NO172945B - Xanthan-baserte polysakkaridpolymerer innbefattende acetylert eller ikke-acetylert polytetramergummi - Google Patents
Xanthan-baserte polysakkaridpolymerer innbefattende acetylert eller ikke-acetylert polytetramergummi Download PDFInfo
- Publication number
- NO172945B NO172945B NO874846A NO874846A NO172945B NO 172945 B NO172945 B NO 172945B NO 874846 A NO874846 A NO 874846A NO 874846 A NO874846 A NO 874846A NO 172945 B NO172945 B NO 172945B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- acetylated
- xanthan
- stated
- mutant
- campestris
- Prior art date
Links
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims description 60
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims description 59
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims description 56
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 title claims description 36
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 title claims description 21
- 239000005060 rubber Substances 0.000 title claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 60
- 241000589636 Xanthomonas campestris Species 0.000 claims abstract description 54
- 108010013043 Acetylesterase Proteins 0.000 claims description 24
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 claims description 15
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 13
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 claims description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 9
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 claims description 5
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 5
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 125000003423 D-mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 3
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 claims description 3
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 claims description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 3
- 125000002353 D-glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 2
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 abstract description 86
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 20
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 14
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 54
- GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthene Chemical compound C1=CC=C2CC3=CC=CC=C3OC2=C1 GJCOSYZMQJWQCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 description 38
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 description 38
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 13
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 10
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 10
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 10
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 10
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 10
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 9
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 7
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 5
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 description 5
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- -1 isoprenoid lipid Chemical class 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 3
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- MVMSCBBUIHUTGJ-GDJBGNAASA-N GDP-alpha-D-mannose Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)N1C=2N=C(NC(=O)C=2N=C1)N)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O MVMSCBBUIHUTGJ-GDJBGNAASA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- XCCTYIAWTASOJW-UHFFFAOYSA-N UDP-Glc Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 XCCTYIAWTASOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N UDP-alpha-D-glucose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDYANYHVCAPMJV-UHFFFAOYSA-N Uridine diphospho-D-glucuronic acid Natural products O1C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)C(O)C(O)C1COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O HDYANYHVCAPMJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N Uridine-5'-Diphosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 2
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000005553 drilling Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- QGWNDRXFNXRZMB-UHFFFAOYSA-N guanidine diphosphate Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O QGWNDRXFNXRZMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- HDYANYHVCAPMJV-USQUEEHTSA-N udp-glucuronic acid Chemical compound O([P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OC[C@H]1[C@@H]([C@H]([C@@H](O1)N1C(NC(=O)C=C1)=O)O)O)[C@H]1O[C@@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O HDYANYHVCAPMJV-USQUEEHTSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MVMSCBBUIHUTGJ-UHFFFAOYSA-N 10108-97-1 Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C(C(C1O)O)OC1COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O MVMSCBBUIHUTGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical group CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101000729818 Bacillus licheniformis Glutamate racemase Proteins 0.000 description 1
- 101100465058 Caenorhabditis elegans prk-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061764 Chromosomal deletion Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N GDP Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-K GDP(3-) Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-K 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 239000005905 Hydrolysed protein Substances 0.000 description 1
- 101150031639 IV gene Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JCHCVLRLCNOYFR-MRQKVNJWSA-N OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O.O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O.O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O JCHCVLRLCNOYFR-MRQKVNJWSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010564 aerobic fermentation Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-KVTDHHQDSA-N aldehydo-D-mannose Chemical group OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactopyranuronic acid Natural products OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000001547 cellobiose group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical group 0.000 description 1
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229960004903 invert sugar Drugs 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000006903 response to temperature Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K8/00—Compositions for drilling of boreholes or wells; Compositions for treating boreholes or wells, e.g. for completion or for remedial operations
- C09K8/02—Well-drilling compositions
- C09K8/04—Aqueous well-drilling compositions
- C09K8/06—Clay-free compositions
- C09K8/08—Clay-free compositions containing natural organic compounds, e.g. polysaccharides, or derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
- C12P19/06—Xanthan, i.e. Xanthomonas-type heteropolysaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/64—Xanthomonas
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Processes Of Treating Macromolecular Substances (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Oppfinnelsen angår polysakkaridpolymerer. I særdeleshet angår den xantan-baserte polysakkaridpolymerer, definert her som polymerer som strukturelt ligner på xantan-gummi og er produsert av bestanddeler fra xantanbiosyntesen, nærmere bestemt polytetramergummier, både acetylerte og ikke-acetylerte.
Xantan-gummi blir produsert av bakterier av slekten Xanthomonas, i særdeleshet av mikroorganismer av arten X.campestris. Xantan-gummi er et produkt som i stor utstrekning blir brukt på grunn av dens usedvanlige fysiske egenskaper, dvs. dens ekstremt høye spesifikke viskositet og dens pseudo-plastisitet. Den er vanlig brukt i matvarer som et fortyknings-middel og ved sekundær eller tertiær oljeutvinning som et mobilitetsregulerende og profilmodifiserende middel, såvel som i petroleumsborevæsker.
Kjemisk er xantan-gummi et anionisk heteropolysakkarid. Den gjentatte enhet av polymeren er en pentamer bestående av fem sukkerenheter, nærmere bestemt to glukose-, en glukuronsyre- og to mannoseenheter. Disse sukkerrester er arrangert på en slik måte at glukoseenhetene danner ryggraden i polymerkjeden, med sidekjeder av mannose/glukuronsyre/mannoserester generelt ragende ut fra annen hver glukoseenhet. Vanligvis er denne grunnleggende struktur spesifikt acetylert og pyruvylert, som beskrevet av f.eks. P.E. Janson, L. Kenne og B. Lindberg, i Carbohydrate Research, 45:275-282 (1975) og L.D. Melton, L. Minot, D.A. Rees og G.R. Sanderson i Carbohydrate Research, 4^:245-257 (1976), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse. Graden av acetylering og pyruvylering er kjent for å variere. Strukturen av xantan-gummi er vist nedenfor:
På tross av den vide anvendelighet av naturlig forekommende xantan-gummi er der enkelte situasjoner hvor dens fysiske egenskaper blir begrensende. Spesielt er det ved sekundær eller tertiær oljeutvinning ikke uvanlig at temperaturen i det oljebærende reservoar og saltkonsentrasjonene i reservoar-saltlaken er høyere enn det som er optimalt for xantan-oppløsninger. Når slike forhold forekommer, kan xantan felles ut, flokkulere og/eller miste sin viskositet. Det vil derfor være ønskelig med nye viskositetsøkende produkter som virker bra ved forskjellige forhold som kan oppstå under oljeutvinning, f.eks. høye temperaturer og høye saltkonsentrasjoner.
Den foreliggende oppfinnelse angår xantanbaserte polysakkarider med forbedrede egenskaper i forhold til naturlig forekommende xantan-gummi. Modifikasjoner av xantan-gummi er tidligere beskrevet. For eksempel beskriver Bradshaw et al. (Carbohydrate Polymers, 3.:23-38 (1983)) metoder til fremstilling av kjemisk modifisert xantan-gummi som er deacetylert eller depyruvylert. Forskjellige måter til kjemisk deacetylering av xantan-gummi produsert av Xanthomonas campestris er også beskrevet i US patentskriftene 3 000 790 og 3 054 689. Til dags dato har den eneste metode som er benyttet til disse deacetyleringsprosesser vært via kjemisk fjerning av acetatenhetene fra normalt acetylert xantan-gummi. Det er funnet at kjemiske prosesser til deacetylering av xantan-gummi resulterer i en rekke uønskede bivirkninger og kan forårsake hydrolyse av glykosidryggraden, noe som fører til en irreversibel forandring av molekylets konformasjon og redusert molekylvekt.
Noen av de reologiske egenskaper av deacetylert xantan i vandige oppløsninger er kjent, se f.eks. Tako og Nakamura, Agric. Biol. Chem. 48.: 2987-2993 (1984) og US patentskriftene 3 000 790 og 3 054 689. En metode til å øke viskositeten av en vandig oppløsning ved bruk av et deacetylert polysakkarid er også beskrevet i US patentskrift 3 096 293. Derfor har man søkt å finne en metode til å skaffe ikke-acetylert xantan som ikke forårsaker uønskede bivirkninger.
Oppfinnerne har identifisert polysakkarider som er basert på forandringer av den normale xantan-pentamerbyggesten. Disse polymerer oppviser forbedrede reologiske egenskaper i forhold til normal xantan-gummi med hensyn på skjærhastighet, evne til å tåle saltholdighet og respons på temperatur som kan påvirke deres viskositetsøkende egenskaper. Disse endrede polysakkarider inkluderer den polytetramer som er vist nedenfor, og den ikke-acetylerte polytetramer.
Et formål med den foreliggende oppfinnelse er å skaffe polysakkaridpolymerer som er bedre egnet til å øke viskositeten av vann enn naturlig forekommende xantan-gummi. Et annet formål med den foreliggende oppfinnelse er å skaffe polysakkaridpolymerer som har bedre reologiske egenskaper enn naturlig forekommende xantan-gummi ved høye temperaturer og/eller i nærvær av salter, som har andre ønskede egenskaper.
Det er også et formål med den foreliggende oppfinnelse å skaffe en in vitro-metode til oppnåelse av visse av disse produkter og mikroorganismer som har evnen til å produsere polysakkaridpolymerer in vivo. Et ytterligere formål med oppfinnelsen er å skaffe fremgangsmåter til fremstilling av polysakkarider ved aerob fermentering av mikroorganismer som har evnen til å produsere de forskjellige polysakkaridpolymerer.
Andre formål med og fordeler ved oppfinnelsen vil dels bli angitt i den etterfølgende beskrivelse, dels være selvfølgelige fra beskrivelsen eller kunne læres ved praktisering av oppfinnelsen. Formålene og fordelene kan realiseres og oppnås ved hjelp av de trekk og kombinasjoner som er spesielt påpekt i kravene.
For oppnåelse av formålene og i samsvar med hensiktene med oppfinnelsen, slik den er generelt beskrevet i fremstillingen, er der skaffet en sammensetning bestående av en vannoppløselig polysakkaridpolymer som har et forhold mellom D-glukose, D-mannose og D-glukuronsyre på ca. 2:1:1, karakterisert ved at den har en molekylvekt på 10<5->10<7> dalton, at (1) D-glukoseenhetene er bundet i en beta-[1,4]-konfigurasjon, (2) D-mannoseenhetene er bundet i en alfa-[l,3]-konfigurasjon, vanligvis til annenhver glukoseenhet, og (3) D-glukuronsyre-enhetene er bundet i en beta-[1,2]-konfigurasjon til mannoseenhetene og at D-mannoseenhetene kan være acetylert eller ikke-acetylert.
Denne polysakkaridpolymer er her kalt "polytetramer" fordi den består av følgende tetramerenhet som gjentar seg: glukose-glukose-mannose-glukuronsyre. Der er også skaffet en poly-tetramersammensetning som beskrevet ovenfor, hvori minst 90%, fortrinnsvis 95% og helst 100% av mannoseenhetene er acetylert i 6-0-stillingen, såvel som en polytetramer som er ikke-acetylert.
Ifølge oppfinnelsen er der også påtenkt prosesser til fremstilling av de polysakkaridpolymerer som er beskrevet ovenfor. Polysakkaridpolymerene ifølge oppfinnelsen kan generelt fremstilles ved genetiske manipuleringer av de mikrobielle biosyntetiske reaksjonsveier som fører til produksjon av polysakkarider. Nærmere bestemt kan mikrobielle synteseveier til fremstilling av xantan-gummi manipuleres for å lage et in-vivo- eller in-vitro-system til fremstilling av en endret polymerenhet. På denne måte kan man lage systemer ved bruk av regulerbare Acetylase- og Transferase-V-gener, i særdeleshet for å lage tetramerpolysakkarider som er acetylert eller ikke-acetylert. Mikroorganismer som produserer de foreliggende polysakkaridpolymerer in-vivo, og metoder til bruk av disse polysakkaridpolymerer er også beskrevet.
Forskjellige stammer av X. campestris som er mer utførlig beskrevet nedenfor, er blitt deponert ved American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, 21. mars 1986. Disse stammer er X921, X1006, X934 og X1231, og de er deponert som henholdsvis nr. 53472, 53473, 53474 og 67344.
De til fremstillingen hørende tegninger illustrerer forskjellige utførelsesformer for oppfinnelsen og tjener sammen med beskrivelsen til å forklare prinsippene ved oppfinnelsen. Fig. 1 viser den antatte syntesevei for xantan-gummibiosyn-tesen. Forkortelser som er brukt, er Glu = glukose; GluA = glukuronsyre; Man = mannose; Glu-Glu = cellobiose; P = fosfat; PP = pyrofosfat; C55 = isoprenoidlipidbærer; PEP = fosfoenolpyruvat; AcCoA = acetylkoenzym A; I-V = glykosyltransferaser; UDP = uridin-5'-difosfat og GDP = guanosin-5'-difosfat. Fig. 2 viser en viskositetssammenligning mellom vill-type-gummier og ikke-pyruvylerte gummier. Fig. 3 viser en viskositetssammenligning mellom ikke-acetylerte og kjemisk deacetylerte gummier. Fig. 4 viser den omtrentlige fysiske plassering av 3 TnK12-innskuddsmutasjoner i det klonede gummigengruppe-DNA av rekombinant plasmid pRK290-H336. Denne figur viser også den omtrentlige plassering av Spel-restriksjonsendonuklease-spaltingsstedene i pRK290-H336.
Det vil nå i detalj bli henvist til for tiden foretrukne utførelsesformer for den foreliggende oppfinnelse som sammen med de følgende eksempler tjener til å forklare oppfinnelsens prinsipper.
Polysakkaridpolymerene ifølge den foreliggende oppfinnelse er beskrevet i detalj ovenfor. Disse polysakkaridpolymerer kan lages in-vitro med et celle-fritt enzymsystem, eller de kan produseres in vivo ved dyrking av celler av en passende itiutantstamme. Andre måter å lage polysakkaridpolymerene på er også beskrevet nedenfor.
Den grunnleggende metode som angår bruken av et celle-fritt system for fremstilling av ikke-variant xantan-gummi, er beskrevet av L. Ielpi, R.O. Couso og M.A. Dankert i FEBS Letters 130:253-256 (1981), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse. Det er funnet at en modifisert versjon av denne metode kan benyttes til å lage variant-polysakkaridene ifølge oppfinnelsen.
Ved denne nye, modifiserte metode blir det in vitro celle-frie system fremstilt generelt ved lyse av celler av en mikroorganisme av slekten Xanthomonas, fortrinnsvis Xanthomonas campestris, i nærvær av en egnet buffer, fortrinnsvis omfat-tende EDTA, og oppnåelse av de passende biosyntetiske enzymer som deretter er i stand til å bearbeide eksogent tilsatte substrater. Andre metoder for lyse som kan benyttes, omfatter, men er ikke begrenset til, lydbehandling, "French Pressure cell", detergentbehandling, enzymbehandling og kombinasjoner av disse.
For fremstilling av variant-polysakkaridene ifølge den foreliggende oppfinnelse, blir generelt et lysat av en mikroorganisme inneholdende de nødvendige enzymer for å sette sammen de ønskede polysakkarider, inkubert med de passende substrater, som avhengig av den ønskede gummi kan inkludere UDP-glukose, GDP-mannose, UDP-glukuronsyre, acetyl-CoA og fosfoenolpyruvat. Valg av sustrater er avhengig av det polysakkarid som ønskes produsert. For eksempel fås et ikke-acetylert polysakkarid ved eliminering av acetyl-CoA som substrat. Kjemisk og/eller enzymatisk behandling av cellelysatene for å utarme endogene substrater vil være selvsagt for en fagmann.
I tillegg kan celle-frie systemer dannes fra mutant-organismer som mangler en eller flere av enzymene fra den xantan-biosyntetiske vei som er vist på fig. 1. Slike mutant-avledede cellelysater ville produsere de variant-gummier som er beskrevet her, enten utelukkende på grunn av mutasjonen eller på grunn av mutasjonen i kombinasjon med et tilbakeholdt substrat. For eksempel vil et celle-fritt system dannet fra en mutant-kultur som mangler Transferase V, produsere polytetramer, mens det samme celle-frie system uten nærvær av acetyl-CoA vil produsere ikke-acetylert polytetramer.
Den biosyntetiske prosess kan i en utførelsesform overvåkes ved innlemmelse av radioaktivt merkede substrater i de polymere enheter. Andre metoder kan også benyttes for å tillate identifikasjon av de biosyntetiske mellomprodukter som er kjent for fagfolk. Spesielt er der utviklet kromatografiske metoder til å skille og identifisere de oligosakkaride mellomprodukter. Disse innbefatter tynnskiktskromatografi og høytrykksvæske-kromatograf i.
Den celle-frie biosyntese av xantan er funnet å være en tidsavhengig, trinnvis prosess som er avhengig av tilsetning av alle de tre spesifikke sukker-nukleotider. Bakgrunnen av ikke-spesifikk innlemmelse av merket substrat er minimal og vil ikke forstyrre målingen av den xantan-spesifikke polymer i gummifraksjonen.
At lipidbærere, nærmere bestemt isoprenoidpyrofosfat, er involvert, er vist i flere polysakkarid-biosyntetiske veier. I tillegg er medvirkning av pyrofosforyl-bundne lipidbærere i xantan-biosyntesen påvist. Det er således funnet at de xantan-biosyntetiske mellomprodukter kan gjenvinnes i den organiske oppløselige fraksjon med disse bærerlipider. Det gjenvundne oligosakkarid kan deretter befris fra bærerlipidet ved mild syrehydrolyse, f.eks. ved en pH-verdi på 2 i 20 min ved 90°C og defosforyleres med alkalisk fosfatase for analyse.
Ved bruk av disse metoder for gjenvinning av mellomprodukter er det oppdaget at visse lysater av X. campestris-mutanter ved in vitro-betingelser vil produsere ikke-acetylert eller ikke-pyruvylert xantan-gummi selv i nærvær av alle de substrater som er nødvendige for ikke-variantgummisyntese. I lys av læren i den foreliggende beskrivelse vil disse metoder gjøre en fagmann i stand til å identifisere cellelysater som produserer andre endrede polysakkarider, f.eks. et mutant-cellelysat som produserer polytetramergummi.
Utviklingen av den celle-frie synteseprosess for polysakkaridene som er beskrevet ovenfor, viser at forskjellige Xanthomonas campestris-celler har alle de enzymer som er nødvendige for syntetisering av acetylert eller ikke-acetylert polytetramer. For å kunne bruke hele celler til syntetisering av polytetramer in vivo, behøver man imidlertid en måte til å blokkere xantan-gummisyntese ved reaksjon V (se fig. 1). For at hele celler skal syntetisere ikke-acetylert polytetramer, vil man videre trenge en måte til å blokkere såvel acetylerings-reaksjonen (se fig. 1) som reaksjon V.
Transposoner, herunder, men ikke begrenset til TnlO og Tn903, kan brukes for å mutere Xanthomonas campestris. I én utførel-sesform gir disse transposoner resistens mot henholdsvis tetracyklin og kanamycin. Transposoner har evnen til å føye seg inn i gener hvor de forårsaker mutasjoner ved å avbryte den kodende sekvens. Transposonene kan føyes inn i Xanthomonas campestris på forskjellige vektorer, herunder på såkalte selvmordsvektorer som pRK2013. Som beskrevet av G. Ditta, D. Corbin og D.R. Helinski i Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 77:7347-7351 (1980), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse, har vektor pRK2013 evnen til å overføre seg selv inn i ikke-enteriske bakterier såsom Xanthomonas campestris, men den er ikke istand til å replikere seg i denne vert. Hvis selvmordsvektoren blir introdusert i en populasjon av Xanthomonas campestris-celler og denne populasjon så blir utsatt for enten tetracyklin eller kanamycin, vil derfor de individer som overlever, være de hvor én av transposonene er satt inn i genomet til Xanthomonas campestris. Overlevende fra en slik eksponering kan underkastes utsortering av slike som har mistet evnen til å lage xantan-gummi. Slike mutanter kan synes å være mindre mukoide enn vill-type-Xanthomonas campestris.
I andre utførelsesformer for oppfinnelsen kan andre måter for mutagenese bli benyttet til å lage mutanter som har mistet evnen til å lage xantan-gummi, eller som ikke acetylerer de gummier de produserer. Slike metoder vil en fagmann lett komme på, og de inkluderer bestråling, rekombinant-DNA-teknologi (spesielt som beskrevet i US patentsøknad nr. 842 944 av Capage et al., med tittelen "Recombinant-DNA Mediated Production of Xanthan Gum", som er innlevert 26. mars 1986, og hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse, og i eksempel 1 nedenfor) og kjemisk mutagenbehandling, men er ikke begrenset til disse metoder. Eksempler på slike mutagenese-prosedyrer er beskrevet av J.H. Miller i Experiments in Molecular Genetics (1972); R.W. Davis, D. Bostein og J.R. Roth i Advanced Bacterial Genetics (1980); og av T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambrook i Molecular Cloning (1982), Cold Spring Harbor.
Selv om der først kan bli valgt mutanter som synes mindre mukoide enn vill-type-organismer, vil de ønskede mutanter generelt beholde evnen til å lage noe polysakkarid. Celle-frie ekstrakter av hver av xantan-mutantene kan lages og testes som nevnt ovenfor ved tilsetning av forskjellige kombinasjoner av substrater og analyse av de resulterende produkter.
Alternativt kan passende mutanter finnes ved at man bestemmer nærværet av det ønskede polysakkarid i kulturmediet fra hver mutant, f.eks. polytetramergummi som er acetylert eller ikke-acetylert. Derfor kan der finnes mutanter som synes å være blokkert ved forskjellige posisjoner i xantan-gummi-synteseveien.
Det ligger ikke utenfor oppfinnelsens omfang å ta i bruk enzyminhibitorer av vill-type Transferase V og Acetylase for å komme frem til de samme produkter. Ytterligere andre alter-nativer til fremstilling av disse polysakkarider er påtenkt, herunder enzymatisk og kjemisk nedbrytning av naturlig xantan-gummi .
Mutantene kan dyrkes under forhold som er generelt kjent innen området for dyrking av vill-type Xanthomonas campestris. For eksempel kan de dyrkes på egnede assimilerbare karbonkilder såsom glukose, sukrose, maltose, stivelse, invertsukker, komplekse karbohydrater såsom melasse eller maissirup, forskjellige organiske syrer og lignende. Blandinger av karbonkilder kan også benyttes. Konsentrasjonen av de tilsatte karbonkilder er ofte mellom 10 og 60 g/l. Nødvendig for vekst er også en kilde til organisk eller uorganisk nitrogen, generelt på mellom 0,1 og 10,0 g/l, og mineraler som lett kan velges ut av fagfolk. Eksempler på passende nitrogenkilder er ammoniumsalter, nitrat, urea, gjærekstrakt, pepton eller andre hydrolyserte proteinmaterialer eller blandinger av disse. Eksempler på passende mineraler innbefatter fosfor, svovel, kalium, natrium, jern og magnesium. Disse blir ofte tilsatt sammen med et chelateringsmiddel såsom EDTA eller sitronsyre.
Optimale temperaturer for vekst av Xanthomonas campestris ligger generelt mellom 18°C og 35°C, fortrinnsvis mellom 27°C og 3 0°C. Xanthomonas campestris-celler dyrkes aerobt ved tilførsel av luft eller oksygen slik at et tilstrekkelig nivå av oppløst oksygen blir holdt ved like, f.eks. over ca. 10% metning. Fortrinnsvis holdes nivået over ca. 2 0%. pH-verdien blir holdt på 6,0-8,0, fortrinnsvis på 6,5-7,5.
Polysakkaridene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan gjenvinnes fra fermenter ved passende metoder. Utfelling med isopropanol, etanol eller en annen passende alkohol vil uten videre gi polysakkaridene ifølge oppfinnelsen. Generelt blir alkoholer tilsatt til en konsentrasjon på 50-75% på volumbasis, fortrinnsvis i nærvær av kaliumklorid, natriumklorid eller et annet salt. Alternativt kan polymerene gjenvinnes fra fermentet ved ultrafiltrering.
Mobilitetskontroll-oppløsninger til bruk ved økt oljeutvinning kan også fremstilles fra variant-polysakkaridpolymerene som her er beskrevet. Oppløsninger av polysakkaridpolymerene i konsentrasjoner på 50-3000 ppm er passende for slike mobili-tetskontroll-oppløsninger. Andre kjente tilsetningsstoffer kan også benyttes i kombinasjon med disse oppløsninger for å øke oljegjenvinningen ytterligere. Slike tilsetningsstoffer innbefatter f.eks. overflateaktive midler, alkaliske reagenser eller metalliske eller organiske tverrbindingsmidler.
I likhet med xantan-gummi kan polysakkaridpolymerene også benyttes som fortykningsmidler i matvarer, kosmetiske produkter, medikamenter, papirbindemidler, boreslam, trykksverte og lignende og som geleringsmiddel. I tillegg kan de benyttes til å redusere friksjonsmotstanden av en væskestrøm i rørledninger.
EKSEMPEL I
Dette eksempel viser de metoder for mutagenese og sortering som benyttes for å generere X. campestris-mutantstammer som har defekter i Acetylaseaktivitet eller Ketalaseaktivitet.
De gener som koder for enzymene til xantan-gummi-biosyntese, er vist å bestå av en gruppe gener på X. campestris-kromosomet. Denne "gummigengruppe" er beskrevet i detalj av Capage et al. Segmenter av gummigen-DNA er blitt klonet på plasmidvektorer såsom pMW79 som beskrevet i detalj av Capage et al.
Region-rettet mutagenese ble utført på subklonede deler av gummi-DNA båret i plasmid pMW79. Disse klonede DNA-segmenter ble mutagenisert in vivo med transposoner og in vitro ved bruk av rekombinant-DNA-teknologi for å generere innskudds-, slettings- og substitusjonsmutasjoner inne i det klonede X. campestris-DNA. For studium av de fenotyper som fremkommer ved disse mutasjoner, ble de plasmider som bærer mutasjonene tilbakeført til X. campestris, og deretter ble der identifisert rekombinanter hvor det plasmid-bårede, muterte gen var blitt innsatt i kromosomet via homolog rekombinasjon. Den tetracyklinresistens som TnlO koder for, skaffer et fordelaktig utvelgelsessystem for overføring av mutasjonene fra et plasmid til kromosomet.
En slik mutantstamme (X1006) bar et TnlO-innskudd som ble funnet å forårsake inaktivering av Acetylaseaktiviteten. Denne mutantstamme var karakterisert som beskrevet i eksemplene 2 og 3, og ble funnet å produsere et polysakkarid som var ikke-acetylert. En annen mutantstamme ble konstruert ved in vivo-innskudd av et fragment av DNA inneholdende tetracyklin-resistensgenet fra TnlO i et restriksjonssete inne i gummigengruppen. Denne mutantstamme (X921) ble funnet å være uten Ketalaseaktivitet. Som funnet ved metodene i eksemplene 2 og 3, produserte denne mutant xantan som var ikke-pyruvylert.
Der ble også funnet en tredje mutantstamme (X934) med sterkt redusert Ketalaseaktivitet. Denne mutantstamme produserer xantan-gummi med svært lavt pyruvyleringsnivå: 1-5% av det pyruvyleringsnivå som finnes i normalt xantan.
Mutantstammen X934 ble funnet som beskrevet nedenfor. I preliminære forsøk beregnet på å undersøke rekombineringen mellom plasmid-båret X. campestris-DNA og X. campestris-kromosomet, ble plasmidet pTX655 benyttet som modellsystem. Dette plasmid bærer et TnlO-innskudd i midten av et 2,3 kb X. campestris-Pstl-fragment klonet i plasmidet RSF1010. Dette innskudd av TnlO forårsaker Gum~-defekten i mutantstammen X655 som beskrevet av Capage et al. og Vanderslice et al. Forsøket gikk ut på å mobilisere pTX655 med plasmidet pRK2 013 og overføre det fra E. coli til X. campestris ved utvelging for overføring av den tetracyklinresistens som TnlO koder for. De første resultater av denne paring var anomale og antydet at TnlO ikke effektivt uttrykte tetracyklinresistens i X. campestris når det var båret på plasmidet, men at medikament-resistensen ble mer effektivt uttrykt når TnlO var båret i kromosomet av X. campestris.
Dette fenomen er også beskrevet for TnlO i E. coli. Der er det vist at stammer som bærer én kopi av TnlO innsatt i kromosomet, er resistente for betydelig høyere konsentrasjoner av tetracyklin enn stammer som bærer TnlO på et multikopiplasmid. Utvelgelsen av Tet<r->X. campestris fra den ovennevnte paring resulterte i en høy frekvens (0,5 pr. mottaker) av avkom som vokste svært dårlig (dvs. bare små, vannlignende kolonier) på tetracyklin. Etter forlenget inkubering produserte en stor andel av koloniene (25%) sektorer av kraftigere voksende celler. Mer enn 50% av disse sektorer syntes å ha Gum~-morfologi. Disse er sannsynligvis resultatet av rekombinering mellom det plasmid-bårede DNA inneholdende TnlO-innskuddet og det kromosomale vill-type-DNA. Når TnlO blir rekombinert inn i kromosomet, oppnås høy-nivå Tet<r>, og den kraftigvoksende sektor observeres. Når disse Gurn-, Tet<r->sektorer ble høstet og nysådd på tetracyklin, vokste de bra og viste en karakteristisk Gum~-morfologi.
Gum<+>, Tet<r->isolater ble også karakterisert. Noen av disse stammer (i særdeleshet X934) ble funnet å inneholde det fullstendige plasmid pTX655 innsatt i kromosomet til X. campestris via homolog rekombinasjon. Den kromosomale struktur av X934-stammen ble bestemt ved "Southern blot"-hybridisering av det kromosomale DNA og viste at plasmidfrekvensene eksisterer i en kromosomalt integrert form.
EKSEMPEL 2
Dette eksempel viser hvorledes det endrede polysakkarid ifølge oppfinnelsen kan fremstilles in vitro. For eksempel viser det hvorledes ikke-acetylert xantan-gummi ble fremstilt in vitro.
FREMSTILLING AV LYSATER
Xanthomonas campestris B1459 S4-L- eller S4-L-mutanter beskrevet i eksemplene 1 og 5 ble dyrket i YM (gjær/maltmedium) som hadde fått tilsatt 2% (w/v) glukose som beskrevet av A. Jeanes et al. i U.S. Department of Agriculture, ARS-NC-51, p. 14 (1976), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse. Kulturene ble dyrket til sen logfase ved 3 0°C. Cellene ble høstet ved sentrifugering og vasket med kaldt Tris-HCl, 70 mM, pH-verdi 8,2 med 10 mM EDTA og ble fryst/tint tre ganger ved en prosedyre i likhet med den som er beskrevet av R.C. Garcia et al. i European Journal of Biochemistry 4.3:93-105 (1974), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse. Denne prosedyre sprengte cellene, noe som ble klart ved den økede viskositet av suspensjonene og det fullstendige tap av celleoverlevelse (en av IO<6> overlevende) etter denne behandling. De fryste/tinede lysater ble fryst i porsjoner ved -80°C. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved "BIO RAD analyse" (BIO RAD Laboratories, Richmond, California) og ble funnet å være 5-7 mg celleprotein pr. ml lysat.
BIOSYNTETISK ANALYSEPROSEDYRE
Som beskrevet av L. Ielpi, R.O. Couso og M.A. Dankert i FEBS Letters 130:253-256 (1981), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse, ble en porsjon av fryst/tint lysat (tilsvarende 300-400 jug protein) , DNAase I (10jig/ml) og MgCl2 (8 mM) forinkubert ved 20°C i 20 min. Et like stort volum av 70 mM Tris-HCl, pH-verdi 8,2, med de ønskede radioaktivt merkede sukkernukleotider (UDP-glukose, GDP-mannose og UDP-glukuronsyre) ble tilsatt og inkubert ved 20°C. Radioaktivt merket fosfoenolpyruvat og acetylkoenzym A ble tilsatt når ønsket som beskrevet av Ielpi et al., se ovenfor, L. Ielpi, R.O. Couso og M.A. Dankert, M.A. Biochem. Biophys. Res. Comm. 102:1400-1408 (1981), og L. Ielpi, R.O. Couso og M.A. Dankert, Biochem. Intern. 6:323-333 (1983), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse. På forskjellige tidspunk-ter ble reaksjonen stanset ved fortynning med buffer som holdt 4°C. Prøvene ble sentrifugert og pelletene vasket to ganger med buffer. Supernatantene ble slått sammen, bærer-xantan (100 jxg) ble tilsatt, og xantan pluss syntetisert polymer ble utfelt med etanol(60%)/KC1(0,8%. Den utfelte polymer ble resuspendert i vann og utfelt ytterligere to ganger for fjerning av ikke-innlemmet markør. Radioaktivitet i utfellingen (kalt gummifraksjonen) ble bestemt i en væskescintillasjonsteller og dataene bearbeidet for å gi den innlemmede mengde, målt i picomol, av de radioaktivt merkede bestanddeler.
Cellelysater av X1006 innlemmet ikke karbon-14-acetat fra [<14>C]-acetyl-CoA i gummifraksjonen fra in vitro-systemet. Cellelysater av S4-L ga in vitro-gummi som var radioaktivt merket med [<14>C]-acetat. Tilsvarende innlemmet ikke cellelysater av X921 [<14>C]-pyruvat i gummifraksjonen, mens S4-L-cellelysater innlemmet radioaktivt merket pyruvat fra fos-foenol-[<14>C]-pyruvat i fraksjonen fra in vitro-systemet. Derfor ble X1006 identifisert som en mutantstamme med en defekt i genet for Acetylase og X921 som en mutantstamme med en defekt i genet for Ketalase. Lysatene av disse stammer produserte henholdsvis ikke-acetylert xantan og ikke-pyruvylert xantan in vitro.
Det er også vist at X.campestris-B1459-S4-L-lysater ved å holde tilbake substrater vil produsere endrede polysakkarider in vitro. For eksempel produserte cellelysater av S4-L ikke-acetylert, ikke-pyruvylert xantan-gummi in vitro når det endogene acetyl-CoA og fosfoenolpyruvat var brukt opp.
En mutasjon i genet for Transferase V vil føre til fremstilling av polytetramer. Denne fenotype vil bli påvist ved den in vitro-metode som er beskrevet ovenfor. Gummifraksjonen vil avdekke et polysakkarid sammensatt av glukose, mannose og glukuronsyre i molforhold på 2:1:1. Det tetramere mellomprodukt som blir hydrolysert fra lipidbæreren, vil også bli påvist ved sin mobilitet på TLC og sitt molforhold av sukkere.
EKSEMPEL 3
Dette eksempel viser bruken av den Acetylase-manglende stamme X1006 for fremstilling av ikke-acetylert gummi in vivo. Eksempelet viser også fremstilling in vivo av ikke-pyruvylert gummi fra Ketalase-minus-stammen, X921, og xantan-gummi med redusert nivå av pyruvylering fra stammen X934.
De tre mutantstammer som er beskrevet ovenfor, og S4-L ble dyrket over natten i næringsvæske med 2% glukose ved 30°C. Gummien ble høstet ved at cellene ble fjernet ved sentrifugering og gummien utfelt fra supernatanten ved tilsetning av 2-propanol eller etanol med 0,5-1% kaliumklorid. Gummiutfellingen ble gjenvunnet ved sentrifugering og resuspendert. Prosedyren ble gjentatt. Den resuspenderte gummi ble dialysert mot vann. En prøve av hvert polysakkarid ble syrehydrolysert og analysert ved hjelp av HPLC ved bruk av en BIO RAD HPX-87H-kolonne. Xantan-betanddelene ble mengdebestemt ved injeksjon av standarder med kjent konsentrasjon.
HPLC-analysen av de hydrolyserte gummier viste at X921 produserte xantan-gummi uten pyruvat. Stammen X1006 produserte xantan-gummi uten acetat. Stammen X934 produserte en gummi som inneholdt pyruvat i en mengde på 1-5% av den for S4-L-gummi.
EKSEMPEL 4
Dette eksempel beskriver metoder og strategier som vil kunne benyttes for å konstruere mutanter av X. campestris som vil produsere xantan som er både ikke-acetylert og ikk-pyruvylert.
Mutantstammer av X. campestris som mangler Ketalase- eller Acetylase-aktivitet (X921 resp. X1006) er blitt beskrevet. Man vil kunne benytte de mikrobielle genetikk- og rekombinant-DNA-metoder som er beskrevet av Vanderslice et al. og Capage et al. for å innføre en Ketalasedefekt og en Acetylasedefekt i en enkelt stamme av X. campestris. Denne dobbelt-mutant-stamme ville produsere xantan-gummi som ville være både ikke-acetylert og ikke-pyruvylert.
Metoder til å produsere innskuddsmutasjoner i klonede gummigen-DNA båret på plasmidvektorer har vært beskrevet av Capage et al. Man kunne tenke seg å bruke et plasmid som bærer den innskuddsmutasjon som gav opphav til mutantstammen X921, som et substrat for en andre runde mutagenese in vivo eller in vitro. Denne annen runde mutagenese kunne benytte et hvilket som helst av en rekke transponerbare elementer som vil være innlysende for fagfolk, eller en hvilken som helst av en rekke like innlysende DNA-restriksjonsfragmenter inneholdende selekterbare markører. Et sett plasmider som bærer to innskuddsmutasjoner, kunne benyttes i den gensubstitusjonsteknikk som er beskrevet av Capage et al., for å overføre de plasmid-bårne mutasjoner til kromosomet av X. campestris. Fenotyper av de resulterende stammer kan analyseres ved de in vivo- og in vitro-teknikker som er beskrevet av Vanderslice et al. og Capage et al. (se ovenfor) i eksempel 2. Disse analyser vil avdekke dobbeltmutantstammer som er blokkert i både Ketalase- og Acetylase-aktivitet. Disse dobbeltmutantstammer vil produsere xantan som på samme tid er ikke-pyruvylert og ikke-acetylert.
EKSEMPEL 5
Dette eksempel beskriver prosedyrer for å skaffe en X. campestris-mutant som produserer polytetramer.
Som beskrevet ovenfor og av Vanderslice et al. (se ovenfor) er der allerede oppnådd et xantan-beslektet polysakkarid med en avkortet sidekjede-polytrimer. Denne mutant ble karakterisert ved in vivo- og in vitro-metoder som er beskrevet her. Ved bruk av de metoder som er beskrevet her og i de angitte patentsøkna-der, vil en fagmann være istand til å lage mutantstammer av X.campestris som produserer polytetramergummi som beskrevet ovenfor.
Identifikasjon av disse mutantstammer kan oppnås ved bruk av in vitro-metoder eller ved analyse av polysakkarider produsert in vivo, som beskrevet her og hos Capage et al. (se ovenfor). Når den polytetramer-produserende mutant er laget, kan ytterligere mutasjonstrinn utføres, f.eks. slike som er beskrevet i eksemplene 1 og 4, og som er generelt kjent for fagfolk, for å generere mutantstammer som produserer ikke-acetylert polytetramer.
EKSEMPEL 6
Dette eksempel diskuterer kloning av Acetylasegenet på vektorer for å sikre at de her beskrevne polysakkarider er fullt acetylert.
X. campestris-stammen X1006 har mutasjon i genene for Acetylase resp. Ketalase, som beskrevet i eksemplene 2 og 3. Disse mutanter ble laget ved bruk av de metoder som er beskrevet i eksempel 1. Det er mulig for en fagmann å benytte metoder beskrevet hos Betlach et al., se ovenfor, for å utvinne native DNA-restriksjonsfragmenter inneholdende Acetylase- eller Ketalasegenene. Det vil si at plasmider med DNA-restriksjonsfragmenter inneholdende Acetylase- eller Ketalasegenene avbrutt av en medikament-resistensmarkør kan benyttes til utprøving av lambdagenomiske biblioteker for å skaffe native DNA-sekvenser for Acetylase- eller Ketalase-genet. I en annen utførelsesform er genene for Acetylase- og Ketalaseenzymene allerede blitt klonet på plasmidet pRK290-H336, som beskrevet av Capage et al., se ovenfor, og andre plasmider beskrevet her. Det er en enkel sak for en fagmann å subklone Acetylase- og Ketalasegenene fra disse plasmider.
De native DNA-sekvenser som oppnås ved en av disse metoder, kan så settes inn i plasmider som er istand til å replikere seg i X. campestris, f.eks. pMW79, ved bruk av de metoder som er beskrevet av Betlach et al. og Capage et al. Ekspresjon av Acetylase- og/eller Ketalasegenet kan kontrolleres ved modifisering av den eksisterende DNA sekvens eller innsetting av regulerbare promotorer oppstrøms i forhold til genet. Slike teknikker er velkjente for den som har kunnskaper i molekylær biologi og genetikk. Tilsvarende kan de plasmider som genene er satt inn i, være såkalte "high copy number"-plasmider. Som beskrevet av Capage et al. er de xantan-biosyntetiske enzymer tilstede i små mengder i X. campestris. Innskudd av de ovenfor beskrevne plasmider i X. campestris og dyrking av kulturer under forhold som er egnet for ekspresjon av plasmidbårede gener, vil resultere i syntese av meget større antall Acetylase- og/eller Ketalase-enzymer enn andre xantan-biosyntetiske enzymer. Overekspresjon av Acetylase skulle få xantanpolysak-karidene til å være fullt acetylert, dvs. at alle interne mannoserester er acetylert. Tilsvarende skulle overekspresjon av Ketalase forårsake full pyruvylering av de terminale mannoserester i xantan-polysakkaridene.
Det skulle være klart for en fagmann at full acetylering og full pyruvylering av xantan kan oppnås ved de metoder som er beskrevet ovenfor. Videre kan der oppnås full acetylering av polytetramer og full acetylering av polytrimer (beskrevet hos Vanderslice et al., se ovenfor) ved bruk av de her beskrevne metoder.
EKSEMPEL 7
Dette eksempel viser fordelene ved et ikke-acetylert xantan produsert av en genetisk modifisert Xanthomonas campestris til bruk som viskositetsøkende middel for vandige oppløsninger. Fig. 3 sammenligner viskositeten av kjemisk deacetylert, kommersielt xantan og dets opphavsforbindelse med den av ikke-acetylert xantan-polysakkarid laget av en genetisk manipulert Xanthomonas campestris (stamme X1006) og av xantan-gummi laget av vill-type X. campestris-opphavstammen (stamme X237). Viskositeten ble målt ved en skjærhastighet på 8 s"<1> for 1000 ppm polymerkonsentrasjon i 50.000 ppm NaCl-oppløsning. Viskositetene ble målt over temperaturområdet 25-80°C. Fig. 3 viser at kjemisk deacetylering av xantan resulterer i tap av viskositetsøkende evne over hele temperaturområdet. Imidlertid fører eliminasjon av acetylering ved genetiske metoder til betydelig øket viskositet sammenlignet med vill-type xantan-gummi. således er ikke-acetylert xantan-gummi produsert av en mutantstamme av X. campestris et forbedret polysakkarid sammenlignet med xantan selv og sammenlignet med deacetylert xantan-gummi produsert ved kjemiske metoder.
EKSEMPEL 8
Dette eksempel beskriver de metoder som ble benyttet til å konstruerer en dobbeltmutantstamme av X. campestris som produserer ikke-acetylert, ikke-pyruvylert xantan.
Capage et al. har beskrevet kloningen av en gengruppe fra X. campestris inneholdende gener som dirigerer biosyntesen av xantan-gummi. De har også beskrevet isoleringen av kromosomale slettingsmutasjoner i X. campestris som eliminerer alle eller forskjellige deler av denne gengruppe. Én slik slettingsmutant, stamme X1231, mangler alt X. campestris-DNA som er båret på det rekombinante plasmid pRK290-H336. Således syntetiserer stammen X1231 ikke xantan. Når pRK290-H336 overføres til stamme X1231, gjenvinnes dets evne til å syntetisere xantan. Capage et al. har også beskrevet metoder til å isolere og karakterisere innskuddsmutasjonene av transposon TnK12 inne i det klonede gummigen-DNA båret på pRK290-H336. To slike mutantplasmider er pRK290-H336.22 og pRK290-H336.41. Den omtrentlige plassering av TnK12-innskuddene på hvert av disse plasmider er vist på fig. 4. Når pRK290-H3 36.22 overføres inn i X1231, produserer den resulterende stamme ikke-acetylert xantan. Når pRK290-H336.41 overføres inn i X1231, produseres ikke-pyruvylert xantan. Disse to plasmidmutanter har vært benyttet til å konstruere ved hjelp av in vitro-rekombinering, et dobbeltmutantplasmid som styrer syntesen av ikke-acetylert, ikke-pyruvylert xantan når det bæres i slettingsstammen X1231.
Strategien for å generere in vitro et ikke-acetylert, ikke-pyruvylert dobbeltmutantplasmid er som følger. Et kanamycinføl-somt (Kan<s>) derivat av pRK290-H33 6.41 ble generert ved en partiell Hindlll-digerering av plasmidet, ligering av diges-tionsproduktene ved svært lave DNA-konsentrasjoner (for å fremme intramolekylær ligering), og deretter screening av tetracyklin-resistente (Tet<r>) transformanter for kanamycin-følsomhet. Plasmid-DNA<1>er ble så laget fra Tet<r>, Kan<s->isolater og analysert ved restriksjonsendonuklease-digerering og agarosegelelektroforese. Der finnes bare tre Hindlll-seter i pRK290-H336.41, og to av disse finnes inne i TnK12 og omslutter Kan-genet. Derfor ble en høy andel av de slettinger som ble generert ved den partielle digerering slettet for Kan-genet, mans resten av plasmidet forble intakt. Kan<s->plasmidet bærer fremdelet et innskudd (1 kb) i Ketalasegenet, og man ventet derfor at det skulle gi ikke-pyruvylert gummi. Dette plasmid benevnes p41KS. Det neste trinn var å klone det store Spel-fragment av det ikke-acetylerte mutant-plasmid pRK290-H336.22 inn i p41KS. Som vist på fig. 4, inneholder hvert plasmid tre Spel-seter ved posisjonene 758, 771 og 11,716 inne i DNA-sekvensen i henhold til Capage et al.. 10,9 kb Spel-fragmentet bærer TnK12-innskuddet av pRK290-H336.22. Det lille (13 bp) Spel-fragment ligger fullstendig inne i et tRNA-gen som ikke er vesentlig for vekst av X. campestris og xantan-produksjon. Derfor burde fjerning av dette lille Spel-segment i løpet av dobbeltmutasjonskonstruksjonen ikke påvirke xantan-biosyntesen. Plasmidene p41KS og pRK290-H336.22 ble renset og digerert fullstendig med Spel, og ligering ble utført. Ved denne ligering ble p41KS/SpeI ligert i 10 ganger større mol-overskudd med H336.22/SpeI. Når rekombinanter inneholdende Kan<r>, Spel-fragmentet av H336.22 blir valgt, skulle de således som oftest være assosiert med Spel-vektorfraksjoner av p41KS. Transformas-joner med disse ligasjoner ble utført og der ble oppnådd Kan<r->transformanter. De plasmider som var båret av disse transformanter, ble analysert for identifisering av de interessante rekombinantprodukter. Det ønskede rekombinant-plasmid ble lett identifisert blant Kan<r->transformantene. Dette rekombinant-plasmid, benevnt p41KS22, inneholder det p41KS-avledede innskudd i Ketalasegenet og det H33 6.22-avledede TnK12 innskudd inne i Acetylasegenet. Passende restriksjonsdigereringsanalyse bekreftet nærværet av begge innskuddsmutasjonene og viste videre at Spel-fragmentet inneholdende TnK12-mutasjonen var satt inn med riktig orientering.
Plasmid p41KS22 ble deretter overført inn i en serie av X. campestris-stammer ved konjugering. Den store Gum~-slet-tingsstamme X1231 var blant mottagerne. Denne slettingsbit mangler alt gummigen-DNA båret på p41KS22; derfor skulle X1231 som bærer p41KS22 produsere ikke-acetylert, ikke-pyruvylert xantan. Plasmidet ble effektivt ført over i X1231, og den resulterende fenotype var klart mukoid, men betydelig mindre mukoid enn en vill-type som ble brukt som sammenligning. Polysakkarid produsert av X1231 som bærer p41KS222 ble laget og analysert. Denne polymer inneholdt glukose, mannose og glukuronsyre, men ikke noe målbart acetat eller pyruvat, noe som viser at X1231 (p41KS22) virkelig frembringer den forven-tede ikke-acetylerte, ikke-pyruvylerte gummi.
EKSEMPEL 9
Dette eksempel beskriver konstruksjonen og egenskapene av et dobbeltmutant-plasmid som kombinerer en Acetylasemutasjon og en Transferase IV-mutasjon.
Capage et al. beskriver metoder til isolering og karakteriser-ing av transposon TnK12-innskudd inne i det klonede gummigen-DNA båret av plasmid pRK290-H336. Et mutant-plasmid som bærer en slik innskuddsbit er pRK290-H336.6. Den omtrentlige plassering av TnK12-innskuddsbiten i dette plasmid er vist på fig. 4. Når dette plasmid er tilstede i slettingsstammen X1231, dirigerer det syntesen av polytrimergummi som et resultat av inaktiveringen av Transferase IV ved hjelp av innskuddsbiten. Ved bruk av prosedyrer analoge med dem beskrevet i eksempel 9 ble det konstruert et dobbeltmutantplasmid som kombinerer denne Transferase IV-defekt med Acetylasemutasjonen båret i pRK290-H336.22. Et kanamycin-følsomt derivat av pRK290-H336.6 ble avledet ved sletting av Hindlll-fragmentet av TnK12. Dette plasmid, p6KS, er analogt med Kan<s->plasmidet p41KS og har fremdeles igjen 1 kb av TnK12 innsatt i Transferase IV-genet. Deretter ble det store TnK12-inneholdende Spel-fragment av pRK290-H336.22 ligert inn i Spel-digerert p6KS-plasmid-DNA som beskrevet i eksempel 8, og dobbeltmutant-plasmidet p6KS22 ble oppnådd. Dette plasmid bærer innskuddsmutasjoner i Transferase IV og Acetylase. Når det overføres inn i slettingsstammen X1231, burde det dirigere systesen av ikke-acetylert polytrimer. I mange uavhengige plasmidoverføringsforsøk kunne imidlertid ikke overføring av p6KS22 inn i stamme X1231 oppdages selv om plasmidet med hell ble overført med høy frekvens inn i andre mottagere, hvorunder både Gum~- og Gum<+->stammer. Dette resultat antyder at nærværet av p6KS22 i stamme X1231 er dødelig, sannsynligvis som et direkte resultat av produksjon av ikke-acetylert polytrimergummi. Capage et al har beskrevet tre andre dødelige mutasjoner innen gummigengruppen, og trukket den slutning at disse dødelige mutasjoner forårsaker akkumulering av et giftig mellomprodukt i xantan-biosyntesen. Akkumulering av ikke-acetylert polytrimer kan potensielt være giftig hvis dette polysakkarid ikke kan sekreteres av det transportsystem som normalt sekreterer xantan.
Det skal forstås at en fagmann med kjennskap til læren ifølge den foreliggende oppfinnelse vil kunne anvende denne på en spesifikk mikroorganisme.
Claims (11)
1. Sammensetning bestående av en vannoppløselig polysakkaridpolymer som har et forhold mellom D-glukose, D-mannose og D-glukuronsyre på ca. 2:1:1, karakterisert ved at den har en molekylvekt på 10<5->10<7> dalton, at (1) D-glukoseenhetene er bundet i en beta-[1,4]-konfigurasjon,
(2) D-mannoseenhetene er bundet i en alfa-[1,3]-konfigurasjon, vanligvis til annenhver glukoseenhet, og (3) D-glukuronsyre-enhetene er bundet i en beta-[1,2]-konfigurasjon til mannoseenhetene og at D-mannoseenhetene kan være acetylert eller ikke-acetylert.
2. Sammensetning som angitt i krav 1, karakterisert ved at mannoseenhetene av polysakkaridpolymeren er acetylert i 6-0-stillingen.
3. Sammensetning som angitt i krav 1, karakterisert ved at mannoseenhetene av polysakkaridpolymeren ikke er acetylert i 6-0-stillingen.
4. Sammensetning som angitt i krav 1, karakterisert ved at minst 90% av mannoseenhetene er acetylert i 6-0-stillingen.
5. Fremgangsmåte til fremstilling av polysakkaridpolymerene ifølge krav 1, karakterisert ved at
et egnet vekstmedium podes med en mikroorganisme av genus Xanthomonas som er istand til å syntetisere polytetramergummi iht. krav 1, og
det podede vekstmedium inkuberes ved passende temperatur, pH-verdi og nivå av oppløst oksygen for produksjon av en polysakkaridpolymer som har et forhold mellom D-glukose, D-mannose og D-glukuronsyre på ca. 2:1:1.
6« Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at polysakkaridpolymeren gjenvinnes fra vekstmediet ved utfelling eller ultrafiltrering.
7. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at mikroorganismen er av arten Xanthomonas campestris.
8. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at mikroorganismen er en mutant av Xanthomonas campestris som mangler Transferase V.
9. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at mikroorganismen er en mutant av Xanthomonas campestris som mangler Transferase V og Acetylase.
10. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at mikroorganismen er en mutant av Xanthomonas campestris som mangler Transferase V og acetylkoenzym A.
11. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at mikroorganismen er en mutant av Xanthomonas campestris som mangler fosfoenolpyruvat.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NO921787A NO309102B1 (no) | 1986-03-24 | 1992-05-06 | Sammensetninger bestÕende av en vannoppløselig polysakkaridpolymer bestÕende av repeterende pentamerenheter, og fremgangsmÕte for fremstilling derav |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US84294586A | 1986-03-24 | 1986-03-24 | |
US84443586A | 1986-03-26 | 1986-03-26 | |
US2909087A | 1987-03-23 | 1987-03-23 | |
PCT/US1987/000606 WO1987005939A1 (en) | 1986-03-24 | 1987-03-24 | Family of xanthan-based polysaccharide polymers including non-acetylated and/or non-pyruvylated gum and acetylated or non-acetylated polytetramer gum |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO874846D0 NO874846D0 (no) | 1987-11-20 |
NO874846L NO874846L (no) | 1988-01-25 |
NO172945B true NO172945B (no) | 1993-06-21 |
NO172945C NO172945C (no) | 1993-09-29 |
Family
ID=27363404
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO874846A NO172945C (no) | 1986-03-24 | 1987-11-20 | Xanthan-baserte polysakkaridpolymerer innbefattende acetylert eller ikke-acetylert polytetramergummi |
NO921787A NO309102B1 (no) | 1986-03-24 | 1992-05-06 | Sammensetninger bestÕende av en vannoppløselig polysakkaridpolymer bestÕende av repeterende pentamerenheter, og fremgangsmÕte for fremstilling derav |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO921787A NO309102B1 (no) | 1986-03-24 | 1992-05-06 | Sammensetninger bestÕende av en vannoppløselig polysakkaridpolymer bestÕende av repeterende pentamerenheter, og fremgangsmÕte for fremstilling derav |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
EP (3) | EP0765939A2 (no) |
JP (2) | JP2559437B2 (no) |
AT (2) | ATE92965T1 (no) |
CA (1) | CA1339113C (no) |
DE (2) | DE3787026T2 (no) |
NO (2) | NO172945C (no) |
SG (1) | SG164261A1 (no) |
WO (1) | WO1987005939A1 (no) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5514791A (en) * | 1986-03-26 | 1996-05-07 | Getty Scientific Development Company | Genetic control of acetylation and pyruvylation of xanthan based polysaccharide polymers |
CA2021414C (en) * | 1989-07-25 | 2004-09-28 | Daniel H. Doherty | Genetic control of acetylation and pyruvylation of xanthan gum |
ATE246255T1 (de) * | 1991-05-07 | 2003-08-15 | Monsanto Co | Genetische kontrolle zur acetylierung von polysacchariden der art xanthan |
ZA974982B (en) * | 1996-06-06 | 1998-01-23 | Monsanto Co | Acidic cleaning compositions containing xanthan gum. |
FR2766203B1 (fr) * | 1997-07-17 | 2002-05-24 | Rhodia Chimie Sa | Fluides utilisables dans l'exploitation du petrole comprenant de la gomme xanthane desacetylee et au moins un compose augmentant la force ionique du milieu |
US6139895A (en) * | 1999-07-06 | 2000-10-31 | Monsanto Company | Viscosity stable acidic edible liquid compositions and method of making |
US7285409B1 (en) * | 2000-05-09 | 2007-10-23 | Fundacao De Amparo A Pesquisa Do Estado De Sao Paulo | Isolated gum operon from Xyllela fastidiosa, isolated nucleic acid molecules therefrom, and uses thereof |
US6573221B2 (en) | 2000-05-12 | 2003-06-03 | Cp Kelco U.S., Inc. | Non-pyruvylated xanthan in oil field applications utilizing high density calcium-based brines |
US20080078545A1 (en) * | 2006-09-28 | 2008-04-03 | Halliburton Energy Services, Inc. | Treatment fluids viscosifield with modified xanthan and associated methods for well completion and stimulation |
DE102007041861A1 (de) | 2007-09-03 | 2009-03-05 | Evonik Degussa Gmbh | Herstellung von Polymeren mit reduziertem Acylgehalt |
EP2413714A1 (en) | 2009-04-02 | 2012-02-08 | Danisco A/S | Improved xanthan gum |
US20110274629A1 (en) * | 2010-05-04 | 2011-11-10 | Cp Kelco U.S., Inc. | Natural Polymer Blends for Use in Personal Care Products |
MX2020010036A (es) | 2018-03-28 | 2021-03-02 | Herbalife Int Of America Inc | Acetilacion de polisacaridos. |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3096293A (en) | 1959-12-30 | 1963-07-02 | Allene R Jeanes | Method of increasing the viscosity of an aqueous solution of a deacetylated polysaccharide |
US3000790A (en) | 1959-12-30 | 1961-09-19 | Allene R Jeanes | Method of producing an atypically salt-responsive alkali-deacetylated polysaccharide |
US3054689A (en) | 1959-12-30 | 1962-09-18 | Allene R Jeanes | Atypically salt-responsive alkali-deacetylated polysaccharide produced by xanthomonas campestris |
US4296203A (en) * | 1977-11-15 | 1981-10-20 | Pfizer Inc. | Xanthomonas bipolymer for use in displacement of oil from partially depleted reservoirs |
CA1153971A (en) * | 1980-07-14 | 1983-09-20 | Standard Oil Company | Semi-continuous method for production of xanthan gum using xanthomonas campestris atcc 31601 |
DE3274467D1 (en) * | 1981-05-22 | 1987-01-15 | Kelco Biospecialties Ltd | Production of xanthan having a low pyruvate content |
US4713449A (en) * | 1985-08-06 | 1987-12-15 | Getty Scientific Development Company | Polysaccharide polymer made by xanthomonas |
DE3751554T2 (de) * | 1986-03-24 | 1996-06-13 | Texaco Development Corp | Erzeugung von xanthangummi durch rekombinant-dns. |
-
1987
- 1987-03-24 AT AT87902919T patent/ATE92965T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-03-24 JP JP62502340A patent/JP2559437B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-24 DE DE87902919T patent/DE3787026T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-03-24 SG SG9607926-4A patent/SG164261A1/en unknown
- 1987-03-24 WO PCT/US1987/000606 patent/WO1987005939A1/en active IP Right Grant
- 1987-03-24 DE DE3752096T patent/DE3752096T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-03-24 AT AT92111024T patent/ATE156190T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-03-24 EP EP96119095A patent/EP0765939A2/en not_active Withdrawn
- 1987-03-24 EP EP92111024A patent/EP0511690B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-03-24 CA CA000532838A patent/CA1339113C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-03-24 EP EP87902919A patent/EP0323952B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-20 NO NO874846A patent/NO172945C/no unknown
-
1992
- 1992-05-06 NO NO921787A patent/NO309102B1/no unknown
-
1996
- 1996-03-26 JP JP8070588A patent/JP2670256B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATE156190T1 (de) | 1997-08-15 |
DE3752096T2 (de) | 1997-11-13 |
EP0323952B1 (en) | 1993-08-11 |
WO1987005939A1 (en) | 1987-10-08 |
EP0511690A3 (en) | 1992-11-19 |
NO172945C (no) | 1993-09-29 |
DE3787026D1 (de) | 1993-09-16 |
ATE92965T1 (de) | 1993-08-15 |
EP0511690B1 (en) | 1997-07-30 |
NO921787D0 (no) | 1992-05-06 |
EP0323952A4 (en) | 1989-07-11 |
DE3787026T2 (de) | 1993-11-25 |
CA1339113C (en) | 1997-07-29 |
EP0323952A1 (en) | 1989-07-19 |
EP0765939A3 (no) | 1997-05-14 |
EP0511690A2 (en) | 1992-11-04 |
JPS63503198A (ja) | 1988-11-24 |
SG164261A1 (en) | 2010-09-29 |
JP2670256B2 (ja) | 1997-10-29 |
JPH09176205A (ja) | 1997-07-08 |
DE3752096D1 (de) | 1997-09-04 |
NO921787L (no) | 1988-01-25 |
JP2559437B2 (ja) | 1996-12-04 |
NO874846L (no) | 1988-01-25 |
NO874846D0 (no) | 1987-11-20 |
EP0765939A2 (en) | 1997-04-02 |
NO309102B1 (no) | 2000-12-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2746560B2 (ja) | 微生物学的に純粋な培養物 | |
Sutherland | Xanthan | |
NO172945B (no) | Xanthan-baserte polysakkaridpolymerer innbefattende acetylert eller ikke-acetylert polytetramergummi | |
US5948651A (en) | Preparation of water-soluble non-acetylated polysaccharide polymer having repeating pentamer units with xanthomonas | |
US7883895B2 (en) | Methods for enhanced bacterial exopolysaccharide production | |
EP0584206B1 (en) | Genetic control of acetylation of xanthan based polysaccharide polymers | |
US20030100078A1 (en) | Mutant strain of Sphingomonas elodea which produces non-acetylated gellan gum | |
CA2293739A1 (en) | Production of non-native bacterial exopolysaccharide in a recombinant bacterial host | |
US5985668A (en) | Sucrose metabolism mutants | |
EP0410326B1 (en) | Genetic control of acetylation and pyruvylation of xanthan gum | |
CA1264537A (en) | Process utilizing a polysaccharide polymer |