JPS63503198A - アセチル化されていないおよび／またはピルビル化されていないガムおよびアセチル化されたまたはアセチル化されていないポリテトラマーガムを含むキサンタンに基づくポリサッカライドポリマー群 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アセチル化されていないおよび／またはビルビル化されていないガムおよびアセ チル化されたまたはアセチル化されていないポリテトラマーガムを含むキサンタ ンに基づくポリサッカライドポリマー群企里少宵景 この出願は、１９８６年３月２６日に提出された米国特許出砂筒８４４、４３５ 号の一部継続出願である。

本発明は、ポリサンカライドポリマーに関する。と（に、本発明は、キサンタン に基づくポリサッカライドポリマーであり、このポリマーは、ここでキサンタン ガムに構造的に類似するポリマーとして定義され、そしてアセチル化されていな い、ピルビル化されていない、アシル化されておらず且つピルビル化されていな い、低度にピルビル化されている、およヒ完全にピルビル化されているキサンタ ン（ペンタマー）ガム、およびポリテトラマーガム、アセチル化されている、お よびアセチル化されていないの両者、を含み、キサンタン生物合成通路の成分に よって生成される。

キサンタンガムは、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属（以後キサン トモナスと呼ぶ）のバクテリア、とくにＸ、カンペストリス種の微生物によって 生成される。キサンタンガムは、通常の物理的性質、すなわち、きわめて高い比 粘度および擬塑性をもつため、広く使用されている生成物である。

それは、普通、食物において増粘剤として、そして第２または第３油回収におい て移動性調節剤またはプロフィル変更剤として、ならびに石油掘削流体において 使用されている。

化学的には、キサンタンガムは陰イオン性へテロポリサッカライドである。この ポリマーの反復単位は、５つの糖部分、詳しくは２つのグルコース部分、１つの グルクロン酸部分および２つのマンノース部分から構成されたペンタマーである 。

これらの糖残基は、グルコース部分がポリマー鎖の主鎖を形成し、マンノース− グルクロン酸−マンノース残基が一般に交互するグルコース部分から延びている ように配置されている。通常、この基本構造は、特別のアセチル化およびピルビ ル化されている。これは、例えば、次の文献に記載されている：　Ｊａｎｓｏｎ 、　Ｐ、Ｅ、　、　Ｋｅｎｎｅ、　Ｌ、およびＬｉｎｄｂｅｒｇ、　Ｂ、　＋　 ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓｅａｃｈ、４５　：　２７５−２８２（１９７ ５）およびＭｅｌ　ｔｏｎ、　Ｌ、Ｄ、　、　Ｍｉｎｏｔ、　Ｌ、　。

Ｒｅｅｓ、Ｄ、八、および５ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｇ、Ｒ，、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ ａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｃｈ、４６：２４５−２５７　（１９７６）。これらの各々 を特別にここに引用によって加える。アシル化およびピルビル化の程度は変化す ることが知られている。キサンタンガムの構造を下に描く：天然キサンタンガム の広い利用にかかわらず、その物理的性質が制限されるようになる場合が存在す る。とくに、第２または第３の油の回収において、油含有容器の温度および容器 内の塩濃度がキサンタン溶液にとって最適より高くなることはまれなことではな い。これらの状態が起こると、キサンタンは沈澱し、凝集しそして／またはその 粘度を失うことがある。したがって、油の回収の間に直面する種々の条件、例え ば、高温および高い塩濃度において良好に作用する新しい増粘性生成物が望まし いであろう。

本発明は、自然キサンタンガムに関して改良された性質を有するキサンタンの基 づく多糖の１つの族を開示する。キサンタンガムの変更は従来記載されてきてい る。例えば、Ｂｒａｄｓｈａｗら（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒ ｓ、３　：２３−３８（１９８３））　は、脱アセチル化または脱ビルビル化さ れている、化学的に変更したキサンタンガムの製造法を記載している。また、キ サントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　印肚競ｔｒｉｓ）種 （以後Ｘ、カンペストリスと呼ぶ）によって生成されるキサンタンガムを化学的 に脱アセチル化する種々の手段は、米国特許第３．０００，７９０号および米国 特許第３，０５４，６８９号に記載されている。今日まで、これらの脱アセチル 化法に利用された唯一の方法は、通常アセチル化されたキサンタンガムからアセ テート部分を化学的に除去することによった。キサンタンガムを脱アセチル化す る化学的方法は、多くの望ましくない副作用を生じ、そしてグリコシドの主鎖を 加水分解させて、分子の立体配座を不可逆的に変化させそして分子量を低下させ ることがあることが見出された。

水性媒質中で脱アセチル化したキサンタンのレオロジー的性質のあるものは知ら れている。参照、例えば、ＴａｋｏおよびＮａｋａｍｕｒａ、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ、　４８　：　２９８７−２９３３（１９８４）および米国特許 第３，０００，７９０号および米国特許第３，０５４，６８９号。また、脱アセ チル化ポリサンカライドを使用して水溶液の粘度を増加する方法は米国特許第３ ．０９６，２９３号に記載されている。こうして、不適当な副作用を起こさない 、アセチル化されていないキサンタンを得る方法は探究されてきている。

キサンタンガムは同様によく化学的に脱ピルビル化することができる。これは次 の文献に記載されている：　Ｈｏｌｚｗａｒｔｈおよび０ｇ１ｅｔｒｅｅ、Ｃａ ｏｂｏ、Ｒｅｓ、　７６　：　２７７−２８０（（１９７９）。この脱ピルビル 化の方法は、また、キサンタンポリマーの単位を変更しそして／またはグリコシ ド主鎖の加水分解を起こすことがある。ピルビル化されていないキサンタンガム を生成するＸ、カンペストリスの菌株は米国特許第４，２９６．２０３号に記載 されているが、このビルビル化されていないガムは化学的手段により完全にアセ チル化されるか、あるいは脱アシル化された。本発明者らが信するところいよる と、アセチル化されておらずかつピルビル化されていないキサンタンポリサッカ ライドは、改良されたレオロジー的および粘性化の性質を有し、したがってこの ようなガムおよびそれを製造する微生物学的方法が探究された。

さらに、キサンタンの側鎖上の内部のマンノースのアセチル化の程度および末端 マンノースのピルビル化の程度は変化しうる。本発明者らは、完全にアセチル化 および／または完全にピルビル化されたキサンタンは、ある油の回収の目的に対 して改良されたレオロジー的性質を有すると信する。

その上、本発明者らは、通常のキサンタンペンタマー構成ブロックの変更に基づ （、ポリサンカライドを同定した。これらのポリマーは、剪断速度、塩度に耐え る能力、および粘性化性質に影響を及ぼす温度に対する応答に関して、通常のキ サンタンガムよりも改良されたレオロジー的性質を示す。

この変更された多糖は、下に描くポリテトラマーおよびアセチル化されていない ポリテトラマーを包含する。

Ｈ これらの多糖は、また、１９８５年８月６日に提出された「キサントモナスによ り作られたポリサンカライドポリマー」と題する同時係属米国特許出砂筒７６２ ，８７８号（これをここに特別に引用によって加える）におにおいて、Ｖａｎｄ ｅｒｓｌｉｃｅらの記載するアセチル化されたおよびアセチル化されていないポ リテトラマーを包含する。

発里■翌對 本発明の目的は、天然キサンタンガムよりもすぐれた水の粘性化剤である、ポリ サンカライドポリマーの族を提供することである。本発明の他の目的は、高温お よび／または塩類の存在下に、天然キサンタンガムよりも改良されたレオロジー 的性質を有し、そして他の所望の性質を有するポリサンカライドポリマーの族を 提供することである。

また、本発明の目的は、これらの生成物をあるものを得る生体外法および生体内 でポリサンカライドポリマーのこの族の構成員を生成する能力を有する微生物を 提供することである。本発明の他の目的は、種々のポリサンカライドポリマーを 生成する能力を有する微生物を好気的に発酵することによって、ポリサッカライ ドのこの族の構成員を調製する方法を提供することである。

本発明の追加の目的および利点は、一部分の説明において記載されており、そし て一部分この説明から明らかであり、あるいは本発明の実施により学ぶことがで きるであろう。これらの目的および利点は、添付した請求の範囲において指摘さ れたいる手段および組み合わせによって実現および達成できるであろう。

これらの目的を達成するために、かつ、ここに具体化されかつ広く記載されてい るように、本発明の目的に従い、２：１：１のＤ−グルコース＝Ｄ−マンノース ：Ｄ−グルクロン酸の比を有する多糖ポリマーを含んでなり、Ｄ−グルコース部 分がベーター（１、４）立体配置において結合しており、Ｄ−マンノース部分が アルファー（１、３）立体配置において、一般に交互するグルコース部分に結合 しており、そしてＤ−グルクロン酸部分がベーター（１、２）立体配置において マンノース部分に結合している組成物が提供される。この多糖ポリマーは、反復 テトラマー：グルコース−グルコース−マンノース−グルクロン酸から成るので 、「ポリテトラマー」と呼ぶ。また、マンノース部分の少なくとも９０％、好ま しくは９５％および最も好ましくは１００％が６−０位置においてアセチル化さ れている、前述の、ポリテトラマー組成物ならびにアセチル化されていないポリ テトラマーが提供される。

さらに、これらの目的を達成するために、かつ、本発明の目的に従い、マンノー ス部分がアセチル化されていないキサンタンガムを含んでなる組成物が提供され る。このガムは、以後、「アセチル化されていないキサンタン」と呼ふ。キサン タンガムの末端マンノース部分がビルビル化されていない、第２構造体をここで 言及する。このガムを「ピルビル化されていないキサンタン」と呼ぶ。その上、 アセチル化されておらずかつピルビル化されていないガムを開示する。このポリ マーを、以後、「非アアセル化、非ビルビル化キサンタンガム」と呼ぶ。また、 本発明は、「完全にアセチル化されたキサンタンガム」と呼ぶキサンタンガムに 関し、ここで内部のマンノース部分の少なくとも９０％はアシル化されており、 好ましくは９５％、より好ましくは１００％アシル化されている。また、本発明 は、末端マンノース部分の少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましく は１００％がピルビル化されているキサンタンガムに関し、ここでこれを「完全 にピルビル化されてキサンタンガム」と呼ぶ。

本発明は、また、前述のポリサンカライドポリマーの製造法を包含する。本発明 のポリサンカライドポリマーは、一般にポリサンカライドの生成を導（、微生物 の生物合成通路の遺伝子操作によって一般につくることができる。とくに、キサ ンタンガムを生成する微生物の通路は、変更されたポリマー単位の生成のために 生体内または生体外の系をつくるように操作することができる。こうして、この 系は、とくに調節可能なアセチラーゼ遺伝子およびケタラーゼ遺伝子を使用して 、種々の程度にアシル化またはピルビル化されたポリサッカライドをつくること ができる。例えば、１０％、２０％、３０％、４０％または５０％であるキサン タンガムを合成することができ、あるいは１０％、２０％、３０％、４０％また は５０％がピルビル化されているキサンタンを合成できることが考えられる。本 発明のポリサンカライドポリマーを生体内で生成する微生物およびこれらのポリ サッカライドポリマーを使用する方法も記載する。

下により完全に説明するキサントモナス・カンペストリス種の種々の菌株は、ア メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　 Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉ ｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）に１９８６年３月２１日に受託 されあ。これらの菌株はχ９２１、Ｘ１００６、ｘ９３４およびＸ１２３１であ り、そして、それぞれ、受託番号５３４７２．５３４７３．５３４７４および６ ７３４４で受託された。

上の一般的説明および下の詳細な説明の両者は、例示および説明のみであり、そ して請求の範囲に記載されている本発明を限定しない。この明細書の一部に組込 まれかつそれを構成する添付図面は、本発明の種々の実施態様を例示し、そして 、この説明と一緒に、本発明の詳細な説明役目をする。

図面の簡単な説明 第１図は、キサンタンガムの生物合成の推定した通路を示す。略号は次の通りで ある：Ｇ１ｕ−グルコース；　ＧｌｕＡ−グルクロン酸；Ｎａｎ＝マンノース； 　Ｇｌｕ−Ｇｌｕ　−セルビオース；Ｐ＝ホスフェ−）；ＰＰ＝ピリホスフェー ト；Ｃ５５−イソプレノイド脂質キャリヤー、ＰＥＰ＝ホスホエノールピルベー ）　；　ＡｃＣｏＡ−アセチル補酵素Ａ；ｒ−Ｖ＝グルコシルトランスフェラー ゼ、ＵＤＰ−ウリジン５゛　−ジホスフェート；およびＧＤＰ＝グアノシン５° 　−ジホスフェート。

第２図は、野生型ガムおよびピルビル化されていないガムの間の粘度の比較を示 す。

第３図は、アシル化されていないガムおよび化学的に脱アシル化したガムの粘度 の比較を示す。

第４図は、Ｕ換えプラスミドｐＲＫ２９０−　Ｈ３３６のクロー化遺伝子クラス ターＤＮＡ内の３７Ｊ１２挿入突然変異体のおよその物理的位置を示す。この図 面は、また、ｐＲＫ２９０−　Ｈ３３６中のｍＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部 位のおよその位置を示す。

衾更皇距旦笠脱肌 本発明の現在好ましい実施態様について説明する。これは、下の実施例と一緒に 、本発明の詳細な説明する。

本発明のポリサッカライドポリマーは上に詳細に説明した。

これらのポリサッカライドポリマーは細胞不合酵素系を使用して生体外で製造す ることができるが、あるいは適当な突然変異体菌株の細胞を増殖することによっ て生体内で製造することができる。ポリサンカライドポリマーを調製する他の手 段もまた、下に記載する。

の　声の人 変種でないキサンタンガムをつくるための無細胞系の使用に関する基本法は、次 の文献に記載されている：　Ｌ、、Ｃ０ＬＩＳＯ＋Ｒ２０，およびＤａｎｋｅｒ ｔ、　Ｍ、八、、ＦＢＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１３０　：　２５３−２５６（１ ９８１）（ここに特別に引用によって加える）。この方法の変法を使用して本発 明の変種の多糖をつくことが可能であることがわかった。

この新規な変法のために、生体外無細胞系は、一般に、好ましくはＥＤＴＡを含 む、適当な緩衝液の存在下に、キサントモナス属、好ましくはキサントモナス・ カンペストリスの微生物の細胞を溶解し、そして適当な生合成酵素を得ることに よって調製され、前記酵素は外的に添加した基質を引続いて処理することができ る。細胞の溶解の別の手段は、超音波処理、フレンチ・プレス処理、洗浄剤処理 、酵素処理およびそれらの組合わせを包含するが、それらに限定されない。

−ｍに、本発明の形体ポリサンカライドポリマーを製造するために、所望のポリ サンカライドを組み立てるために要求される酵素を有する微生物の細胞溶解物を 、適当な基質とともにインキュベーションし、前記基質は、所望のガムに依存し て、ＵＤＰ−グルコース、ＧＤＰ−マンノース、ＵＤＰ−グルクロン酸、アセチ ル−ＣｏＡおよびホスホエノールピルベートを包含できる。基質の選択は、生成 しようとする多糖に依存する。例えば、アセチル化されていない多糖は基質とし てアセチル−ＣｏＡを排除することによって得られる。同様に、ビルビル化され ていないガムは基質としてホスホエノールピルベートを排除することによって得 られる。内因性基質を消耗するための細胞溶解物の化学的および／または酵素的 処理は、この分野において明らかであろう。

さらに、無細胞系は、第１図に記載するキサンタン生合成通路の酵素の１または ２以上を欠乏する突然変異体からつくることができる。このような突然変異体由 来の細胞溶解物は、突然変異体のみにより、あるいは差し控えた基質との組み合 わせにおける突然変異体により、ここに記載する変形体ガムを生成するであろう 。例えば、トランスフェラーゼＶを欠（突然変異体培養物からつくられる無細胞 系はポリサッカライドポリマーを生成するであろうが、同一の細胞不含系が、ア セチル−ＣｏＡが存在しないとき、アセチル化されていないポリテトラマーを生 成するであろう。

生物合成法は、１つの実施態様において、放射標識した基質をポリマー単位中に 組込むことによって監視することができる。他の方法は、また、この分野におい て知られている生物合成中間体を同定するために使用できる。とくに、クロマト グラフィー法がオリゴサツカリド中間体を分離しかつ同定するために開発された 。これは薄層クロマトグラフィーおよび高性能液体クロマトグラフィーを包含す る。

キサンタンの無細胞生合成は、すべての３つの特異的糖ヌクレオチドの添加に依 存する、時間依存性の逐次過程であることがわかった。標識した基質の非特異的 組込みのバンクグラウンドは、最小であり、そしてガム分画中のキサンタン特異 的ポリマーの検出を妨害しない。

脂質キャリヤ、とくにイソブレノイドビロホフェートの関与は、いくつかのポリ サッカライド生合成通路において示された。さらに、キサンタンの生合成におい てピロホスホリル結合脂質キャリヤーの関与が立証された。こうして、キサンタ ン生合成中間体は、これらのキャリヤー脂質を使用して有機可溶性分画において 回収可能であることがわかった。これらの回収されたオリドサッカリドは、引続 いて、キャリヤー脂質から、例えば、ｐＨ２および９０℃における２０分の、穏 和な加水分解によって分離し、そして分析のためアルカリ性ホスファターゼで脱 ホスホリル化することができる。

中間生成物を回収するこれらの方法を使用すると、生体外の条件下に、Ｘ、カン ペストリス突然変異体のある種の細胞溶解物は、非変形体ガムの合成に要求され るすべての基質の存在下でさえ、アセチル化されていないキサンタンガムまたは ピルビル化されていないキサンタンガムを生成するであろうことが見出された。

ここの教示に照して、これらの方法により、当業者は、他の変形されポリサッカ ライドを生成する細胞溶解物、例えば、ポリテトラマーガムを生成する突然変異 体細胞溶解物を同定することができるであろう。

・でのポｌす・カーイドの人 前述のポリサンカライドのための無細胞合成法の開発は、種々のキサントモナス ・カンペストリス細胞が、アセチル化されたまたはアセチル化されていないポリ テトラマー、アセチル化されていないおよび／またはピルビル化されていないキ サンタンガム、および完全にアセチル化されたキサンタンガムを生成するために 必要な酵素のすべてを有することを立証した。しかしながら、ポリテトラマーを 生体内で合成するために全細胞を使用するために、反応■（第１図）においてキ サンタンガムの合成をブロッキングする手段が要求されるであろう。その上、全 細胞がアセチル化されていないポリテトラマーを合成するようにするために、ア セチル化反応（第１図参照）ならびに反応Ｖをブロッキングする手段が要求され るであろう。

さらに、全細胞がアセチル化されていないキサンクンガムを合成するようにする ために、キサンタンガムの合成の間アセチル化工程をブロッキングする手段が要 求されるであろう。

さらに、全細胞が非アセチル化、非ビルビル化キサンタンガンム合成するように するために、アセチル化およびピルビル化の両者の工程においてキサンタンガム の合成をブロッキングする手段が要求されるであろう。本発明の１つの実施態様 において、突然変異誘発を使用してこれらの反応の原因となる遺伝子のあるもの を変更した。

トランスポゾン類（これはＴｎｌＯおよびＴｎ９０３を包含するが、これらに限 定されない）を使用してキサントモナス・カンペストリスを突然変異誘発するこ とができる。これらのトランスポゾン類は、１つの実施態様において、それぞれ 、テトラサイクリンおよびカナマイシンに対する耐性を付与する。Ｉ・ランスポ ゾン類、遺伝子中に自らを挿入する能力を有し、その遺伝子中でコード配列を中 断することによって突然変異を生じさせる。トランスポゾン類は、種々のベクタ ー、例えば、いわゆる自殺ベクター、例えば、ｐＲＫ２０１３上でキサントモナ ス・カンペストリスに導入され得る。ｐＲＫ２０１３は、Ｄｉｔｔａ、Ｇ。

Ｃｏｒｂｉｎ、Ｄ、およびＨｅ１ｉｎｓｋｉ、　Ｄ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　＋７７、７３４７−７３５０１９８１）　 （ここに特別に引用によって加える）に記載されているように、それ自体を、非 腸内バクテリア、例えば、キサントモナス・カンペストリスの中に移送する能力 を有するが、その宿主内で複製することはできない。こうして、自殺ベクターが キサントモナス・カンペストリス細胞の集団中に導入され、そしてその集団が次 にテトラサイクリンまたはカナマイシンによりチャレンジされればトランスポゾ ン類の１つがキサントモナス・カンペストリスのゲノム中に挿入された個体が生 存する。このようなチャレンジに対して生存した個体を、キサンタンガムをつく る能力の喪失についてスクリーニングすることができる−０このような突然変異 体は、野生型キサントモナス・カンペストリスよりもムコイドが少ないように思 わるであろう。

本発明の他の実施態様においては、突然変異誘発の他の手段を使用して、キサン タンガムをつくる能力を失った突然変異体、またはそれらが生成するガムをアセ チル化および／またはビルビル化しない突然変異体を発生させる。このような手 段はこの分野において知られており、そして、次のものを包含するが、これらに 限定されない：照射、組換えＤＮＡ技術〔と（に、「キサンタンガムの組換えＤ 　Ｎ　Ａ仲介生成」と題するＣａｐａｇｅらの１９８６年３月２６日に提出され た米国特許出砂筒８４２．９４４号（これをここに特別に引用によって加える） 、および下の実施例１に記載されている〕および化学的突然変異誘発処理。この ような突然変異誘発手順の例は、次の文献に記載されている：　Ｍｉｌｌｅｒ、 Ｊ、Ｈ，、Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ （１９７２）　；　Ｄａｖｉｓｕ、Ｒ，Ｗ、、Ｂｏｓｔｅｉｎ、Ｄ、およびＲｏ ｈｔ、Ｊ、Ｒ，。

Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｂｅｎｅｔｉｃｓ（１９８０）　；お よびＭａｎｉａｔｉＳ＋Ｔ、＋Ｆｅｉ　ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、およびＳａｍｂｒ ｏｃｋ、Ｔ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　（１９８２）＋Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒｓ野生型生物体よりもムコイドが少ないように思わ れる突然変異体をまず選択することができるが、−ｉに多少のポリサンカライド をつくる能力を保持しているものが望まれる。キサンタン突然変異体の各々の無 細胞抽出物を調製し、そして前述のように、基質の異なる組み合わせの添加およ び得られる生成物の分析により試験することができる。

あるいは、適当な突然変異体は、各突然変異体の培養ブロスを所望の多糖、例え ば、アセチル化されているかあるいはアセチル化されていないポリテトラマーガ ムまたはアセチル化されていない、アセチル化されておらず且つピルビル化され ていない、低度にピルビル化された、または完全にアセチル化されたキサンタン ガムの存在についてアッセイすることによって検出できる。キサントモナス・カ ンペストリスのアセチル化されていないキサンタンガムを生成する突然変異体（ Ｘ１００６）　、ピルビル化されていなガスを生成する突然変異体（Ｘ９２１） 、低いレベルのピルビル化を含有するキサンタンガムを生成する突然変異体く５ ％より少ない未満マンノース、Ｘ９３４）　、およびアシル化されておらず且つ ピルビル化されていないキサンタンガムを生成する突然変異体（１２３１）　（ ｐ４１Ｋｓ２２）の各々は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３ ０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ。

Ｒｏｃｋｖｉ　ｌｉｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）に、それぞれ、受託番号５３４７ ２．５３４７３．５３４７４および６７３４４として受託されている。

野生型トランスフェラーゼＶ、アセチラーゼおよびケタラーゼの酵素阻害剤を使 用して同一の生成物をつ（ることは、この発明の範囲を逸脱するものではない。

多糖のこの族を生成する、その他の変法が考えられ、これには天然のキサンタン ガムの酵素的および化学的分解が包含がされる。

突然変異体は、野生型キサントモナス・カンペストリスの増殖について、この分 野において一般に知られている条件下に増殖させることができる。例えば、それ らは適当な同化可能な炭素源、例えば、グルコース、スクロース、マルトース、 澱粉、転化糖、複合炭水化物、例えば、糖蜜またはコーンシロップ、種々の有機 酸類などで増殖させることができる。炭素源の混合物を使用することもできる。

炭素源の供給濃度は、しばしば、１０〜６０ｇ／ｌである。また、有機または無 機の同化可能な窒素源、一般に約０．１〜１０．０ｇ／ｌ、および無機類が、増 殖に必要であり、そしてそれらの選択は当業者にとって容易であろう。適当な窒 素源の例は、アンモニウム塩類、硝酸塩、尿素、酵母エキス、ペプトン、または 他の加水分解可能な蛋白質の物質またはそれらの混合物である。適当な無機類の 例は、リン、イオウ、カリウム、ナトリウム、鉄、マグネシウムであり、これら はキレート化剤、例えば、ＥＤＴＡまたはクエン酸と一緒に添加される。

キサントモナス・カンペストリスの増殖に最適な温度は、−ｉに、１８℃〜３５ ℃、好ましくは約２７℃〜３０℃である。キサントモナス・カンペストリスの細 胞は、溶存酸素の適切なレベル、例えば約１０％飽和が維持されるように空気ま たは酸素を供給することによって好気的に増殖させる。好ましくは、このレベル を約２０％以上に保持する。ｐＨは、しばしば、約６．０〜８．０、好ましくは 約６．５〜７．５に維持される。

本発明のポリサッカライドは発酵プロスから適当な手段によって回収できる。イ ソプロパツール、エタノールまたは他の適当なアルコールによる沈澱により、本 発明ポリサンカライドが容易に得られる。一般にアルコールは、体積基準で約５ ０〜７５％の濃度に、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたは他の塩の存在下に添 加する。あるいは、ポリマーはブロスから限外濾過によって回収できる。

ピルビル化されていないキサンタンガムは、特定の用途において水性媒質の粘性 付与剤としてキサンタンより優れる。

アセチル化されていないキサンタンおよびピルビル化されていないキサンタンの 溶液の粘度は、高い温度および／または高い塩濃度の条件下で保持される。こう して、本発明の生成物は第２および第３の油回収における使用に理想的に適する 。

油回収の増強において使用するための移動度調節溶液はまた、ここに開示する種 々の変種形体ポリサッカライドポリマーから調製することができる。約５００〜 約３０００ｐｐｍの濃度のポリサンカライドポリマーの溶液がこのような移動度 調節溶液に適する。他の既知の添加剤をさらにこれらの溶液と組み合わせて使用 して、さらに油の回収を増大することができる。

このような添加剤は、例えば、界面活性剤、アルカリ剤または金属または有機架 橋剤を包含する。

ポリサンカライドポリマーはさらに、キサンタンガムのように、食品、化粧品、 医薬製剤、紙のサイジング、掘削泥しよう、印刷インキなどにおける増粘剤とし て、およびゲル化剤として使用できる。さらに、それらはパイプ中の流体の流れ の摩擦抵抗を減少するために使用できる。

実施例１ この実施例は、アセチラーゼまたはケタラーゼの活性を欠くＸ、カンペストリス 突然変異誘発を発生するために使用した突然変異誘発およびスクリーニングの方 法を示す。

キサンタンガムの生合成の酵素をコードする遺伝子は、Ｘ。

カンペストリスの染色体上に集まった遺伝子の組からなることが示された。この 「ガム遺伝子のクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）　ＪはＣａｐａｇｅらによって詳 細に記載された。ガム遺伝子ＤＮＡのセグメントは、Ｃａｐａｇｅらが詳述して いるように、プラスミドベクター、例えば、ｐＭＷ７９の上にクロー化されてい る。

領域特異的突然変異誘発を、プラスミドｐＭＷ７９中に担持されたガムＤＮＡの サブクローン化部分に対し実施した。これらのクロー化Ｄ　Ｎ　Ａセグメントを 生体内でトランスポゾンを使用して、そして生体外で、組換えＤＮＡ技術により 突然変異誘発して、クロー化Ｘ、カンペストリスＤＮＡ内に、挿入、欠失および 置換突然変異を発生させた。これらの突然変異によって与えられる表現型を研究 するために、突然変異を担持するプラスミドをＸ、カンペストリスに移して戻し 、引続いて、プラスミドに担持された突然変異した遺伝子が相同組換えを経て染 色体中に挿入されている組換え体を同定した。

ＴｎｌＯによってコードされるテトラサイクリン耐性は、プラスミドから染色体 中への突然変異の移動についての便利な選択的系を与える。

１つのこのような突然変異株（Ｘ１００６）はＴｎｌＯ挿入を有し、アセチラー ゼ活性を不活性化することがわかった。この突然変異体株は、実施例２および３ において特徴づけられており、そしてアセチル化されていないポリサッカライド を生成することがわかった。第２の突然変異株は、ＴｎｌＯのテトラサイクリン 耐性遺伝子を含有するＤＮＡの断片を、ガム遺伝子クラスター内の制限部位の中 に生体外挿入することによって構成した。この突然変異株（Ｘ９２１）はケタラ ーゼ活性に欠けることがわかった。実施例２および３の方法によって見出された ように、この突然変異体はビルビル化されていないキサンタンを生成した。

第３の突然変異体（Ｘ９３４）は、また、ケタラーゼ活性を大きく減少させてい ることがわかった。この突然変異株は、ビルビル化が非常に低いキサンタンガム を生成する二通常のキサンタン中に存在するビルビル化の１〜５％。

突然変異株Ｘ９３４は下に記載するようにして見出された。プラスミドに担持さ れたＸ、カンペストリスＤＮＡとＸ、キサントモナス染色体との間の組換えを研 究するように設計した予備実験において、プラスミドｐＴＸ６５５をモデル系と して使用した。このプラスミドは、プラスミドＲＳＦＩＯＩＯ中にクロー化され た２、　３　ｋｂのＸ、カンペストリスＰｓｔｌ断片の中央にＴｎｌＯ挿入部を 有する。このＴｎｌＯの挿入により、ＣａｐａｇｅらおよびＶａｎｄｅｒｓｌｉ ｃｅらが記載するように、突然変異体株ｐＴＸ６５５においてＧｕｍ−欠損が生 ずる。この実験は、ｐＴＸ６５５をプラスミドｐＲＫ２０１３によって動員し、 そしてそれをＥ、コリからＸ、カンペストリス中に、ＴｎｌＯによってコードさ れたテトラサイクリン耐性の転移にについて選択することによって転移させるこ とであった。この交配の初期の結果は例外的であり、そしてＴｎｌＯがプラスミ ド上に担持されている場合にはＸ、カンペストリス中でテトラサイクリン耐性を 効率的に発現しないが、ＴｎｌＯがＸ、カンペストリスの染色体中に担持されて いる場合には前記薬物耐性はより効率よく発現されることを示唆した。

この現象は、また、Ｅ、コリでのＴｎｌＯについても記載されている。そこにお いて示されているように、染色体中に挿入されているＴｎｌＯの１つのコピーを 有する菌株は、マルチコピーのプラスミド上にＴｎｌＯを有する菌株よりも、有 意に高いテトラサイクリン濃度に対して耐性である。上の交配からのＴｅｔ’Ｘ 、カンペストリスの選択は、テトラサイクリン上での増殖が非常に劣る（すなわ ち、小さい淡いコロニー）子孫を高い頻度（０，５／受容体）で生じさせた。延 長したインキュベーションの後、大きい割合（２５％）のコロニーがより激しく 増殖する細胞のセクター（ｓｅｃｔｏｒ）を生成した。これらのセクターの５０ ％より多くは形態がＧｕｍ−であるように見えた。

これらは、多分、ＴｎｌＯの挿入を含有するプラスミドに担持されたＤＮＡと染 色体の野生型ＤＮＡとの間の組換えから生ずる。ＴｎｌＯが染色体中に組み込ま れるとき、高いレベルのＴｅｒ’が得られ、そして激しく増殖するセクターが観 察される。これらのＧｕｍ−２Ｔｅｔ’セクターを取り上げ、そしてテトラサイ クリン上に再びストリーキング（ｓｔｒｅａｋ）すると、それらは良好に増殖し 、そして特徴的なＧｕｍ−形態を表わす。

Ｇｕｍ”、Ｔｅｒ’単離体も特徴づけた。これらの株のあるもの（とくにＸ９３ ４）は、相同組換えを介してＸ、カンペストリスの染色体中に挿入された全体プ ラスミドｐＴＸ６５５を含有することがわかった。Ｘ９３４株の染色体の構造を 、染色体ＤＮＡのサザン・プロットハイブリダイゼーションによって決定し、こ れはプラスミド配列が染色体的に一体化された形態で存在することを示す。

実画ｌ吐ｉ この実施例は、本発明の変形されたポリサッカライドを生体外で調製できる方法 を示す。例えば、これはアセチル化されていないおよび／またはビルビル化され ていないキサンタンガムを生体外でどのようにして調製したかを示す。

■許搭五隻１１ｕ製 実施例１および５に記載するキサントモナス・カンペストリスＢ１４５９５４− Ｌまたは５４−Ｌ突然変異株を、Ｊｅａｎｅｓ＋Ａ、ら、米国農務省、ＡＲＳ− ＮＣ−５１，ｐｐ１４（１９７６）　（ここに特別に引用によって加える）に記 載されているように、２％（Ｗ／Ｖ）のグルコースを補充したＹＭ（酵母−麦芽 培地）中で増殖せしめした。培養物を対数期後期まで３０℃において増殖せしめ た。

細胞を遠心分離によって収得し、そして冷トリス−ＨＣ１，７０ミリモル（ｐＨ ８，２）および１０ミリモルのＥＤＴＡで洗浄し、そしてＧａｒｃｉａ、　Ｒ， Ｃ，ら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３　：　９３−１０５（１９７４）　（ここに特別に引用によって加える）に 類似する手順により、３回凍結−溶融した。この手順は、懸濁液の粘度増加によ って示されるように、細胞を破裂させ、そして処理後細胞の生存能力を完全に損 失させた（、　１　／１０６の生存）。凍結−溶融による細胞溶解物を小分けし て−８０’Ｃにおいて凍結した。蛋白質濃度はＢＴＯＲＡＤのアッセイ　（ＢＩ ＯＲＡＤ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉ ａ）で決定し、そしてｌ　ｍ　ｌの細胞溶解物につき５〜７ｍｇの細胞蛋白質が 存在することがわがかった。

人　ア・・セイの　１１ １ｅｌｐｉ、Ｌ、、Ｃｏｕｓｏ、Ｒ，Ｏ，およびＤａｎｋｅｒ＋Ｊ、Ａ、、ＦＥ ＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ１３０　：　２５３−２５６（１９８１）　（ここに特別 に引用によって加える）に記載されているように、凍結−溶融による細胞溶解物 のアリコー）　（３００〜４００Ｉ１ｇの蛋白質に等しい）、ＤＮアーゼＩ（１ ０ｃｒｇ／ｌ）およびＭｇＣ１ｚ（８ミリモル）を２０℃において２０分間予備 インキュベーションした。等しい体積の７０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐｔ＋ ８．２、および所望の放射線標識した糖ヌクレオチド（ＵＤＰ−グルコース、Ｇ ＤＰ−マンノースおよびＵＤＰ−グルクロン酸）を添加し、そして２０℃でイン キュベーションした。放射線標識したホスホエノールピルベートおよびアセチル 補酵素Ａを、Ｉｅｌｐｉ等（前掲）及びＩｅｌｐｉ、Ｌ、、Ｃｏｕｓｏ、Ｒ，Ｏ ，、及びＤａｍｋｅｒｔ、　Ｍ、八、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、　１０２　：　１４００　１４０８（１９ ８１）、並びにＩｅｌｐｉ、Ｌ、＋Ｃｏｕｓｏ、　Ｒ，０，及びＤａｎｋｅｒｔ 、Ｍ、Ａ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｉｎｔｅｒｎ、６　：３２３−３３３（１９８３ ）　（両者を引用によりこの明細書に組み入れる。）に記載されているように、 必要に応じて添加する。種々の時間において、反応を４°Ｃにて緩衝液で停止し た。試料を遠心分離し、そして沈澱物を緩衝液で２回洗浄した。上澄みを一緒に し、キャリヤーキサンクン（１００μｇ）を添加し、そしてキサンタン十合成し たポリマーをエタノール（６０％）−ＫＣＩ（０，８％）で沈澱させた。沈澱し たポリマーを水中に再懸濁し、そして２回以上細沈澱させて取り込まれていない 標識を除去した。沈澱物（ガム分画と呼ぶ）中に取り込まれた放射能を液体シン チージョンカウンターで決定し、そしてデータを処理して取り込み放射線標識さ れた成分のピコモルで表わす）を算出した。

Ｘ１００６の細胞リゼイトは、炭素−１４アセテートを（１４ｃ　）アセチルＣ ｏＡから生体外合成系のガム分画中に取り込まなかった。５４−Ｌの細胞溶解物 は、（＋４ｃ）アセテートで放射線標識されたガムを生体外で生成しなかった。

同様に、Ｘ９２１の細胞溶解物は（＋４ｃ）ピルベートをガム画分中に組入れず 、これに対して５４−Ｌ細胞溶解物は放射線標識したピルベートをホスホエノー ル〔Ｉ４０〕ピルベートからガム画分中に生体外で取り込んだ。こうして、Ｘ１ ００６はアセチラーゼの遺伝子中に欠損をもつ突然変異株として同定され、そし てＸ９２１はケタラーゼの遺伝子中に欠損をもつ突然変異株として同定された。

これらの株の細胞溶解物は、それぞれ、アセチル化されていないキサンタンおよ びピルビル化されていないキサンクンを生体外で生成した。

また、基質を省略することにより、Ｘ、カンペストリスＢ１４５９５４−Ｌ細胞 溶解物は生体外で変形した多糖を生成した。

例えば、５４−Ｌの細胞溶解物は、内因性アセチル−ＣｏＡおよびホスホエノー ルピルベートが消耗されたとき、アセチル化されておらずビルビル化されていな いキサンタンガムを生体外で生成した。

トランスフェラーゼ■についての遺伝子の突然変異は、ポリテトラマーを生成す るであろう。この表現型は、前述の方法によって立証されるであろう。このガム 分画は２：１：１のモル比でグルコース、マンノースおよびグルクロン酸から構 成されたたとを明らかにするであろう。脂質キャリヤーから加水分解したテトラ マーの中間体は、また、ＴＬＣ上の移動度および糖類のモル比によって検出され るであろう。

実拒尉主 この実施例は、アセチル化されていないガムを生体内で生成するために、アセチ ラーゼ欠失株、Ｘ１００６、を使用することを明らかにする。この実施例は、ま た、ケタラーゼ−マイナス株×９２１、からピルビル化されていないガムを、お よび株ｘ９３４からピルビル化のレベルが低いキサンタンガムが、生体内で生成 することを明らかにする。

前述の３種類の突然変異株および５４−Ｌを、２％のグルコースを含むブロス中 で３０°Ｃにおいて一夜増殖させた。細胞を遠心により除去し、上澄みからガム を２−プロパノ−またはエタノールおよび０．５〜１％の塩化カリウムの添加に より沈澱させることによってガムを収得した。沈澱物の遠心によりガムを回収し 、そして再懸濁した。この手順を反復した。再懸濁したガムを水に対して透析し た。各ポリサッカライドの試料を酸加水分解し、そしてＢＩＯＲＡＤ　ＨＰＸ− ８７Ｈカラムを使用する＋１　Ｐ　Ｌ　Ｃによって分析した。キサンタン成分を 、既知濃度の標準の注入によって定量した。

加水分解したガムのＨＰ　Ｌ　Ｃ分析は、Ｘ９２１がピルビン酸を含まないキサ ンタンガムを生成することを示した。株Ｘ１００６はアセテートを含まないキサ ンタンガムを生成した。株ｘ９３４は、５４−Ｌガムの１〜５％のレベルでビル ビル酸を含有するガムを生成した。

実画１生（ この実施例は、アセチル化されておらず且つピルビル化されていないキサンタン を生成する、Ｘ、カンペストリスの突然変異体を造成するために使用できる方法 を記載する。

ケタラーゼ（Ｘ９２１）またはアセチラーゼ（Ｘ１００６）活性を欠くｘ、カン ペストリスの突然変異株は記載されている。

ＶａｎｄｅｒｓｌｉｃｅらおよびＣａｐａｇｅらが記載する微生物遺伝学および 組換えＤＮＡ法を使用して、ケタラーゼ欠失および脂肪族欠失をＸ、カンペスト リスの単一の株の中に導入することがきた。この二重突然変異の株は、アセチル 化されておらず且つピルビル化されていないキサンタンガムを生成するであろう 。

プラスミドベクター上に担持されたクローン化ガム遺伝子ＤＮＡの中への挿入突 然変異を生成する方法は、Ｃａｐａｇｅらによって記載されている。生成内また は生体外における突然変異誘発の第２ラウンドのための基材として突然変異株Ｘ ９２１を生ずる、挿入変異を有するプラスミドの使用を考えることができるであ ろう。この突然変異誘発の第２ラウンドは、この分野において容易に思い浮かぶ 多くの転移可能な要素のいずれをも、あるいは容易に明らかな数の選択可能な遺 伝標識を含有するＤＮＡ制限断片のいずれをも使用できるであろう。

２つの挿入突然変異体を有するプラスミドの組は、Ｃａｐａｇｅらの遺伝子置換 技術において使用して、プラスミドに担持された突然変異をＸ、カンペストリス の染色体中に転移することができるであろう。得られる株の表現型は、実施例に おいてＶａｎｄｅｒｓｌｉｃｅらおよびＣａｐａｇｅらが記載する生体内および 生体外技術によって分析できる。これらの分析は、ケタラーゼおよびアセチラー ゼ活性の両者においてブロッキングされている、二重突然変異株を明らかにする であろう。これらの二重突然変異株は、同時にピルビル化されておらず且つアシ ル化されていないキサンタンを生成するであろう。

実施■工 この実施例は、ポリテトラマーを生成するＸ、カンペストリス突然変異体を得る 手順を記載する。

上におよびＶａｎｄｅｒｓ　ｌ　ｉｃｅら（前掲）に記載されているように、切 断された側鎖のポリテトラマーをもつキサンタンに関係するポリサンカライドは すでに得られた。この突然変異体は、ここに記載する生体内および生体外の方法 によって特徴づけられた。この明細書及び参照した特許出願に記載される方法を 使用して、この分野に熟達している者は、前述のポリテトラマーをつくるＸ、カ ンペストリスの突然変異株を生成できる。

これらの突然変異株の同定は、この明細書およびＣａｐａｇｅら。

５ｕｐｒａに記載されているように、生体外法により、あるいは生体内で生成さ れたポリサンカライドの分析により達成することができる。

いったんポリテトラマー生産性突然変異体が得られると、追加の突然変異工程、 例えば、実施例１および４に記載されている工程、およびこの分野に熟達してい る者に一般に知られている工程を実施して、アセチル化されていないポリテトラ マーを生成する突然変異株を発生させることができる。

尖拒尉旦 この実施例はアセチラーゼ遺伝子およびケタラーゼ遺伝子をベクター上にクロー ン化して、ここに記載するポリサンカライドを完全にアシル化、完全にピルビル 化、または完全にアシル化および完全にピルビル化することを保証することを論 する。

Ｘ、カンペストリス株Ｘ１００６およびＸ９２１は、実施例２および３に記載し たように、それぞれ、アセチラーゼおよびケタラーゼの遺伝子において突然変異 を有する。これらの突然変異体は実施例１に記載する方法を使用してつ（られた 。当業者は、Ｂｅｔｌａｃｈら、５ｕｐｒａに記載される方法を使用して、アセ チラーゼまたはケタラーゼの遺伝子を含有する天然ＤＮＡ制限断片を回収するこ とができる。すなわち、薬物耐性遺伝標識によって中断されたアセチラーゼまた はケタラーゼの遺伝子を含有するＤＮＡ制限断片をもつプラスミドを使用して、 ラムダゲノムのライブラリーをプロービングして、アセチラーゼまたはケタラー ゼの遺伝子のための天然ＤＮＡ配列を得ることができる。他の実施態様において 、アセチラーゼまたはケタラーゼ酵素の遺伝子は、すでに、プラスミドｐＲＫ　 ２９０−Ｈ３３６、ＡＴＣＣ受託ｋ　（Ｃａｐａｇｅら、５ｕｐｒａに記載され ている）、およびその中に記載されている他のプラスミドの上にクローン化され ている。当業者にとって、これらのプラスミドからアセチラーゼおよびケタラー ゼの遺伝子自体をサブクロー化することは簡単である。

次いで、いずれかの方法によって得られた天然ＤＮＡ配列は、Ｘ、カンペストリ ス中で複製できるプラスミド、例えばｐ聞７９上に、ＢｅｔｌａｃｈらおよびＣ ａｐａｇｅらによって明らかにされた方法を用いて挿入することができる。アセ チラーゼおよび／またはケタラーゼの遺伝子の発現は、存在するＤＮＡ配列を修 飾することにより、あるいはその遺伝子から上流に調節可能なプロモーターを挿 入することによって調節することができる。このような技術は分子生物学および 遺伝学において熟達しているものによく知られている。同様に、遺伝子をその上 に挿入するプラスミドは高いコピー数のプラスミドであることができる。Ｇａｐ ａｇａらにおいて明らかにされているように、キサンタンの生合成酵素はＸ、カ ンペストリス中に少量で存在する。前述のプラスミドをＸ、カンペストリス中に 挿入し、そしてプラスミドに担持された遺伝子の発現に適当な条件下で培養物を 増殖せしめることにより、他のキサンタンの生合成酵素よりも、非常に多量のア セチラーゼおよび／またはケタラーゼ酵素が生ずるであろう。アセチラーゼの過 度の発現は、キサンクンのポリサンカライドを完全にアセチル化する、すなわち 、すべての内部マンノース残基をアセチル化する。同様に、ケタラーゼの過度の 発現は、キサンタンの多糖を末端マンノース上で完全にピルビル化すせる。

当業者にとって明らかなように、キサンタンの完全なアセチル化および完全なピ ルビル化は前述の方法によって達成できる。さらに、ポリテトラマーの完全なア セチル化、およびポリトリマーの完全なアセチル化（Ｖａｎｄｅｒｓｌｉｃｅら 、　５ｕｐｒａに記載されている）は、ここに記載する方法を使用して達成する ことができる。

直溝ｌ」Ｌ この実施例は、高温において水を粘性化するための、遺伝的にに修飾されたキサ ントモナス・カンパスＩ・リスにより生成されるピルビル化されていない多糖の 経済的および技術的利点を明らかにする。

キサンタンガム、すなわちキサントモナス・アンペストリス天然生成物は、例え ば、石油の回収を増大するために使用する水の有効な粘性化剤である。これらの 粘度の用途は、顧繁に、キサンタンガムを高い温度において、そして食塩水中で 適用することを必要とする。キサンタンガムは高温（例えば、７５〜１００℃） においてさえ有効な粘性化剤であるが、それらの粘度はより低い温度（例えば、 ２５〜６０℃において実質的に減少する。

本発明者らは、キサントモナス・アンペストリスの遺伝的に修飾された株（株９ ２１）によって生成される新しい新規なポリサンカライドが、５４−Ｌ親株（株 Ｘ２７３）から生成される野生型キサンタンガムのそれに等しい、高温における 粘度を発生させることを発見した。このキサンタンガムは、正常のペンタマーの キサンタンの構造を有するが、遺伝的に修飾されているために、末端マンノース 上にビルビル酸成分を含有しない。この新規な多糖は、３０℃付近の発酵温度に おいて低い粘度を有し、その結果実質的にコストが節約されかつ処理が便利にな る。ピルビル化されたキサンタンガムを製造するコストは、主として、このポリ マーの高い粘度が攪拌、通気および冷却のためのエネルギーの入力を大きくする ために高い。

第２図は、新規なビルビル化されていないキサンタンガムと修飾されない親によ って生成された野生型キサンタンガムとの粘度の比較を示す。野生型ガムは低温 において高い粘度を示すが、温度上昇とともに粘度は急速に減少する。ピルビル 化されていないガムは、他方において、低温において低い粘度を有するが、野生 型キサンタンガムに本質的に等しい高温における粘度を保持する。第２図に報告 する粘度は、３　ｓ　−１の剪断速度で同心シリンダー粘度計で５０００ｐｐｍ のＮａＣ１ブライン中の１１０００ｐｐの活性ポリマー固体の溶液について記録 した。

去詣■主 この実施例は、水溶液のための粘性化剤として使用するための、遺伝的に修飾さ れたキサントモナス・カンペストリスにより生成されるアセチル化されていない キサンタンの利点を明らかにする。

第３図は、化学的に脱アセチル化された市販のキサンタンおよびその親化合物の 粘度を、遺伝的に修飾されたキサントモナス・カンペストリス（株Ｘ１００６） により生成されるアシル化されていないキサンタンおよび野生型Ｘ、カンペスト リス親（株Ｘ２３７）からつ（られるキサンタンの粘度と比較する。

粘度は８ｓ−１の剪断速度で５０００ｐｐｍのＮａＣｌブライン中の１１０００ ｐｐのポリマーについて得た。粘度は２５℃〜約８０℃の温度範囲にわたって測 定した。

第３図から明らかなように、キサンタンの化学的脱アセチル化は、この温度範囲 全体にわって粘性化力を損失させる。

しかしながら、遺伝的手段によるアセチル化の排除は野生型キサンタンガムに比 較して粘度を実質的に増大させる。こうして、Ｘ、カンペストリスの突然変異株 により生成されるアセチル化されていないキサンタンガムは、キサンタンそれ自 体に比較して、および化学的方法によって製造された脱アセチル化キサンタンガ ムに比較して、改良されたポリサッカライドである。

実画ｌ」１ この実施例は、アセチル化されておらず且つピルビル化されていないキサンタン を生産するＸ、カンペストリスの二重突然変異体を構成するため北使用する方法 を明らかにする。

Ｃａｐａｇｅらは、キサンタンの生合成を指令する遺伝子を含有するＸ、カンペ ストリスからの遺伝子クラスターのクローン化を記載している。彼らは、また、 この遺伝子クラスターのすべてまたは種々の部分を除去する、Ｘ５カンペストリ スにおける染色体欠失突然変異の分離を記載している。１つのこのような欠失突 然変異体Ｘ１２３１株は、組換えプラスミドｐＲＫ２９０−Ｈ３３６上に担持さ れるＸ、カンペストリスのＤＮＡのすべてを欠く。従って、株Ｘ１２３１はキサ ンタンを合成しない。

ｐＲＫ　２９０−Ｈ３３６をＸ１２３１株中に転移すると、キサンタンを合成す る能力が回復する。Ｃａｐａｇｅらは、また、ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６上に担持 されたクローン化ガム遺伝子ＤＮＡ内のトランスポゾンＴｎＫＩ２の挿入突然変 異を分離しかつ特徴づける方法を記載している。２つのこような突然変異体プラ スミドは、ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６，２２およびｐＲＫ２９０−１３３６．４１ である。これらのプラスミドの各々上のＴｎＫ１２ｎＫ１２挿入まかな位置は第 ４図に示されている。ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６，２２がＸ１２３１中に移行する と、得られる株アセチル化されていないキサンタンを生成する。ｐＲＫ２９０− Ｈ３３６，４１がＸ１２３１中に移行すると、ピルビル化されていないキサンタ ンが生成する。これらの２つのプラスミドの突然変異体を使用して、生体外組換 えによって、欠失Ｘ１２３１株に担持された場合に、アシル化されておらず且つ ピルビル化されていないキサンタンの合成を指令する二重突然変異プラスミドを 造成した。

アシル化されず且つピルビル化されない二重突然変異のプラスミドを発生させる 生体外法は次の通りである。ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６，４］のカナマイシン怒受 性（Ｋａｎ″″）誘導体を、このプラスミドの部分的ｔ（ｉｎｄ　ＩＩＩ消化を 実施し、非常に低Ｄ　Ｎ　Ａ　濃度において消化生成物を結合しく分子内結合を 促進するために）、次いでテトラサイタリン耐性（Ｔｅｒ’）形質転換体をカナ マイシン惑受性についてスクリーニングすることによって造成した。次いで、プ ラスミドのＤＮＡをＴｓｔ’、　Ｋａｎ”単離体から調製し、そして制限エンド ヌクレアーゼ消化およびアガロースゲルの電気泳動によって分析した。わずかに ３つの１（ｉｎｄＩＩＩ部位がｐＲＫ２９０−Ｈ３３６，４１中に存在し、そし てこれらのうぢ２つはＴｎＫ１２内に存在し、そしてＫａｎ遺伝子の限界を確定 する。部分的消化において発生する欠失の多くはＫａｎ遺伝子について欠失され 、これに対してプラスミドの残部は無傷に保持された。Ｋａｎｓプラスミドは、 なお、ケタラーゼ遺伝子中に挿入部（１ｋｂ）を維持し、こうしてピルビル化さ れていないガムを生成することが期待される。このプラスミドはｐ４１Ｋｓと呼 ばれる。次の工程は、非アセチル化突然変異体プラスミドｐＲＫ２９０−Ｈ３３ ６，２２の大きい揖徂■断片をｐ４１Ｋｓ中にクローン化することであった。第 ４図に示すように、各プラスミドはＣａｐａｇｅらのＤＮＡ配列内の位置７５８ ，７７１、および１１．７１６に力咀■部位を含有する。１０．９ｋｂＯ力副■ 断片は、ｐＲＫ２９０−１１３３６．２２のＴｎＫ１２挿入を担持する。小さい （１３ｂｐ）　５２ｇ　Ｉ断片は、Ｘ、カンペストリスの増殖およびキサンタン の生成物に必須ではないｔＲＮＡ遺伝子内に完全に横たわる。従って、二重突然 変異体の造成の過程におけるこの小さいＳ狙Ｉセグメント欠失は、キサンタン生 合成に影郷を与えないに違ない。

プラスミドｐ４１ＫＳ２２およびｐＲＫ２９０−Ｈ３３６，２２を精製し、そし て力狙１で完全に消化し、そして連結を実施した。この連結において、ｐ４１Ｋ Ｓ２２・力受Ｉを１０×モル過剰でＨ３３６，２２／力狙■と連結した。こうし て、Ｈ３３６，２２のＫａｒ’ジ徂Ｉ断片を含有する組換え体を選択すると、そ れらは最も頻繁にｐ４１Ｋｓ２２のηｘｅｌベクター断片と関連するであろう。

本発明者等はこれらの連結物を用いて形質転換を行い、そしてＫａｎ’形質転換 体を得た。これらの形質転換体により担持されるプラスミドを分析して、問題の 組換え体を同定した。所望の組換え体プラスミドは、Ｋａｎ’組換えの中から容 易に同定された。組換え体プラスミド、ｐ４１Ｋｓ２２と呼ぶ、はケタラーゼ遺 伝子中にｐ４１Ｋｓ由来の挿入を含有し、そしてアセチラーゼ遺伝子内に＋＋３ ３６．２２由来のＴｎＫ１２挿入を含有する。適当な制限消化分折は両者の挿入 突然変異体の存在を確証し、そして、さらに、ＴｎＫ１２突然変異を含有する力 受Ｉ断片が正しい向きで挿入されていることを示した。

プラスミドｐ４１Ｋｓ２２を引続いて１連のＸ、カンペストリス株中に接合を介 して転移した。大きいＧｕｍ−欠失株Ｘ１２３１が受容体の中に存在した。この 欠失はｐ４１Ｋｓ２２上に担持されるガム遺伝子ＤＮＡのすべてを欠き、それゆ え、ｐ４１Ｋｓ２２を担持するＸ１２３１はアセチル化されておらず且つビルビ ル化されていないキサンタンを生成するであろう。プラスミドは効率よ＜　Ｘ１ ２３１中に転移し、そして得られる表現型は明瞭にムコイドであるが、野生型の 対照よりも有意にムコイドが低い。

ｐ４１Ｋｓ２２を担持するＸ１２３１により生産されたポリサンカライドを調製 しそして分析した。このポリマーはグルコース、マンノースおよびグルクロン酸 を含有するが、検出可能なアセテートまたはピルベートを有せず、こうしてＸ１ ２３１　（ｐ４１Ｋｓ２２）は期待通りのアシル化されておらずビルビル化され ていないガムを生成することが示される。

ス耐ｌ殊１０− この実施例は、アセチラーゼ突然変異およびトランスフェラーゼ■突然変異を兼 備する二重突然変異体プラスミドの構成および性質を記載する。

Ｃａｐａｇｅらは、プラスミドｐＲＫ２９０−Ｈ３３６によりＩ旦持されるクロ ーン化ガム遺伝子ＤＮＡ内のトランスポゾンＴｎＫ１２挿入を分離しかつ特徴づ ける方法を記載している。このような挿入を担持する１つの突然変異体プラスミ ドは、ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６，６である。このプラスミド中のＴｎＫ１２挿入 のおおまかな位置は第４図に示されている。このプラスミドは、欠失株Ｘ１２３ １中に存在するとき、トランスフェラーゼＩＶの挿入失活の結果として、ポリテ トラマーガムの合成を指令する。実施例９に記載するものに類似する手順を用い て、二重突然変異体プラスミドを構成だ。これはトランスフェラーゼＩＶ欠失と ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６，２２中に担持されるアセチラーゼ突然変異とを兼備す る。ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６，６のカナマイシン感受性誘導体を、ＴｎＫ１２の Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片の欠失によって誘導した。このプラスミド、ｐ６Ｋｓ、は Ｋａｎ’ｐ４１ＫＳに類似し、そしてなおトランスフェラーゼＩＶ遺伝子内に挿 入されたｌｋｂのＴｒ＋に１２を保持する。引続いて、ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６ ，２２の大ＴｎＫ１２含有力徂Ｉ断片を、実施例９に記載するように力受Ｉ消化 した９６Ｋｓプラスミド中に結合し、そして二重突然変異体プラスミドｐ６ＫＳ ２２を得た。このプラスミドはトランスフェラーゼＩＶおよびアセチラーゼ中に 挿入突然変異を担持する。欠失株Ｘ１２３１中に転移すると、それはアセチル化 されていない蛋白質の合成を指令するに違ない。しかしながら、いくかつの独立 のプラスミド転移実験において、株Ｘ１２３１中へのｐ６ＫＳ２２の転移は検出 されなかたが、プラスミドはＧｕｍ−およびＧｕｍ”株を含む他の受容体中に高 い頻度で首尾よく転移された。この結果が示唆するように、株１２３１中のｐ６ ＫＳ２２の存在は、多分アセチル化されていないポリトリマーガムの生成の直接 の結果として、致死的である。

Ｃａｐａｇｅらは、ガム遺伝子クラスター内の３つの他の致死突然変異体を記載 し、そしてこれらの致死的突然変異はキサンタンの生合成において毒性の中間体 を蓄積させると結論した。

アセチル化されていないポリトリマーの蓄積は、このポリサンカライドが通常キ サンタンを分泌する転移系によって分泌されえない場合、潜在的に毒性となりう るであろう。

本発明の技術の特定の微生物への応用は、その中に含有される教示に照して当業 者の能力の範囲内であることを理解すべきである。

種々の変更および変化は本発明の方法および生成物において可能であることは当 業者にとって明らかであろう。こうして、本発明は、本発明の変更および変化が 添付する請求の範囲および同等物の範囲内に入るかぎり、それらを包含する。

≧ 手続補正書（方式） 昭和６３年２月　り日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８７１００６０６ ２、発明の名称 アセチル化されていないおよび／またはピルビル化されていないガムおよびアセ チル化されたまたはアセチル化されていないポリテトラマーガムを含むキサンタ ンに基づくポリサッカライドポリマー群 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　ゲティ　サイエンティフィック デベロップメント　カンパニー ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、補正命令の日付 ６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者」 の欄 （２）委任状 （３）　図面の翻訳文（Ｆｉｇ、１．２，３λ明＋ｔ４グ鱈■こ＾細−細阪７、 補正の内容 ８、添付書類の目録 （１）訂正した特許法第１８４条の ５第１項の規定による書面　１通 （２）委任状及びその翻訳文　各１通 （３）浄書した図面の翻訳文 国際調査報告

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．約２：１：１のＤ−グルコース：Ｄ−マンノース：Ｄ−グルクロン酸の比を 有する水溶性ポリサツカライドポリマーを含んでなり、（１）Ｄ−グルコース部 分はβ−〔１，４〕配置で結合しており、（２）Ｄ−マンノース部分はα−〔１ ，３〕配置で一般に交互のグルコース部分に結合しており、そして（３）Ｄ−グ ルクロン酸部分はβ−〔１，２〕配置でマンノース部分に結合していることを特 徴とする組成物。
2. ２．ポリサッカライドポリマーのマンノース部分が６−０位置においてアセチル 化されている請求の範囲第１項記載の組成物。
3. ３．ポリサッカライドポリマーのマンノース部分が６−０位置においてアセチル 化されていない請求の範囲第１項記載の組成物。
4. ４．マンノース部分の少なくとも９０％が６−０位置においてアセチル化されて いる請求の範囲第１項記載の組成物。
5. ５．約２：２：１のＤ−グルコース：Ｄ−マンノース：Ｄ−グルクロン酸の比を 有する水溶性ポリサッカライドポリマーを含んでなり、（１）Ｄ−グルコース部 分はβ−〔１，４〕配置で結合しており、（２）Ｄ−マンノース部分は、６−０ 位置においてアセチル化されておらず、α−〔１．３〕配置で、一般に交互のグ ルコース部分に結合しており、（３）Ｄ−グルクロン酸部分はβ−〔１，２〕配 置で前記アセチル化されていないマンノース部分に結合おり、そして（４）第２ マンノース部分は、ケタール結合したピルビン酸を４，６位置に含有し、前記グ ルクロン酸部分にβ−〔１，４〕配置で結合していることを特徴とする組成物。
6. ６．前記第２マンノース部分がピルピル化されていない請求の範囲第５項記載の 組成物。
7. ７．前記ポリサッカライドポリマーがアセチル化されていおらずかつピルビル化 されていない請求の範囲第６項記載の組成物。
8. ８．約２：２：１のＤ−グルコース：Ｄ−マンノース：Ｄ−グルクロン酸の比を 有する水溶性ポリサツカライドポリマーを含んでなり、（１）Ｄ−グルコース部 分はβ−〔１，４〕配置で結合しており、（２）Ｄ−マンノース部分は、６−０ 位置においてアセチル化されており、α−〔１，３〕配置で、一般に交互のグル コース部分に結合しており、（３）Ｄ−グルクロン酸部分はβ〔１，２〕配置で 前記アセチル化されているマンノース部分に結合おり、そして（４）第２マンノ ース部分は、ピルベート部分を４，６位置に含有せず、前記グルクロン酸部分に β−〔１，４〕配置で結合していることを特徴とする組成物。
9. ９．約２：２：１のＤ−グルコース：Ｄ−マンノース：Ｄ−グルクロン酸の比を 有する水溶性ポリサツカライドポリマーを含んでなり、（１）Ｄ−グルコース部 分はβ−〔１，４〕配置で結合しており、（２）Ｄ−マンノース部分は、６−０ 位置においてアセチル化されており、α−〔１，３〕配置で、一般に交互のグル コース部分に結合しており、（３）Ｄ−グルクロン酸部分はβ−〔１，２〕配置 で前記アセチル化されているマンノース部分に結合おり、そして（４）第２マン ノース部分は、ケチル結合したピルビン酸を４，６位置に含有し、前記グルクロ ン酸部分にβ−〔１，４〕配置で結合おり、そして前記ポリマーは９０％より多 くアセチル化されていることを特徴とする組成物。
10. １０．第２マンノース部分の少なくとも９０％がピルピン化されている請求の範 囲第９項記載の組成物。
11. １１．約２：２：１のＤ−グルコース：Ｄ−マンノース：Ｄ−グルクロン酸の比 を有する水溶性ポリサッカライドポリマーを含んでなり、（１）Ｄ−グルコース 部分がβ−〔１，４〕配置で結合しており、（２）マンノース部分が、６−０位 置においてアセチル化されており、α−〔１，３〕配置で、一般に交互のグルコ ース部分に結合しており、（３）Ｄ−グルクロン酸部分がβ−〔１，２〕配置で 前記アセチル化されているマンノース部分に結合おり、そして（４）第２マンノ ース部分が前記グルクロン酸部分にβ−〔１，４〕配置で結合おり、そして前記 第２マンノース部分の少なくとも９０％は４，６位置にケチル結合したピルピル 酸を含有することを特徴とする組成物。
12. １２．約２：１のＤ−グルコース：Ｄ−マンノースの比を有する水溶性ポリサツ カライドポリマーを含有し、（１）Ｄ−グルコース部分はβ−〔１，４〕配置で 結合しており、（２）Ｄ−マンノース部分はα−〔１，３〕配置で一般に交互の グルコース部分に結合しており、そしてＤ−マンノース部分の少なくとも９０％ は６−０位置においてアセチル化されていることを特徴とする組成物。
13. １３．請求の範囲第１項記載のポリサッカライドポリマーを製造する方法であっ て、 適当な増殖培地に請求の範囲第１項記載のポリテ・トラマーガムを合成できるキ サントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の微生物を接種し、そして 接種された培地を適当な温度、ｐＨおよび溶存酸素レベルでインキュベーション して、約２：１：１のＤ−グルコース：Ｄ−マンノース：Ｄ−グルクロン酸の比 を有するポリサッカライドポリマーを生成せしめる、 ことを含んでなる方法。
14. １４．ポリサッカライドポリマーを、増殖培地から沈澱または限外濾過によって 回収する請求の範囲第１３項記載の方法。
15. １５．前記微生物がキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）種である請求の範囲第１３項記載の方法。
16. １６．前記微生物がキサントモナス・カンベストリスのトランスフェラーゼＶ欠 損突然変異体である請求の範囲第１３項記載の方法。
17. １７．前記微生物がキサントモナス・カンベストリスのトランスフェラーゼＶお よびアセチラーゼ欠損突然変異株である請求の範囲第１３項記載の方法。
18. １８．前記微生物がキサントモナス・カンベストリスのトランスフェラーゼＶお よびアゼル補酵素Ａ欠損突然変異体である請求の範囲第１３項記載の方法。
19. １９．前記微生物がキサントモナス・カンベストリスのホスホエノールピルベー ト欠損突然変異株である請求の範囲第１３項記載の方法。
20. ２０．請求の範囲第４項記載のポリサッカライドポリマーを製造する方法であっ て、 適当な増殖培地に請求の範囲第４項記載のアセチル化されていないキサンタンガ ムを合成できるキサントモナス属の微生物を接種し、そして 接種された増殖培地を適当な温度、ｐＨおよび溶存酸素レベルでインキュベーシ ョンして、約２：２：１のＤ−グルコース：Ｄ−マンノース：Ｄ−グルクロン酸 の比を有するポリサフカライドポリマーを生成せしめ、前記ポリマーはアセチル 化されていない、 ことを含んでなる方法。
21. ２１．請求の範囲第６項記載のポリサツカライドポリマーを製造する方法であっ て、 適当な増殖培地に請求の範囲第６項記載のアセチル化されておらず且つピルビル 化されていないポリテトラマーガムを合成できるキサントモナス属の微生物を接 種し、そして接種された増殖培地を適当な温度、ｐＨおよび溶存酸素レベルでイ ンキュベーションして、約２：２：１のＤ−グルコース：Ｄ：マンノース：Ｄ− グルクロン酸の比を有するポリサフカライドポリマーを生成せしめ、前記ポリマ ーはアセチル化されておらず且つピルビル化されていない、ことを含んでなる方 法。
22. ２２．請求の範囲第８項記載のポリサッカライドポリマーを製造する方法であっ て、 適当な増殖培地に請求の範囲第８項記載のアセチル化されているがピルビル化さ れていないポリテトラマーガムを合成できるキサントモナス属の微生物を接種し 、そして接種された増殖培地を適当な温度、ｐＨおよび溶有酸素レベルでインキ ュベーションして、約２：２：１のＤ−グルコース：Ｄ−マンノース：Ｄ−グル クロン酸の比を有するポリサフカライドポリマーを生成せしめ、前記ポリマーは アシル化されているがピルビル化されていない、ことを含んでなる方法。
23. ２３．前記微生物がキサントモナス・カンベストリスのケトラーゼおよびアセチ ラーゼ欠損突然変異株である請求の範囲第２１項記載の方法。
24. ２４．前記微生物がキサントモナス・カンベストリス（Ｘ１２３１）ＡＴＣＣＮ ａ、ケトラーゼおよびアセチラーゼ欠損突然変異株である請求の範囲第２１記載 の方法。
25. ２５．前記微生物がキサントモナス・カンベストリスのケトラーゼ欠損突然変異 株である請求の範囲第２２項記載の方法。
26. ２６．前記微生物がキサントモナス・カンペストリス（Ｘ９２１）ＡＴＣＣＮａ ５３４７２、ケトラーゼ欠損突然変異株である請求の範囲第２２項記載の方法。
27. ２７．前記微生物がキサントモナス・カンペストリスのアセチラーゼ欠損突然変 異株である請求の範囲第２０項記載の方法。
28. ２８．前記微生物がキサントモナス・カンペストリス（Ｘ１００６）ＡＴＣＣＮ ａ５３４７３、アセチラーゼ欠損突然変異株である請求の範囲第２０項記載の方 法。