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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung liegt auf dem Gebiet der Herstellung acylierter Polymere,
insbesondere auf dem Gebiet der Herstellung von acylierten Polysacchariden
in Mikroorganismen.
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Es
werden rekombinante DNA-Techniken angewandt, somit liegen Teile
der Erfindung auf dem Gebiet der rekombinanten Biotechnologie.
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Stand der Technik
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Polysaccharide
sind dem Fachmann bekannt und kommen in der Natur z. B. als Glycogen,
Stärken (Amylose, Amylopektin), Chitin, Callose, Zellulose
und speziell in Bakterien in Form von z. B. Lipopolysacchariden
oder extrazellulären Polysacchariden vor. Industriell verwendete
Polysaccharide sind z. B. Karayagummi, Gummiarabicum, Johannisbrotkernmehl,
Tragantgummi, Dextran und Pullulan. Polysaccharide können
acyliert werden, so z. B. durch Carboxyl-, Acetyl- oder Succinyl-Gruppen.
Beispiele für acylierte Polysaccharide sind Mannan, Xylan,
Rhamnogalacturonan, Pektin, Xyloglucan, Galactomannan, Galactoglucomannan,
Galactoglucan, Xanthan, Gellan, Rhamsan, und Welan.
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Xanthan
ist ein anionisches Polysaccharid, das von gram-negativen, aeroben
Bakterien der Gattung Xanthomonas, Ordnung Xanthomonadales innerhalb
der taxonomischen Klasse der Gamma-Proteobakterien, hergestellt
wird. Seit den 1960er Jahren wird Xanthan industriell produziert
und vor allem als Zusatzstoff für Lebensmittel aber auch
als Verdicker in technischen Anwendungen eingesetzt.
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Xanthan
ist ein lineares Polymer dessen Rückgrat aus 1–4
verknüpften β-D-Glucoseeinheiten besteht. Am C3-Atom
jeder zweiten Glucoseeinheit hängt ein Trisaccharid aus β-D-Mannose
1–4 verknüpft mit β-D-Glucuronsäure
1–2 verknüpft mit α-D-Mannose. Die beiden
Mannoseeinheiten sind dabei häufig derivatisiert: die α-D-Mannose
kann am C6 Atom acetyliert sein, die β-D-Mannose kann an
C4 und C6-Stellung mit Pyruvat oder nur an C6 mit Acetat verbunden
sein (vergleiche 1). Der Anteil an Acetat und
Pyruvat schwankt allerdings. Typischerweise hat Xanthan einen Besetzungsgrad
von ca. 80–90% mit Acetat und ca. 40% mit Pyruvat. Das
Molekulargewicht von Xanthan liegt bei über 1 Mio Dalton
(Da).
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In
Lösung bilden zwei Xanthan-Moleküle eine Doppelhelix
aus, wodurch aus einem zunächst flexiblen Polymer ein steifes
Stäbchen wird. Diese Konformation bedingt die viskoelastischen
Eigenschaften von Xanthanlösungen: In Ruhe ist eine solche
Lösung sehr viskos und verfügt über eine
hohe Suspendierkraft, da die Polymerstäbchen sich gegenseitig
in ihrer Beweglichkeit behindern. Wenn Bewegungsenergie bzw. Scherkraft in
die Lösung eingebracht wird, so richten sich die Stäbchen
parallel zueinander aus und die Lösung wird frei fließend
und verliert ihre Suspensionskraft. Man spricht von „scherverdünnendem"
oder „thixotropem" Verhalten. Mit der Rückkehr
in den ruhenden Zustand kehrt auch schlagartig die hohe Viskosität
zurück. Die Höhe der Viskosität von Xanthanlösungen
ist erheblich vom Grad der Derivatisierung mit Acylresten und von
der Anwesenheit verschiedener Metallsalze abhängig. Ein
erhöhter Anteil an Pyruvat führt z. B. in Anwesenheit
von Kalium-Ionen zu einer erhöhten Viskosität.
Ein niedrigerer Anteil an Acetat verringert die Temperaturabhängigkeit der
Viskosität von Xanthan Lösungen (Dentini,
M.; Crescenzi, V.; Blasi, D. (1984) Conformational properties of
xanthan derivatives in dilute aqueous solution. Int. J. of Biological
Macromolecules 6(2), 93–8.). In Lösungen
mit Johannesbrotkernmehl bildet Xanthan schon bei geringer Konzentration
stabile Gele aus. Xanthan mit einem reduzierten Gehalt an Acetatgruppen
zeichnet sich dadurch aus, dass die Wechselwirkung mit Johannesbrotkernmehl
und damit auch die Gelbildung verstärkt wird (Wang,
F.; Wang, Y.-J.; Sun, Z. (2002) Conformational role of xanthan in
its interaction with locust bean gum. J. Food Science 67(7), 2609–2614; Copetti G.;
Grassi M.; Lapasin R.; Pricl S. (1997) Synergistic gelation of xanthan
gum with locust bean gum: a rheological investigation. Glycoconjugate
J. 14(8), 951–61). Daher kann es vorteilhaft sein,
Xanthan zu produzieren, welches über einen niedrigen Gehalt
an Acetyl-Gruppen verfügt. Ideal wäre es daher, über
ein System zu verfügen, mit dem der Acetylierungsgehalt
beeinflusst und bestimmt werden kann.
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Da
der Acetatgehalt von Xanthan von verschiedenen natürlichen
Isolaten von Xanthomonas campestris schwankt, konnten Varianten
isoliert werden, die einen niedrigeren Acetatgehalt besitzen (Tait,
M. I.; Sutherland, I. W. (1989) Synthesis and properties of a mutant
type of xanthan. J. of Applied Bacteriology 66(5), 457–60).
Außerdem haben die Wachstumsbedingungen von Xanthomonas
campestris einen geringen aber signifikanten Einfluss auf den Acetatgehalt
des produzierten Xanthans (Tait, M. I.; Sutherland, I. W.;
Clarke-Sturman, A. J. (1986) Effect of growth conditions an the
production, composition and viscosity of Xanthomonas campestris
exopolysaccharide. J. of General Microbiology 132(6), 1483–92).
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Eine
weitere Möglichkeit den Acetatgehalt von Xanthan zu reduzieren,
ist es, eine Xanthanlösung unter alkalischen Bedingungen
zu inkubieren, wie in
US-Patent
4296203 beschrieben.
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Diese
Methode wird großtechnisch eingesetzt, hat aber den Nachteil,
dass dabei als Nebenreaktion eine Spaltung der Polymerkette erfolgt
und dabei das Molekulargewicht des Xanthans reduziert bzw. die intrinsische
Viskosität herabgesetzt wird, wie in
WO8705939 beschrieben. Eine andere
Methode den Acetatgehalt von Xanthan zu reduzieren, ist es, Xanthan
in Pulverform stark zu erhitzen, vergleiche
JP2006213867 , wobei auch hier mit
einer starken Depolymerisierung zu rechnen ist. Bei beiden beschriebenen
Verfahren werden zusätzliche Prozessschritte benötigt,
die zu erhöhten Produktionskosten führen.
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Eine
Möglichkeit, Xanthan mit modifiziertem Acetatgehalt zu
produzieren, ohne dabei zusätzliche Prozessschritte zu
beanspruchen, ist dadurch gegeben, dass gentechnische Eingriffe
im Produktionsstamm vorgenommen werden. Die Biosynthese des Xanthans
erfolgt mithilfe von 12 Enzymen, deren Gene (gumB bis gumM) sich
in einem Operon befinden, das unter der Kontrolle eines Promotors
steht. Zunächst werden an der cytoplasmatischen Seite der
inneren Membran von X. campestris die fünf Zucker einer
Monomereinheit zusammengebaut. Die Monomereinheiten werden anschließend
auf die periplasmatische Seite der Membran transferiert und dort
polymerisiert und exportiert. Noch auf der cytoplasmatischen Seite
werden Acetylgruppen von den Enzymen gum F und gumG auf die Zuckermoleküle übertragen.
WO9219753 und
US-Patent 5948651 beschreiben eine
Methode, bei der diese Enzyme bzw. die Gene, die für diese
Enzyme kodieren, in den Xanthan produzierenden Stämmen inaktiviert
bzw. ausgeschaltet werden. Damit konnte jedoch lediglich Xanthan erhalten
werden, welches komplett deacetyliert war.
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Es
sind in der Literatur eine Reihe Enzyme beschrieben worden (allgemein
der Klasse E. C. 3.1.1), die in der Lage sind, Acylgruppen von Polysacchariden
abzuspalten. Darunter befinden sich Carboxylesterasen (Cui,
W.; Winter, W. T.; Tanenbaum, S. W.; Nakas, J. P. (1999) Purification
and characterization of an intracellular carboxylesterase from Arthrobacter
viscosus NRRL B-1973. Enzyme and Microbial Technology 24(3/4), 200–208)
und Acetylxylanesterasen (Margolles-Clark E., Tenkanen M.,
Söderlund H., Penttilä M. (1996) Acetyl xylan
esterase from Trichoderma reesei contains an active-site serine
residue and a cellulose-binding domain. Eur J Biochem. 237(3) 553–60).
Im Genom von Xanthomonas campestris pv. campestris ATCC33913 wurde ein
Enzym über Sequenzhomologie identifiziert, welches potentiell
eine Acetylxylanesteraseaktivität besitzt (da Silva,
A. C. R. et al. (2002) Comparison of the genomes of two Xanthomonas
pathogens with differing host specificities. Nature 417 (6887),
459–463, SEQ ID NO: 1).
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Generelle
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Methode bereitzustellen mit der
Polymere mit – verglichen zu konventionellen Verfahren – erniedrigtem
Acylgehalt hergestellt werden können. Dieser Herstellungsprozess
kann durch Mikroorganismen erfolgen; daher ist eine weitere Aufgabe
der Erfindung, Mikroorganismen bereitzustellen, die Polysaccharide
produzieren, deren Acylierungsgehalt beeinflusst werden kann.
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Weitere
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Familie von Polysaccharid-Polymeren
mit verändertem Acylierungsgehalt bereitzustellen, die
vorzugsweise verbesserte rheologische Eigenschaften aufweisen und bessere
Verdicker von Wasser bei erhöhten Temperaturen und/oder
Salzkonzentrationen sind, als es natürlich vorkommendes
Xanthan ist.
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Beschreibung der Erfindung
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Es
wurde gefunden, das acyliertes Polymer in einem modifiziertem Mikroorganismus,
der auf natürliche Weise oder durch rekombinante Modifizierung
befähigt ist, acylgruppenhaltiges Polymer zu bilden, wobei hergestelltes
Polymer mit einem niedrigeren Grad an Acylierung versehen ist, verglichen
zu dem Polymer, welches von demselben, nicht modifizierten Mikroorganismus
gebildet wird, hergestellt werden kann, indem in dem Mikroorganismus
eine Acylase überexpremiert wird und der acylaseüberexpremierende
Mikroorganismus unter Bedingungen, unter denen er acyliertes Polymer
bildet, angezogen wird.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind daher ein Verfahren zur Herstellung
acylierter Polymere in einem modifiziertem Mikroorganismus, der
auf natürlicher Weise oder durch rekombinante Modifizierung
befähigt ist, acylgruppenhaltiges Polymer zu bilden, wobei
hergestelltes Polymer mit einem niedrigeren Grad an Acylierung versehen
ist, verglichen zu dem Polymer, welches von demselben, nicht modifizierten
Mikroorganismus gebildet wird, umfassend: Modifizieren des Mikroorganismus
durch Überexpression einer Acylase und Anzucht des acylaseüberexpremierenden Mikroorganismus
unter Bedingungen, unter denen er acyliertes Polymer bildet.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist das mit diesem Verfahren hergestellte
Polymer selber.
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Ein
Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist,
dass es eine generelle Methode bietet, mit der acylhaltige Polymere
mit erniedrigtem Acylgehalt hergestellt werden können.
Des Weiteren ist es vorteilhaft, dass das Verfahren ohne die Inaktivierung
von endogenen Genen des modifizierten Mikroorganismus auskommt.
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Ein
weiterer Vorteil der Erfindung ist die Tatsache, dass ein Xanthan
produzierender Stamm generiert wurde, der den Status „selbstkloniert"
besitzt.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren wird nachfolgend beispielhaft
beschrieben, ohne dass die Erfindung auf diese beispielhaften Ausführungsformen
beschränkt sein soll. Sind nachfolgend Bereiche, allgemeine
Formeln oder Verbindungsklassen angegeben, so sollen diese nicht
nur die entsprechenden Bereiche oder Gruppen von Verbindungen umfassen,
die explizit erwähnt sind, sondern auch alle Teilbereiche
und Teilgruppen von Verbindungen, die durch Herausnahme von einzelnen
Werten (Bereichen) oder Verbindungen erhalten werden können.
Werden im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Dokumente zitiert,
so soll deren Inhalt vollständig zum Offenbarungsgehalt
der vorliegenden Erfindung gehören.
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Als
Begriff Polymer ist ein Stoff gemeint, der aus Molekülen
besteht, die durch eine gegebenenfalls verzweigte Kette einer oder
mehrerer Arten von Monomereinheiten gekennzeichnet sind, und der
eine einfache Gewichtsmehrheit von Molekülen mit mindestens
drei Monomereinheiten enthält, die zumindest mit einer weiteren
Monomereinheit bzw. einem sonstigen Reaktanden eine kovalente Bindung
eingegangen sind, sowie weniger als eine einfache Gewichtsmehrheit
von Molekülen mit demselben Molekulargewicht. Diese Moleküle liegen
innerhalb eines bestimmten Molekulargewichtsbereichs, wobei die
Unterschiede beim Molekulargewicht im Wesentlichen auf die Unterschiede
in der Zahl der Monomereinheiten zurückzuführen
sind. Hier ist unter einer "Monomereinheit" die gebundene Form eines
Monomers in einem Polymer zu verstehen.
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Werden
im Rahmen der vorliegenden Erfindung polymere Verbindungen beschrieben,
die verschiedene Monomereinheiten mehrfach aufweisen können,
so können diese statistisch verteilt (statistisches Oligomer) oder
geordnet (Blockoligomer) in diesen Verbindungen vorkommen. Angaben
zu Anzahl von Einheiten in solchen Verbindungen sind als Mittelwert,
gemittelt über alle entsprechenden Verbindungen zu verstehen.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung acylierter
Polymere in einem modifiziertem Mikroorganismus, der auf natürlicher
Weise oder durch rekombinante Modifizierung befähigt ist, acylgruppenhaltiges
Polymer zu bilden, wobei hergestelltes Polymer mit einem niedrigeren
Grad an Acylierung versehen ist, verglichen zu dem Polymer, welches
von demselben, nicht modifizierten Mikroorganismus gebildet wird, umfassend:
Modifizieren des Mikroorganismus durch Überexpression einer
Acylase und Anzucht des acylaseüberexpremierenden Mikroorganismus
unter Bedingungen, unter denen er acyliertes Polymer bildet.
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Rekombinante
Modifizierungen an Mikroorganismen können durch die rekombinanten
Gentechnikverfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt
sind. Im Allgemeinen können die Fremd-DNA tragende Vektoren
in die Zellen durch konventionelle Transformations- oder Transfektionstechniken
eingeschleust werden.
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Geeignete
Methoden können gefunden werden bei Sambrook et
al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring
Harbor Laboratory, 1989).
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Gegenstand
der Erfindung sind ebenfalls Vektoren, insbesondere Plasmide, die
die erfindungsgemäß eingesetzten Acylasen enthalten
und gegebenenfalls in Bakterien replizieren. Gegenstand der Erfindung
sind ebenfalls die rekombinanten Mikroorganismen, die mit den genannten
Vektoren transformiert wurden. Dabei können die proteinkodierenden
Polynukleotide unter der Wirkung eines einzigen oder mehrerer Promotoren stehen.
Der Begriff "Verstärkung" oder „Überexpression"
beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären
Aktivität oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme
oder Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende
DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens
bzw. der Gene, des ORFs bzw. der ORFs um mindestens eine (1) Kopie
erhöht, einen starken Promotor funktionell mit dem Gen
verknüpft oder ein Gen oder Allel oder ORF verwendet, das
für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen
Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen
kombiniert. In E. coli werden exemplarisch lac, tac und trp als
starke Promotoren genannt. Als Überexpression soll ebenfalls
die analog zu vorangegangen beschriebene Expression eines Proteins,
welches vorher nicht in dem Mikroorganismus vorhanden war, verstanden
werden. Als offener Leserahmen (ORF, open reading frame) wird ein
Abschnitt einer Nukleotidsequenz bezeichnet, der für ein
Protein beziehungsweise Polypeptid oder Ribonukleinsäure
kodiert oder kodieren kann, dem (der) nach dem Stand der Technik
keine Funktion zugeordnet werden kann. Nach Zuordnung einer Funktion
zu dem betreffenden Abschnitt der Nukleotidsequenz wird im Allgemeinen
von einem Gen gesprochen. Unter Allelen versteht man im Allgemeinen
alternative Formen eines gegebenen Gens. Die Formen zeichnen sich
durch Unterschiede in der Nukleotidsequenz aus. Als Genprodukt bezeichnet
man im Allgemeinen das von einer Nukleotidsequenz, d. h. einem ORF,
einem Gen oder einem Allel kodierte Protein oder die kodierte Ribonukleinsäure.
Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression,
wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden
Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%,
150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen
auf die des Wildtyp-Proteins beziehungsweise auf die Aktivität
oder Konzentration des Proteins im für das entsprechende
Enzym bzw. Protein nicht rekombinanten Mikroorganismus oder Elternstamm
erhöht. Als nicht rekombinanter Mikroorganismus oder Elternstamm
(parent strain) wird der Mikroorganismus verstanden, an dem die
erfindungsgemäße Verstärkung oder Überexpression
durchgeführt wird. Die Gene oder Genkonstrukte können
entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen
oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann
weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch
Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung
erreicht werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist das acylierte Polymer ein Polysaccharid, besonders
bevorzugt ist das acylierte Polymer ein wasserlösliches
Polymer bestehend aus einer linearen Kette von 1–4 verknüpften β-D-Glucoseeinheiten,
deren jede zweiten Glucoseeinheit am C3-Atom mit einem Trisaccharid
aus β-D-Mannose 1–4 verknüpft mit β-D-Glucuronsäure
1–2 verknüpft mit α-D-Mannose verknüpft
ist. Als Mikroorganismus wird vorzugsweise ein Bakterium der Gattung
Xanthomonas, besonders bevorzugt Xanthomonas campestris, verwendet.
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In
dem erfindungsgemäßen Verfahrens ist die überexpremierte
Acylase vorzugsweise eine Acetylesterase, besonders bevorzugt eine
Acetylxylanesterase. Besonders bevorzugt wird eine Acetylxylanesterase von
Xanthomonas campestris eingesetzt.
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Als
Acylase kann auch eine Acylase überexpremiert werden, deren
Aminosäuresequenz mindestens 70%, 80%, 90%, 95% bzw. besonders
bevorzugt 99% zu SEQ ID NO: 7 identisch ist.
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Die
in erfindungsgemäßem Verfahren eingesetzten Mikroorganismen
können die für die überexpremierte Acylase
proteinkodierenden Nukleinsäuren episomal oder im Genom
integriert tragen. In einer Ausführungsform wird der Mikroorganismus
Xanthomonas campestris Stamm XCA4 im erfindungsgemäßem
Verfahren eingesetzt, der sich dadurch auszeichnet, dass die für
die überexpremierte Acylase proteinkodierende DNA-Sequenz
SEQ ID NO: 10 in den Genlocus zwischen gumE und gumF integriert
wurde.
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Im
erfindungsgemäßen Verfahren kann der Acylgehalt
des zu produzierenden Polymers beeinflusst werden. Dies kann z.
B. durch Regulierung der Überexpression der Acylase erfolgen,
so z. B. in der Form, dass unterschiedliche Promotoren zur Expression
der Acylase eingesetzt werden. So können z. B. induzierbare
Promotoren eingesetzt werden.
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Es
kann vorteilhaft sein, wenn die Expressionsrate der überexpremierte
Acylase mit der Produktionsrate an Polymer korreliert wird. Dies
kann beispielsweise durch den Einsatz von Promotoren ausgewählt
aus der Gruppe der Promotoren, die die Expression der Enzyme verantwortlich
für die Polymer-Synthese in dem Mikroorganismus sicherstellen,
erfolgen.
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Bevorzugt
wird dies ebenfalls durch den Einsatz des Mikroorganismus Xanthomonas
campestris Stamm XCA4 in erfindungsgemäßem Verfahren
erreicht, der sich dadurch auszeichnet, dass die für die überexpremierte
Acylase porteinkodierende DNA-Sequenz SEQ ID NO: 10 in den Genlocus
zwischen gumE und gumF integriert wurde.
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Es
kann vorteilhaft sein, wenn der Grad an Acylierung des Polymers über
die intrazelluläre Lokalisation der Acylase beeinflusst
wird. Dem Fachmann ist bekannt, dass diese Beeinflussung z. B. durch
Variation des Signalpeptides bzw. der Lokalisierungssequenz der überexpremierten
Acylase erreicht werden kann. Bevorzugt wird in erfindungsgemäßen
Verfahren die intrazelluläre Lokalisation der Acylase über
eine Aminosäuresequenzveränderung innerhalb der
ersten 60 N-terminalen Aminosäuren der Acylase beeinflusst.
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Im
Lichte der öffentlichen Diskussion um gentechnisch veränderte
Organismen ist es wünschenswert, Mikroorganismen vorweisen
zu können, die keinerlei Fremd-DNA enthalten. Daher wird
in dem erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise
ein modifizierter Mikroorganismus eingesetzt, der keinerlei Fremd-DNA
enthält.
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Bevorzugt
ist dieser Mikroorganismus der Xanthomonas campestris Stamm XCA4,
der sich dadurch auszeichnet, dass die DNA-Sequenz SEQ ID NO: 10
in den Genlocus zwischen gumE und gumF integriert wurde und der
somit ebenfalls Bestandteil der Erfindung ist.
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Die
physikalischen Eigenschaften wie beispielsweise Wasserlöslichkeit,
Viskositätsbeeinflussbarkeit der Polymerlösungen
so wie offensichtlich die chemische Zusammensetzung der mit erfindungsgemäßem
Verfahren hergestellten Polymere unterscheiden sich wesentlich von
den mit klassischen Verfahren produzierten. Daher ist ein weiterer
Bestandteil der Erfindung das mit erfindungsgemäßem
Verfahren hergestellte acylierte Polymer.
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Zur
Generierung der modifizierten Mikroorganismen, die zum Einsatz in
erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, können
verschiedene Klonierungs- und Expressionsplasmide in Kombination
mit Nukleinsäuren proteinkodierend für verschiedene
Acylasen eingesetzt werden. Um das erfindungsgemäße
Verfahren durchzuführen können die Plasmide pASKxca1
mit Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 13, pASKxca2 mit Nukleotidsequenz
SEQ ID NO: 14, pASKxca3 mit Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 15, pJNxca1
mit Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 16, pJNxca2 mit Nukleotidsequenz
SEQ ID NO: 17, pJNxca3 mit Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 18 und pK18mobSacBxca4
mit Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 19 eingesetzt werden. Diese Nukleotidsequenzen
sind somit Bestandteil der Erfindung.
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Ebenso
sind die verwendeten Mikroorganismen, die mindestens eines der Plasmide
ausgewählt aus der Gruppe pASKxca1 mit Nukleotidsequenz
SEQ ID NO: 13, pASKxca2 mit Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 14, pASKxca3
mit Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 15, pJNxca1 mit Nukleotidsequenz
SEQ ID NO: 16, pJNxca2 mit Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 17, pJNxca3
mit Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 18 und pK18mobSacBxca4 mit Nukleotidsequenz
SEQ ID NO: 19, in sich tragen, Bestandteil der Erfindung.
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In
den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende
Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung, deren
Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt,
auf die in den Beispielen genannten Ausführungsformen beschränkt
sein soll.
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Folgende
Abbildung ist Bestandteil der Beschreibung
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1:
Struktur von Xanthan
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Beispiele:
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Die
Analyse der SEQ ID NO: 1 mit Hilfe des TMpred Algorithmus (K.
Hofmann & W.
Stoffel (1993) TMbase – A database of membrane spanning
Proteins segments. Biol. Chem. Hoppe-Segler 374: 166, 1993)
ergab, dass die ersten ca. 50 Aminosäuren einen Membrananker darstellen,
und das Enzym auf der cytoplasmatischen Seite der inneren Membran
von Xanthomonas campestris lokalisiert ist. Das Enzym wurde wie
im Folgenden beschrieben mit vier verschiedenen N-terminalen Signalsequenzen
exprimiert:
Mit der originalen Signalsequenz mit Membrananker;
xca1; SEQ ID NO: 3,
mit einer Signalsequenz von E. coli (ompA),
die das Protein ins Periplasma dirigiert; xca2; SEQ ID NO: 5,
allein
mit der cytoplasmatischen Domäne; xca3; SEQ ID NO: 7 und
mit
der Sequenz des Signalpeptids des periplasmatisch vorliegenden Disulfidbindeproteins
A (DsbA) von X. campestris, die das Protein ebenfalls ins Periplasma
dirigiert; xca4; SEQ ID NO: 9.
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Beispiel 1: Klonierung von xca1 zur Expression
in E. coli
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Das
Gen wurde aus dem Genom von X. campestris ATCC 33913 mit Hilfe der
Primer xcan1: CGTACAGGTCTCCAATGACCACGCTGGAAACGC und xcac: CGTACAGGTCTCTGCGCTATCCGGGCGCCGCGCGAC
amplifiziert und über BsaI in den pASK IBA3 (IBA GmbH Göttingen)
einkloniert. Das so erhaltene Gen, dargelegt in SEQ ID NO: 4, stand
dadurch unter Kontrolle des tet-Promoters und es wurde dadurch eine DNA-Sequenz
kodierend für ein C-terminales Peptid (Strep-Tag) angehängt,
um Reinigung und Detektion auf Protein-Ebene zu erleichtern.
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Nach
Transformation des so erhaltenen Vektors „pASKxca1" mit
Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 13 in E. coli BL21 konnte das Enzyme
exprimiert und die Aktivität bei der Deacetylierung von
Substraten getestet werden.
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Beispiel 2: Klonierung von xca2 zur Expression
in E. coli
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Das
Gen wurde aus dem Genom von X. campestris ATCC 33913 mit Hilfe der
Primer xcan2: CGTACAGGTCTCAGGCCGCGCCGGTGTTCTTGCC und xcac: CGTACAGGTCTCTGCGCTATCCGGGCGCCGCGCGAC
amplifiziert und über BsaI in den pASK IBA2 (IBA GmbH Göttingen)
einkloniert. Das so erhaltene Gen, dargelegt in SEQ ID NO: 6, stand
dadurch unter Kontrolle des tet-Promoters und es wurde dadurch eine DNA-Sequenz
kodierend für ein C-terminales Peptid (Strep-Tag) angehängt,
um Reinigung und Detektion auf Protein-Ebene zu erleichtern. Nach
Transformation des so erhaltenen Vektors „pASKxca2" mit
Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 14 in E. coli BL21 konnte das Enzyme
exprimiert und die Aktivität bei der Deacetylierung von
Substraten getestet werden.
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Beispiel 3: Klonierung von xca3 zur Expression
in E. coli
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Das
Gen wurde aus dem Genom von X. campestris ATCC 33913 mit Hilfe der
Primer xcan3: CGTACAGGTCTCCAATGTCGCATGCATTGTTCGTTGC und xcac: CGTACAGGTCTCTGCGCTATCCGGGCGCCGCGCGAC
amplifiziert und über BsaI in den pASK IBA3 (IBA GmbH Göttingen)
einkloniert Das so erhaltene Gen, dargelegt in SEQ ID NO: 8, stand
dadurch unter Kontrolle des tet-Promoters und es wurde dadurch eine
DNA-Sequenz kodierend für ein C-terminales Peptid (Strep-Tag)
angehängt, um Reinigung und Detektion auf Protein-Ebene
zu erleichtern.
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Nach
Transformation des so erhaltenen Vektors „pASKxca3" mit
Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 15 in E. coli BL21 konnte das Enzyme
exprimiert und die Aktivität bei der Deacetylierung von
Substraten getestet werden.
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Beispiel 4: Expression der Acetylxylanesterase
xca1, xca2 und xca3 in E. coli
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Proteinexpression
wurde in E. coli BL21 im 500 ml-Maßstab in TB/Amp-Medium
durchgeführt, wobei tagsüber eine 5 ml-Vorkultur
im Reagenzglas (angeimpft mit einer Einzelkolonie) in dYT/Amp-Medium
angezüchtet wurde, diese abends in einen 50 ml-Ansatz im
Schüttelkolben (TB/Amp-Medium) überführt
und o/n bei 37°C unter Schütteln inkubiert wurde.
Die 50 ml-Vorkultur wurde in 500 ml des gleichen Mediums überführt,
im Schikanenkolben inkubiert. Dabei wurde das Wachstum der Zellen
durch regelmäßige Messung (ca. jede Stunde) der
optischen Dichte bei 600 nm verfolgt. Bei einer OD von 2 wurde die
Expression des rekombinanten Proteins durch Zugabe von Anhydrotetrazyklin
in einer Endkonzentration von 200 μg/l induziert. Das weitere Wachstum
der nun Enzym produzierenden Zellen wurde durch OD-Messungen im
Abstand von in etwa zwei Stunden kontrolliert und die Inkubation
eingestellt, sobald die Wachstumskurve deutlich abflachte. Im Anschluss
daran wurden die Zellen zentrifugiert (4000 rpm, 20 min, 4°C)
und die Zellmasse durch Wägung bestimmt.
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Expression
der Enzyme wurde durch SDS-Gel-Elektrophorese und/oder Westernblot
bestätigt.
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Beispiel 5: Aktivität der Acetylxylanesterase
xca1, xca2 und xca3 auf para-Nitrophenylacetat
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Eine
Untersuchung der Aktivität der rekombinant exprimierten
Acetylxylanesterase wurde an dem Substrat para-Nitrophenylacetat
(PNPA) durchgeführt. Dessen Acetylgruppe wird von Acetylesterasen
abgespalten, wobei das bei 400 nm absorbierende, gelbliche Nitrophenol
entsteht. Um die Aktivität der Enzymlösungen am
Tecan- Mikrotiterplattenleser jeweils in Doppelbestimmungen zu vermessen,
wurden zunächst in einer 96-well-Platte Ansätze
aus 20 μl Enzymlösung (Überstand aus
Zellaufschluss) und 30 μl Substratlösung (0,67
mM) in 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7) mit einem Endvolumen von 150 μl
gemischt. Zur Negativkontrolle wurden zusätzlich Puffer-Enzym-Lösungen
und Substrat ohne Enzym in derselben Konzentration mitgetestet. Die
Platte wurde im Tecan-Einschubfach bei 30°C inkubiert,
wobei in regelmäßigen Abständen über
einen Zeitraum von 10–20 min die Absorption bei 400 nm
gemessen wurde. Aus dem Anstieg der Absorption pro Sekunde (μE/s)
wurde auf die Aktivität der Enzyme rückgeschlossen.
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Nach
erfolgreicher Klonierung und Expression der Varianten xca1, xca2
und xca3 in BL21 wurde Zellaufschlüsse am Substrat PNPA
auf ihre Aktivität hin untersucht. Tabelle 1 zeigt die
Aktivität repräsentativer Zellaufschlüsse
(BugBuster, Firma Novagen). Es ist zu erkennen, dass die Zellextrakte
eine deacetylierende Aktivität auf PNPA als Substrat besitzen.
| | Freisetzung
Acetat von PNPA Absortion/min |
| xca1 | 1,6
10–4 |
| xca2 | 3,2
10–5 |
| xca3 | 6,1
10–5 |
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Tabelle
1 zeigt die Freisetzung von Acetat aus PNPA durch Zellextrakte von
BL21, die verschiedene Varianten der Acetylxylanesterase XCA expremierten.
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Beispiel 6: Aktivität der Acetylxylanesterase
xca3 auf das Substrat Xanthan
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In
den Ansätzen für eine Untersuchung der Enzymaktivitäten
an den Polysachariden Xanthan wurden soweit wie möglich
die gleichen Bedingungen wie beim „künstlichen"
Substrat PNPA eingehalten. Für eine Endkonzentration von
2% Xanthan im Ansatz wurde eine entsprechend dem Enzymanteil (13,3%)
höher konzentrierte Xanthanlösung hergestellt.
Dazu wurde der Aktivitätspuffer (100 mM TrisHCl-Puffer,
pH 7) auf einer Magnetrührplatte gerührt und das
abgewogene Xanthan nach und nach zugegeben, um die Ausbildung von nicht
lösbaren Xanthan-Niederschlägen zu verhindern.
Anschließend ließ man die Masse weiterrühren
bis sie homogen vorlag. Eine abgewogene Masse an Substratlösung
(aufgrund ihrer hohen Zähigkeit nicht pipettierbar) wurde
mit einem entsprechenden Enzymvolumen oder für eine Negativkontrolle
mit H2O dd vermischt und bei 30°C
inkubiert.
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Die
quantitative Bestimmung des enzymatisch abgespaltenen Acetats erfolgte
mittels Ionenchromatografie über die Anionenaustauschersäule
IonPac® AS9-HC (4 × 250
mm, DIONEX). Das Prinzip dieser Analysemethode beruht darauf, dass
verschiedene Anionen entsprechend ihrer Ladungsdichte unterschiedlich
stark an die Säule binden und daher früher oder
später vom Laufmittel (Na2CO3, 9 mM) von der Säule gewaschen werden,
was einen vorübergehenden Anstieg der Leitfähigkeit
verursacht. Ein derartiger Leitfähigkeitspeak wird von
einem Leitfähigkeitsdetektor registriert, die Peakfläche
wird über Integration bestimmt.
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Nach
der jeweiligen Inkubationszeit wurden die Proben vorbereitet indem
Xanthan mit Isopropanol ausgefällt wurden. Dazu wurde ein
Teil der Probe entnommen, 1:3 mit Isopropanol LiChrosolv (für Flüssigchromatographie)
versetzt und anschließend bei 13000 rpm für 10
Minuten zentrifugiert. Der Acetat enthaltende Überstand
wurde von den ausgefallenen Polysacchariden abgetrennt und, um ein
Verstopfen der Säule durch eventuell noch enthaltene Reste
auszuschließen, über Nacht bei Raumtemperatur
in Eppendorf-Safe Lock Tubes stehen gelassen und am nächsten
Tag noch einmal für 30 min zentrifugiert.
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Zur
Erstellung einer Eichkurve wurden zunächst verschieden
konzentrierte Natriumacetatstandards vermessen, woraus auch die
Lage des Acetatpeaks ermittelt wurde. Probenauftrag und Waschen
erfolgte jeweils mit einem Fluss von 1 ml/min, wobei zwischen der
Injektion der verschiedenen Proben je 25 min gewaschen wurde.
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Xanthan
wurden mit einem Zellaufschluss von xca3 expremierenden BL21 und
BL21 ohne rekombinantes Enzym deacetyliert.
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Acetatmessungen
nach verschieden langen Inkubationszeiten kamen zu den in Tabelle
2 dargestellten Ergebnissen. Nach 24 Stunden konnten durch das Enzym
ca. 60 mg/l Acetat freigesetzt werden. Es wurde eindeutig nachgewiesen,
dass Acetat enzymatisch abgespalten wird.
| t
(h) | BL21
und XCA3 | Hintergrund
BL21 |
| 0 | 0 | 0 |
| 2 | 21 | 0 |
| 8 | 42 | –11 |
| 24 | 56 | –10 |
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Tabelle
2 zeigt die Freisetzung von Acetat aus Xanthan [ppm].
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Nachdem
gezeigt werden konnte, dass das rekombinant exprimierte Enzym an
Xanthan aktiv ist, wurden alle drei Proteine plasmidal in X. campestris
expremiert.
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Beispiel 7: Klonierung von xca1 zur Expression
in X. campestris
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Zur
Expression der Acetylxylanesterase xca1 wurde das kodierende Gen
aus dem pASK-Vektor in den Vektor PJN105 (SEQ ID NO: 11) umkloniert:
pASKxca1 wurde zunächst mit HindIII linearisiert, mit T4-Polynukleotidkinase
behandelt und anschließend wurde mit XbaI die kodierende
Sequenz aus dem Vektor geschnitten, die in den mit XbaI und AleI
restringierten pJN ligiert wurde. Somit wurde das Plasmid pJNxca1
mit Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 16 erhalten. Erfolgreiche Klonierung
wurde mittels Restriktionsanalyse bestätigt.
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Beispiel 8: Klonierung von xca2 zur Expression
in X. campestris
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Zur
Expression der Acetylxylanesterase xca2 wurde das kodierende Gen
aus dem pASK-Vektor in den Vektor pJN105 umkloniert: pASKxca2 wurde
zunächst mit HindIII linearisiert, mit T4-Polynukleotidkinase
behandelt und anschließend wurde mit XbaI die kodierende
Sequenz aus dem Vektor geschnitten, die in den mit XbaI und AleI
restringierten pJN ligiert wurde. Somit wurde das Plasmid pJNxca2
mit Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 17 erhalten.
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Erfolgreiche
Klonierung wurde mittels Restriktionsanalyse bestätigt.
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Beispiel 9: Klonierung von xca3 zur Expression
in X. campestris
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Zur
Expression der Acetylxylanesterase xca3 wurde das kodierende Gen
aus dem pASK-Vektor in den Vektor pJN105 umkloniert: pASKxca3 wurde
zunächst mit HindIII linearisiert, mit T4-Polynukleotidkinase
behandelt und anschließend wurde mit XbaI die kodierende
Sequenz aus dem Vektor geschnitten, die in den mit XbaI und AleI
restringierten pJN ligiert wurde. Somit wurde das Plasmid pJNxca3
mit Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 18 erhalten. Erfolgreiche Klonierung
wurde mittels Restriktionsanalyse bestätigt.
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Beispiel 10: Expression der Acetylxylanesterase
xca1, xca2 und xca3 in X. campestris
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Proteinexpression
wurde in X. campestris LMG8031* durchgeführt; hierzu wurden
die Plasmid pJNxca1, pJNxca2 und pJNxca3 in LMG8031* elektroporiert.
Frische, logarithmisch wachsende 5 ml-Kulturen wurden mit 250 μl
L-Arabinose (0.2 g/ml) induziert und weitere 12 Sunden inkubiert.
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Expression
der Enzyme wurde durch SDS-Gel-Elektrophorese und/oder Westernblot
in Zelllysaten bestätigt.
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Beispiel 11: Xanthan-Produktion in xca1,
xca2 und xca3 expremierenden X. campestris
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280
ml Medium wurden mit frischen Übernachtkulturen von pJNxca1,
pJNxca2 oder pJNxca3 beimpft und nach 6 Stunden Inokulation mit
je 7.5 ml L-Arabinose (0.2 g/ml) induziert. Es wurde für
weitere vier Tage inkubiert.
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150
ml des Kolbeninhalts wurden mit 75 ml NaCl (3%) versehen, und anschließend
wurde das Xanthan mit 450 ml Isopropanol unter Rühren gefällt.
Das Xanthan wurde über Gaze (74 μm) abgetrennt
und im Vakuumtrockenschrank bei 60°C über Nacht
getrocknet.
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Beispiel 12: Acetatanalytik der Xanthan-Produktion
in xca1, xca2 und xca3 expremierenden X. campestris
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Zur
Analytik des Acetylierungsgehaltes der erhaltenen Xanthane wurden
alle Proben mit einer Kugelmühle vermahlen (15 sec, 30/min)
und eine 2 prozentige Xanthanlösung (0.200 g/10 ml) hergestellt.
3,5 g der Xanthanlösung wurden mit 700 μl 1 M
KOH versetzt und für 6 h bei 45°C unter Schutzgas
inkubiert. Anschließend wurden 30 μl einer 1 M
H
3PO
4 Lösung
und 1,2 ml Isopropanol (LiChrosolv für Chromatographie)
pro 0,5 g Xanthan-Lösung hinzugegeben und anschließend
bei 13000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert. Der Acetat
enthaltende Überstand wurde von den ausgefallenen Polysacchariden
abgetrennt und, um ein Verstopfen der Säule durch eventuell
noch enthaltene Reste auszuschließen, über Nacht
bei Raumtemperatur in Eppendorf-Safe Lock Tubes stehen gelassen
und am nächsten Tag noch einmal für 30 min zentrifugiert.
Nach der Fällung wurden die Probe wie in Beispiel 6 beschrieben
vermessen und somit der Acetylierungsgehalt wie in Tabelle 3 gezeigt
bestimmt.
| | mg
Acetat pro g Xanthan | Anteil
an Acetylgruppen pro Pentasaccharid |
| xca1 | 42,7 | 0,65 |
| xca2 | 35,4 | 0,54 |
| xca3 | 46,1 | 0,71 |
| Wildtyp | 54,4 | 0,84 |
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Tabelle
3 zeigt den Acetatgehalt des in xca1, xca2 und xca3 expremierenden
X. campestris produzierten Xanthans im Vergleich zum Wildtyp.
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Es
zeigte sich, dass alle Varianten Xanthan mit einen reduzierten Anteil
an Acetat bildeten und zwar so, dass die Lokalisation der Esterase
in der Zelle die Stärke der Deacetylierung beeinflusst:
Das im Cytoplasma befindliche Enzym (xca3) führt dabei
zur geringsten Reduktion des Acetatgehalts, wahrscheinlich, weil
es in Konkurrenz mit der Acetyltransferase tritt, d. h. nach Abspaltung
von Acetylgruppen kann es zur erneuten Acetylierung kommen. Bei
dem in der Membran verankerten Enzym (xca1) kann es zwar zur selben
Konkurrenzreaktion kommen, durch die Kolokalisation von Enzym und
Substrat an der Membran tritt hier aber eine erhöhte Reduktion
des Acetatgehaltes auf. Das Enzym im Periplasma (xca2) ist keiner
Konkurrenzreaktion ausgesetzt, daher verleiht es auch den niedrigsten
Acetatgehalt. Dass dieser nicht noch niedriger ist, könnte daran
liegen, dass das Signalpeptid für den Export in das Periplasma
von E. coli und nicht von X. campestris stammt und daher der Export
des Proteins nicht optimal ist.
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Beispiel 13: Generierung eines xca4 expremierenden
X. campestris Stammes ohne Fremd-DNA
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Im
Weiteren wurde ein Stamm konstruiert, bei dem xca3 über
eine Xanthomonas eigene Signalsequenz ins Periplasma dirigiert wird
und die Expression unter der Kontrolle der Regulation der Xanthanproduktion
steht. Dazu wurde das Gen der Acetylxylanesterase von X. campestris
mit der Sequenz des Signalpeptids von DsbA von X. campestris fusioniert.
Die Aminosäuresequenz des so erhaltene Enzyms ist in SEQ
ID NO: 9, die korrespondierende kodierende DNA in SEQ ID NO: 10
wiedergegeben. Dieses Enzym wurde anschließend in das gum
Operon in Xanthomonas eingebaut. Um den Einfluss auf die Translation
der downstream des Einbaus befindlichen Gene nicht zu beeinflussen,
wurde ein Teil des gum-Operons dupliziert und das Gen der Acetylxylanesterase
um Teile des Gens von gum E verlängert (Aminosäuresequenz
AGAPR). Dadurch wurde ein neues gum Operon gewonnen, dessen Sequenz
durch Sequenzierung verifiziert wurde.
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Im
Detail wurden PCRs an genomischer DNA von LMG8031* mit Primer dac1n
GTTGCCCAAGCTTTTCATACGCATGACG und dac2n TCGGCAGCAGCGCCATCAGCGTCAGGGCGAAGCGGGTCTTCATCGCGGCGCTCCTGCGGGC
bzw. dac5n CCGGATGCAGGAGCGCCGCGGTGAATACG und dac6n GCAAAGAGCGTCTAGAAGATGGCCC
durchgeführt. Eine weitere PCR mit pASKxca3 als Matrize
mit Primerpaar dac3n CTGATGGCGCTGCTGCCGATCCTGGTCGCATGCAAGGCCCAGGCGCCGGTGTTCTTGCCGC
und dac4n GCGCTCCTGCATCCGGGCGCCGCGCGACC.
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Die
drei aufgereinigten PCR-Produkte wurden einer dritten PCR mit Primerpaar
dacin1 und dacin6 unterworfen.
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Das
resultierende ~ 2600 bp große Fragment wurde über
XbaI und HindIII in den Vektor pK18mobSacB SEQ ID NO: 12 einkloniert.
Erfolgreiche Klonierung des resultierenden Plasmides „pK18mobSacBxca4” mit
Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 19 wurde mittels Restriktionsanalyse
bestätigt.
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E.
coli S17-1 wurde mit pK18mobSacBxca4 per Elektoroporation transformiert,
der erhaltene Stamm wurde mit X. campestris LMG8031* gekreuzt. Varianten
von Xanthomonas, die den Vektor ins Chromosom integriert hatten
wurden durch Selektion auf Kanamycin und Streptomycin erhalten.
Die Integration des Vektors ins Genom per PCR mit dem Primerpaar
glup CACCACGAAGACTAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTG und LZ982 AGCTCTGCAGCTGGCACGACAGGTT,
die beide im Vektor pK18mobSacB binden, überprüft.
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Da
der Vektor pK18mobSacB eine Saccharosesensitivität bewirkt,
können Varianten, die den Vektor ins Genom integriert haben,
auf Saccharose nicht wachsen. Somit wurden Varianten, bei denen
der Einbau von pK18mobSacBxca4 ins Chromosom nachgewiesen werden
konnte auf Saccharose inkubiert. Varianten, bei denen die Vektorsequenz
pK18mobSacB spontan über Rekombination entfernt war, wurden
somit selektiert und von diesen diejenigen, bei denen xca4 verblieben
war mit PCR mit dem Primerpaar XC_gumD3 AACGGTTTCCGCGGTGAGAC und
xcaK GATGGCTGTGGCTGTGATTG) identifiziert. Der erhaltene Stamm „XCA4",
wurde per PCR und Sequenzierung auf korrekte Integration von xca4
und das Fehlen von Punktmutationen überprüft.
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Beispiel 14: Produktion von niedrig acetyliertem
Xanthan in dem Stamm XCA4
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Analog
zu Beispiel 11 und 12 wurde der so erhaltene Stamm fermentiert,
das gebildete Xanthan analysiert und mit dem von Wildtyp verglichen.
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Der
Acetatgehalt des Xanthans konnte auf 0,5%, d. h. 5 mg pro g Xanthan
reduziert werden.
| | mg Acetat pro g Xanthan | Anteil
an Acetylgruppen pro Pentasaccharid |
| xca4 | 5,0 | 0,075 |
| Wildtyp | 47,6 | 0,73 |
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Somit
konnte ein Stamm generiert werden, dessen Gehalt an Acetylgruppen
noch einmal im Vergleich zu xca1 bis 3 expremierenden Stämmen
deutlich reduziert ist. Dieser Stamm enthält zudem keine
Fremd-DNA.
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Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
-
- - US 4296203 [0008]
- - WO 8705939 [0009]
- - JP 2006213867 [0009]
- - WO 9219753 [0010]
- - US 5948651 [0010]
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