KR100771260B1

KR100771260B1 - 신규한 이눌린 합성효소 및 이를 이용하는 이눌린의 제조방법

Info

Publication number: KR100771260B1
Application number: KR1020027017795A
Authority: KR
Inventors: 다다시와다; 마사오오구치
Original assignee: 후지 니혼 세이토 코퍼레이션
Priority date: 2000-06-28
Filing date: 2001-02-16
Publication date: 2007-10-29
Also published as: AU3409001A; AU2001234090B2; EP1298204A1; US7214521B2; EP1298204A4; DE60127675T2; US20030190711A1; JP4676672B2; EP1298204B1; DE60127675D1; WO2002000865A1; KR20070069221A; KR20030016308A

Abstract

본 발명은 슈크로오스(sucrose)에 작용하여 이눌린(inulin)을 생성하지만, 케스토오스(kestose), 말토오스(maltose), 락토오스(lactose), 트레할로오스(trehalose), 셀로비오스(cellobiose)에는 작용하지 않는 작용 및 기질특이성을 갖는 신규한 이눌린 합성효소 및 당해 효소를 생산하는 미생물의 배양액, 또는 배양균체 또는 그 처리물을 슈크로오스에 접촉시켜 이눌린을 생성하는 것을 특징으로 하는 이눌린의 제조방법에 관한 것이다.

이눌린(inulin), 슈크로오스(sucrose), 바실러스 속, 평균중합도

Description

신규한 이눌린 합성효소 및 이를 이용하는 이눌린의 제조방법{Novel inulin synthase and process for producing inulin by using the same}

본 발명은 신규한 이눌린(inulin) 합성효소 및 이를 이용하는 이눌린의 제조방법에 관한 것이다.

이눌린(inulin)이란 다당류의 일종으로 자연계에 널리 분포하고 있으며, 달리아(dahlia), 돼지감자, 목향(elecampane) 등의 국화과 식물의 덩이줄기나 치커리(chicory)의 뿌리 등에 콜로이드 상으로 존재하는 물질이다. 그 성질은 전분과는 달라서 온수에 용해되며, 그 구조는 슈크로오스(sucrose)의 프룩토오스(fructose) 측에 D-프룩토오스가 β-(2→1)결합에 의해 탈수중합하여 형성된 구조로 이루어져 있다. 분자량은 프룩토오스 사슬의 길이에 따라 다르며, 식물유래의 이눌린은 분자량이 다른 화합물들의 집합체라고 할 수 있다. 그 평균중합도에 관하여는 생화학사전(이와나미서점. 제2판(1978))에 의하면 32~43, 이화학사전(이와나미서점. 제3판(1979))에 의하면 약 30, 생화학사전(동경화학동인, 제1판(1985))에 의하면 분자량 약 5000, W.praznik 등의 문헌(Journal of Chromatography, 348, 187-197(1985))에 의하면, 그 중합도는 식물의 종류에 따라 다소의 차이가 있지만 평균분자량은 2282-17000이고, 그 분자 크기는 일정한 범위 내에 한정되어 있다고 한다.

이눌린은 난쇄화성의 식물섬유이기 때문에 식이섬유로서 주목되고 있으며, 더욱이 비피더스균의 증식효과 등이 있기 때문에 근래의 건강지향붐과 맞물려 그 수요가 지속적으로 증가하고 있는 추세이다.

종래, 이눌린은 주로 해외에서 생산되어 왔다. 해외에서는 달리아, 치커리, 돼지감자라는 식물을 재배하여 그 뿌리줄기로부터 착즙액을 건조시켜 제조하며, 이를 일반적인 식재로 이용하고 있다. 한편, 일본에서는 이들 식물의 상업적 재배가 곤란하기 때문에 이눌린은 제조되지 않고 있다.

그 때문에 이눌린의 입수는 수입에 의존하지 않을 수 없어서, 가격도 국산의 유사기능을 갖는 물질에 비해 고가이므로 산업상 이용에 문제가 있다. 식물유래의 이눌린은 그 추출원료가 식물이기 때문에 수득량이 작황에 따라 좌우되며, 수확 후 즉시 추출하지 않으면 자기소화 등에 의해 이눌린 함량이 현저히 감소하게 되는 문제점이 있다. 또한, 식물유래의 이눌린의 경우 프룩토오스의 사슬길이가 성기기 때문에 정제가 극히 곤란한 문제가 있다. 이 때문에, 현재 이용할 수 있는 식물유래의 이눌린은 다양한 사슬길이를 갖는 이눌린이 함유되어 있는 용액을 원료로 하여 적당히 분획한 후 분무건조시켜 상품화한 것이다. 따라서, 이눌린으로서의 순도는 높아도 사슬길이의 면으로 보면 균일성이 결여되어 있다는 과제가 남아 있다.

반면, 상기와 같은 이눌린을 추출할 수 있는 고등식물에는 당연한 얘기지만 이눌린을 생성하는 효소가 함유되어 있고 이와 같은 식물로부터 추출하여 얻어진 효소를 사용하여 슈크로오스로부터 이눌린을 생성하는 것은 이미 M.Luscher 등에 의해 규명되어 있다(FEBS Letter 385, 39(1996)). 그 메커니즘은 슈크로오스간의 프룩토실(fructosyl) 전이를 수행하는 슈크로오스: 슈크로오스 1-프룩토실 트랜스퍼라아제(SST; sucrose 1-frultosyltransferase)와, 중합도 3 이상의 프룩탄(fructan)끼리의 전이를 수행하는 β-(2→1)프룩탄: β-(2→1)프룩탄 1-프룩토실트랜스퍼라아제(FFT; fructan 1-fructosyltransferase)라는 2종의 효소의 공동작용에 의한 것이라고 한다.

그러나, 식물체로부터 효소를 대량으로 조제하는 것은 상당한 시간과 노력을 요구하기 때문에 현실적으로 공업적 규모로는 이용되지 않고 있다.

또한, 식물유래의 이눌린 이외에도 미생물의 효소를 작용시켜 이눌린 유사물질을 제조하는 방법 또한 보고되어 있다.

예를 들어, 1920년에 N. Kopeloff 등에 의하여 아스퍼질러스 시도위(Aspergullus sydowi)의 분생포자가 인버타아제(invertase) 활성을 갖고 슈크로오스로부터 레반(levan) 타입의 프룩탄을 생성한다는 것이 보고되어 있고(J. Biol. Chem., 43,171(1920)), 그 이후 J. R. Loewenberg 등에 의해 그 다당류가 프룩토오스의 β-(2→1) 결합으로 된 이눌린타입의 구조를 갖고 있는 것이 명확히 규명되었다(Can. J. Microbiol., 3,643, (1957)).

그 후, 1973년에 G. Kawai 등은 아스퍼질러스 시도위(Aspergillus sydowi)의 분생포자를 슈크로오스와 함께 반응시킴으로써 폴리프룩탄(polyfructan) 및 올리고 프룩탄(oligofructan)의 생성을 확인하였으며 이들은 고등식물 유래의 이눌린과 같이 β-(2→1) 결합으로 된 직쇄상 폴리프룩탄이지만 말단에 글루코오스가 존재하지 않고 분자의 크기도 고등식물유래의 이눌린에 비해서도 훨씬 큰 2000만 정도인 것을 보고하였다(Agric. Biol. Chem., 37, (9), 2111, (1973)).

또한, 나카쿠키(中久喜) 등은 슈크로오스를 아스퍼질러스 시도위(Aspergillus sydowi) 균체에서 처리하여 올리고프룩탄과 고분자 프룩탄을 얻는 방법에 대하여 제안하였다. 생성된 프룩탄의 구조는 말단에 글루코오스를 갖고 프룩토오스가 β-(2→1)결합한 직쇄상 폴리프룩탄인데, 이 경우의 올리고프룩탄은 중합도가 5 이하인 반면, 고분자 프룩탄은 분자량이 1.8×10⁵ ~ 1.4×10⁷의 범위에 해당한다고 기재되어 있다(특개소61-187797).

하라다(原田) 등도 아스퍼질러스 시도위(Aspergillus sydowi)의 분생포자를 사용하여 슈크로오스로부터 폴리프룩탄을 제조하는 방법에 대하여 제안하였는데, 이 때의 폴리프룩탄의 분자량은 1000만 정도인 것으로 기재하고 있다(특개평5-308885).

히다카(日高) 등은 슈크로오스에 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 혹은 푸사리움(Fusarium) 속에 속하는 미생물이 생산하는 프룩토실트랜스퍼라아제를 작용시켜, β-(2→1) 결합한 직쇄상 프룩탄을 제조하는 방법을 제안하였다(특원소55-40193). 그러나, 이 경우에 생성된 프룩탄은 슈크로오스에 프룩토오스가 1~4분자 결합한 올리고당이어서 분자의 크기 면에서 이눌린과는 다른 것이라고 할 수 있다.

또한, 충치의 원인균으로 알려져 있는 스트렙토코쿠스 뮤탄스(streptococcus mutans) 중에도 이눌린 유사물을 생성하는 효소를 생산하는 것이 있다는 것을 Rosell 등이 보고하였다(Acta. Chem. Scand., B28, 589). 그러나, 그 이눌린 유사물은 분자량이 2000만으로 이눌린에 비해 상당히 거대한 분자이고, 게다가 β-(2→1)결합의 직쇄에 β-(2→6)결합이 함유되어 있다는 점에서 이눌린과는 다른 물질이라고 할 수 있는 것이다.

상기와 같이, 현재까지 알려져 있는 미생물 유래의 효소를 이용하여 제조된 물질은 그 특성이 상기에 기재한 식물유래의 이눌린과는 큰 차이(식물유래의 이눌린과 비교하여 그 분자가 거대하거나 결합형식이 다르거나 등)가 있기 때문에, 이눌린과는 구별하여 이눌린형 폴리프룩탄이라고 불리고 있다.

따라서, 현재까지는 미생물 유래의 효소를 이용하는 이눌린 제조기술은 확립되어 있지 않다고 할 수 있다.

본 발명은 고순도의 일정한 품질을 갖는 이눌린(inulin)을 효율적으로 대량 생산하는 수단을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 목적을 해결하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 미생물 특히 바실러스(Bacillus) 속에 속하는 미생물이 상기 과제를 해결할 수 있는 효소를 갖는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

(ⅰ) 즉, 본 발명은 이하의 작용 및 기질특이성을 갖는 것을 특징으로 하는 이눌린 합성효소에 관한 것이다;

작용 및 기질특이성: 슈크로오스(sucrose)에 작용하여 이눌린을 생성하지만, 케스토오스(kestose), 말토오스(maltose), 프룩토오스(fructose), 트레할로오스(trehalose), 셀로비오스(cellobiose)에는 작용하지 않는다.

(ⅱ) 또한 본 발명은 상기 이눌린 합성효소를 미생물의 배양액 또는 배양균체 혹은 그 처리물로부터 얻을 수 있는 상기 (ⅰ)의 이눌린 합성효소에 관한 것이다.

(ⅲ) 더 나아가 본 발명은 상기 미생물이 바실러스(Bacillus) 속에 속하는 미생물인 상기 (ⅱ)의 이눌린 합성효소에 관한 것이다.

(ⅳ) 또한 본 발명은 상기 바실러스 속에 속하는 미생물이 바실러스 sp.217C-11균주(FERM BP-7450)인 상기 (ⅲ)의 이눌린 합성효소에 관한 것이다.

(ⅴ) 또한, 본 발명은 상기 (ⅰ)~(ⅳ) 중 어느 하나의 이눌린 합성효소에 있어서, 그 N말단의 아미노산 배열이 서열목록 서열 1에 해당하는 상기 이눌린 합성효소에 관한 것이다.

(ⅵ) 또한 본 발명은 상기 (ⅰ)~(ⅴ) 중 어느 하나의 이눌린 합성효소, 당해 효소를 생산하는 미생물의 배양액 또는 배양균체 혹은 그 처리물을 슈크로오스에 접촉시켜 이눌린을 생성하는 것을 특징으로 하는 이눌린의 제조방법에 관한 것이다.

(ⅶ) 더 나아가 본 발명은 상기 미생물이 바실러스 속에 속하는 미생물인 상기 (ⅵ)의 이눌린의 제조방법에 관한 것이다.

(ⅷ) 또한 본 발명은 상기 바실러스 속에 속하는 미생물이 바실러스 sp.217C-11균주(FERM BP-7450)인 상기 (ⅶ)의 제조방법에 관한 것이다.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본국 특허출원 2000년 제195245호의 명세서 및/또는 도면에 기재된 내용을 포함한다.

본 발명의 이눌린(inulin) 합성효소는 슈크로오스(sucrose)에 작용하여 이눌린을 생성하지만, 케스토오스(kestose), 말토오스(maltose), 프룩토오스(fructose), 트레할로오스(trehalose), 셀로비오스(cellobiose)에는 작용하지 않는 작용 및 기질특이성을 갖는 것을 특징으로 하는 이눌린 합성효소이다(상기 (ⅰ)의 이눌린 합성효소).

상기의 작용 및 기질특이성은 아래의 실시예 1에 기재된 바와 같은 방법을 거쳐 결정된 것이다.

상술한 바와 같이 식물유래의 효소는 2종류의 효소의 공동작용에 의해 슈크로오스로부터 이눌린을 생성하는 것으로 알려져 있다. 즉, 제 1단계로서 2분자의 슈크로오스로부터 1분자의 케스토오스(3탄당)을 생성하는 효소의 작용이 있고, 제 2단계로서 이들끼리를 다시 중합시키는 효소의 작용에 의해 슈크로오스로부터 이눌린을 생성시킨다는 것이다.

반면, 본 발명의 이눌린 합성효소는 슈크로오스로부터의 케스토오스의 유리가 현저히 적은 데다가 상기와 같이 본 발명의 효소를 케스토오스에 작용시켜도 이눌린의 생성이 확인되지 않기 때문에 슈크로오스에 대한 작용형식이 기존의 식물유래의 효소와는 본질적으로 다른 것으로 판단된다. 따라서, 본 발명의 효소는 현재 까지 알려져 있는 것이 아니라 슈크로오스로부터 이눌린을 직접 합성하는 신규한 효소인 것이다.

또한, 본 발명의 이눌린 합성효소는, 하기의 이화학적 성질을 갖는다;

분자량 : 45,000~50,000

최적온도 : 40~50℃

열안정성 : 45℃를 넘으면 서서히 활성을 잃기 시작하고, 50℃에서 70%, 60℃에서 40%의 잔존활성을 나타낸다.

최적pH : 7~8(45℃)

pH 안정성 : pH 6 이상에서 안정.

상기 각 성질은 아래에 기재된 방법을 거쳐 결정된 것이다.

분자량 : 본 명세서 중 실시예 1(후술)에서 조제한 정제효소 표준시약 및 마커(marker) 단백질로서 바이오라드(Bio-Rad)사의 표준단백질(Thyroglobulin(bovine)); 분자량 670,000, Gammar globulin(bovine); 분자량 158,000, Ovalbumin(chicken); 분자량 44,000, Myoglobin(hores); 분자량 17,000)을 이용하여, 세파크릴(sephacryl) S-300 컬럼을 사용하여 단백질 정제 분석기(FPLC; fast protein liquid chromatography)의 겔여과법에 의해 본 발명에 의한 이눌린 합성효소의 분자량을 측정하였다.

최적온도 : 정제효소 표준시약(상동)을 사용하여 각 온도(37, 45, 50, 60, 70℃; pH 7)에서 효소를 슈크로오스 용액과 반응시킨 후 반응액 내에 생성된 글루 코오스(glucose)를 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase)법에 의해 정량하여 단위시간 당의 글루코오스 생성량을 이용하여 그 활성을 측정하였다(데이터를 도 1에 도시하였다). 또한, 도 1로부터 상기의 조건 하에서 당해 효소의 활성저하가 최소한으로 억제됨과 동시에 효소반응이 신속하게 진행되는 온도는 45℃임을 알 수 있다. 상기 글로코오스 옥시다아제법에서는 1단위(unit)의 효소활성은 1분에 1μmole의 글루코오스를 생성시키는 효소량을 나타내는 것으로 한다.

열안정성 : 정제효소 표준시약(상동)를 각 온도(37, 45, 50, 60, 70℃; pH 7)에서 30분간 열처리하여 이를 슈크로오스 용액과 반응시켜 반응액 내에 생성된 글루코오스를 글루코오스 옥시다아제법에 의해 정량함으로써, 단위시간당의 글루코오스 생성량을 이용하여 활성을 측정하였다(데이터를 도 3에 도시하였다).

최적 pH : 정제효소 표준시약(상동)을 각 pH(4.2, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 8.9)에서 슈크로오스 용액과 반응시킨 후(37℃), 반응액 내에 생성된 글루코오스를 글루코오스 옥시다아제법으로 정량하여 단위시간당의 글루코오스의 생성량을 이용하여 활성을 측정하였다(데이터를 도 2에 도시하였다).

pH 안정성 : 정제효소 표준시약(상동)을 각 pH(4.2, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 8.9)로 조제하고, 이를 4℃에서 24시간 방치시킨 후에 슈크로오스 용액과 반응시켜(37℃) 반응액 내에 생성된 글루코오스를 글루코오스 옥시다아제법으로 정량하여 단위시간당의 글루코오스 생성량을 이용하여 활성을 측정하였다(데이터를 도 4에 도시하였다).

또한, 본 발명의 이눌린 합성효소는 그 아미노산 배열을 후술하는 실시예 1 에 기재한 대로 해석한 경우, 그 N말단에 부분 아미노산배열: Glu-Glu-Ile-Asn-Ser-Asp-Tyr-Thr-Ser-Ile-Trp-Ser-Arg-Gln-Gln-Ala-Glu-Lys-Val-Thr-Pro-Thr-Asp-Lys-Thr-Thr-Ala-Pro-Lys-Ile(서열목록 서열 1)을 갖는다.

따라서, 본 발명의 이눌린 합성효소는, 예를 들어 상기의 부분 아미노산 배열을 암호화하는 염기서열을 결정하고, 이 염기서열을 기초로 가장 적당한 프라이머(primer)를 설계·합성한 후 중합효소연쇄반응법(PCR; polymerase chain reaction)을 수행함으로서 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 이눌린 합성효소를 암호화하는 전염기서열이 결정된 후에는, 예를 들어 그 전체 유전자배열을 복제(cloning)하고 이들을 공지의 유전공학적 수법을 이용하여 발현시킴으로써 본 발명의 이눌린 합성효소를 얻을 수 있다. 또는, 당해 효소를 생산하는 미생물의 배양액 또는 배양균체 혹은 그 처리물로부터 채취할 수 있다(상기 (ⅱ)의 이눌린 합성효소).

상기 미생물은 본 발명의 이눌린 합성효소를 생산하는 것이라면 특별히 한정할 필요는 없으며, 공지의 균주 혹은 새롭게 토양·해수 등으로부터 분리한 균주이어도 좋다. 또는, 이들 균주를 변이처리(예를 들어, 자외선조사, 니트로소구아니딘(NTG; nitrosoguanidine), 에틸메틸술폰산(EMS; ethyl methyl sulfonic acid)) 등을 가함으로써 당해 효소의 이눌린 생성능을 향상시킨 변이주 균체이어도 좋다.

구체적으로는, 예를 들어 바실러스 속에 속하는 미생물(상기(ⅲ)의 이눌린 합성효소), 특히 바실러스 sp.217C-11균주(FERM BP-7450)(부다페스트 조약에 기초하여, 경제산업성 산업기술총합연구소 생명공학공업기술연구소(자성현 쓰쿠바시 동1쵸메 1반 2호)에 국제기탁되어 있다. 원기탁일 : 2000년(평성12년) 6월 14일)를 들 수 있다(상기 (ⅳ)의 이눌린 합성효소).

이 바실러스 sp.217C-11균주(FERM BP-7450)는 본 발명자들에 의해 새롭게 자연계로부터 분리된 균주이며, 이하의 균학적 성질을 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 제 2권(1986)에 기초하여 검토한 결과 바실러스 속에 속하는 균주로 동정된 것이다;

바실러스 sp.217C-11균주(FERM BP-7450)의 균학적 성질

(a) 형태

1) 세포의 형태 및 크기 : 간균, 1×2~3㎛

2) 운동성 : 있음

3) 포자 : 형성함

4) 그람(Gram) 염색성 : 불확실함

(b) 배지에서의 생육상태

1) 콜로니 형태 : 원형, 주변파상, 낮은 굴곡형, 광택, 크림상

(C) 생리학적 성질

1) 카탈라아제(catalase) : 양성

2) 옥시다아제(oxidase) : 양성

3) 젤라틴(gelatin)의 가수분해 : 음성

4) 생육온도 25-37℃, 50℃ 이상에서는 생육하지 않음

5) 산소에 대한 태도 : 호기성(혐기조건하에서도 생육할 수 있음)

6) 당류로부터 산의 생성(+: 산 생성, -: 산 생성하지 않음)

프룩토오스(fructose) +

글루코오스(glucose) +

크실로오스(xylose) -

슈크로오스(sucrose) +

락토오스(lactose) +

말토오스(maltose) +

트레할로오스(trehalose) +

만노오스(mannose) +

멜리비오스(melibiose) +

이눌린(inulin) +

셀로비오스(cellobiose) +

만니톨(mannitol) -

글리세롤(glycerol) -

7) 질산염의 환원 : 환원하지 않음

8) β-갈락토시아다제(β-galatosidase) : 양성

9) 아르기닌 디히드롤라아제(arginine dihydryolase) : 음성

10) 리신 데카르복실라아제(lysine decarboxylase) : 음성

11) 오르니틴 데카르복실라아제(ornithine decarboxylase) : 음성

12) 구연산(citric acid)의 이용성 : 음성

13) 황화수소(hydrogen sulfide)의 생성 : 음성

14) 유레아제(urease) : 음성

15) 트립토판 데아미나아제(tryptophan deaminase) : 음성

16) 인돌(indole) 생산 : 음성

17) 아세토인(acetoin) 생산 : 음성

18) 젤라티나아제(gelatinase) : 음성

19) 카제인(casein)의 가수분해 : 음성

20) 히푸레이트(hippurate)의 가수분해 : 음성

21) 전분의 가수분해 : 양성

배양균체란 적절한 조건 하에서 배양시킨 상기 미생물을 의미하고 생균이거나 동결건조시킨 것이어도 좋고 또는 아세톤 파우더 등의 형태이어도 좋다.

배양균체의 처리물이란 본 발명의 효소를 그 기능을 잃지 않은 상태에서 채취할 수 있는 상태에 있는 것이라면 특별히 한정하지 않는데, 예를 들어 상기 배양균체의 파쇄물, 균체 추출액, 고정화 균체 등을 의미한다.

배양균체의 파쇄물 및 균체 추출액이란 당해 균체를 공지의 파쇄방법, 예를 들어 초음파 파쇄법, 다이노밀(DynoMill) 파쇄법, 프렌치 프레스(French press) 파쇄법에 의해 파쇄하여 얻을 수 있는 물질 및 추출액 등을 의미한다. 또한, 고정화 균체란 공지의 고정화법, 예를 들어 포괄법, 담체결합법으로 상기 균체를 고정화하고 필요에 따라서 가교시킨 것을 의미한다. 포괄법으로는, 예를 들어, 카라기난(carageenan)이나 알긴산(alginic acid) 등의 천연고분자를 이용하는 방법을 들 수 있다.

본 발명의 이눌린 합성효소를 미생물의 배양액으로부터 채취하는 경우에는, 예를 들어 다음과 같이 실시할 수 있다;

미생물의 배양

우선, 상기 미생물을 적절한 조건 하에서 배양한다.

상기 미생물을 배양하는 데 적절한 배지는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하는데 이들에 한정되지 않으며, 그 필요에 따라서 아미노산, 비타민 등의 통상의 배양에 이용되고 있는 영양원도 적절히 이용할 수 있다.

배지에 첨가하는 탄소원으로는, 당해 분야에서 공지인 탄소원, 예를 들면, 슈크로오스, 글루코오스, 프룩토오스, 말토오스 등의 당질을 이용할 수 있다. 그러나, 미생물로 바실러스 sp.217C-11주(FERM BP-7450)를 사용하는 경우에는 슈크로오스를 주탄소원으로 한 액체배지를 이용하는 것이 가장 바람직하고, 이를 통하여 본 발명의 이눌린 합성효소의 활성을 향상시킬 수 있다. 이들 탄소원은 적당한 당도(예를 들어 0.5~5.0%)로, 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 또한, 이들 탄소원은 단리·정제된 형태이거나 다른 물질에 함유된 형태이어도 좋고, 예를 들어 슈크로오스를 탄소원으로 하는 경우에는 슈크로오스 정제물 대신 슈크로오스 원당 또는 폐당밀 등의 슈크로오스 함유물을 이용하여도 좋다.

배지에 첨가하는 질소원으로는 예를 들어, 펩톤, 육엑기스, 효모엑기스, 옥수수 전분 침출폐액(corn steep liquor) 등의 유기질소원 외에 황산, 질산, 인산의 암모늄염 등의 무기질소원을 단독으로 또는 혼합하여 이용할 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다.

무기염류로는 예를 들어, 칼륨, 나트륨, 칼슘, 마그네슘, 망간, 철 등의 황산염, 염산염, 탄산염, 초산염, 인산염을 각각 단독으로 또는 조합하여 이용하는 것이 가능하지만 이들에 한정되지 않는다.

상기의 조성을 갖는 배지의 pH는 pH 6~9, 바람직하게는 pH 7~8이다.

상기 미생물의 배양은 진탕배양 또는 자 퍼멘터(jar fermentor)를 이용하여 통기조건 하에서 수행할 수 있다. 배양 온도는 25℃~37℃의 범위가 바람직하다. 또한, 배양시간은 미생물이 증식할 수 있는 이상의 시간이 좋고, 5~96 시간, 바람직하게는 15~72 시간이다.

본 발명의 이눌린 합성효소의 채취

본 발명의 이눌린 합성효소의 채취는 그 효소활성이 주로 상기 미생물(배양균체)의 배양상징액 중에서 확인되기 때문에, 예를 들어 그 배양액을 채취함으로써 이루어질 수 있다.

배양액의 채취는 공지의 고액분리법, 예를 들어 배양액을 원심분리하는 방법, 혹은 막여과에 의해 분리하는 방법 등을 이용하여 실시할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

상기와 같이 채취한 본 발명의 이눌린 합성효소는 상기 배양액 등의 액상형태인 원효소액 상태 그대로 후술하는 본 발명의 이눌린 조제방법에 이용할 수도 있 지만 농축하여 사용하는 것이 바람직하다.

농축방법으로는 당업자에게 공지인 수법, 예를 들어 아세톤(acetone), 이소프로판올(isopropanol)에 의한 용매침전법, 황산암모늄 분획법, 막농축법 등이 이용될 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

더 나아가 상기 효소액을 공지의 방법에 의해 고정화하는 것도 가능하다. 고정화방법으로는 예를 들어 이온교환체로의 결합법, 수지 또는 막 등과의 공유결합·흡착법· 고분자물질을 이용한 포괄법 등이 이용될 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 이눌린 합성효소는 원효소(예를 들어, 상기의 원효소액)를 그대로 사용할 수도 있지만, 당업자에게 공지인 방법 예를 들어 시판되는 수지를 사용하는 이온교환 크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피 등을 이용하여 더욱 정제할 수 있다.

상기 수지로는 예를 들어 동소주식회사의 TSKgel DEAE TOYOPEARL 650, TOYOPEARL HW55, Pharmacia의 세파크릴 S-300을 이용할 수 있다.

구체적으로는, 본 발명의 이눌린 합성효소의 채취 및 정제는 실시예 1에 기재된 바와 같이 실시할 수 있다.

또한, 본 발명의 이눌린의 제조방법은 상기 (ⅰ)~(ⅴ)의 어느 하나의 이눌린 합성효소, 당해 효소를 생산하는 미생물의 배양액 또는 배양균체 혹은 그 처리물을 슈크로오스에 접촉시켜 이눌린을 생성하는 것을 특징으로 한다(상기(ⅵ)의 이눌린 제조방법).

「슈크로오스에 접촉시킨다」는 것은, 구체적으로는 슈크로오스를 함유하는 당액에 상기 (ⅰ)~(ⅴ)의 어느 하나의 이눌린 합성효소, 당해 효소를 생산하는 미생물의 배양액 또는 배양균체 혹은 그 처리물을 첨가하고, 이들이 반응액 중에서 슈크로오스를 기질로 하여 이눌린을 생성할 수 있는 조건 하에서 반응시키는 것을 의미한다. 이러한 과정을 거침으로써 생성된 이눌린을 함유하는 반응액을 얻을 수 있다.

상기 미생물은 상기 본 발명의 이눌린 합성효소에 대한 설명에서 이미 기재한 것과 동일한 의미를 갖는다.

본 발명의 이눌린의 제조방법에 사용할 수 있는 「미생물의 배양액」에는 이미 상세히 기재한 바와 같이 배양액(원효소액), 또는 농축, 고정화, 정제된 형태의 것이 포함된다.

또한, 본 발명의 이눌린의 제조방법에 사용될 수 있는 「배양균체」에는 이미 기재한 바와 같이 생균 그대로, 동결건조시킨 것, 또한 아세톤 파우더 등의 형태의 것이 포함된다.

더욱이, 본 발명의 이눌린 제조방법에서 사용될 수 있는 「배양액체의 처리물」로는 이미 기재한 바와 같이 예를 들어, 상기 배양균체의 파쇄물, 균체추출액, 고정화 균체 등이 포함된다. 배양균체의 파쇄물 및 균체 추출액이란 당해 균체를 공지의 파쇄방법, 예를 들어 초음파 파쇄법, 다이노밀 파쇄법, 프렌치 프레스 파쇄법에 의해 파쇄하여 얻을 수 있는 물질 및 추출액 등을 의미하고, 이들을 원효소액으로서 이용할 수 있다. 또한, 고정화균체란 공지의 고정화법, 예를 들어 포괄법, 담체결합법으로 전기균체를 고정화하고, 필요에 따라서 가교결합시킨 것을 의미한다. 포괄법으로는, 예를 들어 카라기난이나 알긴산 등의 천연고분자를 이용하는 방법을 들 수 있다.

상기 당액 중의 적절한 슈크로오스의 농도는 예를 들어 3~68%(w/w), 바람직하게는 10~60%(w/w)으로 한다. 당액 중에 함유될 수 있는 그 외의 성분에 대해서는 상기 본 발명의 이눌린 합성효소를 설명할 때에 정의한 것과 동일하다.

반응에 이용하는 본 발명의 이눌린 합성효소 또는 당해 효소를 생산하는 미생물의 배양액 또는 배양균체 혹은 그 처리물의 농도는 반응액 중의 슈크로오스(기질)를 충분히 이용할 수 있는 농도, 예를 들어 슈크로오스 40~60%(w/w)의 경우, 이눌린 합성효소의 활성이 0.4-20 unit/mL반응액으로 하는 농도를 이용하는 것이 바람직하다.

슈크로오스를 기질로 하여 이눌린을 생성하는 데에 적절한 조건으로는 예를 들어, 20~70℃의 반응온도, 바람직하게는 40~50℃의 반응온도, 또는 pH 6~8 범위의 반응액을 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 당해 반응액의 pH를 유지하기 위하여 인산완충액을 이용할 수 있다. 반응시간은 본 발명의 이눌린 합성효소에 따라 적절히 변경하는 것이 가능하지만, 0.1~100시간, 바람직하게는 0.5~72시간으로 한다.

반응액 내에서 생성된 이눌린은 공지의 방법에 따라 정제할 수 있다.

정제는 예를 들어, 얻어진 반응액을 이온교환수지 또는 활성탄 등으로 정제하고 이들을 감압농축 또는 역삼투막을 이용하여 농축시킨 후 냉각하여 이눌린의 결정을 얻을 수 있다. 또는, 반응액에 에탄올 등의 유기용매를 첨가하고 이눌린을 침전시켜 회수하는 것도 가능하지만 이들에 한정되는 것은 아니다.

또한, 40℃에 이르지 않은 온도에서 반응을 수행한 경우에는 반응생산물인 이눌린이 반응액에 완전히 용해하지 않고 반응 중에 석출되는 수도 있는데 이러한 때에는 그 결정을 통상의 고액분리법에 의해 회수할 수 있다.

구체적으로는, 본 명세서 중 실시예 2 및 3에 기재된 것과 같은 과정을 거쳐 본 발명의 이눌린의 제조방법을 실시할 수 있다.

본 발명의 이눌린의 제조방법을 이용함으로써 평균중합도가 8~20인 즉, 종래의 식물유래 이눌린에 비하여 분자량의 분포가 좁은(즉, 일정한 품질을 갖는) 특징이 있는 이눌린을 얻을 수 있다.

본 발명의 이눌린 합성효소를 이용함으로써 저렴한 슈크로오스를 원료로 하여 일정한 품질을 갖는 이눌린을 효율적으로 다량 제조할 수 있지만, 이눌린이나 프룩탄을 원료로 하여 제조하는 물질도 본 효소와 병용함으로써 슈크로오스로부터 직접적 제조가 가능하다고까지 말할 수는 없고, 당업자라면 용이하게 유추할 수는 있을 것이다.

이눌린 또는 프룩탄을 원료로 하여 제조된 물질로는 예를 들어, 이눌로올리고당(inulo-oligosaccharide), 프룩토오스 등의 환상 이당류(디프룩토오스 무수화물(difructose anhydride)) 또는 시클로이눌로올리고당(cyclioinlo-oligosaccharide)(시클로프룩탄(cyclofructan)) 등을 들 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 이눌린 합성효소의 효소활성에 대한 온도의 영향을 나타낸 도면이다.

도 2는 본 발명의 이눌린 합성효소의 효소활성에 대한 pH의 영향을 나타낸 도면이다.

도 3은 본 발명의 이눌린 합성효소의 안정성에 대한 온도의 영향을 나타낸 도면이다.

도 4는 본 발명의 이눌린 합성효소의 안정성에 대한 pH의 영향을 나타낸 도면이다.

도 5는 실시예 3의 반응에 있어서 이눌린 생성의 경시적 변화를 도시한 도면이다.

도 6은 실시예 3의 각 물질에 대한 ¹³C-NMR 스펙트럼이다. a에 반응생성물, b에 시판되고 있는 이눌린, c에 시약 레반(화광순약제)에 대한 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타내었다.

도 7은 실시예 3의 각 물질에 대한 ¹H-NMR 스펙트럼이다. a에 반응생성물, b에 시판되고 있는 이눌린, c에 시약 레반(화광순약제)에 대한 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타내었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만 본 발명의 범위가 이들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 본 발명의 이눌린 합성효소의 작용 및 기질특이성

본 발명의 이눌린 합성효소가 기존의 식물유래의 효소와는 다른 신규한 것임을 확인하기 위하여 본 효소를 케스토오스에 작용시켜 이눌린이 생성되는지의 여부를 조사하였다. 또한, 본 효소의 기질특이성을 조사하기 위하여 슈크로오스 이외의 이당류로서 프룩토오스, 트레할로오스, 말토오스, 셀로비오스에 대하여도 본 효소를 작용시켜서 이눌린이 생성되는지의 여부를 조사하였다.

본 발명의 이눌린 합성효소의 정제효소 표준시약의 조제

바실러스(Bacillus) sp.217C-11주(FERM BP-7450)를, 슈크로오스 0.5~2%(w/v), 펩톤 1%, 효모엑기스 0.5%, 인산이칼륨(K₂PO₄) 0.2%, 황산마그네슘(MgSO₄) 0.05%를 함유하는 pH 7~8의 액체배지에서 30℃로 2일간 진탕배양한 후, 그 배양 상징액에 고형의 황산마그네슘을 첨가하여 70%의 포화도에서 침전하는 분획을 원심분리기로 응집시켰다. 상기의 과정을 통하여 응집된 침전물을 pH 7.0의 20mM 인산완충액에 용해시키고 투석튜브에 삽입한 후 상기 완충액으로 충분히 투석시켜 본 발명의 효소의 원효소액을 얻었다. 그리고, 통상적인 방법에 따 라서 동소주식회사의 TSKgel DEAE TOYOPEARL 650, TOYOPEARL HW55, Pharmacia의 세파크릴 S-300을 사용하여 당해 원효소액을 이온교환 크로마토그래피 및 겔여과 크로마토그래피에 제공함으로써 본 발명의 이눌린 합성효소를 정제하였다. 이것을 정제효소 표준시약으로 하여 다음의 조작에 이용하였다.

정제효소 표준시약의 부분 아미노산 배열의 해석

이하의 조작을 통하여 상기 정제효소 표준시약의 N말단 아미노산 배열을 결정하였다.

우선, 통상적인 방법에 따라 상기 정제효소 표준시약의 7.5% SDS-폴리아크릴아미드 겔(SDS-polyacrylamide gel) 전기영동을 수행하고, PVDF막으로 전이시킨 후, 쿠마시 브릴리안트 블루(Coomasssie brilliant blue)로 염색하였다. 50kDa의 목적밴드 부분의 막을 적출하여 충분히 수세한 후, 그 적출막을 0.5% 폴리비닐피롤리딘(polyvinylpyrrolidine)에서 1시간 동안 처리하였다. 또한 그 막을 충분히 수세한 후, HP G1005A Protein Sequencing System(휴렛팩커드사)을 이용하여 N말단의 아미노산 배열을 분석하였다.

그 결과, 상기 정제효소 표준시약의 N말단 아미노산 배열예는 Glu-Glu-Ile-Asn-Ser-Asp-Tyr-Thr-Ser-Ile-Trp-Ser-Arg-Gln-Gln-Ala-Glu-Lys-Val-Thr-Pro-Thr-Asp-Lys-Thr-Thr-Ala-Pro-Lys-Ile(서열목록 서열 1)인 것으로 나타났다.

이눌린의 생성반응

상기 각 기질의 100mM 용액을 조제하고 여기에 0.74u/mL의 상기 정제효소 표준시약을 동일중량 가하여, 37℃에서 17시간 반응시킨 후 반응생성물을 고속액체 크로마토그래피(HPLC)에서 분석하였다. HPLC 조건은 아래와 같다.

HPLC 조건

칼럼 : 신화화공 ULTRON PS-80N(8×300mm)

용매 : 물

유속 : 0.5mL/분

온도 : 50℃

검출기 : 시차굴절계

그 결과, 본 발명의 효소가 작용하여 이눌린을 생성하는 기질은 슈크로오스뿐이고 그 이외의 이당류에는 전혀 작용하지 않은 것으로 나타났다. 케스토오스의 경우에는 90% 이상이 그대로 잔존하고 주생성물은 니스토오스(nystose)이었으며 이눌린은 생성되지 않았다.

실시예 2: 미생물의 배양에 적절한 탄소원의 결정

본 발명의 이눌린 합성효소를 미생물로부터 채취할 때 어떤 탄소원을 이용하여 미생물을 배양하는 것이 바람직한가를 조사하기 위하여 바실러스(Bacillus) sp.217C-11균주(FERM BP-7450)를 이용하여 아래의 실험을 수행하였다.

(원효소액의 조제)

펩톤 1%, 효모엑기스 0.5%, 맥아엑기스 0.3%, 인산칼륨 0.2%, 황산마그네슘·7수화물 0.05%를 함유한 pH 8의 배지에 하기 표 1에 나타낸 각종 탄소원을 2% 첨가하여 통상적인 방법에 의해 조제멸균한 후, 그 배지에 바실러스 sp.217C-11균주(FERM BP-7450)를 백금이(백금선)로 접종하였다. 이것을 30℃에서 2일간 진탕배양한 후 배양상징액에 함유된 본 발명의 이눌린 합성효소의 활성을 측정하였다.

효소활성의 측정

40mM의 인산완충액(pH 7)에 용해시킨 20%의 슈크로오스 용액 0.2mL에 상기 배양상징액(효소액) 0.2mL를 가하여 37℃에서 120분간 반응시킨 후, 5분간 열탕시켜 반응을 정지시켰다. 반응에 의해 생성된 글루코오스를 글루코오스 옥시다아제법으로 측정하였다. 이는 바실러스(Bacillus) sp.217C-11주(FERM BP-7450)가 슈크로오스를 글루코오스와 프룩토오스로 분해하는 인버타아제 활성을 거의 갖고 있지 않고, 슈크로오스를 기질로 한 효소반응에 의해 이눌린을 생성할 때에 부차적으로 글루코오스를 생성하기 때문이다. 또한, 1단위(unit)의 효소활성은 1분 동안 1μmole의 글루코오스를 생성시키는 효소량으로 하였으며 이 결과를 표 1에 나타내었다.

배지에 첨가한 각종 탄소원과 그 때 얻어진 효소의 활성

탄소원	활성(u/mL)
슈크로오스(sucrose)	0.62
글루코오스(glucose)	0.08
프룩토오스(fructose)	0.05
말토오스(maltose)	0.03
폐당밀	1.73

표 1에 명백히 나타난 바와 같이, 바실러스 sp.217C-11주(FERM BP-7450)는 탄소원으로 슈크로오스 또는 이를 함유한 소재(폐당밀)을 사용한 경우에 활성이 높았다.

실시예 3: 이눌린의 조제

(1) 원효소액의 조제

슈크로오스 2%, 펩톤 1%, 효모엑기스 0.5%, 맥아엑기스 0.3%, 인산칼륨 0.2%, 황산마그네슘·7수화물 0.05%를 함유한 pH 8의 배지를 통상적인 방법에 따라서 조제멸균하고, 그 배지에 바실러스(Bacillus) sp.217C-11주(FERM BP-7450)를 백금이로 접종하였다. 30℃에서 2일간 진탕배양한 후 원심분리에 의해 제균한 배양상징액을 얻었다.

이 배양상징액 중에 함유된 효소에 대해서 실시예 1과 동일한 방법으로 효소활성을 측정하였더니 0.8u/mL이었다.

이 배양상징액에 70% 포화되도록 황산암모늄을 첨가하고 생성된 침전을 20mL 의 인산완충액(pH 7)에 용해시킨 후, 상기 인산완충액에 대해서 투석시켜 이를 아래의 효소액으로 사용하였다. 이 때 효소의 활성은 16u/mL이었다.

(2) 원효소액을 이용한 이눌린의 생성반응

2g의 슈크로오스를 44mM 인산완충액(pH 7) 2.75mL에 용해하고, 여기에 상기 (1)에서 얻은 효소액을 0.25mL 첨가하여 37℃에서 반응을 수행한 후, 반응액의 일부를 상기 실시예 1과 동일한 조건으로 HPLC로 분석하였다.

그 결과를 도 5에 도시하였다. 도면에 도시된 바와 같이, 상기 효소액을 슈크로오스에 작용시킴으로써 이눌린이 생성되었다. 또한, 반응생성물은 시간이 경과함에 따라 증가하고 약 3일 후에 평형에 도달하였으며 슈크로오스로부터의 수율은 약 50%이었다.

(3) 반응산물의 동정

상기 (2)에서 얻어진 반응액 중에서 다량 석출된 이눌린 결정을 원심분리(10000rpm, 15분)에 의해 회수하였다.

다음으로 고형분으로 약 5%가 되도록 물에 용해시키고, 부피비로 3배의 에탄올을 가하여 침전시킨 후 결정을 세정하였다. 이와 같은 조작을 2회 반복하여 최종적으로 얻어진 침전물을 동결건조시켜 중량을 측정하였더니 350mg이었다.

본 시료에 대해서 상기 (2)와 동일하게 HPLC를 수행한 결과, 순도는 98.8%이었다. 이하, 얻어진 결정에 대해서 각종의 동정·확인시험을 행하였다.

(a) 핵자기공명흡수(NMR)

상기에서 얻어진 결정 외에 시판되고 있는 이눌린(상품명 RAFTILINE HP : ORAFTI사제)을 표준으로 하고, 또한 참고예로서 β-(2→6) 결합을 갖는 세라티아 레바니쿰(Serratia levanicum) 유래의 레반(화광순제약)에 대해서도 동일한 해석을 하였다. NMR 기기로 JEOL lambda-500 FT-NMR spectrometer 500MHz의 분광계를 이용하여 중수 내에서 측정하였다.

이들 각각에 대해서 얻어진 ¹³C-NMR 스펙트럼을 도 6에, ¹H-NMR 스펙트럼을 도 7에 정리하여 나타내었다. 이들을 비교한 결과, 상기 결정은 이눌린과 동일한 피크 양상을 보이는 것을 알 수 있었다.

(b) HPLC에 의한 분자량의 추정

상기 결정을 하기의 조건에서 고속액체 크로마토그래피(HPLC)에 제공하여 분자량을 추정하였다. 표준시료로 ORAFTI사의 RAFTILINE HP(평균중합도 23)과 RAFTILINE ST(평균중합도 10)를 이용하였다. 검량선을 제작하여 산출한 결과 RAFTILINE HP의 보유시간(retention time)은 17.23분, RAFTILINE ST의 보유시간은 17.75분이고, 상기 결정물질의 보유시간은 17.39분이었다. 이로부터, 상기 결정물질의 평균중합도는 18인 것으로 추정할 수 있었다.

HPLC 조건

칼럼 : TOSOH TSK-GEL C3000PWXL(7.8×300mm)

용매 : 물

유속 : 0.5mL/분

온도 : 50℃

검출기 : 시차굴절계

(c) 이눌리나아제 소화시험

상기 결정에 시판되고 있는 이눌리나아제(상품명 Fructozyme L: NOVO사제)를 작용시킨 후의 반응액에 대해서 실시예 1과 동일한 조건으로 HPLC 분석을 수행한 결과, 상기 결정은 글루코오스와 프룩토오스로 완전히 분해되며, 그 생성비율은 1:17인 것으로 나타났다. 이로부터 당해 결정은 평균중합도가 18인 것으로 추정되었다.

(d) 질량 스펙트럼(mass spectrum)

상기 결정의 분자량을 질량 스펙트럼에 의해 측정한 결과, 당해 결정의 평균중합도는 17~18인 것을 알 수 있었다.

상기 (a)~(d)의 결과로부터 슈크로오스를 원료로 하여 얻어진 상기 결정은 이눌린인 것으로 판단되었다.

실시예 4

(1) 원효소의 조제

실시예 3의 (1)과 동일한 조건 하에서 배양하고, 효소활성이 0.6u/mL인 원효소액을 조제하였다.

(2) 원효소를 이용한 이눌린의 생성반응

80g의 슈크로오스에 200mM 인산완충액(pH 7) 20mL, 원효소액 100mL를 가하여 용해하고 교반(147rpm)하면서 37℃에서 4일간 반응을 수행하였다.

반응액을 실시예 1과 동일한 조건으로 HPLC 분석을 하였다. 반응생성물은 시간 경과와 함께 증가하고 3일 내지 4일에 평형에 달하였다. 또한, 슈크로오스로부터의 수율은 약 37.5%이었다.

(3) 반응산물의 동정

상기 (2)에서 얻어진 반응액을 역삼투막을 이용하여 약 2배로 농축하고, 4℃에서 냉각시킴으로써 이눌린 결정을 석출시켰다. 이것을 원심분리(10000rpm, 15분)에 의해 고액분리하고 침전부분을 회수한 후, 실시예 2의 (2)와 동일하게 동결건조시켜 중량을 측정하였더니 5g이었다. 본 시료의 HPLC(실시예 1과 동일한 조건)에서 순도는 99.6%이었다. 이하, 얻어진 결정에 대하여 실시예 3의 (3)과 동일하게 각종의 동정·확인시험을 수행하였다.

(a) 핵자기공명흡수(NMR)

상기 결정은 이눌린과 동일한 피크 양상을 보였다. NMR기기로는 JEOL lambda-500 FT-NMR spectrophotometer 500MHz의 분광계를 이용하였으며, 중수 내에서 측정하였다.

(b) HPLC에 의한 분자량의 추정

상기 결정을 실시예 3의 (3)에 나타낸 HPLC 조건에서 수회분석함으로써, 분자량을 추정하였다. 그 결과, RAFTILINE HP의 보유시간은 17.23분, RAFTILINE ST의 보유시간은 17.75분 이었고, 상기 결정물질의 보유시간은 17.59분, 17.70분, 17.78분 및 17.82분이었다. 이로부터, 당해 결정물질의 평균중합도는 8~14인 것으로 추정되었다.

(C) 질량 스펙트럼(mass spectrum)

상기 결정의 분자량을 질량 스펙트럼에 의해 측정한 결과 당해 결정의 평균중합도는 13~14인 것을 알 수 있었다.

상기 (a), (b), (c)의 결과로부터, 슈크로오스를 원료로 하여 얻은 당해 물질은 이눌린인 것으로 판정되었다.

본 명세서 중에서 인용한 모든 문헌은 문헌내용 그대로 참고로서 본 명세서 내에 도입되었다.

본 발명에 의해 고순도의 일정한 품질을 갖는 이눌린을 효율적이며 공업적으로도 생산가능한 방법으로 대량제조하기 위한 신규한 이눌린 합성효소 및 그를 이용한 이눌린의 제조방법이 제공되었다.

<110> Fuji Seito Co., LTD. <120> Novel inulin synthase and process for producing inulin by using the same <130> YLIP021213JP/PCT <150> JP 2000/195245 <151> 2000-06-28 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Bacillus sp. 217C-11(FERM BP-7450) <400> 1 Glu Glu Ile Asn Ser Asp Tyr Thr Ser Ile Trp Ser Arg Gln Gln Ala 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Pro Thr Asp Lys Thr Thr Ala Pro Lys Ile 20 25 30

Claims

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이눌린 생산능이 있는 바실러스 에스피 217C-11(Bacillus sp. 217C-11)(FERM BP-7450)의 배양액, 배양균체 또는 그 처리물을 슈크로오스(sucrose)에 접촉시켜 이눌린을 생성함에 있어서 상기 처리물은 배양균체의 파쇄물, 균체추출액 및 고정화 균체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나임을 특징으로 하는 이눌린의 제조방법.
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