DE3743135A1 - Verfahren zur herstellung von l-valin - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die mikrobiologische Industrie, insbesondere auf Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren und genauer auf Verfahren zur Herstellung von L-Valin.

Die vorliegende Erfindung kann in der Medizin, in der chemischen, Nahrungs- und Rauchwarenindustrie angewendet werden.

Bekannt ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Valin durch Züchtung von Mikroorganismen der Art Serratia marcescens, die gegen α-Aminobuttersäure beständig sind. Diese Mikroorganismen sind zur Ansammlung von L-Valin bei Züchtung in Medien befähigt, die assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoffquellen, anorganische Salze und Wuchsstoffe enthalten (Journal of "Bacteriology", Nr. 5, 1971, Mai, Kisumi M. et al. "Valine accumulation by α-aminobutyric Acid Resistant mutants of Serratia marcescens", S. 493-499).

Die maximale Ausbeute an L-Valin beträgt bei der Anwendung dieses Verfahrens 9-10 g/l.

Bekannt ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Valin, das auf der Anwendung von Mikroorganismen der Gattungen Corynebacterium und Brevibacterium beruht, die gegen 2-Thiazolalanin beständig sind und gleichzeitig L-Leuzin, L-Isoleuzin oder L-Threolin benötigen (JP, B, 52-116). Die maximale Ausbeute an L-Valin, die mit diesem Verfahren erreicht wird, beträgt 25 g/l.

Bekannt ist auch ein Verfahren zur Herstellung von L-Valin, das auf der Anwendung von Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium und Brevibacterium als Produzenten von L-Valin beruht, die gegen S-Aminoethylzystein beständig sind (JP-B, 58-2678). Dieses Verfahren garantiert eine Ansammlung von L-Valin in der Kulturflüssigkeit bis 30,5 g/l.

Bekannt ist auch ein Verfahren zur Herstellung von L-Valin durch Fermentation, das auf der Anwendung von Mikroorganismen der Gattung Brevibacterium beruht, die für das Wachstum L-Isoleuzin brauchen und zugleich beständig gegen D-Ribose oder Purinribonukleoside oder Pyrimidinribonukleoside sind (JP-B, 58-32594).

Die maximale Ausbeute an L-Valin von 325 g/l wird im Falle erreicht, wenn die genannten Mikroorganismen auch gegen 2-Thiazolalanin beständig sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, bei der Verwendung von neuen Mikroorganismen ein Verfahren zur Herstellung von L-Valin zu entwickeln, das es ermöglicht, die Ausbeute an Endprodukt zu steigern.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß im Verfahren zur Herstellung von L-Valin, das durch Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Brevibacterium auf einem Nährboden, der Kohlenstoff-, Stickstoffquellen, anorganische Salze und organische Stoffe enthält, die das Wachstum von Mikroorganismen stimulieren, durch anschließende Ausscheidung des Endproduktes aus der Kulturflüssigkeit und Reinigung desselben durchgeführt wird, erfindungsgemäß, Mikroorganismen der Gattung Brevibacterium verwendet werden, die gegen Hydroxamat von L-Arginin oder sowohl gegen Hydroxamat von L-Arginin als auch gegen α-Aminobuttersäure in Gegenwart von L-Leuzin beständig sind.

Durch die vorliegende Erfindung erreicht die Ausbeute an L-Valin 55 g/l.

Nach der vorliegenden Erfindung ist es zweckmäßig, Mikroorganismen der Art Brevibacterium flavum zu verwenden, die im Allunions-Forschungsinstitut für die Genetik und Selektion gewerblicher Mikroorganismen deponiert sind:
Stamm Brevibacterium flavum AA52, registriert am 21. April 1986 unter der Nummer B3713;
Stamm Brevibacterium flavum AA53, registriert am 21. April 1986 unter der Nummer B-3714;
Stamm Brevibacterium flavum AA54, registriert am 21. April 1986 unter der Nummer B-3715.

Nach der vorliegenden Erfindung ist es auch zweckmäßig, den Stamm Brevibacterium flavum AA52 zu verwenden, der gegen Hydroxamat von L-Arginin beständig ist.

Nach der vorliegenden Erfindung ist es darüber hinaus zweckmäßig, den Stamm Brevibacterium flavum AA53 oder den Stamm Brevibacterium flavum AA54 zu verwenden, die sowohl gegen Hydroxamat von L-Arginin als auch gegen α-Aminobuttersäure in Gegenwart von L-Leuzin beständig sind.

Weitere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nachstehend durch eine ausführliche Beschreibung des Verfahrens zur Herstellung von L-Valin und Beispiele zur Durchführung dieses Verfahren näher erläutert.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von L-Valin durch Fermentation beruht auf der Verwendung von Mikroorganismen-Produzenten von L-Valin, die auf einem Nährboden gezüchtet werden.

Es wird die Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Brevibacterium vorgeschlagen, die gegen Hydroxamat von L-Arginin beständig sind. Ein konkretes Beispiel solcher Mikroorganismen ist der Stamm-Produzent von L-Valin Brevibacterium flavum AA52, der im Allunions- Forschungsinstitut für die Genetik und Selektion gewerblicher Mikroorganismen deponiert und am 21. April 1986 unter der Nummer B-3713 registriert ist.

Erfindungsgemäß wird auch die Anwendung von Mikroorganismen der Gattung Brevibacterium vorgeschlagen, die sowohl gegen Hydroxamat von L-Arginin als auch gegen α-Aminobuttersäure in Gegenwart von L-Leuzin beständig sind. Als Beispiele solcher Mikroorganismen können die Stamm-Produzenten von L-Valin Brevibacterium flavum AA53 oder Brevibacterium flavum AA54 dienen, die im Allunions-Forschungsinstitut für die Genetik und Selektion gewerblicher Mikroorganismen deponiert und am 21. April unter der Nummer B-3714 bzw. B-3715 registriert sind.

Die Stämme Brevibacterium flavum AA52, AA53 und AA54 benötigen L-Isoleuzin für das Wachstum.

Mutationen der Beständigkeit gegen hohe Konzentrationen von α-Aminobuttersäure in Gegenwart von L-Leuzin und gegen Hydroxamat von L-Arginin und Mutationen der auxotrophen Eigenschaften nach L-Isoleuzin können durch Mutagenisierung von Bakterien nach jedem beliebigen bekannten Verfahren (beispielsweise durch Behandlung mit N-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidin oder mit Ultraviolettstrahlen) erhalten werden.

Die genannten neuen Stämme sind nach einem genetisch- selektiven Verfahren aus dem Stamm Brevibacterium flavum ATCC 14067 hergestellt, der im Allunions-Forschungsinstitut für die Genetik und Selektion gewerblicher Mikroorganismen deponiert und am 16. Januar 1969 unter der Nummer B-42 registriert ist.

Aber als Elternstämme können zur Selektion der in der vorliegenden Erfindung erwähnten Mikroorganismen beliebige Stämme von Mikroorganismen, die zur Gattung Brevibacterium gehören, verwendet werden.

Nachstehend wird ein konkretes Schema der Selektion der Stamm-Produzenten von L-Valin angeführt.

Die Stämme AA52, AA53 und AA54 unterscheiden sich nicht nach ihren Charakteristiken (außer der Beständigkeit gegen Hydroxamat von L-Arginin, a-Aminobuttersäure in Gegenwart von L-Leuzin; auxotropher Eigenschaften nach L-Isoleuzin und der Fähigkeit zur L-Valinerzeugung) von dem Elternstamm Brevibacterium flavum ATCC 14067.

Die zu verwendenden Stamm-Produzenten von L-Valin Brevibacterium AA52, AA53 und AA54 haben die folgende Kultur- und morphologische Charakteristik.

Morphologische Merkmale: die Zellen von 1,7-2,5 µm Länge sind oval, porenfrei, unbeweglich, grampositiv.

Kulturmerkmale: Am zweiten Tage des Wachstums bei 28°C bilden sich der Oberfläche von Fleischpeptonagar Kolonien mit einem Durchmesser von 3,4 mm, rund, mit glatter Kante, die Mitte ist in Form eines Konus leicht gehoben, die Oberfläche ist glatt, glänzend, die Farbe ist gelblich-cremefarben.

Beim Inokulieren des Strichs auf Fleischpepton- Agar: am zweiten Tage ist das Wachstum mäßig, die Kanten sind glatt, die Oberfläche ist glatt, dicht, die Farbe ist gelblich-cremefarben.

Das Wachstum ist in der Masse von Fleichpeptonagar mäßig, grundsätzlich auf der Oberfläche des Mediums.

Mineralisches Nährmedium der folgenden Zusammensetzung (mg/ml): Glukose - 20; Na₂SO₄ - 2; K₂HPO₄- 3; KH₂PO₄ - 1; NH₄Cl - 3; NH₄NO₃-1; MgSO₄ · 7 H₂O - 0,1; MnSO₄ · 5 H₂O - 1 · 10^-4; Biotin - 5 · 10^-5; Thiaminhydrochlorid -1 · 10^-4; L-Isoleuzin - 0,2; FeSO₄ · 7 H₂O - 1 · 10^-4, pH 7,4. Für das Wachstum sind Biotin, Thiamin und L-Isoleuzin erforderlich. Am zweiten Tage des Wachstums bildet bei 28°C Kolonien mit einem Durchmesser von 1 mm, die Farbe ist hellcremefarben. Das Wachstum des Strichs ist am zweiten Tage mäßig, dicht, die Farbe ist hellcremefarben.

Auf Kartoffeln wächst und bildet sich ein Pigment gelber Schattierung.

Verflüssigt Gelatine nicht.

Das Verhalten zu Kohlenstoffquellen: wächst gut auf Glukose, Saccharose, Maltose, Fruchtzucker, Mannose, schwächer auf Galaktose, Rhamnose, Sorbose, Sorbit, Ammonium- und Natriumsalz von Essigsäure, Ethylalkohol; benutzt Laktose nicht.

Das Verhalten zu Stickstoffquellen: assimiliert (NH₄)₂SO₄, NH₄Cl und Harnstoff.

Der Stamm Brevibacterium flavum AA52 wird wie folgt hergestellt.

Der Stamm Brevibacterium flavum ATCC 14067 wird in Fleischpeptonbouillon bei 30°C unter Belüftung bis zur Erreichung eines Titers von 10⁹ Zellen/ml gezüchtet. Zellen werden von der Fleischpeptonbouillon durch Zentrifugieren abgewaschen und man resuspendiert pH 5,5 in einem Zitratpuffer. Der erhaltenen Suspension wird N-Methyl-N′-′-nitro-N-nitrosoguanidin bis zur Erzielung einer Konzentration von 300 µg/ml zugegeben und man inkubiert unter Belüftung während 20 Minuten bei 30°C. Dann werden die Zellen vom Mutagen mit gekühlter Fleischpeptonbouillon abgewaschen, in ein Glas mit 10 ml Fleischpeptonbouillon übertragen, unter Belüftung innerhalb von 10 Stunden bei 30°C inkubiert und danach auf ein Nährmedium Nr. 1 folgender Zusammensetzung (mg/ml) ausgesät : Glukose - 20; Na₂SO₄ - 2; K₂HPO₄ - 3; KH₂PO₄ - 1; NH₄Cl - 3; NH₄NO₃ - 1; FeSO₄ · 7 H₂O - 1 · 10^-4; MgSO₄ · 7 H₂O - 0,1; MnSO₄ · 5 H₂O - 10^-4; Biotin - 5 · 10^-5; Thiaminhydrochlorid - 1 · 10^-4; L-Isoleuzin - 0,2; Agar-Agar - 20; pH 7,4. Unter den Kolonien, die auf diesem Nährmedium Nr. 1 gewachsen waren, wurde nach 48 Stunden der Inkubation bei 30°C eine Mutante ausgewählt, die zum Wachstum auf dem Nährmedium Nr. 1, das kein L-Isoleuzin enthält, unfähig ist. Das erhaltene Isoleuzinauxotroph wird von neuem durch N-Methyl-N′-nitro- N-nitrosoguanidin mutagenisiert und auf das Nährmedium Nr. 1, das auch Hydroxamat von L-Arginin in einer Konzentration von 10 mg/ml enthält, inokuliert. Die Kolonien, die auf diesem Nährmedium gewachsen sind, werden nach 72 Stunden der Inkubation gereinigt und auf die valinerzeugende Fähigkeit geprüft. Ein derart ausgewählter Mutant, der L-Valin erzeugt, ist als Brevibacterium flavum AA52 bezeichnet.

Die Stämme Brevibacterium flavum AA53 und AA54 werden wie folgt hergestellt.

Der Stamm AA52 wird durch N-Methyl-N′-nitro-N- nitrosoguandin mutagenisiert und auf ein Nährmedium Nr. 2 folgender Zusammensetzung (mg/ml) gesät: Glukose - 10; Na₂SO₄ - 2; K₂HPO₄ - 3; KH₂PO₄ - 1; NH₄Cl - 3; NH₄NO₃ - 1; MgSO₄ · 7 H₂O - 0,1; MnSO₄ · 5 H₂O- 1 · 10^-4; FeSO₄ · 7 H₂O - 1 · 10^-4; Biotin - 5 · 10^-5; Thiaminhydrochlorid - 1 · 10^-4; L-Isoleuzin - 0,2; L-Leuzin - 0,2; α-Aminobuttersäure - 55 und Agar-Agar - 20. Die gewachsenen Kolonien werden gereinigt und auf die valinerzeugende Fähigkeit geprüft. Zwei solcher Mutanten, die eine Erhöhung der Menge von L-Valin bewirken, sind als Brevibacterium flavum AA53 und Brevibacterium flavum AA54 bezeichnet.

Das Inokulum von Stamm-Produzenten für eine nachfolgende Fermentation kann nach jedem beliebigen bekannten Verfahren hergestellt werden, solches wie Züchtung auf der Oberfläche fester agarisierter Nährmedien oder in flüssigen Nährmedien, die assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoffquellen, anorganische Salze und organische Stoffe, die das Wachstum von Mikroorganismen bewirken, enthalten.

Zu den organischen Stoffen gehören Vitamine (Biotin, Thiamin) sowie andere Verbindungen, darunter auch Aminosäuren, im Falle, wenn sie für das Wachstum eines konkreten Stamm-Produzenten tätig sind.

Als Nähr- und Fermentationsmedium zur Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Brevibacterium, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können beliebige Nährmedien angewendet werden, die assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoffquellen, anorganische Salze und organische Stoffe, die das Wachstum von Mikroorganismen und die Anreicherung von L-Valin stimulieren, enthalten.

Als assimilierbare Kohlenstoffquellen können Kohlenhydrate, solche wie Saccharose, Glukose, Fruchtzucker, Maltose, Mannose, Stärke, Stärkehydrolysat und Melasse; mehrwertige Alkohole, solche wie Glyzerin und Sorbit; organische Säuren, solche wie Ameisensäure, Essigsäure, Milchsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Propionsäure; Alkohole, solche wie Methanol und Ethanol angewendet werden. Die genannten Kohlenstoffquellen können sowohl einzeln als auch in Kombination in verschiedenen Massenverhältnissen verwendet werden. Die Gesamtmenge des Stoffes einer Kohlenstoffquelle kann am Anfang der Fermentation oder portionsweise während der Fermentation eingeführt werden.

Als assimilierbare Stickstoffquelle können sowohl organische wie auch anorganische Salze von Ammonium, zum Beispiel Ammoniumsulfat, -chlorid, -carbonat, -acetat, -nitrat, -phosphat, -laktat; Harnstoff; verschiedene natürliche stickstoffhaltige Verbindungen, zum Beispiel Pepton, Hefehydrolysat, Fleischextrakt und Pflanzeneiweißhydrolysate angewendet werden.

Als anorganische Salze können Kalium-, Natriumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisensalze und Manganate, Calciumcarbonat angewendet werden.

Als organische Stoffe, die für das Wachstum der obengenannten Mikroorganismen notwendig sind, können Thiamin (zum Beispiel in Form von Hydrochlorid oder Bromid); Biotin oder dessen Ersatzstoffe (zum Beispiel Destiobiotin, Biozin, 7,8-Diaminopelargonsäure) und auch Aminosäuren, wenn sie für das Wachstum von Mikroorganismen nötig sind, beispielsweise L-Isoleuzin angewendet werden. Unter der Bedingung des Vorliegens organischer Stoffe in einer ausreichenden Menge als Bestandteil der anderen Komponenten des Nährmediums entfällt die Notwendigkeit, diese organischen Stoffe in reiner Form einzutragen.

Als Beispiel konkreter Zusammensetzung des Fermentationsmediums kann die folgende dienen:

Saccharose oder Glukose100-200 g/l Ammoniumsulfat40-80 g/l Magnesiumsulfat0,5-10 g/l Kaliumdihydrogenphosphat0,5-10 g/l L-Isoleuzin0,1-0,4 g/l

und auch Eisen- und Mangansulfat, Biotin und Thiamin. Eine Ansammlung von L-Valin wird in 6-8 Stunden nach Beginn der Fermentation nachgewiesen. Aber die maximale Menge von L-Valin wird in der Kulturflüssigkeit im Ergebnis eines vollständigen Verbrauchs an Kohlenstoff- und Energiequelle (in 26 Stunden und mehr nach Beginn der Fermentation in Abhängigkeit von der verwendeten Konzentration von Kohlenstoff- und Energiequelle) erzielt.

Der Gehalt an L-Valin in der Kulturflüssigkeit und anderen Lösungen wird durch Papierchromatografie und Färbung mit Ninhydrin oder mit Hilfe eines Aminosäurenanalysator ermittelt.

Das angesammelte L-Valin kann aus der Kulturflüssigkeit nach jedem beliebigen bekannten Verfahren isoliert werden, solches wie Entfernung von Mikroorganismen und anderer ungelöster Teilchen durch Zentrifugieren oder Filtrieren, Adsorbieren von L-Valin auf Ionenaustauscherharze und anschließende Eluieren, Konzentrieren und Kristallisieren von L-Valin.

Beispiel 1

Das Inokulum vom Stamm Brevibacterium flavum AA54 wird wie folgt hergestellt. In Prüfgläser, die je 10 ml sterile Fleischpeptonbouillon, pH 7,5, enthalten, wird aseptisch die Kultur AA54 eingetragen, die auf der Oberfläche des Fleischpepton-Agars gezüchtet ist, die Prüfgläser werden innerhalb von 16 Stunden unter Schaukeln inkubiert.

In Fermentationskolben von 500 ml Inhalt wird aseptisch je 15 ml sterilisiertes Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung (g/l) eingegossen: Saccharose - 150; (NH₄)₂SO₄ - 55; KH₂PO₄ - 0,1; MgSO₄ · 7 H₂O - 1; CaCO₃ - 50; FeSO₄ · 7 H₂O - 0,01; MnSO₄ · 5 H₂O - 0,01 Biotin - 0,0005; Thiaminhydrochlorid - 0,0005; L-Isoleuzin - 0,25; pH 7,5.

In Kolben wird je 1 ml Inokulum vom Stamm Brevibacterium flavum AA54 eingetragen und innerhalb von 95 Stunden bei 30°C unter Schaukeln (220 U/min) inkubiert. Der Gehalt an L-Valin in der Kulturflüssigkeit beträgt nach der Beendigung der Fermentation 55,3 g/l.

250 ml erhaltene Kulturflüssigkeit von Stamm Brevibacterium flavum AA54, die 13,8 g L-Valin enthält, wird zentrifugiert (5000 U/min während 20 min), damit die Bakterien und andere ungelöste Teilchen entfernt werden. Die über dem Rückstand gebildete Schicht wird durch eine Säule mit Ionenaustauschharz in H⁺-Form in Richtung von unten nach oben mit einer Geschwindigkeit von 0,6 Volumeneinheiten der Lösung pro 1 Volumeneinheit des Harzes pro 1 Stunde durchgelassen. Die Säule wird mit Wasser durchgespült, und das adsorbierte L-Valin wird mit einer 3,5%igen wäßrigen Ammoniaklösung eluiert. Das erhaltene Eluat wird unter Vakuum bis zum Auftreten von Kristallen konzentriert, die weitere Kristallisation von L-Valin wird während 3 Stunden bei +5°C durchgeführt. Die Kristalle werden von der Lösung durch Filtrieren mit einem Papierfilter abgetrennt und unter Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an L-Valin beträgt 8,7 g ohne Berücksichtigung seines Gehaltes in der Mutterlauge, was die Gesamtausbeute 63% von dem Gehalt in der Kulturflüssigkeit ergibt.

Der Reinheitsgrad des Produktes beträgt nach den Angaben der Papierchromatografie 96,6%.

Beispiel 2

Das Verfahren wird unter den Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, aber als Stamm-Produzent von L-Valin wird der Stamm Brevibacterium flavum AA53 angewendet, wobei eine Konzentration von Saccharose im Fermentationsmedium gleich 120 g/l genommen wird.

Der Gehalt an L-Valin in der Kulturflüssigkeit nach 72 Stunden der Inkubation beträgt 41,7 g/l.

Weiter wird die Reinigung ähnlich wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.

Beispiel 3

Das Verfahren wird unter den Bedingungen wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, aber als Stamm-Produzent von L-Valin wird der Stamm Brevibacterium flavum AA54 angewendet.

Der Gehalt an L-Valin in der Kulturflüssigkeit beträgt nach 72 Stunden der Inkubation 43,5 g/l.

Weiter wird die Reinigung ähnlich wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.

Beispiel 4

Das Verfahren wird unter den Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, aber als Stamm- Produzent von L-Valin wird der Stamm Brevibacterium flavum AA53 angewendet.

Die Ausbeute an L-Valin in der Kulturflüssigkeit beträgt 52,7 g/l.

Weiter wird die Reinigung ähnlich wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.

Beispiel 5

Das Verfahren wird unter den Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, aber als Stamm-Produzent von L-Valin wird der Stamm Brevibacterium flavum AA52 angewendet.

Der Gehalt an L-Valin in der Kulturflüssigkeit beträgt 17,2 g/l.

Weiter wird die Reinigung ähnlich wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung von L-Valin durch Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Brevibacterium auf einem Nährboden, der Kohlenstoff-, Stickstoffquellen, anorganische Salze und organische Stoffe enthält, die das Wachstum von Mikroorganismen stimulieren, und anschließende Isolierung des sich bildenden L-Valins aus der Kulturflüssigkeit und Reinigung des ausgeschiedenen L-Valins, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Gattung Brevibacterium verwendet die gegen Hydroxamat von L-Arginin oder sowohl gegen Hydroxamat von L-Arginin als auch gegen α-Aminobuttersäure in Gegenwart von L-Leuzin beständig sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Art Brevibacterium flavum anwendet, die im Allunions-Forschungsinstitut für Genetik und Selektion von gewerblichen Mikroorganismen deponiert sind:
Stamm Brevibacterium flavum AA52, registriert am 21. April 1986 unter der Nummer B-3713, der gegen Hydroxamat von L-Arginin beständig ist;
Stamm Brevibacterium flavum AA53, registriert am 21. April 1986 unter der Nummer B-3714, und
Stamm Brevibacterium flavum AA54, registriert am 21. April 1986 unter der Nummer B-3715,
die sowohl gegen Hydroxamat von L-Arginin als auch gegen α-Aminobuttersäure in Gegenwart von L-Leuzin beständig sind.

3. Biologisch reine Kulturen von Mikroorganismen, die Charakteristiken eines beliebigen der nachstehenden Stamm-Produzenten von L-Valin,
Brevibacterium flavum AA52,
Brevibacterium flavum AA53,
Brevibacterium flavum AA54
aufweisen und mit diesen identifiziert werden.