DE3782716T2

DE3782716T2 - Verfahren zum herstellung eines wachstumsfaktors fuer bifidobacterium sp.

Info

Publication number: DE3782716T2
Application number: DE19873782716
Authority: DE
Inventors: Munehiko C O Unitika Lt Dombou; Senji C O Unitika L Kitabatake; Hiroshi C O Unitika L Nakajima; Isao C O Unitika Ltd Tomioka; Ryoichi C O Unitika Tsurutani
Original assignee: Unitika Ltd
Current assignee: Unitika Ltd
Priority date: 1986-09-27
Filing date: 1987-09-23
Publication date: 1993-04-01
Anticipated expiration: 2007-09-24
Also published as: EP0262858A2; EP0262858B1; CA1334741C; DE3782716D1; EP0262858A3

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Wachstumsfaktors für Bifidobacterium-Arten (im folgenden als Bifidobakterien bezeichnet).
Man kennt Bifidobakterien als nützliche Kolonien bildende Bewohner des menschlichen Darms. Diese Bakterien produzieren Milchsäure, Essigsäure und Ameisensäure, wobei der pH im Darmtrakt erniedrigt wird und pathogene Organismen an der lokalen Ansiedlung gehindert werden. Verbindungen mit einer wachstums- und vermehrungssteigernden Aktivität dieser nützlichen Bifidobakterien sind als Zusätze verschiedenen Nahrungsmitteln, wie Trockenmilch, Getränken usw. zugegeben worden. Es wurden eine Reihe von Untersuchungen über die Wachstumsfaktoren für Bifidobakterien (im folgenden als Bifidusfaktoren bezeichnet) durchgeführt, und es wurde berichtet, dass Lactulose, Fructooligosaccharide, Galactooligosaccharide der allgemeinen Formel Gal-(Gal)n-Glc (worin Gal ein Galactoserest, Glc ein Glucoserest und n eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist), Karottenextrakt, N-Acetyllactosamin usw., solche Faktoren sind.
Zur Produktion von Galactooligosaccharid aus Lactose unter Verwendung einer enzymatischen oder mikrobiellen Technik gibt es ein bekanntes Verfahren, welches beta-Galactosidase verwendet, das durch Aspergillus oryzae hergestellt wird (japanische Patentveröffentlichung Nr. 20266/83; entsprechend US-PS 4 435 389), ein Verfahren, welches die Kultur eines Stammes von Bacillus sp. in lactosehaltigem Medium und die Gewinnung des Bifidusfaktors aus dem Kulturmedium umfasst [japanische Patentanmeldung (OPI) Nr. 115796/81 (der Begriff OPI, wie hierin verwendet, bedeutet "veroffentlichte ungeprüfte, japanische Patentanmeldung")], ein Verfahren, welches die Kultur einer Hefe des Stammes Cryptococcus in lactosehaltigem Medium und Gewinnen eines Lactooligosaccharides aus dem Kulturmedium umfasst (japanische Patentanmeldung (OPI) Nr. 251896/85), ein Verfahren, bei dem ein Galactooligosaccharid unter Verwendung der Lactase aus Saccharomyces fragilis hergestellt wird (Agricultural and Food Chemistry 5, 130k (1957)), ein Verfahren, bei dem ein Stamm von Sporobolomyces singularis in einem lactosehaltigen Medium unter Produktion eines Galactooligosaccharides im Kulturmedium kultiviert wird (Canadian Journal of Chemistry, 42, 1341 (1964)), ein Verfahren, das die Kultur eines Penicillium chrysogenum-Stammes in einem lactosehaltigen Medium unter Herstellung eines Galactooligosaccharides im Medium umfasst (Tetrahedron 9, 125 (1960)), ein Verfahren, bei dem ein Galactooligosaccharid unter Verwendung von beta-Galactosidase aus Lactobacillus eingesetzt wird (Journal of Dairy Science, 64, 185 (1981)) und ein Verfahren, welches beta-Galactosidase aus Bacillus circulans unter Herstellung eines Galactooligosaccharides verwendet (Agricultural Biological Chemistry 48, 3053 (1984)) sowie andere.
Die zuvor erwähnten Verfahren zur Herstellung von Bifidusfaktoren aus Lactose können grob in solche eingeteilt werden, die Enzyme verwenden, die aus mikrobiellen Zellen extrahiert wurden, und in solche, bei denen ein bestimmter Stamm eines Mikroorganismus in einem lactosehaltigen Medium kultiviert wird und das gebildete Galactooligosaccharid aus dem Kulturmedium gewonnen wird. Von diesen beiden Gruppen von Verfahren erfordern die Verfahren, die ein Enzym verwenden, das aus mikrobiellen Zellen extahiert wird, natürlich die Extraktion der Enzyme, welches arbeits- und zeitaufwendig ist. Darüber hinaus verursachen diese Verfahren Hydrolyse von Lactose, wie auch der erwünschten Galactooligosaccharide, und die sich daraus ergebende Anhäufung von Glucose und Galactose als Reaktionsnebenprodukte, wodurch das Ausgangsmaterial Lactose verbraucht wird, was zu einer verminderten Ausbeute des Galactooligosaccharides führt.
Auf der anderen Seite haben die Verfahren, welche die Produktion von Galactooligosachariden aus Kulturmedien umfassen, den Nachteil, dass ebenfalls andere mikrobielle Ausscheidungen sich im Medium ansammeln, da die Zellen wachsen und sich vermehren, und die Abtrennung und Reinigung der Galactooligosaccharide stören, und sie sind auch darin benachteiligt, dass die erwünschten Galactooligosaccharide von den im Medium enthaltenen Materialien abgetrennt werden müssen, nämlich von den Stickstoffquellen, Vitaminen, Spurenelementen usw., die notwendig oder nützlich für das Wachstum der Bakterien sind.
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines Bifidusfaktors mit einer hohen Effizienz zur Verfügung zu stellen. Die von den Erfindern durchgeführten intensiven Studien zur Überwindung der oben erwähnten Nachteile führten zu der Erkenntnis, dass ruhende Zellen einer lactoseverwertenden Hefe vorteilhaft bei der Produktion von Bifidusfaktoren eingesetzt werden können. Die Erfindung ist daher auf ein Verfahren zur Produktion eines Bifidusfaktors aus Lactose gerichtet, welches umfasst: Inkontaktbringen von Lactose mit den ruhenden Zellen eines Hefestammes, der zur Verwendung von Lactose in der Lage ist, um Umwandlung von Lactose unter Bildung von Galactooligosacchariden.
Erfindungsgemäss kann das Extraktionsverfahren des Enzyms aus den kultivierten Zellen weggelassen werden, und die in einem üblichen Medium kultivierten Zellen können einfach nach üblichen Verfahren, wie Zentrifugation, Filtration, abgetrennt werden, oder sie werden verwendet wie sie sind. Da ferner die Hefezellen als sogenannte Enzymtaschen dienen, ist es nur notwendig, ihnen Lactose als enzymatisches Reaktionssubstrat zur Verfügung zu stellen.
Ferner wird erfindungsgemäss keine verbrauchende Zersetzung von Lactose induziert, nur die Umlagerungsreaktion der Lactose unter Bildung von Galactooligosacchariden findet selektiv statt, so dass nicht nur die Ausbeute an Bifidusfaktor verbessert wird, sondern auch die Hefezellen wiederverwendet werden können, wodurch eine effiziente Produktion des Bifidusfaktors sichergestellt wird.
Die Hefe zur erfindungsgemässen Verwendung kann jeder Stamm sein, der zur Verwertung von Lactose in der Lage ist und eine Aktivität zur Lactoseumlagerung aufweist. Bevorzugt sind Lactose verwertende Hefen aus der Familie Rhodotorula, Pichia, Sporobolomyces, Kluyveromyces, Debaryomyces, Candida, Torulopsis, Cryptococcus, Trichosporon, Lipomyces, Bullera und Brettanomyces.
Spezifische Stämme solcher Hefen umfassen Rhodotorula lactosa IFO 1423, IFO 1424, Cryptococcus laurentii IFO 0372, IFO 0384, IFO 0930, IFO 1376, IFO 1487, Pichia polymorpha IFO 1166, IFO 1357, Sporobolomyces singularis ATCC 24193, Kluyveromyces lactis IFO 0433, IFO 0648, IFO 1090, IFO 1267, IFO 1903, Debaryomyces cantarellii IFO 1189, IFO 1363, IFO 1716, IFO 1717, Candida curvata IFO 0732, IFO 1159, Lipomyces lipofer IFO 0673, IFO 1288, Torulopsis candida IFO 0380, IFO 0664, IFO 0768, Trichosporum pullulans IFO 0114, Bullera alba IFO 1192, Brettanomyces anomalus IFO 0642.
Insbesondere wird diese Erfindung vorzugsweise unter Verwendung von Lipomyces starkeyi und insbesondere einer biologisch reinen Kultur von Lipomyces NKD-14 (FERM P-8948, Internationale Hinterlegungsnummer gemäss Budapester Vertrag, Nr. BP-1456) durchgeführt, der keine verbrauchende Zersetzung des Lactosesubstrates verursacht, jedoch selektiv unter hoher Ausbeute des erwünschten Bifidusfaktors die Umlagerungsreaktion der Lactose bewirkt.
Lipomyces NKD-14 wurde aus Bodenproben isoliert, die aus dem Gebiet heisser Quellen am Atsukawa, Shizuoka Präfektur, Japan, entnommen wurden, und seine mykologischen Eigenschaften wurden zur taxonomischen Identifizierung gemäss der Bescheibung und dem Verfahren aus J. Lodeer, The Yeasts (1984) und H. Iizuka und S. Goto, Methods for Taxonomic Identification of Yeasts (1969) untersucht. Die mykologischen Eigenschaften von Lipomyces NKD-14 sind wie folgt dargesellt.

(1) Kultureigenschaften:

(a) My-Medium (Glukose 10 g/l, Pepton 5 g/l, Hefeextrakt 3 g/l, Malzextrakt 3 g/l).
Kultiviert bei 30ºC über 3 bis 7 Tage, die Zellen messen (3,75-5) x 5 µm, sie sind sphärisch oder ellipsoid. Die Kapsel wird gebildet. Ein Oidium wird nicht gebildet. Vermehrung durch multilaterale Knospung.
(b) My-Agar (Glukose 10 g/l, Pepton 5 g/l, Hefeextrakt 3 g/l, Malzextrakt 3 g/l, Agar 15 g/l).
Kultiviert bei 30ºC über 4 Tage, die Kolonien sind cremefarben und opak. Die Konsistenz der Kolonien ist mucoid.
(c) Maismehl-Agarplatten:
Kultur bei 30ºC. Weder Mycelien noch Pseudomycelien werden beobachtet.

(2) Bildung von Ascosporen:

Auf einem stickstofffreien Medium werden 8 bis 10 Sporen gebildet.

(3) Bildung von Ballistosporen:

Auf einer My-Agarplatte werden keine Ballistosporen gebildet.

(4) Physiologische Eigenschaften:

(a) Optimaler Wachstumsbereich. Gutes Wachstum bei 26 bis 32ºC und zufriedenstellendes Wahstum auch bei 24 bis 35ºC. Gutes Wachstum bei pH 5 bis 7.
(b) Wachstumsbereich: Kein Wachstum unter 5ºC oder über 37ºC. Kein Wachstum bei einem pH unter 2 oder über 10.
(c) Nitrate werden nicht verwertet
(d) Lipide werden nicht hydrolysiert.
(e) Harnstoff wird nicht hydrolysiert.
(f) Gelatine wird nicht verflüssigt.
(g) Es wird kein Karotinoidpigment produziert.
(h) Es wird keine stärkeähnliche Substanz produziert.
(i) Vitaminerfordernisse. Kein Wachstum auf vitaminfreien Medien.
(j) Es wird Arbutin hydrolysiert.

(5) Fermentation von Zuckern:

Das Symbol "-" bedeutet keine Fermentation.
D-Glucose -
D-Galactose -
Lactose -
Saccharose -
Maltose -
Raffinose -

(6) Assimilation von Kohlenstoffquellen:

Das Symbol "+" bedeutet gute Assimilierung; "±" schwache Assimilierung; "-" keine Assimilierung.
D-Glucose +
D-Galactose +
L-Sorbose +
Maltose +
Saccharose +
D-Ribose ±
L-Rhamnose +
Ethanol +
Erythritol +
Trehalose +
Melibiose +
Melezitose +
Inulin +
lösliche Stärke +
D-Xylose +
L-Arabinose +
D-Arabinose +
D-Mannitol +
alpha-Methyl-D-glucosid +
DL-Milchsäure -
Succinsäure ±
Zitronensäure -
Inositol +
Dextrin +
Vergleich der obigen mikrobiellen Eigenschaften mit der einschlägigen Referenz J. Lodder: The Yeasts (1984), zeigte, dass die Stämme zu Lipomyces starkeyi gehören, sich jedoch von bekannten Stämmen unterscheiden. Sie wurden daher als Lipomyces NKD-14 bezeichnet und beim Fermentation Research Institute, the Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, am 1. September 1986 under der Hinterlegungsnummer FERM P-8948 hinterlegt (in Übereinstimmung mit der internationalen Hinterlegungsnummer BP-1456, gemäss Budapester Vertrag).
Es gibt keine besonderen Beschränkungen bei den Produktionsbedingungen der Hefezellen. Daher können ruhende Zellen mit einer hohen Aktivität zur Synthese von Bifidusfaktor durch Kultur des Stammes in einem lactosehaltigen Medium erhalten werden. Wahlweise kann der Stamm in einem Medium, welches Glucose, Sorbitol, Maltose, Saccharose, verbrauchte Molasse usw. als Kohlenstoffquellen kultiviert werden, bis sich ein ausreichendes Wachstum eingestellt hat, und nach Zugabe von Lactose wird die Kultivierung fortgesetzt, bis ein ausreichender Titer an beta-Galactosidase induziert ist. Nach dem obigen Verfahren können die Zellen nach üblichen Verfahren durch Zentrifugation und Filtration geerntet werden. Die Stickstoffquellen, die zur Kultur eingesetzt weden können, umfassen verschiedene organische stickstoffhaltige Materialien, wie Pepton, Kasein, Corn steep liquor, Fleischextrakt, Hefeextrakt usw., und verschiedene anorganische Stickstoffverbindungen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Harnstoff, usw..
Der Stamm kann nach irgendeinem bekannten Kulturverfahren kultiviert werden, wie stationärer Kultur, aerober submerser Kultur, Schüttelkultur, usw., unter Verwendung eines üblichen flüssigen oder festen Mediums. Die durch Zentrifugation und Filtration geernteten Zellen können als solche als Reaktionskatalysator ohne weitere Behandlung eingesetzt werden.
Alternativ können die Zellen in einem immobilisierten Zustand nach einem geeigneten Immobilisierungsverfahren eingesetzt werden.
Es besteht keine besondere Beschränkung beim Immobilisationsverfahren. Es können daher das Einschliessen in Acrylamidgel, Kalziumalginatgel usw., das Quervernetzen durch interzelluläre Vernetzungsverfahren unter Verwendung von Glutaraldehyd, Toluoldiisocyanat usw., Immobilisierung durch Kopplung mit Dowex 50 (Dow Chemical), CM-Zellulose, P-Zellulose- DEAE-Zellulose, ECTEOLA-Zellulose (Whatman), usw., und Immobilisieren durch Adsorption an Sähstaub usw. ewähnt werden. Die so immobilisierten Hefezellen können in einen Säulenreaktor gepackt eingesetzt werden. Die freien oder immobilisierten Hefezellen können auch in einem Reaktionsgefäss vom Mebrantyp suspendiert werden, so dass nur das Reaktionsprodukt kontinuierlich aus dem Reaktionsgefäss entnommen wird.
Die Konzentration der mit den Hefezellen zu behandelnden Lactose ist erfindungsgemäss nicht weniger als 1 % (G/V), vorzugsweise nicht weniger als 5 % (G/V), und ganz besonders bevorzugt nicht weniger als 10 % (G/V). Der pH des Reaktionssystems ist vorzugsweise im Bereich von pH 3 bis 9 und besonders bevorzugt im pH-Bereich von 5 bis 7. Natürlich ist es bevorzugt, einen pH zu verwenden, bei dem die Hefezellen kaum lysiert werden und die maximale Aktivität für die Synthese des Bifidusfaktors zeigen.
Falls notwendig, können Pufferlösungen verendet werden. Die Temperatur ist in solchen Fällen 10 bis 50ºC und bevorzugt im Bereich von 25 bis 45ºC. Wenn die Reaktion unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, wird das Bifidusfaktor-Oligosaccharid produziert. Nach Reaktionsbeendigung werden die Zellen durch Filtration, Zentrifugation oder Abgiessen entfernt, wie es erforderlich ist, um ein Filtrat mit dem Oligosaccharid zu erhalten. Im allgemeinen wird das Filtrat durch Passage durch ein Ionenaustauscherharz entsalzt, und wenn ein reines Oligosaccharid hergestellt werden soll, wird das Eluat einer weiteren Adsorptionschromatografie unter Verwendung von Aktivkohle, Gelfiltration usw. unterworfen.
Die folgenden Referenz- und Arbeitsbeispiele dienen zur weiteren Illustration der Erfindung.
Sofern nicht anders angegeben, sind alle Verhältnisse, Prozentangaben usw. auf das Gewicht bezogen.

REFERENZBEISPIEL 1

10 500 ml-Erlenmeyer-Kolben wurden mit 100 ml-Anteilen eines Mediums der folgenden Zusammensetzung gefüllt und durch Autoklavieren sterilisiert.
Lactose 5 g
Ammoniumsulfat 0,2 g
Hefeextrakt 0,02 g
KH&sub2;PO&sub4; 0,08 g
Na&sub2;HPO&sub4;.12H&sub2;O 0,03 g
MgSO&sub4;.7H&sub2;O 0,002g
Wasser 100 ml
pH 5,6
Jeder Kolben wurde anschliessend mit einer Impföse von Rhodotorula lactosa IFO 1423 inokuliert und auf einem Rotationsschüttler 3 Tage bei 30ºC inkubiert. Das erhaltene Medium wurde unter Erhalt von 5,2 g feuchten Zellen zentrifugiert.

REFERENZBEISPIEL 2

10 500 ml-Erlenmeyer-Kolben wurden mit 100 ml-Anteilen eines Mediums der folgenden Zusammensetzung gefüllt und autoklaviert.
Lactose 5 g
Polypepton 0,5 g
Hefeextrakt 0,3 g
Wasser 100 ml
pH 5,5
Jeder Kolben wurde anschliessend mit einer Impföse Crryptococcus laurentii IFO 0372 inokuliert und auf einem Rotationsschüttler 2 Tage bei 30ºC inkubiert. Das erhaltene Medium wurde zentrifugiert unter Erhalt von 7,5 g feuchten Zellen.

REFERENZBEISPIEL 3

10 Kolben mit dem selben Medium wie in Referenzbeispiel 1 wurden entsprechend mit einer Impföse Pichia polymorpha IFO 1166 inokuliert und auf einem Rotationsschüttler 3 Tage bei 30ºC inkubiert. Das erhaltene Medium wurde zentrifugiert unter Erhalt von 5,5 g feuchten Zellen.

REFERENZBEISPIEL 4

10 Kolben mit dem selben Medium wie in Referenzbeispiel 2 wurden entsprechend mit einer Impföse Sporobolomyces singularis ATCC 24193 inokuliert und auf einem Rotationsschüttler 2 Tage bei 30ºC inkubiert. Das erhaltene Medium wurde zentrifugiert unter Erhalt von 3,2 g feuchten Zellen.

REFERENZBEISPIEL 5

10 Kolben mit dem selben Medium wie in Referenzbeispiel 2 wurden entsprechend mit einer Impföse Kluyveromyces lactis IFO 0433 inokuliert und auf einem Rotationsschüttler 2 Tage bei 30ºC inkubiert. Das erhaltene Medium wurde zentrifugiert unter Erhalt von 5,3 g feuchten Zellen.

REFERENZBEISPIEL 6

10 Kolben mit dem selben Medium wie in Referenzbeispiel 2 wurden entsprechend mit einer Impföse Debaryomyces cantarellii IFO 1189 inokuliert und auf einem Rotationsschüttler 2 Tage bei 30ºC inkubiert. Das erhaltene Medium wurde zentrifugiert unter Erhalt von 3 g feuchten Zellen.

REFERENZBEISPIEL 7

10 Kolben mit dem selben Medium wie in Referenzbeispiel 2 wurden entsprechend mit einer Impföse Candida curvata IFO 0732 inokuliert und auf einem Rotationsschüttler 2 Tage bei 30ºC inkubiert. Das erhaltene Medium wurde zentrifugiert unter Erhalt von 2,5 g feuchten Zellen.

REFERENZBEISPIEL 8

10 Kolben mit dem selben Medium wie in Referenzbeispiel 2 wurden entsprechend mit einer Impföse Torulopsis candida IFO 0380 inokuliert und auf einem Rotationsschüttler 2 Tage bei 30ºC inkubiert. Das erhaltene Medium wurde zentrifugiert unter Erhalt von 3,2 g feuchten Zellen.

REFERENZBEISPIEL 9

10 Kolben mit dem selben Medium wie in Referenzbeispiel 2 wurden entsprechend mit einer Impföse Trichosporon pullulans IFO 0114 inokuliert und auf einem Rotationsschüttler 2 Tage bei 30ºC inkubiert. Das erhaltene Medium wurde zentrifugiert unter Erhalt von 3,1 g feuchten Zellen.

REFERENZBEISPIEL 10

10 Kolben mit dem selben Medium wie in Referenzbeispiel 2 wurden entsprechend mit einer Impföse Bullera alba IFO 1192 inokuliert und auf einem Rotationsschüttler 2 Tage bei 30ºC inkubiert. Das erhaltene Medium wurde zentrifugiert unter Erhalt von 2,8 g feuchten Zellen.

REFERENZBEISPIEL 11

10 500 ml-Erlenmeyer-Kolben wurden mit 100 ml-Anteilen eines Mediums der folgenden Zusammensetzung gefüllt und autoklaviert.
Glucose 2 g
Polypepton 0,2 g
Hefeextrakt 0,1 g
Wasser 100 ml
pH 5,6
Jeder Kolben wurde anschliessend mit einer Impföse Brettanomyces anomalus IFO 0642 inokuliert und auf einem Rotationsschüttler 2 Tage bei 30ºC inkubiert. Anschliessend wurde sterile Lactose mit einem Gehalt von 2 % zugegeben und die Inkubation wurde für einen weiteren Tag fortgesetzt. Das erhaltene Medium wurde zentrifugiert unter Erhalt von 3,9 g feuchten Zellen.

REFERENZBEISPIEL 12

10 Kolben mit dem selben Medium wie in Referenzbeispiel 2 wurden jeweils mit einer Impföse Lipomyces lipofer IFO 0673 inokuliert und auf einem Rotationsschüttler 2 Tage bei 30ºC inkubiert. Das erhaltene Medium wurde zentrifugiert unter Erhalt von 3,5 g feuchten Zellen.

REFERENZBEISPIEL 13

Ein 30 l-Schüttelfermenter wurde mit dem folgenden Medium beladen.
Lactose 400 g
Ammoniumsulfat 40 g
KH&sub2;PO&sub4; 10 g
Na&sub2;HPO&sub4;.12H&sub2;O 10 g
MgSO&sub4;.7H&sub2;O 10 g
Hefeextrakt 20 g
Leitungswasser 20 l
Nach Sterilisation wurde der Fermenter mit 1 l einer Vorkultur (30ºC, 24 Stunden) von Lipomyces NKD-14 (FERM P-8948) inokuliert und unter den Bedingungen von pH 6,5, 30ºC, Luftzutritt von 20 l/min und Rührergeschwindigkeit von 400 Upm für 18 Stunden inkubiert. Nach Abschluss der Fermentation wurde das Medium unter Verwendung einer alpha-Laval-Zentrifuge, Modell LAPZ 202, unter Erhalt von 2,8 kg feuchten Zellen zentrifugiert.

REFERENZBEISPIEL 14

Zu 50 g der feuchten Zellen, die in gleicher Weise wie in Referenzbeispiel 13 gewonnen wurden, wurden 5 g Natriumalginat zugegeben, worauf sich Zusatz von 200 ml Leitungswasser anschloss. Die Mischung wurde mit einem Mischer gerührt bis eine homogene Suspension erhalten wurde. Unter Verwendung einer Injektionsnadel liess man die Suspension in eine 0,2 M Lösung von Kalziumchlorid laufen unter Erhalt von 110 g Perlen aus auf Kalziumalginat immobilisierten Zellen.

REFERENZBEISPIEL 15

Zehn 500 ml-Sakaguchi-Kolben wurden mit 100 ml-Anteilen des selben Mediums wie in Referenzbeispiel 13 gefüllt und sterilisiert. Anschliessend wurde jeder Kolben mit einer Impföse Lipomyces NKD-14 (FERM P-8948) inokuliert und 3 Tage bei 30ºC inkubiert. Das erhaltene Medium wude zentrifugiert unter Erhalt von 2,5 g feuchten Zellen.

BEISPIEL 1 UND VERGLEICHSBEISPIEL 1

10 g Lactose wurden zu 5,2 g der feuchten Zellen von Rhodotorula lactosa IFO 1423 aus Referenzbeispiel 1 zugegeben und mit Leitungswasser auf 100 ml aufgefüllt. Der pH dieser Suspension wurde auf 6,5 eingestellt, und man liess 3 Tage bei 30ºC stehen.
Die Suspension wurde zur Abtrennung des Überstandes zentrifugiert. Die Analyse des Überstandes durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatografie (Waters, µ-Bonadapak/NH&sub2;, mobile Phase: Acetonitril/Wasser = 7:3) zeigte einen Galactooligosaccharid-Peak an der Trisaccharid-Position, wie auch einen Lactose-Peak.
Andererseits wurden überhaupt keine Glucose und Galactose als Hydrolysate der Lactose nachgewiesen. Die Ausbeute an Galactooligosaccharid war 40 %.
Zur Kontrolle wurden 200 Einheiten einer handelsüblichen beta-Galactosidase aus Aspergillus oryzae (Sigma) zu einer Lösung von 10 g Lactose in 100 ml eines 10 mM Acetat-Puffers (pH 5,5) zugegeben, und man liess die Mischung 24 Stunden bei 30ºC stehen.
Wenn diese Mischung in derselben Weise wie in Beispiel 1 analysiert wurde, wurde ein Peak von Galactooligosaccharid an der Trisaccharid-Position nachgewiesen. Das Substrat Lactose wurde teilweise in Glucose und Galactose hydrolysiert. Die Ausbeute an Galactooligosaccharid war 19 %.
Tabelle 1 zeigt die Zuckerzusammensetzung des Reaktionsproduktes aus Beispiel 1 im Vergleich zu dem Reaktionsprodukt aus Vergleichsbeispiel 1. TABELLE 1 Beispiel Nr. Oligosaccharid % Monosaccharid % Lactose % Vergleichsbeispiel

BEISPIEL 2

10 g Lactose wurden zu 5 g feuchten Zellen von Cryptococcus laurentii IFO 0372 aus Referenzbeispiel 2 gegeben und mit Leitungswasser auf 100 ml aufgefüllt. Der pH der Suspension wurde auf 7,5 eingestellt, und man liess 2 Tage bei 30ºC stehen.
Die Reaktionsmischung wurde zentrifugiert und der Überstand wurde durch Autoklavieren sterilisiert und gefriergetrocknet. Die Bifidusaktivität des Lyophilisates wurde bestimmt.
Zur Kontrolle wurden 10 g Lactose zu 5 g feuchten Zellen Cryptocuccus lautentii IFO 0372 zugegeben, und mit Leitungswasser auf 100 ml aufgefüllt. Der pH der Suspension wurde auf 7,5 eingestellt und unmittelbar darauf autoklaviert, ohne dass man 2 Tage bei 30ºC stehen liess, und anschliessend lyophilisiert (die unbehandelte Mischung).
Zum Test auf Bifidusaktivität wurde jedes der obigen Lyophilisate zu Glyörgy's Standardmedium für den Bifidus-Pen-Stamm mit einem Gehalt von 5 % zugegeben (Japanese Journal of Pediatrics 9, 839 (1956)). Das Medium wurde anschliessend mit derselben Inokulationsmenge des Bifidus-Pen-Stammes inokuliert und nach Überschichtung mit flüssigem Paraffin wurde eine anaerobe Kultur 48 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Das Ausmass des Wachstums des Bifidus-Stammes wurde anschliessend aus dem Säuregehalt und pH bestimmt. Der Säuregehalt wurde durch Titration der Probe mit einer Standardlösung bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

BEISPIEL 3

Das Verfahren aus Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass 5 g feuchte Zellen Pichia polymorpha IFO 1166 aus Referenzbeispiel 3 eingesetzt wurden, und es wurde die Bifidusaktivität bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.

BEISPIEL 4

Das Verfahren aus Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass 3 g feuchte Zellen Sporobolomyces singularis ATCC 24193 aus Referenzbeispiel 4 eingesetzt wurden, und es wurde die Bifidusaktivität bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.

BEISPIEL 5

Das Verfahren aus Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass 5 g feuchte Zellen Kluyveromvces lactis IFO 0433 aus Referenzbeispiel 5 eingesetzt wurden, und es wurde die Bifidusaktivität bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.

BEISPIEL 6

Das Verfahren aus Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass 2 g feuchte Zellen Debaryomyces cantatrellii IFO 1189 aus Referenzbeispiel 6 eingesetzt wurden, und es wurde die Bifidusaktivität bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.

BEISPIEL 7

Das Verfahren aus Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass 2 g feuchte Zellen Candida curvata IFO 0732 aus Referenzbeispiel 7 eingesetzt wurden, und es wurde die Bifidusaktivität bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.

BEISPIEL 8

Das Verfahren aus Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass 2 g feuchte Zellen Torulopsis candida IFO 0380 aus Referenzbeispiel 8 eingesetzt wurden, und es wurde die Bifidusaktivität bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.

BEISPIEL 9

Das Verfahren aus Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass 3 g feuchte Zellen Trichosporum pullulans IFO 0114 aus Referenzbeispiel 9 eingesetzt wurden, und es wurde die Bifidusaktivität bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.

BEISPIEL 10

Das Verfahren aus Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass 2,5 g feuchte Zellen Bullera alba IFO 1192 aus Referenzbeispiel 10 eingesetzt wurden, und es wurde die Bifidusaktivität bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.

BEISPIEL 11

Das Verfahren aus Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass 3 g feuchte Zellen Brettanomyces anomalus IFO 0642 aus Referenzbeispiel 11 eingesetzt wurden, und es wurde die Bifidusaktivität bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. TABELLE 2* Testmedium Beispiel Nr. Standardmedium, enthaltend das erfindungsgemässe Produkt Standardmedium, enthaltend die unbehaltende Mischung Standardmedium Azidität * Veränderung der Medien nach Inkubation im Hinblick auf Acidität und pH
Aus Tabelle 2 geht hervor, dass die erfindungsgemässen Produkte Bifidusaktivität haben.

BEISPIEL 12

In 4 ml einer physiologischen Kochsalzlösung wurden 1 g feuchte Zellen von Lipomyces lipofer IFO 0673 aus Referenzbeispiel 12 suspendiert und anschliessend 750 mg Acrylamid und als Quervernetzer 40 mg N,N'-Methylenbiscrylamid zugegeben. Anschliessend wurden 0,5 ml 5 %-iges beta-Dimethylaminopropionitril als Polymerisationsbeschleuniger und 0,5 ml 2,5 %-iges Kaliumperoxydisulfat als Polymerisationsstarter zugegeben. Die Mischung wurde gut gerührt und man liess 30 Minuten bei 30ºC stehen. Das erhaltene Gel wurde mit physiologischer Kochsalzlösung unter Erhalt einer Präparation aus immobilisierten Hefezellen gewaschen.
Zu der obigen Präparation aus immobilisierten Hefezellen wurden 10 g Lactose zugegeben und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt. Der pH der Mischung wurde auf 7,5 eingestellt und man liess 24 Stunden bei 30ºC stehen. Anschliessend wurde die Mischung zentrifugiert unter Erhalt eines von immobilisierten Zellen freien Überstandes. Der Überstand wurde lyophilisiert.
Zur Kontrolle liess man die Mischung nicht 24 Stunden bei 30ºC stehen, sondern zentrifugierte sofort und der Überstand wurde lyophilisiert. Diese Lyophilisat (unbehandelte Mischung) wurde als Kontrollprobe verwendet.
Diese Lyophilisate wurden auf Bifidusaktivität auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 untersucht, und das Ausmass der Vermehrung des Bifidusstammes wurde durch Bestimmung der Acidität und pH geschätzt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. TABELLE 3 Testmedium Bedingungen des Mediums nach Inkubation Acidität Standardmedium, enthaltend das erfindungsgemässe Produkt Standardmedium, enthaltend die unbehandelte Mischung Standardmedium
Aus Tabelle 3 geht hervor, dass das erfindungsgemässe Produkt Bifidusaktiität hat.
Die Präparation immobilisierter Heezellen, wie oben erhalten, wurde zur Produktion des Bifidusfaktors unter denselben Bedingungen in einem 10-fachen Ansatz eingesetzt. Es trat jedoch keine Abnahme bei der Aktivität der Bifidusfaktor-Synthese auf.

BEISPIEL 13

Zu 200 g Lactose wurden 10 g feuchte Zellen von Lipomyces NKD-14, bezogen auf das Trockengewicht (FERM P-8948) aus Referenzbeispiel 3 zugegeben und mit Leitungswasser auf 1 l aufgefüllt. Diese Reaktionsmischung liess man bei pH 6,5 6 Tage stehen.
Nch Abschluss der Reaktion wurde der Überstand entnommen und auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 analysiert. Als Ergebnis wurde ein Galactooligosaccharid-Peak an der Trisacharid-Position wie auch ein Peak für das Substrat Lactose nachgewiesen.
Unter diesen Bedingungen war die Konzentration an Lactose 6,6 % und die an Galactooligosaccharid 10,0 %. Die Ausbeute an Galactooligosacharid, bezogen auf das Ausgangsmaterial Lactose, war 50 %.
Glucose und Galactose, die Hydrolyseprodukte von Lactose sind, wurden überhaupt nicht nachgewiesen. Es war klar, dass Galactooligosaccharid ohne Bildung von Nebenprodukten hergestellt werden konnte.
Anschliessend liess man, um nur das Galactooligosaccharid zu isolieren, den Überstand der Reaktionsmischung durch eine Säule mit Aktivkohle treten, woduch 85 g Galactooligosaccharid erhalten wurden. Dieses Galactooligosaccharid ergab einen einzelnen Peak in der Hochdruck-Flüssigkeitschromatografie (HPLC) unter den zuvor beschriebenen Bedingungen. Strukturanalyse dieses Produktes durch ¹³C NMR ergab, dass es O-beta-D-Galactopyranosyl-(1 -> 4)-O-beta-D-galactopyranosyl- (1 -> 4)-D-glucose war.

BEISPIEL 14

Eine Säule wurde mit 80 g immobilisierten Zellen aus Referenzbeispiel 14 gepackt, und man liess 200 ml 30 %-ige Lactose durch die Säule zirkulieren. Die Reaktion nach 5 Tagen bei pH 6,5 und 40ºC ergab 13,5 % Galactooligosaccharid.
Es wurde weder Glucose noch Galactose nachgewiesen. Die 5-tägige Reaktion wurde insgesamt 10 mal durchgeführt, wobei keine Abnahme an Enzymaktivität auftrat.

BEISPIEL 15

In 4 ml physiologischer Kochsalzlösung wurden 1 g feuchte Zellen von Lipomyces NKD-14 (FERM P-8948) aus Referenzbeispiel 15 suspendiert und ferner 750 mg Acrylamid und als Quervernetzer 40 mg N,N'-Methylenbisacrylamid zugegeben. Anschliessend wurden 0,5 ml 5 %-iges beta-Dimethylaminopropionitril als Polymerisationsbeschleuniger und 0,5 ml 2,5 %-iges Kaliumperoxidisulfat als Polymerisationsstarter zugefügt. Die Mischung wurde gut gerührt und man liess 30 Tage bei 30ºC stehen.
Das erhaltene Gel wurde mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen unter Erhalt einer Präparation aus immobilisierten Hefezellen.
Zu dieser Präparation aus immobilisierten Hefezellen wurde 1 g Lactose zugegeben und mit Leitungswasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Reaktion wurde bei pH 6,0 und 40ºC 3 Tage durchgeführt.
Anschliessend wurde der Überstand der Reaktionsmischung auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 analysiert. Als Ergebnis wurde Galactooligosaccharid in einer Ausbeute von 5,2 % nachgewiesen. Weder Glucose noch Galactose wurden nachgewiesen. Die Ausbeute an Galactooligosaccharid, bezogen auf Lactose, war 52 %.
Die Erfindung wurde in Einzelheiten und unter Bezugnahme auf die spezifischen Ausführungsformen beschrieben. Es ist für den Fachmann jedoch offensichtlich, dass verschiedene Veränderungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Verfahren zur Produktion eines Wachstumsfaktors für Bifidobakteriumarten aus Lactose, welches umfasst: das Inkontaktbringen von Lactose mit ruhenden Zellen eines Lactose verwertenden Hefestammes mit einer Aktivität zur Umlagerung von Lactose zu Galactooligosacchariden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Lactose verwertende Hefestamm ein Stamm der Gattung Rhodotorula ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Lactose verwertende Hefestamm ein Stamm der Gattung Pichia ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Lactose verwertende Hefestamm ein Stamm der Gattung Sporobolomyces ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Lactose verwertende Hefestamm ein Stamm der Gattung Kluyveromyces ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Lactose verwertende Hefestamm ein Stamm der Gattung Debaryomyces ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Lactose verwertende Hefestamm ein Stamm der Gattung Candida ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Lactose verwertende Hefestamm ein Stamm der Gattung Torulopsis ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Lactose verwertende Hefestamm ein Stamm der Gattung Cryptococcus ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Lactose verwertende Hefestamm ein Stamm der Gattung Trichosporon ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Lactose verwertende Hefestamm ein Stamm der Gattung Lipomyces ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Lactose verwertende Hefestamm ein Stamm der Gattung Bullera ist.

13. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Lactose verwertende Hefestamm ein Stamm der Gattung Brettanomyces ist.

14. Verfahren nach Anspruch 1, worin die ruhenden Zellen eines Lactose verwertenden Hefestammes immobilisierte Hefezellen sind.