DE3752096T2

DE3752096T2 - Familie von auf Xanthan basierenden Polysaccharidpolymeren, welche Nichtacetylierten und/oder Nichtpyruvylierten Gum beeinhalten

Info

Publication number: DE3752096T2
Application number: DE3752096T
Authority: DE
Inventors: Daniel H Doherty; Donna M Ferber; John D Marrelli; Rebecca W Vanderslice
Original assignee: Getty Scientific Development Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1986-03-24
Filing date: 1987-03-24
Publication date: 1997-11-13
Anticipated expiration: 2007-03-25
Also published as: DE3787026D1; EP0323952B1; JPS63503198A; DE3752096D1; NO309102B1; EP0511690A2; JP2559437B2; NO921787L; NO172945B; EP0765939A3; DE3787026T2; NO921787D0; WO1987005939A1; SG164261A1; ATE92965T1; CA1339113C; EP0323952A1; NO874846L; EP0511690B1; EP0323952A4

Description

Die Erfindung betrifft Polysaccharid-Polymere. Insbesondere betrifft sie Polysaccharid-Polymere auf Xanthan-Grundlage, die hierin definiert werden als Polymere, die strukturell ähnlich zu Xanthan-Gummi sind und durch Komponenten des Biosynthesewegs von Xanthan hergestellt werden, umfassend sowohl nicht-acetylierte, nicht-pyruvylierte, nicht-acetylierte und nicht-pyruvylierte, niedrig pyruvylierte und voll pyruvylierte Xanthan-(pentamer)- Gummis.
Xanthan-Gummi wird von Bakterien der Gattung Xanthomonas, insbesondere von Mikroorganismen der Art X. campestris hergestellt. Xanthan-Gummi findet aufgrund dessen ungewöhnlichen, physikalischen Eigenschaften breite Anwendung, d.h. aufgrund seiner extrem hohen spezifischen Viskosität und seiner Pseudoplastizität. Er wird gewöhnlich in Lebensmitteln als Verdickungsmittel und sowohl bei der sekundären oder tertiären Ölgewinnung als Mobilitätskontroll- und Profilmodifikationsmittel als auch in Erdölsptiltrüben verwendet.
Chemisch ist Xanthan-Gummi ein anionisches Heteropolysaccharid. Die wiederholungseinheit des Polymers ist ein aus fünf Zuckeranteilen, speziell aus zwei Glucose-, einem Glucuronsäure- und zwei Mannose-Anteilen zusammengesetztes Pentamer. Diese Zuckerreste sind so angeordnet, daß die Glucose-Anteile das Rückgrad der Polymerkette bilden, wobei die Seitenketten aus Mannose-Glucuronsäure-Mannose-Resten gewöhnlich von alternierenden Glucose-Anteilen ausgehen. Gewöhnlich ist diese Grundstruktur spezifisch acetyliert und pyruvyliert, wie z. B. beschrieben von Janson, P.E., Kenne, L., und Lindberg, B. in Carbhohydrate Research, 45:275-282 (1975) und Melton, L.D., Minot, L., Rees, D.A., und Sanderson, G.R. in Carbohydrate Research, 46: 245-257 (1976), wobei beide Publikationen durch Bezugnahme hierin Bestandteil sind.
Es ist bekannt, daß das Ausmaß der Acetylierung und Pyruvylierung variiert. Die Struktur von Xanthan-Gummi ist nachstehend dargestellt: Xanthan
Trotz der breiten Verwendbarkeit des natürlich vorkommenden Xanthan-Gummis gibt es einige Situationen, in denen seine physikalischen Eigenschaften limitierend werden. Insbesondere ist es bei der sekundären oder tertiären Ölgewinnung nicht ungewöhnlich, daß die Temperatur des das Öl enthaltenden Reservoirs und die Salzkonzentrationen in der Sole des Reservoirs höher sind als optimal für Xanthanlösungen. Wenn diese Bedingungen vorkommen, kann Xanthan präzipitieren, ausflocken und/oder seine Viskosität verlieren. Daher wären neue Produkte, die die Viskosität erhöhen und die bei den während der Ölgewinnung zusammentreffenden, verschiedenen Bedingungen, wie hohe Temperatur und hohe Salzkonzentrationen, gut funktionieren, wünschenswert.
Die vorliegende Erfindung offenbart eine eine Familie von Polysacchariden auf Xanthan-Grundlage mit im Verhältnis zu natürlich vorkommendem Xanthan-Gummi verbesserten Eigenschaften. Modifikationen von Xanthan-Gummi sind früher beschrieben worden. Z.B. beschreiben Bradshaw et al., (Carbohydrate Polymers, 3:23-38-38 (1983)) Verfahren zum Herstellen von chemisch modifizierten Xanthan-Gummis, die deacetyliert oder depyruvyliert sind. Verschiedene Mittel zum chemischen Deacetylieren von durch Xanthomonas campestris hergestelltem Xanthan-Gummi sind auch in den US-P- 3 000 790 und 3 054 689 beschrieben. Bis heute war das einzige Verfahren, das für diese Deacetylierungsprozesse verwendet wurde, eine chemische Entfernung der Acetat-Anteile von normal acetyliertem Xanthan-Gummi. Es ist gefunden worden, daß chemische Verfahren zum Deacetylieren von Xanthan-Gummis eine Anzahl von nicht wünschenswerten Nebeneffekten ergeben und eine Hydrolyse des glykosidischen Rückgrads verursachen können, die eine irreversible Veränderung der Molekülkonformation und vermindertes Molekulargewicht ergeben.
Einige der rheologischen Eigenschaften von deacetyliertem Xanthan in wäßrigen Medien sind bekannt. Siehe z. B. Tako und Nakamura, Agric. Biol. Chem. 48:2987-2993 (1984) und US-P- 3 000 790 und 3 054 689. Ebenso ist ein Verfahren zur Erhöhung der Viskosität einer wäßrigen Lösung unter Verwendung eines deacetylierten Polysaccharids beschrieben in US-P-3 096 293. Folglich ist ein Verfahren zum Erhalten von nicht-acetyliertem Xanthan gesucht worden, das keine ungünstigen Nebeneffekte verursacht.
Xanthan-Gummi kann auch chemisch depyruvyliert werden, wie beschrieben von Holzwarth und Ogletree in Carbo. Res. 76: 277-280 (1979). Dieses chemische Verfahren der Depyruvylierung kann auch die Polymereinheiten von Xanthan verändern und/oder eine Hydrolyse des glykosidischen Rückgrads verursachen. Obwohl ein Stamm von X. campestris in US-P-4,296,203 beschrieben worden ist, der nicht-pyruvylierten Xanthan-Gummi herstellt, war dieser nichtpyruvylierte Gummi unter Verwendung von chemischen Mitteln entweder vollständig acetyliert oder deacetyliert.
Die Erfinder dieser Erfindung glauben, daß ein Xanthan-Polysaccharid, das sowohl nicht-acetyliert als auch nicht-pyruvyliert ist, verbesserte rheologische und viskositätsbildende Eigenschaften aufweisen wird und haben daher nach einem solchen Gummi gesucht, zusammen mit einem mikrobiellen Verfahren zu seiner Herstellung.
Zusätzlich kann das Ausmaß der Acetylierung der inneren Mannose an der Xanthanseitenkette und das Ausmaß der Pyruvylierung an der terminalen Mannose variieren. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung glauben, daß ein voll acetyliertes- und/oder voll pyruvyliertes Xanthan verbesserte rheologische Eigenschaften für bestimmte Ölgewinnungszwecke aufweisen wird.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, eine Familie von Polysaccharid-Polymeren bereitzustellen, die zur Erhöhung der Viskosität von Wasser besser geeignet sind als natürlich vorkommende Xanthan-Gummis. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Verbindung ist, eine Familie von Polysaccharid-Polymeren mit verbesserten rheologischen Eigenschaften im Vergleich zu natürlich vorkommendem Xanthan-Gummi bei erhöhten Temperaturen und/oder im Vorhandensein von Salz bereitzustellen, wobei die Mitglieder weitere gewünschte Eigenschaften besitzen.
Es ist ebenso eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein in vitro-Verfahren zum Gewinnen von bestimmten dieser Produkte und von Mikroorganismen mit der Fähigkeit, Mitglieder dieser Familie von Polysaccharid-Polymeren in vivo zu produzieren, bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Verbindung ist, Verfahren zum Herstellen von Mitgliedern dieser Familie von Polysacchariden durch aerob fermentierende Mikroorganismen mit der Fähigkeit, die verschiedenen Polysaccharid-Polymere herzustellen, bereitzustellen.
Zusätzliche Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden zum Teil in der folgenden Beschreibung dargestellt werden und werden zum Teil aus der Beschreibung offensichtlich sein oder können bei der Durchführung der Erfindung erkannt werden. Die Aufgaben und Vorteile können mittels der besonders in den angefügten Ansprüchen hervorgehobenen Instrumentalien und Kombinationen verwirklicht und erreicht werden.
Um die Aufgaben zu lösen und gemäß den Zielen der Erfindung, wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend Xanthangummi, bei dem die Mannoseanteile nicht acetyliert sind. Dieses Gummi wird im weiteren als "nicht-acetyliertes Xanthan" bezeichnet. Es wird hier auf eine zweite Struktur Bezug genommen, bei der die terminalen Mannoseanteile des Xanthan-Gummis nicht pyruvyliert sind. Dieses Gummi wird als "nicht-pyruvyliertes Xanthan" bezeichnet. Weiterhin wurde ein Gummi offenbart, das weder acetyliert noch pyruvyliert ist. Dieses Polymer wird im folgenden als "nichtacetyliertes, nicht pyruvyliertes Xanthan-Gummi" bezeichnet. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Xanthan-Gummi, daß hier als "voll-acetyliertes Xanthan-Gummi" bezeichnet sind, bei dem mindestens 90% der inneren Mannoseeinheiten acetyliert sind, vorzugsweise 95% und besonders bevorzugt 100%. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Xanthan-Gummi, bei dem mindestens 90% der terminalen Mannoseanteile, vorzugsweise 95% und besonders bevorzugt 100% pyruvyliert sind, im weiteren hier bezeichnet als "vollpyruvyliertes Xanthan-Gummi".
Diese Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung der vorstehend beschriebenen Polysaccharid-Polymere. Die erfindungsgemäßen Polysaccharid-Polymere können im allgemeinen durch genetische Manipulationen der mikrobiellen Biosynthesewege hergestellt werden, die zu der Herstellung von Polysacchariden führen. Insbesondere können die mikrobiellen Stoffwechselwege für die Herstellung von Xanthan-Gummi manipuliert werden, um ein in vivo- oder in vitro-System zur Herstellung von einer veränderten polymeren Einheit zu erzeugen. Folglich können Systeme durch die Verwendung von regulierbaren Acetylase- und Ketalase-Genen erzeugt werden, insbesondere um Polysaccharide, die zu unterschiedlichen Graden acetyliert oder pyruvyliert sind, herzustellen. Z.B. wird erwartet, daß Xantham-Gummi synthetisiert werden kann, der 10 %, 20 %, 30 %, 40 % oder 50 % acetyliert ist, wie auch Xanthan-Gummi, der zu 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % oder 80 % pyruvyliert ist. Mikroorganismen, die die vorliegenden Polysaccharid-Polymere in vivo herstellen und Verfahren zum Verwenden dieser Polysaccharid-Polymere sind ebenso offenbart.
Verschiedene Stämme von X.campestris, die im Detail unten beschrieben sind, wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, am 21. März 1986 hinterlegt. Diese Stämme sind X921, X1006, X934 und X1231 und wurden unter den Hinterlegungsnummern 53472, 53473, 53474 bzw. 67344 hinterlegt.
Sowohl die vorstehende allgemeine Beschreibung als auch die folgende genaue Beschreibung sind nur als beispielhaft und erläuternd und nicht als die beanspruchte Erfindung beschränkend zu verstehen. Die beigefügten Zeichnungen, die hier eingefügt sind und einen Teil dieser Beschreibung ausmachen, stellen verschiedene Ausführungsformen der Erfindung dar und dienen dazu, zusammen mit der Beschreibung, die Prinzipien der Erfindung zu erklären.
Figur 1 stellt den vermuteten Weg der Biosynthese von Xanthan- Gummi dar. Die verwendeten Abkürzungen sind: Glu= Glucose; Glu A=Glucuronsäure; Man=Mannose; Glu-Glu--Cellobiose; P=Phosphat; PP=Pyrophosphat; C55=Isoprenoid-Lipid-Carrier; PEP=Phosphoenolpyruvat; Ac Co A=Acetylcoenzym A; I-V=Glcosyltransferasen; UDP-Uridin- 5'-diphosphat; und GDP- Gluanosin-5'-diphosphat.
Figur 2 stellt einen Viskositätsvergleich zwischen Wildtyp und nicht-pyruvylierten Gummis dar.
Figur 3 stellt einen Viskositätsvergleich zwischen nichtacetylierten und chemisch deacetylierten Gummis dar.
Figur 4 stellt eine angenäherte physikalische Lokalisierung der 3 Tn Kl2-Insertionsmutationen innerhalb der donierten DNA des Genclusters für die Gummisynthese des rekombinanten Plasmids p RK290-H336 dar. Diese Figur zeigt auch die ungefähren Lokalisierungen der Spaltstellen der Spe I-Restriktionsendonuclease in p RK290-H336.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Bezug wird jetzt detailliert auf die gegenwärtig bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen genommen, die dazu dienen, zusammen mit den folgenden Beispielen, die Prinzipien der Erfindung zu erklären.
Die erfindungsgemäßen Polysaccharid-Polymere sind vorstehend genau beschrieben worden. Diese Polysaccharid-Polymere können in vitro mit zellfreien Enzymsystemen oder in vivo durch Kultivieren von Zellen eines geeigneten Mutanten-Stamms hergestellt werden. Andere Mittel zum Herstellen der Polysaccharid-Polymere sind nachstehend ebenso beschrieben.

In vitro-Polysaccharidsynthese

Das grundlegende Verfahren, welches die Verwendung eines zellfreien Systems zur Herstellung von nicht-variantem Xanthan-Gummi betrifft, ist beschrieben von Ielpi, L., Couso, R.O. und Dankert, M.A. in FEBS Letters 130: 253-256 (1981), wobei die Publikation durch Bezugnahme hierin Bestandteil wird. Es ist gefunden worden, daß eine modifizierte Version dieses Verfahrens angewendet werden kann, um die varianten, erfindungsgemäßen Polysaccharide zu erzeugen.
Für dieses neue, modifizierte Verfahren wird das zellfreie in vitro-System im allgemeinen durch Lysieren von Zellen eines Mikroorganismus der Gattung Xanthomonas, vorzugsweise Xanthomonas campestris im Vorhandensein eines geeigneten Puffers, vorzugsweise umfassend EDTA, und durch Gewinnen der geeigneten, biosynthetischen Enzyme, die fähig sind, nachfolgend von außen zugefügte Substrate zu prozessieren, hergestellt. Alternative Lysemittel können verwendet werden, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf Beschallung, French-Druckkammer, Behandlung mit Detergens, Behandlung mit Enzym und Kombinationen davon.
Um die varianten, erfindungsgemäßen Polysaccharide herzustellen, wird im allgemeinen ein Lysat eines Mikroorganismus, das die Enzyme besitzt, die benötigt werden, das gewünschte Polysaccharid zusammenzusetzen, mit geeigneten Substraten inkubiert, die in Abhängigkeit von dem gewünschten Gummi UDP-Glucose, GDP-Mannose, UDP-Glucuronsäure, Acetyl-Co A umfassen könnnen. Die Wahl der Substrate hängt von dem gewünschten, herzustellenden Polysaccharid ab. Zum Beispiel wird ein nicht-acetyliertes Polysaccharid durch weglassen von Acetyl-Co A als Substrat erhalten. Ähnlich wird ein nicht-pyruvyliertes Gummi durch Weglassen von Phosphoenolpyruvat als Substrat erhalten. Chemische und/oder enzymatische Behandlungen der Zelllysate zum Entfernen von endogenen Substraten werden für den Fachmann offensichtlich sein.
Zusätzlich können zellfreie Systeme von mutierten Organismen erzeugt werden, die für ein oder mehrere Enzym(e) des in Figur 1 dargestellten Biosynthesewegs von Xanthan defizient sind. Solche von Mutanten stammenden Zellysate würden die hierin beschriebenen, varianten Gummis entweder allein aufgrund der Mutation oder aufgrund der Mutation in Kombination mit einem fehlenden Substrat herstellen.
Der biosynthetische Prozeß kann in einer Ausführungsform durch den Einbau von radioaktiv markierten Substraten in die polymeren Einheiten überwacht werden. Weitere Verfahren, die Durchschnittsfachleuten bekannt sind, können ebenso verwendet werden, um die biosynthetischen Zwischenverbindungen zu identifizieren. Insbesondere sind chromatographische Methoden entwickelt worden, um die Oligosaccharid-Zwischenverbindungen zu trennen und zu identifizieren. Diese umfassen Dünnschichtchromatographie und Hochleistungsflüssigchromatographie.
Es ist gefunden worden, daß die zellfreie Biosynthese von Xanthan ein zeitabhängiger, sequenzieller Prozeß ist, der von der Zugabe aller drei spezifischen Zuckernudeotide abhängig ist. Der Hintergrund eines nicht-spezifischen Einbaus markierter Substrate ist minimal und interferiert nicht mit der Bestimmung des Xanthan-spezifischen Polymers in der Gummi-Fraktion.
Die Beteiligung von Lipid-Carriern, spezifisch Isoprenoidpyrophosphat, ist für mehrere biosynthetische Polysaccharid-Stoffwechselwege gezeigt worden. Zusätzlich ist die Beteiligung von Pyrophosphoryl-verknüpften Lipid-Carriern bei der Xanthan-Biosynthese gezeigt worden. Folglich ist gefunden worden, daß die biosynthetischen Zwischenverbindungen von Xanthan in der in organischen Lösungsmitteln löslichen Fraktion mit diesen Carrier- Lipiden gewinnbar sind. Das gewonnene Oligosaccharid kann nachfolgend von dem Carrier-Lipid durch milde, saure Hydrolyse bei z. B. p H 2 für 20 Minuten bei 90º C freigesetzt und mit alkalischer Phosphatase für die Analyse dephosphoryliert werden.
Unter Verwendung dieser Verfahren für die Gewinnung der Zwischenprodukte ist entdeckt worden, daß gewisse Lysate von X. campestris-Mutanten unter in vitro-Bedingungen nicht-acetylierten oder nicht-pyruvylierten Xanthan-Gummi sogar im Vorhandensein aller Substrate, die benötigt werden, um nicht-varianten Gummi zu synthetisieren, herstellen werden. Angesichts der hierin offenbarten Lehren werden diese Verfahren einen Fachmann befähigen, Zellysate zu identifizieren, die weitere, veränderte Polysaccharide herstellen.

In vivo-Polysaccharidsynthese

Die Entwicklung des zellfreien Syntheseverfahrens für die vorstehend beschriebenen Polysaccharide zeigte, daß verschiedene Xanthomonas campestris-Zellen alle Enzyme besitzen, die notwendig sind, um acetyliertes oder nicht-acetyliertes Polytetramer, nicht-acetylierten und/oder nicht-pyruvylierten Xanthan-Gummi und vollständig acetylierten Xanthan-Gummi zu synthetisieren.
Außerdem würden Blockierungsmittel für den Ayetylierungsschritt während der Xanthan-Gummi-Synthese benötigt, damit ganze Zellen nicht-acetyliertes Xanthan-Gummi synthetisieren. Zusätzlich, damit die ganzen Zellen nicht-acetyliertes, nicht-pyruvyliertes Xanthan-Gummi synthetisieren, würden Blockierungsmittel zur Blokkade der Xanthan-Gummi-Synthese sowohl am Acetylierungs- als auch am Pyruvylierungsschritt notwendig sein.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wurde Mutagenese angewendet, um das für diese Reaktion verantwortliche Gen zu verändern.
Transposons, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf Tnl O und Tn903 können verwendet werden, um Xanthomonas campestris zu mutagenisieren. Diese Transposons übertragen in einer Ausführungsform Resistenz gegenüber Tetracyclin bzw. Kanamycin. Transposons haben die Fähigkeit, sich in Gene zu inserieren, wodurch sie Mutationen durch das Unterbrechen der codierenden Sequenz verursachen. Die Transposons können in Xanthomonas campestris auf verschiedenen Vektoren eingeführt werden, umfassend sogenannte Suizid-Vektoren, wie p RK2013. Der Vektor p RK2013 besitzt, wie beschrieben von Ditta, G., Corbin, D. und Helinski, D.R. in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77:7347-7351 (1980), durch Bezugnahme hierin Bestandteil, die Fähigkeit, sich in nicht-enterische Bakterien, wie Xanthomonas campestris, zu transferieren, jedoch kann er nicht in diesem Wirt replizieren. Folglich sind, wenn der Suizidvektor in eine Population von Xanthomonas campestris-Zellen eingeführt wird und diese Population nachfolgend mit entweder Tetracyclin oder Kanamycin konfrontiert wird, die überlebenden Individuen solche, in denen sich eines der Transposons in das Genom von Xanthomonas campestris inseriert hat. Überlebende einer solchen Konfrontation können auf solche Individuen durchgesucht werden, die die Fähigkeit verloren haben, Xanthan-Gummi herzustellen. Solche Mutanten erscheinen weniger schleimig als Wildtyp-Xanthomonas campestris.
In weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsformen können andere Mutagenesemittel verwendet werden, um Mutanten zu erzeugen, die die Fähigkeit verloren haben, Xanthan-Gummi herzustellen oder die die Gummis, die sie herstellen, nicht acetylieren und/oder pyruvilieren. Solche Mittel werden Fachleuten offensichtlich sein und umfassen ohne Beschränkung Bestrahlung, rekombinante DNA-Technologie (insbesondere wie beschrieben in US-A-842 944 von Capage et al. mit dem Titel "Recombinant-DNA Mediated Production of Xanthan Gum", eingereicht am 26. März 1986 und durch Bezugnahme hierin Bestandteil und im nachstehenden Beispiel 1) und Behandlung mit einem chemischen Mutagen. Beispiele solcher Mutagenisierungsverfahren sind beschrieben worden von Miller, J.H. in Experiments in Molecular Genetics (1972); Davis, R.W., Bostein, D. und Roth, JR. in Advanced Bacterial Genetics (1980); und Maniatis, T., Fritsch, E.F. und Sambrook, J. in Molecular doning (1982), Cold Spring Harbor.
Obwohl die Mutanten zuerst ausgewählt werden können, die weniger schleimig im Vergleich zu Wildtyp-Organismen erscheinen, behalten die gewünschten im allgemeinen die Fähigkeit bei, einige Polysaccharide herzustellen. Zellfreie Extrakte jeder der Xanthan- Mutanten können hergestellt und wie vorstehend bemerkt durch die Zugabe von verschiedenen Kombinationen an Substraten und durch die Analyse der sich ergebenden Produkte getestet werden.
Alternativ dazu können geeignete Mutanten durch das Testen des Kulturmediums jeder Mutante auf das Vorhandensein des gewünschten Polysaccharids, z. B. Xanthan-Gummi, der nicht-acetyliert oder nicht-acetyliert und nicht pyruvyliert, niedrig pyruvyliert oder voll acetyliert ist, ausfindig gemacht werden. Folglich können Mutanten gefunden werden, die anscheinend an verschiedenen Stellen des Synthesewegs von Xanthan-Gummi blockiert sind. Eine Mutante von Xanthomonas campestris, die nicht-acetylierten Xanthan- Gummi (X1006) herstellt, eine Mutante, die nicht pyruvyliertes Gummi (X921) herstellt, eine Mutante, die Xanthan-Gummi herstellt, der geringe Levels der Pyruvylierung (weniger als 5% an der terminalen Mannose X934) herstellt, und eine Mutante, die nicht-acetyliertes, nicht-pyruvyliertes Xanthan-Gummi (X1231 (P41KS22)) herstellt, sind jeweils bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland unter den Hinterlegungsnummern 53473, 53472, 53474 bzw. 67344 hinterlegt worden.
Es überschreitet nicht den Schutzumfang der Erfindung, Enzyminhibitoren der Wildtyp-Acetylase und -Ketalase zu verwenden, um zu denselben Produkten zu kommen. Noch weitere Alternativen zum Herstellen dieser Familie von Polysacchariden werden betrachtet, umfassend enzymatischen und chemischen Abbau von natürlichem Xanthan-Gummi.
Die Mutanten können unter Bedingungen kultiviert werden, die allgemein aus der Literatur für das Wachstum von Wildtyp Xanthomonas campestris bekannt sind. Zum Beispiel können sie auf geeigneten assimilierbaren Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Sucrose, Maltose, Stärke, Invertzucker, komplexen Kohlenhydraten, wie Melasse oder Maissirup, verschiedenen organischen Säuren und ähnlichen kultiviert werden. Mischungen von Kohlenstoffquellen können ebenso verwendet werden. Die Konzentration der angebotenen Kohlenstoffquelle liegt oft zwischen 10 und 60 g/l. Ebenso notwendig für das Wachstum sind eine assimilierbare Quelle organischen oder anorganischen Stickstoffs, im allgemeinen zwischen ungefähr 0,1 und 10,0 g/l und Mineralien, wobei die Wahl im fachmännischen Wissen liegt. Beispiele geeigneter Stickstoffquellen sind Ammoniumsalze, Nitrate, Harnstoff, Hefeextrakt, Pepton oder andere hydrolysierten proteinhaltigen Materialien oder Mischungen davon. Beispiele geeigneter Mineralien umfassen Phosphor, Schwefel, Kalium, Natrium, Eisen, Magnesium; diese werden oft mit einem komplexbildenden Mittel, wie EDTA oder Zitronensäure, zugefügt.
Optimale Temperaturen für das Wachstum von Xanthomonas campestris liegen gewöhnlich zwischen l Bº C und 35º C, vorzugsweise zwischen ungefähr 27º C und 30º C. Xanthomonas campestris-Zellen werden aerob durch Versorgung mit Luft oder Sauerstoff kultiviert, so daß eine angemessene Rate gelösten Sauerstoffs beibehalten wird, z. B. über ungefähr 10 ó Sättigung. Vorzugsweise wird die Rate über 20 % gehalten. Der p H wird oft bei ungefähr 6,0 bis 8,0 gehalten, vorzugsweise bei ungefähr 6,5 bis 7,5. Die erfindungsgemäßen Polysaccharide können aus dem Fermentationsmedium durch geeignete Mittel gewonnen werden. Eine Präzipitation mit Isopropanol, Ethanol oder anderen geeigneten Alkoholen ergibt auf einfache Weise die erfindungsgemäßen Polysaccharide. Gewöhnlich werden die Alkohole zu einer Konzentration von ungefähr 50 bis 75 %, bezogen auf das Volumen, zugefügt, vorzugsweise in Gegenwart von Kaliumchlorid, Natriumchlorid oder anderen Salzen. Alternativ dazu können die Polymere von dem Medium durch Ultrafiltration gewonnen werden.
Nicht-pyruvylierte Xanthan-Gummis sind den Xanthanen als Mittel für eine Erhöhung der Viskosität von wäßrigen Medien bei besonderen Anwendungen überlegen. Die Viskosität von Lösungen von nichtacetyliertem Xanthan und nicht pyruvyliertem Xanthan wird bei Bedingungen einer hohen Temperatur und/oder hohem Salzgehalt gehalten.
Die erfindungsgemäßen Produkte sind ideal geeignet für die Verwendung bei der sekundären und tertiären Ölgewinnung.
Mobilitätskontrollösungen für die Verwendung bei verbesserter Ölgewinnung können auch ausgehend von den hierin offenbarten, varianten Polysaccharid-Polymeren hergestellt werden. Lösungen der Polysaccharid-Polymeren in einer Konzentration von ungefähr 50 bis ungefähr 3000 ppm sind für solche Mobilitätskontrollösungen geeignet. Weitere bekannte Zusätze können in Verbindung mit diesen Lösungen verwendet werden, um die Ölgewinnung zu verbessern. Solche Zusatzstoffe umfassen z.B. oberflächenaktive Mittel, alkalische Mittel oder Metall oder organische quervernetzende Mittel.
Die Polysaccharid-Polymere können, wie Xanthan-Gummi, als Verdikkungsmittel in Lebensmitteln, Kosmetika, medizinischen Formulierungen, Papierleimungen, Spülflüssigkeiten, Druckertinte und ähnlichem und als Quellmittel verwendet werden. Zusätzlich können sie verwendet werden, um den Reibungswiderstand von einem Flüssigkeitsstrom zu vermindern.

Beispiel 1

Dieses Beispiel zeigt Mutagenese- und Screening-Verfahren, die angewendet wurden, um X. campestris-Mutantenstämme mit Defekten hinsichtlich der Acetylase- oder Ketalase Aktivität zu erzeugen.
Es ist gezeigt worden, daß die Gene, die die Enzyme der Biosynthese von Xanthan-Gummi codieren, eine Gruppe aufeinanderfolgender Gene auf dem X. campestris-Chromosom umfassen. Dieses "Gummi- Gen-Cluster" ist im einzelnen von Capage et al. beschrieben worden. Segmente der Gummi-Gen-DNA sind in Plasmidvektoren, wie p MW79, doniert worden, wie im einzelnen in Capage et al. beschrieben.
Auf eine Region gerichtete Mutagenese wurde an subclonierten Teilen der im Plasmid p MW79 donierten Gummi-DNA durchgeführt. Diese donierten DNA-Segmente wurden in vivo mit Transposons und in vitro unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie mutagenisiert, um Insertions-, Deletions- und Substitutionsmutationen innerhalb der donierten x. campestris-DNA zu erzeugen. Um die durch diese Mutationen verliehenen pHänotypen zu untersuchen, wurden die die Mutationen tragenden Plasmide in X. campestris rücküberführt und nachfolgend wurden Rekombinante identifiziert, bei denen das in dem Plasmid enthaltene mutierte Gen über homologe Rekombination in das Chromosom inseriert worden war. Die durch Tnl O codierte Tetracyclin-Resistenz gewährt ein geeignetes Selektionssystem hinsichtlich einer Übertragung von Mutationen von einem Plasmid auf das Chromosom.
Ein Mutantenstamm (X1006) trug eine Tnl O-Insertion, die eine Inaktivierung der Acetylase-Aktivität verursachte. Dieser Mutantenstamm wurde wie in Beispiel 2 und 3 beschrieben charakterisiert und es wurde gefunden, daß dieser ein Polysaccharid herstellte, das nicht-acetyliert war. Ein zweiter Mutantenstamm wurde durch in vitro-Insertion eines DNA-Fragments, das das Tetracyclinresistenz-Gen von Tnl O enthielt, in eine Restriktionsstelle innerhalb des Gummi-Genclusters konstruiert. Es wurde gefunden, daß dieser Mutantenstamm (X921) einen Defekt hinsichtlich der Ketalase-Aktivität besaß. Wie durch die Verfahren der Beispiele 2 und 3 gefunden, produzierte diese Mutante Xanthan, das nicht-pyruvyliert war.
Ein dritter Mutantenstamm (X934) mit stark reduzierter Ketalase- Aktivität wurde ebenso gefunden. Dieser Mutantenstamm produziert Xanthan-Gummi, der eine sehr geringe Pyruvylierungsrate aufwies: 1-5 % der in normalem Xanthan gefundenen Pyruvylierungsrate.
Der Mutantenstamm X934 wurde wie nachstehend beschrieben gefunden. In vorläufigen Experimenten, die darauf ausgerichtet wurden, Rekombination zwischen Plasmid-getragener X. campestris-DNA und dem X. campestris-Chromosom zu untersuchen, wurde das Plasmid p TX655 als Modellsystem verwendet. Dieses Plasmid trägt ein Tnl O- Insert in der Mitte des im Plasmid R5F1010 donierten 2,3 kb langen X. campestris Pst I-Fragments. Diese Tnl O-Insertion verursacht den Defekt bei der Gummisynthese in dem Mutantenstamm X655, wie beschrieben von Capage et al. und Vanderslice et al. Das Experiment bestand darin, p TX655 mit dem Plasmid p RK2013 zu mobilisieren und von E. coli in X. campestris durch Selektion auf den Transfer der durch Tnl O codierten Tetracyclinresistenz zu überführen. Die anfänglichen Ergebnisse dieser Kreuzung waren anormal und deuteten daraufhin, daß Tnl O keine effiziente Tetracyclinresistenz in X. campestris exprimierte, wenn dieses auf dem Plasmid getragen wurde, daß jedoch die Resistenz effizienter exprimiert wurde, wenn Tnl O im Chromosom von X. campestris getragen wurde. Dieses Phänomen ist für Tnl O auch bezüglich E. coli beschrieben worden. Dort ist gezeigt worden, daß Stämme, die eine Kopie von Tnl O in das Chromosom inseriert tragen, resistent gegenüber signifikant höheren Konzentrationen von Tetracyclin sind als Stämme, die Tnl O auf einem Multicopy-Plasmid tragen. Die Selektion auf Tetr X. campestris aus der vorstehend beschriebenen Kreuzung ergab eine hohe Frequenz (0,5 pro Rezipient) an Nachkommen, die sehr schlecht (d.h. nur kleine wäßrige Kolonien) auf Tetracyclin wuchsen. Nach verlängerter Inkubation bildete ein großer Anteil der Kolonien (25 %) Sektoren besser wachsender Zellen. Mehr als 50 % dieser Sektoren schienen hinsichtlich der Morphologie Gummi(-) zu sein. Diese ergaben sich wahrscheinlich aus einer Rekombination zwischen der die Tnl O-Insertion tragenden, in dem Plasmid enthaltenen DNA und der chromosomalen Wildtyp-DNA. Wenn Tnl O in das Chromosom rekombiniert ist, werden hohe Raten an Tetr erhalten und der schnell wachsende Sektor wird beobachtet. Als diese Gummi(-), Tetr-Sektoren aufgenommen und auf Tetracyclin nochmals ausgestrichen wurden, wuchsen sie schnell und zeigten eine charakteristische Gummi(-)-Morphologie.
Gummi(+)-, Tetr-Isolate wurden ebenso charakterisiert. Es wurde gefunden, daß einige dieser Stämme (besonders X934) das vollständige Plasmid p TX655 über homologe Rekombination in das Chromosom von X. campestris inseriert enthalten. Die chromosomale Struktur des X934-Stamms wurde durch Southern blot Hybridisierung der chromosomalen DNA bestimmt, die zeigte, daß die Plasmidsequenzen in einer in das Chromosom integrierten Form vorliegen.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt, wie veränderte, erfindungsgemäße Polysaccharide in vitro hergestellt werden können. Es zeigt beispielsweise, wie nicht-acetylierter und/oder nicht-pyruvylierter Xanthan-Gummi in vitro hergestellt wurde.

Präparation der Lysate

Die in den Beispielen 1 und 5 beschriebenen Xanthomonas campestris B1459 54-L oder 54-L-Mutanten wurden in mit 2 % (Gew./V) Glucose ergänztem YM (Hefe-Malz-Medium) kultiviert, wie beschrieben von Jeanes A. et al., in U.S. Department of Agriculture, ARS.NC-51, S. 14 (1976), durch Bezugnahme hierin spezifischer Bestandteil. Die Kulturen wurden bei 30º C bis zur späten log-Phase wachsengelassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, mit kaltem Tris-H Cl, 70 m M, p H 8,2 mit l Om M EDTA gewaschen und dreimal eingefroren und aufgetaut durch ein Verfahren, das ähnlich zu dem Verfahren von Garcia, R.C. et al. ist, das in European Journal of Biochemistry 43:93-105 (1974), durch Bezugnahme hierin spezifischer Bestandteil, beschrieben wurde. Durch dieses Verfahren wurden die Zellen aufgebrochen, was durch ansteigende Viskosität der Suspension und dem vollständigen Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen (eine aus 10' überlebenden) nach dieser Behandlung nachgewiesen wurde. Die eingefrorenen/aufgetauten Lysate wurden in Aliquots bei -80º C eingefroren. Die Proteinkonzentration wurde durch den BIO RAD-Assay (BIO RAD Laboratories, Richmond, Californien) bestimmt, wodurch gefunden wurde, daß diese 5 bis 7 mg Zellprotein pro ml Lysat betrug.

Diosynthetisches Assay-Verfahren

Wie beschrieben von Ielpi, L., Couso, R.O., und Dankert, M.A. in FEBS Letters 130:253-256 (1981), durch Bezugnahme hierin spezifischer Bestandteil, wurde ein Aliquot des eingefrorenen/aufgetauten Lysats (Äquivalent zu 300 bis 400 µg Protein), D N Aase I (10 µg/ml) und Mg Cl&sub2; (8 m M) bei 20º C für 20 Minuten vorinkubiert. Ein gleiches Volumen von 70 m M Tris-H Cl, p H 8,2 mit den gewünschten radioaktiv markierten Zuckernucleotiden (UDP-Glucose, GDP-Mannose und UDP-Gucuronsäure) wurde zugefügt und bei 20º C inkubiert.
Radioaktiv markiertes Phosphoenolpyruvat und Acetyl-Coenzym A wurden nach Belieben zugefügt, wie beschrieben in Ielpi et al., s.o., und Ielpi, L., Couso, R.O. und Dankert, M.A. Biochem. Biphys. Res. Comm. 102:1400-1408 (1981) und Ielpi, L., Couso, R.O., und Dankert, M.A., Biochem. Intern, 6:323-333 (1983), beide Artikel werden hierin durch Bezugnahme Bestandteil. Zu verschiedenen Zeiten wurden die Reaktionen durch Verdünnung mit 4º C kaltem Puffer gestoppt. Die Proben wurden zentrifugiert und die Pellets wurden zweimal mit Puffer gewaschen. Die Überstände wurden vereinigt, Carrier-Xanthan (100 µg) wurde zugefügt und das Xanthan wurde zusammen mit dem synthetisierten Polymer mit Ethanol (60 %)-K Cl (0,8 ó) prazipitiert. Das präzipitierte Polymer wurde in Wasser resuspendiert und nochmals zweimal präzipitiert, um die nicht eingebauten Markierungssubstanzen zu entfernen. Die in das Präzipitat (als Gummi-Fraktion bezeichnet) eingebaute Radioaktivität wurde in einem Flussigscintillationszähler bestimmt und die Daten wurden verarbeitet, um den Einbau als Picomole der radioaktiv markierten Komponenten zu erhalten.
Zelllysate von X1006 bauten kein Kohlenstoff-14-acetat aus [¹&sup4;C]- Acetyl-Co A in die Gummi-Fraktion des in vitro-Systems ein. Zellysate von 54-L lieferten in vitro mit [¹&sup4;C]-Acetat radioaktiv markierten Gummi. Ähnlich bauten Zellysate von X921 kein [¹&sup4;C]- Pyruvat in die Gummi-Fraktion ein, während 54-L-Zellysate radioaktiv markiertes Pyruvat aus Phosphoenol-[¹&sup4;C]-pyruvat in die Gummi-Fraktion des in vitro-Systems einbauten. Folglich wurde X1006 als ein Mutantenstamm mit einem Defekt im Gen für Acetylase und X921 als ein Mutantenstamm mit einem Defekt im Gen für Ketalase identifiziert. Lysate dieser Stämme produzierten in vitro nicht-acetyliertes bzw. nicht-pyruvyliertes Xanthan.
Es ist auch gezeigt worden, daß ohne geeignete Substrate X. campestris B1459 54-L-Lysate in vitro veränderte Polysaccharide produzierten. Zum Beispiel produzierten Zelllysate von 54-L nichtacetylierten, nicht-pyruvylierten Xanthan-Gummi in vitro, wenn das endogene Acetyl-Co A und Phosphoenolpyruvat verbraucht worden war.

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt die Verwendung des für Acetylase defizienten Stamms X1006, um nicht-acetylierten Gummi in vivo zu produzieren. Dieses Beispiel zeigt auch, die in vivo-Produktion des nicht-pyruvylierten Gummis durch den Ketalase-minus-Stamm X921 und von Xanthan-Gummi mit einem verminderten Pyruvylierungsgrad durch den Stamm X934.
Die drei vorstehend beschriebenen Mutantenstämme und 54-L wurden über Nacht im Medium mit 2 ó Glucose bei 30º C kultiviert. Der Gummi wurde gewonnen durch Entfernen der Zellen durch Zentrifugation, Präzipitieren des Gummis aus dem Überstand und durch Zufügen von 2-Propanol oder Ethanol mit 0,5 bis 1 % Kaliumchlorid. Das Gummi-Prazipitat wurde durch Zentrifugation gewonnen und resuspendiert. Das Verfahren wurde wiederholt. Der resuspendierte Gummi wurde gegen Wasser dialysiert. Eine Probe von jedem Polysaccharid wurde säurehydrolysiert und durch HPLC unter Verwendung einer BIO RAD HPX-87H-Säule analysiert. Xanthanbestandteile wurden durch Injektion von Vergleichsverbindung bekannter Konzentration quantifiziert.
Die HPLC-Analyse des hydrolysierten Gummis zeigte, daß X921 Xanthan-Gummi ohne Pyruvat produzierte. Der Stamm X1006 produzierte Xanthan-Gummi ohne Acetat. Der Stamm X934 produzierte einen Gummi, der Pyruvat zu einer Rate von 1 bis 5 % im Vergleich zum 54-L-Gummi enthielt.

Beispiel 4

Dieses Beispiel beschreibt Methoden und Strategien, die angewendet werden können, um Mutanten von X. campestris zu konstruieren, die Xanthan herstellen werden, welches sowohl nicht-acetyliert als auch nicht-pyruvyliert ist.
Mutantenstämme von X. campestris, denen Ketalase (X921)- oder Acetylase (X1006)-Aktivität fehlt, sind beschrieben worden. Man könnte mikrobielle Genetik und rekombinante DNA-Methoden, wie beschrieben von Vanderslice et al. und Capge et al. beschrieben, verwenden, um einen Ketalase-Defekt und einen Acetylase-Defekt in einen einzigen Stamm von X. campestris einzuführen. Dieser Doppelmutantenstamm würde Xanthan-Gummi produzieren, der sowohl nicht-acetyliert als auch nicht-pyruvyliert ist.
Methoden zum Herstellen von Insertionsmutationen in donierte in Plasmidvektoren enthaltene Gummigen-DNA sind von Capage et al. beschrieben worden. Man könnte sich die Verwendung eines Plasmids, welches die Insertionsmutation trägt, die den Mutantenstamm X921 hervorbringt, als ein Substrat für eine zweite in vivo- oder in vitro-Mutagenese vorstellen. Für diese zweite Mutageneserunde kann man jedes der verschiedenen transposablen Elemente verwenden, das einem Durchschnittsfachmann leicht zugänglich sein würde, oder jedes von verschiedenen, ebenso naheliegenden DNA- Restriktionsfragmenten, die selektierbare Marker enthalten. Eine Reihe von Plasmiden, die zwei Insertionsmutationen tragen, könnten für die Genaustauschtechnik von Capage et al. verwendet werden, um die Plasmid-getragenen Mutationen in das Chromosom von X. campestris zu transferieren.
Die pHänotypen der sich ergebenden Stämme können durch die von Vanderslice et al. und Capage et al., so., im Beispiel 2 beschriebenen in vivo- und in vitro-Techniken analysiert werden.
Diese Analysen werden Doppelmutantenstämme erkennen lassen, die sowohl hinsichtlich der Ketalase als auch der Acetylase-Aktivität blockiert sind. Diese Doppelmutantenstämme werden Xanthan produzieren, das gleichzeitig nicht-pyruvyliert und nicht-acetyliert ist.

Beispiel 5

Dieses Beispiel diskutiert das Clonieren des Acetylase-Gens und des Ketalase-Gens in Vektoren, um sicherzustellen, daß die hierin beschriebenen Polysaccharide vollständig acetyliert, vollständig pyruvyliert oder beides sind.
Die X. campestris-Stämme X1006 und X921 besitzen Mutationen in den Genen für Acetylase bzw. Ketalase, wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben wurde. Diese Mutationen wurden unter Anwendung der im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erzeugt. Für einen Fachmann ist es möglich, die in Betlach et al. s.o., beschriebenen Verfahren anzuwenden, um native, die Acetylaseoder Ketalase- Gene enthaltenden DNA-Restriktionsfragmente zu gewinnen. D.h., Plasmide mit DNA-Restriktionsfragmenten, die die durch einen Resistenzmarker unterbrochenen Acetylase- oder Ketalase-Gene tragen, können verwendet werden, genomische lambda-Banken zu durchsuchen, um native DNA-Sequenzen für das Acetylaseoder Ketalase- Gen zu erhalten. In einer weiteren Ausführungsform sind die Gene für die Acetylase- und Ketalase-Enzyme bereits auf dem Plasmid p RK290-H336, wie beschrieben von Capage et al., s.o., und anderen hierin beschriebenen Plasmiden doniert worden. Für Fachleute ist es einfach, die Acetylase- und Ketalase-Gene für sich von diesen Plasmiden subzudonieren.
Die durch eine der beiden Verfahren erhaltenen DNA-Sequenzen können danach unter Verwendung der in Betlach et al. und Capage et al. beschriebenen Verfahren in Plasmide inseriert werden, die zur Replikation in X. campestris, wie z. B. p MW79, fähig sind. Die Expression des Acetylase- und/oder Ketalase-Gens kann durch Modifizierung der bestehenden DNA-Sequenzen oder durch Insertion von regulierbaren Promotoren stromaufwärts von diesem Gen kontrolliert werden. Solche Techniken sind Fachleuten auf dem Gebiet der Molekularbiologie und Genetik gut bekannt. Ebenso können die Plasmide, in die die Gene inseriert werden, Plasmide mit hoher Kopienanzahl sein. Wie in Capage et al. beschrieben, sind die Enzyme für die Xanthan-Biosynthese in niedrigen Mengen in X. campestris vorhanden. Das Einbringen der vorstehend beschriebenen Plasmide in X. campestris und das Wachsenlassen der Kulturen unter für die Expression der Plasmid-getragenen Gene geeigneten Bedingungen wird eine Synthese von einer viel größeren Anzahl von Acetylase und/oder Ketalase-Enzymen im Vergleich zu den anderen Enzymen für die Xanthan-Biosynthese ergeben. Die Überexpression von Acetylase sollte verursachen, daß das Xanthan-Polysaccharid vollständig acetyliert ist, d.h. daß alle internen Mannose-Reste acetyliert sind. Ähnlich sollte die Überexpression von Ketalase verursachen, daß das Xanthan-Polysaccharid vollständig an der terminalen Mannose pyruvyliert ist.
Es sollte für Fachleute naheliegend sein, daß eine vollständige Acetylierung und vollständige Pyruvylierung von Xanthan durch die vorstehend beschriebenen Verfahren erreicht werden können.

Beispiel 6

Dieses Beispiel bemonstriert die ökonomischen und technischen Vorteile eines nicht-pyruvylierten Polysaccharids, das durch einen genetisch modifizierten Xanthomonas-campestris-Stamm erzeugt wurde zur Erhöhung der Viskosität von Wasser bei hohen Temperaturen.
Xanthan-Gummi, ein natürliches Produkt von Xanthomonas-campestris, ist ein effektiver Viskositätserhöher von Wasser zur Verwendung in z. B. der verstärkten Wiedergewinnung von Petroleum. Diese Viskositätsanwendungen machen es häufig notwendig, daß Xanthan-Gummi bei einer hohen Temperatur und in Salzsolen angewendet wird. Xanthan-Gummis sind effektive Viskositätserhöhungsmittel, sogar bei einer hohen Temperatur (z.B. 75ºC bis 100ºC), obwohl ihre Viskosität darüber bei geringerer Temperatur (z.B. 250 bis 60ºC) wesentlich reduziert ist.
Die Erfinder haben ein neues Polysaccharid entdeckt, das durch einen genetisch modifizierten Stamm von Xanthomonas-campestris (Stamm X921) hergestellt wird, das eine Viskosität bei einer hohen Temperatur erzeugte, die der von Wildtyp Xanthan-Gummi entsprach, produziert von dem S4-L Parentstamm (Stamm X237). Dieses Xanthan-Gummi hatte die normale pentamere Xanthan-Struktur, enthielt aber auf Grund der genetischen Modifikation keinen Pyruvat- Anteil an der terminalen Mannose. Dieses neue Polysaccharid hatte eine geringe Viskosität bei der Fermentationstemperatur nahe 30ºC, was zu einer wesentlichen Kosteneinsparung und Vorteilen bei der Verarbeitung führen wird. Die Kosten zur Herstellung von pyruvyliertem Xanthan-Gummi sind vor allem hoch, da die hohe Viskosität des Polymers eine große Energiezufuhr für das Rühren, die Belüftung und das Abkühlen benötigt.
Figur 2 zeigt einen Viskositätsvergleich des neuen, nicht-pyruvylierten Xanthan-Gummis mit einem Wildtyp Xanthan-Gummi, der durch einen nicht modifizierten Elternteil hergestellt wurde. Das Wildtyp-Gummi zeigt eine hohe Viskosität bei geringer Temperatur aber die Viskosität nimmt schnell mit steigender Temperatur ab. Das nicht pyruvylierte Gummi zeigt dagegen eine geringere Viskosität bei niedriger Temperatur, erhält aber die Viskosität bei hoher Temperatur im wesentlichen äquivalent zum Wildtyp Xanthan-Gummi.
Die in Figur 2 angegebenen Viskositäten werden bei einer Scherungsrate von 8 s&supmin;¹ in einem konzentrischem Zylinder-Viskometer auf Lösungen von 1000 ppm aktiven Polymerfeststoffen in 5000 ppm NaCl-Sole bestimmt.

Beispiel 7

Dieses Beispiel zeigt die Vorteile von nicht acetyliertem Xanthan, das durch einen genetisch modifizierten Xanthomonas campestris-Stamm produziert wurde, für die Verwendung als ein die Viskosität erhöhendes Mittel für wäßrige Lösungen.
Die Figur 3 vergleicht die Viskositäten von chemisch deacetyliertem, kommerziellen Xanthan und seiner Stammverbindung mit denjenigen eines nicht-acetylierten Xanthan-Polysaccharids, das durch genetisch manipulierten Xanthomonas campestris (Stamm X1006) hergestellt wurde und mit denjenigen des vom Wildtyp-X. campestris (Stamm X237) hergestellten Xanthan-Gummis. Die Viskositäten wurden durch eine Scherungsrate von 8 s ¹ für 1000 ppm Polymerkonzentration in 50 000 ppm Na Cl-Sole erhalten. Die Viskositäten wurden über einen Temperaturbereich von 25º bis ungefähr 80º C gemessen.
Die Figur 3 zeigt, daß die chemische Deacetylierung von Xanthan einen Verlust der Viskositäts-erhöhenden Eigenschaft über den gesamten Temperaturbereich ergibt. Jedoch ergibt die Eliminierung der Acetylierung durch genetische Verfahren eine wesentlich erhöhte Viskosität im Vergleich zum Wildtyp-Xanthan-Gummi. Folglich ist der durch einen Mutantenstamm von X. campestris produzierte Xanthan-Gummi ein verbessertes Polysaccharid verglichen mit Xanthan selbst und verglichen mit durch chemische Methoden produziertem deacetylierten Xanthan.

Beispiel 8

Dieses Beispiel beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden, um einen Doppelmutantenstamm von X. campestris zu konstruieren, der nicht-acetyliertes, nicht-pyruvyliertes Xanthan produziert. Capage et al. haben die donierung eines Genclusters von X. campestris beschrieben, das die Gene enthält, die die Biosynthese von Xanthan-Gummi lenken. Sie beschrieben auch die Isolierung von chromosomalen Deletionsmutationen in X. camdestris, die den gesamten Teil oder verschiedene Teile dieses Genclusters eliminieren. Einer solchen Deletionsmutante, Stamm X1231, fehlt die gesamte X. campestris-DNA, die vom rekombinanten Plasmid p RK290- H336 getragen wird. Folglich synthetisiert der Stamm X1231 kein Xanthan. Wenn p RK290-H336 in den Stamm X1231 transferiert wird, wird die Fähigkeit, Xanthan zu synthetisieren, wiederhergestellt. Capage et al. beschrieben weiterhin Methoden zum Isolieren und Charakterisieren von Insertionsmutationen des Transposons Tn Kl2 in der donierten auf p RK290-H336 getragenen DNA der Gummi-Gene. Zwei mutierte Plasmide sind p RK290-H336.22 und p RK290-H336.41. Die ungefähren Lokalisierungen der Tn Kl2-Inserts in jedem dieser Plasmide ist in Figur 4 gezeigt. Wenn p RK290-H336.22 in X1231 transferiert wird, produziert der sich daraus ergebende Stamm nicht-acetyliertes Xanthan. Wenn p RK290-H336.41 in X1231 transferiert wird, wird nicht-pyruvyliertes Xanthan produziert. Diese zwei Plasmid-Mutanten sind verwendet worden, um mittels in vitro- Rekombination ein Plasmid mit einer Doppelmutation zu konstruieren, welches die Synthese von nicht-acetyliertem, nicht-pyruvyliertem Xanthan lenkt, wenn es vom Deletionsstamm X1231 getragen wird.
Die in vitro-Strategie zum Erzeugen eines Plasmids mit einer Doppelmutation, die zu nicht-acetyliertem, pyruvyliertem Xanthan führt, ist folgendermaßen. Ein Kanamycin-empfindliches (Kans) Derivat von p RK290-H336.41 wurde durch Ausführen einer partiellen Hind 111-Spaltung des Plasmids erzeugt, durch Ligieren der Spaltungsprodukte bei sehr niedrigen DNA-Konzentrationen (um intramolekulare Ligation zu fördern) und durch Screening von Tetracyclin Resistenten (Tetr)-Transformanten auf Kanamycin-Empfindlichkeit. Plasmid-D N As wurden danach aus Tetr-, Kans-Isolaten präpariert und durch Spaltung mit Restriktionsendonuclease und Agarosegelelektroporese analysiert. Es gibt nur drei Hind III-Stellen in p RK290-H336.41 und zwei davon innerhalb von Tn Kl2, die vor und hinter dem Kan-Gen liegen. Folglich wurde das Kan-Gen aus einem großen Anteil der durch die partielle Spaltung erzeugten Deletionen deletiert, während der Rest des Plasmids intakt blieb. Das Kans-Plasmid trägt noch eine Insertion (1 kb) in dem Katalase-Gen und folglich wurde erwartet, daß es nicht-pyruvylierten Gummi erzeugt. Dieses Plasmid wird p41 K5 bezeichnet. Der nächste Schritt war, das große Spe I-Fragment des mutierten Plasmids p RK290- H336.22, welches nicht-acetylierten Gummi erzeugt, in p41 K5 zu klonieren. Wie in Figur 4 gezeigt, enthält jedes Plasmid drei Spe I-Stellen an den Positionen 758, 771 und 11716 innerhalb der DNA- Sequenz von Capage et al. Das 10,9 kb umfassende Spe I-Fragment trägt die Tn Kl2-Insertion von p RK290-H336.22. Das kleine, (13 bp) Spe I-Fragment liegt vollständig innerhalb eines t RNA-Gens, welches für das Wachstum von X. campestris und für die Xanthan- Produktion nicht essentiell ist. Folglich sollte die Deletion dieses kleinen Spe I-Segments im Prozeß der Konstruktion der Doppelmutante keinen Einfluß auf die Xanthan-Biosynthese haben. Die Plasmide p41 KS und p RK290-H336.22 wurden gereinigt und vollständig mit Spe I verdaut und eine Ligierung wurde durchgeführt. In dieser Ligierung wurde p41 K5/Spel in zehnfachem molaren Überschuß mit H336.22/Spe I ligiert. Wenn Rekombinante, die das Kanr Spe I-Fragment von H336.22 enthalten, selektiert wurden, sollten diese am öftesten mit dem Spe I-Vektorfragment von p41 KS assoziiert sein. Wir führten Transformationen mit diesen Ligierungen durch und erhielten Kanr-Transformanten. Die von diesen Transformanten getragenen Plasmide wurden analysiert, um die interessanten Rekombinanten zu identifizieren. Das gewünschte rekombinante Plasmid wurde schnell unter den Kanr-Transformanten identifiziert. Dieses als p41 K522 bezeichnete rekombinante Plasmid enthält die von p41 K5 stammende Insertion im Katalase-Gen und die von H336.22 stammende Tn Kl2-Insertion innerhalb des Acetylase- Gens. Eine Analyse durch geeignete Restriktionsspaltung bestätigte das Vorhandensein beider Insertionsmutationen und zeigte weiterhin, daß das die Tn Kl2-Mutation enthaltende Spe I-Fragment in korrekter Orientierung inseriert worden war.
Das Plasmid p41 K522 wurde nachfolgend in eine Reihe von X. campestris-Stämme über Konjugation transferiert. Der Stamm X1231 mit der großen Gummi(-)-Deletion war unter den Rezipienten. Bei dieser Deletion fehlt die gesamte DNA der Gummi-Gene, die von p41 K522 getragen wird; daher sollte X1231, der p41 K522 trägt, nicht-acetyliertes, nicht-pyruvyliertes Xanthan produzieren. Das Plasmid ließ sich effizient in X1231 transferieren, und der sich daraus ergebende Phänotyp war offensichtlich schleimig, jedoch signifikant weniger schleimig im Vergleich zur Wildtyp-Kontrolle. Das durch X1231, welcher p41 K522 trägt, produzierte Polysaccharid wurde präpariert und analysiert. Dieses Polymer enthielt Glucose, Mannose und Glucuronsäure, jedoch kein nachweisbares Acetat oder Pyruvat, was zeigt, daß X1231 (p41 K522) den erwarteten nicht-acetylierten, nicht-pyruvylierten Gummi produziert.

Beispiel 9

Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion und die Eigenschaften eines doppelt mutierten Plasmids, das eine Acetylasemutation und eine Transferase IV-Mutation kombiniert.
Capage et al. beschrieben Verfahren zum Isolieren und Charakterisieren von Insertionen des Transposons Tn Kl2 in der durch das Plasmid p RK290-H336 getragenen DNA der Gummi-Gene. Ein mutiertes Plasmid, das eine solche Insertion trägt, ist p RK290-H336.6. Die ungefähre Lokalisierung der Tn Kl2-Insertion in diesem Plasmid ist in Figur 4 gezeigt. Wenn dieses Plasmid in dem Deletionsstamm X1231 vorhanden ist, lenkt es die Synthese des Polytrimer-Gummis als ein Ergebnis der Insertions-Inaktivierung von Transferase IV. Unter Verwendung von Verfahren, die analog zu denjenigen sind, die im Beispiel 8 beschrieben wurden, wurde ein doppelt mutiertes Plasmid konstruiert, das diesen Transferase IV-Defekt mit der auf p RK290-H336.22 getragenen Acetylase-Mutation kombiniert. Ein Kanamycin-empfindliches Derivat von p RK290-H336.6 wurde durch Deletion des Hind III-Fragments von Tn Kl2 abgeleitet. Dieses Plasmid, p6 K5 ist analog zum Kans-Plasmid p41 KS und enthält noch 1 kb von Tn Kl2, das in dem Transferase IV-Gen inseriert ist. Nachfolgend wurde das große Tn Kl2-enthaltende Spe I-Fragment von p RK290-H336.22 in mit Spe I gespaltener p6 KS-Plasmid- DNA, wie in Beispiel 8 beschrieben, ligiert und das doppelt mutierte Plasmid p6 K522 wurde erhalten. Dieses Plasmid trägt Insertionsmutationen in der Transferase IV und der Acetylase. Wenn es in den Deletionsstamm X1231 transferiert wird, sollte es die Synthese von nicht-acetyliertem Polytrimer lenken. Jedoch wurde in mehreren unabhängigen Plasmidtransferexperimenten kein Transfer von p6 K522 in den Stamm X1231 nachgewiesen, obwohl das Plasmid mit einer hohen Frequenz in andere Rezipienten, umfassend sowohl Gummi(-)- als auch Gummi(+)- Stämme, erfolgreich transferiert wurde. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, daß das Vorhanden sein von p6 K522 im Stamm X1231 lethal ist, wahrscheinlich als direktes Ergebnis der Produktion von nicht-acetyliertem Polytrimer-Gummi. Capage et al. beschrieben drei weitere lethale Mutationen innerhalb des Gummi-Genclusters und schlossen, daß diese lethalen Mutationen die Anhäufung einer toxischen Zwischenverbindung bei der Xanthan-Biosynthese verursachen. Die Anhäufung von nicht-acetyliertem Polytrimer könnte potentiell toxisch sein, wenn dieses Polysaccharid durch das Transportsystem, das normalerweise Xanthan sezerniert, nicht sezerniert werden kann.
Die Anwendung der erfindungsgemäßen Lehren auf einen spezifischen Mikroorganismus sollte angesichts der hierin enthaltenen Lehren innerhalb der Fähigkeiten eines Fachmanns liegen.
Für Fachleute wird es offensichtlich sein, daß verschiedene Modifikationen und Variationen in die erfindungsgemäßen Verfahren und Produkte eingeführt werden können. Folglich ist beabsichtigt, daß die vorliegende Erfindung die Modifikationen und Variationen dieser Erfindung unter der Voraussetzung umfaßt, daß sie im Schutzumfang der angefügten Ansprüche liegen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen Polysaccharid-Polymers, umfassend sich wiederholende pentamere Einheiten mit einem D-Glucose: D-Mannose: D-Glucuronsäureverhältnis von ungefähr 2:2:1, worin die D-Glucoseanteile in beta-[1,4]-Konfiguration verknüpft sind, innere D-Mannoseanteile in einer alpha-[1,3]-Konfiguration im wesentlichen an alternierende Glucoseanteile gebunden sind, die D-Glucuronsäureanteile in einer beta- [1,2]-Konfiguration an die inneren Mannoseanteile gebunden und äußere Mannoseanteile an die Glucuronsäureanteile in einer beta-[1,4]-Konfiguration gebunden sind, wobei das Polysaccharid-Polymer nicht acetyliert ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

(a) Erhalten eines Acetylase-defizienten Mutanten von Xanthomonas; und

(b) Kultivierung des Xanthomonas unter Bedingungen, die geeignet sind, das Polysaccharid-Polymer zu produzieren.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Polymer nicht pyruvyliert ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Polymer pyruvyliert ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Polymer zu mindestens 90% pyruvyliert ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Xanthomonas-Art Xanthomonas campestris ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei Xanthomonas campestris X1006 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 53473 ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Xanthomonas-Art Xanthomonas campestris ist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei Xanthomonas ein Ketalase- und Acetylase-defizienter Mutant von Xanthomonas ist.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Xanthomonas-Art Xanthomonas campestris ist.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Xanthomonas-Art Xanthomonas campestris X1231 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 67344 ist.

11. Ein mutanter Xanthomonas, der fähig ist zur Produktion des Polysaccharid-Polymers, definiert wie in einem oder mehreren Ansprüchen 1 bis 4.

12. Mutanter Xanthomonas gemäß Anspruch 11, wobei der Xanthomonas ein Acetylase-defizienter Mutant von Xanthomonas ist.

13. Mutanter Xanthomonas gemäß Anspruch 12, wobei der Xanthomonas Xanthomonas campestris ist.

14. Mutanter Xanthomonas, der fähig ist zur Production des Polysaccharid-Polymers, wie definiert in Anspruch 2, wobei der Xanthomonas ein Ketalase- und Acetylase-defizienter Mutant von Xanthomonas ist.

15. Mutanter Xanthomonas gemäß Anspruch 14, wobei der Xanthomonas Xanthomonas campestris ist.

16. Mutanter Xanthomonas gemäß Anspruch 15, wobei der Xanthomonas Xanthomonas campestris X1231 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 67344 ist.

17. Mutanter Xanthomonas X1006 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 53473.

18. Ein wasserlosliches Polysaccharid-Polymer, umfassend sich wiederholende pentamere Einheiten, mit einem D-Glucose: D-Mannose: D-Glucuronsäureverhältnis von ungefähr 2:2:1, wobei die D-Glucoseanteile in einer beta-[1,4]-Konfiguration verknüpft sind, innere Mannoseanteile in einer alpha- [1,3]-Konfiguration im wesentlichen an alternierende Glucoseanteile gebunden sind, die D-Glucuronsäureanteile in einer beta-[1,2]-Konfiguration an die inneren Mannoseanteile gebunden sind und äußere Mannoseanteile mit den Glucuronsäureanteilen in einer beta-[1,4]-Konfiguration verbunden sind, wobei das Polysaccharid-Polymer nicht acetyliert ist, und eine Viskosität aufweist, die größer ist als die Viskosität von chemisch deacetyliertem Xanthan-Gummi.

19. Polysaccharid-Polymer gemäß Anspruch 18, wobei das Polymer eine Viskosität aufweist, die großer ist als die von chemisch deacetyliertem Xanthan-Gummi bei Temperaturen von 25ºC bis 76ºC.

20. Polysaccharid-Polymer gemäß Anspruch 19, wobei das Polymer eine Viskosität aufweist, die grsßer ist als die von chemisch deacetyliertem Xanthan-Gummi bei einer Temperatur von 25ºC.

21. Polysaccharid-Polymer gemäß Anspruch 20, wobei das Polymer eine Viskosität aufweist, die größer ist als die von chemisch deacetyliertem Xanthan-Gummi bei 25ºC bei einer Scherungsrate von 8s&supmin;¹ für eine 1000 ppm Polymerkonzentration in 50.000 ppm NaCl-Sole.

22. Polysaccharid-Polymer gemäß Anspruch 21, wobei das Polymer eine Viskosität von ungefähr 2,0 cP aufweist.

23. Polysaccharid-Polymer gemäß Anspruch 21, wobei das Polymer eine Viskosität aufweist, die größer ist als 1,5 cP bei einer Temperatur von 70ºC.

24. Wasserlösliches Polysaccharid-Polymer, umfassend sich wiederholende pentamere Einheiten, mit einem D-Glucose: D-Mannose: D-Glucuronsäureverhältnis von ungefähr 2:2:1, wobei die D-Glucoseanteile in beta-[1,4]-Konfiguration verknüpft sind, innere Mannoseanteile in einer alpha- [1,3]-Konfiguration im wesentlichen an alternierende Glucoseanteile gebunden sind, die D-Glucuronsäureanteile in einer beta-[1,2]-Konfiguration an die inneren Mannoseanteile gebunden sind und äußere Mannoseanteile an die Glucuronsäureanteile in einer beta-[1,4]-Konfiguration gebunden sind, wobei das Polysaccharid-Polymer nicht acetyliert ist und eine Viskosität aufweist, die größer ist als die Viskosität von Xanthan-Gummi.