DE60127675T2

DE60127675T2 - Neuartige insulin synthase und verfahren zur herstellung von insulin durch anwendung derselben

Info

Publication number: DE60127675T2
Application number: DE60127675T
Authority: DE
Inventors: Tadashi Shizuoka-shi WADA; Masao Shizuoka-shi OHGUCHI
Original assignee: Fuji Nihon Seito Corp
Current assignee: Fuji Nihon Seito Corp
Priority date: 2000-06-28
Filing date: 2001-02-16
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2021-02-17
Also published as: KR20070069221A; EP1298204A1; EP1298204A4; US7214521B2; AU2001234090B2; DE60127675D1; US20030190711A1; KR20030016308A; JP4676672B2; KR100771260B1; EP1298204B1; AU3409001A; WO2002000865A1

Description

Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Inulinsynthase und ein Verfahren zum Herstellen von Inulin unter Verwendung der Inulinsynthase.
Technischer Hintergrund
Inulin ist eine Polysaccharid-Art und ist in der gesamten natürlichen Welt weit verbreitet. Kolloidales Inulin ist in den Knollen von Pflanzen der Familie Asteraceae, wie Dahlien, Jerusalem-Artischocken und Inula japonica oder in der Chicoreewurzel vorhanden. Anders als Stärke löst sich Inulin im warmen Wasser und hat eine Struktur, in der D-Fructofuranose durch Dehydratisierung auf der Fructoseseite der Saccharose durch β-(2→1)-Bindungen polymerisiert ist. Das Molekulargewicht unterscheidet sich in Abhängigkeit von der Kettenlänge der Fructose. Aus Pflanzen stammendes Inulin kann als ein Aggregat aus Verbindungen angesehen werden, die sich in ihren Molekulargewichten unterscheiden. Der durchschnittliche Polymerisierungsgrad reicht gemäß dem Dictionary of Biological Science (IWANAMI SHOTEN, PUBLISHERS, 2. Ausgabe (1978)) von 32 bis 34, und beträgt nach dem Dictionary of Physics and Chemistry (IWANAMI SHOTEN, PUBLISHERS, 3. Ausgabe (1979)) ungefähr 30. Das Molekulargewicht beträgt gemäß dem Dictionary of Biochemistry (TOKYO KAGAKU DOZIN CO., LTD., 1. Ausgabe (1985)) ungefähr 5.000, während es nach der Literatur in W. Praznik (Journal of Chromatography, 348, 187-197 (1985)) ein mittleres Molekulargewicht von 2.282 bis 17.000 ergibt, wobei der Polymerisierungsgrad in Abhängigkeit von den Pflanzenarten etwas variiert. Die molekulare Größe von Inulin wird innerhalb eines bestimmten Bereichs begrenzt.
Da Inulin eine diätetische Faser ist, die schwer zu verdauen ist, hat sie als diätetische Faser Interesse auf sich gezogen. Des weiteren, da ihre Wirkungen beispielsweise die Erhöhung des Wachstums vom Bifidobacterium einschließen, steigt die Nachfrage nach Inulin innerhalb des kürzlichen Booms des Gesundheitsbewußtseins an.
Inulin ist hauptsächlich in Gebieten außerhalb Japans hergestellt werden, wo Inulin durch die Kultivierung einer Pflanze wie Dahlien, Chicoree oder der Jerusalem-Artischocke hergestellt wird, und indem die Extrakte aus den Rhizomen getrocknet werden, und es wird im allgemeinen als Nahrungsmittel konsumiert. Inulin wird in Japan nicht hergestellt, da der kommerzielle Anbau dieser Pflanzen schwierig ist.
Um Inulin in Japan zu gewinnen, gab es daher keine andere Wahl, als dieses zu importieren. Derart importiertes Inulin ist teurer als eine einheimische Substanz, die Funktionen besitzt, die Inulin analog sind. Dieses kann als ein Problem bezüglich der industriellen Verwendung angesehen werden. Zusätzlich hängt die Ausbeute an aus Pflanzen stammendem Inulin von den Anbaubedingungen ab, da das Rohmaterials des Inulins aus der Pflanze extrahiert wird. Daneben ist ein Problem, das mit aus Pflanzen stammendem Inulin in Verbindung gebracht wird das, dass der Inulingehalt sich beispielsweise durch Autolyse reduziert, solange eine Extraktion nicht direkt nach der Ernte durchgeführt wird. Des weiteren ist die Reinigung im Falle des aus Pflanzen stammenden Inulins aufgrund der unterschiedlichen Fructose-Kettenlängen extrem schwierig. Daher wird das derzeit verfügbare, aus Pflanzen stammende Inulin durch grobe Fraktionierung als Rohmaterial in Form einer Lösung, die Inulin mit verschiedenen Kettenlängen enthält kommerzialisiert, und dann durch Sprühen getrocknet. Deswegen bleibt das Problem, dass selbst wenn die Reinheit des Inulins hoch sein sollte, es einen Mangel der Gleichmäßigkeit der Kettenlängen gibt.
Andererseits enthalten die oben erwähnten höheren Pflanzen, aus denen Inulin extrahiert werden kann, offensichtlich ein Enzym, das in der Lage ist, Inulin herzustellen, und es ist bereits von M. Luscher et al. (FEBS Letter 385, 39 (1996)) gezeigt worden, dass Inulin unter Verwendung eines Enzyms aus Saccharose produziert wird, das aus der Pflanze extrahiert wird. Dieser Mechanismus wird durch die gemeinsame Wirkung von zwei Arten von Enyzmen ausgeführt: Saccharose-1-fructosyltransferase (SST), eine Saccharose, die den Transfer von Fructosyl zwischen Saccharosen ausführt, und β-(2→1)Fructanl-fructosyltransferase (FFT), ein β-(2→1)Fructan, welches die Fructosereste zwischen den Fructanen mit einem Polymerisierungsgrad von 3 oder mehr überträgt.
Es ist jedoch nicht praktikabel, diesen Mechanismus in industriellem Maßstab zu verwenden, um eine große Menge an Enzym aus Pflanzenkörpern herzustellen, da es sowohl zeit- als auch arbeitsintensiv ist.
Zusätzlich zu dem aus Pflanzen stammenden Inulin ist ein Verfahren zum Herstellen von Analoga des Inulins durch Einwirkung mikrobieller Enzyme beschrieben worden.
N. Kopeloff et al., beschrieben beispielsweise 1920, dass die Conidiosporen von Aspergillus sydowi Invertaseaktivität besitzen und einen Levan-Typ der Fructose aus Saccharose herstellen (J. Biol. Chem., 43,171 (1920)). Später haben J. R. Loewenberg et al. gezeigt, dass das Polysaccharid eine inulinartige Konformation mit β-(2→1)-Bindungen der Fructose besitzt (Can. J. Microbiol., 3,643, (1957)).
Anschließend haben G. Kawai et al. 1973 berichtet, dass in dem Fall, dass Conidiosporen von Aspergillus sydowi auf Saccharose einwirken gelassen wurden, die Herstellung von Polyfructan und Oligofructan beobachtet wurde, und dass das Polyfructan, wie das aus höheren Pflanzen stammende Inulin in Form einer geraden Kette mit β-(2→1)-Verbindungen vorliegt, aber dass die Glucose an seinem Ende fehlt, und dass die molekulare Größe ungefähr 20.000.000 beträgt, was viel größer ist, als das aus höheren Pflanzen stammende Inulin (Agric. Biol. Chem., 37, (9), 2111, (1973)).
Danach haben Nakakuki et al. ein Verfahren zum Herstellen von Oligofructan und makromolekularem Fructan durch Behandlung von Saccharose mit den Zellen von Aspergillus sydowi vorgeschlagen. Das hergestellte Fructan ist ein lineares Polyfructan mit Glucose an dessen Ende und mit Fructose, die durch β-(2→1)-Bindungen verbunden ist. Das Oligofructan in diesem Fall wurde als eines beschrieben, das einen Polymerisierungsgrad von 5 oder weniger hat, während das makromolekulare Fructan ein Molekulargewicht hat, das von 1,8 × 10⁵ bis 1,4 × 10⁷ reicht (japanische Patentveröffentlichung (nicht geprüfte Anmeldung) Nr. 61-187797).
Harada et al. haben ebenfalls ein Verfahren zum Herstellen von Polyfructan aus Saccharose unter Verwendung der Conidiosporen von Aspergillus sydowi vorgeschlagen, und beschreiben, dass das Molekulargewicht des Polyfructans in diesem Fall um 10.000.000 lag (japanische Patentveröffentlichung (nicht geprüfte Anmeldung) Nr. 5-308885).
Hidaka et al. haben ein Verfahren zum Herstellen eines linearen Fructans mit β-(2→1)-Bindungen vorgeschlagen, indem Fructosyltransferase, welche durch Mikroorganismen hergestellt wird, die zum Genus Aspergillus oder Fusarium gehören, erlaubt wird, auf Saccharose einzuwirken (japanische Patentveröffentlichung (ungeprüfte Anmeldung) Nr. 55-40193). Jedoch ist das in diesem Fall hergestellte Fructan ein Oligosaccharid, worin 1 bis 4 Moleküle der Fructose an Saccharose gebunden sind, so dass es als eine Substanz definiert wird, die von Inulin in der Molekulargröße verschieden ist.
Des Weiteren haben Rosell et al. beschrieben, dass einige der Streptococcus mutans, welche als Pathogen der Dentalkaries angesehen werden, ein Enzym zum Herstellen des Analogons von Inulin angesehen wird (Acta. Chem. Scand., B28, 589). Jedoch unterscheidet sich das Inulin-Analogon von Inulin darin, dass es ein ziemlich riesiges Molekül mit einem Molekulargewicht von 20.000.000 ist, und β-(2→6)-Bindungen in einer geraden Kette der β-(2→1)-Bindungen hat.
Wie oben beschrieben wurde, werden Substanzen, die bisher unter Verwendung von Enzymen hergestellt worden sind, welche aus Mikroorganismen stammen, als polyfructanartiges Inulin beschrieben, um es aus dem aus Pflanzen stammenden Inulin zu unterscheiden, da die Substanzen Eigenschaften haben, die von denen des oben beschriebenen, aus Pflanzen stammenden Inulins stark unterscheiden (beispielsweise ist ihr Molekulargewicht groß oder sie haben unterschiedliche Bindungsformate, verglichen mit dem aus Pflanzen stammenden Inulin).
Daher gab es bis zum heutigen Zeitpunkt keine etablierte Technik zum Herstellen von Inulin unter Verwendung eines Enzyms, das aus einem Mikroorganismus stammt.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin, ein Mittel zur wirksamen Herstellung von Inulin in einer uniformen Qualität mit einer hohen Reinheit in großen Mengen bereitzustellen.
Als Ergebnis ernsthafter Studien, das oben erwähnte Problem zu lösen, haben wir die vorliegende Erfindung durch den Befund erfüllt, dass ein Mikroorganismus, insbesondere ein Mikroorganismus, der zum Genus Bacillus gehört, ein Enzym besitzt, das die oben genannten Probleme lösen kann.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung eine Inulinsynthase bereit, die eine N-terminale Aminosäuresequenz hat, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, und die folgende Funktion und Substratspezifität besitzt: in der Lage, auf Saccharose einzuwirken, um Inulin herzustellen, aber nicht in der Lage, auf Kestose, Maltose, Lactose, Trehalose und Cellobiose einzuwirken.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter bereit:
Ein Verfahren zur Herstellung von Inulin, wobei das Verfahren das Kontaktieren (a) einer Inulinsynthase, welche eine N-terminale Aminosäuresequenz hat, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, und die folgende Funktion und Substratspezifität hat: Fähigkeit zum Einwirken auf Saccharose, um Inulin herzustellen, aber nicht in der Lage ist, auf Kestose, Maltose, Lactose, Trehalose oder Cellobiose einzuwirken; oder (b) eine Kulturflüssigkeit der kultivierten Zellen des Mikroorganismus, der eine Inulinsynthase herstellt; mit Saccharose umfasst, wodurch Inulin hergestellt wird; und

– eine Kultur aus Bacillus sp. 217C-11-Stamm (FERM BP-7450) oder ein mutierter Stamm davon, der eine Inulinsynthase herstellt, die in Anspruch 1 definiert ist. Die Inulinsynthase kann aus einer Kulturflüssigkeit oder kultivierten Zellen eines Mikroorganismus gewonnen werden, oder aus einem behandelten Produkt davon. Der Mikroorganismus gehört typischerweise zum Genus Bacillus und genauer gesagt ist es der Stamm Bacillus sp. 217C-11 (FERM BP-7450).

Die Beschreibung schließt einen Teil oder alle der Inhalte ein, die in der Beschreibung und/oder den Zeichnungen der japanischen Patentanmeldung Nr. 2000-195245 offenbart sind, welches das Prioritätsdokument der vorliegenden Erfindung ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Wirkung der Temperatur auf die Enzymaktivität der Inulinsynthase der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt die Wirkung des pH-Werts auf die Enzymaktivität der erfindungsgemäßen Inulinsynthase.
3 zeigt die Wirkung der Temperatur auf die Stabilität der Inulinsynthase der vorliegenden Erfindung.
4 zeigt die Wirkung des pH-Werts auf die Stabilität der erfindungsgemäßen Inulinsynthase.
5 zeigt den zeitlichen Verlauf der Änderung der Inulinproduktion in der Reaktion nach Beispiel 3.
6 zeigt das ¹³C-NMR-Spektrum für jede Substanz in Beispiel 3. "a", "b" und "c" stellen das ¹³C-NMR-Spektrum der Reaktionsprodukte, des kommerziell erhältlichen Inulins und eines Reagenz bzw. Levans (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dar.
7 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum jeder Substanz in Beispiel 3. "a", "b" und "c" stellen das ¹C-NMR-Spektrum der Reaktionsprodukte, des kommerziell erhältlichen Inulins und eines Reagenz bzw. Levans (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dar.
Beste Art der Durchführung der Erfindung
Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachfolgend im Detail beschrieben.
Die Inulinsynthase der vorliegenden Erfindung hat die Funktion und Substratspezifität der Einwirkung auf Saccharose, um Inulin herzustellen, aber keine Einwirkung auf Kestose, Maltose, Lactose, Trehalose und Cellobiose.
Die oben angegebene Funktion und Substratspezifität sind wie in dem später beschriebenen Beispiel 1 bestimmt worden.
Wie oben beschrieben wurde, ist das aus Pflanzen stammende Enzym dafür bekannt, dass es Inulin aus Saccharose durch gemeinsame Einwirkung von zwei Arten von Enzymen herstellt. Genauer wird Inulin aus Saccharose in einer Zwei-Schritt-Reaktion hergestellt: im ersten Schritt wirkt das Enzym so, dass es ein Molekül aus Kestose (Trissaccharid) aus zwei Molekülen Saccharose herstellt, und im zweiten Schritt wirkt das Enzym so, dass es die beiden polymerisiert.
Im Gegensatz dazu hat die erfindungsgemäße Inulinsynthase den Mechanismus der Einwirkung auf Saccharose, der wesentlich verschieden ist als der des existierenden, aus Pflanzen stammenden Enzyms, da hier im wesentlichen die Freisetzung von Kestose aus Saccharose fehlt, und keine Inulinproduktion beobachtet wird, wenn das erfindungsgemäße Enzym auf Kestose einwirken lassen wird, wie oben beschrieben wurde. Daher ist das erfindungsgemäße Enzym zuvor nicht bekannt gewesen, und ist ein neues Enzym zur direkten Synthese von Inulin aus Saccharose.

Die erfindungsgemäße Inulinsynthase hat die folgenden physikochemischen Eigenschaften:

Molekulargewicht:	45.000-50.000
Optimale Temperatur:	40 bis 50°C
Thermostabilität:	Beginnt graduell inaktiviert zu werden,
	wenn die Temperatur 45°C überschreitet.
	Zeigt eine verbleibende Aktivität von
	70 % bei 50°C und 40 % bis 60°C.
Optimaler pH-Wert:	7 bis 8 (45°C)
pH-Stabilität:	stabil bei pH 6 oder mehr.

Jede der oben genannten Eigenschaften wurde durch Techniken bestimmt, die unten beschrieben werden.
Molekulargewicht: Das Molekulargewicht der Inulinsynthase der vorliegenden Erfindung wurde durch ein Gelfiltrationsverfahren der ersten Protein-Flüssigchromatographie (FPLC) unter Verwendung einer Sephacryl S-300-Säule gemessen, indem eine gereinigte Enzymprobe, die in Beispiel 1 der Beschreibung hergestellt worden ist (unten beschrieben), und indem ein Markerprotein als Standardprotein verwendet wurde, das von Bio-Rad hergestellt wird (Thyroglobulin (Rind), Molekulargewicht 670.000, Gammer-Globulin (Rind), Molekulargewicht 158.000; Ovalbumin (Huhn), Molekulargewicht 44.000; und Myoglobin (Pferd), Molekulargewicht 17.000)).
Optimale Temperatur:
Eine gereinigte Enzymprobe (die gleiche wie oben) wird verwendet. Das Enzym wurde bei jeder Temperatur umgesetzt (37, 45, 50, 60 und 70°C, und pH 7) mit einer Saccharoselösung. Die Glucose, die in der Reaktionslösung hergestellt wurde, wurde quantitativ durch ein Glucose-Oxidase-Verfahren bestimmt, und dann wurde die Aktivität aus der Menge an Glucose bestimmt, die pro Zeiteinheit gewonnen wurde (1 zeigt die Daten). Wie in 1 gezeigt wird, wurde eine Inaktivierung des Enzyms unter den obigen Bedingungen minimiert, und die Enzymreaktion schritt bei 45°C gleichmäßig voran. In dem oben erwähnten Glucose-Oxidase-Verfahren bedeutet 1 Einheit der Enzymaktivität die Menge an Enzym, die für die Herstellung von 1 μmol Glucose pro Minute notwendig ist.
Thermostabilität: Die gereinigte Enzymprobe (die gleiche wie oben), welche bei jeder Temperatur (37, 45, 50, 60 und 70°C und pH 7) für 30 Minuten wärmebehandelt wurde, wurde mit einer Saccharoselösung reagieren gelassen. Die Glucose, die in der Reaktionslösung hergestellt wurde, wurde quantitativ durch das Glucose-Oxidase-Verfahren bestimmt. Die Aktivität wurde aus der Menge an Glucose, die pro Stundeneinheit hergestellt wurde, berechnet (3 zeigt die Daten).
Optimaler pH-Wert: Die gereinigte Enzymprobe (die gleiche wie oben) wurde auf eine Saccharoselösung bei jedem pH-Wert (4,2, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 und 8,9) bei 37°C einwirken lassen. Die Glucose, die in der Reaktionslösung hergestellt wurde, wurde quantitativ durch das Glucose-Oxidase-Verfahren bestimmt. Die Aktivität wurde aus der Menge an Glucose, die pro Stundeneinheit hergestellt wurde, gewonnen (2 zeigt die Daten).
pH-Stabilität: Die gereinigte Enzymprobe (die gleiche wie oben) wurde jeweils bei jedem pH-Wert (4,2, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 und 8,9) hergestellt, für 24 Stunden bei 4°C stehen gelassen, und dann bei 37°C auf eine Saccharoselösung einwirken lassen. Die Glucose, die in der Reaktionslösung hergestellt wurde, wurde quantitativ durch das Glucose-Oxidationsverfahren bestimmt. Die Aktivität wurde aus der Glucosemenge erhalten, die pro Zeiteinheit hergestellt worden ist (4 zeigt die Daten).
Wenn außerdem die Aminosäuresequenz der Inulinsynthase der vorliegenden Erfindung analysiert wurde, wie später in dem Beispiel 1 beschrieben wird, wurde gefunden, dass sie eine Teil-Aminosäuresequenz hat:
Glu-Glu-Ile-Asn-Ser-Asp-Tyr-Thr-Ser-Ile-Trp-Ser-Arg-Gln-Gln-Ala-Glu-Lys-Val-Thr-Pro-Thr-Asp-Lys-Thr-Thr-Ala-Pro-Lys-Ile (SEQ ID NO: 1), die am N-Terminus liegt.
Daher kann die erfindungsgemäße Inulinsynthase beispielsweise durch die Bestimmung der Nukleotidsequenz gewonnen werden, die die oben genannte Teil-Aminosäuresequenz codiert, durch das Entwerfen und Synthetisieren geeigneter Primer, die auf der Nukleotidsequenz beruht, und dann durch das Durchführen der PCR. Sobald die gesamte Nukleotidsequenz, die die Inulinsynthase der vorliegenden Erfindung codiert, bestimmt ist, kann die erfindungsgemäße Inulinsynthase beispielsweise durch Klonierung der gesamten Gensequenz gewonnen werden, und indem der klonierten Sequenz ermöglicht wird, durch bekannte gentechnische Verfahren exprimiert zu werden. Alternativ dazu kann die erfindungsgemäße Inulinsynthase auch aus der Kulturflüssigkeit der kultivierten Zellen eines Mikroorganismus eingesammelt werden, der das Enzym herstellt.
Beispiele des oben erwähnten Mikroorganismus sind nicht besonders beschränkt, sofern sie die Inulinsynthase der vorliegenden Erfindung herstellen, und schließen bekannte Stämme, oder neue Stämme ein, die aus dem Boden, Meereswasser oder ähnlichem isoliert wurden. Alternativ kann ein mutierter Stamm, der durch Mutationsbehandlung (beispielsweise ultraviolette Strahlung, Nitrosoguanidin (NTG) und Ethylmethansulfonat (EMS)) hergestellt worden ist, und ein Enzym mit verbesserter Fähigkeit, Inulin herzustellen, verwendet werden.
Genauer kann der oben erwähnte Mikroorganismus beispielsweise ein Mikroorganismus sein, der zum Genus Bacillus gehört (Inulinsynthase aus dem oben genannten (iii)), insbesondere Bacillus sp. 217C-11-Stamm (FERM BP-7450), welcher international am 14. Juni 2000 nach dem Budapester Vertrag beim internationalen Patenthinterlegungsamt, National Institute of Bioscience and Human-Techonology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology des Ministeriums für Wirtschaft, Handel und Industrie (Tsukuba Central 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan) hinterlegt wurde (das bisherige Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology des Ministeriums für internationalen Handel und Industrie, 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan) (Inulinsynthase aus dem oben erwähnten (iv)).
Wir haben den Bacillus sp.-Stamm 217C-11 (FERM BP-7450) zum ersten Mal aus der Natur isoliert. Als Ergebnis der Untersuchungen, die auf den folgenden mykologischen Eigenschaften nach dem Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Band 2 (1986)) beruhen, ist dieser Stamm als Stamm bestimmt worden, der zum Genus Bacillus gehört.
Mykologische Eigenschaften von Bacillus sp. 217C-11-Stamm (FERM BP-7450)
(a) Morphologie

1) Zellform und Größe: Bacillus, 1 × 2 bis 3 μm
2) Mobilität: beweglich
3) Sporen: Sporenform der Bazillen
4) Gramfärbung: unklar

(b) Wachstumsstadium im Medium

1) Koloniemorphologie: rund, wellenartige Peripherie, geringe Konvexität, Glanz und Cremigkeit

(c) Physiologische Eigenschaften

1) Katalase: positiv
2) Oxidase: positiv
3) Hydrolyse von Gelatine: negativ
4) Wachstumstemperatur: 25 bis 37°C. Kein Wachstum bei 50°C oder mehr
5) Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob (in der Lage, unter anaeroben Bedingungen zu wachsen)
6) Herstellung von Säure aus Saccharid (+: Säureproduktion, –: keine Säureproduktion) Fructose + Glucose + Xylose – Saccharose + Lactose + Maltose + Trehalose + Mannose + Melibiose + Inulin + Cellobiose + Mannitol – Glycerol –
7) Nitratreduzierung: keine Reduzierung
8) β-Galactosidase: positiv
9) Arginindihydrolase: negativ
10) Lysindecarboxylase: negativ
11) Ornithindecarboxylase: negativ
12) Fähigkeit zur Verwendung von Zitronensäure: negativ
13) Herstellung von Schwefelwasserstoff: negativ
14) Urease: negativ
15) Triptophandeaminase: negativ
16) Indolproduktion: negativ
17) Acetoinproduktion: negativ
18) Gelatinase: negativ
19) Hydrolyse von Casein: negativ
20) Hydrolyse von Hippurat: negativ
21) Hydrolyse von Stärke: positiv.

Der Begriff "kultivierte Zellen" kennzeichnet den oben erwähnten Mikroorganismus, der unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird, und es können lebende Zellen oder gefriergetrocknete Zellen sein, oder sie können in Form eines Acetonpulvers oder ähnlichem vorliegen.
Das Enzym der vorliegenden Erfindung kann aus dem behandelten Produkt der kultivierten Zellen ohne Verlust der Enzymfunktion gewonnen werden. Beispiele des behandelten Produkts schließen zerstörte Zellen, Zellextrakte (Flüssigkeit), immobilisierte Zellen und ähnliche der oben erwähnten kultivierten Zellen ein, welche das Enzym der vorliegenden Erfindung enthalten.
Die zerstörten Zellen und Zellextrakte (Flüssigkeit) der kultivierten Zellen bedeuten Substanzen, Extrakte und ähnliche, die durch Zerstören der Zellen durch ein bekanntes Zerstörungsverfahren gewonnen werden, wie beispielsweise Ultraschallaufbrechung, DynoMill-Zerstörung und French-press-Zerstörung. Der Begriff "immobilisierte Zellen" bedeutet, dass die oben erwähnten Zellen, die durch ein bekanntes Immobilisierungsverfahren immobilisiert sind, wie beispielsweise das Entrap-Verfahren oder das Trägerbindungsverfahren und dann einer Vernetzung, falls notwendig, unterworfen werden. Beispiele der Entrapment-Verfahren schließen ein Verfahren unter Verwendung natürlicher Polymere, wie mit Karrageenan oder Alginsäure ein.
Die erfindungsgemäße Inulinsynthase kann aus der Kulturflüssigkeit eines Mikroorganismus gewonnen werden, wie beispielsweise unten beschrieben wird.
Kultivierung eines Mikroorganismus
Zuerst wird der oben genannte Mikroorganismus unter entsprechenden Bedingungen kultiviert.
Ein geeignetes Medium zur Kultivierung des oben erwähnten Mikroorganismus enthält eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, Mineralien und ähnliche, aber die Nährstoffquellen sind nicht hierauf beschränkt. Falls notwendig, können ebenfalls Nährstoffquellen, die normalerweise für die Kultivierung verwendet werden, wie beispielsweise Aminosäuren und Vitamine, entsprechend verwendet werden.
Beispiele der Kohlenstoffquelle, die zum Medium hinzugefügt werden können, schließen bekannte Kohlenstoffquellen in dem Gebiet ein, wie beispielsweise Zucker, beispielsweise Saccharose, Glucose, Fructose und Maltose. Jedoch ist das am meisten bevorzugte Medium zur Kultivierung des Bacillus sp.-Stamms 217C-11 (FERM BP-7450) für einen Mikroorganismus ein Flüssigmedium, das Saccharose als Haupt-Kohlenstoffquelle enthält, was die Aktivität der Inulinsynthase der vorliegenden Erfindung verbessern kann. Diese Kohlenstoffquellen können in entsprechender Konzentration (beispielsweise 0,5 bis 5,0 %) entweder unabhängig oder durch Mischen verwendet werden. Zusätzlich können diese Kohlenstoffquellen in einer isolierten oder gereinigten Form verwendet werden, oder sie können in anderen Substanzen enthalten sein. Beispielsweise kann, wenn Saccharose als Kohlenstoffquelle verwendet wird, ein Saccharoseeinschluss, wie Saccharose-Braunzucker oder Molasse anstelle von gereinigter Saccharose verwendet werden.
Beispiele der Stickstoffquelle, die zum Medium hinzugegeben wird, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, eine organische Stickstoffquelle, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt und Mais-Weiche-Liquor und eine anorganische Stickstoffquelle wie Ammoniumsalz oder Schwefelsäure, Salpetersäure und Phosphorsäure. Die Stickstoffquelle kann unabhängig verwendet werden, oder es kann eine Mischung der Stickstoffquellen verwendet werden.
Beispiele für ein anorganisches Salz, das unabhängig verwendet werden kann, oder in Kombination verwendet wird, schließt ein, aber ist nicht beschränkt auf Sulfat, Hydrochlorid, Carbonat, Nitrat, Phosphat und ähnliche von Kalium, Natrium, Calcium, Magnesium, Mangan, Eisen und ähnlichen.
Der pH-Wert eines Mediums mit der oben erwähnten Zusammensetzung reicht von pH 6 bis 9, und bevorzugt pH 7 bis 8. Die Kultivierungstemperatur reicht bevorzugt von 25°C bis 37°C.
Der oben erwähnte Mikroorganismus kann in einer Schüttelkultur gehalten werden, oder unter Belüftungsbedingungen unter Verwendung eines Fass-Fermentors kultiviert werden. Die Kultivierungsdauer kann ein Zeitraum sein, in dem ein Mikroorganismus wachsen kann, oder länger, und beträgt 5 bis 96 Stunden und bevorzugt 15 bis 72 Stunden.
Einsammeln der Inulinsynthase der vorliegenden Erfindung
Das Einsammeln der Inulinsynthase der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise durch Einsammeln der Kulturflüssigkeit durchgeführt werden, da die enzymatische Aktivität des Inulins hauptsächlich in dem Kulturüberstand der oben erwähnten Mikroorganismen (kultivierten Zellen) gefunden wird.
Die Kulturflüssigkeit kann durch ein bekanntes Fest-Flüssig-Separationsverfahren eingesammelt werden, beispielsweise ein Verfahren zum Zentrifugieren einer Kulturflüssigkeit, oder ein Verfahren zum Abtrennen einer Kulturflüssigkeit durch Membranfiltration oder ähnliche. Das Verfahren ist jedoch nicht hierauf beschränkt.
Die erfindungsgemäße Inulinsynthase, die wie oben beschrieben eingesammelt wird, kann intakt verwendet werden (in einer flüssigen Form, wie beispielsweise der oben erwähnten Kulturflüssigkeit), in dem später erwähnten Verfahren zur Herstellung von Inulin nach der vorliegenden Erfindung als Rohenzymlösung, aber sie wird bevorzugt in einer konzentrierten Form verwendet.
Beispiele für ein Aufkonzentrierungsverfahren, das hier verwendet wird, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Techniken, die einem Fachmann bekannt sind, beispielsweise die Lösungsmittelsedimentierung unter Verwendung von Aceton oder Isopropanol, Ammoniumsulfat-Fraktionierung und Membran-Konzentrierung.
Des Weiteren kann die oben erwähnte Enzymlösung durch ein bekanntes Verfahren immobilisiert werden. Beispiele des Immobilisierungsverfahrens, das hier verwendet wird, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, ein Verfahren zur Bindung an einen Ionenaustauscher, ein Verfahren zur kovalenten Bindung und Adsorption an ein Harz, Membran oder ähnliche, und ein Einfangverfahren unter Verwendung von hochmolekulargewichtigen Substanzen.
Die Inulinsynthase der vorliegenden Erfindung kann intakt als Rohenzym (beispielsweise als die oben erwähnte Rohenzymlösung) verwendet werden, oder sie kann weiter durch ein Verfahren gereinigt werden, das einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, beispielsweise Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Harzen und der Gelfiltrationschromatographie.
Beispiele des oben erwähnten Harzes, das hier verwendet werden kann, schließen ein TSKgel DEAE TOYOPEARL 650 und TOYOPEARL HW55, welche durch die TOSOH CORPORATION hergestellt werden sowie Sephacryl S-300, welches von Pharmacia hergestellt wird.
Spezifisch gesagt kann die Inulinsynthase der vorliegenden Erfindung wie in Beispiel 1 gesammelt und gereinigt werden.
Das Verfahren zur Herstellung von Inulin nach der vorliegenden Erfindung umfasst den Schritt der Inulinsynthase oder der Kulturflüssigkeit oder kultivierter Zellen oder eines Mikroorganismus, der das Enzym herstellt, Saccharose zu kontaktieren, wodurch Inulin hergestellt wird.
Der Satz "Ermöglichen, mit Saccharose in Kontakt zu kommen" bedeutet genauer, dass die Inulinsynthase oder die Kulturflüssigkeit oder die kultivierten Mikroorganismenzellen, die das Enzym herstellen, zu einer Zuckerlösung zugegeben werden, die die Saccharose enthält, und dann wird ihnen ermöglicht, unter Bedingungen, in denen Inulin hergestellt wird zu reagieren, indem Saccharose als Substrat in der Reaktionslösung verwendet wird. So kann eine Reaktionslösung, die das hergestellte Inulin enthält, gewonnen werden.
Die oben erwähnten Mikroorganismen bedeuten das gleiche wie zuvor in der Erläuterung der oben erwähnten erfindungsgemäßen Inulinsynthase beschrieben.
Der Begriff "Kulturflüssigkeit eines Mikroorganismus", der im Verfahren zur Herstellung von Inulin nach der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, schließt die Kulturflüssigkeit selbst (Rohenzymlösung), oder das konzentrierte Produkt ein, das immobilisiert oder aus der Kulturflüssigkeit gereinigt werden kann, wie im Detail oben beschrieben wird.
Der Begriff "kultivierte Zellen", welche für das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Inulin verwendet werden können, schließen intakte lebensfähige Zellen, gefriergetrocknete Zellen oder Zellen in Form von beispielsweise Acetonpulver, wie oben beschrieben, ein.
Des Weiteren schließt, wie oben beschrieben, der Begriff "das behandelte Produkt der kultivierten Zellen", welches für das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Inulin verwendet werden kann, beispielsweise zerstörte Produkte, Zellextrakte (Flüssigkeit) und immobilisierte Zellen der oben erwähnten kultivierten Zellen ein, die notwendigerweise das erfindungsgemäße Enzym enthalten. Die zerstörten Produkte der kultivierten Zellen und der Zellextrakte (Flüssigkeiten) bedeuten Substanzen, Extrakte (Flüssigkeit), und ähnliche, welche durch Aufschließen der Zellen durch ein bekanntes Aufschließungsverfahren gewonnen werden, wie beispielsweise durch Ultraschallaufschließen, DynoMill-Aufschließung und French-press-Aufschließung. Derartige Substanzen und Extrakte (Flüssigkeit) können ebenfalls als Rohenzymlösung verwendet werden. Zusätzlich bedeutet "immobilisierte Zellen" die oben erwähnten Zellen, welche durch bekannte Immobilisierungsverfahren immobilisiert werden, beispielsweise das Einfangverfahren oder ein Trägerbindungsverfahren, und dann das Unterwerfen gegenüber einer Vernetzung, falls notwendig. Beispiele des Einfangverfahrens schließen ein Verfahren der Verwendung natürlicher Polymere ein, wie beispielsweise von Karrageenan oder Alginsäure.
Geeignete Saccharosekonzentrationen der oben erwähnten Zuckerlösung sind beispielsweise 3 bis 68 % (w/w) und bevorzugt 10 bis 60 % (w/w). Andere Inhaltsstoffe, die in der Zuckerlösung enthalten sein können, sind die gleichen wie die, die in der Erklärung der oben erwähnten Inulinsynthase der vorliegenden Erfindung definiert sind.
Die erfindungsgemäße Inulinsynthase oder die Kulturflüssigkeit oder die kultivierten Zellen eines Mikroorganismus, der das Enzym hergestellt, welches für die Reaktion verwendet wird, sollten eine Konzentration besitzen, bei der Saccharose (Substrat) in der Reaktionslösung wirksam verwendet werden kann. Beispielsweise ist eine bevorzugte Konzentration die, die einen Gewinn einer Reaktionslösung ermöglicht, bei der die Aktivität der Inulinsynthase 0,4 bis 20 Einheiten/ml beträgt, wenn 40 bis 60 % (w/w) Saccharose verwendet wird.
Geeignete Bedingungen, die vorzugsweise für die Herstellung von Inulin unter Verwendung von Saccharose als Substrat verwendet werden, bestehen beispielsweise aus einer Reaktionstemperatur von 20 bis 70°C und bevorzugt 40 bis 50°C, und einer Reaktionslösung mit einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 8. Des weiteren kann ein Phosphatpuffer ebenfalls verwendet werden, um den pH-Wert der Reaktionslösung zu bewahren. Die Reaktionsdauer kann in Abhängigkeit von der Menge der Inulinsynthase der vorliegenden Erfindung, die hier verwendet werden soll, entsprechend geändert werden. Beispielsweise beträgt die Reaktionsdauer 0,1 bis 100 Stunden und bevorzugt 0,5 bis 72 Stunden.
Das in der Reaktionslösung hergestellte Inulin kann gemäß einem bekannten Verfahren gereinigt werden.
Beispielsweise wird die gewonnene Reaktionslösung unter Verwendung eines Ionenaustauschharzes, von Aktivkohle oder ähnlicher gereinigt, und dann wird das Produkt unter reduziertem Druck oder unter Verwendung einer Umkehrosmosemembran aufkonzentriert, gefolgt vom Abkühlen, wodurch der Inulinkristall gewonnen wird. Alternativ dazu kann ein organisches Lösungsmittel, wie beispielsweise Ethanol, zu der Reaktionslösung zugegeben werden, um ein Präzipitat herzustellen, und das Inulin einzusammeln. Die Beispiele des Verfahrens, welches hier verwendet wird, sind jedoch nicht auf die oben erwähnten Verfahren beschränkt.
Wenn eine Reaktion bei einer Temperatur unter 40°C durchgeführt wird, kann das Reaktionsprodukt, Inulin, welches sich nicht in der Reaktionslösung lösen kann, während der Reaktion präzipitieren. In diesem Fall kann ein Kristall durch normale Feststoff-Flüssigkeits-Auftrennungsverfahren gesammelt werden.
Genauer gesagt kann das Verfahren zum Herstellen von Inulin nach der vorliegenden Erfindung wie in den Beispielen 2 und 3 dieser Beschreibung umgesetzt werden.
Die Verwendung des Verfahrens zum Herstellen von Inulin nach der vorliegenden Erfindung ermöglicht das Erzielen von Inulinprodukten, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie einen durchschnittlichen Polymerisierungsgrad von 8 bis 20 besitzen, was bedeutet, dass sie, verglichen mit den aus den Pflanzen stammenden Inulin-Standardprodukten, eine begrenzte Molekulargewichtsverteilung haben (genauer, sie haben alle die gleiche Aktivität).
Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Inulinsynthase kann Inulin mit gleichmäßiger Qualität wirksam in großen Mengen unter Verwendung von günstiger Saccharose als Ausgangsmaterial produziert werden. Es kann leicht durch eine Person des Fachgebiets abgeleitet werden, dass die kombinierte Verwendung eines Substrats, das aus Inulin oder Fructan als Ausgangsmaterial hergestellt wird, durch dieses Enzym die direkte Herstellung aus Saccharose ermöglicht.
Beispiele für eine Substanz, die unter Verwendung von Inulin oder Fructon als Ausgangsmaterial hergestellt wird, schließt Inulo-Oligosaccharide, cyclische Disaccharide der Fructose (Difructoseanhydrid) und Cycloinulo-Oligosaccharide (Cyclofructan) und ähnliche ein, ist aber nicht darauf beschränkt.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele genauer beschrieben. Jedoch beabsichtigen diese Experimente nicht den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung zu begrenzen.
[Beispiel 1] Funktion und Substratspezifität der erfindungsgemäßen Inulinsynthase
Als Weg der Bestätigung, dass die Inulinsynthase der vorliegenden Erfindung ein neues Enzym ist, das sich von vorhandenen, aus Pflanzen stammenden Enzymen unterscheidet, haben wir untersucht, ob Inulin hergestellt wird, wenn dem Enzym ermöglicht wird, auf Kestose einzuwirken. Zusätzlich haben wir untersucht, ob Inulin hergestellt wird, wenn dem Enzym ermöglicht wird, auf ein anderes Disaccharid als Saccharose einzuwirken, einschließlich Lactose, Trehalose, Maltose und Cellobiose, um die Substratspezifität des Enzyms zu untersuchen.
(Herstellung einer gereinigten Enzymprobe der Inulinsynthase der vorliegenden Erfindung)
Der Stamm Bacillus sp. 217C-11 (FERM BP-7450) wurde in einem Flüssigmedium (pH 7 bis 8), enthaltend 0,5 bis 2 % (G/V) Saccharose, 1 % Pepton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,2 Dikaliumphosphat und 0,05 % Magnesiumsulfat bei 30°C für zwei Tage in einer Schüttelkultur gezüchtet. Als nächstes wurde festes Ammoniumsulfat zu dem Kulturüberstand hinzugegeben, und dann wurde eine Fraktion, die bei einer 70%igen Sättigung präzipitiert unter Verwendung eines Zentrifugalseparationsapparats eingesammelt. Danach wurde das Präzipitat in 20 mM Phosphatpuffer bei pH 7,0 gelöst, in ein Dialyseröhrchen gegeben und dann hinreichend mit dem gleichen Puffer dialysiert, wodurch eine Rohenzymlösung des Enzyms der vorliegenden Erfindung gewonnen wurde. Anschließend wurde die Rohenzymlösung einer Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von TSKgel DEAE TOYOPEARL 650 und TOYOPEARL HW55, hergestellt von TOSOH CORPORATION, und Sephacryl S-300, hergestellt von Pharmacia, unterworfen, entsprechend den Standardverfahren untezogen, wodurch die Inulinsynthase der vorliegenden Erfindung gereinigt wurde. Die so gereinigte Inulinsynthase wurde in dem nächsten Verfahren als gereinigte Enzymprobe verwendet.
(Analyse der Teil-Aminosäureseguenz der gereinigten Enzymprobe)
Die N-terminale Aminosäuresequenz der oben erwähnten gereinigten Enzymprobe wurde nach den folgenden Verfahren bestimmt.
Zuerst wurde die gereinigte Enzymprobe einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (7,5 %) gemäß Standardverfahren unterzogen, auf eine PVDF-Membran übertragen und dann mit Coomassie brilliant blue gefärbt. Ein Teil der Membran, der einer Zielbande von 50 kDa entspricht, wurde ausgeschnitten und hinreichend mit Wasser gewaschen. Die ausgeschnittene Membran wurde für 1 Stunde mit 0,5 % Polyvinylpyrrolidon behandelt. Des weiteren wurde die Membran mit ausreichend Wasser gewaschen, und dann wurde die N-terminale Aminosäuresequenz mit dem HP G1005A Protein-Sequenziersystem (Hewlett-Packard Company) analysiert.
Im Ergebnis wurde die N-terminale Aminosäuresequenz der oben gereinigten Enzymprobe bestimmt und war wie folgt:
Glu-Glu-Ile-Asn-Ser-Asp-Tyr-Thr-Ser-Ile-Trp-Ser-Arg-Gln-Gln-Ala-Glu-Lys-Val-Thr-Pro-Thr-Asp-Lys-Thr-Thr-Ala-Pro-Lys-Ile (SEQ ID NO: 1).
(Reaktion zur Herstellung von Inulin)
Eine 100 mM Lösung jedes der oben erwähnten Substrate wurde hergestellt. Dann wurde ein äquivalentes Volumen der oben gereinigten Enzymprobe (0,74 μ/ml) zu der Lösung hinzugegeben, gefolgt von der Umsetzung bei 37°C für 17 Stunden. Die Reaktionsprodukte wurden durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) analysiert.
Die HPLC-Bedingungen waren wie folgt. HPLC-Bedingungen

Säule: ULTRON PS-80N (8 × 300 mm), SHINWA CHEMICAL

INDUSTRIES, LTD.

Lösungsmittel: Wasser

Fließrate: 0,5 ml/min

Temperatur: 50°C

Detektor: Differenzial-Refraktometer
Im Ergebnis war Saccharose das einzige Substrat, auf das das erfindungsgemäße Enzym einwirkte, um Inulin herzustellen. Das Enzym wirkte auf alle Disaccharide außer Saccharose nicht ein. Wenn das Enzym auf Kestose einwirkte, blieben 90 % oder mehr des Enzyms intakt, und das Hauptprodukt war Nystose und es wurde kein Inulin hergestellt.
[Beispiel 2] Bestimmung der Kohlenstoffquelle, die für die Kultivierung von Mikroorganismen geeignet ist
Um zu bestimmen, welche Kohlenstoffquelle für die Kultivierung eines Mikroorganismus vorzuziehen ist, wenn die erfindungsgemäße Inulinsynthase von dem Mikroorganismus gewonnen wird, wurde das folgende Experiment unter Verwendung des Stamms Bacillus sp. 217C-11 (FERM BP-7450) durchgeführt.
(Herstellung einer Rohenzymlösung)
Jeweils 2 % der Kohlenstoffquellen, die in Tabelle 1 unten gezeigt sind, wurden zu einem Medium hinzugegeben (pH 8), das 1 % Pepton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,3 % Malzextrakt, 0,2 % Kaliumphosphat und 0,05 % Magnesiumsulfat-7-hydrate enthielt, und dann für die Herstellung nach Standardverfahren sterilisiert. Dann wurde eine Platinschlaufe des Stamms Bacillus sp. 217C-11 (FERM BP-7450) in jedes dieser Medien inokuliert. Die Schüttelkultur wurde bei 30°C für 2 Tage durchgeführt, und dann wurde die Aktivität der Inulinsynthase der vorliegenden Erfindung, die in dem Kulturüberstand enthalten war, gemessen.
(Messung der Enzymaktivität)
0,2 ml des oben erwähnten Kulturüberstands (Enzymlösung) wurden zu 0,2 ml einer 20%igen Saccharoselösung gegeben, welche in 40 mM Phosphatpuffer (pH 7) gelöst war. Das Gemisch wurde bei 37°C für 120 Minuten einwirken lassen, und dann für 5 Minuten gekocht, um die Reaktion zu stoppen. Die hergestellte Glucose der Reaktion wurde durch das Glucose-Oxidase-Verfahren gemessen. Das liegt daran, dass der Stamm Bacillus sp. 217C-11 (FERM BP-7450) fast keine Intervaseaktivität besitzt, um Saccharose in Glucose und Fructose zu degradieren, und Glucose als Nebenprodukt herstellt, wenn es Inulin durch die Enzymreaktion unter Verwendung von Saccharose als Substrat herstelle. Hier wurde die Enzymaktivität einer Einheit als die Menge an Enzym angesehen, die ausreicht, in 1 Minute 1 μmol Glucose herzustellen. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse.
Tabelle 1 Verschiedene Kohlenstoffquellen, die zu dem Medium hinzugegeben worden sind, und die Aktivität des daraus erhaltenen Enzyms
Wie aus Tabelle 1 klar wird, wurde eine starke Aktivität erzielt, wenn der Stamm Bacillus sp. 217C-11 (FERM BP-7450) unter Verwendung von Saccharose oder einem Material, das diese enthält (Melasse), als Kohlenstoffquelle kultiviert wurde.
[Beispiel 3] Herstellung von Inulin
(1) Herstellung einer Rohenzymlösung
Ein Medium (pH 8), enthaltend 2 % Saccharose, 1 % Pepton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,3 % Malzextrakt, 0,2 % Kaliumphosphat und 0,05 % Magnesiumsulfat-7-hydrat wurde für die Herstellung gemäß Standardverfahren sterilisiert. Dann wurde eine Platinschlaufe des Stamms Bacillus sp. 217C-11 (FERM BP-7450) in jedes dieser Medien inokuliert. Die Schüttelkultur wurde für 2 Tage bei 30°C durchgeführt und dann wurde ein Kulturüberstand zur Zentrifugierung gewonnen, um die Bakterien zu entfernen.
Die Aktivität des in dem Kulturüberstand enthaltenen Enzyms betrug 0,8 U/ml, wenn sie in gleicher Weise gemessen wurde wie in Beispiel 1 oben.
Ammoniumsulfat wurde zu dem Kulturüberstand bei einer 70%igen Sättigung hinzugegeben. Das erhaltene Präzipitat wurde in einem 20 mM Phosphatpuffer (pH 7) gelöst, und dann gegen die Pufferlösung dialysiert. Das Produkt wurde als Enzymlösung in den folgenden Beispielen verwendet. Die Enzymaktivität betrug dieses Mal 16 U/ml.
(2) Reaktion zum Herstellen von Inulin unter Verwendung einer Rohenzymlösung
2 g Saccharose wurden in 2,75 ml 44 mM Phosphatpuffers (pH 7) gelöst, und dann wurde 0,25 ml der in (1) oben erhaltenen Enzymlösung zu der Lösung zugegeben, um eine Reaktion bei 37°C durchzuführen. Dann wurde ein Teil der Reaktionslösung durch HPLC unter ähnlichen Bedingungen analysiert, wie in Beispiel 1 verwendet.
5 zeigt die Ergebnisse. Wie aus der Figur klar wird, wurde Inulin hergestellt, wenn die oben erwähnte Enzymlösung auf Saccharose einwirken lassen wurde. Des weiteren stieg das Reaktionsprodukt über die Zeit an und erreichte ein Gleichgewicht innerhalb von ungefähr 3 Tagen. Die Ausbeute aus Saccharose betrug ungefähr 50 %.
(3) Identifizierung des Reaktionsprodukts
Eine signifikante Menge eines Inulinkristalls, welcher aus der Reaktionslösung, die in (2) oben gewonnen wurde, wurde durch Zentrifugieren (10.000 Upm, 15 min) abgetrennt.
Anschließend wurde der Feststoffanteil in Wasser gelöst, auf ungefähr 5 %, und ein 3faches Volumen an Ethanol wurde zu der Lösung zur Präzipitierung hinzugegeben, und dann wurden die Kristalle gewaschen. Dieses Verfahren wurde zweimal wiederholt. Schließlich wurde das erhaltene Präzipitat gefriergetrocknet, und dann gewogen. Das Gewicht betrug 350 mg.
Eine HPLC wurde an der Probe in gleicher Weise wie in (2) oben durchgeführt. Die Reinheit betrug 98,8 %. Zahlreiche Identifizierungs-/Untersuchungstests wurden bei dem erhaltenen Kristall wie folgt durchgeführt.
(a) Kernmagnetresonanzabsorption (NMR)
Zusätzlich zu dem erhaltenen Kristall oben wurde die gleiche Analyse für Levan durchgeführt, das aus Serratia Levanicum stammte (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) mit β-(2→6)-Bindungen als Referenzbeispiel, indem kommerziell erhältliches Inulin (Produktname RAFTILINE HP, hergestellt von ORAFTI) als Standard verwendet wurde. Das Spektrometer, das als NMR-Apparat verwendet wurde, war hier JEOL lambda-500 FT-NMR-Spektrometer 500 MHz und die Messung wurde in Deuteriumoxid durchgeführt.
6 zeigt alle 13C-NMR-Spektren, die bei jeder Substanz gewonnen wurden, und 7 zeigt alle 1H-NMR-Spektren. Als Ergebnis eines Vergleichs hiervon wurde gefunden, dass der obige Kristall ein Gipfelmuster zeigte, das mit dem von Inulin identisch ist.
(b) Abschätzung des Molekulargewichts mittels HPLC
Der oben erwähnte Kristall wurde einer Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) unter den unten gezeigten Bedingungen unterworfen, und dann wurde das Molekulargewicht abgeschätzt. Zusätzlich wurden RAFTILINE HP (Durchschnitts-Polymerisierungsgrad: 23) und RAFTILINE ST (Durchschnitts-Polymerisierungsgrad: 10), beide hergestellt von ORAFTI, als Standardproben verwendet. Eine analytische Kurve wurde erstellt und berechnet. Die Rückhaltedauer von RAFTILINE HP betrug 17,23 Minuten, und die Rückhaltedauer von RAFTILINE ST betrug 17,75 Minuten, und die Rückhaltedauer der oben erwähnten kristallinen Substanz betrug 17,39 Minuten. Es wurde geschätzt, dass der durchschnittliche Polymerisierungsgrad der oben erwähnten kristallinen Substanz 18 war. HPLC-Bedingungen

Säule: TOSOH TSK-GEL G3000PWXL (7,8 × 300 mm)

Lösungsmittel: Wasser

Fließrate: 0,5 ml/min

Temperatur: 50°C

Detektor: Differenzialrefraktometer
(c) Verdauungstest mit Inulinase
Die Reaktionslösung, die erhalten wurde, nachdem kommerziell erhältliche Inulinase (Produktname: Fructozyme L, hergestellt von NOVO) ermöglicht wurde, auf den oben erwähnten Kristall einzuwirken, wurde mittels HPLC unter den Bedingungen analysiert, die dem Beispiel 1 ähneln. Als Ergebnis wurde der obige Kristall in Glucose und Fructose vollständig degradiert, und das Herstellungsverhältnis betrug 1:17. Der durchschnittliche Polymerisierungsgrad des Kristalls wurde als 18 eingeschätzt.
(d) Massenspektrum
Wenn man das Molekulargewicht des oben erwähnten Kristalls als Massenspektrum maß, reichte der durchschnittliche Polymerisierungsgrad des Kristalls von 17 bis 18.
Auf Grundlage der obigen Ergebnisse (a) bis (d) wurde bestimmt, dass der erhaltene Kristall, unter Verwendung von Saccharose als Ausgangsmaterial, Inulin war.
[Beispiel 4]
(1) Herstellung von Rohenzym
Die Kultivierung wurde unter gleichen Bedingungen wie in Beispiel 3 (1) durchgeführt, und eine Rohenzymlösung mit einer enzymatischen Aktivität von 0,6 Einheiten/ml wurde hergestellt.
(2) Reaktion zum Herstellen von Inulin unter Verwendung des Rohenzyms
80 g Saccharose wurden zu 20 ml 200 mM Phosphatpuffer (pH 7) und 100 ml einer Rohenzymlösung hinzugegeben und gelöst. Die Reaktion wurde für 4 Tage unter Rühren bei 147 Upm bei 37°C durchgeführt.
Als nächstes wurde die Reaktionslösung durch eine HPLC unter Bedingungen analysiert, die Beispiel 1 ähneln. Das Reaktionsprodukt nahm über die Zeit zu und erreichte innerhalb von 3 oder 4 Tagen ein Gleichgewicht. Zusätzlich betrug die Ausbeute aus Saccharose ungefähr 37,5 %.
(3) Identifizierung des Reaktionsprodukts
Die in (2) oben erhaltene Reaktionslösung wurde ungefähr 2fach aufkonzentriert, indem eine Umkehrosmosemembran verwendet wurde, und dann auf 4°C abgekühlt, um einen Inulinkristall abzutrennen. Die Feststoff-Flüssigabtrennung wurde durch Zentrifugieren (10.000 Upm, 15 min) durchgeführt, um einen präzipitierten Teil einzusammeln, welcher dann gefriergetrocknet wurde und in gleiche Weise wie in Beispiel 2 (2) gewogen wurde. Das Gewicht betrug 5 g. Die Reinheit dieser Probe wurde mittels HPLC (unter Bedingungen, die Beispiel 1 ähneln) analysiert und betrug 99,6 %. Es wurden zahlreiche Identifizierungs-/Bestätigungstests an dem erhaltenen Kristall in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 3 (3) durchgeführt, und zwar wie folgt.
(a) Kernmagnetresonanzabsorption (NMR)
Der obige Kristall zeigte ein Gipfelmuster, das identisch war mit Inulin. Ein Spektrometer, das als NMR-Apparat verwendet wurde, war das JEOL lambda-500 FT-NMR-Spektrometer 500 MHz und die Messung wurde in Deuteriumoxid durchgeführt.
(b) Abschätzung des Molekulargewichts mittels HPLC
Das Molekulargewicht des oben erwähnten Kristalls wurde durch mehrmaliges Analysieren unter HPLC-Bedingungen, die im Beispiel 3 (3) gezeigt sind, abgeschätzt. Im Ergebnis betrug die Rückhaltezeit von RAFTILINE HP 17,23 min, die Rückhaltezeit von RAFTILINE ST betrug 17,75 min und die Rückhaltedauer der oben erwähnten kristallinen Substanz betrug 17,59 min, 17,70 min, 17,78 min bzw. 17,82 min. Es wurde geschätzt, dass der durchschnittliche Polymerisierungsgrad der kristallinen Substanz von 8 bis 14 reichte.
(c) Massenspektrum
Wenn man das Molekulargewicht des oben erwähnten Kristalls in einem Massenspektrum maß, reichte der durchschnittliche Polymerisierungsgrad des oben erwähnten Kristalls von 13 bis 14.
Auf Grundlage der obigen Ergebnisse (a), (b) und (c) wurde bestimmt, dass die Substanz, welche unter Verwendung von Saccharose als Ausgangsmaterial gewonnen wurde, Inulin war.
Alle Publikationen, Patente und Patentanmeldungen, die hierin zitiert sind, werden durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit auf genommen.
Industrielle Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Inulinsynthase zum Herstellen von Inulin gleichmäßiger Qualität mit hoher Reinheit in großen Mengen in einem effizienten und industriell praktikablen Verfahren dar, und ein Verfahren zum Herstellen von Inulin unter Verwendung der neuen Inulinsynthase.
Sequenzliste

Claims

Inulinsynthase, die eine N-terminale Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, aufweist und die folgende Funktion und Substratspezifität besitzt: in der Lage, auf Saccharose einzuwirken, um Inulin herzustellen, aber nicht in der Lage, auf Kestose, Maltose, Lactose, Trehalose und Cellobiose einzuwirken.
Inulinsynthase gemäß Anspruch 1, welche aus Bacillus sp. 217C-11-Stamm (FERM BP-7450) erhältlich ist.
Verfahren zur Herstellung von Inulin, wobei das Verfahren das Kontaktieren (a) einer Inulinsynthase, die eine N-terminale Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, aufweist und die folgende Funktion und Substratspezifität hat: in der Lage, auf Saccharose einzuwirken, um Inulin herzustellen, aber nicht in der Lage, auf Kestose, Maltose, Lactose, Trehalose und Cellobiose einzuwirken, oder (b) einer Kulturflüssigkeit oder kultivierter Zellen eines Mikroorganismus, der eine solche Inulinsynthase herstellt, mit Saccharose, wodurch Inulin hergestellt wird, umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 3, worin dieser Mikroorganismus Bacillus sp. 217C-11-Stamm (FERM BP-7450) ist.
Kultur eines Bacillus sp. 217C-11-Stammes (FERM BP-7450) oder eines Mutantenstammes davon, welcher eine Inulinsynthase herstellt wie in Anspruch 1 definiert.