DE2434874A1

DE2434874A1 - Verfahren zur herstellung von galactose sowie von getraenken auf galactosebasis aus loesungen von lactose als ausgangsstoff

Info

Publication number: DE2434874A1
Application number: DE2434874A
Authority: DE
Inventors: Pierre Galzy; Guy Jean Moulin
Original assignee: Agence National de Valorisation de la Recherche ANVAR
Current assignee: Bpifrance Financement SA
Priority date: 1973-07-20
Filing date: 1974-07-19
Publication date: 1975-02-06
Also published as: NL7409830A; CA1026985A; US3981773A; GB1425303A; IT1029309B

Description

17.7.1974 A 7491

Anmelder: Agence Nationale de Valorisation de la Recherche (ANVAR) ,

13, Rue Madeleine Michelis, 92522 Neuilly s. Seine, Rrankreich

Verfahren zur Herstellung von Galactose sowie von Getränken auf Galactosebasis aus Lösungen von Lactose als Ausgangsstoff

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Galactose sowie von Getränken auf- Galactosebasis aus Lösungen von Lactose als Ausgangsstoff.

Das Verfahren ist insbesondere in der HiIchverwertung anwendbar, vor allem zur Behandlung von Milchserum, in dem dieses als Lactoselösung genutzt wird.

Die Milchindustrie produziert wachsende Mengen Molke, eine flüssige Phase, die erhalten v/ird, nachdem aus der Milch (durch Zugabe von Lab oder Säure) Kasein ausgefällt worden ist, welches zur Käseherstellung benötigt wird. Die Molke hat durchschnittlich folgende Zusammensetzung:

Wasser 96Og-

Lactose 35 g Asche 4g

Kalium 1 g

Natrium o,5 g

Riboflavin 1,4 mg

Niacin 1 mg

Thiamin 0,3 mg

Calcium 0,25 mg

Phosphor 0,20 mg

Vitamin A 100 I.E.

Proteine Spuren

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Wenn auch die Ausgangsstoffe des erfindüngsgemäßen Verfahrens nicht auf Molke beschränkt sind, hat jedoch deren Verwendung als Ausgangsstoffe zahlreiche Vorteile.

Molke ist ein nicht unbeträchtlicher Verschmutzungsfaktor, wenn sie in Vorfluter von Molkereien abgegeben wird. Dies war bisher üblich, v/eil Molke als praktisch unverwertbares Nebenprodukt angesehen wurde. Die Erfindung ermöglicht nun, aus Molke interessante und unmittelbar marktfähige Produkte zu erzeugen, so daß die Molke nicht mehr in das Abwasser eingeleitet zu v/erden braucht, also ein doppelter Vorteil erreicht wird.

Nun ist eine Erkenntnis der Geriatrie, daß bestimmte Erv/achsene, insbesondere ältere Menschen, in ihrem Stoffwechsel durch nachlassende Bildung von ß-Galactosidase die Fähigkeit verlieren. Lactose zu hydrolysieren. Diese Erscheinung tritt sehr häufig in Afrika, Asien und den Mittelmeerländern auf und hat hauptsächlich zur Folge, daß bei diesen Personen Mangelerscheinungen an einem v/esentlichen Zucker, der Galactose, auftreten, die fast ausschließlich bei der Zufuhr der in Milch enthaltenen Lactose durch Hydrolyse in situ gebildet wird.

Es ist deshalb wichtig, eine Galactose enthaltende diätetische Milch anbieten zu können, die vollständig von den Personen verwertet werden kann, welche an dieser enzymatisehen Defizienz leiden.

Die Erfindung gibt ein Verfahren zur besonderen Behandlung von Molke oder Milch mit Hilfe von Mikroorganismen an, das einerseits eine Mikroorganismen-Masse liefert, welche in der Tierernährung verwertbar ist, und andererseits eine Galactose-Lösung erbringt, welche nach Klärung direkt zur Herstellung von Getränken dienen kann. Das Verfahren gestattet es ferner, Galactose durch Extraktion aus dieser Lösung zu gewinnen.

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Die französische Patentschrift 71 27592 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Galactose aus einer Lactose-Lösung wie Molke Dabei ist es zunächst erforderlich, die Molke auf einen Lactose-Gehalt von 5 bis 15 % Lactose zu konzentrieren, die erhaltene Lösung der sauren Hydrolyse zu unterwerfen und sodann den pH-Wert der Lösung in den Bereich zwischen 3 und 6 -zu bringen. Die Lösung, welche nun Glucose und Galactose aus der Hydrolyse der Lactose enthält, wird mit einem Hefestamm·vergoren, der die Glucose fermentiert und assimiliert, nicht jedoch die Galactose. Die Hefezellen werden anschließend durch Zentrifugieren von dem Medium abgetrennt, welches die Galactose enthält.

Dieses Verfahren erfordert eine ganze Reihe von Arbeitsgängen. Durch chemische Hydrolyse lassen sich Lactose-Lösungen behandeln deren Konzentration zv/ischen 5 und 15 % liegt, aber rohe Molke enthält nur etwa 3,5 % Lactose. Dementsprechend ist auch der vollständige Abbau der Glucose in den Gärbehältern schwierig zu erreichen. Ferner findet während des Verfahrens kein Wachstun statt, so daß besondere Sterilitätsbedingungen eingehalten v/erden müssen.

Das Verfahren nach der Erfindung erübrigt nicht nur die meisten der vorstehend beschriebenen Arbeitsgänge, sondern hat noch weitere Vorzüge, die aus der nachfolgenden Beschreibung hervorgehen .

Kach der Erfindung bereitet nan Galactose oder ein galactosehaltiges Getränk aus einer Lösung, die Lactose enthält, insbesondere Molke oder Milch, indem man die lactosehaltige Lösung mit einem nicht pathogenen Mikroorganismus-Mutanten behandelt, der prototroph ist, ß-Galactosidase aufweist und als.gal charakterisiert wird, d.h. die Galactose nicht zu vergären vermag, worauf man gegebenenfalls nach der Fermentierung die Mikroorganismen von der Lösung abtrennt, welche die Galactose enthält, und, falls gewünscht, die Galactose aus dieser Lösung extrahiert.

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Nach einer der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der verwendete Mikroorganismus ein Bakterium, das durch xMutation und Selektion aus einem Wildstamm erhalten worden ist. Dieses Bakterium wird vorzugsweise aus den Enterobacteriaceae oder den Lactobacteriaceae/ insbesondere Escherichia coli, ausgewählt und zwar insbesondere derart, daß der Stamm von Escherichia coli der unter Ur. CBS 6051 B in DeIft hinterlegte Stamm ist (vgl. Beispiel 1).

Nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der verwendete Mikroorganismus eine Hefe. Diese Hefe wird durch Mutation und Selektion vorzugsweise aus einem haploiden Stamm gewonnen. Als Ausgangsstamme kommen vorzugsweise in Betracht:
Ascomyceten

Debaryomyces cantarellii Debaryomyces castellii

Debaryomyces hansenii

Debaryomyces inorana

Debaryomyces tamarii

Hansenula capsulata

Kluyveromyces aestuarii Kluyveromyces bulgaricus Kluyveromyces cicerisporus Kluyveromyces fragilis

Kluyveromyces lactis

Kluyveromyces wikerhamii Lipomyces lipofer

Lipomyces starkeyi

Pichia farinosa

Pichia polynorpha

Pichia pseudopolymorpha Pichia scolyti

Pichia stipitis

SchwannioKiyces castellii Wingea robertsii

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vorzugsweise Kluyveromyces fragilis oder Kluyveromyces lactis, -

Dasidiomycetes

Leucosporium ffigidum

Leucosporidium scottii

Bullera alba

Bullera strigea

Sporobolomyces singularis

Nach einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als Mikroorganismus einer der Hefe-Mutanten von Kluyveromyces fragilis eingesetzt, die unter Nr. CBS 6498 und 6499 im Centraal Bureau voor Schimmelcultures in Delft hinterlegt worden sind.

Eine Variante des Verfahrens der Erfindung besteht darin, daß · die Molke vor der Vergärung von Proteinen befreit wird; dies erfolgt nach einem der bekannten Verfahren, z.B. durch Ausfällen der Eiweißstoffe in der Wärme in saurem Medium oder durch Ultrafiltration mit Hilfe selektiver Membranen.

Die Abtrennung der Mikrobenkörper nach der Fermentation kann auf jede bekannte Weise erfolgen, insbesondere durch Zentrifugieren. Bei Verwendung von Hefe bringt die Verwertung dieser Mikroorganismen zu Nahrungszwecken keine Probleme mit sich, sondern sie stellen sogar ein Nebenprodukt von einigem wirtschaftlichen Wert dar. Bakterien können gegebenenfalls zu Geflügelfutter verarbeitet werden.

Im Falle der Verwendung von Hefen und bei starker Belüftung des Gärmediums verbleibt kein Nebenprodukt in der Lösung, so daß diese unmittelbar zur Herstellung galactosehaltiger Getränke eingesetzt werden kann.

Man kann hier jedoch auch die Fermentation abbrechen, bevor die Lactose verbraucht ist, so daß man eine Lösung von Lactose und Galactose erhält, wenn man dies wünscht.

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Falls die Lactose-Lösung eine Milch ist, sei sie nun nicht, halb oder ganz entrahmt, kann die nach Abtrennung der Ilefenasse erhaltene diätetische Milch direkt auf den Markt gebracht v/erden Die Hefen hinterlassen tatsächlich keine Rückstände in den Gärlösungen. Gleichwohl betrifft die Erfindung auch ein Verfahren sowie -ein nach diesem Verfahren erhaltenes Produkt, bei welchen man nach der Abtrennung und vor der Konditionierung Glucose oder Saccharose zu der Milch-hinzusetzt. Dementsprechend.soll unter "Milch mit hydrolysierter Lactose" Milch verstanden v/erden die keine Lactose, jedoch wenigstens Galactose, Galactose und Glucose oder Galactose und Saccharose enthält.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens lässt sich auch eine mit Proteinen angereichterte Milch bereiten, indem man die Hefen nur teilv/eise oder überhaupt nicht abtrennt. .Man hält also die Ilefezellen in der Milch suspensiert und gewinnt so eine eiweißreiche Milch, die vorzugsweise in Pulverform gebracht wird. Unter der Behandlung der Lactose-Lösung i9t natürlich die Impfung und Vergärung zu verstehen, die nach bekannten, hier nicht näher zu beschreibenden Methdoden durchgeführt werden.

Wenn man Bakterian verwendet, insbesondere coliforme Bakterien, verläuft der Fermentationsvorgang schneller, so daß dio Belüftung weniger wichtig ist als bei Hefen. Dies ist einerseits von Vorteil, aber andererseits verbleiben in dem Gärmediu» nebenprodukte, die für die Herstellung von Getränken wenig/er günstig sind. Vorzugsweise extrahiert man deshalb gewöhnlich in diesem Fall die Galaktose aus der Lösung, indem man die Milch auf einen Trockengehalt von 50 % konzentriert und durch Abkühlen auf etwa 20° C kristallisiert, worauf man das Produkt wäscht, zentrifugiert und abscheidet.

Man kann dann eine Sprühtrocknung vornehmen oder zur Erzielung eines Produktes größerer Reinheit die gewonnene Galactose in warmen Wasser auflösen, die Lösung durch Aktivkohle geben und auskristallisieren lassen, und das Produkt waschen, zentrifugieren, abscheiden und durch Zerstäubung oder nach dem Wirbel-

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schichtverfahren trocknen und anschließend mahlen. Stattdessen kann reine Galactose auch nach einem bekannten Verfahren durch Extraktion mit Hilfe einer Äthylalkohol-Lösung erhalten v/erden.

Im nachstehenden soll - ohne die Erfindung auf irgendwelche theoretischen Überlegungen festzulegen - das Schema des Galactose-Metabolismus bei den Mikroorganismen und sein Zusammenhang mit der Erfindung erläutert werden. Von gewissen Hefen und gewissen Bakterien wird die Lactose durch eine ß-Galactosidase hydrolysiert, aber die Mikroorganismen, welche diese ß-Galactosidase besitzen, sind im allgemeinen auch enzymatisch zur Umwandlung von Galactose ausgerüstet. Das Schema des Galactose-Metabolismus bei den Mikroorganismen dürfte wie folgt sein:

1. Stufe:

Penetration der Galactose durch eine Permease

2. Stufe:

Galacto-Kinase
Galactose + ATP > Galactose-1-phosphat + ADP

ATP = Adenosintriphosphat
ADP = Adenosindiphosphat

3. Stufe;

Uridyl-transferase Galactose-1-phosphat * Glucose-1-phosphat

+ Uridin-diphosphat-glucose + Uridin-diphosphat-galactose

4. Stufe:

Epimerase
Uridin-diphosphat-Galactose -» Uridin-diphosphat-glucose

5. Stufe;

Pyrophosphorylase

Uridin-diphosphat-glucose Uridin-triphosphat

* Glucose-1-phosphat

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Genetische Untersuchungen haben gezeigt, daß die verschiedenen Etappen durch ein einziges Enzyn kontrolliert werden, also durch ein einziges Gen, "wobei eine Mutation auf den Niveau des Gens eines der Enzyme Permease, Galacto-Kinase, Uridyl-Transferase oder Epiir.erase kontrolliert und dementsprechend die Verwertung der Galactose blockiert. Es ist dann möglich, einen Stamm hervor zubringen, der über ß-Galactosidase verfügt, aber durch Mutation ein Enzym verloren hat, das zum Abbau der in der Zelle freigesetzten Galactose unbedingt erforderlich ist. Die Mutation, die den Einsatz der Permease verhindert, ist in dem erfindungsgemäßen Verfahren jedoch unbrauchbar. Tatsächlich bleibt nämlich der Mikroorganismus befähigt, die Galactose umzuwandeln, wenn sie sich bereits im Inneren der Zelle befindet, was bei der Hydrolyse der Lactose der Fall ist. Die für die Anwendung des Stammes in dem erfindungsgemäßen Verfahren interessanteste Mutation ist der Verlust der Uridyl-Transferase.

Um Bakterienstämme zu erlangen, die für das Verfahren nach der Erfindung brauchbar sind, kann man zwei verschiedene Arten der Mutation und Selektion anwenden.

Man kann einmal von einem Sammelstamm ausgehen, der. die. Eigenschaft gal hat, ß-Galactosidase besitzt und nicht pathogen, jedoch für bestimmte Substanzen auxotroph ist. Dieser Stamm wird derart behandelt, daß seine verschiedenen Auxotrophion aufgehoben werden, bis ein prototropher Stamm vorliegt, der jedoch seine anderen Eigenschaften bewahrt hat. Vom Industrie1-len Standpunkt hat ein solcher prototropher Stamm den Vorteil, keine Wachstumsfaktoren mehr aufzuweisen, die für die Entwicklung eines auxotrophen Stammes nötig v/ären.

Als Beispiel für ein Verfahren, das die Umkehr eines auxotrophen Stammes ermöglicht, kann man wie folgt vorgehen:

Von einer Kultur des auxotrophen Stammes, der natürlich auf einem die Wachsturasfaktoren enthaltenden Milieu gewonnen wurde,

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bringt man 10³ bis 10⁹ Zellen auf die Oberfläche eines Mininal-Mediuns, dem ein VJachstumsfaktor X fehlt, v/elcher für die Entwicklung des Ausgangsstammes erforderlich ist. (Es sei erwähnt, daß das Charakteristikum eines prototrophen Stammes darin besteht, daß er in der Lage ist, alle seine Inhaltsstoffe in einem künstlichen, ausschließlich mineralischen lledium zu synthetisieren, den sog. Minimal-Medium.) Der für den Faktor X prototroph gewordene umgewandelte Mutant treibt weiter.

Man bringt dann die Kulturen auf die Oberfläche eines in Tetrischalen gegossenen Mediums. Die erscheinenden Kolonien v/erden isoliert und abgenommen. Sie sind für den Faktor X prototroph geworden und können in einer anderen Stufe des Verfahrens eingesetzt werden, in der sie für-eine andere der Auxotrophien des Originalstammes inaktiv gemacht werden.

Kach diesem Verfahren wurde der Mutant nach Beispiel 1 hergestellt..

Es ist auch möglich, von ßinem Wildstamm einen für das erfindungsgemäße Verfahren brauchbaren Bakterienstamm nach einer anderen Methode der Mutation und Selektion zu gewinnen. Die nachstehende Beschreibung dieser Methode bezieht sich auf Escherichia coli, kann aber selbstverständlich auch auf andere Wildstämme angewandt werden, insbesondere auf Stämme von Enterobacteriaceae oder Lactobacteriaceae.

Escherichia coli gehört zur Familie der Enterobacteriaceae, Unterabteilung Escherichiaceae, und sind gramnegative, eiförmige oder leicht längliche Bakterien; die Zellen v/erden in Paaren oder kurzen Ketten isoliert, im allgemeinen von der Schale getrennt und meistens beweglich. Es handelt sich um fakultative Anaerobier, die Glucide nach dem Mischsäure-Typ ohne Bildung von Acetoin vergären und positive Methylrotreaktion zeigen. Die Bakterien, welche die Glucide verwerten, Insbesondere Lactose, Galactose, Glucose und Mannit, verfügen

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über Lysin-Decarboxylase, erzeugen jedoch aus Phenylalanin keine Phenylpyruvinsäure; sie hydrolysieren auch Harnstoff nicht mehr und entwickeln keinen H-S.

Der Wildstanun von Escherichia coli wird mit Hilfe eines physikalischen oder chemischen mutagenen Agens derart behandelt, daß die Frequenz der Mutationen bei den Genen erhöht wird, die an dem Metabolismus der Galactose teilnehmen. Als physikalisches mutagenes Agens seien beispielsweise ultraviolette Strahlen, Roentgenstrahlen und Gammastrahlen erwähnt. Als chemische mutagene Agentien kommen u.a. in Betracht. A"thylmethansulfonat, Salpetrige Säure, Alkylierungsnittel, Hitrosoguanidin, Acryflavin und andere als mutagene Agentien bekannte Verbindungen.

Nach dieser Behandlung wird eine Anreicherung an Bakterienmutanten mit der Eigenschaft gal" durchgeführt; zu diesen Zweck wird die Population, die bereits die Mutation durchgemacht hat, in ein anderes, das Wachstum erlaubendes Medium übergeführt, in welchem jedoch die einzige Kohlenstoffquelle Galactose ist, und das ferner ein Antibioticum wie Penecillin enthält. Das Antibioticum tötet die Zellen mit vegetativer Vermehrung ab, bleibt aber gegenüber solchen Mutanten ohne Wirkung, die sich nicht vermehren können, weil sie die Galactose nicht abzubauen vermögen. Mach einer gewissen Seit überleben nur die Bakterien mit der Eigenschaft gal". Unter den isolierten Stämmen muß man nun eine neue Auswahl treffen, weil gewisse Vertreter trotz ihrer Unfähigkeit, Galactose als Kohlenstoffquelle zu benutzen, für das erfindungsgomäße Verfahren nicht brauchbar sind, beispielsweise Stämme, die keine Permease produzieren.

Um diese unerwünschten Stämme zu eliminieren, kultiviert man. die in der vorhergehenden Stufe erhaltenen Stämme in Petrischalen, die ein vollständiges Medium auf Basis von Glucose als Kohlenstoff quelle enthalten. Zweckmäßigerweise werden etv/a 100 lebende Zellen pro Schale eingesetzt. Die entstandenen

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Kolonien werden auf einem Galactone-Medium repliziert. Die gesuchten gal~-Mutanten ergeben auf dem ersten (Glucose-) Medium Kolonien, nicht jedoch auf dem zweiten (Galactose-) Medium.

Aus den Klonen-Mutanten gal~ Lactose"¹* werden zweckmäßigerweise mit Hilfe geeigneter Tests diejenigen ausgewählt, die die Fähigkeit, haben* Lactose zu hydrolysieren, aber die Galactose in dem Medium nicht annehmen. ■ .

In jedem Fall ist es möglich, zellfreie Präparationen herzustellen und die enzymatischem Aktivitäten zu dosieren, um festzustellen, welchem Klon das Enzym fehlt.

■ *

Wenn -man als Mikroorganismus für das erfindungsgemäße Verfahren eine Hefe verwenden will, verfährt man zur Mutation und Selektion der Hefe, wie weiter unten ausgeführt wird. Die Beschreibung bezieht sich auf den Stamm Kluyveromyces fragilis, ist jedoch ebenso auch.auf andere Hefestämme anwendbar, insbesondere solche, die bei den Ascomyceten auftreten und diplobiontisch ' heterothalisch sind, vor allem die vorstehend erwähnten; es ist weiterhin möglich, gewisse Basidionyceten zu benutzen, insbesondere die oben erwähnten Stämme".

Schließlich kann man auch Hefen einsetzen, die den Fungi imperfects zugehören, wenn auch die Gewinnung von Mutanten, die Lactose, nicht aber Galactose verwerten, bei diesen Hefen schwieriger ist, weil ihr biologischer. Zyklus unbekannt ist und man nicht weiß, ob sie haploid oder diploid sind. Folgende Hefen dieses Typs sind besonders für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet:

Brettanomyces anomalus

Brettanomyces claussenii

Brettanomyces curtersii

Candida aaseri .

Candida aquatica

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Candida blankii Candida curvata Candida glaebosa Candida humicola Candida intermedia Candida kefir
Candida macedoniensis Candida muscorum Candida pseudotropicalis Candida salmanticensis Candida shehatae Candida tenuis Cryptococcus albidus Cryptococcus ater Cryptococcus dimennae Cryptococcus flavus Cryptococcus gastricus Cryptococcus hungaricus Cryptococcus infirmo-miniatus Cryptococcus laurentii Cryptococcus macerans Cryptococcus melibiosum Cryptococcus terreus Rhodotorula aurantiaea Rhodotorula lactosa Rhodotorula marina Rhodoturula minuta Sterigmatomyces halophilus Torulopsis Candida Torulopsis ingeniosa Torulopsis versatilis Trichosporum cutaneum Trichosporum inkins Trichosporum pullulans

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Der Stamm Kluyveromyces fragilis findet sich in der Uatur in diploidem Zustand; die Untersuchung von Mutanten auf ein gegebenes Gen lässt sich nun aber mit guten Erfolgsaussichten nur dann durchführen, wenn nan von einem haploiden Individuum ausgeht. Zur Erlangung eines erfindungsgemäß verwendbaren Stammes muß man deshalb einen Weg beschreiten, der zwei Ilauptschritte umfasst. Der erste ist die Aufsuchung haploider Individuen und der zv/eite die Mutation und Selektion der erhaltenen haploiden Stämme.

Es folgt die Beschreibung des Schemas nach J. Lodder:

Assinilation kohlenstoffhaltiger Substrate

Glucose Galactose L.Sorbose Saccharose Maltose, Cellobiose Threhalose Lactose Melibiose Raffinose

Melezitose

Inulin

D-Xylose

L-Arabinose

D-Arabinose

D-Ribose

L-Rhamnose.

Äthanol

Glycerin

Erythrit

Ribit

Galactit D-Mannit D-Glucit .

a-Methy1-D-glucosid Salicin DL-MiIchsäure Bernsteinsäure Citronensäure Inosit

Vergärung kohlenstoffhaltiger Verbindungen

Glucose Raffinose Maltose Lactose

+ Melibiose

+ Saccharose

- Inulin

+ Galactose

Melezitose + Cellobiose + a-Methyl-D-glucosid + Trehalose

Andere Tests:

Hydrolyse von Arbutin,

Assimilation von Kaliumnitrat und Ivthylaminchlorhydrat als

Stickstoffquelle,

Negatives Wachstum in Abv/esenheit von Vitaminen,

Wachstum bei 37°C,

WiderStandsfähigkeit gegen Cycloheximid

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Wachstum auf Malzextrakt:

Nach 3 Tagen bei 23°C sind die Zellen ellipsoidisch oder zylindrisch (2,0 - 6,0) χ (3,5 - 10,0) y. Sie liegen einzeln, in Paaren oder in Ketten vor. Die Pseudonycelien bilden sich in mehr oder weniger großer Menge. Ein Hof erscheint, gelegentlich auch ein Ring.

liach einem Monat bei Umgebungstemperatur hat sich ein großer Hof gebildet. Gewöhnlich ist auch Ringbildung erfolgt.

Wachstun auf gelierten Malzextrakt

Nach 3 Tagen sind die Zellen zylindrisch oder ellipsoidisch und liegen meist einzeln, in Paaren oder in kurzen Ketten .vor. Häufig bildet sich ein Pseudomycelium. Die Kultur ist glänzend und cremefarbig. Die Kolonien sind flach, bisweilen auch faltig. :

Bildung von Ascosporen:

Die diploiden Zellen wandeln sich direkt in ascische um. Zwischen isolierten Zellen kann Konjugation eintreten. Der Schlauchbildung kann Somatogamie vorhergehen. Pro Schlauch^ v/erden 1 bis 4 Sporen gebildet. Die Ascosporen werden in den Medium schnell freigesetzt und agglutiniert. Sie sind nierenförmig oder länglich.

Bildung von Pseudomycelien; -

Auf speziellen Medien tritt auch Bildung eines Pseudorayceliums ein. Es entwickelt sich am besten in anaerobiotischen Medium und kann rudimentär oder verzweigt sein.

Um haploide Klone zu gewinnen, läss,t man den Stamm auf einen nährstoffreichen Medium wachsen (Hefeextrakt, Glucose, Peptone). Die in exponentieller Wachstumsphase befindliche Kultur wird, auf ein Sporenbildungs-Medium übertragen, dessen Zusammensetzung von F. Vezinnet beschrieben worden ist: es handelt sich um eine

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Mischung von gleichen Teilen einer 0,4 molaren Kaliumacetat-Lösung und Sörensen-Phosphat-Puffern M/15 (pH 7).

Nach 48 bis 72 Stunden ist bei 80 % der Zellen Sporenbildung erfolgt. Die Schläuche platzen sehr schnell und setzen die haploiden Sporen in dein Medium frei. In diesem Fall kann man nicht wie gewöhnlich mit dem Mikromanipulator nach Fontbrurie arbeiten, v/eil die Sporen zu 99 % lethal sind, sondern nrnß · zur Gewinnung der haploiden Klone eine thermische Behandlung anwenden. Die vegetativen Zellen sind nämlich weniger wärmebeständig als die Sporen, und eine Behandlung von 2 Minuten bei 60°C gestattet es, 99 % der vegetativen diploiden Formen zu zerstören. Nach dieser Behandlung bringt man auf die Oberfläche eines nährstoffreichen, in Petr!schalen vergossenen Mediums 100 - 200 Kolonien pro Schale auf. Die Schalen v/erden 48 bis 72 Stunden im Brutschrank auf 26°C gehalten und dann untersucht. Die aufgetretenen zellularen Klone v/erden abgenommen. Jedes Klon wird auf einem nährstoffreichen Medium weiter, gezüchtet und dann auf einem Sporenbildungs-riediun geprüft, wobei jedes Klon, das zu Sporen führt, eliminiert wird, v/eil es diploidisch ist. Die nicht sporenbildenden Klone werden als haploidisch angesehen. Un den haploidinchen Charakter jedes Klons zu bestätigen, muß man versuchen, sie durch auxotrophe Mutationen zu kennzeichnen. Einfach und schnell lässt sich dies bewerkstelligen durch Auswahl der Klone, die zu Mutanten führen, welche für eine stickstoffhaltige Säure oder Base bei einer Mutagenese auxotroph sind. Man verfährt dabei so, daß man auf eine Population in stationäre Phase ein physikalisches oder chemisches mutagenes Agens einwirken lässt, wie sie beispielsweise oben für die Mutation von Bakterien beschrieben sind. In vorliegenden Fall verwendet man vorzugsweise Äthylmethansulfonat und überträgt alsdann die Kultur auf ein Medium, welches nur die Vermehrung von Prototrophen zulässt. Auf das bebrütete Medium lässt man nach zwei Generationen ein Antifungicum einwirken. Das Myco- · statin tötet die Zellen in der Wachstumsphase ab, die den

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prototrophen Klonen entsprechen, bei denen keine Mutation erfolgt ist. Nach Verdünnung bringt man 100 Zellen pro Schale auf ein vollständiges Medium, wo sich die Auxotrophen entwickeln können. Die Schalen werden 48 bis 72 Stunden bebrütet. Die Technik des sog. "Replicaplating" gestattet es, dann anschließend die Klone zu bestimmen, die auf einem vollständigen Medium zur Entwicklung gekommen sind, aber auf dem Minimai-Medium keine Kolonien ergeben haben, wo sich nur die Prototrophen entwickeln. Nach 48-stündiger Inkubation ist es möglich, die Auxotrophen zu unterscheiden. Nach dieser Arbeitsweise ist es möglich, haploide Klone zu erzielen. Die so erhaltenen und gekennzeichneten Stämme dienen dann dazu, in der nachfolgenden Stufe Mutanten für eines der Gene auszuwählen, bei denen die Verwertung der Galactose blockiert ist.

Die Technik der Mutation und Selektion auf gal~-Mutanten ist die gleiche, wie sie oben zur Erlangung von auxotrophen Mutanten beschrieben ist; lediglich die Kulturmedien werden verändert. Das "vollständige" Medium, das ein Wachstum ermöglicht, wird Glucose, das "Minimal"-Medium jedoch Galactose enthalten. Wenn nach dem "Replicaplating" eine gewisse Anzahl von Klonen sich auf dem Minimal-Medium nicht entwickelt, werden diese abgenommen und in Flüssigkultur auf den folgenden Medien geprüft: Hefeextrakt + Galactose sowie Molke.

Gewisse von den auf Galactose nicht treibenden Klonen sind für das erfindungsgemäße Verfahren ungeeignet. Beispielsweise wird sich ein für Permease mutierter Stamm nicht auf Galactose entwickeln, weil diese nur durch Osmose eindringen kann. Dieser Stamm verbraucht gleichwohl Galactose nach der Hydrolyse von Lactose, wenn sie im Zelleninneren stattfindet. Es ist möglich, das unterdrückte Enzym durch enzymatische Untersuchunge zu bestimmen. Wenn ein Mutant gal" durch eine Auxotrophie gekennzeichnet ist, muß man deshalb wie bei Bakterien nach einer Reversion suchen, und zwar mit einer der Techniken, wie sie oben beschrieben worden sind. Die so erhaltenen

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Hefestämme können in dem Verfahren nach der Erfindung eingesetzt werden, jedoch wird im allgemeinen die Diploidisierung dieser Stämme angestrebt, weil die diploiden Stämme ein besseres Wachstum als die Haploiden aufweisen.

Eine gewisse Anzahl von Verfahren steht heute bereits zur Verfügung, wenn es gewünscht wird, haploide Stämme diploid zu machen. Man kann Zelle für Zelle kreuzen, mit dem Mikromanipulator arbeiten, oder zwei auxotrophe, erforderlichenfalls komplementäre Klone unter Ausscheidung der Prototrophen kreuzen. Selbstverständlich müssen Klone mit entgegengesetzten Geschlecht zeichen gekreuzt v/erden. Die beschriebene Arbeitsweise ist auf alle Zellen anwendbar, die Lactose und Galactose verwerten können, vorausgesetzt, daß sie diplobiontisch und heterotalisch sind. Bei haplobiontischen Hefen lässt sich die Mutagenese unmittelbar auf die Zellen der Kollektion oder auf die in der Natur isolierten Zellen anwenden.

Bei diplobiontischen homothalischen Hefen' können gewisse Schwierigkeiten auftreten./ so bei Kluyveromyces marxianus. Nach der Sporenbildung ist es möglich, die Sporen zu extrahieren. Jede Spore entwickelt sich unter Erzeugung eines haploiden Klones. Dieses wird sich anschließend diploidisieren, wenn Wachstum erfolgt ist; die Gewinnung von Mutanten ist deshalb sehr schwierig. Die Aussichten, mit den Diploiden einen Mutanten zu erzielen, sind sehr gering und liegen in der Größenordnung von 10 bis 10 . In den angegebenen Fall wird vernachlässigt,ob ein Diploid oder Ilaploid vorliegt.

Die Erfindung ist im nachstehenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

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Beispiel 1

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet· man ein Bakterium das Typs Escherichia coli, das unter Kr. CDS- 6051 B hinterlegt und durch Mutation und Selektion aus einem Stamm erhalten worden ist, der beim Pasteur Institut in Paris unter Nr. 115.15 katalogisiert und mit B 112.21 bezeichnet wird. Dieser Stamm hat den folgenden Genotypus: Thi" gal" (Transferase), Hfr .P 0.00.

Nachdem die Umwandlung der Auxotrophie für Thymin nach dem oben beschriebenen Verfahren erreicht worden ist, wird das Wachstum auf Molke untersucht. Die Vorkulturen v/erden auf einem durch Thiamin ergänzten mineralischen Medium gewonnen, dessen Zusammensetzung wie folgt ist:

K₂H PO₄

PO

Mg SO₄, 7 H₂O

Natriumcitrat mit 2 Eisencitrat Mn SO₄, H₂O

Glucose oder Lactose Thiamin

7 g/l 3 g/l 1 · g/i 0,10 g/l 0,5 g/l 0,3 mg/1 0,17 mg/1 5 g/l 1 mg/1

Die besagte Kultur wird auf thiaminhaltiger Molke gezüchtet,, und zwar in einer Menge von 1 mg/ml bei einer Temperatur von 34°C + 0,5°C. Man schüttelt die Kultur derart, daß das Medium belüftet wird und die Zellen in Suspension gehalten werden (30 Schwingungen pro Minute mit einen Amplitude von 7 cm). Die Kultur wird mit Hilfe der Vorkultur auf mineralischem Medium beimpft. Unter diesen Bedingungen erhält man eine Kultur, die Trockensubstanz in der Größenordnung von 1,5 bis 3,5 mg/ml Molke ergibt. Die Menge der Restzucker wird nach Partridge auf Whatman Nr. I -Papier chromatographisch bestimmt. Alle Chromatogramme ergeben die Anwesenheit von Galactose am Ende des

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VZachstums. Glucose lässt sich auch nicht· in Spuren nachweisen. Ihre gesamte Menge ist nach 48 Stunden Wachstum auf Molke mit 35 g/l Lactose praktisch verbraucht.

Dieser Stamm bewirkt somit den angestrebten Vorgang und hydrolysiert quantitativ die Lactose der Molke in Galactose, welche sich in dem Medium anreichert, während die Glucose verbraucht wird,

Beispiel 2

In diesem Beispiel wird zur Durchführung des Verfahrens eine Hefe Kluyveromyces fragilis SG 11 verwendet, die in DeIft unter Kr. CBS 6498 registriert ist und nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren der Mutation und Selektion aus einem Stamm von Kluyveromyces fragilis erhalten wurde, der als SG 1 bezeichnet wird und unter Nr. CBS 6497 hinterlegt ist.

Die Kulturen werden in 5-Liter Erlenmeyer-Kolben gezüchtet die zu 1/10 ihres Volumens mit roher Molke ohne Wachstumsfaktor gefüllt sind. Die Temperatur wird auf 26°C + o,5°C gehalten. Man bewegt die Kultur mittels einer Schüttelvorrichtung (80 Schwingungen pro Minute mit einer Amplitude von 7 cm). Auf diesem Medium ergibt der Stamm Populationen in der Größenordnung von 300 χ 10 pro ml nach 120 stündigem Wachstum. Dieser Stamm verbraucht die gesamte Lactose der

Molke, welche 35 g/l Lactose enthielt. Das Verschwinden der Lactose und die Anwesenheit von Galactose wird in dem Medium · nach der für Bakterien erwähnten ehromatographisehen Methode bestimmt.

Das Wachstum dieses Stammes ist nach 120 Stunden abgeschlossen, zeigt jedoch eine besonders lange latente Phase von 48 Stunden.

Deispiel 3

Der in diesem Beispiel verwendete Stamm ist Kluyveromyces fragiles SG 12, in DeIft unter Nr. CBS 6499 hinterlegt. Er

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wird wie SG 11 durch Mutation und Selektion aus den. Stann SG 1 von Beispiel 2 erhalten. Die Kultur wurde unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 2 durchgeführt/ jedoch ergibt der Stamm SG 12 Populationen in der Größenordnung von 500 χ 10 Zellen pro ml nach 72 stündigera Wachstum.

Er verbraucht die gesamte Glucose, die der Hydrolyse einer Molke mit 35 g/l Lactose entspricht, und setzt die Galactose quantitativ in der Lösung frei.

Beim Stamm SG 12 beträgt die Latenzphase nur 30 Stunden. Es ist auch möglich, diese Phase zu unterdrücken. Wenn man die Kultur kontinuierlich durchführt, treten keine Latenzphasen auf, jedoch sind die Sterilitäts-Bedingungen schwieriger einzuhalten.

Nach der Fermentation werden in den beiden vorstehenden Fällen die Mikroorganismen abgeschleudert, so daß es möglich ist, einerseits die Hefen oder die Bakterien und andererseits die Galactose-Lösung zu gev/innen. Bei Verv/endung von Hefen kann diese Lösung direkt oder nach Konzentrieren für die Herstellung von Getränken verwendet werden; die Hefen werden gegebenenfalls gewaschen, sodann in der Wärme getrocknet und beispielsweise vermählen. Wenn man Bakterien einsetzt, muß man im allgemeinen die Galactose extrahieren, um sie von den ungenießbaren Fermentationsprodukten abzutrennen. Zu diesem Zweck konzentriert man die Lösung auf einen Trockengehalt von 50 % und kristallisiert durch Abkühlen auf ungefähr 20°C. Wenn eine Galactose vom Codex-Typ gewonnen werden soll, kann es notwendig sein, die Kristallisation nach Reinigung mit Aktivkohle zu wiederholen oder die Galactose mit Äthylalkohol zu extrahieren.

Beispiel 4

Eine entrahmte Milch wird mit dem Stamm Kluyveromyces fragilis CBS Nr. 6498 geimpft. Nach etwa 72 Stunden unter starker Belüftung erreicht die Hefepopulation 4 χ 10 Zellen pro ml.

A09886/U07

•Die Milch enthält keine Lactose mehr, jedoch quantitativ die äquivalente Menge Galactose. Sodann wird die galactosehaltige Milch mit 10 000 g zentrifugiert. Man gewinnt dadurch die Hefezellen, die ein wertvolles Nebenprodukt darstellen, und eine Milch, die Galactose an Stelle von Lactose enthält und ihre organoleptischen Eigenschaften bewahrt hat. Wie oben erwähnt, ist es möglich, den eigentlichen Nährwert der Milch durch Zugabe von Glucose wieder herzustellen.

Beispiel 5

Das Verfahren von Beispiel 4 ,wird wiederholt, jedoch wird die liefe nicht abgeschleudert, sondern in dem Medium suspendiert erhalten, und die Milch wird in Pulverform übergeführt. Das so erhaltene Produkt ist eiweißreicher als gewöhnliche Milch.

409886/1407

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung einer galactosehaltigen Lösung, insbesondere zur Gewinnung von Galactose oder von Getränken, die mit Galactose angereichert sind, dadurch gekennzeichnet, daß man eine lactosehaltige Lösung mit einem Mikroorganisrms-Ilutanten vergärt, der prototroph und nicht pathogen ist,
ß-Galactosidase auf v/eist und die Eigenschaft gal~ besitzt, und daß man gegebenenfalls nach der Fermentation die Mikroorganismen-Masse von der galactosehaltigen Lösung abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Lactose-Lösung Vollmilch oder halb bzw. ganz entrahmte Milch verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Lactose-Lösung Molke verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus eine durch Mutation und Selektion erhaltene Hefe verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mutation an einem haploiden Mikroorganismen-Stamm durchführt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der haploide Mutanten-Stamm diploidisiert ist.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß

man als Hefe einen der Stämme Kluyveromyces fragilis verwendet, die im Centraal Bureau voor Schimmelcultures in Delft unter den Nr. CDS 6493 und 6499 hinterlegt sind.

409886/U07

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3. Verfahren nach Anspruch T, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus ein Bakterium verwendet., v/elches durch Mutation und Selektion aus einem WiIdstamm erhalten worden ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8-, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus ein Bakterium verwendet, welches aus einem nicht pathogenen, auxotrophen, ß-Galactosidase enthaltenden und die Eigenschaft gal~ aufweisenden Bakterien-Mutanten erhalten worden ist, dessen verschiedene Auxotrophien unterdrückt wurden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß

als Bakterium Escherichia coli, hinterlegt unter Kr. CBS 6051 B, verwendet wird.

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterium aus den Enterobacteriaceae und den Lactobacteriaceae ausgewählt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Bakterium ein Escherichia coli verwendet wird.

409886/U07