NO172945B - Xanthan-baserte polysakkaridpolymerer innbefattende acetylert eller ikke-acetylert polytetramergummi - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår polysakkaridpolymerer. I særdeleshet angår den xantan-baserte polysakkaridpolymerer, definert her som polymerer som strukturelt ligner på xantan-gummi og er produsert av bestanddeler fra xantanbiosyntesen, nærmere bestemt polytetramergummier, både acetylerte og ikke-acetylerte.

Xantan-gummi blir produsert av bakterier av slekten Xanthomonas, i særdeleshet av mikroorganismer av arten X.campestris. Xantan-gummi er et produkt som i stor utstrekning blir brukt på grunn av dens usedvanlige fysiske egenskaper, dvs. dens ekstremt høye spesifikke viskositet og dens pseudo-plastisitet. Den er vanlig brukt i matvarer som et fortyknings-middel og ved sekundær eller tertiær oljeutvinning som et mobilitetsregulerende og profilmodifiserende middel, såvel som i petroleumsborevæsker.

Kjemisk er xantan-gummi et anionisk heteropolysakkarid. Den gjentatte enhet av polymeren er en pentamer bestående av fem sukkerenheter, nærmere bestemt to glukose-, en glukuronsyre- og to mannoseenheter. Disse sukkerrester er arrangert på en slik måte at glukoseenhetene danner ryggraden i polymerkjeden, med sidekjeder av mannose/glukuronsyre/mannoserester generelt ragende ut fra annen hver glukoseenhet. Vanligvis er denne grunnleggende struktur spesifikt acetylert og pyruvylert, som beskrevet av f.eks. P.E. Janson, L. Kenne og B. Lindberg, i Carbohydrate Research, 45:275-282 (1975) og L.D. Melton, L. Minot, D.A. Rees og G.R. Sanderson i Carbohydrate Research, 4^:245-257 (1976), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse. Graden av acetylering og pyruvylering er kjent for å variere. Strukturen av xantan-gummi er vist nedenfor:

På tross av den vide anvendelighet av naturlig forekommende xantan-gummi er der enkelte situasjoner hvor dens fysiske egenskaper blir begrensende. Spesielt er det ved sekundær eller tertiær oljeutvinning ikke uvanlig at temperaturen i det oljebærende reservoar og saltkonsentrasjonene i reservoar-saltlaken er høyere enn det som er optimalt for xantan-oppløsninger. Når slike forhold forekommer, kan xantan felles ut, flokkulere og/eller miste sin viskositet. Det vil derfor være ønskelig med nye viskositetsøkende produkter som virker bra ved forskjellige forhold som kan oppstå under oljeutvinning, f.eks. høye temperaturer og høye saltkonsentrasjoner.

Den foreliggende oppfinnelse angår xantanbaserte polysakkarider med forbedrede egenskaper i forhold til naturlig forekommende xantan-gummi. Modifikasjoner av xantan-gummi er tidligere beskrevet. For eksempel beskriver Bradshaw et al. (Carbohydrate Polymers, 3.:23-38 (1983)) metoder til fremstilling av kjemisk modifisert xantan-gummi som er deacetylert eller depyruvylert. Forskjellige måter til kjemisk deacetylering av xantan-gummi produsert av Xanthomonas campestris er også beskrevet i US patentskriftene 3 000 790 og 3 054 689. Til dags dato har den eneste metode som er benyttet til disse deacetyleringsprosesser vært via kjemisk fjerning av acetatenhetene fra normalt acetylert xantan-gummi. Det er funnet at kjemiske prosesser til deacetylering av xantan-gummi resulterer i en rekke uønskede bivirkninger og kan forårsake hydrolyse av glykosidryggraden, noe som fører til en irreversibel forandring av molekylets konformasjon og redusert molekylvekt.

Noen av de reologiske egenskaper av deacetylert xantan i vandige oppløsninger er kjent, se f.eks. Tako og Nakamura, Agric. Biol. Chem. 48.: 2987-2993 (1984) og US patentskriftene 3 000 790 og 3 054 689. En metode til å øke viskositeten av en vandig oppløsning ved bruk av et deacetylert polysakkarid er også beskrevet i US patentskrift 3 096 293. Derfor har man søkt å finne en metode til å skaffe ikke-acetylert xantan som ikke forårsaker uønskede bivirkninger.

Oppfinnerne har identifisert polysakkarider som er basert på forandringer av den normale xantan-pentamerbyggesten. Disse polymerer oppviser forbedrede reologiske egenskaper i forhold til normal xantan-gummi med hensyn på skjærhastighet, evne til å tåle saltholdighet og respons på temperatur som kan påvirke deres viskositetsøkende egenskaper. Disse endrede polysakkarider inkluderer den polytetramer som er vist nedenfor, og den ikke-acetylerte polytetramer.

Et formål med den foreliggende oppfinnelse er å skaffe polysakkaridpolymerer som er bedre egnet til å øke viskositeten av vann enn naturlig forekommende xantan-gummi. Et annet formål med den foreliggende oppfinnelse er å skaffe polysakkaridpolymerer som har bedre reologiske egenskaper enn naturlig forekommende xantan-gummi ved høye temperaturer og/eller i nærvær av salter, som har andre ønskede egenskaper.

Det er også et formål med den foreliggende oppfinnelse å skaffe en in vitro-metode til oppnåelse av visse av disse produkter og mikroorganismer som har evnen til å produsere polysakkaridpolymerer in vivo. Et ytterligere formål med oppfinnelsen er å skaffe fremgangsmåter til fremstilling av polysakkarider ved aerob fermentering av mikroorganismer som har evnen til å produsere de forskjellige polysakkaridpolymerer.

Andre formål med og fordeler ved oppfinnelsen vil dels bli angitt i den etterfølgende beskrivelse, dels være selvfølgelige fra beskrivelsen eller kunne læres ved praktisering av oppfinnelsen. Formålene og fordelene kan realiseres og oppnås ved hjelp av de trekk og kombinasjoner som er spesielt påpekt i kravene.

For oppnåelse av formålene og i samsvar med hensiktene med oppfinnelsen, slik den er generelt beskrevet i fremstillingen, er der skaffet en sammensetning bestående av en vannoppløselig polysakkaridpolymer som har et forhold mellom D-glukose, D-mannose og D-glukuronsyre på ca. 2:1:1, karakterisert ved at den har en molekylvekt på 10<5->10<7> dalton, at (1) D-glukoseenhetene er bundet i en beta-[1,4]-konfigurasjon, (2) D-mannoseenhetene er bundet i en alfa-[l,3]-konfigurasjon, vanligvis til annenhver glukoseenhet, og (3) D-glukuronsyre-enhetene er bundet i en beta-[1,2]-konfigurasjon til mannoseenhetene og at D-mannoseenhetene kan være acetylert eller ikke-acetylert.

Denne polysakkaridpolymer er her kalt "polytetramer" fordi den består av følgende tetramerenhet som gjentar seg: glukose-glukose-mannose-glukuronsyre. Der er også skaffet en poly-tetramersammensetning som beskrevet ovenfor, hvori minst 90%, fortrinnsvis 95% og helst 100% av mannoseenhetene er acetylert i 6-0-stillingen, såvel som en polytetramer som er ikke-acetylert.

Ifølge oppfinnelsen er der også påtenkt prosesser til fremstilling av de polysakkaridpolymerer som er beskrevet ovenfor. Polysakkaridpolymerene ifølge oppfinnelsen kan generelt fremstilles ved genetiske manipuleringer av de mikrobielle biosyntetiske reaksjonsveier som fører til produksjon av polysakkarider. Nærmere bestemt kan mikrobielle synteseveier til fremstilling av xantan-gummi manipuleres for å lage et in-vivo- eller in-vitro-system til fremstilling av en endret polymerenhet. På denne måte kan man lage systemer ved bruk av regulerbare Acetylase- og Transferase-V-gener, i særdeleshet for å lage tetramerpolysakkarider som er acetylert eller ikke-acetylert. Mikroorganismer som produserer de foreliggende polysakkaridpolymerer in-vivo, og metoder til bruk av disse polysakkaridpolymerer er også beskrevet.

Forskjellige stammer av X. campestris som er mer utførlig beskrevet nedenfor, er blitt deponert ved American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, 21. mars 1986. Disse stammer er X921, X1006, X934 og X1231, og de er deponert som henholdsvis nr. 53472, 53473, 53474 og 67344.

De til fremstillingen hørende tegninger illustrerer forskjellige utførelsesformer for oppfinnelsen og tjener sammen med beskrivelsen til å forklare prinsippene ved oppfinnelsen. Fig. 1 viser den antatte syntesevei for xantan-gummibiosyn-tesen. Forkortelser som er brukt, er Glu = glukose; GluA = glukuronsyre; Man = mannose; Glu-Glu = cellobiose; P = fosfat; PP = pyrofosfat; C55 = isoprenoidlipidbærer; PEP = fosfoenolpyruvat; AcCoA = acetylkoenzym A; I-V = glykosyltransferaser; UDP = uridin-5'-difosfat og GDP = guanosin-5'-difosfat. Fig. 2 viser en viskositetssammenligning mellom vill-type-gummier og ikke-pyruvylerte gummier. Fig. 3 viser en viskositetssammenligning mellom ikke-acetylerte og kjemisk deacetylerte gummier. Fig. 4 viser den omtrentlige fysiske plassering av 3 TnK12-innskuddsmutasjoner i det klonede gummigengruppe-DNA av rekombinant plasmid pRK290-H336. Denne figur viser også den omtrentlige plassering av Spel-restriksjonsendonuklease-spaltingsstedene i pRK290-H336.

Det vil nå i detalj bli henvist til for tiden foretrukne utførelsesformer for den foreliggende oppfinnelse som sammen med de følgende eksempler tjener til å forklare oppfinnelsens prinsipper.

Polysakkaridpolymerene ifølge den foreliggende oppfinnelse er beskrevet i detalj ovenfor. Disse polysakkaridpolymerer kan lages in-vitro med et celle-fritt enzymsystem, eller de kan produseres in vivo ved dyrking av celler av en passende itiutantstamme. Andre måter å lage polysakkaridpolymerene på er også beskrevet nedenfor.

Den grunnleggende metode som angår bruken av et celle-fritt system for fremstilling av ikke-variant xantan-gummi, er beskrevet av L. Ielpi, R.O. Couso og M.A. Dankert i FEBS Letters 130:253-256 (1981), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse. Det er funnet at en modifisert versjon av denne metode kan benyttes til å lage variant-polysakkaridene ifølge oppfinnelsen.

Ved denne nye, modifiserte metode blir det in vitro celle-frie system fremstilt generelt ved lyse av celler av en mikroorganisme av slekten Xanthomonas, fortrinnsvis Xanthomonas campestris, i nærvær av en egnet buffer, fortrinnsvis omfat-tende EDTA, og oppnåelse av de passende biosyntetiske enzymer som deretter er i stand til å bearbeide eksogent tilsatte substrater. Andre metoder for lyse som kan benyttes, omfatter, men er ikke begrenset til, lydbehandling, "French Pressure cell", detergentbehandling, enzymbehandling og kombinasjoner av disse.

For fremstilling av variant-polysakkaridene ifølge den foreliggende oppfinnelse, blir generelt et lysat av en mikroorganisme inneholdende de nødvendige enzymer for å sette sammen de ønskede polysakkarider, inkubert med de passende substrater, som avhengig av den ønskede gummi kan inkludere UDP-glukose, GDP-mannose, UDP-glukuronsyre, acetyl-CoA og fosfoenolpyruvat. Valg av sustrater er avhengig av det polysakkarid som ønskes produsert. For eksempel fås et ikke-acetylert polysakkarid ved eliminering av acetyl-CoA som substrat. Kjemisk og/eller enzymatisk behandling av cellelysatene for å utarme endogene substrater vil være selvsagt for en fagmann.

I tillegg kan celle-frie systemer dannes fra mutant-organismer som mangler en eller flere av enzymene fra den xantan-biosyntetiske vei som er vist på fig. 1. Slike mutant-avledede cellelysater ville produsere de variant-gummier som er beskrevet her, enten utelukkende på grunn av mutasjonen eller på grunn av mutasjonen i kombinasjon med et tilbakeholdt substrat. For eksempel vil et celle-fritt system dannet fra en mutant-kultur som mangler Transferase V, produsere polytetramer, mens det samme celle-frie system uten nærvær av acetyl-CoA vil produsere ikke-acetylert polytetramer.

Den biosyntetiske prosess kan i en utførelsesform overvåkes ved innlemmelse av radioaktivt merkede substrater i de polymere enheter. Andre metoder kan også benyttes for å tillate identifikasjon av de biosyntetiske mellomprodukter som er kjent for fagfolk. Spesielt er der utviklet kromatografiske metoder til å skille og identifisere de oligosakkaride mellomprodukter. Disse innbefatter tynnskiktskromatografi og høytrykksvæske-kromatograf i.

Den celle-frie biosyntese av xantan er funnet å være en tidsavhengig, trinnvis prosess som er avhengig av tilsetning av alle de tre spesifikke sukker-nukleotider. Bakgrunnen av ikke-spesifikk innlemmelse av merket substrat er minimal og vil ikke forstyrre målingen av den xantan-spesifikke polymer i gummifraksjonen.

At lipidbærere, nærmere bestemt isoprenoidpyrofosfat, er involvert, er vist i flere polysakkarid-biosyntetiske veier. I tillegg er medvirkning av pyrofosforyl-bundne lipidbærere i xantan-biosyntesen påvist. Det er således funnet at de xantan-biosyntetiske mellomprodukter kan gjenvinnes i den organiske oppløselige fraksjon med disse bærerlipider. Det gjenvundne oligosakkarid kan deretter befris fra bærerlipidet ved mild syrehydrolyse, f.eks. ved en pH-verdi på 2 i 20 min ved 90°C og defosforyleres med alkalisk fosfatase for analyse.

Ved bruk av disse metoder for gjenvinning av mellomprodukter er det oppdaget at visse lysater av X. campestris-mutanter ved in vitro-betingelser vil produsere ikke-acetylert eller ikke-pyruvylert xantan-gummi selv i nærvær av alle de substrater som er nødvendige for ikke-variantgummisyntese. I lys av læren i den foreliggende beskrivelse vil disse metoder gjøre en fagmann i stand til å identifisere cellelysater som produserer andre endrede polysakkarider, f.eks. et mutant-cellelysat som produserer polytetramergummi.

Utviklingen av den celle-frie synteseprosess for polysakkaridene som er beskrevet ovenfor, viser at forskjellige Xanthomonas campestris-celler har alle de enzymer som er nødvendige for syntetisering av acetylert eller ikke-acetylert polytetramer. For å kunne bruke hele celler til syntetisering av polytetramer in vivo, behøver man imidlertid en måte til å blokkere xantan-gummisyntese ved reaksjon V (se fig. 1). For at hele celler skal syntetisere ikke-acetylert polytetramer, vil man videre trenge en måte til å blokkere såvel acetylerings-reaksjonen (se fig. 1) som reaksjon V.

Transposoner, herunder, men ikke begrenset til TnlO og Tn903, kan brukes for å mutere Xanthomonas campestris. I én utførel-sesform gir disse transposoner resistens mot henholdsvis tetracyklin og kanamycin. Transposoner har evnen til å føye seg inn i gener hvor de forårsaker mutasjoner ved å avbryte den kodende sekvens. Transposonene kan føyes inn i Xanthomonas campestris på forskjellige vektorer, herunder på såkalte selvmordsvektorer som pRK2013. Som beskrevet av G. Ditta, D. Corbin og D.R. Helinski i Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 77:7347-7351 (1980), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse, har vektor pRK2013 evnen til å overføre seg selv inn i ikke-enteriske bakterier såsom Xanthomonas campestris, men den er ikke istand til å replikere seg i denne vert. Hvis selvmordsvektoren blir introdusert i en populasjon av Xanthomonas campestris-celler og denne populasjon så blir utsatt for enten tetracyklin eller kanamycin, vil derfor de individer som overlever, være de hvor én av transposonene er satt inn i genomet til Xanthomonas campestris. Overlevende fra en slik eksponering kan underkastes utsortering av slike som har mistet evnen til å lage xantan-gummi. Slike mutanter kan synes å være mindre mukoide enn vill-type-Xanthomonas campestris.

I andre utførelsesformer for oppfinnelsen kan andre måter for mutagenese bli benyttet til å lage mutanter som har mistet evnen til å lage xantan-gummi, eller som ikke acetylerer de gummier de produserer. Slike metoder vil en fagmann lett komme på, og de inkluderer bestråling, rekombinant-DNA-teknologi (spesielt som beskrevet i US patentsøknad nr. 842 944 av Capage et al., med tittelen "Recombinant-DNA Mediated Production of Xanthan Gum", som er innlevert 26. mars 1986, og hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse, og i eksempel 1 nedenfor) og kjemisk mutagenbehandling, men er ikke begrenset til disse metoder. Eksempler på slike mutagenese-prosedyrer er beskrevet av J.H. Miller i Experiments in Molecular Genetics (1972); R.W. Davis, D. Bostein og J.R. Roth i Advanced Bacterial Genetics (1980); og av T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambrook i Molecular Cloning (1982), Cold Spring Harbor.

Selv om der først kan bli valgt mutanter som synes mindre mukoide enn vill-type-organismer, vil de ønskede mutanter generelt beholde evnen til å lage noe polysakkarid. Celle-frie ekstrakter av hver av xantan-mutantene kan lages og testes som nevnt ovenfor ved tilsetning av forskjellige kombinasjoner av substrater og analyse av de resulterende produkter.

Alternativt kan passende mutanter finnes ved at man bestemmer nærværet av det ønskede polysakkarid i kulturmediet fra hver mutant, f.eks. polytetramergummi som er acetylert eller ikke-acetylert. Derfor kan der finnes mutanter som synes å være blokkert ved forskjellige posisjoner i xantan-gummi-synteseveien.

Det ligger ikke utenfor oppfinnelsens omfang å ta i bruk enzyminhibitorer av vill-type Transferase V og Acetylase for å komme frem til de samme produkter. Ytterligere andre alter-nativer til fremstilling av disse polysakkarider er påtenkt, herunder enzymatisk og kjemisk nedbrytning av naturlig xantan-gummi .

Mutantene kan dyrkes under forhold som er generelt kjent innen området for dyrking av vill-type Xanthomonas campestris. For eksempel kan de dyrkes på egnede assimilerbare karbonkilder såsom glukose, sukrose, maltose, stivelse, invertsukker, komplekse karbohydrater såsom melasse eller maissirup, forskjellige organiske syrer og lignende. Blandinger av karbonkilder kan også benyttes. Konsentrasjonen av de tilsatte karbonkilder er ofte mellom 10 og 60 g/l. Nødvendig for vekst er også en kilde til organisk eller uorganisk nitrogen, generelt på mellom 0,1 og 10,0 g/l, og mineraler som lett kan velges ut av fagfolk. Eksempler på passende nitrogenkilder er ammoniumsalter, nitrat, urea, gjærekstrakt, pepton eller andre hydrolyserte proteinmaterialer eller blandinger av disse. Eksempler på passende mineraler innbefatter fosfor, svovel, kalium, natrium, jern og magnesium. Disse blir ofte tilsatt sammen med et chelateringsmiddel såsom EDTA eller sitronsyre.

Optimale temperaturer for vekst av Xanthomonas campestris ligger generelt mellom 18°C og 35°C, fortrinnsvis mellom 27°C og 3 0°C. Xanthomonas campestris-celler dyrkes aerobt ved tilførsel av luft eller oksygen slik at et tilstrekkelig nivå av oppløst oksygen blir holdt ved like, f.eks. over ca. 10% metning. Fortrinnsvis holdes nivået over ca. 2 0%. pH-verdien blir holdt på 6,0-8,0, fortrinnsvis på 6,5-7,5.

Polysakkaridene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan gjenvinnes fra fermenter ved passende metoder. Utfelling med isopropanol, etanol eller en annen passende alkohol vil uten videre gi polysakkaridene ifølge oppfinnelsen. Generelt blir alkoholer tilsatt til en konsentrasjon på 50-75% på volumbasis, fortrinnsvis i nærvær av kaliumklorid, natriumklorid eller et annet salt. Alternativt kan polymerene gjenvinnes fra fermentet ved ultrafiltrering.

Mobilitetskontroll-oppløsninger til bruk ved økt oljeutvinning kan også fremstilles fra variant-polysakkaridpolymerene som her er beskrevet. Oppløsninger av polysakkaridpolymerene i konsentrasjoner på 50-3000 ppm er passende for slike mobili-tetskontroll-oppløsninger. Andre kjente tilsetningsstoffer kan også benyttes i kombinasjon med disse oppløsninger for å øke oljegjenvinningen ytterligere. Slike tilsetningsstoffer innbefatter f.eks. overflateaktive midler, alkaliske reagenser eller metalliske eller organiske tverrbindingsmidler.

I likhet med xantan-gummi kan polysakkaridpolymerene også benyttes som fortykningsmidler i matvarer, kosmetiske produkter, medikamenter, papirbindemidler, boreslam, trykksverte og lignende og som geleringsmiddel. I tillegg kan de benyttes til å redusere friksjonsmotstanden av en væskestrøm i rørledninger.

EKSEMPEL I

Dette eksempel viser de metoder for mutagenese og sortering som benyttes for å generere X. campestris-mutantstammer som har defekter i Acetylaseaktivitet eller Ketalaseaktivitet.

De gener som koder for enzymene til xantan-gummi-biosyntese, er vist å bestå av en gruppe gener på X. campestris-kromosomet. Denne "gummigengruppe" er beskrevet i detalj av Capage et al. Segmenter av gummigen-DNA er blitt klonet på plasmidvektorer såsom pMW79 som beskrevet i detalj av Capage et al.

Region-rettet mutagenese ble utført på subklonede deler av gummi-DNA båret i plasmid pMW79. Disse klonede DNA-segmenter ble mutagenisert in vivo med transposoner og in vitro ved bruk av rekombinant-DNA-teknologi for å generere innskudds-, slettings- og substitusjonsmutasjoner inne i det klonede X. campestris-DNA. For studium av de fenotyper som fremkommer ved disse mutasjoner, ble de plasmider som bærer mutasjonene tilbakeført til X. campestris, og deretter ble der identifisert rekombinanter hvor det plasmid-bårede, muterte gen var blitt innsatt i kromosomet via homolog rekombinasjon. Den tetracyklinresistens som TnlO koder for, skaffer et fordelaktig utvelgelsessystem for overføring av mutasjonene fra et plasmid til kromosomet.

En slik mutantstamme (X1006) bar et TnlO-innskudd som ble funnet å forårsake inaktivering av Acetylaseaktiviteten. Denne mutantstamme var karakterisert som beskrevet i eksemplene 2 og 3, og ble funnet å produsere et polysakkarid som var ikke-acetylert. En annen mutantstamme ble konstruert ved in vivo-innskudd av et fragment av DNA inneholdende tetracyklin-resistensgenet fra TnlO i et restriksjonssete inne i gummigengruppen. Denne mutantstamme (X921) ble funnet å være uten Ketalaseaktivitet. Som funnet ved metodene i eksemplene 2 og 3, produserte denne mutant xantan som var ikke-pyruvylert.

Der ble også funnet en tredje mutantstamme (X934) med sterkt redusert Ketalaseaktivitet. Denne mutantstamme produserer xantan-gummi med svært lavt pyruvyleringsnivå: 1-5% av det pyruvyleringsnivå som finnes i normalt xantan.

Mutantstammen X934 ble funnet som beskrevet nedenfor. I preliminære forsøk beregnet på å undersøke rekombineringen mellom plasmid-båret X. campestris-DNA og X. campestris-kromosomet, ble plasmidet pTX655 benyttet som modellsystem. Dette plasmid bærer et TnlO-innskudd i midten av et 2,3 kb X. campestris-Pstl-fragment klonet i plasmidet RSF1010. Dette innskudd av TnlO forårsaker Gum~-defekten i mutantstammen X655 som beskrevet av Capage et al. og Vanderslice et al. Forsøket gikk ut på å mobilisere pTX655 med plasmidet pRK2 013 og overføre det fra E. coli til X. campestris ved utvelging for overføring av den tetracyklinresistens som TnlO koder for. De første resultater av denne paring var anomale og antydet at TnlO ikke effektivt uttrykte tetracyklinresistens i X. campestris når det var båret på plasmidet, men at medikament-resistensen ble mer effektivt uttrykt når TnlO var båret i kromosomet av X. campestris.

Dette fenomen er også beskrevet for TnlO i E. coli. Der er det vist at stammer som bærer én kopi av TnlO innsatt i kromosomet, er resistente for betydelig høyere konsentrasjoner av tetracyklin enn stammer som bærer TnlO på et multikopiplasmid. Utvelgelsen av Tet<r->X. campestris fra den ovennevnte paring resulterte i en høy frekvens (0,5 pr. mottaker) av avkom som vokste svært dårlig (dvs. bare små, vannlignende kolonier) på tetracyklin. Etter forlenget inkubering produserte en stor andel av koloniene (25%) sektorer av kraftigere voksende celler. Mer enn 50% av disse sektorer syntes å ha Gum~-morfologi. Disse er sannsynligvis resultatet av rekombinering mellom det plasmid-bårede DNA inneholdende TnlO-innskuddet og det kromosomale vill-type-DNA. Når TnlO blir rekombinert inn i kromosomet, oppnås høy-nivå Tet<r>, og den kraftigvoksende sektor observeres. Når disse Gurn-, Tet<r->sektorer ble høstet og nysådd på tetracyklin, vokste de bra og viste en karakteristisk Gum~-morfologi.

Gum<+>, Tet<r->isolater ble også karakterisert. Noen av disse stammer (i særdeleshet X934) ble funnet å inneholde det fullstendige plasmid pTX655 innsatt i kromosomet til X. campestris via homolog rekombinasjon. Den kromosomale struktur av X934-stammen ble bestemt ved "Southern blot"-hybridisering av det kromosomale DNA og viste at plasmidfrekvensene eksisterer i en kromosomalt integrert form.

EKSEMPEL 2

Dette eksempel viser hvorledes det endrede polysakkarid ifølge oppfinnelsen kan fremstilles in vitro. For eksempel viser det hvorledes ikke-acetylert xantan-gummi ble fremstilt in vitro.

FREMSTILLING AV LYSATER

Xanthomonas campestris B1459 S4-L- eller S4-L-mutanter beskrevet i eksemplene 1 og 5 ble dyrket i YM (gjær/maltmedium) som hadde fått tilsatt 2% (w/v) glukose som beskrevet av A. Jeanes et al. i U.S. Department of Agriculture, ARS-NC-51, p. 14 (1976), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse. Kulturene ble dyrket til sen logfase ved 3 0°C. Cellene ble høstet ved sentrifugering og vasket med kaldt Tris-HCl, 70 mM, pH-verdi 8,2 med 10 mM EDTA og ble fryst/tint tre ganger ved en prosedyre i likhet med den som er beskrevet av R.C. Garcia et al. i European Journal of Biochemistry 4.3:93-105 (1974), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse. Denne prosedyre sprengte cellene, noe som ble klart ved den økede viskositet av suspensjonene og det fullstendige tap av celleoverlevelse (en av IO<6> overlevende) etter denne behandling. De fryste/tinede lysater ble fryst i porsjoner ved -80°C. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved "BIO RAD analyse" (BIO RAD Laboratories, Richmond, California) og ble funnet å være 5-7 mg celleprotein pr. ml lysat.

BIOSYNTETISK ANALYSEPROSEDYRE

Som beskrevet av L. Ielpi, R.O. Couso og M.A. Dankert i FEBS Letters 130:253-256 (1981), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse, ble en porsjon av fryst/tint lysat (tilsvarende 300-400 jug protein) , DNAase I (10jig/ml) og MgCl2 (8 mM) forinkubert ved 20°C i 20 min. Et like stort volum av 70 mM Tris-HCl, pH-verdi 8,2, med de ønskede radioaktivt merkede sukkernukleotider (UDP-glukose, GDP-mannose og UDP-glukuronsyre) ble tilsatt og inkubert ved 20°C. Radioaktivt merket fosfoenolpyruvat og acetylkoenzym A ble tilsatt når ønsket som beskrevet av Ielpi et al., se ovenfor, L. Ielpi, R.O. Couso og M.A. Dankert, M.A. Biochem. Biophys. Res. Comm. 102:1400-1408 (1981), og L. Ielpi, R.O. Couso og M.A. Dankert, Biochem. Intern. 6:323-333 (1983), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse. På forskjellige tidspunk-ter ble reaksjonen stanset ved fortynning med buffer som holdt 4°C. Prøvene ble sentrifugert og pelletene vasket to ganger med buffer. Supernatantene ble slått sammen, bærer-xantan (100 jxg) ble tilsatt, og xantan pluss syntetisert polymer ble utfelt med etanol(60%)/KC1(0,8%. Den utfelte polymer ble resuspendert i vann og utfelt ytterligere to ganger for fjerning av ikke-innlemmet markør. Radioaktivitet i utfellingen (kalt gummifraksjonen) ble bestemt i en væskescintillasjonsteller og dataene bearbeidet for å gi den innlemmede mengde, målt i picomol, av de radioaktivt merkede bestanddeler.

Cellelysater av X1006 innlemmet ikke karbon-14-acetat fra [<14>C]-acetyl-CoA i gummifraksjonen fra in vitro-systemet. Cellelysater av S4-L ga in vitro-gummi som var radioaktivt merket med [<14>C]-acetat. Tilsvarende innlemmet ikke cellelysater av X921 [<14>C]-pyruvat i gummifraksjonen, mens S4-L-cellelysater innlemmet radioaktivt merket pyruvat fra fos-foenol-[<14>C]-pyruvat i fraksjonen fra in vitro-systemet. Derfor ble X1006 identifisert som en mutantstamme med en defekt i genet for Acetylase og X921 som en mutantstamme med en defekt i genet for Ketalase. Lysatene av disse stammer produserte henholdsvis ikke-acetylert xantan og ikke-pyruvylert xantan in vitro.

Det er også vist at X.campestris-B1459-S4-L-lysater ved å holde tilbake substrater vil produsere endrede polysakkarider in vitro. For eksempel produserte cellelysater av S4-L ikke-acetylert, ikke-pyruvylert xantan-gummi in vitro når det endogene acetyl-CoA og fosfoenolpyruvat var brukt opp.

En mutasjon i genet for Transferase V vil føre til fremstilling av polytetramer. Denne fenotype vil bli påvist ved den in vitro-metode som er beskrevet ovenfor. Gummifraksjonen vil avdekke et polysakkarid sammensatt av glukose, mannose og glukuronsyre i molforhold på 2:1:1. Det tetramere mellomprodukt som blir hydrolysert fra lipidbæreren, vil også bli påvist ved sin mobilitet på TLC og sitt molforhold av sukkere.

EKSEMPEL 3

Dette eksempel viser bruken av den Acetylase-manglende stamme X1006 for fremstilling av ikke-acetylert gummi in vivo. Eksempelet viser også fremstilling in vivo av ikke-pyruvylert gummi fra Ketalase-minus-stammen, X921, og xantan-gummi med redusert nivå av pyruvylering fra stammen X934.

De tre mutantstammer som er beskrevet ovenfor, og S4-L ble dyrket over natten i næringsvæske med 2% glukose ved 30°C. Gummien ble høstet ved at cellene ble fjernet ved sentrifugering og gummien utfelt fra supernatanten ved tilsetning av 2-propanol eller etanol med 0,5-1% kaliumklorid. Gummiutfellingen ble gjenvunnet ved sentrifugering og resuspendert. Prosedyren ble gjentatt. Den resuspenderte gummi ble dialysert mot vann. En prøve av hvert polysakkarid ble syrehydrolysert og analysert ved hjelp av HPLC ved bruk av en BIO RAD HPX-87H-kolonne. Xantan-betanddelene ble mengdebestemt ved injeksjon av standarder med kjent konsentrasjon.

HPLC-analysen av de hydrolyserte gummier viste at X921 produserte xantan-gummi uten pyruvat. Stammen X1006 produserte xantan-gummi uten acetat. Stammen X934 produserte en gummi som inneholdt pyruvat i en mengde på 1-5% av den for S4-L-gummi.

EKSEMPEL 4

Dette eksempel beskriver metoder og strategier som vil kunne benyttes for å konstruere mutanter av X. campestris som vil produsere xantan som er både ikke-acetylert og ikk-pyruvylert.

Mutantstammer av X. campestris som mangler Ketalase- eller Acetylase-aktivitet (X921 resp. X1006) er blitt beskrevet. Man vil kunne benytte de mikrobielle genetikk- og rekombinant-DNA-metoder som er beskrevet av Vanderslice et al. og Capage et al. for å innføre en Ketalasedefekt og en Acetylasedefekt i en enkelt stamme av X. campestris. Denne dobbelt-mutant-stamme ville produsere xantan-gummi som ville være både ikke-acetylert og ikke-pyruvylert.

Metoder til å produsere innskuddsmutasjoner i klonede gummigen-DNA båret på plasmidvektorer har vært beskrevet av Capage et al. Man kunne tenke seg å bruke et plasmid som bærer den innskuddsmutasjon som gav opphav til mutantstammen X921, som et substrat for en andre runde mutagenese in vivo eller in vitro. Denne annen runde mutagenese kunne benytte et hvilket som helst av en rekke transponerbare elementer som vil være innlysende for fagfolk, eller en hvilken som helst av en rekke like innlysende DNA-restriksjonsfragmenter inneholdende selekterbare markører. Et sett plasmider som bærer to innskuddsmutasjoner, kunne benyttes i den gensubstitusjonsteknikk som er beskrevet av Capage et al., for å overføre de plasmid-bårne mutasjoner til kromosomet av X. campestris. Fenotyper av de resulterende stammer kan analyseres ved de in vivo- og in vitro-teknikker som er beskrevet av Vanderslice et al. og Capage et al. (se ovenfor) i eksempel 2. Disse analyser vil avdekke dobbeltmutantstammer som er blokkert i både Ketalase- og Acetylase-aktivitet. Disse dobbeltmutantstammer vil produsere xantan som på samme tid er ikke-pyruvylert og ikke-acetylert.

EKSEMPEL 5

Dette eksempel beskriver prosedyrer for å skaffe en X. campestris-mutant som produserer polytetramer.

Som beskrevet ovenfor og av Vanderslice et al. (se ovenfor) er der allerede oppnådd et xantan-beslektet polysakkarid med en avkortet sidekjede-polytrimer. Denne mutant ble karakterisert ved in vivo- og in vitro-metoder som er beskrevet her. Ved bruk av de metoder som er beskrevet her og i de angitte patentsøkna-der, vil en fagmann være istand til å lage mutantstammer av X.campestris som produserer polytetramergummi som beskrevet ovenfor.

Identifikasjon av disse mutantstammer kan oppnås ved bruk av in vitro-metoder eller ved analyse av polysakkarider produsert in vivo, som beskrevet her og hos Capage et al. (se ovenfor). Når den polytetramer-produserende mutant er laget, kan ytterligere mutasjonstrinn utføres, f.eks. slike som er beskrevet i eksemplene 1 og 4, og som er generelt kjent for fagfolk, for å generere mutantstammer som produserer ikke-acetylert polytetramer.

EKSEMPEL 6

Dette eksempel diskuterer kloning av Acetylasegenet på vektorer for å sikre at de her beskrevne polysakkarider er fullt acetylert.

X. campestris-stammen X1006 har mutasjon i genene for Acetylase resp. Ketalase, som beskrevet i eksemplene 2 og 3. Disse mutanter ble laget ved bruk av de metoder som er beskrevet i eksempel 1. Det er mulig for en fagmann å benytte metoder beskrevet hos Betlach et al., se ovenfor, for å utvinne native DNA-restriksjonsfragmenter inneholdende Acetylase- eller Ketalasegenene. Det vil si at plasmider med DNA-restriksjonsfragmenter inneholdende Acetylase- eller Ketalasegenene avbrutt av en medikament-resistensmarkør kan benyttes til utprøving av lambdagenomiske biblioteker for å skaffe native DNA-sekvenser for Acetylase- eller Ketalase-genet. I en annen utførelsesform er genene for Acetylase- og Ketalaseenzymene allerede blitt klonet på plasmidet pRK290-H336, som beskrevet av Capage et al., se ovenfor, og andre plasmider beskrevet her. Det er en enkel sak for en fagmann å subklone Acetylase- og Ketalasegenene fra disse plasmider.

De native DNA-sekvenser som oppnås ved en av disse metoder, kan så settes inn i plasmider som er istand til å replikere seg i X. campestris, f.eks. pMW79, ved bruk av de metoder som er beskrevet av Betlach et al. og Capage et al. Ekspresjon av Acetylase- og/eller Ketalasegenet kan kontrolleres ved modifisering av den eksisterende DNA sekvens eller innsetting av regulerbare promotorer oppstrøms i forhold til genet. Slike teknikker er velkjente for den som har kunnskaper i molekylær biologi og genetikk. Tilsvarende kan de plasmider som genene er satt inn i, være såkalte "high copy number"-plasmider. Som beskrevet av Capage et al. er de xantan-biosyntetiske enzymer tilstede i små mengder i X. campestris. Innskudd av de ovenfor beskrevne plasmider i X. campestris og dyrking av kulturer under forhold som er egnet for ekspresjon av plasmidbårede gener, vil resultere i syntese av meget større antall Acetylase- og/eller Ketalase-enzymer enn andre xantan-biosyntetiske enzymer. Overekspresjon av Acetylase skulle få xantanpolysak-karidene til å være fullt acetylert, dvs. at alle interne mannoserester er acetylert. Tilsvarende skulle overekspresjon av Ketalase forårsake full pyruvylering av de terminale mannoserester i xantan-polysakkaridene.

Det skulle være klart for en fagmann at full acetylering og full pyruvylering av xantan kan oppnås ved de metoder som er beskrevet ovenfor. Videre kan der oppnås full acetylering av polytetramer og full acetylering av polytrimer (beskrevet hos Vanderslice et al., se ovenfor) ved bruk av de her beskrevne metoder.

EKSEMPEL 7

Dette eksempel viser fordelene ved et ikke-acetylert xantan produsert av en genetisk modifisert Xanthomonas campestris til bruk som viskositetsøkende middel for vandige oppløsninger. Fig. 3 sammenligner viskositeten av kjemisk deacetylert, kommersielt xantan og dets opphavsforbindelse med den av ikke-acetylert xantan-polysakkarid laget av en genetisk manipulert Xanthomonas campestris (stamme X1006) og av xantan-gummi laget av vill-type X. campestris-opphavstammen (stamme X237). Viskositeten ble målt ved en skjærhastighet på 8 s"<1> for 1000 ppm polymerkonsentrasjon i 50.000 ppm NaCl-oppløsning. Viskositetene ble målt over temperaturområdet 25-80°C. Fig. 3 viser at kjemisk deacetylering av xantan resulterer i tap av viskositetsøkende evne over hele temperaturområdet. Imidlertid fører eliminasjon av acetylering ved genetiske metoder til betydelig øket viskositet sammenlignet med vill-type xantan-gummi. således er ikke-acetylert xantan-gummi produsert av en mutantstamme av X. campestris et forbedret polysakkarid sammenlignet med xantan selv og sammenlignet med deacetylert xantan-gummi produsert ved kjemiske metoder.

EKSEMPEL 8

Dette eksempel beskriver de metoder som ble benyttet til å konstruerer en dobbeltmutantstamme av X. campestris som produserer ikke-acetylert, ikke-pyruvylert xantan.

Capage et al. har beskrevet kloningen av en gengruppe fra X. campestris inneholdende gener som dirigerer biosyntesen av xantan-gummi. De har også beskrevet isoleringen av kromosomale slettingsmutasjoner i X. campestris som eliminerer alle eller forskjellige deler av denne gengruppe. Én slik slettingsmutant, stamme X1231, mangler alt X. campestris-DNA som er båret på det rekombinante plasmid pRK290-H336. Således syntetiserer stammen X1231 ikke xantan. Når pRK290-H336 overføres til stamme X1231, gjenvinnes dets evne til å syntetisere xantan. Capage et al. har også beskrevet metoder til å isolere og karakterisere innskuddsmutasjonene av transposon TnK12 inne i det klonede gummigen-DNA båret på pRK290-H336. To slike mutantplasmider er pRK290-H336.22 og pRK290-H336.41. Den omtrentlige plassering av TnK12-innskuddene på hvert av disse plasmider er vist på fig. 4. Når pRK290-H3 36.22 overføres inn i X1231, produserer den resulterende stamme ikke-acetylert xantan. Når pRK290-H336.41 overføres inn i X1231, produseres ikke-pyruvylert xantan. Disse to plasmidmutanter har vært benyttet til å konstruere ved hjelp av in vitro-rekombinering, et dobbeltmutantplasmid som styrer syntesen av ikke-acetylert, ikke-pyruvylert xantan når det bæres i slettingsstammen X1231.

Strategien for å generere in vitro et ikke-acetylert, ikke-pyruvylert dobbeltmutantplasmid er som følger. Et kanamycinføl-somt (Kan<s>) derivat av pRK290-H33 6.41 ble generert ved en partiell Hindlll-digerering av plasmidet, ligering av diges-tionsproduktene ved svært lave DNA-konsentrasjoner (for å fremme intramolekylær ligering), og deretter screening av tetracyklin-resistente (Tet<r>) transformanter for kanamycin-følsomhet. Plasmid-DNA<1>er ble så laget fra Tet<r>, Kan<s->isolater og analysert ved restriksjonsendonuklease-digerering og agarosegelelektroforese. Der finnes bare tre Hindlll-seter i pRK290-H336.41, og to av disse finnes inne i TnK12 og omslutter Kan-genet. Derfor ble en høy andel av de slettinger som ble generert ved den partielle digerering slettet for Kan-genet, mans resten av plasmidet forble intakt. Kan<s->plasmidet bærer fremdelet et innskudd (1 kb) i Ketalasegenet, og man ventet derfor at det skulle gi ikke-pyruvylert gummi. Dette plasmid benevnes p41KS. Det neste trinn var å klone det store Spel-fragment av det ikke-acetylerte mutant-plasmid pRK290-H336.22 inn i p41KS. Som vist på fig. 4, inneholder hvert plasmid tre Spel-seter ved posisjonene 758, 771 og 11,716 inne i DNA-sekvensen i henhold til Capage et al.. 10,9 kb Spel-fragmentet bærer TnK12-innskuddet av pRK290-H336.22. Det lille (13 bp) Spel-fragment ligger fullstendig inne i et tRNA-gen som ikke er vesentlig for vekst av X. campestris og xantan-produksjon. Derfor burde fjerning av dette lille Spel-segment i løpet av dobbeltmutasjonskonstruksjonen ikke påvirke xantan-biosyntesen. Plasmidene p41KS og pRK290-H336.22 ble renset og digerert fullstendig med Spel, og ligering ble utført. Ved denne ligering ble p41KS/SpeI ligert i 10 ganger større mol-overskudd med H336.22/SpeI. Når rekombinanter inneholdende Kan<r>, Spel-fragmentet av H336.22 blir valgt, skulle de således som oftest være assosiert med Spel-vektorfraksjoner av p41KS. Transformas-joner med disse ligasjoner ble utført og der ble oppnådd Kan<r->transformanter. De plasmider som var båret av disse transformanter, ble analysert for identifisering av de interessante rekombinantprodukter. Det ønskede rekombinant-plasmid ble lett identifisert blant Kan<r->transformantene. Dette rekombinant-plasmid, benevnt p41KS22, inneholder det p41KS-avledede innskudd i Ketalasegenet og det H33 6.22-avledede TnK12 innskudd inne i Acetylasegenet. Passende restriksjonsdigereringsanalyse bekreftet nærværet av begge innskuddsmutasjonene og viste videre at Spel-fragmentet inneholdende TnK12-mutasjonen var satt inn med riktig orientering.

Plasmid p41KS22 ble deretter overført inn i en serie av X. campestris-stammer ved konjugering. Den store Gum~-slet-tingsstamme X1231 var blant mottagerne. Denne slettingsbit mangler alt gummigen-DNA båret på p41KS22; derfor skulle X1231 som bærer p41KS22 produsere ikke-acetylert, ikke-pyruvylert xantan. Plasmidet ble effektivt ført over i X1231, og den resulterende fenotype var klart mukoid, men betydelig mindre mukoid enn en vill-type som ble brukt som sammenligning. Polysakkarid produsert av X1231 som bærer p41KS222 ble laget og analysert. Denne polymer inneholdt glukose, mannose og glukuronsyre, men ikke noe målbart acetat eller pyruvat, noe som viser at X1231 (p41KS22) virkelig frembringer den forven-tede ikke-acetylerte, ikke-pyruvylerte gummi.

EKSEMPEL 9

Dette eksempel beskriver konstruksjonen og egenskapene av et dobbeltmutant-plasmid som kombinerer en Acetylasemutasjon og en Transferase IV-mutasjon.

Capage et al. beskriver metoder til isolering og karakteriser-ing av transposon TnK12-innskudd inne i det klonede gummigen-DNA båret av plasmid pRK290-H336. Et mutant-plasmid som bærer en slik innskuddsbit er pRK290-H336.6. Den omtrentlige plassering av TnK12-innskuddsbiten i dette plasmid er vist på fig. 4. Når dette plasmid er tilstede i slettingsstammen X1231, dirigerer det syntesen av polytrimergummi som et resultat av inaktiveringen av Transferase IV ved hjelp av innskuddsbiten. Ved bruk av prosedyrer analoge med dem beskrevet i eksempel 9 ble det konstruert et dobbeltmutantplasmid som kombinerer denne Transferase IV-defekt med Acetylasemutasjonen båret i pRK290-H336.22. Et kanamycin-følsomt derivat av pRK290-H336.6 ble avledet ved sletting av Hindlll-fragmentet av TnK12. Dette plasmid, p6KS, er analogt med Kan<s->plasmidet p41KS og har fremdeles igjen 1 kb av TnK12 innsatt i Transferase IV-genet. Deretter ble det store TnK12-inneholdende Spel-fragment av pRK290-H336.22 ligert inn i Spel-digerert p6KS-plasmid-DNA som beskrevet i eksempel 8, og dobbeltmutant-plasmidet p6KS22 ble oppnådd. Dette plasmid bærer innskuddsmutasjoner i Transferase IV og Acetylase. Når det overføres inn i slettingsstammen X1231, burde det dirigere systesen av ikke-acetylert polytrimer. I mange uavhengige plasmidoverføringsforsøk kunne imidlertid ikke overføring av p6KS22 inn i stamme X1231 oppdages selv om plasmidet med hell ble overført med høy frekvens inn i andre mottagere, hvorunder både Gum~- og Gum<+->stammer. Dette resultat antyder at nærværet av p6KS22 i stamme X1231 er dødelig, sannsynligvis som et direkte resultat av produksjon av ikke-acetylert polytrimergummi. Capage et al har beskrevet tre andre dødelige mutasjoner innen gummigengruppen, og trukket den slutning at disse dødelige mutasjoner forårsaker akkumulering av et giftig mellomprodukt i xantan-biosyntesen. Akkumulering av ikke-acetylert polytrimer kan potensielt være giftig hvis dette polysakkarid ikke kan sekreteres av det transportsystem som normalt sekreterer xantan.

Det skal forstås at en fagmann med kjennskap til læren ifølge den foreliggende oppfinnelse vil kunne anvende denne på en spesifikk mikroorganisme.

Claims (11)

1. Sammensetning bestående av en vannoppløselig polysakkaridpolymer som har et forhold mellom D-glukose, D-mannose og D-glukuronsyre på ca. 2:1:1, karakterisert ved at den har en molekylvekt på 10<5->10<7> dalton, at (1) D-glukoseenhetene er bundet i en beta-[1,4]-konfigurasjon,

(2) D-mannoseenhetene er bundet i en alfa-[1,3]-konfigurasjon, vanligvis til annenhver glukoseenhet, og (3) D-glukuronsyre-enhetene er bundet i en beta-[1,2]-konfigurasjon til mannoseenhetene og at D-mannoseenhetene kan være acetylert eller ikke-acetylert.

2. Sammensetning som angitt i krav 1, karakterisert ved at mannoseenhetene av polysakkaridpolymeren er acetylert i 6-0-stillingen.

3. Sammensetning som angitt i krav 1, karakterisert ved at mannoseenhetene av polysakkaridpolymeren ikke er acetylert i 6-0-stillingen.

4. Sammensetning som angitt i krav 1, karakterisert ved at minst 90% av mannoseenhetene er acetylert i 6-0-stillingen.

5. Fremgangsmåte til fremstilling av polysakkaridpolymerene ifølge krav 1, karakterisert ved at et egnet vekstmedium podes med en mikroorganisme av genus Xanthomonas som er istand til å syntetisere polytetramergummi iht. krav 1, og det podede vekstmedium inkuberes ved passende temperatur, pH-verdi og nivå av oppløst oksygen for produksjon av en polysakkaridpolymer som har et forhold mellom D-glukose, D-mannose og D-glukuronsyre på ca. 2:1:1.

6« Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at polysakkaridpolymeren gjenvinnes fra vekstmediet ved utfelling eller ultrafiltrering.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at mikroorganismen er av arten Xanthomonas campestris.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at mikroorganismen er en mutant av Xanthomonas campestris som mangler Transferase V.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at mikroorganismen er en mutant av Xanthomonas campestris som mangler Transferase V og Acetylase.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at mikroorganismen er en mutant av Xanthomonas campestris som mangler Transferase V og acetylkoenzym A.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at mikroorganismen er en mutant av Xanthomonas campestris som mangler fosfoenolpyruvat.