DE3751554T2

DE3751554T2 - Erzeugung von xanthangummi durch rekombinant-dns.

Info

Publication number: DE3751554T2
Application number: DE3751554T
Authority: DE
Inventors: Michael Betlach; Michael Capage; Daniel Doherty; Rebecca Vanderslice
Original assignee: Texaco Development Corp
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1986-03-24
Filing date: 1987-03-24
Publication date: 1996-06-13
Anticipated expiration: 2007-03-25
Also published as: JPH01502555A; NO874878L; NO306476B1; NO874878D0; EP0326544A1; JP2612583B2; EP0326544A4; CA1338138C; DE3751554D1; EP0326544B1; ATE128731T1; WO1987005938A1

Description

Xanthangummi wird natürlicherweise hergestellt durch Bakterien der Gattung Xanthomonas, insbesondere von Mikroorganismen der Art X. Campestris. Xanthangummi wird wegen seiner ungewöhnlichen physikalischen Eigenschaften in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt, d. h. seiner extrem hohen spezifischen Viskosität und seiner Pseudoplastizität. Bei zwei speziellen Anwendungen wird Xanthangummi in Nahrungsmitteln verwendet als ein Dickungsmittel und bei der gesteigerten Ölgewinnung als Mobilitätskontrolle und Profilmodifizierendes Mittel. Weiterhin ist Xanthangummi nützlich bei der Formulierung von Petroleum-Bohrflüssigkeiten.
Chemisch gesehen ist Xanthangummi ein anionisches Heteropolysaccharid. Die sich wiederholende Einheit des Polymers ist ein Pentamer, das sich aus fünf Zuckerresten zusammensetzt, insbesondere zwei Glukose-, einer Glukuronsäure- und zwei Mannosekomponenten. Die Zuckerreste sind so angeordnet, daß die Glukosekomponenten das Rückgrat der Polymerkette bilden, wobei sich die Seitenketten aus Mannose-Glukuronsäure-Mannose-Resten im allgemeinen von alternierenden Glukosekomponenten erstrecken. Üblicherweise ist diese Grundstruktur spezifisch acetyliert und pyruvyliert, wie beispielsweise beschrieben von Janson, E.P., et al., in Carbohydrate Research 45: 275-282 (1975), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird.
Bis zum heutigen Tage sind Xanthomonas campestris und verwandte Xanthomonasarten die einzige verfügbare Quelle für die Erzeugung von Xanthangummi gewesen. Jedoch besitzen diese Organismen geringe Temperaturoptima (27 bis 30ºC), geringe Wachstumsraten und sie sind obligat aerob, wobei all dies die Kosten für die Fermentation erhöht. Die Xanthanproduktion erhöht dramatisch die Viskosität des Fermentationsmediums, wodurch die Sauerstoffübertragungsrate erniedrigt wird, und die Verwendung einer teuren Belüftung, Kühl- und Schüttelausrüstung erforderlich wird, um die gewünschten Produktkonzentrationen zu erzielen.
Die vorliegenden Erfinder haben eine übertragbare DNA-Sequenz gefunden, die ein Gencluster codiert, das erforderlich ist für die Xanthanproduktion, und sie haben diese übertragbaren Sequenzen in Plasmidvektoren cloniert. Wenn sie in einem geeigneten Wirt, insbesondere einem denitrifizierenden Bakterium verwendet werden, verursachen diese Plasinidvektoren die Produktion von Xanthangummi gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren in einer ökonomischen und kommerziell machbaren Weise. Diese Technologie kann auch angewendet werden zum Herstellen von Varianten von Xanthangummi. Solche varianten Polysaccharide werden bekanntermaßen von Mutantenstämmen von X. campestris erzeugt, die Mutationen in der chromosomalen Kopie des Genclusters tragen, das für die Xanthanproduktion verantwortlich ist. Beispiele für diese varianten Gummis sind in der USSN-762,878 von Vanderslice et al. mit dem Titel "A Polysaccharide Polymer made by Xanthomonas", eingereicht am 06.08.1985, und der USSN-844,435 von Doherty et al. mit dem Titel "Family of Xanthanbased Polysaccharide Polymers including non-acetylated and/or non-pyruvylated Gum and acetylated and non-acetylated Polytetramer Gum", eingereicht am 26.03.1986, offenbart. Beide Patentanmeldungen werden hierin durch Bezugnahme eingeführt. Das Clonieren einer übertragbaren DNA-Sequenz, die eine solche Mutation enthält, in einem Plasmidvektor und der anschließende Transfer des rekombinanten Plasmids in ein geeignetes Bakterium führt zu der Synthese eines Polysaccharids durch das Bakterium, das äquivalent ist zu der speziellen Xanthangummi-Polysaccharidvariante, die von dem mutierten X. campestris-Stamm, der die Mutation in seinem Chromosom trägt, erzeugt wird.

Zusammenfassung der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zum Herstellen von Xanthangummi, in dem die Fermentation bei einer Temperatur von höher als 30ºC und/oder das unter anaeroben Bedingungen durchgeführt werden kann. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens unter Verwendung von rekombinanter DNA zur Herstellung eines Xanthangummis unter Verwendung von Mikroorganismen, die zur Polysacchariderzeugung fähig sind, und die vorzugsweise bei oder oberhalb von 30ºC und/oder unter anaeroben Bedingungen wachsen können. Die gemäß diesem Verfahren erzeugten Xanthangummis sind chemisch äquivalent zu dem, der von Xanthomonas campestris erzeugt wird. Weitere Polysaccharide, die durch Mutationen in verschiedenen biosynthetischen Genen erzeugt werden, können ebenfalls in alternativen Wirten erzeugt werden.
Um die durch die rekombinante DNA vermittelte Synthese dieser Polysaccharide zu ermöglichen, besteht eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, übertragbare DNA-Sequenzen bereitzustellen, die die Erzeugung von Polysacchariden steigern können. Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Vektoren bereitzustellen, die diese übertragbaren Sequenzen enthalten. Diese Vektoren können in rekombinanten Systemen verwendet werden, um kommerziell brauchbare Mengen an Xanthangummis oder anderen Polysacchariden bereitzustellen.
Weitere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in der folgenden Beschreibung ausgeführt und sind teilweise aus der Beschreibung ersichtlich, oder sie könne bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung erkannt werden. Die Aufgaben und Vorteile können realisiert und erzielt werden mit den in den angefügten Ansprüchen angegebenen Mitteln und Kombinationen davon.
Um die Aufgabe gemäß den Zwecken der vorliegenden Erfindung zu lösen, werden Verfahren zur Erzeugung von Xanthangummi erläutert, wobei diese Verfahren Mikroorganismen verwenden, die zur Polysacchariderzeugung fähig sind, vorzugsweise bei oder oberhalb von 30ºC und/oder unter anaeroben Bedingungen. Die nach diesen Verfahren erzeugten Polysaccharide sind gemäß einer Ausführungsform chemisch äquivalent zu solchen, die von Xanthomonas campestris erzeugt werden, und bei einer weiteren Ausführungsform sind sie chemisch äquivalent zu den varianten Gummis, offenbart von Vanderslice et al., siehe oben, und Doherty et al., siehe oben.
Die übertragbaren Sequenzen können entweder synthetische Sequenzen oder Restriktionsfragmente ("natürliche" DNA-Sequenzen) sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird eine übertragbare DNA-Sequenz aus einer X. campestris-Bank isoliert, und sie kann, falls sie in einen alternativen Wirt übertragen wird, die Erzeugung eines Xanthangummis steuern, der chemisch äquivalent ist zu dem, der von Xanthomonas campestris erzeugt wird.
Weiterhin wird zum Lösen der Aufgaben in Übereinstimmung mit den Zwecken der vorliegenden Erfindung ein rekombinantes DNA-Verfahren offenbart, das zu einer mikrobiellen Herstellung eines Xanthangummis und weiterer Polysaccharide unter Verwendung der übertragbaren DNA-Sequenzen führt, auf die oben Bezug genommen wurde. Dieses rekombinante DNA-Verfahren umfaßt:
a) Herstellen einer DNA-Sequenz, wie sie in dem Plasmid pRK290-H336, hinterlegt unter ATCC 67049 (in E. coli LE392), enthalten ist, oder von Varianten davon, die einen nicht-Xanthomonaswirt veranlassen können, ein Xanthanpolysaccharid oder eine Xanthanpolysaccharidvariante, die mit Xanthan strukturell verwandt ist, herzustellen;
b) Clonieren der DNA-Sequenz in mindestens einen Vektor, der in einen Wirtsmikroorganismus übertragen und darin repliziert werden kann, wobei dieser Vektor Elemente für die Expression der biosynthetischen Enzyme, die durch die DNA-Sequenz codiert werden, enthält;
c) Übertragen des Vektors, enthaltend die DNA-Sequenz, in einen Wirtsmikroorganismus, der Polysaccharid unter dem Einfluß der DNA-Sequenz erzeugen kann;
d) Kultivieren des Wirtsmikroorganismus unter geeigneten Bedingungen zum Beibehalten des Vektors und der Synthese des Polysaccharids; und
e) Ernten des Polysaccharids.
Bei einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform setzt sich die übertragbare DNA-Sequenz aus DNA-Sequenzen zusammen, die die Erzeugung der folgenden Enzyme steuern können: Transferase I, Transferase II, Transferase III, Transferase IV, Transferase V, Acetylat, Ketalase und Polymerase.
Diese Enzyme, die in der Xanthangummi-Biosynthese verwendet werden, sind in Fig. 1 dargestellt und ausführlicher unten beschrieben.
Zur weiteren Lösung der Aufgaben und in Übereinstimmung mit den Zwecken der vorliegenden Erfindung wird eine Reihe von Clonierungsvektoren bereitgestellt, von denen jeder mindestens eine der oben diskutierten übertragbaren DNA-Sequenzen enthält.
Insbesondere werden Plasmide pRK290-H336 und pX209 offenbart.
E. coli-Stämme LE392 (TX209), der das Plasmid pX209 trägt, und E. coli-Stamm LE392 (pRK290-11336), der das Plasmid pRK290-H336 trägt, sind bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, am 21.93.1986 unter der Hinterlegungs-Nr. 67051 bzw. 67049 hinterlegte worden.
Selbstverständlich sind die zuvor erwähnte allgemeine Beschreibung und die folgende ausführliche Beschreibung nur beispielhaft und nicht beschränkend für die beanspruchte Erfindung. Die beigefügten Zeichnungen, die hierin eingeführt sind und einen Teil der Beschreibung darstellen, erläutern verschiedene Ausführungsformen der Erfindung und dienen zusammen mit der Beschreibung dem Erläutern der Prinzipien der Erfindung.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt den biosynthetischen Reaktionsweg der Xanthangummisynthese in X. campestris.
Fig. 2 zeigt eine Restriktionskarte von Lambda 655(+).
Fig. 3 zeigt eine Restriktionskarte von Lambda 708(+).
Fig. 4 zeigt eine BamHI-Restriktionskarte der Region des X. campestri-Genoms, die das Gencluster für den Gummi enthält. Die Zahlen geben die molekulare Größe des Fragments in Kilobasen (kb) an.
Fig. 5a zeigt die allgemeine Struktur und die einschlägigen Restriktionsendonuklease-Spaltstellen des Clonierungsvektors pMW79.
Fig. 5b zeigt eine repräsentative, aber nicht ausschließliche, Ansammlung der Abschnitte der DNA der Gummi-codierenden Gene aus entweder partiellen oder vollständigen Verdaus von verschiedenen Lambda-Rekombinanten mit BamHI, wie in Beispiel 6 beschrieben, die in die BamHI-Stelle von pMW79 cloniert wurden.
Fig. 6 zeigt partielle Restriktionskarten von zwei rekombinanten X-Phagen (Lambda 708(8) und Lambda 655(B)), die in Beziehung zu der BamHI-Restriktionskarte der X. campestris-DNA in der Nähe des Gummi-Genclusters dargestellt sind. Die clonierten Abschnitte der Gummi- Gen-DNA, die in vier rekombinanten Plasmiden (px206, pX207, pX208 und pX209) enthalten sind, sind ebenfalls gezeigt. Aus Gründen der Einfachheit sind die pMW79-Vektorsequenzen dieser Plasmide nicht gezeigt, aber die Einzelheiten dieser Konstruktionen sind in Beispiel 6 gezeigt.
Fig. 7 zeigt die Positionen innerhalb der BamHI-Restriktionskarte der Gummi-Gencluster-DNA von 22 Insertionsmutationen. Offene Kreise bedeuten in vitro erzeugte Insertionen des BglII-Tetr-Fragments von Tn10, während ausgefüllte Kreise in vivo erhaltene Tn10-Insertionen darstellen. Die phänotypische Klassifikation von Mutanten, die diese Insertionen tragen, wie in Beispiel 2 beschrieben, sind unten gezeigt.
Fig. 8 zeigt innerhalb der BamHI-Restriktionskarte die Lage eines Satzes von sechs repräsentativen Mutationen in dem Gummi-Gencluster. Stämme X925, X928, X975, X1008 und X655 tragen Insertionsmutationen von Tn10 oder das BglII-Tetr-Fragment von Tn10 in den angegebenen Positionen. Stamm X974 trägt eine Deletion des 1,35 kb BamHI-Fragments und eine Substitution des BglII-Tetr-Fragments in dieser Position. Unter der Restriktionskarte sind repräsentative Plasmide gezeigt, die in Komplementierungsexperimenten mit den obigen Mutanten verwendet wurden. Aus Gründen der Einfachheit sind nur clonierte X. campestris-Sequenzen gezeigt. Die pMW79-Vektorsequenzen sind nicht dargestellt. Ein Pluszeichen (+) zeigt die erfolgreiche Komplementierung der Mutante durch das Plasmid an, während ein Minuszeichen (-) das Ausbleiben der Komplementierung angibt. Einzelheiten der Experimente und deren Interpretationen sind in Beispiel 8 gegeben.
Fig. 9 zeigt eine partielle Restriktionskarte des Plasmids pRK290 und verschiedene Abschnitte von DNA, die aus dem rekombinanten Lambda-Phagen 655 (L') herauscloniert und in die BglII-Stelle von pRK290, wie in Beispiel 10 erläutert, cloniert wurden.
Fig. 10 besteht aus der Nukleotidsequenz eines 16080-Basenpaarabschnitts von Xanthomonas campestris-DNA, die ein Gencluster enthält, das die Xanthanbiosynthese steuert.
Fig. 11 zeigt einen Überblick über die Organisation und Struktur der Gene, die in dem 16 kb-Abschnitt der DNA enthalten sind. Die obere Linie in der Figur ist eine BamHI-Restriktionskarte und zeigt die Lage einer jeden BamHI-Restriktionsstelle in der Sequenz an. Die Linie, die oberhalb der Kurven der Rasteranalyse gezeigt ist, zeigt die ungefähre Position von einigen der Mutationen, die isoliert und charakterisiert worden sind. Die dargestellten Kurven der Rasteranalyse zeigen die Verteilung des G+C-Gehalts an der ersten (blaue Linie), zweiten (rote Linie) und dritten (schwarze Linie) Nukleotidposition. Es ist zu beachten, daß die Verteilung des G+C-Gehalts an den drei Nukleotiden nicht zufällig ist über die vollständige Sequenz, wobei dies darauf hindeutet, daß praktisch die gesamte DNA für Proteinprodukte codiert. Das Leseraster eines jeden Proteins wird definiert durch die Nukleotidposition mit einem Zwischenwert innerhalb jeder Region der nicht-zufälligen G+C-Verteilung. Der Punkt, an dem sich die G+C-Verteilung bei den drei Nukleotidpositionen ändert, sagt entweder den Anfang oder das Ende eines Gens, oder das Ende eines Gens und den Anfang des nächsten vorher. In jedem Fall wurde gefunden, daß diese Punkte mit der Anwesenheit eines Start- oder Stoppkodons in dem entsprechenden Leseraster korrelieren.
Unterhalb der Kurven der Rasteranalyse sind verschiedene Pfeile eingezeichnet, um die Lage und das Ausmaß eines jeden Gens in der Sequenz anzuzeigen. Aus Gründen der Einfachheit bezeichnen wir jedes Gen mit einem Buchstaben und verwenden diesen Buchstaben mit dem vorangestellten "gp", um sein Proteinprodukt zu bezeichnen. Über jedem Pfeil ist das Molekulargewicht des Proteinprodukts in kD gezeigt. Unter jedem Pfeil ist der Name eines jeden Genprodukts gezeigt in Form seines sich aus den Buchstaben zusammensetzenden Namen wie auch als funktioneller Name für diejenigen Fälle, in denen die Genfunktion aus dem mutierten Phänotyp abgeleitet werden konnte.
Fig. 13 zeigt mögliche Sekundärstrukturen der vermuteten Transkriptionsterminatoren, die innerhalb der DNA-Sequenz um die Positionen 900, 3400 und 12400 identifiziert wurden.
Fig. 14 zeigt die gefaltete Sekundärstruktur der Prolin-tRNA, die in der DNA-Sequenz zwischen Positionen 732 bis 808 identifiziert wurde.
Fig. 15a zeigt die Lagen von verschiedenen TnK12-Insertionsmutationen innerhalb der clonierten X. campestris-DNA, die in dem rekombinanten Plasmid pRK290-H336 enthalten ist.
Fig. 15b zeigt das Ausmaß der DNA, die von dem X. campestris-Chromosom in einer Reihe von Deletionsmutanten deletiert wurde. Die deletierte DNA wird durch schraffierte Rechtecke angegeben.
Fig. 16a zeigt die Positionen von in vitro erzeugten Kanr Insertions- und Deletionsmutationen in dem Plasmid pRK290-HA3.
Fig. 16b zeigt die Positionen von sieben in vitro erzeugten Kanr-Inserationsmutationen in dem Plasmid pRK290-H336.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die gegenwärtigen Erfinder nehmen an, daß die Biosynthese von Xanthangummi in Xanthomonas campestris nach dem in Fig. 1 gezeigten Reaktionsweg abläuft. Diese Figur zeigt den Aufbau der sich wiederholenden Pentasaccharid (5 Zucker)-Einheit des Xanthangmmmis, die an ein Isoprenoidlipid-"Träger"-Molekül geknüpft ist. Der Aufbau des gezeigten Pentasaccharids erfolgt durch sequentielle Addition, in einer spezifischen und definierten Reihenfolge, der fünf einzelnen Zuckerkomponenten, die in der sich wiederholenden Pentasaccharideinheit vorkommen. Jede einzelne Zuckeraddition wird von einer spezifischen enzymatischen Aktivität katalysiert, die für den speziellen Schritt spezifisch ist. Die Zucker werden durch spezifische Zuckernukleotide bereitgestellt. Die enzymatischen Aktivitäten werden hierin als "Transferasen" bezeichnet. Die einzelnen enzymatischen Aktivitäten werden weiterhin durch römische Zahlen I bis V bezeichnet, die den Schritt in der sequentiell geordneten Abfolge von Zuckeradditionen angeben, die jede Transferaseaktivität katalysiert.
Von den zwei Mannosezuckerkomponenten, die in dem reifen Xanthan und in der Pentasaccharidvorläufereinheit vorliegen, ist bekannt, daß sie modifiziert werden. Von der Mannosekomponente, die bei Schritt 3 durch die Aktivität der Transferase III angefügt wird, ist bekannt, daß sie acetyliert ist. Von der Fraktion dieser Komponente, die in der acetylierten Form in reifem Xanthangummi vorliegt, ist beobachtet worden, daß sie variabel ist. Eine enzymatische Aktivität, hier Acetylase genannt, katalysiert die Addition der Acetylgruppe an die Mannose, obwohl der genaue Punkt in der Abfolge des biosynthetischen Reaktionsweges, an dem die Acetylase wirkt, gegenwärtig unbekannt ist. Ähnlich ist von der Mannosezuckerkomponente, die von der Transferase v in: Schritt V angeheftet wird, bekannt, daß sie pyruvyliert ist. Eine enzymatische Aktivität, hier Ketalase genannt, katalysiert die Addition der Pyruvatgruppe. Wiederum ist von dieser Fraktion, die die Mannosekomponenten enthält, die in reifem Xanthangummi pyruvyliert sind, bekannt, daß sie variabel ist, und der Punkt innerhalb des biosynthetischen Reaktionswegs, an dem die Ketalase wirkt, ist gegenwärtig unbekannt.
Die Pentasaccharidvorläufereinheiten werden in einer anschließenden enzymatischen Reaktion polymerisiert, die von einer Aktivität katalysiert wird, die hier als "Polymerase" bezeichnet wird. Die Polymerasereaktivität katalysiert die Freisetzung einer Pentasacchariduntereinheit von seinem angehefteten Isoprenoidlipidträgermolekül und die abgestimmte Anheftung dieser Pentasaccharideinheit an ein mit einem Lipid verknüpftes Pentasaccharid, Decasaccharid, oder einer Anordnung höherer Ordnung des Pentasaccharidbasisrepeats, mit der daraus folgenden Zunahme in dem Grad der Polymerisation des im Entstehen begriffenen Xanthanempfängermoleküls.
Wie in den ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldungen von Vanderslice et al. und Doherty et al., siehe oben, die beide hierin durch Bezugnahme eingeführt werden, sind andere Polysaccharide aufgefunden worden, die als "Varianten" von Xanthan beschrieben werden können. Diese umfassen das "Polytrimer" von Vanderslice et al. sowohl in seinen acetylierten und nichtacetylierten Formen, wie auch das "Polytetramer" in acetylierter und nicht-acetylierter Form, und nicht-acetylierte, nichtpyruvylierte, oder nicht-acetylierte und nicht-pyruvylierte pentamere Xanthangummis von Doherty et al. Es ist aus der zuvor erwähnten Beschreibung der Enzyme, die in dem Xanthanreaktionsweg aufgefunden wurden, und aus der folgenden Beschreibung der neu aufgefundenen Mutantenorganismen ersichtlich, daß die Materialien, die notwendig sind für die rekombinante, DNA-vermittelte Erzeugung dieser varianten Gummis hierin inhärent beschrieben sind. Zum Beispiel kann ein Polytetramer in einem rekombinanten DNA-System synthetisiert werden, das nicht die DNA-Sequenz, die die Transferase V codiert, umfaßt, während einem Plasmid, das das nicht-acetylierte Polytetramer synthetisiert, beide Gene fehlen würden, die Transferase V und Acetylase codieren.
Eine Mutation von Xanthomonas campestris ist identifiziert worden, die spezifisch die Aktivität der Transferase IV inaktivierte. Ein Stamm, der diese Mutation trägt, X655, ist von Vanderslice et al. beschrieben worden und bei der American Type Culture Collection (ATCC) in Rockville, Maryland, unter der Hinterlegungs-Nr. 53195 hinterlegt worden. Die Identifizierung dieses spezifischen Defekts in diesem X. campestris-Mutantenstamm X655 führte zu der Clonierung der chromosomalen DNA-Sequenzen von X. campestris aus der Region des Chromosoms, in der die Stelle der Mutation in Stamm X655 lokalisiert worden war. Mutagenese und analytische Technologie wurde eingesetzt, wie unten in den Beispielen 1, 2 und 7 beschrieben, um die phänotypischen Eigenschaften von Mutationen in DNA-Sequenzen nahe der Stelle der X655-Mutation zu induzieren und analysieren. Als Grundlage der vorliegenden Erfindung wird angenommen, daß Gene, die andere Transferaseaktivitäten codieren, in der Nähe des Gens gehäuft vorkommen, das in Stamm X655 als dasjenige identifiziert wurde, das einen notwendigen Bestandteil der Aktivität von Transferase IV codiert, da das gehäufte Auftreten (clustering) von Genen des metabolischen Reaktionsweges in Bakterien bekannt ist.
Das Wissen über den Transferase IV-Defekt in Stamm X655 wurde zum Clonieren und genetischen und physikalischen Analysieren eines großen Abschnitts (35 kb) von X. campestris chromosomaler DNA verwendet, die die Stelle der Mutation überspannt, die den Transferase IV-Defekt in Stamm X655 verursacht. Zahlreiche Mutationen innerhalb dieser DNA wurden induziert und charakterisiert. Die Analysen der genetischen Lokalisation dieser Mutationen und der Phänotypen der Mutantenstämme, die diese Mutationen tragen (Beispiel 2, 4 und 7), stellte einen direkten Hinweis dar, daß diese DNA-Sequenz in dem X. campestris-Chromosom und als übertragbares DNA-Segment auf einem übertragbaren Plasmidvektor Gene enthielt, die Proteine codieren, die für die Aktivitäten von Transferasen I, II, III und IV, Acetylase und Ketalase erforderlich sind. Diese Daten führten zu der Schlußfolgerung, daß die übertragbaren DNA-Segmente, die in Plasmiden pRK290-H336 und pX209 cloniert waren, Gene enthalten, die Proteine codieren, die für die Aktivitäten von Transferase I bis V, Acetylase, Ketalase, Polymerase und möglicherweise für weitere, bisher nicht-charakterisierte Aktivitäten, die für die Xanthanbiosynthese notwendig oder fit dieser verwandt sind, erforderlich sind. Übertragen dieser Plasmidvektoren, enthaltend diese "Gencluster" für die Xanthanbiosynthese als übertragbare DNA-Sequenz, in andere Bakterien als Xanthomonas campestris könnte somit verwendet werden zum Verringern der Kosten der Erzeugung von Xanthangummi durch Verändern der Bedingungen der Fermentation.
Bis zum heutigen Tage sind Xanthomonas campestris und verwandte Xanthomonasarten die einzige verfügbare mikrobiologische Quelle für die Erzeugung von Xanthangummi gewesen. Jedoch besitzen diese Organismen niedrige Temperaturoptima (27 bis 30ºC), langsame Wachstumsraten und sind obligat aerob, wobei all dies die Kosten der Fermentation erhöht. Weiterhin erfordern die bestehenden aeroben Fermentationstechniken ein Fermentationsmedium mit niedriger Viskosität, um dem Medium zu ermöglichen, eine hohe Sauerstofftransferrate zu besitzen. Da jedoch Xanthan ein Exopolysaccharid ist, steigert die Xanthanproduktion drastisch die Viskosität des Fermentationsmediums, wodurch die Sauerstofftransferrate erniedrigt wird, und die Verwendung einer teuren Belüftung, Schüttel- und Kühlvorrichtung erforderlich wird, um die gewünschten Produktkonzentrationen zu erzielen.
Es ist von den gegenwärtigen Erfindern vorgeschlagen worden, daß denitrifizierende Bakterien, die höhere Temperaturoptima und größere Wachstumsraten besitzen können, und die die Fähigkeit besitzen, anaerob zu wachsen, falls sie mit einer geeigneten Stickstoffquelle ausgestattet werden, mit den übertragbaren DNA-Sequenzen, die die Erzeugung von Xanthangummi steuern können, transformiert werden könnten. Die Erzeugung von Xanthan in diesen Organismen wird weniger teuer sein als in der gegenwärtigen Art, die verwendet wird. Weiterhin haben die gegenwärtigen Erfinder eine übertragbare DNA-Sequenz gefunden, die das Gencluster codiert, das für die Xanthanerzeugung verantwortlich ist, und sie haben Plasmidvektoren, die diese übertragbaren Sequenzen enthalten, gefunden. Wenn sie in einem geeigneten Wirt, insbesondere in einem denitrifizierenden Bakterium, verwendet werden, veranlassen diese Plasmide die Erzeugung von Xanthangummi gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren auf eine ökonomische und kommerziell machbare Weise. Weiterhin kommen auch bakterielle Wirte mit nur einigen der vorgeschlagenen Eigenschaften als alternative Wirte für die Erzeugung in Frage.
Die Gene, die verantwortlich sind für die Umwandlung von Xanthanvorläufern (UDP-Glukose, UDP-Glukuronsäure, GDP-Mannose, Acetyl-CoA und Phosphoenolpyruvat) zu Xanthan sind in dem X. campestris-Genom in einem Cluster angeordnet und sind cloniert worden. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden diese Gene in geeignete alternative Wirte eingeführt und die Gummibiosynthese wird gemessen. Korrigierende Schritte werden erläutert für den Fall, daß die alternativen Wirte mit dem vorliegenden biosynthetischen Cluster kein Xanthangummi synthetisieren.
Weitere erfindungsgemäße Ausführungsformen kommen in Betracht, bei denen andere bekannte oder gegenwärtig unbekannte Vektoren verwendet werden, die eines oder mehrere der hierin beschriebenen übertragbaren DNA-Sequenzen enthalten können. Insbesondere ist es bevorzugt, daß diese Vektoren einige oder sämtliche der folgenden Eigenschaften aufweisen:
(1) Sie sind stabil in dem gewünschten Wirt;
(2) sie können in einer geeigneten Kopienzahl in dem gewünschten Wirt vorliegen;
(3) sie besitzen einen regulierbaren Promotor; und
(4) sie besitzen mindestens eine DNA-Sequenz, die für eine selektierbare Eigenschaft codiert, die auf einem Teil des Plasmids getrennt von dem Bereich, in dem die überragbare DNA-Sequenz eingefügt werden wird, vorliegt.
Die folgende, nicht-abschließende Liste an bakteriellen Wirten und Plasmidvektoren erläutert Kombinationen, die leicht verändert werden können, um die obigen Kriterien zu erfüllen, und sie sind deshalb zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt (Tabelle I). Solche Abwandlungen können leicht vom Fachmann im Licht der verfügbaren Literatur und der hierin gegebenen Lehren durchgeführt werden. Tabelle I Wirtsvektoren Bemerkungen Pseudomonas P. Aeruginosa P. Putida Einige Vektoren sind in einem breiten Wirtebereich von gramnegativen Bakterien, einschließlich Xanthomonas und Agrobakterium, brauchbar Clostridium Shuttleplasmide für E. coli und C. Perfringens C. perfrigens-Konstruktion, Referenz Squires Journal Bacteriol
Das große Cluster an biosynthetischen Gummi-Genen ist in einem Plasmid cloniert worden, das einen DNA-Replikationsursprung mit weitem Wirtebereich enthält, das in eine große Anzahl an gramnegativen Bakterienarten übertragen und beibehalten werden kann, einschließlich X. campeszris und X. campestris-Stamm X1107, der eine Deletion sämtlicher der bekannten biosynthetischen Gummi-Gene enthält. Plasmid pRK290-H336 wandelt X1107 in einen Xanthan-erzeugenden Stamm durch Komplementierung um.
Wenn ein Plasmid wie pRK290-H336 in einen alternativen Wirt eingeführt wird, müssen viele Schritte in geeigneter Weise erfolgen, damit die Xanthanbiosynthese erfolgt. Zuerst müssen die Gene, die die biosynthetischen Enzyme codieren, transkribiert und translatiert werden, damit funktionelle biosynthetische Enzyme bei einem angemessenen Spiegel erzeugt werden. Zweitens, die alternativen Wirte müssen ausreichende biosynthetische Kapazitäten für Acetyl-CoA, Phosphoenolpyruvat, UDP-Glukose, UDP-Glukuronsäure und GDP-Mannose besitzen, so daß die biosynthetischen Enzyme solche Vorläufer zu Xanthangummi polymerisieren können. Drittens, die durch das Cluster codierten, biosynthetischen Enzyme müssen aggregieren, falls ein solcher Multiproteinkomplex die funktionelle biosynthetische Einheit darstellt. Viertens, die Architektur dieses Komplexes (oder der einzelnen Enzyme) muß eine gerichtete Polysaccharidbiosynthese bereitstellen, so daß das Xanthan in das Kulturmedium ausgeschieden wird.
Die Fähigkeiten eines Fachmanns auf dem Gebiet der Genetik, Molekularbiologie, Biochemie, Fermentationstechnik, mikrobiellen Physiologie und rekombinanten DNA-Technologie macht die zielstrebige und naheliegende Isolierung eines alternativen Wirts wahrscheinlich, der die biosynthetischen Xanthangene exprimiert, und der extrazellulären Xanthangummi erzeugen kann.

Beispiele

Beispiel 1

Dieses Beispiel zeigt ein Verfahren zur Mutagenese und das Screeningverfahren, die angewendet wurden, um die Mutantenstämme zu erzeugen, die keinen Xanthangummi erzeugen können.
B1459 S4-L wurde von den Northern Regional Research Laboratories des US-Departments of Agriculture erhalten. Er wurde genetisch mit einer chromosomalen Resistenz gegen Streptomycin markiert und wurde als Empfänger in einer Konjugation mit E. coli LE392, enthaltend das Plasmid pRK2013::Tn10, verwendet. Plasmid pRK2013 enthält Tn903, das eine Kanamycinresistenz codiert, wie beschrieben von Figurski, D.H., und Helinski, D.R., in Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76: 1648-1652 (1979), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird. Das Plasmid kann nicht in X. campestris replizieren. Das Transposon Tn10 codiert eine Resistenz gegen Tetracyclin. Transkonjugierte Stämme wurden ausgewählt, die resistent gegen Streptomycin und Kanamycin oder Streptomycin und Tetracyclin waren. Erstere traten in einer Häufigkeit von ungefähr 4 · 10&supmin;&sup6; pro Empfänger auf und resultieren vermutlich aus einer Transposition von Tn903. Letztere traten mit einer Häufigkeit von ungefähr 3 · 10&supmin;&sup6; pro Empfänger auf und resultieren vermutlich aus einer Transposition von Tn10 in das Genom von Xanthomonas campestris.
Auxotrophe wurden unter diesen transkonjugierten Stämmen mit einer Häufigkeit von ungefähr 2% gefunden; ihre Bedürfnisse streuten stark unter den verschiedenen Anforderungen an die Ernährung. Dies zeigt an, daß diese Transposons keinen besonders bevorzugten Locus für die Insertion in X. campestris besitzen. Prototrophe Revertanten dieser Auxotrophen wurden selektiert und von den meisten wurde gefunden, daß sie Wirkstoff-sensitiv sind; dies legt nahe, daß die Auxotrophie durch Transposoninsertion hervorgerufen wurde.
Zum Screenen nach Xanthangummi-Mangelmutanten unter den doppelt resistenten, transkonjugierten Stämmen wurde der Farbstoff Congorot (200 µg/ml), der die morphologische Unterscheidung zwischen Xanthangummi erzeugenden und unproduktiven Kolonien verstärkt, den festen Medien zugesetzt. Die Koloniemorphologie wurde nach 7 bis 12 Tagen Inkubation bei 30ºC untersucht. Xanthangummi-Mangelmutanten wurden mit einer Häufigkeit von ungefähr 10&supmin;&sup4; gefunden. Von nun an werden Stämme, die Xanthan in vivo nicht herstellen; können, Gum&supmin;-Stämme genannt, und solche, die durch eine Insertion von Tn10 entstanden sind, ebenfalls Gum&supmin;-Stämme, können zusätzlich als Gum::Tn10-Mutanten bezeichnet werden.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt die biochemischen Phänotypen der Gum&supmin;-Mutantenstämme und die Verfahren, die zum Ermitteln der Phänotypen verwendet wurden.
Das grundlegende Verfahren, das die Verwendung eines zellfreien Systems zum Untersuchen des biosynthetischen Reaktionsweges von Xanthangummi betrifft, ist beschrieben von Ielpi, L., Couso, R.O., und Dankert, M.A., in FEBS Letters 130: 253-256 (1981), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird. Es ist gefunden worden, daß eine modifizierte Version dieses Verfahrens verwendet werden kann, um die hierin beschriebenen Gum&supmin;-Isolate zu analysieren. Für dieses neue Verfahren wird das zellfreie in vitro-System im allgemeinen hergestellt durch Lysieren von Zellen eines Mikroorganismus, vorzugsweise von Xanthomonas campestris, in der Anwesenheit eines geeigneten Puffers, vorzugsweise enthaltend EDTA, und Erhalten der geeigneten biosynthetischen Enzyme, die in der Lage sind, sukzessive exogen zugesetzte Substrate zu verarbeiten. Alternative Mittel zur Lysis können verwendet werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Beschallung, Detergensbehandlung, Enzymbehandlung und Kombinationen davon.
Im allgemeinen wird zum Bestimmen der defekten Stufe in dem biosynthetischen Reaktionsweg einer Gum&supmin;-Mutante ein Lysat dieses Mikroorganismus mit den geeigneten Substraten inkubiert, die UDP-Glukose, GDP-Mannose, UDP-Glukuronsäure, Acetyl-CoA und Phosphoenolpyruvat umfassen. Die Wahl der Substrate ist abhängig von der Stufe, die analysiert werden soll. Der biosynthetische Vorgang kann bei einer Ausführungsform registriert werden durch den Einbau von radiomarkierten Substraten in die Polymereinheiten. Andere Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, können ebenfalls verwendet werden zum Identifizieren der biosynthetischen Zwischenprodukte. Insbesondere sind chromatographische Verfahren entwickelt worden, um die Oligo-Saccharidzwischenprodukte nach der Hydrolyse von den Lipidträgern zu trennen und zu identifizieren. Diese umfassen Dünnschichtchromatographie (TLC) und hochauflösende Flüssigkeitschromatographie (HPLC).
Von der zellfreien Biosynthese von Xanthan ist gefunden worden, daß sie ein zeitabhängiger, sequentieller Vorgang ist, der abhängig ist von dem Zusatz sämtlicher drei Spezifischer Zuckernukleotide. Der Hintergrund an unspezifischem Einbau von markierten Substraten ist minimal und beeinträchtigt den Nachweis der Xanthan-spezifischen Zwischenprodukte oder des Xanthanpolymers in der Gummifraktion nicht.
Die Beteiligung von Lipidträgern, insbesondere C55-Isoprenoidpyrophosphat, ist in mehreren biosynthetischen Polysaccharidreaktionswegen gezeigt worden. Weiterhin ist die Beteiligung eines Pyrophosphoryl-verknüpften Lipidträgers an der Xanthanbiosynthese aufgezeigt und bestätigt worden. Somit ist von den Xanthanbiosynthesezwischenprodukten, zumindest bis zu dem Pentasaccharid, gefunden worden, daß sie in der organischen löslichen Fraktion mit diesen Trägerlipiden wiedergewonnen werden können.
Unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren zur Gewinnung der Zwischenprodukte ist gefunden worden, daß X. campestris-Mutantenlysate unter in vitro-Bedingungen angehäufte Zwischenprodukte und neue verkürzte Formen von Xanthangummi erzeugen, selbst in der Anwesenheit sämtlicher Substrate, die für die normale Xanthanbiosynthese erforderlich sind. Die Spezifischen Blockierungsstellen zeigen an, welche Speziellen Enzymaktivitäten fehlen. Gum&supmin;-Stämme wurden analysiert und biochemischen Phänotypen zugewiesen. Diese biochemischen Phänotypen erlauben das Identifizieren der Genotypen der Mutanten-Stämme. Zum Beispiel wird von einem Mutantenstamm, der Cellobiose auf dem Lipidträger in vitro akkumuliert, angenommen, daß er einen Defekt in dem Gen für Transferase III besitzt.
Wenn das Lysat einer Gum&supmin;-Mutante normalen Xanthangummi erzeugt, wenn sie mit sämtlichen Substraten versorgt wird, schließt man daraus, daß sämtliche Enzyme in dem biosynthetischen Reaktionsweg normal vorliegen. Somit ist die Unfähigkeit, Gummi in vivo zu erzeugen, ein Ergebnis der Abwesenheit eines der erforderlichen Substrate. Es wurde eine Klasse an Gum&supmin;-Mutanten gefunden, die Gummi in vitro nur erzeugen können, wenn die Substrate bereitgestellt werden. Diese Gum&supmin;-Mutanten werden ausführlicher diskutiert in USSN-843 349 von Betlach et al., mit dem Titel "Verfahren für die Synthese von Zuckernukleotiden unter Verwendung von rekombinanten DNA-Verfahren", eingereicht am 24.03.1986. Sämtliche dieser Mutanten trugen Mutationen außerhalb des Gummi-Clusters.
Spezifische Verfahren für diese zellfreien Untersuchungen werden hierin beschrieben. Die Gum -Derivate wurden in YM (Hefe-Malz-Medium), ergänzt mit 2% (Gew./Vol.) Glukose, kultiviert, wie beschrieben von Jeanes, A., et al., (US-Department of Agriculture, ARS-NC-51, Seite 14 ff. (1976)), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird. Die Kulturen wurden bis zur Späten log-Phase bei 30ºC bei 300 Upm kultiviert. Die Zellen wurden in einem bestimmten Titer auf YM plus 2% (Gew./Vol.) Glukoseplatten bei 30ºC gegeben. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und mit kaltem Tris-HCl, 70 mM, pH 8,2, gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden in Tris-HCl, 70 mM, pH 8,2, mit 10 mM EDTA resuspendiert und dreimal eingefroren und aufgetaut nach einem Verfahren ähnlich zu dem von Garcia, R.C., et al., (European Journal of Biochemistry, 43: 93-105 (1974)), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird. Dieses Verfahren brach die Zellen auf, wie durch die gesteigerte Viskosität der Suspension und den Vollständigen Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen (eine in 10&sup6; Überlebende) nach dieser Behandlung angezeigt wurde. Die durch Einfrieren und Auftauen behandelten Lysate wurden in Aliquots bei -80ºC eingefroren. Die Proteinkonzentration wurde mit einem BIO RAD-Assay (BIO RAD Laboratories, Richmond, Kalifornien) ermittelt, und sie betrug 5 bis 7 mg Zellprotein pro ml des Lysats.
Wie von Ielpi, L., Couso, R.O. und Dankert, N.A., siehe oben, beschrieben, wurde ein Aliquot des eingefrorenen und aufgetauten Lysats (äquivalent zu 300 bis 400 µg Protein), DNAase I (10 µg/ml) und MgCl (8 mM) bei 20ºC für 20 Minuten vorinkubiert. Ein gleiches Volumen an 70 mM Tris-HCl, pH 8,2, mit den gewünschten radiomarkierten Zuckernukleotiden (UDP-Glukose und GDP-Mannose) mit oder ohne UDP-Glukuronsäure, wurden zugesetzt und bei 20ºC inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden die Reaktionen durch den Zusatz von EDTA auf 4 mM gestoppt. Die Proben wurden zentrifugiert; die Pellets wurden zweimal mit Puffer gewaschen. Um die Analyse der Gummifraktionen zu ermöglichen, wurden die Überstände vereinigt, Trägerxanthan (100 µg) wurde zugesetzt, und das Xanthan plus synthetisiertes Polymer wurden mit Ethanol (60%)-KCl (0,8%) präzipitiert. Das präzipitierte Polymer wurde in Wasser resuspendiert und zwei weitere Male erneut präzipitiert, um nicht-eingebaute Markierung zu entfernen. Die in die Gummifraktion eingebaute Radioaktivität wurde in einem Flüssigszintillationszähler bestimmt, und die Daten wurden verarbeitet, um den Einbau in Picomolen zu erhalten.
Um die Analyse der mit dem Lipidträger verknüpften Zwischenprodukte zu ermöglichen, wurde das gewaschene Pellet zweimal mit Chloroform:Methanol:Wasser (1 : 2 : 0,3) extrahiert. Die lipidverknüpften biosynthetischen Zwischenprodukte wurden in die freien Oligosaccharide durch milde Säurehydrolyse (pH 2, 90ºC, 20 Min.) und alkalische Phosphatasebehandlung (alkalische Rinderphosphatase, 50 mM MgCl und 10 mM Glycinpuffer, pH 9,8 bei 37ºC über Nacht) umgewandelt. Die Proben wurden erneut extrahiert mit Chloroform:Methanol (2 : 1) und zentrifugiert. Die wäßrige Phase wurde entfernt und das Volumen im Vakuum für die Analyse durch Dünnschichtchromatographie verringert.
Die Dünnschichtchromatographie wurde auf Silikagel (Baker 250 µm, vorgeformte Spuren) mit Butanol:Dioxan:Wasser (35 : 50 : 20) unter Verwendung von drei Entwicklungen durchgeführt. Die mit Kohlenstoff-14 markierten Verbindungen wurden durch Autoradiographie bei -80ºC unter Verwendung des Kodak X-Omat AR-Films mit einer Standardentwicklung nachgewiesen. Die Zuckerstandards wurden mit Anilindiphenylamin (1,8% Anilin und 1,8% Diphenylamin in angesäuertem Aceton, erhalten von Sigma Chemical Co.) sichtbar gemacht. Die Mobilität der biosynthetischen Xanthanzwischenprodukte wurde mit der Mobilität der Zuckerstandards verglichen. Für radiometrische Analyse von doppelt-markierten Oligosacchariden wurde Silikagel, das nicht mit beeinträchtigenden Sprays behandelt worden war, abgekratzt, eluiert und mit einem Budget-solve Aqueous Counting Cocktail (RPI) in Plastikgefäßen in einem Beckman LS-7500 Szintillationszähler unter Verwendung der Autoquenchkompensation ausgezählt. Die Szintillationsdaten wurden verarbeitet, um die absolute Menge an [³H]-markierten und [¹&sup4;C]-markierten Materialien zu erhalten, um die Berechnung der molaren Verhältnisse der Zucker in den Verbindungen zu ermöglichen.
Die in vitro analysierten Gum&supmin;-Stämme wurden auf mehreren Wegen untersucht:
(1) radiomarkierte UDP-Glukose alleine, um die Beladung des Trägerlipids mit Glukose oder Cellobiose abzuschätzen,
(2) unmarkierte UDP-Glukuronsäure und doppelt-markierte UDP-Glukose und GDP-Mannose, um das molare Verhältnis von Glukose und Mannose zu bestimmen, und
(3) unmarkierte UDP-Glukose und doppelt-markierte GDP-Mannose und UDP-Glukuronsäure, um das molare Verhältnis von Mannose und Glukuronsäure in den Zwischenprodukten der Gummifraktion zu vergleichen.
Mutanten, von denen angenommen wurde, daß sie Defekte bei der Acetylierung und Pyruvylierung aufweisen, wurden auf ihre Fähigkeit, radiomarkierten Acetyl-CoA und Phosphoenolpyruvat einzubauen, untersucht nach dem Verfahren von Ielpi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm 102: 1400-1408 (1981) und Ielpi et al., Biochem. Intern. 6: 323-333 (1983), die beide hierin durch Bezugnahme eingeführt werden.
Die Stämme gehörten zu zwei wesentlichen Phänotypen. Eine Gruppe besaß einen Defekt in der Gummisynthese in vivo und in vitro. Sämtliche dieser Mutanten besaßen mutierende Insertionen in dem Gummi-DNA-Cluster. Die andere Gruppe, obwohl sie kein Polysaccharid in vivo synthetisieren konnte, konnte Xanthangummi in vitro synthetisieren, wenn die Substrate bereitgestellt wurden. Sämtliche dieser Mutanten besaßen mutierende Insertionen in DNA, die nicht mit dem Gummi-Cluster in Verbindung stand. Diese Mutanten wurden auf die Anwesenheit der Zuckernukleotide hin untersucht, und es wurde festgestellt, daß sie in verschiedenen Schritten der Biosynthese der Zuckernukleotide Defekte aufweisen.
Die Mutanten mit den Blockaden in dem biosynthetischen Reaktionsweg für Gummi gehörten zu verschiedenen Arten. Die möglichen biochemischen Phänotypen und unsere Beobachtungen werden hier und in Fig. 7 erläutert, worin die Kartenpositionen für einige Mutationen, die diese speziellen Phänotypen hervorrufen, gezeigt sind.

Transferase I- und unbekannte Defekte

Viele Mutantenlysate zeigten einen schlechten Einbau von radioaktiver Markierung in die organische Fraktion, wobei eine kleine Menge an Glukose der einzige Zucker war, der oberhalb des Hintergrunds nachgewiesen wurde. Es wurde kein polymeres Material in der Gummifraktion nachgewiesen. Die kleine Menge an Glukose ist durch TLC und/oder HPLC nachgewiesen worden. Es gibt verschiedene Erklärungsmöglichkeiten für diesen Phänotyp. Der beobachtete Spiegel an Glukose in dieser Klasse ist ähnlich zu der nicht-Xanthan-spezifischen oder "nicht-chasebaren" Glukose, wie beobachtet wird für S4-L, wenn sämtliche drei Zuckernukleotide vorhanden sind. Dieser Phänotyp kann das Ergebnis eines Transferase I-Defekts sein, der die Beladung des Lipidträgers mit Glukose nicht erlauben würde. Alternativ kann er aus einem Defekt eines anderen Gens stammen, das die Initiation der Biosynthese beeinflußt, wobei dies direkt oder indirekt die Expression der Transferase I betrifft.

Transferase II

Zwei Mutantenlysate, die eine signifikante Akkumulation von Glukose auf dem Lipidträger zeigten, wurden beobachtet. Die Glukose wurde nicht zu Cellobiose auf dem Lipidträger polymerisiert. Diese Lysate wurden von der Anwesenheit von GDP-Mannose und UDP-Glukuronsäure nicht beeinflußt. Es wurde kein radiomarkiertes Material in der Gummifraktion gefunden. Von diesem Defekt wird angenommen, daß er in dem Gen für Transferase II vorliegt.

Transferase III

Die radiometrische Analyse der zellfreien biosynthetischen Reaktionsmischungen aus einigen Lysaten zeigte, daß die organische Fraktion in der Anwesenheit von UDP[¹&sup4;C]Glukose gut beladen wird (37% des S4-L-Spiegels) In der Anwesenheit sämtlicher drei Zuckernukleotide war die Beladung mit Glukose bei gleich-hohem Spiegel, aber es gab keinen Einbau von Mannose oder Glukuronat. Die Gummifraktion zeigte, daß kein polymeres Material (Zellulose) synthetisiert worden war. Die aus der organischen Fraktion freigesetzten Zucker wurden durch TLC analysiert, und diese Mutanten zeigten eine sehr effiziente Synthese von Cellobiose. Die Cellobiose akkumulierte in der organischen Fraktion. Die Anwesenheit von GDP-Mannose oder UDP-Glukuronat beeinflußte die Akkumulation der Cellobiose nicht; die Cellobiose schien nicht weiter prozessiert zu werden. Diese Daten zeigen an, daß diese Mutanten einen Defekt in der Transferase III besitzen.

Transferase IV

Einige Mutantenlysate (einschließlich Lysate von X655, ATCC Nr. 53195) zeigen die Akkumulation der Lipid-verknüpften primären Zwischenprodukte (beschrieben in US-Patentanmeldung von Vanderslice et al., siehe oben) in der organischen Fraktion, die ein molares Verhältnis von 2 : 1 von Glukose zu Mannose aufweist. Die Gummifraktion eines jeden Zell-Lysats in dieser Gruppe enthält radiomarkierten polytrimeren Gummi. Diese Mutationen liegen in dem Gen für Transferase IV, der Glykosyltransferase, vor, die Glukuronsäure an den Lipid-verknüpften Oligosaccharidvorläufer überträgt.

Transferase V

Mutantenstämme dieses Typs würden das tetramere Oligosaccharid auf dem Lipidträger anhäufen und vermutlich ein verändertes Polysaccharid erzeugen, dem die terminale Mannose und Pyruvat fehlt.

Polymerase

Mutantenstämme mit einer defekten Polymerase können die Lipidverknüpften pentameren Aufbaueinheiten akkumulieren, sie aber nicht polymerisieren. Dieser Phänotyp wurde nicht beobachtet. Ein defektes Gen für die Polymerase kann n eine:n verschiedenen biochemischen Phänotyp resultieren, wie keiner Beladung, oder einem letalen Phänotyp für den Organismus. Insbesondere können Polymerasemutanten einen Transferase I-Phänotyp aufweisen.

Acetylase und Ketase

Diese Defekte wurden in Gum&spplus;-Stämmen vorgefunden. Polysaccharid wurde nach dem Wachstum durch Zentrifugation des Kulturmediums bei 12000 g für 30 Minuten bis zu einer Stunde bei 10 bis 20ºC geerntet. Aus dem Überstand präzipitierter Gummi wurde nach der Hydrolyse mit HPLC analysiert. Die HPLC-Analyse des hydrolysierten Gummis zeigt, daß einige Mutanten Xanthangummi ohne Pyruvat erzeugen, und einige Mutanten erzeugen Xanthangummi mit molaren Verhältnissen von 2 : 2 : 1 von Glukose:Mannose:Glukuronat ohne Acetat. In vitro-Daten bestätigten diese Ergebnisse. Diese Mutationen eliminieren die Ketalase bzw. Acetylase.

Beispiel 3

Beispiel 3 betrifft die Herstellung einer Bank aus genomischer Gesamt-DNA von X. campestris in Lambda 1059.
Der Bakteriophage Lambda 1059 ist ein Substitions-Clonierungsvektor, der von Karn et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5172-5176 (1980), der hierin durch Bezugnahme eingeführt wird, konstruiert wurde. Das Chromosom dieses Phagen enthält eine 14 kb-große, zentrale Region, die von zwei BamHI-Stellen begrenzt ist. Dieses zentrale BamHI-Fragment (in folgenden als das "Stuffer"-Fragment bezeichnet) enthält keine genetischen Funktionen, die notwendig sind für das Phagenwachstum und kann somit entfernt und durch fremde DNA ersetzt werden. Die zwei Arme des Vektors enthalten sämtliche essentiellen genetischen Funktionen für die Lambda-Replikation und Reifung. Lebensfähige Phagenpartikel werden erzeugt durch Ligieren eines DNA-Fragments mit einer Größe von 6 kb bis 24 kb zwischen den linken und rechten Arm der Vektor-DNA. Legierungen der linken und rechten Arme miteinander ergeben keine lebensfähigen Phagenpartikel, da die Genomgröße zu klein ist für eine geeignete Verpackung in Phagenköpfe.
Das "Stuffer"-Fragment vom Lambda 1059 trägt die Lambda red- (exo- und beta-Gene) und Gamma unter der Kontrolle des linksseitigen Promotors (pL). Diese Gene verleihen dem Vektor einen Spi&spplus;-Phänotyp, d. h. der Phage kann auf recA&supmin;-Stämmen wachsen, aber er kann nicht auf Stämmen wachsen, die lysogen sind für den Bakteriophagen P2. Da pL auch auf dem "Stuffer"-Fragment gelegen ist, wird die Expression des Spi&spplus;-Phänotyps nicht durch die Orientierung des "Stuffers" zwischen den linken und rechten Arm des Vektors beeinflußt.
Vektor-DNA, die mit BamHI gespalten wurde, wird mit geflomischer DNA ligiert, die durch Spaltung mit einem beliebigen Restriktionsenzym erhalten wurde, das "überhängende" Enden erzeugt, die mit den cohäsiven Enden von BamHI kompatibel sind (z. B. BglII, BclI und Sau3A). Die Spaltung von genomischer DNA mit Sau3A ist eine wirksame Technik zum Erzeugen einer nahezu zufälligen Population an DNA-Fragmenten mit hohem Molekulargewicht, da die Erkennungsstellen für die Spaltung durch dieses Enzym durchschnittlich einmal alle 256 bp auftritt. Lebensfähige Phagenpartikel, die ein Insert aus Fremd-DNA enthalten, exprimieren einen Spi&supmin;-Phänotyp und sind somit fähig, auf P2-Lysogenen, aber nicht auf recA&supmin;-Stämmen zu wachsen.
Genomische DNA mit hohem Molekulargewicht (größer als 100 kb) wurde aus 2 l S4-L rif-101 unter Verwendung der von Saito und Muria beschriebenen Verfahren isoliert, wie beschrieben in Biochem. Biophys. Acta 72: 619-629, das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird. Genomische DNA von X. campestris mit hohem Molekulargewicht wurde partiell gespalten mit Sau3A unter Verwendung der Reaktionsbedingungen, die eine Sammlung von Fragmenten mit einer vorherrschenden Größe von 15 bis 20 kb erzeugten. Um eine falsche Verknüpfung durch mehrere Legierungsvorgänge zu vermeiden, wurden die durch die Sau3A-Spaltung erzeugten Fragmente einer sorgfältigen Fraktionierung auf einem 10 bis 40% Glukosegradienten auf eine Größe von 15 bis 24 kb unterzogen. Die Größe der DNA wurde durch Untersuchung eines kleinen Aliquots auf einem 0,4% Agarosegel bestätigt.
DNA des Phagen Lambda öde aus Phagenpartikeln isoliert, die durch Gleichgewichtszentrifugation über Cäsiumchloridgradienten gereinigt wurden. Die Lambda 1059-DNA wurde mit BamHI und SalI gespalten. Die BamHI-Spaltung trennt den linken und rechten Arm von dem "Stuffer"-Fragment. Die SalI-Spaltung spaltet den "Stuffer" weiter und beschränkt damit die Wiederherstellung des Clonierungsvektors während der Legierung. Ein 2 µg Aliquot der BamHI-SalI gespaltenen Vektor-DNA wurde mit 0,6 µg der 15 bis 24 kb-Fragmente, die durch die Sau3A-Spaltung von X. campestris-DNA erzeugt wurden, gemischt und mit T4-Ligase ligiert. Die ligierte DNA wurde in vitro unter Verwendung des Lambda-Verpackungsmixes, erhalten von Boehringer Mannheim, verpackt.
Verdünnungen der verpackten DNA wurden verwendet zum Infizieren von drei verschiedenen E. coli-Stämmen: einem nicht-restriktiven Stamm Km392, einem recA&supmin;-Stamm KRO und einen P2-lysogenen Stamm Q359. Stamm Km392 ist LE392, der Tn5, eingefügt in proC, trägt, und er ist beschrieben worden von Young, R.A., in Science 222 : 778-782 (1983), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird. Die Infektion von KM392 ergab einen Titer von 1 · 10&sup6;, während die Infektion von KRO und Q359 Titer von 6 · 10&sup4; bzw. 1,2 · 10&sup5; ergaben. Der Titer auf KM392 ist eine Maßzahl für den gesamten lebensfähigen Phagen. Der Titer auf KRO ist eine Maßzahl für die Anzahl von Phagen ohne ein Insert der X. campestris-DNA, während der Titer auf Q359 die Anzahl der Phagen anzeigt, die ein Insert von X. campestris-DNA enthalten. Die relativ große Zahl der lebensfähigen Phagen, die kein Insert an X. campestris-DNA enthalten, war überraschend, da eine Doppelspaltung der Vektor-DNA mit BamHI und SalI die Bildung einer signifikanten Anzahl von Lambda 1059-Partikeln durch die Relegierungsvorgänge verhindern sollte. Es ist auch anzumerken, daß die Gesamtzahl der lebensfähigen Phagen, die durch Addieren der Titer auf KRO und Q359 ermittelt wurde, ungefähr fünffach geringer ist, als die gesamten lebensfähigen Phagen, die aus der Infektion von KM392 ermittelt wurde. Eine Interpretation dieser Ergebnisse ist, daß die Ausplattierungseffizienz von Phagen mit und ohne Insert-DNA ungefähr fünffach geringer ist auf KRO und Q359 als auf KM392. Mit anderen Worten, die Anzahl an Phagen mit und ohne Insert an X. campestris-DNA ist tatsächlich fünfmal größer als die kombinierten Titer an KRO und Q359 anzeigen.
Diese Interpretation wurde getestet durch die Bestimmung des Phagenanteils, der auf KM392 wächst, der keine Insert-DNA enthält. Die in 48 isolierten Plaques vorhandenen Phagen, die auf KM392 wuchsen, wurden mittels eines Zahnstochers in Tropfen aus sterilem Puffer überführt, und dann wiederum auf einem Rasen von Q359-Zellen, KRO-Zellen und KM392-Zellen ausplattiert. Sämtliche dieser Isolate wuchsen auf KM392, 62% wuchsen auf Q359, aber keine auf KRO, und 38% wuchsen auf KRO, aber nicht auf Q359. Somit ist der Phagenanteil, der auf KM392 wächst und der ein Insert aus X. campestris-DNA enthält, 62%. Dieser Wert ist in guter Übereinstimmung mit dem vorhergesagten Wert von 66% (1,2 · 10&sup5;/1,8 · 10&sup5;) und zeigt an, daß die tatsächliche Anzahl lebensfähiger Phagen, die ein DNA-Insert enthalten, 6 · 10&sup5; ist.
Zusätzlicher Hinweis darauf, daß X. campestris-DNA erfolgreich cloniert worden ist, wurde durch Isolieren der DNA erhalten, die in sechs unabhängigen Clonen vorhanden war, die auf KM392 und Q359, aber nicht auf KRO wuchsen. Die Größe eines jeden isolierten Phagenchromosoms war leicht größer als die Größe des Chromosoms von Lambda 1059, wobei dies anzeigt, daß das Insert, das in jedem Clon vorhanden ist, größer ist als das 14 kb "Stuffer"-Fragment. Eine BamHI-Spaltung der DNA aus jedem der Isolate zeigte, daß jede ein einzigartiges Restriktionsmuster aufwies, das verschieden war von dem BamHI-Restriktionsmuster von Lambda 1059.

Beispiel 4

Dieses Beispiel beschreibt das Absuchen der Bank aus X. campestris-DNA, und zeigt, daß einige der Gene, die an der Xanthanbiosynthese beteiligt sind, in einem Cluster vorliegen.
Mutanten von X. campestris, die keinen Xanthangummi erzeugen, wurden mit Hilfe der Tn10-Mutagenese isoliert. Die von Tn10 codierte Tetracyclinresistenz ist verwendet worden zum Clonieren von Restriktionsendonukleasefragmenten, die Tn10 und die chromosomale DNA von 35 Gum::Tn10-Mutanten enthalten. Diese chromosomalen Sequenzen, die die Tn10-Insertionsstelle flankieren, stellen Hybridisierungsproben bereit, die verwendet wurden zum Identifizieren der in der genomischen Lambda-Bank clonierten Wildtyp X. campestris-DNA-Sequenzen und zum Erzeugen einer physikalischen Karte der Gum::Tn10-Mutationen.
Chromosomale DNA wurde extrahiert und aus den Gum:: Tn10-Mutanten gereinigt, wie oben in Beispiel 3 beschrieben. Diese DNA wurde vollständig mit der Restriktionsendonuklease PstI gespalten. Dieses Enzym spaltet nicht innerhalb von Tn10. Deshalb enthält ein chromosomales PstI-Fragment das intakte Tn10-Element und fusioniert an die chromosomale X. campestris-DNA, benachbart zu der Insertionsstelle. Die gespaltene DNA wurde mit PStI-gespaltenem Plasmid RSF1010 wie folgt ligiert.
Die Spaltungen wurden untersucht durch das Auftrennen der Aliquots der Reaktionen auf Agarosegelen. Bei einer typischen Legierungsreaktion wurden ungefähr 8 µg des Plasmids und ungefähr 5 µg der chromosomalen DNA in einem Gesamtvolumen von 200 µl vereinigt. Ungefähr 20 Einheiten der T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) wurden zugesetzt, und die Reaktionen wurden bei 12ºC für ungefähr 16 Stunden inkubiert. Das Ausmaß der Legierung wurde durch Agarosegelelektrophorese eines Aliquots der Reaktion vor der Transformation untersucht.
Die Legierungsprodukte werden zur Transformation von E. coli LE392 verwendet, wobei auf die Resistenz gegen Streptomycin (getragen von RSF1010) oder Tetracyclin selektiert wurde. Die vollständige Legierungsreaktion wurde dann verwendet zum Transformieren von E. coli LE392. Die Selektion auf die Tetr-Transformanden sollte rekombinante Plasmide selektieren, die sowohl das große PstI-Fragment von RsF1010 (das die Replikationsfunktion bereitstellt) und das PStI-Fragment von chromosomaler DNA, das Tn10 (das die Tetracyclinresistenz bereitstellt) umfaßt, enthalten. Für das Transformationsverfahren wird die Legierungsreaktion mit Ethanol präzipitiert, resuspendiert in 50 µl Puffer und zu 0,2 bis 1,0 ml Zellen (die durch eine CaCl-Behandlung transformationskompetent gemacht wurden) bei einer Konzentration von ungefähr 3 · 10&sup9; pro ml zugesetzt. Diese Mischung wird auf Eis für 45 Minuten inkubiert, einem Hitzeschock bei 43ºC für zwei Minuten unterzogen, fünffach mit Luriamedium verdünnt, bei 37ºC für 60 Minuten inkubiert und schließlich konzentriert und auf dem geeigneten wirkstoffhaltigen Medium ausplattiert.
Alle Legierungen mit chromosomaler DNA, enthaltend Tn10, ergaben einige Tetracyclin-resistente Transformanden, die rekombinante Plasmide enthielten, die clonierte Tn10-DNA trugen. Nicht-Tetracyclin-resistente Transformanden wurden bei Kontrolltransformationen mit RSF1010 alleine, ohne DNA, und am signifikantesten mit einer Legierungsreaktion unter Verwendung von chromosomaler DNA, die aus S4-L str-101, der Tn10 nicht enthält, extrahiert wurde, erhalten. Die Frequenz von Streptomycin-resistenten Transformanden bei dieser Kontrolliegierung war jedoch äquivalent zu den Frequenzen an Streptomycinresistenten Transformanden, die mit anderen Legierungen erhalten wurden.
Die Tetracyclin-resistenten Transformanden wurden auf die Anwesenheit von rekombinanten Plasmiden, die Tn10 tragen, untersucht. Kolonien wurden abgenommen und über Nacht in LB mit 10 µg/ml Tetracyclin kultiviert. Plasmid-DNA wurde hergestellt mit Hilfe einer üblichen Klar-Lysat-Technik, wie beschrieben von Clewell und Helsinki in Biochemistry 62: 1159-1166 (1969), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird. Plasmide wurden durch Spaltung mit geeigneten Restriktionsendonukleasen analysiert. Um auf die Anwesenheit von Tn10 auf dem Plasmid hin zu testen, wurde eine HindIII-Spaltung durchgeführt. Tn10 enthält zwei interne HindIII-Fragmente, 4,8 kb und 0,5 kb in Länge. Somit sollten sämtliche rekombinanten Plasmide diese zwei Fragmente ergeben, wenn sie mit HindIII gespalten werden. Weiterhin, wenn sie mit PstI gespalten werden, sollten sämtliche Rekombinanten ein 8,1 kb-Fragment ergeben, das von RSF1010 stammt, plus ein zweites, größeres Fragment, das größer als 9,3 kb sein sollte. Dies ist das PstI-Fragment von chromosomaler DNA, die Tn10 enthält, das selbst 9,3 kb lang ist.
Nahezu alle untersuchten Plasmide schienen nach diesen Kriterien Tn10 zu enthalten. Jedoch ergaben PstI-Spaltungen oft die Anwesenheit von mehr als zwei PstI-Fragmenten. Vermutlich sind diese "extra"-Fragmente das Ergebnis von multiplen Legierungsvorgängen. Diese extra-Fragmente waren unerwünscht, da, falls solche Rekombinanten als eine Hybridisierungsprobe verwendet wurden, das Annealing an DNA-Fragmenten, die homolog sind zu dem externen PstI-Fragment, auftreten könnte, wie auch ein Annealing an das PstI-Fragment, das Sequenzen des Gens von Interesse enthält.
Um die externen PstI-Fragmente zu entfernen, wurde das Tn10-enthaltende Fragment dann "recloniert". Gereinigte Plasmid-DNA wurde über Cäsiumgradienten gereinigt und vollständig mit PstI gespalten. Die Spaltprodukte wurden bei niedriger DNA-Konzentration (ungefähr 10 µg/ml) ligiert. Bei dieser relativ niedrigen Konzentration sollten die meisten Legierungsvorgänge zur Zirkularisierung linearer Fragmente führen. Zufälligerweise können sich dimere Ringe bilden, und Multimere höherer Ordnung sollten selten sein.
Das Ausmaß der Legierung wurde durch Gelelektrophorese eines Aliquots der Reaktion untersucht, und im allgemeinen wurde eine geringe Multimerbildung beobachtet. Die Legierungsreaktion wurde dann verwendet zum Transformieren von E. coli LE392, und Tetracyclin-resistente Transformanden wurden selektiert. Die in diesen Transformanden vorhandenen Plasmide wurden dann analysiert; sie hatten fast immer die gewünschte rekombinante Struktur. Das heißt, sie enthielten zwei, und nur zwei, PstI-Fragmente: eines mit 8,1 kb Größe, das von RSF1010 stammt, und ein zweites Fragment, das größer war als 9,3 kb, das das chromosomale Fragment von X. campestris, enthaltend das Tn10 und die benachbarte genomische DNA, darstellt. Die erhaltenen rekombinanten Plasmide wurden pTXnnn genannt, worin T für die Tetracyclinresistenz steht, und Xnnn ist die Stammbezeichnung der Gum::Tn10-Mutante, aus der die Tetracyclinresistenz cloniert wird. Zum Beispiel wurde Plasmid pTX655 durch Herausclonieren der Tetracyclin-resistenten Determinante aus dem Gum:: Tn10-Mutantenstamm X655 erhalten.
Die Gum&supmin;-Mutante, X655 bezeichnet, erzeugt ein Polysaccharin mit Untereinheiten mit einer Trimerstruktur anstelle der normalen Pentamerstruktur. Diese Mutante ist ausführlicher beschrieben von Vanderslice et al., siehe oben. Es schien möglich, daß das biosynthetische Gen für Gummi, das durch diese Mutation definiert war, Teil eines Clusters von Genen sein könnte, die in koordinierter Weise exprimiert und reguliert werden, um die Gummibiosynthese zu bewerkstelligen. Um diese Möglichkeit zu testen, wurde ein Satz von 26 Lambda 1059-Clonen, die X. campestris-DNA enthalten, die mit Plasmid pTX655 (künftig Lambda 655(+) genannt) hybridisieren, isoliert und gereinigt. Da die Genbank nicht amplifiziert worden war, enthielt jeder Clon X. campestris-DNA, die von einem unabhängigen Legierungsvorgang stammte. Der Effekt hiervon war, daß entlang des Chromosoms in dem Bereich des Genoms "gewandert" wurde, der das Gummi-Gen enthält, das durch die X655-Mutation definiert war. Da jedes clonierte Fragment ungefähr 15 kb groß ist, erstreckte sich die "Wanderung" auf ungefähr 30 kb.
Der Satz an 26 Phagenclonen wurde dann wiederum hybridisiert mit Proben-DNA, die aus jedem der 35 Gum::Tn10-Mutanten cloniert worden war. Von 24 der 35 Plasmidproben wurde gefunden, daß sie entweder mit sämtlichen oder einigen der 26 Phagenclone in diesem Satz hybridisierten. Diese Ergebnisse zeigen an, daß zumindest einige der Gummi-Gene in der gleichen Region des X. campestris-Genoms als Cluster vorliegen, die das biosynthetische Gummi-Gen enthält, das durch die X655-Mutation definiert ist, Transferase IV.
Die 26 rekombinanten Lambda Phagen 655(+) enthalten, als eine Population, ungefähr 30 kb chromosomaler X. campestris-DNA, die sich um das PstI-Fragment, cloniert in pTX655, anordnet. Durch Hybridisieren der anderen 34 pTX-Plasmide gegen diese Phagen wurde ermittelt, welche der anderen Gum&supmin;-Mutanten Tn10-Insertionen innerhalb dieses 30 kb Segments enthielten. Sämtliche 35 PTX-Plasmide wurden durch Nicktranslation radiomarkiert und mit Filter-gebundener DNA des Lambda-Phagen 655(+) zusammen mit DNA des Clonierungsvektors Lambda 1059, die als eine Negativkontrolle diente, hybridisiert.
Nicktranslationen wurden durchgeführt in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA, 1 mM DTT und 50 µg/ml BSA (Sigma Pentax Fraktion V). Typische Reaktionsvolumen betrugen 30 µl und typischerweise wurden 0,4 µg DNA zugesetzt. Kalte dNTP's waren jeweils anwesend bei 20 µM und ³²P-markierte dNTP's waren jeweils bei 3,3 µM anwesend. Insgesamt wurden ungefähr 80 µCi ³²P mit jedem heißen dNTP zugesetzt; im allgemeinen waren ein oder zwei Nukleotide markiert. Diese Reaktionsmischung wurde mit DNAaseI (1 µl auf 0,1 µg/ml Lösung) für 1 Minute bei 37ºC behandelt. Anschließend wurde 1 µl E. coli DNA-Polymerase I (5 Einheiten, wie definiert von Richardson et al. (1964)) der Reaktion zugesetzt. Nach der Inkubation bei 37ºC für 30 Minuten wurde die Reaktion mit Träger-DNA Ethanol-präzipitiert. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen, im Vakuum getrocknet und in 200 µl 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM EDTA, resuspendiert.
Hybridisierungen wurden nach den folgenden Verfahren durchgeführt. Nitrozellulosefilter mit daran gebundenen Lambda-DNAs wurden hergestellt unter Verwendung der Protokolle von Davis et al. (1980). Diese Filter wurden vorhybridisiert in 5 · SSPE, 5 · Denhardt's Lösung (Maniatis et al., siehe oben) 0,1% SDS und 50% Formamid, enthaltend 100 µg/ml denaturierte, Ultra- Schall-behandelte Kalbsthymus-DNA, für 4 bis 16 Stunden bei 42ºC auf einem Schüttler. Die Hybridisierungsreaktion selbst wurde in 2 · SSPE, 1 · Denhardt's Lösung, 50% Formamid, enthaltend 100 µg/ml denaturierte, Ultraschall-behandelte Kalbsthymus-DNA, durchgeführt. Radioaktiv markierte ³²P-DNA-Proben wurden in 0,1 M NaOH denaturiert und durch den Zusatz von 1/10 Volumen Tris-HCl (pH 8,0) neutralisiert. Typischerweise wurden 106 cpm eingebautes ³²P pro ml der Hybridisierungsreaktion zugesetzt. Die Hybridisierungen wurden bei 42ºC für 12 bis 20 Stunden auf einem Schüttler inkubiert. Anschließend wurden die Filter bei Raumtemperatur gewaschen, einmal in 2 · SSPE und dann einmal in 0,1 · SSPE. Die Filter wurden auf Whatman 3 MM-Papier gegeben und dann an der Luft getrocknet. Die Filter wurden dann mit einem Kodak X-OMAT AR-Film zusammengebracht und für 4 bis 16 Stunden bei -70ºC exponiert. Eine Du Pont Coronex Verstärkerfolie wurde verwendet.
Es wurde gefunden, daß 25 der 35 Plasmide an einige oder sämtliche der DNAs der Lambda-Phagen 655(+) hybridisierten Zehn Proben hybridisierten an keinen der Lambda-Phagen 655(+). Somit ist eine ansehnliche Fraktion der Gum::Tn10-Mutationen (ungefähr 60%) innerhalb dieser clonierten 30 kb-Region lokalisiert, aber eine signifikante Anzahl liegt außerhalb dieses DNA-Segments
Die Hybridisierungsdaten erlauben die Klassifizierung der Lambda-Phagen 655(+) auf der Basis der Proben, die hybridisierten und die nicht hybridisierten. Diese Hybridisierungsmuster spiegeln die in jedem Phasen clonierten DNA-Segmente wider. Da jedes der clonierten DNA-Fragmente ein einzelnes, zusammenhängendes Stück des X. campestris-Chromosoms darstellt, wurde die Reihenfolge der Mutationen in dem Genom aus den Klassen der Hybridisierungsmuster geschlossen. Die Anwesenheit oder Abwesenheit von bestimmten DNA-Fragmenten korreliert gut mit der Hybridisierung oder dem Ausbleiben der Hybridisierung an bestimmte Proben.
Die Restriktionskarten und Hybridisierungsdaten zeigten, daß die Mutante X708 recht nahe an einem Ende des clonierten 30 kb-Segments von X. campestris-DNA lokalisiert war. Es wurde somit an dem X. campestris-Chromosom entlang "gewandert" durch Isolieren von rekombinanten Lambda-Phagen, die an das Plasmid pTX708 hybridisieren. 26 solcher Rekombinanten wurden abgenommen und durch Restriktionskartierung analysiert, wie oben beschrieben. Dieser Satz an Phagen erweiterte die clonierte Region um ungefähr 8 kb.
Sämtliche 35 pTX-Plasmidproben wurden dann an diesen Satz rekombinanter Phagen hybridisiert mit Hilfe des gleichen Verfahrens, das in den Hybridisierungen mit den Lambda-Phagen 655(+) angewendet wurde. Die gleichen 25 pTX-Proben hybridisierten (annealed) an einige oder sämtliche der Lambda-Phagen 708(+), und der gleiche Satz an Proben der an keinen Lambda-Phagen 655(+) hybridisierte, zeigte auch keine Hybridisierung an einen der Lambda-Phagen 708(+). Wiederum erlaubten die Restriktionskarten der Lambda-Phagen 708(+) die Korrelation zwischen der Anwesenheit oder Abwesenheit von bestimmten DNA-Fragmenten mit der Hybridisierung an bestimmte Plasmidproben. Zusammenfassend, anhand dieser Hybridisierungen wurde gefunden, daß 25 Mutationen clusterartig in einer Region der DNA in der Nähe der Mutation, die in dem Transferase IV-Stamm X655 vorliegt, auftreten. Zehn Mutationen wurden nicht in dieser DNA-Region kartiert. Einige dieser Mutationen werden oben beschrieben und von Betlach et al., siehe oben. Diese Mutationen veränderten die Enzyme für biosynthetischen Gummi nicht.

Beispiel 5

Dieses Beispiel zeigt die Restriktionskartierung der clonierten DNA, die die Gene für biosynthetischen Gummi clusterartig enthält.
Da eine große Anzahl der Gummi-Gene, die durch die Sammlung der Tn10-Insertionsmutationen definiert wurden, clusterartig um die Position der X655-Mutation auftraten, wurde die Region des X. campestris-Genoms, das diese Gene enthält, weiter charakterisiert durch Restriktionsenzymkartierung. Dies wurde bewerkstelligt durch das Erstellen einer Restriktionsenzymkarte der clonierten DNA, die in jedem der 26 Phagenclone vorhanden ist, die den Satz an überlappenden Fragmenten darstellen, die das Gummi-Gencluster tragen.
Da jeder der Phagenclone DNA von Lambda 1059 zusätzlich zu der clonierten X. campestris-DNA enthielt, wurde die Restriktionsenzymanalyse durchgeführt mit einen Restriktionsenzym, das die Unterscheidung der Lambda-DNA von der X. campestris-DNA leicht ermöglicht. Ein solches Enzym ist BamHI. Da es keine BamHI-Stellen in den zwei Armen von Lambda 1059 gibt, tritt die Lambda-DNA, die in jeder BamHI-Spaltung vorhanden ist, immer in zwei Banden auf: Eine größer oder gleich 20 kb, die Lambda-DNA von dem linken Arm enthält, die andere größer oder gleich 9 kb, die Lambda-DNA von dem rechten Arm enthält.
DNA, die aus jedem der 26 Phagenclone isoliert worden war, wurde mit BamHI gespalten. Da die erzeugten Restriktionsfragmente eine Größe von größer als 20 kb bis weniger als 0,5 kb aufwiesen, wurden die Spaltungen auf einem niedrigprozentigen Agarosegel (um die großen Fragmente abzutrennen) und bei hoher Spannung (um die Diffusion der kleinsten Fragmente zu verringern) laufengelassen. Diese Gele verwendeten oft eine Agarosekonzentration von 0,4%, die bei 100 Volt für ungefähr 5 Stunden liefen. Jedes Gel enthielt Analysenproben der Phagenclone, die mit BamHI gespalten wurden, eine HindIII- Spaltung der Wildtyp-Lambda-DNA (zur Verwendung als Größenstandard) und eine BamHI-Spaltung von Lambda 1059-DNA (um die Lage der Vektor-DNA in den Spaltungen der Analysenprobe zu markieren). Der von jedem Restriktionsfragment der Analysenprobenspaltung durchlaufene Abschnitt wurde gemessen und in eine molekulare Größe umgerechnet unter Verwendung einer Standardkurve, die erstellt worden war mit den HindIII-Spaltungen der Wildtyp-Lambda-DNA.
Die Restriktionsmuster, die durch die BamHI-Spaltung der DNA, die in jedem der 26 Phagenclone vorhanden war, erzeugt worden waren, wurden analysiert, um die Regionen der überlappenden DNA in jedem der Phagenclone zu ermitteln. Aus dem Muster der Überlappungen wurde die Reihenfolge der Restriktionsfragmente in jeder Spaltung ermittelt (Fig. 2).
Da die Position der X708-Mutation sehr nahe an dem einen Ende der clonierten DNA vorlag, schien es möglich, daß eine oder mehrere der DNAs der 10 pTX-Proben, die nicht hybridisierte, gerade außerhalb der Region der DNA lokalisiert war, die in dem Satz überlappender Phagenclone enthalten war. Diese Möglichkeit wurde getestet durch die Isolierung eines Satzes an Lambda-Clonen, die mit pTX708 aus der Genbank hybridisieren. Auf diese Weise wurde die Region des X. campestris-Genoms, die sich an das Gummi-Gencluster anschließt, über die Stelle der Gum&supmin;-Mutation, die in X708 vorhanden ist, hinaus ausgedehnt. BamHI-Restriktionskarten wurden für die DNA erstellt, die in diesen Clonen enthalten ist (Fig. 3).
Zum Ermitteln, ob es sehr kleine BamHI-Restriktionsfragmente (kleiner als 0,5 kb) gab, die auf 0,4% Agarosegelen nicht nachgewiesen werden, wurden ausgewählte Phagenclone, die DNA enthalten, die von der vollständig clonierten Region stammt, mit BamHI gespalten und auf einem 5% Polyacrylamidgel laufen gelassen. Ein solches Gel kann Fragmente bis zu 30 bp auftrennen. Dieses Experiment zeigte die Anwesenheit von zwei zuvor nicht nachgewiesenen BamHI-Fragmenten mit Größen von 300 bp und 190 bp.
Die weiteren Analysen dieser Daten zeigten, daß das 300 bp-Fragment zwischen dem 1,05-Fragment und 1,4 kb-Fragment lokalisiert ist, während das 190 bp-Fragment zwischen dem 5,8 kb-Fragment und 1,05 kb-Fragment lokalisiert ist. Sämtliche BamHI-Restriktionskartierungsdaten und die Probenhybridisierungsdaten wurden kombiniert, um eine physikalische und genetische Karte einer Region des X. campestris-Chromosoms zu erstellen, die ein Cluster an Genen trägt, das an der Xanthangummibiosynthese beteiligt ist (Fig. 4).

Beispiel 6

Beispiel 6 beschreibt die Subclonierung von DNA des Gummi-Genclusters aus der Lambda 1059-Bank in den Plasmidvektor pMW79 mit breitem Wirtsbereich.
Der Vektor pMW79 ist ausführlich beschrieben von Wood et al. in J. Bact. 14: 1448-1451 (1981), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird. Kurz, es ist ein chimäres Plasmid, das den breiten Wirtsbereich des Inc-Q-Plasmids RSF1010 und den klassischen Clonierungsvektor für E. coli pBR322 kombiniert (siehe Fig. 5a). pMW79 kann in eine große Anzahl an gramnegativen Bakterien übertragen und darin vermehrt werden, und es behält viele der nützlichen Clonierungsstellen, die in pBR322 vorliegen. Die Clonierungsstellen in dem pBR322-Anteil des Plasmids sind prinzipiell verwendet worden und insbesondere sind Stellen verwendet worden, die innerhalb des Tetracyclinresistenz-Gens auftreten.
Der Clon 655 (I) des Lambda-Phagen 1059 enthält die vollständige Region des X. campestris-Genoms, das die Gummi-Gene trägt, die durch unsere Tn10-Mutationen definiert wurden. Die X. campestris-DNA in Phagenclon I wurde subcloniert in den Plasmidcloniertingsvektor pMW79.
Eine partielle BamHI-Spaltung der aus dem Lambda-Clon 655 (I) isolierten DNA wurde mit einer begrenzten BamHI-Spaltung von pBR322 und pMW79 ligiert. Die ligierte DNA wurde verwendet zum Transformieren von KM392, wobei auf Ampr-Transformanden selektiert wurde. Insgesamt wurden 1200 Ampr-Transformanden auf Agarplatten, enthaltend Tetracyclin, übertragen, um zu bestimmen, welche der Transformanden Tet sind und somit wahrscheinlich ein Insert in der einzigen BamHI-Stelle enthalten, die in dem Tet-Gen von pMW79 enthalten ist. Sechzig Ampr-Tets-Transformanden wurden isoliert und gereinigt. Plasmid-DNA wurde dann aus jedem der Transformanden isoliert, mit BamHI gespalten, und die Spaltungen wurden auf 0,4% Agarosegelen laufengelassen, um die Anwesenheit und das Ausmaß an X. campestris-DNA zu ermitteln.
Die Mehrzahl der isolierten Plasmide enthielt keine Insert-DNA. Jedoch enthielten 19 Inserts. 9 der 19 enthielten ein einzelnes Fragmentinsert, während 10 Inserts enthielten, die sich aus zwei oder mehreren Fragmenten zusammensetzten. In allen Fällen, in denen zwei oder mehr BamHI-Fragmente in der clonierten DNA vorhanden sind, sind die Fragmente zusammenhängend auf der BamHI-Restriktionskarte des Lambda-Clons 655 (I). Dieser Befund stellt einen unabhängigen Hinweis darauf dar, daß die Reihenfolge der BamHI-Fragmente in dem Lambda-Clon 655 (I) richtig ist. Mit der Ausnahme des 1,0 kb-Fragments an dem rechten Ende ist die gesamte Xanthomonas-DNA, die in dem Lambda-Clon 655 (I) vorhanden ist, in einem oder mehreren der Subclonderivate repräsentiert.
Clone von pMW79, enthaltend entweder das 5,8 kb-Fragment oder das 11,5 kb-Fragment (die nicht in dem Lambda-Clon 655 (I) vorhanden sind), wurden in einem getrennten Experiment hergestellt durch Ligieren der begrenzten BamHI-Spaltungen der Lambda-Clone 655 (C,) und Lambda-Clone 708 (8) mit BamHI-Spaltungen von pMW79. Eine repräsentativ. Sammlung von X. campestris-DNA-Fragmenten, die so in pMW79 cloniert wurden, ist in Fig. 5b gezeigt.
In einer Reihe von Schritten wurde ein einzelnes, großes (20 kb) Segment an DNA, das die Region überspannt, die genetisch an der Xanthangummibiosynthese beteiligt ist, in pMW79 cloniert. Die dieser Clonierung folgenden Schritte waren wie folgt. DNA des Lambda-Phagen-Clons 655(B) (Fig. 2) wurde vollständig mit BglII und HindIII gestalten und ligiert mit Plasmid PMW79-DNA, die vollständig gespalten worden war mit BamHI und HindIII. BamHI und BglII spalten an Verschiedenen Sequenzen, aber sie erzeugen identische cohäsive Enden; somit können BamHI-Enden mit BglII-Enden ligiert werden. Die Legierungsprodukte wurden verwendet zum Transformieren von E. coli, wobei auf die von pMW79 codierte Ampicillinresistenz selektiert wurde. 88 Ampr-Transformanden wurden auf die Resistenz gegen Tetracyclin hin abgesucht, und 75 Tets-Isolate wurden gefunden. Das Clonieren in die BamHI-HindIII-Region von pMW79 führt zur Inaktivierung der Tetracyclinresistenz. Die hohe Frequenz der Tets-Transformanden tritt auf, da HindIII- und BamHI-Enden nicht miteinander ligiert werden können, um das Plasmid erneut zu Schließen; eine Insertion eines DNA-Fragments ist für die Rezirkularisierung erforderlich. Sechs Tets-Transformanden wurden auf Plasmid hin analysiert. Geklärte Lysate wurden in kleinem Maßstab hergestellt, mit BamHI gespalten und auf einem Agarosegel aufgetrennt. Von zwei Transformanden wurde gefunden, daß sie Plasmide enthalten, die das gewünschte Fragment tragen. Ein Isolat wurde für eine größere Plasmidpräparation hochgezogen. Diese Plasmid-DNA wurde durch Cäsiumchlorid Dichtegradientenzentrifugation gereinigt und erneut analysiert durch verschiedene Restriktionsendonukleasespaltungen. Dieses Plasmid (nun pX206 bezeichnet) besaß die erwartete Struktur, die in Fig. 6 gezeigt ist, wie durch das Schnittmuster dieser Restriktionsendonukleasen bewiesen.
Es wurde auch ein Versuch unternommen, das 8 kb BglII-Fragment von Lambda 708(8), wie in Fig. 6 gezeigt, zu clonieren. Gereinigte DNA von Lambda 708(8) wurde vollständig mit BglII gespalten und mit BamHI-gespaltener pMW79-DNA ligiert. Die Legierungsmischung wurde zum Transformieren von E. coli verwendet, wobei wiederum auf Ampr selektiert wurde. 166 Ampr-Transformanden wurden auf die Resistenz gegenüber Tetracyclin getestet, und 49 Tets-Isolatate wurden gefunden. Plasmid-DNA von 18 von diesen wurde isoliert, und es wurde ein rekombinantes Plasmid gefunden, das das BglII-Fragment zu enthalten schien. Ein geklärtes Lysat wurde in großem Maßstab von diesem Stamm hergestellt, und die Plasmid-DNA wurde über Cäsiumchloridgradienten gereinigt. Die weitere Analyse dieses Plasmids zeigte, daß es das Fragment von Interesse enthielt, aber es enthielt auch ein zweites, externes BglII-Fragment
Die Struktur dieser zufälligen Rekombinanten eröffnete die Möglichkeit, einen brauchbareren Subclon zu konstruieren. Nebenbei bemerkt, die Lokalisierung der BglII- und ClaI-Stellen in diese Plasmid eröffnete die Möglichkeit, es mit ClaI und BglII zu spalten und dann in das 2 kb ClaI-BglII-Fragment zu ligieren, das sich in dem Gummi-Gencluster anschließt. Diese Konstruktion erweitert die in dem Plasmid clonierte DNA um 2 kb über die BglII-Stelle hinaus; diese zusätzliche DNA war nützlich zum Erleichtern von Genaustauschexperimenten. Weiterhin enthielt dieses Konstrukt einmalig vorkommende HindIII- und BglII-Stellen innerhalb der clonierten Xanthomonas-DNA. Die Struktur dieses Plasmids, als pX207 bezeichnet, ist in Fig. 6 gezeigt.
Anschließend wurde das große (8 kb) BglII-ClaI-Fragment von Lambda 655(B) in pX207 eingeführt, wobei das kleine (2 kb) BglII-ClaI-Segment von pX207 ersetzt wurde. Plasmid pX207 wurde vollständig mit beiden dieser Enzyme gespalten und mit der DNA des rekombinanten Lambda 655(B) ligiert, der auch mit BglII und ClaI gespalten wurde. Die Doppelspaltung mit ClaI und BglII selektiert nach rekombinanten Plasiniden unter den Transformanden, da BglII-Enden nicht mit ClaI-Enden ligiert werden können, und somit kann das Plasmid pX207 nicht rezirkularisieren, sofern nicht ein zweites BglII-ClaI-Fragment hineinligiert wird. Tatsächlich enthielten sämtliche 12 Transformanden, die untersucht wurden, rekombinante Plasmide und eines von diesen stellte sich als die gewünschte Rekombinante heraus. Das Plasmid pX208 ist in Fig. 6 gezeigt. Dieses Plasmid enthält die DNA des Gummi-Gens von der BglII-Stelle rechter Hand des 5,8 kb BamHI-Fragments bis zur ClaI-Stelle des 11,5 kb BamHI-Fragments mit der Ausnahme eines dazwischen liegenden 4,5 kb BglII-Stücks. Das fehlende 4,5 kb BglII-Fragment wurde anschließend in pX208 eingeführt, um den gewünschten großen Subclon zu erzeugen, der pX209 genannt wird.
Die Plasmid-DNA von pX208 wurde durch Spaltung mit BglII linearisiert. Das fehlende 4,5 kb BglII-Fragment wurde durch Elektroelution aus einem präparativen Agarosegel gereinigt und an das BglII-gespaltene pX208 legiert. Die Legierungsprodukte wurden zum Transformieren von E. coli verwendet und Ampicillinresistente Transformanden wurden erhalten. Bei dieser Legierung gibt es keine Selektion auf Rekombinanten und es gibt kein einfaches Screeningverfahren. Die Transformanden wurden nach rekombinanten Plasmiden mit der Technik der Koloniehybridisierung (Maniatis et al., siehe oben) abgesucht. Dieses Verfahren ist analog zu dem Plaquehybridisierungsprotokoll, das verwendet wurde zum Absuchen von Lambda-Clonen nach DNA-Segmenten von Interesse. Die Transformanden werden mit einem Zahnstocher auf eine "Master"-Platte in einer geordneten Anordnung übertragen. Diese Masterplatte wird dann verwendet zum Herstellen von Kopien auf einem Nitrozellulosefilter. Diese Filterkopie wird auf einer Agarplatte inkubiert, mit dem Ergebnis, daß das bakterielle Wachstum auf der Oberfläche des Filters erfolgt, wobei die Nährstoffe durch den Filter aus dem Agar durch Diffusion zugeführt werden. Anschließend werden die Bakterien auf dem Filter in situ lysiert, und die DNA wird irreversibel an den Filter gebunden. Dieser Filter kann dann mit einer beliebigen radioaktiven DNA-Probe untersucht werden. In dem vorliegenden Fall wurde ein radiomarkiertes, 4,5 kb BglII-Fragment verwendet; nur Rekombinanten, die dieses Fragment enthielten, hybridisierten mit der Probe. Die meisten Transformanden enthielten nur das rezirkularisierte Plasmid pX208 und hybridisierten nicht. 576 Transformanden wurden mit Hilfe der 4,5 kb BglII-DNA, markiert mit ³²P durch ein Nicktranslationsverfahren, abgesucht. Unter diesen hybridisierten 20 Transformanden mit der Probe. Plasmid-DNAs aus einigen dieser Transformanden wurde analysiert, um die Anwesenheit des 4,5 kb-Fragments zu verifizieren und seine Orientierung zu bestimmen. Plasmide aus 12 solchen vermuteten Rekombinanten wurden analysiert mit Hilfe der Agarosegelelektrophorese. 11 davon enthielten das erwartete BglII 4,5 kb-Fragment, und von diesen 11 trugen 8 das Fragment in der richtigen Orientierung. Eines dieser 8 wurde für die weitere Analyse abgenommen. Dieses Plasmid, als pX209 bezeichnet, ist in Fig. 6 gezeigt.

Beispiel 7

Dieses Beispiel beschreibt die Methodologie für die in vivo- und in vitro-Mutagenese, die auf einen bestimmten Bereich des clonierten DNA-Segments des Gummi-Gens gerichtet ist, das in pMW79 enthalten ist.
Die auf einen Bereich gerichtete Mutagenese wurde mit subclonierten Anteilen der Gummi-DNA, die in dem Plasmid pMW79 enthalten ist, durchgeführt. Diese clonierten DNA-Segmente wurden in vivo mutagenisiert mit Transposons und in vitro unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie, und Insertionen, Deletionen und substituierende Mutationen innerhalb der clonierten X. campestris-DNA zu erzeugen. Um den durch diese Mutationenen verliehenen Phänotyp zu untersuchen, wurden die Mutationen-tragenden Plasmide zurück in X. campestris übertragen, und anschließend wurden Rekombinanten identifiziert, in denen das auf dem Plasmid vorliegende, mutierte Gen in das Chromosom über homologe Rekombination eingeführt worden ist. Die Tn10 codierte Tetracyclinresistenz stellt ein einfaches, selektives System zum Übertragen von Mutationen von einem Plasmid in das Chromosom bereit.
In Vorversuchen, die zum Untersuchen der Rekombination zwischen Plasmid-getragener X. campestris-DNA und dem X. campestris-Chromosom entworfen wurden, wurde das Plasmid pTX655 als ein Modellsystem verwendet. Dieses Plasmid trägt ein Tn10-Insert in der Mitte eines 2,3 kb PstI-Fragments von X. campestris, das in Plasmid RSF1010 cloniert ist. Dieses Experiment diente zum Mobilisieren von pTX655 mit dem Plasmid, pRK2013 und dessen Transfer von E. coli in X. campestris, indem auf die Übertragung durch die Tetracyclinresistenz, codiert durch Tn10, selektiert wurde. Die anfänglichen Ergebnisse dieser Paarung waren anormal und legten nahe, daß Tn10 die Tetracyclinresistenz nicht wirksam in X. campestris exprimierte, wenn sie in einem Plasmid enthalten war, aber daß die Wirkstoffresistenz stärker exprimiert wurde, wenn Tn10 in dem Chromosom von X. campestris vorlag. Dieses Phänomen ist auch für Tn10 in E. coli beschrieben worden. Dort ist gezeigt worden, daß Stämme, die eine Kopie des Tn10, eingeführt in das Chromosom, tragen, resistent sind gegen signifikant höhere Konzentrationen an Tetracyclin als Stämme, die Tn10 in einem Multi-Kopien-Plasmid enthalten. Die Selektion auf Tet r X. campestris aus der obigen Paarung führte zu einer hohen Frequenz (0,5 pro Empfänger) an Nachkommen, die auf Tetracyclin schlecht wuchsen (d. h. nur sehr kleine, wäßrige Kolonien). Nach längerer Inkubation erzeugte eine große Fraktion der Kolonien (25%) Sektoren mit stärker wachsenden Zellen. Mehr als 50% dieser Sektoren schienen in der Morphologie Gum&supmin; zu sein. Diese stammen vermutlich von der Rekombination zwischen der Plasmidgetragenen DNA, enthaltend die Tn10-Insertion, und der chromosomalen Wildtyp-DNA. Wenn das Tn10 in das Chromosom rekombiniert wird, wird eine Tetr auf hohem Niveau erreicht, und der stark wachsende Sektor wird beobachtet. Wenn diese Gum&supmin; Tetr Sektoren abgenommen und auf Tetracyclin erneut ausgestrichen wurden, wuchsen sie gut und zeigten die charakteristische Gum&supmin;-Morphologie. Dies spricht stark dafür, daß die ursprüngliche X655-Mutation rekonstituiert worden ist durch die Rekombination der Plasmid-getragenen Tn10-Insertion in das Chromosom.
Lamda 173, wie beschrieben von Kleckner et al. in Genetics 90: 426-461 (1978), das hierin durch Bezugnahme spezifisch eingeführt wird, wurde verwendet zum Einführen von Tn10 in Plasmide, enthaltend X. campestris-DNA. Dieser Bakteriophage enthält einen Temperatur-sensitiven Repressor für lytische Funktionen und eine Tn10-Insertion in einem nicht-essentiellen Gen. Aliquots dieses Phagen wurden verwendet zum Infizieren eines Lambda-sensitiven E. coli, der ein rekombinantes Plasmid von Interesse enthält, bei einer Multiplizität der Infektion von 0,1 bei 30ºC. Nach 45 Minuten (um die Phagenadsorption, DNA-Injektion und Expression der Tetracyclinresistenz zu ermöglichen) wurden die Zellen pelletiert, um nicht-absorbierten Phagen zu entfernen. Dann wurden die Zellen in Luria-Medium resuspendiert, und Aliquots mit 108 Zellen wurden auf Luria-Platten, enthaltend 20 µg/ml Tetracyclin, 100 µg/ml Ampicillin und 2,5 mM Natriumpyrophosphat, ausplattiert. Das Tetracylcin selektiert für Tn10, während das Pyrophosphat Magnesium komplexiert, um sekundäre Phageninfektionen zu minimieren. Die Bildung von Lysogenen wird minimiert durch das Inkubieren der Platten bei 42ºC. Tetr-überlebende Zellen entstehen mit einer Frequenz von 10&supmin;&sup7; bis 10&supmin;&sup6;. In einem Experiment, das zum Zwecke der Plasmidmutagenese durchgeführt wurde, werden 10¹&sup0; Zellen mit 10&sup9; Phagen infiziert und 10²-Platten werden ausplattiert. Nach 24 Stunden der Inkubation werden die Kolonien von jeder Platte in 4 ml Luria-Medium suspendiert und auf Eis vereinigt. Nach der Zentrifugation werden die Plasmide aus den Zellen extrahiert unter Anwendung eines Lysozym-Triton-Klarlysatprotokolls, und dann wird Plasmid-DNA durch Ethidiumbromid-Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Nach weiterer Reinigung wird die Plasinid-DNA, zum Transformieren von E. coli LE392 unter Selektion auf Ampr, Tetr verwendet.
Anschließend wird Plasmid-DNA aus jedem Transformanden extrahiert und mit BamHI geschnitten, um die Insertion der X. campestris-DNA oder der Vektor-DNA zu lokalisieren. Solche Plasmide mit inseriertem Tn10 in X. campestris-Sequenzen werden dann in Gum&spplus; X. campestris überführt. Die Selektion auf Tetracyclin-resistente X. campestris aus dieser Paarung führt regelmäßig zur Übertragung der Plasmid-getragenen Tn10-Insertion in das Chromosom von X. campestris über homologe Rekombination, wie oben erläutert. Die phänotypischen Eigenschaften von X. campestris-Stämmen, die diese chromosomalen Insertionen tragen, können dann analysiert werden.
Eine zweite Strategie zum Isolieren von Tn10-Insertionen in vivo wurde ebenfalls angewendet. Diese Strategie verwendete das Plasmid pRK2013::Tn10, beschrieben in Beispiel 1, als Quelle für Tn10. Die Inkompatibilität zwischen dem Ampr-pMW79-Replikon (von pX113) und pRK2013::Tn10 und das Fehlen einer SmaI-Restriktionsstelle in pX113 wurden ausgenutzt. Rifr Ampr E. coli (pX113) wurde mit Rifs E. coli (pRK2013::Tn10) gepaart unter Selektion auf Rifr Ampr Tetr. Die Selektion auf Ampr Tetr durch die Plasmidinkompatibilität sollte Zellen begünstigen, die die Transpositionen von Tn10 auf pX113 unterstützen. Plasmid-DNA wurde aus einem Pool von mehreren tausend Kolonien gereinigt und dann vollständig gespalten mit der Restriktionsendonuklease SmaI. Das Plasmid pRK2013::Tn10 besitzt SmaI-Stellen in dem Vektoranteil des Plasmids, während es in Tn10 keine SinaI-Stellen gibt. Die erhaltene DNA wurde verwendet zum Transformieren eines nativen E. coli zu Ampr Tetr. Nur pX113::Tn10-Plasmide sollten diesen Phänotyp während der Transformation verleihen. Der Plasmidgehalt an Ampr Tetr Transformanden wurde durch BamHI-Restriktionsendonukleasespaltung und Agarosegelelektrophorese analysiert. Einige von ihnen enthielten Inserts von Tn10 innerhalb der clonierten Xanthoronas campestris-Sequenzen. Solche Plasmid-getragenen Insertionsmutationen konnten in das X. campestris-Chromosom über Genaustausch, wie oben beschrieben, eingeführt werden.
Die in vitro-Mutagenese-Experimente wurden ebenfalls so entworfen, um die nützlichen Eigenschaften der Tn10-Tetracyclinresistenzdeterminante auszunutzen. Ein 2,8 kb BglII-Fragment wurde von Tn10 gereinigt. Frühere Arbeit hat gezeigt, daß dieses Fragment das intakte Gen enthält, das das Protein codiert, das die Tetracyclinresistenz verleiht, und ein Gen enthält, das ein Protein codiert, das die Expression des Resistenzgens reguliert. In E. coli muß zumindest dieses regulatorische Gen funktionell sein, damit die Unterschiede zwischen Plasmid-getragener und chromosomal lokalisierter Tetracyclinresistenz beobachtet wird. Das DNA-Fragment von Interesse wurde aus präparativen Agarosegelen durch elektrophoretische Elution der DNA aus Gelstreifen gereinigt (Maniatis et al., 1982). Die eluierte DNA wurde mit Phenol zweimal extrahiert, Ethanol-präzipitiert, mit 70% Ethanol gewaschen, im Vakuum getrocknet und in geeignetem Puffer resuspendiert.
In vitro-Insertionen dieses DNA-Fragments wurden anschließend in BglII- und BamHI-Stellen eingeführt, die innerhalb von clonierter Gummi-Gen-DNA vorhanden sind, die in verschiedenen pMW79-Derivaten vorhanden ist. Zum Herstellen dieser neuen Konstrukte wurde die Tatsache ausgenutzt, daß die cohäsiven Enden von BamHI-gespaltener DNA identisch sind zu den cohäsiven Enden von BglII-gespaltener DNA; deshalb kann BglII-gespaltene DNA in BamHI-Stellen ligiert werden. Plasmid-DNAs wurden mit BamHI in der Anwesenheit von 20 bis 80 µg/ml Ethidiumbromid gespalten. In der Anwesenheit von Ethidiumbromid ist die Aktivität der Restriktionsendonuklease gestört. Das Ergebnis ist, daß diese Spaltung einen hohen Anteil an einmal gespaltenen, linearen Produkten erzeugt. A priori würden man erwarten, daß die BamHI-Stelle, an der geschnitten wird, mehr oder weniger zufällig ausgewählt würde, und in erster Näherung scheint dies so zu sein. Das gereinigte BglII-Tetr-Fragment kann an diese Population an linearen Fragmenten ligiert werden. Die Legierungsprodukte wurden zu- Transformieren von E. coli verwendet, und es wurden Tetracyclin-resistente Transformanden selektiert.
Plasmide wurden von diesem Transformanden extrahiert und durch Restriktionsendonukleasespaltung analysiert. Plasmide, die eine Insertion des BglII Tetr-Fragments in einer BamHI- oder BglII-Stelle tragen, wurden dann mit X. campestris gepaart, und die unterschiedliche Tetracyclinresistenz des chromosomal gegenüber dem Plasmid-getragenen Tetr-Element wurde verwendet zum Identifizieren von homologen Rekombinationsvorgängen, die Genaustausche erzeugen. Unter leichter Modifikation dieser Technologie wurden ebenfalls Deletionsmutationen konstruiert. Wenn die Plasmid-DNAs, die in der Anwesenheit von Ethidiumbromid gespalten wurden, zwei oder mehr Spaltungen durch BamHI erlitten, ging das Segment, das von den zwei gespaltenen Stellen flankiert ist, verloren. Wenn das Tetr BglII-Fragment an solche linearen Plasmidmoleküle ligiert wurde, enthielten die hergestellten Rekombinanten eine Deletion eine Segments der Gummi-Gen-DNA. Plasmide mit Deletionen an Gummi-Gen-DNA wurden bewußt konstruiert durch aneinanderligieren von nicht zusammenhängenden Segmenten der Gummi-Gen-DNA. Wenn das Tetr-BglII-Fragment an der Verknüpfungsstelle zweier solcher clonierter, nicht-zusammenhängender DNA-Segmente des Gummi-Genclusters vorliegt, war es oft möglich, selbst sehr große Deletionen in das Xanthomonas campestris-Genom über Genaustausch einzuführen. Zum Beispiel wurde der Deletionsstamm X1107, bei dem 15 kb der DNA des Gummi-Genclusters deletiert sind, durch diese Technik konstruiert.
Durch die Anwendung von auf einen bestimmten Bereich gerichteter in vivo- und in vitro-Mutagenese-Technologie auf eine Vielzahl subclonierter Segmente der Gummi-Gen-DNA wurden zahlreiche plasmidgetragene Insertionen erhalten, die anschließend zu Tetracyclin-resistenten X. campestris-Derivaten in dem Genaustauschexperiment führten. Eine physikalische Karte einiger dieser Insertionsmutationen ist in Figur gezeigt. Die Southern-Blot-Hybridisierungsanalyse dieser chromosomalen DNAs dieser Genaustauschstämme wurde durchgeführt, um zu bestätigen, daß die Positionen der chromosomalen Insertionen den Positionen der plasmidgetragenen Insertionen, von denen sie stammen, entsprechen. Für diese Experimente wurde gesamte chromosomale DNA aus jedem vermeintlichen Genaustauschstamm hergestellt, wie oben beschrieben. Die gereinigten DNAs wurden mit diagnostischen Restriktionsendonukleasen gespalten; üblicherweise mit BamHI, BglII, EcoRI, HindIII oder PstI oder einigen Kombinationen davon. Die DNA-Spaltungen wurden auf Agarosegelen aufgetrennt, auf Nitrozellulosefilter übertragen und mit radioaktiv markierten Plasmid-DNA-Proben untersucht. Die Autoradiogramme zeigten das Muster der Hybridisierung, die mit Wildtypkontrollen verglichen wird, um auf die Lage und Orientierung der Insertion des Tn10 oder des BglII-Tetr-Fragments zu schließen. Sämtliche dieser Insertionen waren echte Genaustauschstämme. Das heißt, es wurden keine Plasmidsequenzen durch die Hybridisierung nachgewiesen, und die chromosomalen DNAs unterschieden sich von dem Wildtyp durch die angegebene Insertionsmutation und nicht durch weitere offensichtliche Vorgänge. Die Phänotypen sämtlicher dieser Insertionsmutationen wurden untersucht durch in vitro- und/oder in vivo-Verfahren, wie beschrieben in Beispiel 2. Die so identifizierten Phänotypen sind in Fig. 7 angegeben.

Beispiel 8

Dieses Beispiel beschreibt Verfahren, die in Komplementierungsexperimenten verwendet wurden, die die Expression von clonierten biosynthetischen Gummi-Genen, die auf Plasmid enthalten sind, in X. campestris zeigen.
Die Komplementierungsexperimente sind mit Plasmiden durchgeführt worden, die Segmente von Gummi-Gen-DNA und Gum&supmin;-Insertionsmutationen in den Gummi-Gencluster tragen. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Fig. 8 zusammengefaßt. In diesen Experiinenten wurden die Plasmide mit X. campestris-Empfängern gepaart, und sie wurden darin aufrechterhalten unter Verwendung der Selektion auf Streptomycinresistenz. Die Anwesenheit von Plasmid wurde bestätigt durch Herstellen von Plasmid-DNA-Präparationen aus jedem Empfängerstamm und Analysieren der Plasmid-DNA durch Restriktionsendonukleasespaltung und Agarosegelelektrophorese. Plasmid-"curing"-Experimente wurden durchgeführt um zu demonstrieren, daß der Verlust des Plasmids korreliert mit dem Verlust des Gum&spplus;-Phänotyps in komplementierten Stämmen. Im allgemeinen wurden Mutanten komplementiert durch Plasmid-DNAs, die die mutierende Insertionsstelle überspannen. Zum Beispiel komplementierte das Plasmid pX110 X925, X928, X975 und X655 aber nicht den Deletionsmutantenstamm X974. Die Gummi- Gen-DNA, die in Plasmid pX110 enthalten ist, erstreckt sich deutlich über die Insertionsstelle sämtlicher der komplementierten Mutationen hinaus. Jedoch, wie aus Fig. 8 ersichtlich, erstreckt sich die Deletionsmutation in X974 direkt bis zum rechten Endpunkt der clonierten Gummi-DNA, die in pX110 enthalten ist. Es ist deshalb möglich, daß pX110 nicht eine intakte Kopie des Gens trägt, das durch die Deletion in Stamm X974 eliminiert ist. Tatsächlich spricht das Ausbleiben der Komplementierung von X974 durch pX110 für diesen Fall.
Ein überraschendes Ergebnis war das Ausbleiben der Komplementierung von X974 durch pX206. Dieses Plasmid konnte ebenfalls nicht X975 komplementieren, aber dieses clonierte Segment erstreckt sich nur 1,0 kb über die Stelle der X975-Insertion. Es ist vollkommen plausibel, daß ein Element (z. B. ein Promotor), das für die Expression des Gens erforderlich ist, das in X975 mutiert ist, außerhalb des clonierten Segments in pX206 lokalisiert ist. Das Unvermögen von pX206, X974 zu komplementieren, ist überraschender, da die clonierte Gummi-Gen-DNA sich über 4 bis 5 kb über die Mutationsstelle in beiden Richtungen erstreckt. Jedoch war diese spezielle Paarung einzigartig, indem sie eine ungewöhnlich niedrige Frequenz an Plasmidtransfer ergab. Diese Frequenz war drei Größenordnungen niedriger als diejenige, die in sämtlichen anderen Paarungen dieses Satzes an Experimenten beobachtet wurde. Bei allen anderen Paarungen wurde das Plasmid pX206 mit einer höheren Frequenz übertragen, und in allen anderen Paarungen mit X974 als dem Empfänger wurde die höhere Transferfrequenz beobachtet.
Somit kann ein negativer Einfluß vorliegen, der aus der Kombination der speziellen chromosomalen Mutation und dem speziellen clonierten DNA-Segment herrührt.
Die meisten der Komplementierungsergebnisse können in einfacher Weise erklärt werden. Die plasmidgetragenen Gummi-Gene können zumindest in X. campestris exprimiert werden.

Beispiel 9

Dieses Beispiel erläutert das Sequenzieren von DNA aus dem biosynthetischen Gummi-Gencluster.
Die Nukleotidsequenz des clonierten DNA-Segments, enthaltend das Gummi-Gencluster, wird bestimmt mit Hilfe des Dideoxy-Kettenabbruchsequenzierverfahrens, beschrieben von Sanger et al. in Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74: 5463-5468 (1977), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird. Jedes der in dem Gummi-Gencluster enthaltenen BamHI-Fragmente ist (in beiden Orientierungen) in den M13-Clonierungsvektor MP18 oder MP19 cloniert worden. Jedes clonierte Fragment wurde dann subcloniert unter Verwendung des Verfahrens, wie beschrieben von S. Henikoff in Gene 28: 351-359 (1984), der hierin durch Bezugnahme eingeführt wird. Durch Sequenzieren der DNA, die in einem Satz überlappender Subclone enthalten ist, kann eine Nukleotidsequenz für das vollständige clonierte BamHI-Fragment erhalten werden. Bisher ist eine vollständige Sequenz jedes der zwei DNA-Stränge für die 0,3, 1,4, 1,5 und 2,2 kb BamHI-Fragmente ermittelt worden, wie unten gezeigt
Die 0,3, 1,4 und 1,5 kb Fragmente lauten wie folgt:
Die Sequenz des 2,2 kb BamHI-Fragment ist wie folgt:
Der G+C-Gehalt von Xanthomonas-DNA ist relativ hoch (berichtet in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Band 1, (1984) Williams and Wilkins, Baltimore, Maryland, als 65 bis 70 Prozent). Wegen dieses hohen G+C-Gehalts treten auf den Sequenziergelen mit relativ großer Häufigkeit Bandenkompressionen auf. Dieses Problei:i ist auf zwei Wegen angegangen worden: (1) die Nukleotidsequenz stammt von beiden DNA-Strängen, so daß die gesamte Sequenz durch die Komplementarität der Stränge bestätigt werden kann und (2) Desoxyinosin ersetzte Desoxyguanosin, um die Sequenz in Bereichen zu erhalten, wo die Bandenkompression ein akutes Problem darstellt. Angesichts dieser Maßnahmen zum Vermeiden von Fehlern unterliegt die oben gezeigte Sequenz leichten Unsicherheiten aufgrund von primären technischen Schwierigkeiten, die sich aus dem hohen G+C-Gehalt der DNA ergeben.

Beispiel 10

Dieses Beispiel beschreibt das Clonieren eines großen Segments von X. campestris-DNA, das sämtliche DNA enthält, von der bekannt ist, daß sie biosynthetische Gummi-Gene codiert.
Um das Gummi-Gencluster von X. campestris effizient auf alternative Produktionsorganismen zu übertragen, wurde das Gummi-Gencluster im Plasmid pRK290, beschrieben von Titta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 22: 7347-7351 (1980), der hierin durch Bezugnahme eingeführt wird, cloniert. Dieser Plasmidvektor besitzt eine niedrige Kopienzahl, einen breiten Wirtsbereich und kann durch Konjugation von E. coli auf eine große Vielzahl gramnegativer Bakterien übertragen werden. Es wurde gefunden, daß das Restriktionsenzym DraI in keiner der clonierten X. campestris-DNA der Gummiregion spaltet, aber es spaltet mehrere Male in dem Lambda-Clonierungsvektor, der zur Konstruktion der X. campestris-Genbank verwendet wurde. Die Spaltung von rekombinanter Bakteriophagen-DNA mit DraI erzeugt deshalb mehrere DNA-Segmente, von denen eines das vollständige X. campestris-Insert und eine relativ kleine Menge an Lambda-DNA (ungefähr 3 kb), an jedem Ende daran fusioniert, enthält. Deshalb wurde entschieden, eine Lamda-Rekombinante zu wählen, die sämtliche X. campestris-DNA enthält, von der angenommen wird, daß sie die Gummi-Gene enthält, zum Reinigen einer großen Menge an dieser Phagen-DNA, zum Spalten der DNA mit DraI und zum Reinigen und anschließenden Clonieren des Restriktionsfragments, das die X. campestris-Insert-DNA enthält.
Durch Isolieren eines jeden Lambda-Phagen, der Gummi-Gen-DNA enthält, wurde für jeden Phagen eine BamHI-Restriktionskarte erstellt. Als ein Ergebnis der Mutationsanalyse entwickelte sich ein Bild davon, welche Segmente der clonierten DNA Gummi-Gene trugen. Es wurde angenommen, daß Lambda 655 (L'), in Fig. 2 gezeigt, das vollständige Gummi-Gencluster enthielt. Deshalb wurde dieser Phage ausgewählt für die anfänglichen Clonierungsbemühungen. Unter Einsatz von Standardtechniken wurde ein Lysat von Lambda 655 (L') in großem Maßstab (1 Liter) hergestellt. Dieses Lysat ergab insgesamt ungefähr 8 · 10¹¹ Phagenpartikel. Die Phagenpartikel wurden durch Polyethylenglycolpräzipitation und CSCI-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Phagen-DNA wurde aus den verschiedenen Viruspartikeln extrahiert, und es wurde eine Ausbeute von ungefähr 225 µg erhalten.
Ungefähr die Hälfte der gereinigten Lambda 655 (L') DNA (120 µg) wurden mit EcoRI-Methylase und BamHI-Methylase behandelt. Diese Enzyme erkennen und modifizieren, d. h. methylieren, die Nukleotidsequenzen, die von den entsprechenden Restriktionsendonukleasen erkannt und gespalten werden. Die Methylierung macht die Sequenzen: widerstandfähig gegen die Spaltung durch die Endonuklease. Die Methylierung erlaubt die Verwendung von BamHI- und EcoRI-Oligonukleotidlinkern an den Enden des DraI-Fragments, das glatte Enden aufweist und deshalb ein schlechtes Substrat in Legierungsreaktionen darstellt. Der Erfolg der Methylierungsreaktion wird verfolgt durch Analysieren der anschließenden Resistenz von Lamda 655 (L') DNA gegenüber der Spaltung durch EcoRI und BamHI. Die methylierte DNA wurde nicht wahrnehmbar gespalten durch einen ungefähr 20-fachen Überschuß an jedem Enzym in einer zweistündigen Spaltung.
Ungefähr 100 µg methylierter DNA wurden dann vollständig mit DraI gespalten, und ungefähr 80 µg dieser DNA wurden dann in einer Legierung mit 8 bp BamHI-Oligonukleotidlinkern umgesetzt. Der Linker ist eine kleine doppelsträngige DNA mit glatten Enden, die an die glatten DraI-Enden in einer Reaktion unter Verwendung von hohen DNA-Konzentrationen und ungefähr 100-fachem molarem Überschuß an Linkerfragment gegenüber dem DraI-Fragment von Lambda 655 (L') ligiert wird. Die ligierten Linkerfragmente können anschließend mit BamHI gespalten werden, um überhängende Enden zu erzeugen, die geeignet sind zum Clonieren in BamHI-gespaltene Vektor-DNA. Jedoch wird vor der BamHI-Spaltung die DNA fraktioniert durch eine Sedimentation durch einen Sucrosegradienten. Der Zweck der Fraktionierung über die Sucrose ist zweifacher Art. Erstens, eine große Anreicherung des 20 kb-Fragments kann erreicht werden, obwohl die Auftrennung der Sucrosegradienten-Sedimentation nicht die absolute Aufreinigung des 20 kb-Fragments von den anderen DraI-Fragmenten erzielt. Zweitens, die nicht-ligierten BamHI-Linkermoleküle können entfernt werden, da diese kleinen DNA-Fragmente im wesentlichen nicht in den Gradienten eintreten. Somit sind die Gradientenfraktionen enthaltend das 20 kb DraI-Fragment für die praktischen Zwecke vollständig frei an Linker-DNA. Dies ist wichtig, da die Linker-DNA potentiell die anschließende Spaltung und/oder Legierungsschritte beeinträchtigen kann. Die DraI-Spaltung wurde über einen 5 ml 5% bis 20% Sucrosegradienten zentrifugiert.; Fraktionen (ungefähr 250 µl) wurden gesammelt und analysiert durch Laufenlassen eines Aliquots einer jeden Fraktion auf einem Agarosegel. Fraktionen, die den Großteil des 20 kb-DraI-Fragments enthalten, wurden vereinigt, Ethanol-präzipitiert, resuspendiert in Puffer und für die weitere Verwendung aufbewahrt.
Das 20 kb DraI-Fragment wurde dann mit BamHI gespalten, um die angefügten Linkermoleküle zu Spalten und einzelsträngige DNA-Enden zu erzeugen, die für die Clonierung geeignet sind. Das Plasmid pRK290 wurde mit BglII gespalten, das einzelsträngige DNA-Enden erzeugt, die identisch sind zu den BamHI-Enden. Die Legierungsreaktion wurde durchgeführt in 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl, 20 mM Dithiothreotol und 1,0 mM ATP. Die 20 41 Reaktion enthielten 0,2 µg pRK290 (gespalten mit BglII) und 0,1 µg 20 kb DraI-Fragment (gespalten mit BamHI) und wurde katalysiert durch T4-DNA-Ligase (6 Weiß Einheiten). Die Reaktion wurde über Nacht (ungefähr 18 Stunden) bei 12ºC durchgeführt.
Die Produkte der Legierungsreaktion wurden dann zum Transformieren von E. coli verwendet. Tetracyclin-resistente Transformanden wurden selektiert und dann auf die Anwesenheit von rekombinanten Plasmiden, enthaltend das clonierte Gummi-Gencluster, abgesucht. Dieses Screening wurde bewerkstelligt durch Paaren einzelner Tetracyclin-resistenter Transformanden mit einem X. campestris-Stamm, enthaltend eine Gum&supmin;-Mutation (in dem Gummi-Gencluster), Selektieren auf den Konjugationstransfeder Tetracyclinresistenz in X. campestris und optisches Einschätzen des erhaltenen Gum-Phänotyps. Die meisten Paarungen erzeugten Gum&supmin;-Tetr-X. campestris, aber eine kleine Zahl erzeugte Tetr-Kolonien, die sehr mucoid zu sein schienen. Die Analyse von Plasmiden, die in E. coli-Plasmiddonoren in diesen Paarungen enthalten waren, zeigten die Anwesenheit von rekombinanten Plasmiden, die sich aus pRK290 und der eingefügten DNA des Gummi-Genclusters zusammensetzte.
Fünf rekombinante Plasmide sind analysiert worden. Gereinigte Plasmid-DNAs wurden hergestellt durch CsCl-Dichtegradientenzentrifugation und wurden analysiert durch BamHI-Spaltung und Agarosegelelektrophorese. Die erzeugten Restriktionsfragmente wurden mit den BamHI-Spaltungsprodukten von Lambda 655 (L') verglichen. Der Vektor pKR290 besitzt keine BamHI-Stellen (das DraI-Fragment, das die BamHI-Linker an seinen Enden trägt, wurde in eine BglII-Stelle cloniert), und der Lambda Phage 655 (L') enthält keine BamHI-Stellen außerhalb der clonierten X. campestris-DNA. Deshalb sollte die BamHI-Spaltung identische Sätze an X. campestris-DNA-Fragmenten erzeugen. Jedoch enthielten nur zwei pRK290-Derivate (H627 und H806), sämtliche der BamHI-Fragmente, die in Lambda 655 (L') gefunden werden. Die anderen drei Rekombinanten enthielten jeweils einen einzigartigen und zusammenhängenden teilweisen Satz dieser BamHI-Fragmente. Die wahrscheinlichste Erklärung für diese verkürzten Clone ist, daß die Methylierung der BamHI-Stellen (ein Schritt bei der Präparation der DraI-Fragmente für die Clonierung) unvollständig war. Das heißt, eine kleine Fraktion der BamHI-Stellen war nicht methyliert und deshalb nicht gegen die anschließende BamHI-Spaltung geschützt, die verwendet wurde zum Spalten der angefügten Linker. Wenn beispielsweise 5% der BamHI-Stellen ungeschützt wären, würden 40% der DraI-Fragmente eine unmethylierte BamHI-Stelle enthalten. Die anschließende BamHI-Spaltung würde diese Stellen spalten und eine Familie an verkürzten Fragmenten erzeugen, die in pRK290 cloniert werden könnten. Der Test für die BamHI-Methylierung, der verwendet wurde zum Kontrollieren der anfänglichen Reaktion, hätte einen Spiegel an 5% unmethylierten BamHI-Stellen nicht nachgewiesen. Die unvollständigen Clone sind vermutlich wie oben beschrieben entstanden. Auf alle Fälle sind die Strukturen der fünf erhaltenen Clone in Fig. 9 gezeigt.

Beispiel 11

Dieses Beispiel zeigt unter Verwendung von immunologischen Assays, daß die Enzyme, die durch das biosynthetische Gummicluster codiert werden, nur in geringen Mengen in X. campestris vorliegen.
Proteine wurden mit Hilfe der Technik der zweidimensionalen Elektrophorese dargestellt. Wildtyp X. campestris wurde mit einem X. campestris-Stamm verglichen, der keinen Zuckernukleotidvorläufer synthetisieren kann, aber der Xanthan in vitro synthetisieren konnte. Diese zwei Stämme enthalten biosynthetische Enzyme für Gummi. Das Protein, das als UDP-Glukose-Dehydrogenase vorgeschlagen worden war, fehlte dem Muster des zweiten Stamms. Ein X. campestris-Stamm, dem das vollständige biosynthetische Gummi-Cluster deletiert worden war, wurde auch analysiert. Mehrere Proteine fehlten den Extrakten aus dem deletierten Stamm. Die Intensität der Flecken, von denen angenommen wurde, daß sie den biosynthetischen Enzymen für Gummi entsprechen, war sehr niedrig.
Zusätzliche Daten werden bereitgestellt. Eine Insertionsmutation in dem zentralen Bereich des 2,2 kb BamHI-Fragments erzeugt eine Gum&supmin;-Mutante, die einen Mangel hinsichtlich der Transferase III-Aktivität aufweist. Diese Insertion befindet sich an der BglII-Stelle nahe der Position 1132 in der DNA-Sequenz des 2,2 kb-BamHI-Fragments. Die DNA-Sequenz zeigt ein großes offenes Leseraster (ORF) an, das in diesem Bereich der Sequenz vorliegt. Das vermutete Proteinprodukt mit Transferase III-Aktivität beginnt mit dem ATG-Startkodon ungefähr bei Position 738. Acht Basenpaare stromaufwärts von dem Startkodon befindet sich eine Ribosomenbindungsstelle (AGGAGA). Der ORF erstreckt sich deutlich über die BglII-Stelle hinaus, wo die Insertionsmutation, die die Transferase III-Aktivität definiert, lokalisiert ist.
Peptide, die mehreren Regionen der vorhergesagten Proteinsequenz entsprechen, wurden ausgewählt hinsichtlich ihrer vorhergesagten Immunogenizität anhand eines Hydrophilizitätsplots, der dem Fachmann bekannt ist und von Hopp and Woods entwickelt und in dem Artikel mit dem Titel "Prediction of Protein Antigenic Determinants from Amino Acid Sequences" in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 78, Nr. 6, Seiten 3824-3828, Juni 1981, beschrieben wurde, das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird. Die ausgewählten Peptide und ihre Lage in dem 2,2 kb BamHI-Fragment ist in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Peptide für die Antiserum-Herstellung ausgewählt aus dem 2,2 kb BamHI-Fragment ungefähre Lage in dem 2,2 kb-Fragment (erstes bp) Synthetische Peptide (13 Reste)
Die Peptide wurden durch die Festphasenpeptidsynthese synthetisiert, an Rinderserumalbumin konjugiert und zum Immunisieren von Kaninchen verwendet. Nach vier Iminunisierungen wurde von den Hyperimmunseren durch ELISA (enzymgekoppelter Immunabsorptionsassay), der auf auf diesem Gebiet weit verbreitet ist und hierin als Referenz Eva Engvall erwähnt wird, Methods in Enzymology, Band 70, Seiten 419-439, 1980, "Enzyme Immuno-Assay ELISA and EMIT", festgestellt, daß sie ansehnliche Titer an Antikörpern enthielten, die gegen die immunisierenden Peptide gerichtet waren.
Diese spezifischen Antikörper reagierten auch mit einem 40 kD-Protein, codiert durch das 2,2 kb BamHI-Fragment, auf Western-Immunblots, wie beschrieben von Towbin, H., Staehelin, T. und Gordon, J. in "Electrophoretic Transfer of Proteins from Polyacrylamide Gels to Nitrocellulose Sheets: Procedure and Some Applications", Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76: 4350-4354, (1979), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird, von Zelllysaten von X. campestris S4-L. Das Protein kam nicht vor in Zellysaten von X1107, dem Stamm mit der deletierten Gummi-Cluster-DNA, oder von X928, einem Stamm mit einer Mutationsinsertion in dem 2,2 kb BamHI-Fragment. Dieses 40 kD-Protein ist nicht sichtbar in S4-L durch die weniger sensitive Methode der direkten Färbung des Proteins in dem Gel mit Coomassie-Blau; somit macht dieses biosynthetische Gummiprotein einen geringen Prozentsatz des gesamten Zellproteins aus. Es scheint, daß eine niedrige Expression des biosynthetischen Gummiproteins ausreichend ist für die Xanthangummierzeugung in S4-L.

Beispiel 12

Dieses Beispiel diskutiert die spezifischen Zuckernukleotidpools, die in verschiedenen X. campestris-Stämmen identifiziert wurden, die Gum in vivo sind, und in Bakterien, die als alternative Wirte in Betracht kommen.
Mehrere Gum&supmin;-Stämme konnten Xanthan in vitro erzeugen, wenn sie mit den Zuckernukleotiden UDP-Glukose, GDP-Mannose und UDP-Glukuronsäure versorgt wurden. Diese Mutanten besaßen vielmehr einen Defekt in der Zuckernukleotidsynthese als in der Biosynthese von Xanthan selbst. Anschließend wurde von solchen
Mutanten gefunden, daß sie sensitiv sind gegenüber dem Farbstoff Toluidin-Blau. Weitere Zuckernukleotidmutanten wurden erhalten durch Absuchen von anderen Gum&supmin;-Stämmen nach Toluidin- Blau-Sensitivität.
Das folgende Verfahren wurde angewendet zum Identifizieren der spezifischen Zuckernukleotiddefekte in Stämmen, die Gum&spplus; in vitro aber Gum&supmin; in vivo waren. Eine isolierte Kolonie von jedem Stamm wurde abgenommen und in 10 ml YM-Medium (3 g Hefeextrakt, 3 g Malzextrakt und 5 g Pepton pro Liter) mit 2% Glukose in einem 125 ml-Erlenmeyerkolben inokuliert. Die Kulturen wurden bei 30ºC, 250 Upm, für 24 Stunden bis zur Trübung inkubiert. Fünf Prozent des Inokulums wurden aus dem YMG-Medium in ein Mineralsalzmedium mit Glukose als der Kohlenstoffquelle überführt und bei 30ºC für 24 Stunden kultiviert. Die Kulturen wurden durch Zentrifugation geerntet, zweimal mit Salzen gewaschen und in einem Volumen resuspendiert, das ausreichte, um eine Absorption von 100 bei 600 nm zu ergeben. Analysenproben, 1,5 ml, wurden in 50 ml-Erlenmeyerkolben, enthaltend ausreichend Glukose, um die Konzentration auf 20 mM zu bringen, eingebracht. Jede Analysenprobe wurde in einem 30ºC-Wasserbad bei 400 Upm für 10 Minuten inkubiert, dann wurde 1 ml entfernt und zu 0,1 ml 11 N Essigsäure in einem Eppendorf-Zentrifugengefäß zugesetzt. Das Gefäß wurde verschlossen, der Inhalt für 5 Sekunden auf einem Vortex-Mischer gemischt, dann wurde das Gefäß in ein Trockeneisalkoholbad eingebracht. Nachdem alle Analysenproben verarbeitet worden waren, wurden die Gefäße aus dem Trockeneisbad entfernt, bei Raumtemperatur aufgetaut und für 5 Minuten zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu pelletieren. Die Überstände wurden in vorgekühlte 15 ml konische Zentrifugengefäße eingeführt und wieder in einem Trockeneis-Alkohol-Bad eingefroren. Gefrorene Analysenproben wurden in einen Lyophilisator eingebracht und bis zur Trockne getrocknet. Die Inhalte eines jeden Gefäßes wurden in 0,2 ml HPLC-Puffer, 40 mM Phosphorsäure, eingestellt mit Triethylamin (Aldrich) auf pH 6,5, gelöst. Die Analysenproben wurden durch 0,45 µm-Filter in Analysenprobenmikrogefäße filtriert, dann analysiert durch Einspritzen auf eine 4,6 mm · 250 mm C18-Umkehrphasen-Ionenpaarsäule, 40ºC, einer Flußrate von 0,8 ml/min. Zuckernukleotide wurden identifiziert durch Vergleich der Retentionszeiten mit denen von Standards, die unter den gleichen Bedingungen laufengelassen wurden, und durch Untersuchen der Spektren der Verbindungen, die in der Region von Interesse eluierten.
Es wurden vier Klassen an Zuckernukleotidmutanten von X. campestris unter Verwendung dieses Verfahrens identifiziert:
(1) Mutanten, die UDP-Glukose und UDP-Glukuronsäuren nicht synthetisieren können;
(2) Mutanten, die GDP-Mannose nicht synthetisieren können;
(3) Mutanten, die UDP-Glukose synthetisieren, aber UDP-Glukuronsäure nicht synthetisieren können; und
(4) Mutanten, die UDP-Glukose, GDP-Mannose und UDP-Glukuronsäure nicht synthetisieren können.
Extrakte aus Wildtypstämmen von X. campestris besaßen alle die Zuckernukleotide, die für die Xanthan-Biosynthese erforderlich sind. Gum&supmin;-Mutanten, die einen Defekt in dem Xanthan-Biosynthese-Reaktionsweg selbst aufweisen, besaßen höhere Konzentrationen der Zuckernukleotidvorläufer als die Wildtypzellen. Diese Daten zeigen an, daß die Geschwindigkeit der Xanthansynthese in den Wildtypkulturen durch die Bereitstellung der Zuckernukleotidvorläufer limitiert sein kann.
Die Zuckernukleotide in Paracoccus denitrificans (ATCC 17741), Pseudomonas stutzeri (ATCC 17588) und Pseudoromas perfectomarina (ATCC 14405) wurden analysiert unter Verwendung der für X. campestris entwickelten Verfahren. Alle Organismen wurden für 12 Stunden in DENITE-Medium, einen Mineralsalzmedium, mit 2% Glukose als der Kohlenstoffquelle kultiviert. Die Zellen wurden gesammelt, gewaschen und resuspendiert auf eine Absorption von 100 bei 600 nm. Die Zellpellets besaßen eine Pinkfarbschattierung, die typisch ist für denitrifizierende Bakterien, die eine dereprimierte Synthese der Cytochrome besitzen, die für das anerobe Wachstum (eine typische Antwort auf die Sauerstoffbeschränkung während des Wachstums) erforderlich sind. Demzufolge wurde 25 mM Nitrat als ein zusätzlicher Elektronenakzeptor in die Inkubationsmischungen eingeführt. Die Zellsuspensionen wurden mit 20 mM Glukose für 5 Minuten mit und ohne Nitrat inkubiert, dann mit Ameisensäuren extrahiert. Die Extrakte wurden lyophilisiert, aufgelöst in TEA-Phosphatpuffer und analysiert durch HPLC. Paracoccus denitrificans besaß UDP-Glukose und GDP-Mannose, aber nicht nachweisbare Mengen an UDP-Glukuronsäure, wie durch die Spektren der Peaks in der Region von Interesse verifiziert. Ähnlich besaß Pseudomonas perfectomarina und Pseudomonas stutzeri UDP-Glukose und GDP-Mannose. UDP-Glukuronsäure wurde nicht in Extrakten dieser Organismen nachgewiesen.

Beispiel 13

Dieses Beispiel zeigt, daß mehrere biosynthetische Enzyme für Gummi in dem alternativen Wirt E. coli exprimiert worden sind.
Viele DNA-Fragmente des Gummi-Clusters sind in den Expressionsvektor pp3 cloniert worden, der von der Plasmid pKO-1 konstruiert worden war. Dieses Plasmid wurde beschrieben von K. McKenny et al. in Gene Amplification and Analysis, Band II Elsevier, North Holland, Seite 383, 1981, das hierin durch Bezugnahme einbezogen wird.
Das 2,2 kb BamHI-Fragment des Gummi-Clusters, das Transferase III codiert, wurde in pp3 cloniert, wobei dies zu pJP1 führte. E. coli JM105, transformiert fit pJP1, wurde in reichem Medium kultiviert, induziert mit IPTG (10&supmin;³ M) und nach 3 Stunden bei 37ºC durch Zentrifugation geerntet. Ein Zellysat wurde hergestellt durch zweimaliges Durchleiten durch eine French-Preßzelle bei 18000 psi und auf einem 10% SDS-Acrylamidgel laufengelassen, um die Proteine nach dem Molekulargewicht zu trennen. Diese Proteine wurden mit Antikörpern, die spezifisch für die Transferase III sind, nach der Western-Immunblot-Technik behandelt. Das Zellysat von JM105 (pJP1) zeigte eine bestimmte Bande für das 40 kD-Protein. Das ähnlich behandelte E. coli-Zellysat mit pp3 ohne ein Insert zeigte das 40 kD-Protein nicht. Selbst in den IPTG induzierten JM105(pJP1)-Zellen war das 40 kD-Protein der clonierten X. campestris-DNA nicht durch Coomassie-Blau-Färbung sichtbar und stellte somit einen kleinen Prozentsatz des gesamte Zellproteins dar. Wenn die Elektroblots von E. coli JM105 (pJP1) mit den affinitätsgereinigten Antikörpern behandelt wurden, reagierten die Antikörper einzig und allein mit Transferase III. Das biosynthetische Gummi-Gen wurde zweifelsfrei in E. coli JM105 exprimiert.
Ein weiterer Hinweis ergibt sich aus der Expression von Fragmenten des biosynthetischen DNA-Clusters für Gummi, die in pp3 cloniert wurden, die zur Transformation von E. coli FD1098 (F'lacIQ) verwendet wurden. FD1098 ist ein Stamm, der bei einer ungleichmäßigen Zellteilung Minizellen abgibt, die keine chromosomale DNA enthalten, aber die Kopien des von pp3 abstammenden Plasmids enthalten. Die Verwendung von Minizellen zur Analyse der Genexpression wird beschrieben von J.E. Clark-Curtiss und R. Curtiss in Methods in Enzymology 101: 347-362 (1983), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird. Nachdem die Minizellen von den vollständigen Zellen durch Zentrifugation durch eine Reihe von Sucrosegradienten abgetrennt worden sind, werden die Minizellen mit IPTG induziert, und sie werden radiomarkiert, während sie Proteine exprimieren, die durch das von den pp3 stammenden Plasmid codiert werden. Die Minizellen werden geerntet, auf einem 10%-SDS-Acrylamidgel laufengelassen, und die exprimierten Proteine werden durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Die biosynthetische DNA für Gummi codierte deutlich mehrere Proteine, die durch dieses Verfahren sichtbar gemacht wurden. Ein Protein von 40 kD wurde wiederum in E. coli gesehen, und es war abhängig von der Anwesenheit des 2,2 kb BamHI-Fragments. Ein Protein von 47 kD Molekulargewicht wurde von dem 3,5 kb BamHI-Fragment codiert. Ein Protein von 27 kD wird von der X. campestris-DNA codiert, die die 3,5 und 1,35 kb-BamHI-Fragmente überspannt. Der Hinweis auf weitere biosynthetische Gummi-Proteine in E. coli-Minizellen ist vorläufig. Die Expression der Gummi-Cluster-DNA ist niedrig in dem alternativen Wirt E. coli, wie dies für X. campestris gilt.

Beispiel 14

Dieses Beispiel betrachtet die Mittel zum Erzielen der Genexpression in einem alternativen Wirt.
Es ist denkbar, daß das Gummi-Cluster an biosynthetischen Genen, wenn es in einen alternativen Wirt eingeführt wird, es entweder nicht Transkriptions-aktiv oder Translations-aktiv ist. Es ist auch denkbar, daß einige, aber nicht alle der biosynthetischen Gene exprimiert werden. Mit Nukleinsäureproben und Antikörpern, die gegen die Proteine gerichtet sind, die durch das Gummi-Cluster codiert werden, kann die Transkription und Translation sämtlicher Gene innerhalb des Clusters gemessen werden.
Wenn einige oder sämtliche der Gene nicht transkribiert werden, werden regulierbare Promotoren dem Cluster in geeigneten Positionen angefügt. Die RNA-Polymerasen der Eubakterien sind sehr ähnlich, einschließlich derjenigen von gramnegativen und grampositiven Arten. Die DNA-Sequenzen, die die Initiation der Transkription ermöglichen, sind ausreichend verstanden für einen Fachmann, damit solche Promotoren mit Leichtigkeit eingeführt werden können.
Ähnlich sind ribosomale Bindungsstellen (die zur Initiation der Translation verwendet werden) bei grampositiven und gramnegativen ausreichend verstanden, um die Translation einer beliebigen mRNA, die transkribiert worden ist, zu erzielen. Unter Verwendung von Standardverfahren der zielgerichteten Mutagenese kann ein beliebiges Gummi-Cluster-Enzym, das in ungeeigneter Weise relativ zu seiner Expression in dem Wildtyp X. campestris exprimiert wird, so verändert werden, daß es die richtigen Produkte in dem alternativen Wirt liefert.

Beispiel 15

Dieses Beispiel beschreibt die gesteigerte Thermostabilität der Enzyme für biosynthetischen Gummi.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die Verwendung von Organismen als potentielle alternative Wirte, die oberhalb 30ºC wachsen. Die Xanthan-Biosynthese erfolgt in X. campestris optimalerweise bei Temperaturen zwischen 27º und 30ºC. Falls die an der Gummi-Biosynthese beteiligten Enzyme oberhalb 30ºC nicht gut arbeiten, aber exprimiert werden, werden die Enzyme zu thermostabilen Varianten abgeändert, wie beschrieben in Liao et al. in der USSN 793 475, mit dem Titel "Method for the Generation and Detection of Enzyine Variants with Enhanced Thermostability and Activity", eingereicht am 28.10.1985 als eine Continuation der USSN 532 765, eingereicht am 16.09.1983, die hierin durch Bezugnahme eingeführt werden. Einzelne Aminosäuresubstitutionen in einem Protein können die maximale Temperatur um mehr als 10ºC erhöhen, bei der ein Enzym arbeitet. Die hierin beschriebenen Gensequenzen erlauben solche Austausche leicht.

Beispiel 16

Dieses Beispiel beschreibt zusätzliche Verbesserungen, die es einem alternativen Wirt erlauben, Polysaccharide zu synthetisieren.
Alternative Wirte, die die biosynthetischen Gummi-Gene enthalten und die die Transkription und Translation dieser Gene durchführen können, können möglicherweise überhaupt kein Polysaccharid oder nicht mit einer signifikanten Rate erzeugen.
Die ersten Experimente, falls dies auftritt, beschäftigen sich mit dem Ausmaß und der potentiellen Syntheserate der Zuckernukleotidvorläufer (UDP-Glukose, UDP-Glukuronsäure und GDP-Mannose). Clonierte Gene für die Schlüsselenzyme des Zuckernukleotidreaktionsweges sind von X. campestris erhältlich unter Verwendung der von Betlach et al., siehe oben, beschriebenen Verfahren. Falls ein spezieller Zuckernukleotidpool zu niedrig ist für eine angemessene Polysacchariderzeugung, werden die geeigneten X. campestris-Gene dem alternativen Wirt zugesetzt. Der alternative Wirt kann dann angemessene Polysaccharide herstellen oder die Rate kann niedrig bleiben.
Falls die Rate der Polysaccharidsynthese niedrig bleibt, wird die zweite Verbesserung versucht durch Absuchen sämtlicher anderer Regionen des X. campestris-Genoms nach Genen, die es dem Gummi-Gencluster und, falls erforderlich, dem Zuckernukleotidreaktionsweg ermöglichen so zu arbeiten, daß Polysaccharid hergestellt wird. Eine Bank aus X. campestris genomischen Fragmenten, wie in Beispiel 3 erzeugt, mit ca. 20000 Basenpaaren in der Länge, werden per Konjugation nach Standardtechniken, wie beschrieben von Titta et al., den alternativen Wirten zugeführt, die sämtliche Gene des Gummi-Clusters und Zuckernukleotidgene enthalten, aber immer noch kein Polysaccharid herstellen. Die Empfänger dieser Bank werden auf Petrischalen auf mucoide Kolonien hin beobachtet; bakterielle Kolonien, die Polysaccharid erzeugen, können leicht von solchen unterschieden werden, die dies nicht tun. Selbst dicht bewachsen, können Petrischalen mit 10³ Bakterienkolonien leicht beobachtet werden. Nur eine kleine Anzahl an Empfänger muß beobachtet werden (weniger als 10³), um zu sehen, ob ein beliebiges weiteres Gencluster, das auf einem X. campestris-DNA-Fragment vorliegt, das fehlende Genprodukt bereitstellen wird, das für die Polysacchariderzeugung erforderlich ist.
Wenn mit diesem Experiment ein Polysacchariderzeuger nicht bereitgestellt werden kann, wird die gesamte Sammlung der alternativen Empfängerwirte (die jetzt die gut exprimierten biosynthetischen Gummi-Gene, die fehlenden Zuckernukleotidenzyme, falls erforderlich, und eine zufällige Sammlung von DNA-Fragmenten mit 20000 Basenpaaren aus X. campestris enthalten) mutagenisiert mit Chemikalien, die Basenpaarsubstitutionen verursachen (wie beispielsweise Nitrosoguanidin, 2-Aminopurin oder Ethylmethansulfonat). Mutagenisierte Bakterien werden auf Agarmedium ausplattiert, damit die mucoiden Kolonien beobachtet werden können. Mucoide Kolonien sind als sehr seltene Revertanten bei einigen Transposoninduzierten Gum&supmin;-Mutationen von X. campestris gefunden worden. Mehr als 108 mutagenisierte Kolonien eines beliebigen alternativen Wirts werden auf Polysacchariderzeugung hin abgesucht.
Die Wahl von alternativen Wirten braucht nicht auf einige bessere Kandidaten eingeschränkt zu werden. Plasmid pRK290-H336 besitzt einen breiten Wirtebereich und kann durch Konjugation auf eine große Anzahl von potentiellen alternativen Erzeugerstämmen übertragen werden. Ähnliche Konstrukte, die das bzw. die biosynthetische(n) Enzym(e) für Zuckernukleotide tragen, werden so hergestellt, daß viele alternative Wirte ausprobiert werden können. Bisher ist pRK290-H336 in die potentiellen Produzentenstämme Pseudomonas putids, Pseudomonas cepacis, Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas stutzeri, Escherichia coli und Enterobacter cloacae übertragen worden.
Eine Strategie zur Auswahl alternativer Wirte wäre, ein Bakterium auszuwählen, von den bekannt ist, daß es extrazelluläre Polysaccharid-Biosynthese durchführen kann. Solche Stämme können leicht mutiert werden, um die endogene Polysaccharid-Biosynthese zu hemmen, bevor pRK290-H336 in den Stamm eingeführt wird. Solche Stämme könnten wichtige Genprodukte enthalten, die mit den biosynthetischen Gummi-Enzymen von X. campestris und/oder biosynthetischen Zwischenprodukten interagieren könnten, um die Polysaccharidsynthese und -sekretion zu ermöglichen. Da die Plasmidtransfer-Experimente so einfach sind, können Wirte mit breitstreuenden Eigenschaften ausgetestet werden, um Gummi herzustellen.
Die vorgeschlagene Erfindung umfaßt einen alternativen Wirt, der Polysaccharid erzeugt, in dem das Gummi-Gencluster für biosynthetische Enzyme, die Gene, die die Biosynthese der geeigneten Zuckernukleotide bereitstellen, und ein zufälliges X. campestris-DNA-Fragment vorliegen. Weiterhin kann der Stamm eine Anzahl an Basenpaarsubstitutionsmutationen aus den letzten Schritt der Stammverbesserung enthalten. Der alternative Wirt wird erfolgreich geheilt durch Standardtechniken durch das zufällige X. campestris-DNA-Fragment und das biosynthetische Zuckernukleotidgen. Falls die Polysacchariderzeugung unverändert bleibt, werden diese DNA-Fragmente nicht in den alternativen Wirtsproduzentenstämmen verwendet.
Schließlich wird der erfolgreiche alternative Wirt in Kombination mit solchen Mutationen in dem biosynthetischen Gummi-Cluster verwendet, die die Synthese eines varianten Polysaccharids verursachen. Somit wird der alternative Wirt, mit seiner Kombination aus Vorteilen hinsichtlich der metabolischen Rate, der Wachstumstemperatur und dem aneroben Metabolismus verwendet, um Xanthangummi und die Xanthanvarianten von Vanderslice et al. und Coherty et al. und beliebige weitere Exopolysaccharide herzustellen.

Beispiel 17

Dieses Beispiel beschreibt die Herkunft der Nukleotidsequenz für einen 16 kb-Abschnitt von genomischer Xanthomonas-DNA, die ein Gencluster enthält, das an der Xanthangummi-Biosynthese beteiligt ist. Ein Teil der DNA-Sequenz (d. h. die Sequenz des 0,3, 1,4, 1,5 und 2,2 kb BamHI-Fragments), die hier dargestellt wird, wurde zuvor in der Patentanmeldung von Capage et al. mit dem Titel "Recombinant-DNA Mediated Production of Xanthan Gum", eingereicht am 26.03.1986, beschrieben. Die frühere Sequenz ist modifiziert (berichtigt) worden durch jüngere Ergebnisse, die sich aus Sequenzierreaktionen ableiten, die Desoxyinosin verwenden, um Bereiche der Bandenkompression auf den Sequenziergelen aufzulösen. Dieses Beispiel zeigt auch, wie eine geeignete Analyse der DNA-Sequenz die Struktur und die Organisation der Gummi-Gene aufklärt.
Die vollständige Nukleotidsequenz für das gesamte 16 kb-Segment an DNA wird in einem Doppelstrangformat in Fig. 10 dargestellt. Der obere Strang der Sequenz wird von 5' nach 3' in der Links-nach-rechts-Richtung der BamHI-Restriktionskarte, gezeigt in Fig. 4, gelesen. Die Computertechnik (Rasteranalyse), beschrieben van Bibb et al. in Gene 30: 157-166 (1984), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird, wurde verwendet zum Bestimmen der G+C-Verteilung an jeder der drei Nukleotidpositionen, die die drei möglichen Leseraster der Sequenz in jeder Richtung definieren. Diese Ergebnisse der Rasteranalyse zeigten, daß die gesamte DNA in der Links-nachrechts-Richtung transkribiert wird. Somit ist der obere Strang der in Fig. 10 gezeigten Sequenz die Sequenz des codierenden Strangs (d. h. die Sequenz der mRNA mit T ersetzt für U). Die genaue Lage der durch die Sequenz definierten Gene kann aus den in Tabelle 3 gezeigten Daten erhalten werden. Tabelle 3 Protein BamIII-Fragment Lage Anfang (BP-Zahl) Ende Leseraster Mutanten-Phänotyp Funktion Molekular-Gew. Gum kein Belader (letal) nicht bekannt letal keine Acetylierung Acetylase Mucoid-Gum Cellobiose Transferase III vermutlich Transferase I möglicherweise letal Trimer Transferase IV keine Pyruvylierung Ketalase Glukose
Einen Überblick über die Organisation und Struktur der in dem 16 kb DNA-Segment enthaltenen Gene ist in Fig. 11 gezeigt. Die obere Linie in der Figur stellt eine BamHI-Restriktionskarte dar und zeigt die Lage einer jeden BamHI-Restriktionsstelle in der in Fig. 10 gezeigten Sequenz an. In Fig. 11 zeigt die Linie, die oberhalb der Kurven der Rasteranalyse gezeigt ist, die ungefähre Lage einiger der Mutationen, die isoliert und charakterisiert worden sind (Beispiele 1, 2, 7, 19, 20). Die in Fig. 11 dargestellten Kurven der Rasteranalysen zeigen die Verteilung des G+C-Gehalts an der ersten (blaue Linie), zweiten (rote Linie) und dritten (schwarze Linie) Nukleotidposition. Es ist zu beachten, daß die Verteilung des G+C-Gehalts an den drei Nukleotidpositionen nicht zufällig über das meiste der vollständigen Sequenz verteilt ist, wobei dies anzeigt, daß praktisch diese vollständige DNA für Proteinprodukte codiert. Jeder Bereich von nicht zufälliger G+C-Verteilung entlang der Sequenz sagt Regionen von DNA voraus, die für Proteinprodukte codieren. Der Leseraster für jedes Protein wird durch die Nukleotidposition definiert, die einen Zwischenwert innerhalb jeder Region der nicht zufälligen G+C-Verteilung besitzt. Die Punkte, an denen die G+C-Verteilung an den drei Nukleotidpositionen wechselt, sagen entweder den Beginn oder das Ende eines Gens oder das Ende eines Gens und den Beginn des nächsten voraus. In jedem Fall wurde van diesen Punkten gefunden, daß sie mit der Anwesenheit entweder eines Start- oder Stoppkodons in dem entsprechenden Leseraster korrelieren.
Unterhalb der Kurven der Rasteranalyse sind getrennt Pfeile eingezeichnet, um die Lage und die Ausdehnung eines jeden Gens in der Sequenz anzuzeigen. Aus Gründen der Einfachheit wird jedes Gen mit einem Buchstaben bezeichnet, und der Buchstabe, dem "gp" vorangestellt ist, wird zum Bezeichnen seines Proteinprodukts verwendet. Oberhalb eines jeden Pfeils ist das Molekulargewicht des Proteinprodukts in kD gezeigt. Unterhalb jeden Pfeils ist der Name eines jeden Genprodukts als sein in Buchstaben angegebener Name wie auch sein funktioneller Name für die Fälle angegeben, in denen die Genfunktion von dem Mutantenphänotyp abgeleitet werden konnte.
Die Kurven der Rasteranalyse zeigen an, daß es drei Bereiche in der Sequenz gab (angeordnet bei Basennummer 900, 3400 und 12400), an denen der G+C-Gehalt an jeder der drei Nukleotidpositionen eine zufällige Verteilung aufweist. Somit wurde von diesen drei Bereichen der DNA angenommen, daß sie nicht für Proteinprodukte codieren. Alle drei dieser Bereiche enthalten ein Transkriptionsterminationssignal, wie durch einen Bereich der Sequenz definiert, der eine Abfolge von T's enthält, denen eine G+C-reiche Region vorangestellt ist, die eine Haarnadel-Sekundärstruktur ausbildet. Die Sekundärstruktur dieser Terminatoren ist in Fig. 13 gezeigt. Basierend auf der Lage der Transkriptionsterminatoren wird die DNA des 16 kb Segments in drei Transkriptionseinheiten unterteilt. Die Pfeile am Boden der Fig. 11 zeigen die Ausdehnung, die Lage und die Richtung der Transkription für jede der drei Einheiten, die als Transkriptionseinheiten I, II und III bezeichnet werden.
Die DNA-Sequenz zwischen jedem Terminator und dem Anfang des ersten Gens innerhalb einer Transkriptionseinheit sollte eine Sequenz (Promotor) enthalten, die den Initiationspunkt der Transkription definiert. Da in der Literatur berichtete Ergebnisse darauf hinweisen, daß die Sequenz von zumindest einigen Pseudomonas-Promotoren eine Ähnlichkeit zu der Sequenz von E. coli-Promotoren aufweisen, wurden die geeigneten Regionen der DNA-Sequenz innerhalb der drei Transkriptionseinheiten nach Homologie zu den Konsensus-Sequenzen von E. coli-Pronotoren an der -10(Pribnow Box)- und -35-Position untersucht. Es wird allgemein angenommen, daß die Sequenz der Pribnow Box die wichtigste dieser zwei Sequenzen ist hinsichtlich der Bestimmung der Bindung der RNA-Polymerase an die DNA, um die Transkription zu initiieren. Die Konsensus-Sequenz der Pribnow Box und des -35-Hexamers sind TAtaaT bzw. TTGAca (Großbuchstaben bezeichnen die stark konservierten Nukleotide in jedem Hexamer). Somit ist das minimale Kriterium für die Definition eines vermuteten Promotors die Anwesenheit eines Hexamers mit der Sequenz TANNNT ("N" ist ein beliebiges Nukleotid).
In Transkriptionseinheiten I und III enthalten vermeintliche Promotoren (an Positionen 1199 bzw. 12664), die lediglich das Minimalkriterium erfüllen, d. h. Homologie mit den ersten, zweiten und sechsten Nukleotiden der Pribnow Box. Somit ist die Lage der vermeintlichen Promotoren für diese zwei Transkriptionseinheiten äußerst spekulativ. Die Transkriptionseinheit II enthielt einen vermeintlichen Promotor (um die Position 3580) mit einer Sequenz mit deutlicher Homologie zu der Konsensus-Sequenz der E. coli-Promotoren. Die Sequenz der Pribnow Box zeigt Homologie mit vier der sechs Nukleotide, einschließlich der drei, die stark konserviert sind. Die Sequenz des -35-Hexamers zeigt Homologie mit vier aus sechs Nukleotiden, einschließlich der vier stark konservierten. Der Abstand zwischen den beiden Hexameren beträgt 16 Basenpaare in vollständiger Übereinstimmung mit dem Konsensus-Abstand von 16 bis 19 Basenpaaren. Somit, obwohl es nicht möglich ist, einen Promotor nur durch Sequenzierdaten zweifelsfrei zu identifizieren, scheint es sehr wahrscheinlich, daß der vermeintliche Promotor für die Transkriptionseinheit II richtig ist.
Die in Fig. 10, 11 und 12 und Tabelle 3 (zusammengenommen) gezeigten Daten zeigen ein einheitliches Bild der Struktur und Organisation der Gummi-Gene, und sie stellen auch eine leicht zugängliche Quelle für spezifische Information dar. Zum Beispiel zeigt Fig. 11, daß es in dem 4,7 kb BamHI-Fragment eine Insertionsmutation gibt, die Xanthomonas-Mutantenzellen erzeugt, die nicht-acetylierten Gummi herstellen. Die Mutation ist um die Position 7000 der DNA-Sequenz in einer Region lokalisiert, die einen Raster-2-ORF enthält, der ein Proteinprodukt (gpF) definiert mit einem Molekulargewicht von 39,9 kD. Die genaue Lage des Gens innerhalb der DNA-Sequenz ist in Tabelle 3 gezeigt. Diese Information kann verwendet werden zum Lokalisieren der DNA-Sequenz des Gens in Fig. 10. Fig. 11 zeigt, daß das Gen innerhalb der Transkriptionseinheit II lokalisiert ist und vermutlich als das Acetylaseenzym fungiert. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz des Acetylaseenzyms ist in Fig. 12 gezeigt zusammen mit weiteren Daten, die anzeigen, daß das Enzym einen hohen Anteil an hydrophoben Aminosäureresten enthält, die über die gesamte Proteinsequenz verteilt sind. Deshalb übt das Acetylaseenzym seine Funktion vermutlich in den bakteriellen Membranen aus.
Die Region der DNA-Sequenz, die mit dem ersten Nukleotid an der linken BamHI-Seite des 0,3 kb BamHI-Fragments beginnt und sich bis zu dem Transkriptionsterminator um die Position 800 erstreckt, ist DNA, die außerhalb der Region des Xanthomonas-Chromosoms zu liegen scheint, die Gene enthält, die an der Gummi-Biosynthese beteiligt sind. Die DNA-Sequenz in diesem Bereich zeigt, daß es einen Raster-3-ORF gibt, der die BamHI-Stelle überspannt, die das 0,3 und 1,4 kb BamHI-Fragment begrenzt. Der ORF definiert ein Proteinprodukt (gpA) fit einem Molekulargewicht von 24,4 kD. Insertionen in die BamHI-Stelle, die in dem Gen lokalisiert sind, erzeugen Xanthomonas-Zellen mit einem Gum&spplus;-Phänotyp. Somit scheint gpA das letzte Gen in einer Transkriptionseinheit zu sein, die irgendwo links von dem 0,3 kb BamHI-Fragment in einer Region des Xanthomonas-Chromosoms beginnt, die Gene enthält, die nicht an der Gummi-Biosynthese beteiligt sind.
Die Region der DNA-Sequenz zwischen dem Ende von gpA und dem Transkriptionsterminator enthält ein Prolin-tRNA-Gen. Die gefaltete Sekundärstruktur dieses tRNA-Transkripts ist in Fig. 14 gezeigt. Die G- und C-Nuklectide am oberen Ende der Anti-Codon-Schleife (in Fig. 14 durch einen Kreis markiert) schließen vermutlich das Funktionieren dieser tRNA in der Translation aus. Chromosomale Deletionen, die dieses tRNA-Gen wie auch das vollständige Gummi-Gencluster entfernen und Insertionen in die Anti-Codon-Schleife erzeugen Xanthomonas-Zellen, die lebensfähig sind, aber Gum&supmin; im Falle der Deletionen und Gum&spplus; im Falle der Insertionen sind. Somit ist das ProlintRNA-Gen für die Lebensfähigkeit oder Gummi-Biosynthese nicht essentiell.
Die Kurven der Rasteranalyse (Fig. 11) für den Bereich der DNA-Sequenz, der innerhalb der Transkriptionseinheit I vorhanden ist, zeigen, daß diese Region des Xanthomonas-Chromosoms ein großes Raster-1-ORF enthält. Die Lage der Start- und Stoppkodons (Tabelle 3) zeigt, daß der ORF zwei Proteine mit Molekulargewichten von 23,3 bzw. 42,8 kD enthält. Anfängliche Ergebnisse aus Untersuchungen, die durchgeführt wurden zum Charakterisieren von mutierten Xanthomonas-Stämmen mit Tn10-Insertionen innerhalb der 1,4 und 1,5 kb BamHI-Fragmente zeigten, daß beide dieser Proteine einen mutierten Phänotyp "kein Belader" besaßen. Jedoch waren diese Ergebnisse zweifelhaft, da Southern Blots dieser chromosomalen DNA aus den Mutantenstämmen klar zeigten, daß die DNA eine Umlagerung vollzogen hatte. Jüngere Daten aus Komplementierungsexperimenten zeigten, daß die Deletion des 1,5 kb BamHI-Fragments in Xanthomonas-Zellen letal war. Die Xanthomonas-Mutante X1231 enthält eine Deletion des vollständigen 16 kb-Segments der DNA (die das 1,5 kb BamHI-Fragment umfaßt) und, obwohl der Stamm Gum&supmin; ist, bleibt er vollständig lebensfähig. Somit sind gp oder gpB beide essentiell für die Lebensfähigkeit in Xanthomonas-Zellen, die einen ansonsten funktionellen Reaktionsweg an Gummi-Genen enthalten.
Die DNA, die die Transkriptionseinheit I definiert (Fig. 11) ist größer als 9 kb in Länge und codiert für sieben Genprodukte. Insertionsmutationen in jedem dieser Gene sind isoliert und charakterisiert worden. Die Effekte dieser Insertionen der Region der DNA, die gpG definiert, sind noch unsicher. Vorläufige Ergebnisse legen nahe, daß die Insertionen in dieser Region vermutlich letal sind. Insertionen an mehreren Stellen in dem ORF, der gpI definiert, ergibt Xanthomonas-Zellen, die mucoide Kolonien erzeugten, die anscheinend normalen Gummi herstellen, obwohl die Menge des erzeugten Gummis etwas verringert sein könnte. Die hydrophoben Eigenschaften der in gpG enthaltenen Aminosäuren (Fig. 12) zeigen, daß dieses Genprodukt vermutlich ein Membranprotein ist. Wir können das offensichtliche Ausbleiben von schädlichen Effekten durch Insertionsmutagenese nicht erklären. Zwei der Gene (gpF und gpH) in der Transkriptionseinheit 11 spielen offensichtlich eine Rolle in der Gummi-Biosynthese. Die mutierten Phänotypen dieser zwei Gene zeigen an, daß gpF Acetylase und gpH Transferase III ist. Zwei der Gene, gpD und gpI, zeigen einen Mutationsphänotyp "kein Belader". Dieser Phänotyp würde erwartet werden für das Gen, das die Transferase I definiert, wie für ein anderes Genprodukt, das an der Regulationskontrolle der Transkription und/oder Translation der Gummi-Gene beteiligt ist. Dieser Phänotyp könnte auch erwartet werden für ein Genprodukt, das eine strukturelle Rolle bei der Aufrechterhaltung des Enzymkomplexes spielt, der notwendig ist für die Gummi-Biosynthese. Drei der erwarteten fünf Gene, die das Transferase-Enzym definieren, sind eindeutig identifiziert worden anhand ihrer Mutationsphänotypen. Dies sind gpH, gpK und gpM, die Transferase III, IV bzw. II darstellen (siehe Fig. 11). Sämtliche drei dieser Gene setzen sich aus Aminosäuren zusammen mit einem relativ geringen Hydrophobizitätsprofil (Fig. 12) und sind in der DNA auf der rechten Seite des Gummi-Genclusters lokalisiert. Wenn angenommen wird, daß diese Eigenschaften allgemeine Eigenschaften der Xanthomonas-Transferase-Enzyme darstellen, dann ist gpI eindeutig der beste Kandidat für die Transferase I, wobei gpD als vermeintlich regulatorisches oder strukturelles Protein verbleibt, das notwendig ist für die Gummi-Biosynthese. Insertionen in der Region der DNA, die von gpE eingenommen wird, sind letal in Xanthomonas-Zellen, die einen ansonsten intakten Gummi-Gen-Reaktionsweg aufweisen. Wie es auch der Fall war für das Gen, das in dem 1,5 kb BamHI-Fragment lokalisiert ist (oben diskutiert), ist gpE selbst kein essentielles Protein für die Lebensfähigkeit der Zelle, da mehrere Deletionsstämme, die die Region des Chromosoms, enthaltend gpE, Gum aber lebensfähig sind. Es scheint, daß gpE wie auch gpC und/oder gpB Proteine sein müssen, die notwendig sind zum Vermeiden der Akkumulation eines oder mehrerer Produkte (hergestellt durch funktionierende Gummi-Gene), das toxisch ist, sofern es nicht metabolisiert wird durch die Enzymaktivitäten von gpE, gpC und/oder gpB. Somit scheint es wahrscheinlich, daß diese Proteine an der Polymerisation und/oder dem Transport von Xanthangummi aus der Zelle beteiligt sind.
Die DNA-Sequenz, die dem Transkriptionsterminator bei Positionen 12570 folgt und sich über die rechte BamHI-Stelle des 1,0 kb Fragments (d. h. über das Ende der sequenzierten DNA hinaus) erstreckt, definiert das, von dem wir annehmen, daß es eine dritte Transkriptionseinheit darstellt. Es ist anzumerken, daß der Transkriptionsterminator, der das Ende der Transkriptionseinheit II definiert, einen ziemlich kurzen Haarnadelstamm mit einer Stärke der freien Energie (G) von nur -4,4 kcal/Mol aufweist. Falls die Stärke der Haarnadel in Beziehung steht zu der Wirksamkeit der Transkriptionstermination, ist es möglich, daß ein transkriptionales Durchlesen in diesem Bereich auftritt. Die Transkriptionseinheit III enthält eindeutig mindestens drei Gene, definiert durch mutierte Phänotypen, was anzeigt, daß ihre Proteinprodukte Transferase IV (gpK), Ketalase (gpL) und Transferase II (gpM) darstellen. Das Transferase II-Gen endet an Position 15284, die 227 Basenpaare entfernt ist von der linken BamHI-Stelle des 1,0 kb BamHI-Fragments. Über diesen Punkt sich nach rechts erstrecken- bis zum Ende der sequenzierten DNA zeigen die Kurven der Rasteranalysen eine nicht zufällige G+C-Verteilung in den drei Nukleotidpositionen, was charakteristisch ist für DNA, die für ein Proteinprodukt codiert. Obwohl wir nicht eindeutig die Position, die Ausdehnung oder die Anzahl der ORFs in dieser Region definieren konnten, zeigt das Profil der Rasteranalyse eindeutig an, daß diese DNA mindestens ein Gen oder möglicherweise ein Gen und einen kleinen Anteil eines zweiten Gens enthält, das die rechte BamHI-Stelle des 1,0 kb Fragments überspannt und sich in DNA erstreckt, die bisher noch nicht sequenziert worden ist. Andererseits zeigen Insertionen in die rechte BamHI-Stelle des 1,0 kb Fragments wie auch eine Insertion innerhalb des 1,0 kb Fragments, die ungefähr 300 Basenpaare rechts der linken BamHI-Stelle lokalisiert sind, einen Gum&spplus;-Phänotyp.
Im allgemeinen besitzen Membranproteine einen hohen Prozentsatz an hydrophoben Aminosäureresten (d. h. Phe, Trp, Tyr, Ile, Leu, Met und Val). Zum Bestimmen, welches der Gummi-Gen-Proteine wahrscheinlich in den bakteriellen Membranen lokalisiert ist, wurde der Computer verwendet zum Bestimmen des Anteils von hydrophoben Aminosäureresten wie auch der Verteilung von hydrophoben Bereichen innerhalb jeder Proteinsequenz. Diese Daten sind in Fig. 12 dargestellt und zeigen, daß Proteine gpD, gpE, gpF, gpG und gpJ einen relativ hohen Anteil an hydrophoben Aminosäureresten (mehr als 40%) enthalten, die über jede Aminosäuresequenz verteilt sind. Somit sind diese Proteine vermutlich Membranproteine.

Beispiel 18

Dieses Beispiel zeigt, daß ein durch das biosynthetische Gummicluster codiertes Enzym in mehreren alternativen Wirtsstämmen einer unterschiedlichen Gattung exprimiert wird.
Antikörper, die Transferase III erkennen, wurden durch Affinitätschromatographie gereinigt, und zum Nachweisen von Transferase III auf Western Immunblots verwendet. Die Herstellung der Seren, die die Anti-Peptid-Antikörper enthalten, die spezifisch sind für das 40 kb Protein, das als Transferase III identifiziert wurde, sind in Beispiel 11 beschrieben. Eines dieser Seren wurde an eine Peptidaffinitätssäule absorbiert, die aus den immunisierenden Peptiden bestand, die an CH-Sepharose mittels Carbodiimid konjugiert worden waren. Die spezifischen Anti-Peptid-Antikörper wurden von der Affinitätssäule mit Glycin-HCl (0,2 M, pH 2,6) eluiert und mit Tris neutralisiert. Das gereinigte Serum erkannte spezifisch Transferase III auf Western Immunblots (siehe oben).
Das affinitätsgereinigte Anti-Peptid-Antiserum wurde verwendet zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Transferase III in Zellysaten von alternativen Wirtsstämmen, enthaltend ein Plasmid mit (pRK290-H336) oder ohne (pRK290-H11) die DNA des Gummi-Clusters (Beispiel 16). Die getesteten Stämme sind in Tabelle 4 gezeigt. Die Anwesenheit von Transferase III auf den Western Immunblots zeigte an, daß die DNA des Gummi-Clusters in den alternativen Wirtsstämmen exprimiert wird. Transferase III wurde exprimiert in Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas stutzeri und Pseudomonas putida mit pRK290-H336. Der Spiegel der Expression in Pseudomonas stutzeri war nahezu äquivalent zu dem in Xanthomonas campestris selbst. Die Expression von Transferase III von pRK290-H336 in diesen alternativen Wirten erfolgt vermutlich aufgrund der Transkription einer Messenger-RNA, die an einer endogenen X. campestris-Promotor-Sequenz initiiert wird, die an dem linken Ende des 4,7 kb BamHI-Fragments gelegen ist. Die DNA-Sequenz des Gummi-Genclusters, dargestellt in Beispiel 17, identifiziert zwei vermeintlich starke Transkriptionsterminatoren zwischen Transferase III und der Plasmid-DNA des Vektors pRK290. Diese Terminatorsequenzen, die an Positionen 814 bis 844 und 3457 bis 3493 auftreten, würden nahezu sicher die Transkription von Transferase III und beliebigen weiteren, stromabwärts gelegenen Genen durch das RNA-Polymerasemolekül, das die Transkription stromaufwärts der Terminatoren initiierte, verhindern. Deshalb muß das Transkript, das das Transferase III-Gen enthält, einen Ursprung in der Gummi-Gen-DNA besitzen, und es stammt sehr wahrscheinlich von einer vermeintlichen Promotor-Sequenz, die in dem 4,7 kb BamHI-Fragment um die Position 3580 lokalisiert ist. Dies spricht dafür, daß die Transkriptionssignale, die in dem Gummi-Gencluster vorhanden sind und normalerweise von X. campestris verwendet werden, auch in diesen alternativen Wirten erkannt und verwendet werden. Dies impliziert, daß viele oder sämtliche der Gummi-Gene, die in pRK290-H336 enthalten sind, transkribiert und sehr wahrscheinlich in den alternativen Wirten translatiert werden.
Das Enzym wurde von diesem Plasinidkonstrukt in den getesteten E. coli-Stämmen nicht exprimiert. Offensichtlich müssen die geeigneten Expressionssignale für E. coli für die Expression von Xanthomonas-DNA in E. coli vorliegen. Beispiel 13 zeigte die Expression von Transferase III von pp3, einem Plasmid mit geeigneten E. coli-Expressionssignalen. Es wird erwartet, daß die anderen Proteine, die durch das biosynthetische Gummi-Cluster codiert werden, in einer Vielzahl von alternativen Wirtsstämmen exprimiert werden können. Tabelle 4 Expression von Transferase III in alternativen Wirtsstämmen Transferase III anhand von Western-Immunblots Xanthomonas Pseudomonas Enterobacter Eschericia

Beispiel 19

Dieses Beispiel beschreibt die Methodologie der zielgerichteten Nutagenese von clonierter Gummi-Gen-DNA, die in rekombinanten Plasmiden pRK290-336 und pRK290-HA3 vorliegt.
Zielgerichtete Mutagenese wurde durchgeführt mit Gummi-Gen-DNA, die in Plasmiden pRK290-H336 (H336) und pRK290-HA3 (HA3) durchgeführt wurde, beschrieben in Beispiel 10. Diese clonierten DNA-Segmente wurden einer Transposon-Mutagenese in vivo unterzogen und in vitro mutagenisiert unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie, um Insertions- und Deletionsmutationen innerhalb der clonierten X. campestris-DNA zu erzeugen. Plasmide, die solche Mutationen tragen, wurden in X. campestris-Empfänger, einschließlich Deletionsmutantenstämme, übertragen, denen alle oder nahezu alle der Gummi-Gen-DNA fehlt, die in H336 enthalten ist. Die erhaltenen Empfängerstämme, die das mutierte Plasmid enthielten, zeigten dann sofort den Gummi-Phänotyp, der sich aus der Plasmidmutation ergibt. Dieses Verfahren erübrigt den Bedarf des Genaustauschschritts, der zuvor verwendet worden ist (Beispiel 7).
Die Transposon-Mutagenese verwendete ein Transposon, beschrieben von Kleckner et al., in Gene 32: 369-379 (1984) und von ihr als "Element 12" bezeichnet, und hierin als TnK12 (Kleckner's Element 12) bezeichnet. Dieses Transposon trägt ein DNA-Segment, das die Kanamycinresistenz-Determinante von Tn5 enthält. Weiterhin enthält dieses DNA-Segment ein Gen, das die Resistenz gegen Streptomycin codiert. Dieses Gen funktioniert nicht in E. coli, aber von ihm ist gezeigt worden, daß es in anderen gramnegativen Bakterien aktiv ist. Zuvor haben wir gezeigt, daß dieses Gen aktiv war in Xanthomonas und einen Streptomycin-resistenten Phänotyp hervorrief, wenn es auf einem Plasmid in Xanthomonas eingeführt wurde. Deshalb sollte die Übertragung von TnK12 in Xanthomonas auf ähnliche Weise gleichzeitig Resistenz gegen Kanamycin und Streptomycin verleihen, wodurch somit eine starke Selektion nach Plasmiden, die TnK12-Insertionen enthalten, ermöglicht wurde.
TnK12 ist in dem Chromosom von E. coli-Stamm NK7133 enthalten, der resistent ist gegen Rifampicin, dem Wirkstoff, den wir am meisten verwenden, um auf X. campestris-Empfänger in Plasmidtransferexperimenten zu selektieren. Deshalb isolierten und verwendeten wir ein Chloramphenicol-resistentes (Camr) Derivat des Deletionsstamms X1107 (Fig. 15) als den Empfänger in unserem anfänglichen TnK12-Transposonexperimenten. Das erste Experiment wurde wie folgt durchgeführt. Das Plasmid pRK290-H336 wurde in Stamm NK7133 durch Transformation unter Verwendung von gereinigter Plasmid-DNA eingeführt. Wir führten dann eine triparentale Paarung unter Verwendung von NK7133 (pRK290-H336) als dem Donor, LE392 (pRK2013) als einem Mobilisator, und X1107 Camr als dem Empfänger durch. Frische über-Nacht-Kulturen dieser Stämme wurden einmal in LB gewaschen, und 3 ml eines jeden Ausgangsstamms wurden zusammengemischt und durch ein 0,45 µM-Filter filtriert. Der Filter wurde auf einer LB-Platte bei 30ºC für 4 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden dann von dem Filter in 3,0 ml (insgesamt) YM-Medium resuspendiert Aliquots wurden auf YMG-Platten, enthaltend Chloramphenicol, Kanamycin und Streptomycin oder Streptomycin allein, ausplattiert. Jede der 15 Platten von jedem Typ Medium wurde mit 0,1 ml der resuspendierten Paarungsmischung behandelt. Die Platten wurden bei 30ºC für 6 bis 12 Tage inkubiert und dann ausgezählt. Aus diesem Experiment erhielten wir letztlich die 100 Kanr-Strr-Kolonien. Die meisten davon waren Gum&spplus; und vom Wildtyp-Erscheinungsbild Sieben waren Gum&supmin; und fünf Kolonien waren deutlich mucoid, aber sie schienen morphologisch verschieden vom Wildtyp Gum&spplus; zu sein. 14 dieser Kanr-Strr-Derivate von X1107 wurden in triparentalen Kreuzungen mit E. coli HB101 und X. campestris S4L rif-101 (R68.4D tet::Tn7) gepaart. Das Plasmid R68.45 tet::Tn7 ist ein Tetracyclin-sensitives Derivat des konjugationsaktiven Plasmids R68.45. Bei der Paarung dient dieses Plasmid als der Mobilisator, der den Transfer von pRK290-H336::TnK12-Derivaten auf E. coli steuert. Da das Plasmid-Gen, das die Tetracyclinresistenz codiert, inaktiviert ist (aufgrund der Tn7-Insertion), wird die Selektion auf Tetr E. coli HB101 durch die Selektion auf Wachstum bei 37ºC auf 10 µg/ml Tetracyclin zu einer spezifischen Selektion auf den Transfer des pRK290-336-Derivats in HB101. Die Analyse der physikalischen Struktur dieses Plasmids ist in E. coli technisch leichter als in Xanthomonas. Die 14 Paarungen erzeugten Tetr-Derivate von HB101 mit einer Frequenz, die in dem Bereich von 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;&sup4; pro Empfänger lag.
Plasmid-DNAs wurden von diesen Stämmen hergestellt und durch Restriktionsendonukleasespaltungen und Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Molekulargewichte von einzelnen Restriktionsfragmenten wurden bestimmt durch Vergleich der Fragmentmobilität mit der elektrophoretischen Mobilität von DNA-Fragment-Standards mit bekannten Molekulargewichten. Das Muster der durch bestimmte Enzyme erzeugten Restriktionsfragmente erlaubte das Bestimmen der Positionen der TnK12-Insertionen. Diese sind in Fig. 15 gezeigt. Elf Insertionen wurden in dem clonierten Gummi-Gen-DNA-Segment von pRK290-H336 gefunden. Sämtliche dieser Insertionen führten zu einem Gum&supmin;- oder mucoiden Phänotyp, wenn das spezielle mutierte Plasmid in X1107 vorlag. Bei zwei Gum&spplus;-Plasmidderivaten wurde gefunden, daß sie TnK12-Insertionen in dem pRK290-Anteil des Moleküls enthalten; dies ist in Übereinstimmung mit dem Gum&supmin;-Phänotyp. Eine Insertion (13) erfolgte in dem Vektor, aber relativ nahe zu der Gummi- Gen-DNA. Diese Insertion verlieh einen leicht unterschiedlichen Gum-Phänotyp (morphologisch), obwohl der X1107 (pRK290-H336.13)-Stamm große Mengen an Gummi erzeugt. Dieses Plasmid-Mutagenesesystem erlaubte uns, in effizienter Weise Mutationen innerhalb der clonierten Gummi-Gen-DNA zu isolieren und nachzuweisen. Mit Hilfe diesem Verfahrens, unter geringen Abweichungen, isolierten und charakterisierten wir einen Satz an TnK12-Insertionsmutationen in pRK290-H336. In einigen Experimenten wurde ein verschiedener X. campestris Gum&supmin;-Deletionsstamm verwendet. In diesem Deletionsstamm X1231 (siehe Fig. 15) ist sämtliche Gummi-Gen-DNA, die in pRK290-H336 enthalten ist, deletiert. Einige Experimente verwendeten auch unterschiedliche Selektionsstrategien. Zum Beispiel wurde unter bestimmten Umständen Kanamycin plus Streptomycin oder Streptomycin alleine verwendet zum Selektieren auf den Transfer von TnK12 von E. coli auf X. campestris. Schließlich wurden 45 TnK12-Insertionen in pRK290-H336 isoliert und analysiert. Die meisten davon traten in den Gummi-Genen auf, und die meisten waren einfache Insertionen, obwohl einige auch Hinweise auf sekundäre DNA-Umlagerungen aufwiesen.
Insertions- und Deletionsmutationen sind ebenfalls durch in vitro-Mutagenese unter Verwendung eines 1,3 kb-Restriktionsfragments des Transposons Tn903 in pRK290-H336 und pKR290-HA3 isoliert worden. Dieses Fragment kann aus einem Plasmid (pUC4-K) durch eine Vielzahl von Restriktionsenzymen, einschließlich EcoRI, BamHI, SalI, AccI, HincII und PstI herausgeschnitten werden. Die HincII-Spaltung ergibt ein DNA-Fragment mit glatten Enden, das durch das Anfügen eines DNA-"Linker"-Moleküls modifiziert werden kann, um DNA-Enden zu erzeugen, die in andere Restriktionsspaltstellen ligiert werden können. Im allgemeinen ist das Verfahren für die Insertions-Mutagenese mit diesem Fragment analog zu den Verfahren, die verwendet wurden zum Isolieren von Insertions- und Deletionsmutationen innerhalb der clonierten Gummi-Gen-DNA, die in Plasmid pMW79 enthalten ist, wie beschrieben in Beispiel 7. Das Plasmid pUC4-K wurde mit den geeigneten Restriktionsendonukleasen gespalten und das 1,3 kb Kanr-Fragment wurde anschließend aus präparativen Agarosegelen durch elektrophoretische Elution aus den Gelstreifen gereinigt. Wenn es erforderlich war, ein DNA-Linkermolekül an das Ende des Kanr-Fragments anzufügen, wurde eine HincII-Spaltung von pUC4-K mit dem gewünschten Linkermolekül vor dem Schritt der präparativen Elektrophorese ligiert. Anschließende Reinigung des Kanr-DNA-Fragments entfernte die nicht-ligierten Linkermoleküle. Das gereinigte 1,3 kb Kanr-Fragment wurde dann in in vitro-Mutageneseexperimenten verwendet. In diesen Experimenten wurden partielle Restriktionsendonukleasespaltungen durchgeführt mit einer gereinigten Plasmid-DNA durch Beschränken der Menge des zu der Reaktion zugesetzten Restriktionsenzyms. Durch Zusetzen der geeigneten Menge eines gegebenen Enzyms zu einer Reaktionsmischung wurde ein hoher Anteil an einmal gespaltenen linearen Molekülen erhalten. Die geeignete Menge eines jeden speziellen Enzyms wurde empirisch ermittelt. Anschließend wird das gereinigte Kanr-Fragment an die partiell gespaltene Plasmid-DNA ligiert. Produkte dieser Legierungsreaktion werden verwendet zum Transformieren von E. coli und die Selektion auf Kanamycinresistente Transformanden selektiert nach rekombinanten Plasmidmolekülen, die das Kanr-DNA-Fragment inseriert in einer Restriktionsstelle des Plasmids enthalten. Plasmid-DNA von Kanr-Transformanden wurde analysiert, um die Lage der speziellen Insertionsmutationen zu identifizieren. Deletionsmutationen wurden erhalten, wenn das Kanr-Fragment an ein Plasmidmolekül legiert wurde, das zwei oder mehrere Male durch die Restriktionsendonuklease geschnitten worden war. Die in Plasmiden H336 und HA3 konstruierten Insertions- und Deletionsmutationen sind in Fig. 15 gezeigt.
Um die Phänotypen von in vivo- und in vitro-erzeugten Insertionsmutationen zu analysieren, wurden die mutierten Plasmide über Konjugation in X. campestris Gum&supmin;-Deletionsmutanten übertragen. Mutantenderivate von pRK290-H336 wurden in den Deletionsstamm X1231 übertragen, wo der Gum-Phänotyp den Einfluß der Insertionsmutation, die in dem Plasmid enthalten ist, widerspiegelt. Die Phänotypen vieler dieser Mutationen sind in vivo oder in vitro durch Verfahren, wie in Beispiel 2 beschrieben, analysiert worden. Plasmide, die bestimmte Insertionsmutationen enthalten, konnten nicht in Deletionsstamm X1231 übertragen werden. Es ist sehr wahrscheinlich, daß diese Insertionsmutationen letal oder stark schädlich sind in X. campestris. Diese Mutationen und andere Letalmutationen sind in Beispiel 20 beschrieben.

Beispiel 20

Dieses Beispiel beschreibt Hinweise auf letale Mutationen in dem Gummi-Gencluster und diskutiert die mögliche Funktion der Proteine, die durch diese Letalmutationen inaktiviert wurden.
Wie in Beispiel 19 beschrieben, wurden Mutationen in Gummi-Gen-DNA isoliert durch in vitro-Insertion des 1,3 kb Kanr-Fragments in die clonierte Gummi-Gen-DNA, die in pRK290-H336 enthalten ist. Diese mutierten Insertionsplasmide wurden konstruiert und in E. coli analysiert. Um die Gum-Phänotypen dieser Mutanten abzuschätzen, versuchten wir anschließend, die mutierten Plasmide per Konjugation in den Gum&supmin;-Deletionsstamm X1231 zu übertragen. Die meisten mutierten Plasmide wurden wirkungsvoll in X1231 mit Hilfe von standardmäßigen triparentalen Paarungen übertragen. Jedoch wurden einige wenige mutierte Plasmide nicht in X1231 übertragen oder in niedriger Frequenz übertragen.
Ein solches mutiertes Plasmid war pRK29-H336.KR9 (KR9). Dieses Plasmid enthält eine Insertion in der EcoRI-Stelle an Position 6089 in der DNA-Sequenz des Gummi-Genclusters und unterbricht den offenen Leseraster, der gpE codiert, wie beschrieben in Beispiel 17. Dies ist die einzige Insertion, die bis zum heutigen Tage isoliert wurde, die dieses Gen unterbricht. Unsere anfänglichen Versuche, diese mutierte Insertionsplasmid, pRK290-H336.KR9, in X1231 zu übertragen, schlugen fehl, wie dies auch für die Wiederholung dieses Experiments zutraf. Dieses Ergebnis legt die Möglichkeit nahe, daß die KR9-Insertion eine letale Mutation in X. campestris war. Wir versuchten anschließend, KR9 in andere X. campestris-Stämme zu übertragen. Eine Paarung wurde durchgeführt mit Empfängern X1231, X77 (Wildtyp) und X1205, einem Gum&supmin;-Deletionsstamm, dem die Gummi-DNA zwischen der rechten BamHI-Stelle des 2,2 kb-Fragments und der HindIII-Stelle des 11,5 kb BamHI-Fragments (Fig. 15) fehlt. Dieser Stamm besitzt eine intakte Kopie des 4,7 kb-BamHI-Fragments und somit eine intakte Kopie des Gens, das durch die Insertion KR9 inaktiviert wurde. In diesem Experiment wurde wiederum KR9 nicht auf X1231 übertragen. Jedoch wurde das Plasmid leicht in X77 und X1205 übertragen. In dem X1205-Stamm führte das Plasmid zu einem "gummiartigen" Phänotyp. Dies zeigt an, daß die Genfunktionen, die aufgrund der chromosomalen Deletion von X1205 fehlen, ergänzt worden waren durch das entsprechende Segment an clonierter Gummi-Gen-DNA auf dem Plasmid. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit dem Befund, daß die KR9-Insertion eine letale Insertion darstellt. Jedoch kann das durch die KR9-Mutation inaktivierte Gen kein essentielles Gen per se sein, da dieses Gen in vielen der großen Deletionsstämine, wie X1231, X1107 und X1106, eliminiert ist, die lebensfähig sind. Somit scheint die KR9-Mutation nur letal zu sein, wenn der Rest des biosynthetischen Gummireaktionsweges funktionsfähig verbleibt.
Ähnliche Ergebnisse wurden bei zwei mutierten Insertionsplasmiden beobachtet, die Insertionsmutationen in der SpeI-Stelle an Position 11716 innerhalb der Sequenz trugen. Diese mutierten Plasmide, pRK290-H336.KSp12 (KSp12) und pRK290-H336.KSp13 (KSp13), unterscheiden sich nur in der Orientierung des eingefügten Kanr-DNA-Fragments. In standardmäßigen triparentalen Paarungen mit einer Reihe von X. campestris-Empfängern wurden beide Plasmide effizient in den Gum&spplus;-Empfänger X1229 und den Gum&supmin;-Empfänger X1217 übertragen, der eine Wildtyp-Kopie des 3,5 kb BamHI-Fragments in seine Chromosom und somit eine Wildtyp-Kopie des Gens, das gpJ codiert, trägt. Der Transfer dieser zwei Plasmide in den Gum&supmin;-Empfänger X1205 war ungefähr um drei Größenordnungen geringer, und der Transfer in den Gum&supmin;-Stamm X1231 war noch geringer. Die Deletion in X1205 entfernt das 3,5 kb BamHI-Fragment, aber ist ansonsten identisch mit X1217. Stamm X1231 trägt die größte Gummi-Gen-Deletion, die sämtliche clonierte Gummi-Gen-DNA, die in pRK290-H336 und seinen Insertionsderivaten, wie KSp12 und KSp13, enthalten ist, eliminiert. Diese Ergebnisse zeigen an, daß die KSp12- und KSp13-Insertionen schädlich oder letal in X. campestris sein können.
Unter Verwendung eines etwas abgeänderten experimentellen Ansatzes haben wir glücklicherweise gefunden, daß eine Deletion des 1,5 kb BamHI-Fragments letal zu sein scheint, wenn der Rest des Gummi-Genclusters intakt ist. Das Plasmid pRK290-HA3 (HA3), wie in Fig. 10 gezeigt, enthält die gesamte DNA des Gummi-Genclusters, außer die 1,4 kb und 1,5 kb BamHI-Fragmente. Wir waren an der Bestimmung des Phänotyps des Deletionsstammes X1106 interessiert, der das Plasmid HA3 trägt, um den Effekt des Unterbrechens des Gummi-Clusters an der BamHI-Stelle zu bestimmen, die die 1,5 und 4,7 kb BamHI-Segmente begrenzt. Deshalb wurde ein Derivat von HA3 (HA3.1), das die TnK12-Insertion innerhalb des Vektoranteils von HA3 trägt, in die Deletion X1106 übertragen. Dieser Stamm war mucoid, was anzeigte, daß kein essentielles Gen für die Gummibiosynthese diese BamHI-Stelle überspannt. Weiterhin zeigt dies, daß die clonierten Gummi-Gene von HA3.1 von dem Plasmid exprimiert werden.
Jedoch wurde eine interessantere Beobachtung gemacht als wir versuchten, HA3.1 in Deletionen X1107 und X1231 zu übertragen. Wir hofften, die Phänotypen zu analysieren, die aus einer wirksamen Deletion des 1,5 kb BamHI-Segments (in X1107) und Deletion von beiden 1,5 und 1,4 kb BamHI-Fragmenten (in X1231) stammen wurden. Was wir gefunden haben, war, daß HA3.1 in keinen der Deletionsstämme übertragen werden konnte. Dieses Experiment wurde wiederholt und das Ergebnis bestätigt. HA3.1 konnte leicht in X1106 und X77 (Wildtyp) übertragen werden, aber es konnte nicht in X1107 oder X1231 übertragen werden.
Somit schlossen wir, daß die Deletion des 1,5 kb BamHI-Segments und die Deletion der 1,5 kb und 1,4 kb BamHI-Segmente beides Letalmutationen darstellen. Da jedoch die Deletionsstämme X1107 und X1231, denen beiden das 1,5 kb BamHI-Fragment fehlt, lebensfähig sind, muß gelten, daß die durch diese Deletion eliminierte genetische Information nicht per se essentiell ist. Wiederum legt dies nahe, daß das Fehlen des 1,5 kb BamHI-Segments letal wird, wenn der Rest des Gunmi-Gen-Reaktionsweges funktionsfähig ist.
Wir haben Hinweise darauf erhalten, daß mindestens drei verschiedene Mutationen in dem Gummi-Gencluster letale Phänotypen hervorrufen. Diese Letalität scheint sich nur zu manifestieren, wenn mindestens ein Teil des biosynthetischen Gummireaktionsweges aktiv verbleibt. Die Akkumulation eines toxischen Produkts, das normalerweise durch die fehlende bzw. fehlenden Funktion(en) metabolisiert wird, könnte für diese Letalität verantwortlich sein. In einem solchen Modell würde die Aktivität des biosynthetischen Gummireaktionsweges, oder einiger Teile davon, zur Letalität führen, falls bestimmte andere Genfunktionen abwesend wären. Zum Beispiel könnten solche Gene Polymerase codieren. Die Synthese eines C&sub5;&sub5;-Lipid-verknüpften Pentasaccharids könnte letal sein, da das C&sub5;&sub5;-Lipid absolut notwendig ist in mindestens einer weiteren zellulären Funktion, die für das Wachstum essentiell ist - der Zellwandbiosynthese. Somit könnte das Überführen des C&sub5;&sub5;-Lipids in eine nicht-metabolisierbare Form die Letalität verursachen. Alternativ könnten solche Gene Proteine codieren, die an dem Transport des Polymers aus der Zelle beteiligt sind. Die Synthese des Polymers in der Abwesenheit eines solchen Transportsystems könnte auch schädliche Effekte auf das Zellwachstum ausüben und könnte auch letal sein. Es ist auch möglich, daß ein "letales" Gen eine Transferase V codieren könnte. Bis zum heutigen Tage sind keine Transferase V-Mutanten identifiziert worden. Möglicherweise könnte der Transferase V-Defekt letal sein, da er zu der Biosynthese eines Polymers (Polytetramer) führt, das in der Mikrobe toxisch ist. Zum Beispiel könnte das Polytetramer nicht in geeigneter Weise durch das Transportsystem, das normalerweise Xanthan ausscheidet, transportiert werden.
Die Hypothese, daß das Blockieren der Gummibiosynthese in einer frühen Stufe in dem Reaktionsweg die Letalität supprimiert, könnte getestet werden. Das Experiment bestünde darin, Doppelmutanten zwischen großen Gum -Deletionen und Zuckernukleotidmutanaten zu konstruieren. Ein Stamm, der einen Mangel in der UPD-Glukose-Synthese aufweist, kann die Xanthanbiosynthese nicht initiieren und sollte deshalb nicht dieser Letalität unterliegen. Deshalb sollten Plasmide, die letale Insertionen tragen, leicht in solche Doppelmutanten übertragen und darin aufrechterhalten werden können. Sollte sich das als richtig herausstellen, könnte man Funktionen identifizieren, die von den "letalen Genen" codiert werden durch in vitro-Analyse der Xanthanbiosynthese, worin die Zuckernukleotide exogen zugeführt werden. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß verschiedene Modifikationen und Variationen in den erfindungsgemäßen Verfahren und Produkten durchgeführt werden können. Somit erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf Modifikationen und Variationen der Erfindung, vorausgesetzt, sie liegen im Umfang der angefügten Ansprüche und ihrer Äquivalente.

Claims

1. Ein Verfahren mittels rekombinanter DNA für die Herstellung von Xanthanpolysacchariden oder Xanthanpolysaccharidvarianten, die mit Xanthan strukturell verwandt sind, umfassend:

(a) Herstellen einer DNA-Sequenz, wie sie in dem Plasmid pRK290-H336, hinterlegt unter ATCC 67049 (in E. coli LE392), enthalten ist, oder von Varianten davon, die einen Nicht-Xanthomonaswirt veranlassen können, ein Xanthanpolysaccharid oder eine Xanthanpolysaccharidvariante, die mit Xanthan strukturell verwandt ist, herzustellen;

(b) Klonieren der DNA-Sequenz in mindestens einen Vektor, der in einen Wirtsmikroorganismus übertragen und darin repliziert werden kann, wobei dieser Vektor Elemente für die Expression der biosynthetischen Enzyme, die durch die DNA-Sequenz kodiert werden, enthält;

(c) Übertragen des Vektors, enthaltend die DNA-Sequenz, in einen Wirtsmikroorganismus, der Polysaccharid unter dem Einfluß der DNA-Sequenz erzeugen kann;

(d) Kultivieren des Wirtsmikroorganismus unter geeigneten Bedingungen zum Beibehalten des Vektors und der Synthese des Polysaccharids; und

(e) Ernten des Polysaccharids.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das herzustellende Polysaccharid Xanthangummi ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das herzustellende Polysaccharid Polytrimer ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das herzustellende Polysaccharid nicht-acetyliertes Polytrimer ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin das herzustellende Polysaccharid Polytetramer ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin das herzustellende Polysaccharid nicht-acetyliertes Polytetramer ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, worin das herzustellende Polysaccharid nicht-pyrovylierter Xanthangummi ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, worin das herzustellende Polysaccharid nicht-acetylierter Xanthangummi ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin das herzustellende Polysaccharid nicht-acetylierter und nicht-pyrovylierter Xanthangummi ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin jeder der Vektoren eine oder mehrere DNA-Sequenzen enthält, die Enzyme kodieren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Transferase I, Transferase II, Transferase III, Transferase IV, Transferase V, Acetylase, Ketalase und Polymerase.

11. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Vektor einen Vektor umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus pRK290-H336, enthalten in E. coli LE392 und hinterlegt unter ATCC 67049, und pX209, enthalten in E. coli LE392 und hinterlegt unter ATCC 67051.

12. Verfahren nach Anspruch 10, worin der Vektor weiterhin umfaßt mindestens eine der übertragbaren DNA-Sequenzen, die die Enzyme kodieren, die die Synthese von Zuckernukleotiden steuern, wobei die Zuckernukleotide ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus UDP-Glucose, UDP-Glucuronsäure und GDP-Mannose.

13. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Wirt das Polysaccharid mit hohen Syntheseraten herstellen kann.

14. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Wirt das Polysaccharid bei einer erhöhten Temperatur herstellen kann.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin der Wirt das Polysaccharid bei einer Temperatur von größer als 30ºC herstellen kann.

16. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Wirt das Polysaccharid unter anaeroben Bedingungen herstellen kann.

17. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Wirt ein denitrifizierendes Bakterium ist.

18. Verfahren nach Anspruch 16, worin der Wirt ausgewählt wird aus den Bakterien der Gattung Clostridium.

19. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Wirt ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Pseudomonas putida, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas stutzeri, Escherichia coli und Enterobacter cloacae.

20. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Varianten der DNA-Sequenz an DNA der Bakterien der Gattung Xanthomonas hybridisieren.

21. Ein Produkt, umfassend eine DNA-Sequenz, wie in dem Plasmid pRK290-H336, hinterlegt unter ATCC 67049 (in E. coli LE392), enthalten, oder Varianten davon, die eine mikrobielle Zelle veranlassen können, eine Xanthanpolymerase und mindestens eines der Enzyme zu synthetisieren, die für die Xanthanbiosynthese erforderlich sind, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Transferase I, Transferase II, Transferase III, Transferase IV, Transferase V, Acetylase, Ketalase.

22. Produkt nach Anspruch 21, worin die Varianten der DNA-Sequenz an DNA von Bakterien der Gattung Xanthomonas hybridisieren.

23. Das Plasmid pX209, enthalten in E. coli LE392 und hinterlegt unter ATCC 67051.

24. Das Plasmid pRK290-H336, enthalten in E. coli LE392 und hinterlegt unter ATCC 67049.

25. Ein Mikroorganismus des Stamms E. coli LE392 (pRK290-H336), hinterlegt unter ATCC 67049.

26. Ein Mikroorganismus des Stamms E. coli LE392 (pX209), hinterlegt unter ATCC 67051.