DE1932981B2

DE1932981B2 - Verfahren zur biotechnischen herstellung eines enzyms lipase

Info

Publication number: DE1932981B2
Application number: DE19691932981
Authority: DE
Inventors: Jinnosuke Shizuoka Watanabe Tetsuo Yokohama Miyauchi Kango Yama guchi Tsutomu Nito Toshiharu Muroya Nonyuki Shizuoka Abe, (Japan)
Original assignee: Toyo Jozo K K , Mifuku, Shizuoka (Japan)
Priority date: 1968-07-02
Filing date: 1969-06-28
Publication date: 1973-02-15
Also published as: JPS4629787B1; CH521441A; SU416958A3; DK125255B; HU166650B; FR2012170A1; US3649455A; DE1932981A1; AT289011B; GB1210997A; PL80084B1; DE1932981C3; NL6910134A; BE735517A; NL154269B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms Lipase durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus in einem Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoff-Quelle enthält, bei hierfür üblichen Züchtungsbedingungen und durch Isolierung des Enzyms aus dem Nährmedium.

Es ist bekannt, daß es eine große Anzahl von Lipase produzierenden Mikroorganismen gibt, wie beispielsweise solche der Gattung Aspergillus, der Gattung Penicillinum, der Gattung Riiizopus, der Gattung Mucor, der Gattung Absidia, der Gattung Candida, der Gattung Torulopsis, der Gattung Brettanomyces, der Gattung Bacillus, der Gattung Streptococcus, der Gattung Pseudomonus, der Gattung Clostridium, SoJerotinia, Trichosporon, jedoch haben die bisher bekannten Lipase produzierenden Mikroorganismen den Nachteil, daß sie. wenn überhaupt, pflanzliche und insbesondere tierische Fette, speziell Emulsionen von Schweinefett, als Substrat nur ungenügend verbrauchen können. Dies gilt insbesondere, wenn solche Fette zusammen mit Detergentien als Substrat vorliegen. Nachteilig ist dies deshalb, weil seit einiger Zeit Reinigungs- und Waschmittel mit Zusätzen von Enzymen, die zur Beseitigung der Fettstoffe dienen sollen, vielfach Verwendung finden. Dazu werden in Detergentien und Fette enthaltenden Substraten aktive Stoffe benötigt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein solches beständiges und hochwirksames Enzym Lipase zu schaffen, das mittels eines in industriellem Maßstab vorteilhaft durchführbaren Verfahrens unter Anwendung eines bisher dafür nicht bekannten Mikroorganismus als Lipase-Produzent hergestellt werden kann.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren der eingangs genannten Art zur Herstellung eines Enzyms Lipase durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus in einem Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoff-Quelle enthält, bei hierfür üblichen Züchtungsbedingungen und durch Isolierung des Enzyms aus dem Nährmedium, das erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus Chromobacterium viscosum va.. ,.aralipolyticur·. KO HATSU KEN KIN KI Nr. 137 (Hinterlegungsbeieichnungdes Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Ministry of Intei national Trade & Industry, Japan) oder Chrome bacterium viscosum ATCC 6918 oder Chromobac terium violaceum ATCC 12472 einsetzt.

Bisher ist es nicht bekannt gewesen, daß mai mittels Mikroorganismen der Gattung Chromo bacterium Lipase produzieren kann. Die Anmeldern hat Lipase produzierende Mikroorganismen, die al: Substrat tierische oder pflanzliche Fette, speziel Emulsionen von Schweinefett, verbrauchen können untersucht und geprüft, und dabei hat sie gefunden, daß sich ein stark wirksames und beständiges Enzym Lipase produzieren läßt mit Einsatz eines Mikroorganismus, der aus einer Schlammbodenprobe des an der Sardinenbank bei Numazu-shi, S^iizuoka-ken, Japan, vorbeifließenden Flusses erhalten worden war.

Dieser Mikroorganismus hat folgende taxonomische Eigenschaften :

a) Wachstumsbediiigungeii:

(1) Mikroskopische Beobachtung Maß: 0,6 bis 1,2 μ,

Form: kurze Stäbchen,
Beweglichkeit: schwach,
Sporen: keine Sporulation:

(2) Charakteristiken der Kolonie Oberfläche: rund, konvex, glänzend und

viskos,

Färbung: fahl gelblichbraun, Pigment: nicht gebildet, Prüfmedium: a) Mannit-Hefeextrakt-Agar-Mediurn,

b) Glucose-Pepton-Medium,

c) Nähragar-Medium.

d) Kartoffelextrakt-Agar-Medium.

(3) Wachstumsbedingungen in verschiedenen Medien

Bouillon: Wachstum,
Bouillon-Agar-Medium: Wachstum, Glucose-Bouülon-Agar-Mediiim: gutes Wachstum,

Gelatine'Medium: Wachstum, Aqua-Pepton-Medium: Wachstum, Kartoffel-Medium: Wachstum, Lakmusmilch: Wachstum, Säurebildung:

b) Physiologische Eigenschaften

(1) Optimale Wachstumsbedingung, pH: 6,5,

Temperatur: 26°C,

aerob oder anaerob: aerob;

(2) Wachstumsbedingung

pH: 5,5 bis 9,0,
Temperatur: 5 bis 37⁰C,
aerob oder anaerob: aerob;

(3) Gramfärbung: negativ

(4) Säure-Beschleunigung: —

(5) Methylrot-Prüfung: —

(6) Voges-Proskauer-Reaktion: —

(7) Indol-Bildung: —

(8) Schwefelsäurebildung: —

(9) Ammoniakbildung: -|- (10) Nitratreduktion: -j-

1

(11) Katalasebildung: -f

(12) Gelatineverflüssigung: -<-

(13) Kaseinverflüssigung: -j-

(14) Stärkehydrolyse: —

(15) Verbrauch von Citrat: -\-

(16) Koagulierung von Milch: —

(17) Lakmusreduktion: -f

(18) Methylenblau-Reduktion: —

(19) Verbrauch von Ammoniumsalz und Harnstoff: —

c) Verbrauch von Kohlenstoff-Quellen

Arabinose	+	Raffinose
Xylose	—	Sorbit
Glucose		Inosit
Mannose	_\|-	Glycerin
Fructose	+	Saiicin
Galactose	+	Inulin
Lactose	—	Dextrin
Maltose	—	Stärke
Saccharose	+	Cellulose
Trehalose	+

Wenn man den Mikroorganismus mit diesen taxonomischen Eigenschaften unter Bezugnahme auf »Manual for the identification of Medical Bacteria« von S. T. Cowan und K. J. S t e e 1, Cambridge Univ. Press, 1965, hinsichtlich seiner taxonomischen Einordnung prüft, dann kann man im Hinblick auf die negative Gramfärbung die Stäbchenform, die Beweglichkeit, das aerobe Wachstum, die positive Reaktion auf Katalase, die negative Reaktion auf Oxidase und zur oxidativen Zersetzung von Zucker diesen Stamm als zur Gattung Chromobacerium gehörig einstufen.

Wenn man die taxonomischen Eigenschaften dieses Chromobacteriums und die Kulturen, die zu der von der American Type Culture Collection erhältlichen Gattung Chromobacterium gehören, vergleicht, dann erhält man die Bestätigung, daß dieser Lipase produzierende Stamm ein Bakterium Chromobacterium viscosum ist.

In der nachfolgenden Tabelle sind die Eigenschaften des, wie zuvor erwähnt, aus einer Schlammbodenprobe des genannten Flusses in Japan erhaltenen Mikroorganismus und des Mikroorganismus Chrornobacterium viscosum ATCC 6918 gegenübergestellt.

	Stamm
	Chromo
	bacterium
	viscosum
	aus der
	Schlamtn-
	bodenprobc
	aus Japan
Verflüssigung von Kasein ....
Verbrauch von
Citrat
Arabinose	-\|-
Lactose
Raffinose .. ..
Sorbit
Dextrin	_

Chromobacterium viscosum ATCC 6918

55

60

Diese beiden Stämme haben unabhängig von den aus der vorstehenden Tabelle erkennbaren Unterschieden beträchtliche Ähnlichkeit hinsichtlich vieler anderer taxonomischer Eigenschaften, wie beispielsweise die Charakteristiken auf zahlreichen Medien und die physiologischen Eigenschaften, und daher weisen ditse Stämme weniger deutliche Unterschiede auf wie sonstige verschiedene Arten von Chromobacterium. Entsprechend wird der aus der Schlammbodenprobe in Japan abgeschiedene Lipase produzierende Stamm in der vorliegenden Beschreibung als Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum bezeichnet. Er wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Ministry of International Trade & Industry, Japan, hinterlegt und deren ständiger Kultur-Kollektion unter der Hinterlegungsnummer KO HATSU KEN KIN KI Nr. 137 zugeordnet.

Es wurde gefunden, daß ebenso wie dieser Mikroorganismus auch die Mikroorganismen Chromobacterium viscosum ATCC 6918 und Chromobacterium violaceum ATCC 12472 zur Verwendung beim erfindungsgemäßen Verfahren brauchbar sind und das gewünschte Enzym Lipase zu produzieren vermögen.

Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in der Weise, daß man das Nährmedium mit einem der genannten Lipase produzierenden Chromobacterien-Stämme beimpft und dann die Kultur einige Tage lang züchtet.

Nährmedien, die beim erfindungsgemäßen Verfahren für die Produktion von Lipase verwendet werden können, müssen eine Lieferquelle für Kohlenstoff, beispielsweise Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose, lösliche Stärke, Stärke, Dextrin, Melassen od. dgl. enthalten; es muß darin auch eine Lieferquelle für assimilierbaren Stickstoff vorhanden sein, wie beispielsweise Sojabohnenmehl, entfettetes Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Pepton, Fleischextrakt. Hefeextrakt, pulverisierte Trockenhefe, Kornquellwasser, Maisquellwasser, Kaseinhydrolysat, Harnstofl oder Ammoniumsalz. In dem Medium ist weiterhin vorteilhaft ein Salz, wie beispielsweise Magnesium-Calcium-, Kalium-Phosphat od. dgl. enthalten. Unc es können ferner gewisse organische oder anorganisch« Substanzen, die für das Wachstum des Mikroorganismus und/oder die Enzym-Produktion ν im Wert sind dem Medium zugesetzt werden.

Es wurde ferner gefunden, daß sich die Lipase· Produktion erhöhen läßt, wenn die erfindungsgemät einzusetzenden Mikroorganismen in einem Mediun gezüchtet werden, das zusätzlich Öle und Fette enthält Fine bevorzugte Ausführung des erfindungsgemäßei Verfahrens ist demzufolge eine Arbeitsweise, bei dei man den die Lipase produzierenden Mikroorganis mus in einem solchen Medium züchtet, das Öle unc Fette enthält, und dann das Enzym Lipase daraus iso liert.

Beispiele für Öle und Fette, die man beim erfindungs gemäßen Verfahren dem Nährmedium zusetzen kann sind tierische und pflanzliche Fette und Öle, wii beispielsweise Schweineschmalz, Rinderfett, Butter Waliischöl, Fischöl oder Olivenöl, Sojabohnenöi Baumwollsaatöl, Sesamöl, Rapssaatöl, Erdnußöl Kokosnußöl, u. dgl. Diese Fette und Öle kann mai in der geeigneten Menge, vorzugsweise in etwa 0,5 bi 5°/„, dem Medium zusetzen. Feste Fette, wie beispiels weise Schweineschmalz, Rinderfell oder Butter, lassei sich durch Dampfsterilisation in dem Medium suspen dieren, und daher können sie von den Lipase produ zierenden Mikroorganismen verbraucht werden.

Die Züchtung der beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mikroorganismen kann in verschiedener Weise, beispielsweise als Flüsrigkultur oder als Festkultur durchgeführt werden. Für die im industriellen Maßstab durchzuführende Produktion ist die wirtschaftlichste Art der aerobe Submerskulturprozeß.

Zur Durchführung der Züchtung der für die Lipase-Produktion gemäß der Erfindung benutzien Organismen-Stämme kann man die Züchtiingstemperatur ganz allgemein über den Bereich ändern, in dem die Lipase produzierenden Mikroorganismen zu wachsen vermögen und die Lipase produzieren können, vorzugsweise über den Bereich von 24 bis 28⁰C. Die Zeitdauer für die Züchtung liegt im allgemeinen bei 2 bis 6 Tagen, wenngleich diese Zeitspanne je nach dem im Spedalfall benutzten Bedingungen variieren kann, und zu dem Zeitpunkt, an dem die Kultiirbrühe die höchste Potenz an Lipase-Produktion zeigt, sollte das Züchten natürlich beendet werden.

Es ist unnötig, den pH-Wert des Mediums zu kontrollieren. Dieser pH-Wert ist in den meisten Fällen konstant. Jedoch ist es vorteilhaft, ihn bei der Zubereitung des Mediums auf pH 6 bis 7 einzustellen.

Man kann die Isolierung der Lipase aus dem Nährmedium in einer üblichen für die Abtrennung und Reinigung des Enzyms Lipase bekannten Weise vornehmen. Wenn es sich um eine feste Kultur handelt, dann kann man eine Extraktion mit Wasser od. dgl. durchführen, entsprechend den bekannten Verfahren, mit denen sich eine Extraktflüssigkeit gewinnen läßt. In den Fällen, in denen es sich um eine flüssige Kultur handelt, kann man sich einer besonders vorteilhaften Arbeitsweise, wie beispielsweise Vakuumfiltration, Zentrifugieren od. dgl. bekannter Methoden bedienen, wobei die gesamte Flüssigkeit filtriert wird, um die Mycelien abzutrennen und ein Filtrat zu erhalten.

Zu diesem Extrakt oder Filtrat, das man konzentrieren oder in nicht konzentrierter Form einsetzen kann, werden lösliche Salze, wie beispielsweise Kochsalz, Ammoniumsulfat od. dgl., oder mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, wie beispielsweise Äthanol, Aceton od. dgl., hinzugegeben, um die Lipase auszufällen. Alternativ kann man das Filtrat auch sprühtrocknen und dazu sekundäre Stabilisatoren, wie beispielsweise Malzdextrin, Lactose, Carboxymethylcellulose, Polyäthylenglykol, Magermilch, Kasein, Sorbit od. dgl. zusetzen. Ferner gibt es noch die weiteren Methoden der Lyophilisation, Absorption an Kationen- oder Anionenaustausch^- harzen, Gelfiltration oder ähnliche Arbeitsweisen, die man ebenfalls benutzen kann.

Diese isolations- und Reinigungsschritte können entweder einzeln oder kombinativ eingesetzt werden, und dabei erhält man das Enzympulver, das Lipase-Aktivität aufweist.

Die erfindungsgemäß gewonnene Lipase ist stabil und aktiv. In dieser Beziehung weist das rohe Lipasepulver, das man wie nachstehend im Beispiel 1 beschrieben gewinnt, die folgenden Eigenschaften auf:

Stabilität gegen verschiedene pH-Werte bei 20'C Jber 24 Stunden:

im Bereich von pH 4,0 bis 9,0 machte die verbleibende Aktivität mehr als 80°/₀ aus;

im Bereich von pH 3 bis 10 betrug sie mehr als 70%·

Optimaler pH-Wert:

Die Aktivität liegt in einem weiten pH-Bereic von 4,0 bis 9,0;
die maximale Aktivität liegt bei pH 6 bis 7.

Die Aktivitätsrate betrug:

bei pH 6 = 100,

bei pH 4= 80,

bei pH 9 = 80,

bei pH 10 = 70,

bei pH 3 = 40.

Wärmestabilität nach 10 Minuten langer Behänd lung bei Temperaturen von 37 bis 95°C:

90% an Aktivität verblieb bei einer Temperatu; von weniger als 80°C;

60% blieb bei einer Temperatur von unterhalt 90⁰C.
Optimale Temperatur: bei etwa 5O⁰C.

Die so erhaltene Lipase, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden war, ist extrem stabil und aktiv, wie beispielsweise die rohen Proben von durch Alkohol-Ausfäliung gewonnenem Enzym. Daher kann man das Enzym Lipase für eine Vielzahl von Verwendungszwecken benutzen, beispielsweise als Digesm um, Reinigungsmittel, Mittel zur Abwasserklärung u. dgl.

Die Zusammenstellung der Zersetzungsraten von rohem Lipasepulver, wie es bei dem zuvor beschriebenen Alkohol-Ausfällungs-Verfahren gewonnen wird, ist in Tabelle I veranschaulicht (wobei die Zersetzungsrate von Olivenöl als 1,0 gesetzt ist).

Tabelle I

Substrat	Zersetzungsrale
Olivenöl Baumwollsaatöl Sesamsaatöl Sojabohnencl Erdnußöl Rapssaatöl Schweineschmalz Rinderfett Butter	1,0 0,90 0,86 2,20 0,90 0,90 2,0 1,2 1,2 0,50
Tween 60

Versuchsmethode :
Zubereitung: 24 Volumteile Wasser 1 Volumteil Substrat 37,5 mg Lipasepulver je 1 g Substrat Bebrütet wurde 10 Stunden lang bei 30°C und pH 7,0.

Die erfindungsgemäß gewonnene Lipase wird von Metallionen inhibiert, wie dies in der nachfolgenden Tabelle II angezeigt ist:

Tabelle Il

Metall.'oi (IU ³ g lon/l)

Fe", Fe^{1 !}', K¹, Na¹, Pb· ·,
Co⁺¹, Mn", Sii^H, Sn"+, Ba", Ca -ι '■

Zn"-, Al⁺", Ni", Mg"-Cu⁺, Cu"", Hg"

Jnhibi'crung

ο/

/II

unter 10

10 bis 20 mehr als 20

7 8

In den nachfolgenden Beispielen ist die angegebene 20⁰C in einer rotierenden Schütteleinrichtung mi ipase-Aktivität nach folgender Prüf methode geprüft 300 UpM gezüchtet. Es wurden 75 ml an Kultur orden: filtrat gewonnen, die 11,5 Einheiten/ml an Lipase

_ ... , , τ ^₁- ... , r, , bestimmt mit der Prüfmethode II, enthielten.

Prufmethode I. Olivenöl als Substrat _{5 Zu der filtrierten Brühe wurde ÄthanoI bis zu einei}

a) Reaktionsgemisch Alkoholkonzentration von 75% zugegeben, und e:

Enzym-Lösung 1 ml wurden 3,43 g an rohem Lipasepulver gewonnen.

pH 7,0, 0,1 m Phosphatpuffer 5 ml Die Potenz dieses Enzympulvers betrug 198 Ein

Olivenölemulsion 10 ml heiten/g, bestimmt mit der Prüfmethode II.

_. ... _,. ... , . . , , ίο Das so gewonnene rohe Lipasepulver zeigte Spurer

Die zuvor erwähnte Ohvenolemulsion wurde durch _an p_roteaSe-Aktivität neben einer starken Lipase·

Homogems.erung eines Gemisches aus 80 ml e.ner _Aktivität. ^.Amylase-, /9-AmyIase- und Lipoprotein-

2%igen wäßrigen Losung von Polyvinylalkohol ,_ipase_Aktivität u. dgl. wurden nicht festgestellt.

und 20 ml eines Olivenöls (einer fur pharma-

kologische Zwecke in Japan benutzten Qualität) .

bei 5 bis 10⁰C 10 Minuten lang mit einer Ge- ⁵ Beispiel 2

schwindigkeit von 11000 UpM zubereitet. _{Es wurde die im B}g_ispid ₁ _{beschriebene Arbeits}.

d) Arbeitsweise weise, jedoch ohne zusatz von Schweineschmalz.

Die Reaktion wurde 50 Minuten lang bei 37°C wiederholt, und man erhielt 26 g an rohem Lipase-

durchgeführt. Danach wurde die Emulsion durch ²⁰ P^{ulver mit 15} Emheiten/g.
plötzliche Zugabe von 30 ml eines Gemisches aus

ÄthanoI und Aceton (1:1) zerstört. Dann wurde Beispiel 3

mit 0,05 nNaOH in Anwesenheit von Phenol- „ , ......... ... ,.

phthalein als Indikator titriert. . ps wurde wie im Be.sp.el 1 beschrieben gearbeitet

Es wurde auch eine Kontrollprobe an denaturier- ²S jedoch wurde an Stelle von Schweineschmalz Olivenöl

tem Enzym 10 Minuten lang bei 100°C erhitzt. verwendet. Dabei wurden 3,01 g an rohem Lipase-

Die Potenz wird gezeigt an Hand der Anzahl von P^ulver gewonnen Die Aktivität des Enzympulvers,

ml, um die sich die Kontrollprobe und die oben- bestimmt nach der Prufmethode I, betrug 109 Ein-

erwähnten Proben bei der Titration unterscheiden heiten/g.

(wobei 1 ml 1 Einheit anzeigt). ³° B e i s ρ i e 1 4

Prufmethode II. Schweineschmalz als Substrat Es wurde wie im Beispiel 1 beschrieben gearbeitet,

. jedoch wurde an Stelle von Schweineschmalz Soja-

i) Reaktionsgemisch bohnenöl benutzt. Dabei wurden 3,32 g an rohem

Enzym-Lösung 1 ml ₃₅ Lipasepulver gewonnen. Die Potenz dieses Enzyin-

0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,0) 5 ml pulvers, bestimmt nach der Prüf methode I, betrug

Schweineschmalzemulsion 10 ml χοο Einheiten/g.

Die zuvor erwähnte Schweincschmalzemulsion B e i s d i e 1 5

wurde durch Homogenisieren eines Gemisches

aus 20 g geschmolzenem Schweineschmalz, 10 ml ₄₀ 20 Liter eines wäßrigen Mediums (pH 6,5), das aus

an Tween 60 und 70 ml Wasser 10 Minuten lang ₂% Schweineschmalz, 2% Stärke, 2% entfettetem

mit 11000 UpM zubereitet. Sojabohnenpulver, 0,3% Ammoniumsulfat, 0,2%

) Arbeitsweise KH₂PO₄, 0,5 % CaCO₃, 0,1 % MgSO₄ · 7 H₂O bestand

Das in ein L-Rohr eingefüllte Reaktionsgemisch ^und 5 rnj eines Antischaummittel* enthielt, wurden in wurde in einem Monod-Schüttler 60 Minuten ^4S ff ^luener-riascne a.s rermentierDenaiter e.ngelang bei 40⁰C geschüttelt, danach wurde die ^^]it ^{und 3}P ΐ⁴¹,¹¹¹¹¹⁶" ^{lang bei 12}° ^{C stenIlsiert}· ^Der Emulsion durch plötzliche Zugabe von 30 ml Fermentierbehalter hatte e.n Fassungsvermögen von eines Äthanol-Aceton-Gemisches (1:1) zerstört. 30 Litern. ... „,

Danach wurde mit 0,05 η NaOH in Anwesenheit _w ¹ ^{Llter an} Kulturmedium des genannten Chromovon Phenolphthalein als Indikator titriert. Als ⁵° bactenum yiscosum var. parahpolyticum, das in dem Kontrollprobe wurde 10 Minuten bei 100⁰C &*^ic}^en Medium 2 Tage lang bei 26 C gezüchtet erhitztes denaturiertes Enzym verwendet. ^worden war, ™ide zum Beimpfen dazugegeben, und

Die Potenz wird an Hand der Anzahl von ml, ^IJ™ I T?^ge Γ⁸ - ²^Ri"??_u ^Bf^{luften mit} die als Unterschied zwischen der Kontrollprobe ²⁰ ^lf^Mm· ^und Umrühren mit 300 UpM bebrütet Die und der bei der Titration der Prüf probe verbrauch- 55 gewonnene Kulturbrühe hatte eme Lipase-Aküyität ten ml erscheinen, angegeben (wobei 1 ml 1 Ein- ^von„⁸·³ Einheiten/ml. Die: Brühe wurde m 4001 an h 't anzeigt) stenlisiertem waßngen Medium, das aus dem gleichen

Medium wie zuvor angegeben bestand, in einem

Beispiel 1 Fermentations-Behälter aus Edelstahl eingebracht

6o (100 ml an Antischaummittel wurden zugegeben). Es

ml eines wäßrigen Mediums (pH 6,5), das aus wurde 4 Tage lang bei 26⁰C unter Belüftung mit Schweineschmalz, 2% Stärke, 2% entfettetem 400 l/Min, und Rühren mit 300UpM gezüchtet, und abohrjenpulver, 0,3% Ammoniumsulfati 0,2% dabei wurden 2651 an Kulturbrühe erhalten, nachdem [JjPO₄, 0,5% CaCOg und 0,1 % MgSO₄- 7H^O zweimal mittels einer Sharples-Zentrifugc zentrifugiert tandi- wurden in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben 65 worden war.

gebrächt^ 20 Minuten lang bei 120° C sterilisiert, Die Potenz der Brühe betrug, bestimmt nach der

in mit dem genannten Chromobacterium viscosum Prüfmethode Π, 13,0 Einheiten/ml.
. paralipolyticum beimpft und 4 Tage lang bei Weiterhin wurde dieses Filtrat durch Sprühkonzen-

ίο

trierung (Verdampfung 25 I/Std., Temperatur 30⁰C) auf 125 I konzentriert. Das so erhaltene Konzentrat wurde bei einer Einlaßtemperatur von 120⁰C und einer Auslaßtemperatur von 70°C sprühgetrocknet, und es wurden 8,1 kg an rohem Lipasepulver erhalten. Dieses zeigte eine Aktivität von 251 Einheiten/g, bestimmt nach der Prüfmethode II.

Beispiel 6

20 1 an flüssigem Medium (pH 6,5), bestehend aus 2% Schweineschmalz, 2% Stärke, 2% entfettetem Sojabohnenmehl, 0,3% Ammoniumsulfat, 0,2% KH₂PO₁, 0,5% CaCO₁₁, 0,1% MgSO₄-7H₂O und 5 ml Antischaummittel, wurden in eine 30 Liter fassende Leidener-FIaschc als Fermentier-Behälter eingefüllt. Nach 30minutigem Sterilisieren bei 120°C wurde zum Beimpfen 1 Liter an wäßriger Kultur des genannten Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum, die 2 Tage lang bei 26°C in dem gleichen Medium fermentiert worden war, beigegeben, und dann wurde 4 Tage lang bei 26 C unter Belüftungsbedingungen von 20 l/Min, und Umrühren mit 300 UpM kultiviert. Die Mycelien wurden abfiltriert, und es wurden 14,8 1 an Filtrat gewonnen, das eine Lipase-Aktivität von 11,4 Einheiten/ml, bestimmt gemäß der Prüfmethode II, hatte.

490 g an Malzdextrin wurden dem Filtrat zugegeben. Danach wurde bei °iner Einlaßtemperatur von 120⁰C und einer Auslaßtemperatur von 70⁰C sprühgetrocknet, und es wurden 927 g an rohem Lipasepulver erhalten. Die Aktivität dieses Enzympulvers betrug 126 Einheiten/g, bestimmt nach der zuvor beschriebenen Prüfmethode.

Beispiel 7

Es wurde wie im -Beispiel 6 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde an Stelle von Schweineschmalz Olivenöl verwendet, und dabei wurden 15,6 1 an Kulturbrühe mit einer Lipase-Potenz von 5,9 Einheiten/ml, bestimmt gemäß der Prüfmethode I, erhalten.

Diese Kulturbrühe wurde unter Verwendung einer schnell konzentrierenden Vorrichtung bei 30°C mit einer Verdampfungsgeschwindigkeit von 25 I/Std. konzentriert, und es wurden 7,5 1 an Konzentrat (Lipase-Aktivität 11,0 Einheiten/ml) gewonnen. Dazu wurde Äthanol bis zu 75%iger Konzentration zugegeben, und es wurden 495 g an rohem Lipasepulver daraus erhalten. Die Aktivität dieses Enzympulvers betrug 107 Einheiten/ml, bestimmt nach der gleichen zuvor beschriebenen Prüfmethode.

Beispiel 8

Aceton wurde tropfenweise zu 80 ml des Kulturfiltrats, das wie im Beispiel 1 beschrieben gewonnen worden war, (Lipase-Aktivität 11,0 Einheiten/ml, bestimmt nach der zuvor beschriebenen Prüfmethode II) bei 5°C zugegeben, bis die Aceton-Konzentration 30% betrug. Dann wurde durch Zentrifugieren mit 9000 UpM die Ausfällung abgetrennt. Die verbliebene überstehende Flüssigkeit wurde in der gleichen Weise wie zuvor beschrieben behandelt, und dabei wurden bei jeweils 60%iger und 80%iger Konzentration an Aceton die Ausfällungen abgetrennt.

Diese ausgefällten Produkte, die bei 30-, 60- und 80%iger Aceton-Konzentration isoliert worden waren, wurden mit jeweils entsprechend 30-, 60- und 80%ig konzentriertem Aceton gewaschen, und die Waschlösungen wurden getrennt aufbewahrt.

Die gleiche Arbeitsweise wurde nochmals wiederholt, und dann wurden die Ausfällungen im Vakuum getrocknet.

Die Aktivität und Ausbeute an trockenem Lipasepulver, die dabei erhalten wurden, waren folgende:

¹⁰ Aceton- Konzcnlialion CVn)	Lipase-Aktivität (Einheit/g)	Ausbeute (8)
30 15 60 80	15 60 1530	1,03 0,70 0,31

Beispiel 9 20

Es wurde wie im Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde das genannte Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum durch Chromobacterium viscosum ATCC 6918 bzw. Chromobacterium violaceum ATCC 12472 ausgetauscht, und dabei wurden folgende Ergebnisse erhalten:

	Chromobacterium	viscosum	Rohes Lipasepulver	Potenz
	ATCC 6918			Einheiten·!!
30	Chromobacterium	violaceum	Ausbeute	38
	ATCC 12472		1,3 g
			35
		1,5 g
35

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Lipase ist verschieden von bekannten Lipaseii und weist eine diesen gegenüber vorteilhaft unterschiedliche Wirkungsweise auf. Gegenüber einer aus der USA.-Patentschrift 3 262 863 bekannten Lipse, produziert unter Verwendung des Mikroorganismu-Rhizopus delemar, besteht der Vorteil der erfindungsgemäß hergestellten Lipase darin, daß die Anfälligkeit gegen Inhibierung durch Eisen-Ionen wesentlich geringer ist. Die Aktivität der bekannten Lipase wird bereits bei einem Gehalt an Fe++-Ionen von 5,0 ppm vollständig inhibiert, wohingegen die erfindungsgemäß gewonnene Lipase durch 56 ppm Fe⁺⁺-Ionen nur zu weniger als 10% inhibiert wird. Dies ist ein erheblicher Fortschritt für die Praxis, denn die Einwirkung von Eisen-Ionen fällt infolge der Lagerung und der Benutzung der Lipase in üblicherweise eisenhaltigen Gefäßen ins Gewicht.

Gegenüber der aus der schweizerischen Patentschrift 433 162 bekannten Lipase, die mit den Mikroorganismen Mucor Hiemalis, Mucor Racemosus, Mucor Mucedor, Rhizopus delemar, Rhizopus arrhizus und Mortierella Alpina gewonnen werden kann, weist die erfindungsgemäß gewonnene Lipase den Vorteil einer wesentlich höheren Wärmebeständigkeit auf.

Der Vorteil der erfindungsgemäß erhaltenen Lipase gegenüber aus Rhizopus arrhizus var. delemar erhaltener bekannter Lipase, beschrieben in »Bulletin de la Socioto de Chimic Biologique« Tome XLVJiI, Nr. 6, S. 747 bis 770, 1966, liegt für die erfindungsgemäß gewonnene Lipase in der geringeren Anfälligkeit

gegen Inhibierung durch Metall-Kationen, insbesondere Eisen-Ionen.

Der Vorteil der erfindungsgemäß hergestellten Lipase gegenüber der aus der französischen Patentschrift 1 490 099 bekannten, mittels eines Mikroorganismus der Gattung Pseudomocea gewonnenen Lipase liegt in einer höheren Wärmestabilität und außerdem darin, daß die erfindungsgemäße Lipase ihren optimalen Wirkungsbereich bei neutralem pH hat, während die bekannte Lipase ihr Wirkungsoptimum im hoch-alkalischen Bereich hat. Dies macht die erfindungsgemäß gewonnene Lipase insbesondere für die Verwendung in Wasch- und Reinigungsmitteln im neutralen Gebiet vorteilhaft.

Auch gegenüber der aus »Applied Microbiology« 16, S. 617 bis 619, 1968, bekannten Lipase. produziert mittels des Mikroorganismus Mucor pusillus, zeichnet sich die erfindungsgemäß hergestellte Lipase durch bessere Wärmebeständigkeit aus. Beim Erhitzen in Acetat-Puffer (pH 5,5) bei 55°C über eine Zeitspanne bis zu 60 Minuten betrug der Aktivitätsverlust bei der bekannten Lipase rund 38 %, während die erfindungs-12

gemäß hergestellte Lipase nur 10% ihrer Aktivitä einbüßte.

Darüber hinaus ist die erfindungsgemäß hergestellt! Lipase wegen ihrer Fähigkeit, auch schmalzhaltigi Substrate verbrauchen zu können, sonstigen bekann ten Lipasen technisch überlegen. Dies wird in der nachfolgend beschriebenen Vergleichsuntersuchunger illustriert.

Es wurden folgende Mikroorganismen für die Durch ίο führung der Versuche verwendet:

1. Candida cylindracea ATCC 14830 (vgl. mit USA, Patentschrift 3 189 529).

2. Trichosporon heteromorphum ATCC 20001 (vgl mit französischer Patentschrift 1 489 553).

3. Aspergillus luchuensis AHU 7089 (vgl. mit USA. Patentschrift 2 480 090).

4. a) Aspergillus niger AHU 7015 (vgl. mit USA. Patentschrift 2 888 385, Beispiel 2).

b) Aspergillus oryzae AHU 7155 (vgl. USA, Patentschrift 2 888 385, Beispiel 1 und 3).

Für die Versuche wurden folgende Medien eingesetzt:

Medium (A) Stärke

Sojabohnenmehl
Ammoniumsulfat
MgSO₄-7H₂O
K₂HPO₁

Medium (B)

Medium (C)

Medium (D)

Medium (E)

Medium (F)

Dextrin

Maisweichwasser
Ammoniumsulfat
CaCO₃

2°/o 0,17o

0,17o

0,5% 4%

l°/o

1,5% 100 ml, pH 7,0 in 500 ml Schüttelkolben

100 ml, pH 7,0 in 500 ml Schüttelkolben

(Beispiel 1 der USA.-Patentschrift 3 189 529) Stärke 2 7„

Sojabohnenmehl 2%

Ammoniumsulfat 0,1%

Kaliumdiphosphat 0,5%

Magnesiumsulfat 0,1%

(Beispiel 2 der USA.-Patentschrift 3 189 529) Xylose 2

Sojabohnenmehl 2%

Ammoniumsulfat 0,1 %

Magnesiumsulfat 0,1%

Kaliumdiphosphat 0,5%

(Beispiel 1 der französischen Patentschrift 1 489 553) Sojabohnenöl 17o

Sojabohnenrückstand 2 %

Maisweichwasser 1 %

(Der pH-Wert wurde nicht justiert)

Schmalz

Baumwollsaat-Rücl:siat>4 3 %

MgSO₄ 0,01%

K₂HPO₄ 0,2

50 ml, pH 7,2 in 500 ml Schüttelkolben

50 ml, in 500 ml
Schüttelkolben

100 ml in 500 ml
Schüttelkolben

Die Prüfung der Lipase wurde wie folgt vorgenommen:

Als Prüfungsmethoden für die Lipase-Aktivität wurden die in der Beschreibung angegebenen Arbeitsweisen verwendet, wobei geringfügige Abänderungen erfolgten. Es wurde wie folgt gearbeitet:

Prüfmethode I. Olivenöl als Substrat

a) Reaktionsgemisch

Enzymlösung 1 ml

0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,0) 2 ml

Olivenölemulsion 5 ml

Die Olivenölemulsion wurde in der Weise hergestellt, daß zunächst ein Polyvinylalkohol-Gemisch (18,5 g eines Polyvinylalkohole mit einem mittleren Vernetzungsgrad und 1,5 g eines Polyvinylalkohole mit höherem Vernetzungsgrad) in 11 Wasser mechanisch verrührt und 1 Stunde lang auf 75 bis 85⁰C erhitzt wurde, bis vollständige Lösung erfolgt war. Nach dem Abkühlen wurden 75 ml dieser Polyvinylalkohol-Lösung und 23 g Olivenöl bei 0 bis 5°C durch 10 Minuten langes Rühren mit 11000 UpM miteinander _χο emulgiert. Hierzu wurde ein Homogenisator aus Edelstahl benutzt. Die Emulsion wurde nach lstündigem Stehenlassen an einem kalten Ort benutzt. Die Emulsion kann 1 Tag lang an einem solchen Ort stehen bleiben, ohne daß sie instabil wird.

Der Phosphatpuffer wurde aus 39 ml einer 0,1 m Kaliumdihydrogenphosphat-Lösung und 61 ml einer 0,1 m Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung durch Vermischen hergestellt, und der pH-Wert wurde unter Verwendung eines Glaselektroden-pH-Meters auf 7,0 ao eingestellt.

b) Arbeitsweise

Die 2 ml des Phosphatpuffers und die 5 ml der Olivenölemulsion wurden in einem Prüfrohr mit einem Durchmesser von 24 mm gut miteinander ver mischt und 10 Minuten lang bei 37°C präinkubiert Die Reaktion wurde 20 Minuten lang bei 37⁰C durch geführt, durch Zugabe des 1 ml der Enzymlösunj initiiert und durch Hinzufügen von 15 ml eines Ätha nol-Aceton-Gemisches (1:1) beendet.

Die resultierende Lösung wurde mit 0,05 η NaOH in Anwesenheit von Phenolphthalein als Indikator titriert.

Als Kontrolle wurde nach der Zugabe der 15 m des Äthanol-Aceton-Gemisches (1:1) eine ml Enzymlösung beigegeben, und das resultierende Lösungsgemisch wurde wie zuvor beschrieben behandelt.

Die Differenz der Titrationswerte (Probe-Kontrolle] ist proportional der Enzymmenge in der Größenordnung 1,0 bis 2,0 ml; die Werte sind gut reproduzierbar.

c) Berechnung der Enzym-Einheit

Entsprechend dem Vorschlag des Internationalen Enzym-Komittees definiert man die Enzym-Einheit als diejenige Menge, die 1 μπιοί an Fettsäuren je Minute freizusetzen vermag.

Lipase-Aktivität (Einheit) =

(Titrationswert der Probe) — (Titrationswert der Kontrolle)

Menge (g) an Probe in 1 ml

■—- - · 2,5

Prüfmethode II. Schweineschmalz als Substrat

a) Reaktionsgemisch

35

Enzymlösung 1 ml

0,1 ml Phosphatpuffer (pH 7,0) 2 ml

Schweineschmalzemulsion 5 ml

Die Schweineschmalzemulsion wurde in einem Homogenisator aus Edelstahl durch Homogenisieren eines Gemisches aus 20 g durch Erwärmen verflüssigter Schmalzschmelze, 20 ml eines nichtionischen Detergenzes (Athoxyiat von sekundärem Alkohol) und *5 60 ml entsalztem Wasser unter 5 Minuten langem Rühren mit 11000 UpM bei Zimmertemperatur zubereitet.

Diese Emulsion ist 2 Tage lang bei Zimmertemperatur stabil.

b) Arbeitsweise

Es wurde wie zuvor im Zusammenhang mit der Olivenöl-Prüfmethode I beschrieben gearbeitet.

Der Titrationswert ist proportional der Enzymmenge im Bereich von 0,5 bis 3,5 ml und ist gut reproduzierbar.

Es wurden folgende Versuchs-Ergebnisse erhalten: Die zuvor aufgeführten Medien wurden mit den eingangs angegebenen Mikroorganismen beimpft, und es wurde 112 Stunden lang bei 26° C bebrütet.

Nach 40, 64 und 112 Stunden wurde die Lipase-Aktivität untersucht Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 '.rmittelt mit der Prüfmethode I) aufgeführt

Bei Untersuchung mit der Prüf methode Π (unter Zusatz eines nichtionischen Detergens) zeigten die von Candida cylindracea ATCC 14830, Trichosporon heteromorphum ATCC 20001, Aspergilius Luchuensis AHU 7089, Aspergilius niger AHU 7015 und Aspergilius orycae AHU 7155 gar keine oder nahezu keine Lipase-Aktivitäten. Im Gegensatz dazu war die Lipase-Aktivität des erfindungsgemäß gewonnenen Enzyms stark erhöht.

Diese Ergebnisse verdeutlichen den unterschiedlichen Charakter zwischen dem erfindungsgemäß gewonnenen Enzym und den aus den Entgegenhaltungen bekannten Lipase-Enzymen. Die Bebrütung erfolgte dabei wie nachstehend angegeben:

a) Ein Stamm von Candida cylindracea ATCC 14830 wurde in 1 Liter des Mediums (C) 112 Stunden lang gezüchtet.

b) Ein Stamm von Trichosporon heteromorphum ATCC 20001 wurde in 1 Liter des Mediums (B) (1 % Dextrin wurde durch 1 % Olivenöl ersetzt) 64 Stunden lang gezüchtet.

c) Ein Stamm Aspergilius luchuensis AHU 7089 wurde in 1 Liter des Mediums (C) 64 Stunden lang gezüchtet.

d) Ein Stamm Aspergilius niger AHU 7015 wurde in lLieter des Mediums (D) 64 Stunden lang gezüchtet.

e) Ein Stamm Aspergilius orycae AHU 7155 wurde in 1 Liter des Mediums (C) 64 Stunden lang gezüchtet.

f) Ein Stamm des genannten Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum wurde in 150 Liter des Mediums (F) in dem 250-1-Fermentationsbehälter gezüchtet. -

Tabelle 1

16

Mikroorganismus

Medium

Lipase-Aktivität (Einheit/ml) nach Stunden | 64 Stunden | 112 Stunden

Candida cylindracea ATCC 14830

Trichosporon heteromorphum ATCC 20001

Trichosporon heteromorphum ATCC 20001 ....

Aspergillus luchuensis AHU 7089

Aspergillus niger AHU 7015

Aspergillus Oryzae AHU 7155

Chromobacterium viscosum var. paraiipolyticum Chromobacterium viscosum var. paraiipolyticum

A+ 1% Schmalz C D F

A (1 % Stärke ersetzt durch 1% Olivenöl)

B (1 % Stärke

ersetzt durch

1 °/₀ Olivenöl)

A + 17o Schmalz

E E + 1 °/o Schmalz

A A + 1 % Schmalz

B B + 1 % Schmalz

C C + 1 °/₀ Schmalz

D D + 1% Schmalz

A B C D

A F

0 0 0 0 0

0 0

3,5 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0

0 30

8,5

13,5 16,5

0 15,5

5,5 16.5

8,0 0 0

6,5

0 11,5

0 13,0

0 10,0

10

7 10,5

16 14 18

18,5 130

20,5 18

5,5

9,5 10,5

5,0 0 0

0 0

8,0 0

10,0 0

3,5 0 0

10 10 10,5

10 10 14 16 0

10,5 220

Tabelle 2

Enzym extrahiert	Ausbeute an	Aktivität (Einheit/g),	untersucht nach
aus	Enzym-Pulver		Prüfmethode I
Bebrütungsansatz	in g	Prüfmethode II	(Olivenöl)
a)	2,5	0	430
b)	2,7	0	355
c)	1,8	0	205
d)	1,5	0	187
e)	2,2	0	263
f)	101	59000	12700

Die Extraktion des Enzyms aus den Bebrütungs- und dann wurde CaCl₂ bis zu einer Konzentration ansätzen erfolgte wie nachstehend angegeben. 65 von 3 % zugegeben. Danach wurde Aceton hinzu-

Zur Entfernung der Kulturmasse wurde die Kultur- gefügt, bis eine Acetonkonzentration von 50 % erbrühe zentrifugiert. Das Filtrat wurde unter vermin- reicht war. Die gebildete Ausfällung wurde dann abdertem Druck auf ^l/₃ des Volumens konzentriert, zentrifugiert. Zu der überstehenden Flüssigkeit wurde

17 18

weiter Aceton bis zu einer Konzentration von 80% ben. Die Ausfällung wurde gesammelt und mit Äthanol

zugegeben. entwässert, und man erhielt das Lipase-Enzym in Form

Die so gebildete Ausfällung wurde durch Abzentri- eines weißen bis bräunlichweißen Pulvers,

fugieren gesammelt, in Wasser gelöst, und dann wurde Die Lipase-Aktivität der so gewonnenen Enzyme

AmmoniumsuWat bis zur 4O°/oigen Absättigung zugege- 5 ist in der vorstehenden Tabelle 2 illustriert.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung eines Enzyms Lipase durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus in einem Nähnnedium, das eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoff-Quelle enthält, bei hierfür üblichen Züchtungsbedingungen und durch Isolierung des Enzyms aus dem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganimus Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum KO HATSU KEN KIN KI Nr. 137 (Hinterlegungsbezeichnung des Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Ministry of International Trade & Industry, Japan) oder Chromobacterium viscosum ATCC 6918 oder Chromobacterium violaceum ATCC 12472 einsetzt.