das Verfahren wird nachfolgend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert, wodurch die Erfindung jedoch nicht begrenzt wird·

Beispiel

Herstellung von ds-cDiS

Fraktionierte PoIy(A)^-RHS (9S) aus Brockmann-Körpern des Karpfens wird mit AHV-Umkehrtranskriptase in komplementäre WS (cDHS) in einem 2o ο /u.1- Ansatz, der 3o/ug/ml HHS, 8o/ug/ml oligo(d'I)₁₂-1s · 5° ¹^³ T^is/HCl pH 8,2 , 5o mil KCl, 5 xaM ISgA-C₀ , 1o mM DTT, o,5 η&ΐΐ eines jeden dlTTP (G, G, A, T), 4oo/UCi/ml ^H-dCTP und 11 Einheiten/ml AI£V-Umkehrtranskriptase enthält, in 1 Std. bei 37°G in o,72/Ug cDlTS (535.ooo cpm) umgeschrieben. Im alkalischen Saccharosegradienten (5 — 2o?» linearer Saccharose gradient, ο,2 H ITaOH, 1o mEl EDTA, 2o°C_s 4o₅ooo U/rain, Beclnnan SV/4-o Rotor) ergibt dieses Material einen einheitlichen 9S-Pik. Der Gradient wird in 26 !Fraktionen geteilt, die Fraktionen 9 bis 16 v^erden geschnitten. Diese so gewonnene cDHS dient als Ausgangsmaterial für die Doppelstrang;synthese mit den KIIQiTQW-Fragment der Eecoli-DITS-Polymerase I (Fa. Boehringer) in einem Ansatz mit 1,6/Ug/ml cDES 3o mM Sris/HGl pH 7_S5 , 4 mil 13gCl_? , o_?5 ml ß-Merkaptoätnanol,

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o,5 sH eines jeden dITTP (G, C, A, T), 7ο mil KCl und 62,5 Enzymeinheiten/ml. Nach 75 nin. Inkubation bei 18 - 2o°C wird die Mischung enteiweißt, entsalzt und die ds-cDNS mit S^-Nuklease präparativ behandelt, um aus dem Material DIIS-Einstrangbereiche zu entfernen,. Dieses Material wird analytisch im alkalischen Saccharosegradienten charakterisiert« Die durchschnittliche.· Länge beträgt auf der Grundlage des Gradientenprofils nur etwa 3oo bp (Basenpaare), d.h. nur die Hälfte der Länge des 9S-Ausgangsmaterials. Das gesamte ds-cDNS-Material wird präparativ im neutralen Saceharosegradienten (5 - 2o% linearer Saccharosegradient, o,1 M NaCl, 1 ο mil Tris/HCl pH 7,5, 2o°C, Beckman SW4o Rotor, 25.ooo IT/min, 2o Std„) getrennt. Das Material des breiten Piks, wobei aus 26 Fraktionen die von Nr. 12 bis 18 geschnitten wurden, dient als Ausgangsmaterial für die Synthese langer homopolymerer Einstrangenden an die ds-cDNS mittels terminaler Transferase (BOLLIM-Enzym).

Synthese homopolymerer 3'-Enden an doppelsträngiger DNS Ein Ansatz mit o,57/Ug/ml ds-cDNS, diese Konzentration entspricht 5 Bl£ 3'-Enden auf der Grundlage einer durchschnittlichen Länge der ds-cDNS von 3oo bp, 1 mM CoCl₂ , o,2 M HEPES-Puffer pH 7,1 , 5cyuM ⁵H-d0TP (22 Ci/mlTol) und 154 Snzymeinheiten/ml wird 5 min bei 37°C inkubiert. Die Inkubationszeit, die zur Synthese von 3° bis 6o Nukleotiden notwendig ist, wird unmittelbar vorher analytisch bestimmt. Im präparativen Ansatz entspricht der Einbau von "Ή-dCTP einer durchschnittlichen Länge von 41 Nukleotiden pro 3'-Ende der DNS.

Zur Klonierung wird als Yektor das Plasmid pBR322 (Bolivar et al., Gene, 2 (1977), S. 95 - 113) verwendet. Nach Linearisierung des Yektors mit Hilfe der Restriktionsendonuklease Pstl, die das Plasmid nur einmal und zwar im Ampizillin-Gen (das Gen kodiert für eine ß-Lactamase, die Ampicillin unwirksam macht und die damit die.Ampizillinresistenz des Plasmid-tragenden Bakteriums bewirkt) spaltet, viird an dessen 3'-Enden dG_ mit terminaler Transferase synthetisiert. Per

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Ansatz enthält 5 ηΜ 3'-Enden des Plasmids, ο,if? M HEPES-Puffer pH 7,1 , 1 τΜ CoCl₂ und 1ο2 Enzymeinheiten/ml. Eür die Synthese des kurz-geschwänzten Vektors (mit dG. ) wird 2o/uCi Ίϊ-dGTP (8 Ci/mHol) eingesetzt«, Für die Zinn Vergleich durchgeführte Synthese eines lang-geschwänzten Vektors (mit wird 5oo/Ul.i -^H-dGTP (8 Ci/mllol) verwendet. Die entsprechenden Inkubationszeiten bei 37°C werden jeweils unmittelbar vorher analytisch, ermittelt und betrugen ca· 5 13L

Hybridisation der Enden und Transformation Nach Synthese der homopolymer en Enden an ds-cDliS und Vektor-DNS werden jeweils 2 ng ds-cDITS und 53 ng 'Plasmid-DrTS (entweder pBE322-dG^₀ oder zum Vergleich pBR322-äGg,-) untei? Bedingungen inkubiert, die eine Aneinanderlagerung der homopolymeren komplementären Einstrangenden erlauben. (15° /ul Ansatz, der 1o ml,! Tris/HCl pH 7_S5 , 1oo mil KaCl, ο,2 mil EDTA und die angegebenen DKS-LIengen enthält und zunächst 3 Hin« bei 64⁰C, danach 2 StcU bei 42 bis 44⁰C Inkubiert und schließlich innerhalb eines Zeitraums von 3 Std. langsam auf 25°C abgekühlt wird)» Diese raschung kann unmittelbar zur Transformation von CaCIp-behandelten Ε.οοϋ*γ1776 - Bakterien, wobei die von Norgard et al. (Korgard et al·, Gene, J5 (1977)> S· 279 ~ 292) beschriebene Methode Anwendung findet, eingesetzt Y/erden.

Die Tabelle 1 zeigt die charakteristischen Daten der gewonnenen Transformanten (Klone). Aus der Tabelle wird ersichtlich, daß die Effektivität der molekularen Klonierung mit dem erfindvaigsgemäßen, kurz ge schwänzten Vektor 2o-fach, mit dem vergleichsweise langgeschwänzten Vektor dagegen nur 3-fach über dem jeweiligen Kontrollwert (Vektor ohne ds-cDIiS) liegt· Unter den aufgefundenen Klonen befinden sich aufgrund der Integration der ds-cDITS im Ampizillinresistenz-Gen beim eirfinduagsgemäßen Verfahren 60J0, beim vergleichsweise durchgeführten Verfahren dagegen nur 16>& Ampizillin-eiapfindliche Klone« Bei der Rückhybridisation mit der 93-Fraiction der poly(A)^-FdTS, die ursprünglich auch als Ausgangsmaterial für

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die cDITS-Synthese diente, ergibt sich ein ähnliches Bild; im erfindungsgemäßen Verfahren werden 6%, im vergleichsweise durchgeführten Verfahren dagegen nur 1% stark hybridisierende Klone gefunden. Schließlich befinden sich unter den 38 stark hybridisierenden. Klonen aus dem erfindungsgemäßen Verfahren 6 Klone mit Insertlängen von 6OObp, 15 mit Längen von 300 bis 600 bp und nur 5 mit Längen um 300 bp, wobei 26 Klone nur untersucht wurden.

Tabelle 1

Charakterisierung und Vergleich der Effektivität der molekularen Klonierung- von ds-cDHS-dC,,.* im erfindurigsgemäßen Verfahren mit kurz-geschwänztem Vektor und im vergleichsweise

durchgeführten mit lang-ge schwänzten Vektor

	Erfindungs gemäßes Verfahren	Parallel verfahren
	pBR322-dG_1o	pBR322-dG₆₅
Tc^r-Transformanten Ap^r Ap^(r> Ap^s	η %	η %
Davon mit 2²JUp₀Iy(A)^-RHS stark hybridisierenden Klone Längen integrierter ds~cDITS in 26 von 38 stark hybridi sierenden Klonen 600 bp 3oo - 600 bp 300 bp	6o2 I00 72 12 171 28 359 60	138 I00 83 44 75 4o 3o 16
Kontrolliert: Dc^r-'Irarisfor- laanten mit linearisiertem Vektor ohne ds-cDIT3	38 6 6 15 5	2 1 nicht un tersucht
5o 5	65 35

Erläuterungen: Tc Tetrasyklin-resistent

Ap^r Ampizillin-resistent

Ap^ gering Ampizillin-resistent

Ap^s Ampisillin-enpfindlich

bp Basenpaare -

Claims

Erfindungsanspruch

1· Verfahren zur Isolierung langer Doppelstrang-cDHS-Moleküle aus einer heterogenen Population, die aus der Umkehrtranskription von mRNS, poly (A)⁺-RUS oder mit rA -geschwänzter einsträngiger RlTS auf enzymatischem Wege gewonnen wurde, dadurch gekennzeichnet, daß man lange polymere Einstrangenden mit einer durchschnittlichen Länge von 30 bis 60 ITukleotiden an die .Doppelstrang-cDUS-Moleküle polymerisiert, anschließend dieses Material mit einem linearen Plasmidvektor, der nach der Transferasereaktion homopolymere, komplementäre Einstrangenden mit einer durchschnittlichen Länge von 8 bis 12 Uukleotiden besitzt, über die Enden aneinanderlagert und in Empfängerzellen transferiert.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man lange polymere Einstrangenden mit einer durchschnittlichen Länge von 40 Eiukleotiden an die Doppelstrang-cDUS-Moleküle polymerisiert.
3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die langen polymeren Einstrangenden mittels terminaler Transferase an die Doppelstrang-cDHS-Moleküle polymerisiert«
4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein linearer Plasmidvektor verwendet wird, der eine durchschnittliche Länge von 10 Nukleotiden besitzt«
5. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Empfängerzellen mit CaCl₂ behandelte Eocoli-Bakterien verwendet werden