NO309102B1 - Sammensetninger bestÕende av en vannoppløselig polysakkaridpolymer bestÕende av repeterende pentamerenheter, og fremgangsmÕte for fremstilling derav - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår sammensetninger bestående av en vannoppløselig polysakkaridpolymer bestående av repeterende pentamerenheter. I særdeleshet angår den xantan-baserte polysakkaridpolymerer, definert her som polymerer som strukturelt ligner på xantan-gummi og er produsert av bestanddeler fra xantanbiosyntesen, innbefattet ikke-acetylerte, ikke-pyruvylerte, ikke-acetylerte og ikke-pyruvylerte, lavpyruvylerte og fullt pyruvylerte xantan (pentamer)-gummier. Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for fremstilling derav.

Xantan-gummi blir produsert av bakterier av slekten Xanthomonas, i særdeleshet av mikroorganismer av arten X.campestris. Xantan-gummi er et produkt som i stor utstrekning blir brukt på grunn av dens usedvanlige fysikalske egenskaper, dvs. dens ekstremt høye spesifikke viskositet og dens pseudoplastisitet. Den er vanlig brukt i matvarer som et fortykningsmiddel og ved sekundær eller tertiær oljeutvinning som et mobilitetskontroll- og profilendringsmiddel, såvel som i petroleumsborevæsker.

Kjemisk er xantan-gummi et anionisk heteropolysakkarid. Den gjentatte enhet av polymeren er en pentamer bestående av fem sukkerenheter, nærmere bestemt to glukose-, en glukuronsyre og to mannoseenheter. Disse sukkerrester er arrangert på en slik måte at glukoseenhetene danner ryggraden i polymerkjeden, med sidekjeder av mannose/glukuronsyre/ mannoserestene generelt stikkende ut fra annen hver glukoseenhet. Vanligvis er denne grunnleggende struktur spesifikt acetylert og pyruvylert, som beskrevet av f.eks. P.E. Janson, L. Kenne og B. Lindberg, i Carbohydrate Research, 45:275-282 (1975) og L.D. Melton, L. Minot, D.A. Rees og G.R. Sanderson i Carbohydrate Research, 46:245-257 (1976), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse. Graden av acetylering og pyruvylering er kjent å variere. Strukturen av xantan-gummi er avbildet under:

På tross av den vide anvendelighet av naturlig forekommende xantan-gummi er der enkelte situasjoner hvor dens fysikalske egenskaper blir begrensende. Spesielt er det ved sekundær eller tertiær oljeutvinning ikke uvanlig at temperaturen i det oljebærende reservoar og saltkonsentrasjonene i reservoar-saltoppløsningen er høyere enn det som er optimalt for xantan-oppløsninger. Når slike forhold forekommer, kan xantan felles ut, flokkulere og/eller miste sin viskositet. Det vil derfor være ønskelig med nye viskositetsøkende produkter som virker bra ved forskjellige forhold som kan oppstå under oljeutvinning, f.eks. høye temperaturer og høye saltkonsentrasjoner.

Den foreliggende oppfinnelse beskriver en familie av xantanbaserte polysakkarider med forbedrede egenskaper i forhold til naturlig forekommende xantan-gummi. Modifikasjoner av xantan-gummi er tidligere beskrevet. For eksempel beskriver Bradshaw et al. (Carbohydrate Polymers, 3:23-38 (1983)) metoder til fremstilling av kjemisk modifisert xantan-gummi som er deacetylert eller depyruvylert. Forskjellige måter til kjemisk deacetylering av xantan-gummi produsert av Xanthomonas campestris er også beskrevet i US patentskriftene 3 000 790 og 3 054 689. Til dags dato har den eneste metode som er benyttet til disse deacetyleringsprosesser, vært via kjemisk fjerning av acetatenhetene fra normalt acetylert xantan-gummi. Det er funnet at kjemiske prosesser til deacetylering av xantan-gummi resulterer i en rekke uønskede bivirkninger og kan forårsake hydrolyse av glykosidryggraden, noe som fører til en irreversibel forandring av molekylenes konformasjon og nedsatt molekylvekt.

Noen av de reologiske egenskaper av deacetylert xantan i vandige oppløsninger er kjent, se f.eks. Tako og Nakamura, Agric. Biol. Chem. 48:2987-2993 (1984) og US patentskriftene 3 000 790 og 3 054 689. En metode til å øke viskositeten av en vandig oppløsning ved bruk av et deacetylert polysakkarid er også beskrevet i US patentskrift 3 096 293. Derfor har man søkt å finne en metode til å skaffe ikke-acetylert xantan som ikke forårsaker uønskede bivirkninger.

Xantan-gummi kan også depyruvyleres kjemisk som beskrevet av Holzwarth og Ogletree i Carbo. Res. 76:277-280 (1979). Denne kjemiske metode til depyruvylering kan også endre xantanpolymerenheten og/eller forårsake hydrolyse av glykosidryggraden. Selv om der i US patentskrift 4 296 203 er beskrevet en stamme av X. campestris som produserer ikke-pyruvylert xantangummi, ble denne ikke-pyruvylerte gummi enten fullt acetylert eller deacetylert ved anvendelse av kjemiske midler. Oppfinnerne mener at et xantan-polysakkarid som er både ikke-acetylert og ikke-pyruvylert, vil ha viktige reologiske og viskositetsøkende egenskaper og har derfor søkt å finne en slik gummi samt en mikrobiell metode til produksjon av denne.

I tillegg kan graden av acetylering av den interne mannose på xantan-sidekjeden og graden av pyruvylering av den terminale mannose variere. Oppfinnerne mener at et fullt acetylert og/eller fullt pyruvylert xantan vil ha forbedrede reologiske egenskaper for visse oljeutvinningsformål.

Et formål med den foreliggende oppfinnelse er å skaffe en familie av polysakkaridpolymerer som er bedre egnet til å øke viskositeten av vann enn naturlig forekommende xantan-gummi. Et annet formål med den foreliggende oppfinnelse er å skaffe en familie av polysakkaridpolymerer som har bedre reologiske egenskaper enn naturlig forekommende xantan-gummi ved økede temperaturer og/eller i nærvær av salter, som har andre ønskede egenskaper.

Det er også et formål med den foreliggende oppfinnelse å skaffe en in-vitro-metode til oppnåelse av visse av disse produkter og mikroorganismer som har evnen til å produsere medlemmer av denne familie av polysakkaridpolymerer in vivo. Et ytterligere formål med oppfinnelsen er å skaffe fremgangsmåter til fremstilling av medlemmer av denne familie av polysakkarider ved aerob fermentering av mikroorganismer som har evnen til å produsere de forskjellige polysakkaridpolymerer.

Andre formål med og fordeler ved oppfinnelsen vil dels bli angitt i den etterfølgende beskrivelse, dels være selvfølgelige fra beskrivelsen eller kunne læres ved praktisering av oppfinnelsen. Formålene og fordelene kan realiseres og oppnås ved hjelp av de trekk og kombinasjoner som er spesielt påpekt i kravene.

For oppnåelse av formålene og i samsvar med hensiktene med den foreliggende oppfinnelse, er der tilveiebragt ifølge krav 1 en sammensetning bestående av en vannoppløselig polysakkaridpolymer bestående av repeterende pentamerenheter som har et forhold mellom D-glukose, D-mannose og D-glukuronsyre på ca. 2:2:1, som er kjennetegnet ved at den har en molekylvekt på lO^-lO^ dalton, at (1) D-glukoseenhetene er bundet i en beta-[l,4]-konfigurasjon, (2) en D-mannoseenhet som eventuelt kan være acetylert i 6-O-stillingen, er bundet i en alfa-[l,3]-konfigurasjon, vanligvis til annen hver glukoseenhet, (3) D-glukuronsyre-enhetene er bundet i en beta-[l,2]-konfigurasjon til den nevnte ikke-acetylerte eller acetylerte mannoseenhet og (4) en annen mannoseenhet, som inneholder eventuelt en ketal-bundet pyrodruesyre i 4,6-stillingen, er bundet til den nevnte glukuronsyre-enhet i en beta-[l,4]- konfigurasjon. Ifølge krav 5 er der tilveibragt en sammensetning bestående av en vannoppløselig polysakkaridpolymer bestående av repeterende pentamerenheter som har et forhold mellom D-glukose, D-mannose og D-glukuronsyre på ca. 2:2:1, som er kjennetegnet ved at den har en molekylvekt på lO^-lO^ dalton, at (1) D-glukoseenhetene er bundet i en beta-[l,4]-konfigurasjon, (2) en D-mannoseenhet som er acetylert i 6-O-stillingen, er bundet i en alfa-[l,3]-konfigurasjon, vanligvis til annen hver glukoseenhet, (3) D-glukuronsyre-enhetene er bundet i en beta-[l,2]-konfigurasjon til den nevnte acetylerte mannoseenhet og (4) en annen mannoseenhet, som inneholder en ketyl-bundet pyrodruesyre i 4,6-stillingen, er bundet til de nevnte glukuronsyre-enheter i en beta-[l,4]-konfigurasjon, og at polymeren er mer enn 90% acetylert.

Disse sammensetninger omfatter xantan-gummi hvor mannoseenhetene ikke er acetylert. Denne gummi blir heretter betegnet som "ikke-acetylert xantan". Det vil også bli henvist til en annen struktur hvor de terminale mannoseenheter av xantan-gummi ikke er pyruvylert. Denne gummi vil bli betegnet som "ikke-pyruvylert xantan". Videre er det beskrevet en gummi som verken er acetylert eller pyruvylert. Denne polymer blir heretter betegnet som "ikke-acetylert, ikke-pyruvylert xantan-gummi". Den foreliggende oppfinnelse angår også en xantan-gummi som her vil bli betegnet som "fullt acetylert xantan-gummi", hvori minst 90% av de interne mannoseenheter er acetylert; fortrinnsvis er 95% og helst 100% acetylert. Den foreliggende oppfinnelse angår også en xantan-gummi hvori minst 90% av de terminale mannoseenheter, fortrinnsvis 95% og helst 100%, er pyruvylert, og som her er betegnet som "fullt pyruvylert xantan-gummi".

Ifølge oppfinnelsen er der også ifølge krav 8 tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av en vannoppløselig polysakkaridpolymer med repeterende pentamerenheter som angitt i krav 1, 2, 3 og 5, som er kjennetegnet ved at et egnet vekstmedium podes med en mikroorganisme av en mutant av Xanthomonas som mangler Ketalase og Acetylase, og det podede vekstmedium inkuberes ved egnet temperatur, pH-verdi og nivå av oppløst oksygen for produksjon av en polysakkaridpolymer som angitt i krav 1, 2, 3 og 5.

Polysakkaridpolymerene ifølge oppfinnelsen kan generelt lages ved genetiske manipuleringer av de mikrobielle biosyntetiske reaksjonsveier som fører til produksjon av polysakkarider. Nærmere bestemt kan mikrobielle synteseveier til fremstilling av xantan-gummi manipuleres for å lage et in vivo- eller in vitro-system til fremstilling av en endret polymerenhet. På denne måte kan man lage systemer ved bruk av regulerbare Acetylase- og Ketalase-gener, i særdeleshet for å lage polysakkarider som er acetylert eller pyruvylert i varierende grad.

For eksempel menes det at xantan-gummi som er 10%, 20%, 30%, 40% eller 50% acetylert, kan syntetiseres, og det samme gjelder xantan som er 10%, 20%, 30%), 40%, 50%), 60%), 70% eller 80% pyruvylert. Mikroorganismer som produserer de foreliggende polysakkaridpolymerer in vivo, og metoder til bruk av disse polysakkaridpolymerer er også beskrevet.

Forskjellige stammer av X. campestis som er mer utførlig beskrevet nedenfor, er blitt deponert ved American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, 21. mars 1986. Disse stammer er X921, XI006, X934 og XI231, og de er deponert som henholdsvis nr. 53472, 53473, 53474 og 67344.

Det skal forstås at både den foregående generelle beskrivelse og den følgende detaljerte beskrivelse bare er eksempler og forklaringer og ikke skal være begrensende for oppfinnelsen, slik den er angitt i kravene. De til fremstillingen hørende tegninger illustrerer forskjellige utførelsesformer for oppfinnelsen og tjener sammen med beskrivelsen til å forklare prinsippene ved oppfinnelsen. Fig. 1 viser den antatte syntesevei for xantan-gummibiosyntesen. Forkort-elser som er brukt, er: Glu = glukose; GluA = glukuronsyre; Man = mannose; Glu-Glu = cellobiose; P = fosfat; PP = pyrofosfat; C55 = isoprenoidlipid-bærer; PEP = fosfoenolpyruvat; AcCoA = acetylkoenzym A; I-V = glykosyl-transferaser; UDP = uridin-5'-difosfat og GDP = guanosin-5'-difosfat. Fig. 2 viser en viskositetssammenligning mellom vill-type-gummier og ikke-pyruvylerte gummier. Fig. 3 viser en viskositetssammenligning mellom ikke-acetylerte og kjemisk deacetylerte gummier. Fig. 4 viser den omtrentlige fysiske plassering av 3 TnK12-innskuddsmutasjoner i det klonede gummigengruppe-DNA av rekombinant plasmid pRK290-H336. Denne figur viser også den omtrentlige plassering av Spel-restriksjonsendonuklease-delingstedene i pRK290-H336.

Det vil nå i detalj bli henvist til for tiden foretrukne utførelsesformer for den foreliggende oppfinnelse som sammen med de følgende eksempler tjener til å beskrive oppfinnelsens prinsipper.

Polysakkaridpolymerene ifølge den foreliggende oppfinnelse er beskrevet i detalj ovenfor. Disse polysakkaridpolymerer kan lages in vitro med et celle-fritt enzymsystem, eller de kan produseres in vivo ved dyrking av celler av en passende mutantstamme. Andre måter å lage polysakkaridpolymerene på er også beskrevet nedenfor.

Den grunnleggende metode som angår bruken av et celle-fritt system for fremstilling av ikke-variant xantan-gummi, er beskrevet av L. Ielpi, R.O. Couso og M.A. Dankert i FEBS Letters 130:253-256 (1981), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse. Det er funnet at en modifisert versjon av denne metode kan benyttes til å lage variant - polysakkaridene ifølge oppfinnelsen.

Ved denne nye, modifiserte metode blir det in vitro celle-frie system laget generelt ved lysering av celler av mikroorganismer av slekten Xanthomonas, fortrinnsvis Xanthomonas campestris, i nærvær av en egnet buffer, fortrinnsvis innbefattet EDTA, og oppnåelse av de passende biosyntetiske enzymer som deretter er i stand til å bearbeide eksogent tilsatte substrater. Andre metoder for lyse som kan benyttes, omfatter, men er ikke begrenset til, lydbehandling, "French Pressure cell", detergentbehandling, enzym-behandling og kombinasjoner av disse.

For fremstilling av variant-polysakkaridene ifølge den foreliggende oppfinnelse, blir vanligvis et lysat av en mikroorganisme inneholdende de nødvendige enzymer for å sette sammen de ønskede polysakkarider, inkubert med de passende substrater, som avhengig av den ønskede gummi kan inkludere UDP-glukose, GDP-mannose, UDP-glukuronsyre, acetyl-CoA og fosfoenolpyruvat. Valg av substrater er avhengig av det polysakkarid som Ønskes produsert. For eksempel fås et ikke-acetylert polysakkarid ved eliminering av acetyl-CoA som substrat. Tilsvarende kan man danne en ikke-pyruvylert gummi ved å eliminere fosfoenolpyruvat som substrat. Kjemisk og/eller enzymatisk behandling av cellelysatene for å utarme endogene substrater vil være selvsagt for en som er kjent med metodikken.

I tillegg kan celle-frie systemer lages fra mutant-organismer som mangler en eller flere av enzymene fra den xantan-biosyntetiske vei som er vist på fig. 1. Slike mutant-avledede cellelysater ville produsere de variant-gummier som er beskrevet her, enten utelukkende på grunn av mutasjonen eller på grunn av mutasjonen i samband med tilbakeholdt substrat.

Den biosyntetiske prosess kan i en utførelsesform overvåkes ved innlemmelse av radioaktivt merkede substrater i de polymere enheter. Andre metoder som er kjent for fagfolk kan også benyttes for å tillate identifikasjon av de biosyntetiske mellomprodukter. Spesielt er der utviklet kromatograf-iske metoder til å skille og identifisere de oligosakkaride mellomprodukter. Disse innbefatter tynnskiktskromatografi og høytrykks-væskekromatografi.

Den celle-frie biosyntese av xantan er funnet å være en tidsavhengig, trinnvis prosess som er avhengig av tilsetning av alle de tre spesifikke sukkernukleotider. Bakgrunnen av ikke-spesifikk innlemmelse av merket substrat er minimal og vil ikke forstyrre måling av den xantan-spesifikke polymer i gummifraksjonen.

At lipidbærere, nærmere bestemt isoprenoid pyrofosfat, er involvert, er vist i flere polysakkarid-biosyntetiske veier. I tillegg er medvirkning av pyrofosforyl-bundne lipidbærere i xantan-biosyntesen påvist. Det er altså funnet at de xantanbiosyntetiske mellomprodukter kan gjenvinnes fra den organiskoppløselige fraksjon med disse bærerlipider. De gjenvundne oligosakkarider kan deretter befris fra bærerlipidene ved mild syrehydrolyse, f.eks. ved en pH-verdi på 2 i 20 min ved 90°C og defosforyleres med alkalisk fosfatase for analyse.

Ved bruk av disse metoder for gjenvinning av mellomprodukter er det oppdaget at visse lysater av X. campestris-mutanter ved in vitro-betingelser vil produsere ikke-acetylert eller ikke-pyruvylert xantan-gummi selv i nærvær av alle substrater som er nødvendige for ikke-variantgummisyntese.

Utviklingen av den celle-frie synteseprosess for polysakkaridene som er beskrevet ovenfor, viser at forskjellige Xanthomonas campestris-celler har alle de enzymer som er nødvendige for syntetisering av ikke-acetylert og/eller ikke-pyruvylert xantan-gummi og fullt acetylert xantan-gummi.

For at hele celler skal syntetisere ikke-acetylert xantan-gummi, behøves videre en måte til å blokkere acetyleringstrinnet under xantan-gummi-syntesen. I tillegg trengs en metode til blokkering av xantan-gummisyntese i både acetylerings- og pyruvylerings-trinnene foråt hele celler skal kunne syntetisere ikke-acetylert, ikke-pyruvylert xantan-gummi. Ved en utførelsesform for oppfinnelsen ble mutagenese benyttet for å endre noen av de gener som er ansvarlige for disse reaksjoner.

Transposoner, herunder, men ikke begrenset til TnlO og Tn903, kan brukes for å mutere Xanthomonas campestris. I én utførelsesform er gir disse transposoner resistens mot henholdsvis tetracyklin og kanamycin. Transposoner har evnen til å sette seg selv inn i gener hvor de forårsaker mutasjoner ved å avbryte den kodede sekvens. Transposonene kan settes inn i Xanthomonas campestris på forskjellige vektorer, herunder på såkalte selvmordsvektorer som pRK2013. Som beskrevet av G. Ditta, D. Corbin og D.R. Helinski i Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 77:7347-7351 (1980), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse, har vektor pRK2013 evnen til å overføre seg selv inn i ikke-enteriske bakterier såsom Xanthomonas campestris, men den er ikke i stand til å replikere seg i denne vert. Hvis selvmordsvektoren blir introdusert i en populasjon av Xanthomonas campestris-celler og denne populasjonen så blir utsatt for enten tetracyklin eller kanamycin, vil derfor de individer som overlever, være de hvor en av transposonene er satt inn i genomet til Xanthomonas campestris. Overlevende fra en slik eksponering kan underkastes for utsortering av slike som har mistet evnen til å lage xantan-gummi. Slike mutanter kan synes å være mindre mukoide enn vill-type-Xanthomonas campestris.

I andre utførelsesformer for oppfinnelsen kan andre måter for mutagenese bli benyttet til å lage mutanter som har mistet evnen til å lage xantan-gummi, eller som ikke acetylerer og/eller pyruvylerer de gummier de produserer. Slike metoder vil en fagmann lett komme på, og de inkluderer stråling, rekombinant-DNA-teknologi (spesielt som beskrevet i US patent søknad nr. 842 944 av Capage et al., med tittelen "Recombinant-DNA Mediated Production of Xanthan Gum", som er innlevert 26. mars 1986, og hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse, og i eksempel 1 nedenfor) og kjemisk mutagenbehandling, men er ikke begrenset til disse metoder. Eksempler på slike mutageneseprosedyrer er beskrevet av J.H. Miller i Experiments in Molecular Genetics (1972); R.W. Davis, D. Bostein og J.R. Roth i Advanced Bacterial Genetics (1980); og av T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambrook i Molecular Cloning (1982), Cold Spring Harbor.

Selv om der først kan bli valgt mutanter som synes mindre mukoide enn villtype-organismer, vil de ønskede mutanter generelt beholde evnen til å lage noe polysakkarid. Celle-frie ekstrakter av hver av xantan-mutantene kan lages og testes som nevnt ovenfor ved tilsetning av forskjellige kombinasjoner av substrater og analyse av de resulterende produkter.

Alternativt kan passende mutanter finnes ved at man bestemmer nærværet av det ønskede polysakkarid i kulturmediet fra hver mutant, f.eks. xantan-gummi som er ikke-acetylert, ikke-acetylert og ikke-pyruvylert, lav-pyruvylert eller fullt acetylert. Derfor kan der finnes mutanter som synes å være blokkert ved forskjellige posisjoner i xantan-gummi-synteseveien. En mutant av Xanthomonas campestris som produserer ikke-acetylert xantan-gummi (XI006), en mutant som produserer ikke-pyruvylert gummi (X921), en mutant som produserer xantan-gummi med lave nivåer av pyruvylering (mindre enn 5% av den terminale mannose X934) og en mutant som produserer ikke-acetylert og ikke-pyruvylert xantan-gummi (XI231)

(p41KS22), er deponert i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, med deponeringsnr. 53472, 53473,53474 resp. 67344.

Det er ikke utenfor oppfinnelsens rekkevidde å ta i bruk enzymhemmere av vill-type-Acetylase og -Ketalase for å komme frem til de samme produkter. Ytterligere andre alternativer til fremstilling av denne familie av polysakkarider er påtenkt, herunder enzymatisk og kjemisk degradering av naturlig xantan-gummi.

Mutantene kan dyrkes under forhold som er generelt kjent inne området for dyrking av villtype-Xanthomonas campestris. For eksempel kan de dyrkes på egnede assimilerbare karbonkilder såsom glukose, sukrose, maltose, stivelse, invert sukker, komplekse karbohydrater såsom melasse eller maissirup, forskjellige organiske syrer og lignende. Blandinger av karbonkilder kan også benyttes. Konsentrasjonen av de tilsatte karbonkilder er ofte mellom 10 og 60 g/l. Nødvendig for vekst er også en kilde til assimilerbart organisk eller uorganisk nitrogen, generelt på mellom 0,1 og 10,0 g/l, og mineraler som lett kan velges ut av fagfolk. Eksempler på passende nitrogen kilder er ammoniumsalter, nitrat, urea, gjærekstrakt, pepton eller andre hydrolyserte proteinmaterialer eller blandinger a disse. Eksempler på passende mineraler innbefatter fosfor, svovel, kalium, natrium, jern og magnesium. Disse blir ofte tilsatt sammen med et chelateringsmiddel såsom EDTA eller sitronsyre.

Optimale temperaturer for vekst av Xanthomonas campestris ligger generelt mellom 18°C og 35°C, fortrinnsvis mellom 27°C og 30°C. Xanthomonas campestris-celler dyrkes aerobt ved tilførsel av luft eller oksygen slik at et tilstrekkelig nivå av oppløst oksygen blir holdt ved like, f.eks. over ca. 10% metning. Fortrinnsvis holdes nivået over ca. 20%. pH-verdien blir holdt på 6,0-8,0, fortrinnsvis på 6,5-7,5.

Polysakkaridene iht. den foreliggende oppfinnelse kan gjenvinnes fra fermenter ved passende metoder. Utfelling med isopropanol, etanol eller en annen passende alkohol vil uten videre gi polysakkaridene ifølge oppfinnelsen. Generelt blir alkoholer tilsatt til en konsentrasjon på 50-75% på volumbasis, fortrinnsvis i nærvær av kaliumklorid, natriumklorid eller et annet salt. Alternativt kan polymerene gjenvinnes fra fermentet ved ultra-filtrering.

Ikke-pyruvylerte xantan-gummier er overlegne i forhold til xantan som viskositetsmiddel for vandige medier ved visse anvendelser. Viskositeten av oppløsninger av ikke-acetylert xantan og ikke-pyruvylert xantan blir beholdt under forhold med høy temperatur og/eller høy saltholdighet. Produktene ifølge oppfinnelsen er derfor ideelt egnet for bruk ved sekundær eller tertiær oljegjenvinning.

Mobilitetskontroll-oppløsninger til bruk ved økt oljeutvinning kan også lages fra de avvikende polysakkaridpolymerer som er beskrevet. Oppløsninger av polysakkaridpolymerene i konsentrasjoner på 50-3000 ppm er passende for slike mobilitetskontrolloppløsninger. Andre kjente tilsetningsstoffer kan også benyttes i kombinasjon med disse oppløsninger for å øke oljegjenvinningen. Slike tilsetningsstoffer innbefatter f.eks. overflateaktive midler, alkaliske reagenser eller metalliske eller organiske tverrbindingsmidler.

I likhet med xantan-gummi kan polysakkaridpolymerene også benyttes som fortykningsmidler i matvarer, kosmetiske produkter, medikamenter, papirbindemidler, boreslam, trykksverte og lignende og som geleringsmiddel. I tillegg kan de benyttes til å redusere friksjonsmotstanden av en væskestrøm i rørledninger.

EKSEMPEL 1

Dette eksempel viser de metoder for mutagenese og sortering som benyttes for å generere X. campestris-mutantstammer som har defekter i Acetylase-eller Ketalase-aktivitet.

De gener som koder for enzymene til xantan-gummi-biosyntese, er vist å bestå av en gruppe gener på X. campestris-kromosomet. Denne "gummigengruppe" er beskrevet i detalj av Capage et al. Segmenter av gummigen-DNA er blitt klonet på plasmidvektorer såsom pMW79 som beskrevet i detalj av Capage et al.

Region-rettet mutagenese ble utført på subklonede deler av gummi-DNA båret i plasmid pMW79. Disse klonede DNA-segmenter ble mutert in vivo med transposoner og in vitro ved bruk av rekombinant-DNA-teknologi for å generere innskudds-, slettings- og substitusjonsmutasjoner inne i det klonede X. campestris-DNA. For studium av de fenotyper som tildeles ved disse mutasjoner, ble de plasmider som bærer mutasjonene tilbakeført til X. campestris, og deretter ble der identifisert rekombinanter hvor det plasmid-bårne, muterte gen var blitt innsatt i kromosomet via homolog rekombinasjon. Den tetracyklinresistens som TnlO koder for, skaffer et fordelaktig utvelgelsessystem for overføring av mutasjonene fra et plasmid til kromosomet.

En slik mutantstamme (X 1006) bar et TnlO-innskudd som ble funnet å forårsake inaktivering av Acetylaseaktiviteten. Denne mutantstamme var karakterisert som beskrevet i eksemplene 2 og og ble funnet å produsere et polysakkarid som var ikke-acetylert. En annen mutantstamme ble konstruert ved in-vivo-innskudd av et fragment av DNA inneholdende tetracyklin-resistensgenet fra TnlO i et restriksjonssted inne i gummigenknippet. Denne mutantstamme (X921) ble funnet å være uten Ketalaseaktivitet. Som funnet ved metodene i eksemplene 2 og 3, produserte denne mutant xantan som var ikke-pyruvylert.

Der ble også funnet en tredje mutantstamme (X934) med sterkt redusert Ketalaseaktivitet. Denne mutantstamme produserer xantan-gummi med svært lavt pyruvyleringsnivå: 1-5% av det pyruvyleringsnivå som finnes i normalt xantan.

Mutantstammen X934 ble funnet som beskrevet nedenfor. I preliminære forsøk beregnet på å undersøke rekombineringen mellom plasmid-båret X. campestris-DNA og X. campestris-kromosomet, ble plasmidet pTX655 benyttet som modellsystem. Dette plasmid bærer et TnlO-innskudd i midten av et 2,3 kb X. campestris-Pstl-fragment klonet i plasmidet RSF1010. Dette innskudd av TnlO forårsaker Gum-defekten i mutanten X655 som beskrevet av Capage et al. og Vanderslice et al. Forsøket gikk ut på å mobilisere pTX655 med plasmidet pRK2013 og overføre det fra E. coli til X. campestris ved utvelging for overføring av den tetracyklinresistens som TnlO koder for. De første resultater av denne parring var anomale og antydet at TnlO ikke effektivt anga tetracyklinresistens i X. campestris når det var båret på plasmidet, men at medikamentresistensen ble mer effektivt uttrykt når TnlO var båret i kromosomet av X. campestris.

Dette fenomen er også beskrevet for TnlO i E. coli. Der er det vist at stammer som bærer en kopi av TnlO innsatt i kromosomet, er resistente for betydelig høyere konsentrasjoner av tetracyklin enn stammer som bærer TnlO på et multikopiplasmid. Utvelgelsen av Tet<r->X. campestris fra den ovennevnte parring resulterte i en høy frekvens (0,5 pr. mottaker) av avkom som vokste svært dårlig (dvs. bare små, vannlignende kolonier) på tetracyklin. Etter forlenget inkubering produserte en stor andel av koloniene (25%) sektorer av kraftigere voksende celler. Mer enn 50% av disse sektorer syntes å ha Gum-morfologi. Disse er sannsynligvis resultatet av rekombinering mellom plasmid-båret DNA inneholdende TnlO-innskuddet og den kromosomale villtype-DNA. Når TnlO blir rekombinert inn i kromosomet, oppnås høy-nivå Tet<r>, og den kraftigvoksende sektor observeres. Når disse Gum-, Tet<r->sektorer ble høstet og nysådd på tetracyklin, vokste de bra og viste en karakteristisk Gum-morfologi.

Gum<+>, Tet<r->isolater ble også karakterisert. Noen av disse stammer

(i særdeleshet X934) ble funnet å inneholde det fullstendige plasmid pTX655 innsatt i kromosomet til X. campestris via homolog rekombinasjon. Den kromosomale struktur av X934stammen ble bestemt ved "Southern blot"-hybridisering av det kromosomale DNA og viste at plasmidsekvensen eksisterer i en kromosomalt integrert form.

EKSEMPEL 2

Dette eksempel viser hvorledes det endrede polysakkarid iht. den foreliggende oppfinnelse kan lages in vitro. For eksempel viser det hvorledes ikke-acetylert og/eller ikke-pyruvylert xantan-gummi ble laget in vitro.

FREMSTILLING AV LYSATER

Xanthomonas campestris B1459 S4-L eller S4-L-mutanter beskrevet i eksemplene 1 og 5 ble dyrket i YM (gjær/maltmedium) som hadde fått tilsatt 2% (w/v) glukose som beskrevet av A. Jeanes et al. i U.S. Department of Agriculture, ARS-NC-51, p. 14 (1976), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse. Kulturene ble dyrket til sen logfase ved 30°C. Cellene ble høstet ved sentrifugering og vasket med kaldt tris-HCl, 70 mM, pH-verdi 8,2 med 10 mM EDTA og ble fryst/tint tre ganger ved en prosedyre i likhet med den som er beskrevet av R.C. Garcia et al. i European Journal of Biochemistry 43:93-105 (1974), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse. Denne prosedyre sprengte cellene, noe som ble klart ved den økede viskositet av suspensjonene og det fullstendige tap av celleoverlevelse (en av 10^ overlever) etter denne behandlingen. De fryste/tinede lysater ble fryst i porsjoner ved -80°C. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt med "BIO RAD assay" (BIO RAD Laboratories, Richmond, California) og ble funnet å være 5-7 mg celleprotein pr. ml lysat.

BIOSYNTETISK ANALYSEPROSEDYRE

Som beskrevet av L. Ielpi, R.O. Couso og M.A. Dankert i FEBS Letters 130:253-256 (1981), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse, ble en porsjon av fryst/tint lysat (tilsvarende 300-400 ug protein), DNAase 1(10 ug/ml) og MgCl2 (8 mM) forinkubert ved 20°C i 20 min. Et likt volum 70 mm tris-HCl, pH-verdi 8,2, med de ønskede radioaktivt merkede sukkernukleotider (UDP-glukose, GDP-mannose og UDP-glukuronsyre) ble tilsatt og inkubert ved 20°C. Radioaktivt merket fosfoenolpyruvat og acetylkoenzym A ble tilsatt når ønsket som beskrevet av Ielpi et al., se ovenfor, L. Ielpi, R.O. Couso og M.A. Dankert, M.A. Biochem. Biophys. Res. Comm. 102:1400-1408 (1981), og L. Ielpi, R.O. Couso og M.A. Dankert, Biochem. Intern. 6:323-333 (1983), hvis innhold må anses som en del av den foreliggende beskrivelse. På forskjellige tidspunkter ble reaksjonen stanset ved fortynning med buffer som holdt 4°C. Prøvene ble sentrifugert og pelletene vasket to ganger med buffer. Supernatantene ble slått sammen, bærer-xantan (100 |ig) ble tilsatt, og xantan pluss syntetisert polymer ble utfelt med etanol (60%)/KCl (0,8%). Den utfelte polymer ble resuspendert i vann og utfelt ytterligere to ganger for fjerning av ikke innlemmet merkesubstrat. Radioaktivitet i utfellingen (kalt gummifraksjonen) ble bestemt i en væskescintillasjonsteller og dataene bearbeidet for å gi den innlemmede mengde, målt i picomol, av de radioaktivt merkede bestanddeler.

Cellelysater av XI006 innlemmet ikke karbon- 14-acetat fra [<14>c]-acetyl-CoA i gummifraksjonen fra in vitro-systemet. Cellelysater av

S4-L ga in vitro-gummi som var radioaktivt merket med [<l>^cj-acetat. Tilsvarende innlemmet ikke cellelysater av X921 [<l>^cj-pyruvat i gummifraksjonen, mens S4-L-cellelysater innlemmet radioaktivt merket pyruvat fra fosfoenol-[<14>c]- pyruvat i gummifraksjonen fra in vitro-systemet. Derfor ble X1006 identifisert som en mutantstamme med en defekt i genet for Acetylase og X921 som en mutantstamme med en defekt i genet for Ketalase. Lysatene av disse stammer produserte henholdsvis ikke-acetylert xantan og ikke-pyruvylert xantan in vitro.

Det er også vist at X. campestris-B1459-S4-L-lysater ved å holde tilbake substrater vil produsere endrede polysakkarider in vitro. For eksempel produserte cellelysater av S4-L ikke-acetylert, ikke-pyruvylert xantan-gummi in vitro når det endogene acetyl-CoA og fosfoenolpyruvat var brukt opp.

EKSEMPEL 3

Dette eksempel viser bruken av den Acetylase-manglende stamme XI006 for fremstilling av ikke-acetylert gummi in vivo. Dette eksempel viser også fremstilling in vivo av ikke-pyruvylert gummi fra Ketalase-minusstammen X921 og xantan-gummi med redusert nivå av pyruvylering fra stammen X934.

De tre mutantstammer som er beskrevet ovenfor, og S4-L ble dyrket over natten i buljong med 2% glukose ved 30°C. Gummien ble høstet ved at cellene ble fjernet ved sentrifugering og gummien utfelt fra supernatanten ved tilsetning av 2-propanol eller etanol med 0,5-1% kaliumklorid. Gummiutfellingen ble gjenvunnet ved sentrifugering og resuspendert. Prosedyren ble gjentatt. Den resuspenderte gummi ble dialysert mot vann. En prøve av hvert polysakkarid ble syrehydrolysert og analysert ved hjelp av HPLC ved bruk av en BIO RAD HPX-87H-kolonne. Xantan-bestanddelene ble mengdebestemt ved injeksjon av standarder med kjent konsentrasjon.

HPLC-analysen av de hydrolyserte gummier viste at X921 produserte xantan-gummi uten pyruvat. Stammen XI006 produserte xantan-gummi uten acetat. Stammen X934 produserte en gummi som inneholdt pyruvat i en mengde på 1-5% av den for S4-L-gummi.

EKSEMPEL 4

Dette eksempel beskriver metoder og strategier som vil kunne benyttes for å konstruere mutanter av X. campestris som vil produsere xantan som er både ikke-acetylert og ikke-pyruvylert.

Mutantstammer av X. campestris som mangler Ketalase- eller Acetylase-aktivitet (X921 resp. XI006) har vært beskrevet. Man vil kunne benytte de mikrobielle genetikk- og rekombinant-DNA-metoder som er beskrevet av Vanderslice et al. og Capage et al. for å innføre en Ketalasedefekt og en Acetylasedefekt inn i en enkelt stamme av X. campestris. Denne dobbeltmutantstamme ville produsere xantan-gummi som ville være både ikke-acetylert og ikke-pyruvylert.

Metoder til å produsere innskuddsmutasjoner i klonede gummigen-DNA båret på plasmidvektorer har vært beskrevet av Capage et al. Man kunne tenke seg å bruke et plasmid som bærer den innskuddsmutasjon som gav opphav til mutantstammen X921, som et substrat for en annen runde mutagenese in vivo eller in vitro. Denne annen runde mutagenese kunne benytte et hvilket som helst av en rekke transponerbare elementer som vil være innlysende for fagfolk, eller en hvilken som helst av en rekke like innlysende DNA-restriksjonsfragmenter inneholdende valgbare merke-substrater. Et sett plasmider som bærer to innskuddsmutasjoner, kunne benyttes i den gensubstitusjonsteknikk som er beskrevet av Capage et al., for å overføre de plasmid-bårne mutasjoner til kromosomet av X. campestris. Fenotypene til de resulterende stammer kan analyseres ved de in vivo- og in vitro-teknikker som er beskrevet av Vanderslice et al. og Capage et al. (se ovenfor) i eksempel 2. Disse analyser vil avdekke dobbelt-mutantstammer som er blokkert i både Ketalase- og Acetylase-aktivitet. Disse dobbeltmutant-stammer vil produsere xantan som både er ikke-pyruvylert og ikke-acetylert.

EKSEMPEL 5

Dette eksempel diskuterer kloning av Acetylasegenet og Ketalasegenet på vektorer for å sikre at de her beskrevne polysakkarider er fullt acetylert, fullt pyruvylert eller begge deler.

X. campestris-stammene XI006 og X921 har mutasjoner i genene for Acetylase resp. Ketalase, som beskrevet i eksemplene 2 og 3. Disse mutanter ble laget ved bruk av de metoder som er beskrevet i eksempel 1. Det er mulig for en fagmann å benytte metoder beskrevet hos Betlach et al., se ovenfor, for å utvinne native DNA-restriksjonsfragmenter inneholdende Acetylase-eller Ketalasegenene. Det vil si at plasmider med DNA-restriksjonsfragmenter inneholdende Acetylase- eller Ketalasegenene avbrutt av en medikament-resistensmarkør kan benyttes til utprøving av lambdagenomiske biblioteker for å skaffe native DNA-sekvenser for Acetylase- eller Ketalasegenet. I en annen utførelsesform er genene for Acetylase- og Ketalase-enzymene allerede blitt klonet på plasmidet pRK290-H336 (ATCC deponeringsnr. 67344), som beskrevet av Capage et al., se ovenfor, og andre plasmider beskrevet her. Det er enkel sak for en fagmann å subklone Acetylase- og Ketalasegenene fra disse plasmider.

De native DNA-sekvenser som oppnås ved en av disse metoder, kan så settes inn i plasmider som er i stand til å replikere seg i X. campestris, f.eks. pMW79, ved bruk av de metoder som er beskrevet av Betlach et al. og Capage et al. Ekspresjon av Acetylase- og/eller Ketalasegenet kan kontrolleres ved modifisering av den eksisterende DNA sekvens eller innsetting av regulerbare promotorer oppstrøms i forhold til genet. Slike teknikker er velkjente for dem som har kunnskaper i molekylær biologi og genetikk. Tilsvarende kan de plasmider som genene er satt inn i, være såkalte "high copy number"-plasmider. Som beskrevet av Capage et al. er de xantan-biosyntetiske enzymer til stede i små mengder i X. campestris. Innskudd av de ovenfor beskrevne plasmider i X. campestris og dyrking av kulturer under forhold som er egnet for ekspresjon av plasmidbårede gener, vil resultere i syntese av meget større antall Acetylase- og/eller Ketalase-enzymer enn andre xantan-biosyntetiske enzymer. Overekspresjon av Acetylase skulle få xantanpolysakkaridene til å være fullt acetylert, dvs. at alle interne mannoserester er acetylert. Tilsvarende skulle overekspresjon av Ketalase forårsake full pyruvylering av de terminale mannoserester i xantan-polysakkaridene.

Det skulle være klart for en fagmann at full acetylering og full pyruvylering av xantan kan oppnås ved de metoder som er beskrevet ovenfor.

EKSEMPEL 6

Dette eksempel viser de økonomiske og tekniske fordeler ved et ikke-pyruvylert polysakkarid produsert av en genetisk modifisert Xanthomonas campestris som viskositetsmiddel for vann ved høye temperaturer.

Xantan-gummi, et naturprodukt av Xanthomonas campestris, er et effektivt viskositetsmiddel for vann for bruk ved f.eks. økt utvinning av petroleum. Disse viskositetsanvendelser vil ofte gjøre det nødvendig å anvende xantan-gummi ved høye temperaturer og i saltholdige oppløsninger. Xantan-gummier er effektive viskositetsmidler selv ved høye temperaturer (f.eks. 75°-100°C), skjønt deres viskositetsvirkning blir betydelig redusert i forhold til ved lavere temperaturer (f.eks. 25°-60°C).

Oppfinnerne har oppdaget et nytt og ukjent polysakkarid produsert av en genetisk modifisert stamme av Xanthomonas campestris (stamme X921) som ga en viskositet ved høye temperaturer tilsvarende den for villtype-xantan-gummi produsert fra S4-L-foreldrestammen (stamme X237) . Denne xantan-gummi har den normale pentamere xantan-struktur, men på grunn av den genetiske modifikasjon inneholder den ingen pyruvatmolekyldel på mannosen i endestilling. Dette nye polysakkarid har lav viskositet ved en fermenteringstemperatur nær 30°C, noe som vil resultere i betydelig reduserte kostnader og prosessfordeler. Kostnadene ved produksjon av pyruvylert xantan-gummi er høye, hovedsakelig fordi polymerens høye viskositet krever stort energiforbruk til omrøring, lufting og kjøling.

Fig. 2 viser en viskositetssammenligning mellom den nye ikke-pyruvylerte xantan-gummi og en vill-type-xantan-gummi produsert av den umodifiserte foreldrestamme. Vill-typegummien oppviser høy viskositet ved lave temperaturer, men viskositeten avtar raskt med økende temperatur. Den ikke-pyruvylerte gummi har på den annen side lavere viskositet ved lav temperatur, men beholder en viskositet ved høy temperatur som er hovedsakelig lik den for villtype-xantan-gummi. De viskositeter som fremgår av fig. 2, ble målt ved en skjærhastighet på 8 s~<l> i et konsentrisk sylinderviskometer på oppløsninger av 1000 ppm aktivt polymerfaststoff i 5000 ppm NaCl-oppløsning.

EKSEMPEL 7

Dette eksempel viser fordelene ved et ikke-acetylert xantan produsert av en genetisk modifisert Xanthomonas campestris til bruk som viskositetsmiddel for vandige oppløsninger. Fig. 3 sammenligner viskositeten av kjemisk deacetylert, kommersielt xantan og dets utgangsforbindelse med den av ikke-acetylert xantan-polysakkarid laget av en genetisk manipulert Xanthomonas campestris (stamme X1006) og av xantan-gummi laget av villtype-X. campestris-foreldrestammen (stamme X237). Viskositeten ble målt ved en skjærhastighet på 8 s"<l> for 1000 ppm polymerkonsentrasjon i 50.000 ppm NaCl-oppløsning. Viskositetene ble målt over temperaturområdet 25-80°C. Fig. 3 viser at kjemisk deacetylering av xantan resulterer i tap av viskositetsøkende evne over hele temperaturområdet. Imidlertid fører eliminasjon av acetylering ved genetiske metoder til betydelig øket viskositet sammenlignet med villtype-xantan-gummi. Derfor er ikke-acetylert xantan-gummi produsert av en mutantstamme av X. campestris et forbedret polysakkarid sammenlignet med xantan selv og sammenlignet med deacetylert xantan-gummi produsert med kjemiske metoder.

EKSEMPEL 8

Dette eksempel beskriver de metoder som ble benyttet til å konstruere en dobbeltmutantstamme av X. campestris som produserer ikke-acetylert, ikke-pyruvylert xantan.

Capage et al. har beskrevet kloningen av en gengruppe fra X. campestris inneholdende gener som dirigerer biosyntesen av xantan-gummi. De har også beskrevet isoleringen av kromosomale slettingsmutasjoner i X. campestris som eliminerer alle eller varierende deler av denne gengruppe. En slik slettingsmutant, stamme X1231, mangler alt X. campestris-DNA som er båret på det rekombinante plasmid pRK290-H336. Derfor syntetiserer stammen X1231 ikke xantan. Når pRK290-H336 overføres til stamme X1231, gjenvinnes dets evne til å syntetisere xantan. Capage et al. har også beskrevet metoder til å isolere og karakterisere innskuddsmutasjonene av transposon TnK12 inne i det klonede gummigen-DNA båret på pRK290-H336. To slike mutantplasmider er pRK290-H336.22 og pRK290-H336.41. Den omtrentlige plassering av TnK12-innskuddene på hvert av disse plasmider er vist på fig. 4. Når pRK290-H336.22 overføres til X1231, produserer den resulterende stamme ikke-acetylert xantan. Når pRK290-H336.41 overføres inn i X1231, produseres ikke-pyruvylert xantan. Disse to plasmidmutanter har vært benyttet til ved hjelp av in vitro rekombinering å konstruere et dobbelt-mutantplasmid som styrer syntesen av ikke-acetylert, ikke-pyruvylert xantan når det bæres i slettingsstammen X1231.

Strategien for in vitro å generere et ikke-acetylert, ikke-pyruvylert dobbelt-mutantplasmid er som følger. Et kanamycinfølsomt (Kan<s>) derivat av pRK290-H336.41 ble generert ved en partiell Hindlll-digerering av plasmidet, ligering av digeratene ved svært lave DNA-konsentrasjoner (for å fremme intramolekulær ligering), og deretter sortering av tetracyklin-resistente (Tet<r>) transformanter for kanamycin-følsomhet. Plasmid-DNA'er ble så laget fra Tet<r>, Kan<s->isolater og analysert ved restriksjonsendonuklease-digerering og agarosegelelektroforese. Der finnes bare tre Hindlll-steder i pRK290-H336.41, og to av disse finnes inne i TnK12 og omslutter Kan-genet. Derfor ble en høy andel av de slettinger som ble generert ved den partielle digereringen, frigjort fra Kan-genet, mens resten av plasmidet forble intakt. Kan<s->plasmidet bærer fremdeles et innskudd (1 kb) i Ketalasegenet, og man ventet derfor at det skulle gi ikke-pyruvylert gummi.

Dette plasmid benevnes p41KS. Det neste trinn var å klone det store Spel-fragmentet av det ikke-acetylerte mutant-plasmid pRK290-H336.22 inn i p41KS. Som vist på fig. 4, inneholder hvert plasmid tre Spel-steder ved posisjonene 758, 771 og 11,716 inne i DNA-sekvensen til Capage et al.. 10,9 kb Spelfragmentet bærer Tnkl2-innskuddet av pRK290-H336.22. Det lille (13 bp) Spel-fragmentet ligger fullstendig inne i et tRNA-gen som ikke er vesentlig for vekst av X. campestris og xantanfremstilling. Derfor burde fjerning av dette lille Spel-segmentet i løpet av dobbeltmutantkonstruksjonen ikke påvirke xantan-biosyntesen. Plasmidene p41KS og pRK290-H336.22 ble renset og digerert fullstendig med Spel, og ligering ble utført. Ved denne ligeringen ble p41 KS/Spel ligert i 10 gangers mol-overskudd med H336.22/Spel. Når rekombinanter inneholdende Kan<r>, Spel-fragmentet av H336.22 blir valgt, skulle de således som oftest være assosiert med Spel-vektorfragmentet av p41KS. Transformasjoner med disse ligater ble utført og der ble oppnådd Kan<r->transformanter. De plasmider som var båret av disse transformanter, ble analysert for identifisering av de interessante rekombinantprodukter. Det ønskede rekombinant-plasmid ble lett identifisert blant Kan<r->transformantene. Dette rekombinant-plasmid, benevnt p41KS22, inneholder det p41KS-avledede innskudd i Ketalasegenet og det H336.22-avledede TnK12 innskudd inne i Acetylasegenet. Passende restriksjonsdigereringsanalyse bekreftet nærværet av begge innskuddsmutasjonene og viste videre at Spel-fragmentet inneholdende TnK12-mutasjonen var satt inn med riktig orientering.

Det skal forstås at en fagmann med kjennskap til læren ifølge den foreliggende oppfinnelse vil kunne anvende denne på en spesifikk mikroorganisme.

Det vil være klart for fagfolk at det er mulig å gjøre modifikasjoner og variasjoner av prosessene og produktene ifølge oppfinnelsen. Det er derfor meningen at oppfinnelsen skal dekke modifikasjoner og variasjoner av oppfinnelsen såfremt de ligger innen rekkevidden av kravene og deres ekvivalenter.

Claims (12)

1. Sammensetning bestående av en vannoppløselig polysakkaridpolymer bestående av repeterende pentamerenheter som har et forhold mellom D-glukose, D-mannose og D-glukuronsyre på ca. 2:2:1, karakterisert ved at den har en molekylvekt på lO^-lO^ dalton, at (1) D-glukoseenhetene er bundet i en beta-[l,4]-konfigurasjon, (2) en D-mannoseenhet som eventuelt kan være acetylert i 6-O-stillingen, er bundet i en alfa-[l,3]-konfigurasjon, vanligvis til annen hver glukoseenhet, (3) D-glukuronsyre-enhetene er bundet i en beta-[l,2]-konfigurasjon til den nevnte ikke-acetylerte eller acetylerte mannoseenhet og (4) en annen mannoseenhet, som inneholder eventuelt en ketal-bundet pyrodruesyre i 4,6-stillingen, er bundet til den nevnte glukuronsyre-enhet i en beta-[l,4]-konfigurasjon.

2. Sammensetning som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte annen mannoseenhet ikke er pyruvylert.

3. Sammensetning som angitt i krav 2, karakterisert ved at den nevnte polysakkaridpolymer er ikke-acetylert og ikke-pyruvylert.

4. Sammensetning som angitt i krav 1, karakterisert ved at den har en molekylvekt på 10^-10^ dalton, at (1) D-glukoseenhetene er bundet i en beta-[l,4]-konfigurasjon, (2) en D-mannosenhet, som er acetylert i 6-O-stillingen, er bundet i en alfa-[l,3] konfigurasjon, vanligvis til annen hver glukoseenhet, (3) D-glukuronsyre-enhetene er bundet i en beta-[l,2]-konfigurasjon til den nevnte acetylerte mannoseenhet og (4) en annen mannoseenhet som ikke inneholder en pyruvatenhet i 4,6-stillingen, er bundet til de nevnte glukuronsyre-enheter i en beta-[l,4]-konfigurasjon.

5. Sammensetning bestående av en vannoppløselig polysakkaridpolymer bestående av repeterende pentamerenheter som har et forhold mellom D-glukose, D-mannose og D-glukuronsyre på ca. 2:2:1, karakterisert ved at den har en molekylvekt på lO^-lO^ dalton, at (1) D-glukoseenhetene er bundet i en beta-[l,4]-konfigurasjon, (2) en D-mannoseenhet som er acetylert i 6-O-stillingen, er bundet i en alfa-[l,3]-konfigurasjon, vanligvis til annen hver glukoseenhet, (3) D-glukuronsyre-enhetene er bundet i en beta-[l,2]-konfigurasjon til den nevnte acetylerte mannoseenhet og (4) en annen mannoseenhet, som inneholder en ketyl-bundet pyrodruesyre i 4,6-stillingen, er bundet til de nevnte glukuronsyre-enheter i en beta-[l,4]-konfigurasjon, og at polymeren er mer enn 90% acetylert.

6. Sammensetning som angitt i krav 5, karakterisert ved at minst 90% av de andre mannoseenheter er pyruvylert.

7. Sammensetning bestående av en vannoppløselig polysakkaridpolymer bestående av repeterende pentamerenheter som har et forhold mellom D-glukose, D-mannose og D-glukuronsyre på ca. 2:2:1, karakterisert ved at den har en molekylvekt på 10^-10^ dalton, at (1) D-glukoseenhetene er bundet i en beta-[l,4]-konfigurasjon, (2) mannose-enheten, som er acetylert i 6-O-stillingen, er bundet i en alfa-[l,3]-konfigurasjon, vanligvis til annen hver glukoseenhet, (3) D-glukuronsyre-enhetene er bundet i en beta-[l,2]-konfigurasjon til den nevnte acetylerte mannoseenhet, og (4) en annen mannoseenhet, hvor minst 90% av de andre mannoseenheter inneholder en ketyl-bundet pyrodruesyre i 4,6-stillingen, er bundet til de nevnte glukuronsyre-enheter i en beta-[l,4]-konfigurasjon.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av en vannoppløselig polysakkaridpolymer med repeterende pentamerenheter som angitt i krav 1, 2, 3 og 5, karakterisert ved at et egnet vekstmedium podes med en mikroorganisme av en mutant av Xanthomonas som mangler Ketalase og Acetylase, og det podede vekstmedium inkuberes ved egnet temperatur, pH-verdi og nivå av oppløst oksygen for produksjon av en polysakkaridpolymer som angitt i krav 1, 2, 3 og 5.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at mikroorganismen er Xanthomonas campestris.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at mikroorganismen er ATCC nr. 67344, en mutant (X1231) av Xanthomonas campestris som mangler Ketalase og Acetylase.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at mikroorganismen er ATCC nr. 53472, en mutant (X921) av Xanthomonas campestris som mangler Ketalase.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at mikroorganismen er ATCC nr. 53473, en mutant (XI006) av Xanthomonas campestris som mangler Acetylase.