CN104561074B - 一株高产l‑缬氨酸工程菌的构建及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高产L‑缬氨酸工程菌的构建及其应用。本发明提供了制备重组菌的方法，包括如下步骤：将乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分子、乙酰羟基酸异构还原酶编码DNA分子、支链氨基酸转氨酶编码DNA分子和二羟酸脱水酶编码DNA分子导入目的菌中，得到重组菌。本发明的实验证明了本发明利用黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)MDV‑07发酵生产L‑缬氨酸，可以大大提高L‑缬氨酸的产率，提高转化率，极具生产应用价值。

Description

一株高产L-缬氨酸工程菌的构建及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一株高产L-缬氨酸工程菌的构建及应用该菌种进行L-缬氨酸发酵生产的方法。

背景技术

L-缬氨酸(L-valine)是人体八种必需氨基酸之一，也是一种支链氨基酸，在人体及其他动物的代谢过程中有显著的功能，可应用于制药工业、食品行业及饲料行业等。

在医药领域，L-缬氨酸是复合氨基酸输液和氨基酸注射液的原料，由其配制的复合氨基酸输液在血脑屏障、肝昏迷、慢性肝硬化以及肾功能衰竭的治疗，先天性代谢缺陷病的膳食治疗，败血症及术后糖尿病患者的治疗，加快外科创伤愈合的治疗和肿瘤患者的营养支持治疗中应用广泛。近年研究发现，L-缬氨酸是一种治疗高血压特效药-缬沙坦的原料，需求量猛增。食品方面，鉴于支链氨基酸在肌肉组织中的代谢特性，常作为运动时的能量来源，并且加强运动过程中对肌肉的维护，减轻肌肉疲劳等作用，常用于保健食品及运动饮料当中。饲料工业方面，L-缬氨酸对哺乳动物乳腺组织分泌乳汁及提高动物免疫力有重要作用，同样对动物的肌肉生长也有促进作用。

L-缬氨酸的生产方法主要有提取法、化学合成法、发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制、生产成本高、收率低，污染严重，难以实现工业化生产。微生物直接发酵法是借助于微生物自身具有合成所需氨基酸的能力，生产L-缬氨酸具有原料来源广泛，成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是一种非常经济、高效的生产方法。短杆菌是用于生产L-氨基酸(如L-谷氨酸、L-亮氨酸和L-缬氨酸等)的主要微生物,其中黄色短杆菌或谷氨酸棒杆菌是其中的主要代表，在微生物发酵生产L-缬氨酸工业中占有非常重要的地位。

由于其用途广泛，市场上L-缬氨酸总是处于供不应求局面，带动各生产企业在L-缬氨酸产量及其生产成本等方面的良性竞争，开发新的优良菌株就显得尤为关键。传统的菌株选育主要是鉴于自然界中有产L-缬氨酸能力的菌株，结合反复诱变选育，并通过优化培养提高L-缬氨酸产率，但是该方法所能积累的氨基酸的水平有限，诱变育种的方法盲目性大，工作量繁重，遗传背景不明，很难通过进一步的诱变或改造来提高产量，所以且产率受到了极大的限制。而且诱变获得的菌株抗杂菌能力一般较弱，极易造成染菌，也不利于工业放大生产。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备重组菌的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分子ilvBN^*、乙酰羟基酸异构还原酶编码DNA分子ilvC、支链氨基酸转氨酶编码DNA分子ilvE和二羟酸脱水酶编码DNA分子ilvD导入目的菌中，得到重组菌。

乙酰羟酸合成酶突变体为仅将乙酰羟酸合成酶氨基酸序列第782位的甘氨酸(G)突变为谷氨酸(E)，且不改变其他氨基酸残基得到的蛋白质；其与乙酰羟酸合成酶相比，仅是第782位氨基酸不同，其他氨基酸残基均相同。

所述乙酰羟酸合成酶突变体的氨基酸序列为序列表中序列5.

所述乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分子为将乙酰羟酸合成酶编码DNA分子核苷酸序列6第2377位的g突变为a；

所述乙酰羟酸合成酶编码DNA分子核苷酸序列为序列表中序列6。

上述方法中，所述乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分子、乙酰羟基酸异构还原酶编码DNA分子、支链氨基酸转氨酶编码DNA分子和二羟酸脱水酶编码DNA分子通过重组载体导入目的菌中。

上述方法中，所述重组载体pZ8-1BN^*CED为将含有所述支链氨基酸转氨酶编码DNA分子和所述二羟酸脱水酶编码DNA分子的DNA片段ilvED插入中间载体pZ8-1BN^*C得到的载体；具体为将序列表的序列4所示的ilvED插入上述一制备的载体pZ8-1BN^*C的BamHⅠ酶切位点间得到的载体；

所述中间载体pZ8-1BN^*C为将含有所述乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分子和所述乙酰羟基酸异构还原酶编码DNA分子的DNA片段ilvBN^*C插入表达载体得到的载体；具体为将序列表的序列1自5’末端第1至3700位核苷酸所示的ilvBN^*C(编码BNC蛋白)插入载体pZ8-1的BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切位点间得到的载体。

上述方法中，所述支链氨基酸转氨酶编码DNA分子和所述二羟酸脱水酶编码DNA分子组成的融合基因的核苷酸序列为序列表中序列4，其中序列4自5’末端第16-1155位核苷酸为支链氨基酸转氨酶编码DNA分子，序列4自5’末端第1464-3302位核苷酸为二羟酸脱水酶编码DNA分子。

所述乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分子和所述乙酰羟基酸异构还原酶编码DNA分子组成的融合基因的核苷酸序列为序列表中序列1，其中序列1自5’末端第21-2382位核苷酸为乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分子，序列1自5’末端第2614-3630位核苷酸乙酰羟基酸异构还原酶编码DNA分子。

上述方法中，所述目的菌为黄色短杆菌Brevibacterium flavum。

由上述方法制备的重组菌也是本发明保护的范围。

上述重组菌为黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)MDV-07CCTCC NO:M2014621。

上述的重组菌在制备L-缬氨酸中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种制备L-缬氨酸的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述的重组菌，收集发酵产物的上清液，即得到L-缬氨酸。

上述方法中，所述发酵条件为在发酵培养基中28-33℃、200-250r/min振荡培养50-60小时；

或所述发酵条件为在发酵培养基中28-33℃、培养70-80小时，其使所述发酵过程中发酵体系中的溶氧量为30-50％，葡萄糖含量为0.8-1.0g/100mL。

黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)MDV-07简称黄色短杆菌MDV-07，已于2014年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO:M 2014621，分类命名为Brevibacterium flavum MDV-07。

本发明的实验证明，本发明构建了重组工程菌黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)MDV-07，用其发酵生产L-缬氨酸，在30L全自动发酵罐采用该生产工艺发酵生产L-缬氨酸，可以大大提高L-缬氨酸的产率，而且大大降低L-缬氨酸发酵过程中的染菌概率，提供的黄色短杆菌工程菌可直接发酵得到L-缬氨酸，发酵70-80小时后，发酵液中的L-缬氨酸含量达85g/L-95g/L，糖酸转化率达35％-40％，极具生产应用价值。

附图说明

图1为外源表达载体pMDBN^*C的结构示意图。

图2为载体pZ8-1的结构示意图。

图3为重组载体pZ8-1BN^*C的结构示意图。

图4为重组载体pMDilvED的结构示意图。

图5为重组载体pZ8-1BN^*CED的结构示意图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、高产L-缬氨酸工程菌的构建

一、重组载体pZ8-1BN^*C的构建

1、pMDBN^*C载体的构建

1)、根据已公布在NCBI的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组信息及基因功能注释，结合L-缬氨酸的代谢途径分析，设计引物BNC-F、BNC-R，以黄色短杆菌20160基因组为模板，PCR扩增串联在基因中的ilvBN基因和ilvC基因，以及他们本身携带的核糖体结合位点序列(RBS),得到扩增产物——ilvBNC基因片段。

BNC-F:5’-GAATTC AGTAAAGGAGCCAGAAAGTCGTG-3’；

BNC-R:5’-GGATCC GTACAAAGTGCACAGCAGGTAGC-3’。

其中引物BNC-F带有EcoRⅠ酶切位点(下划线序列)，引物BNC-R带有BamHⅠ酶切位点(下划线序列)。

PCR扩增条件：95℃预变性5分钟；94℃变性40秒、57℃退火1分钟、72℃延伸3分钟，30个循环；72℃10分钟，4℃保存。

2)、回收步骤1)的PCR扩增产物并插入载体Simple pMD-18T(购自于宝生物工程(大连)有限公司)，得到载体pMDBNC。

3)、以步骤2)的重组载体pMDBNC为模板，用BN^*C-F和BN^*C-R组成的引物对进行PCR扩增(将ilvBNC串联基因片段中的ilvN进行定点突变，将定点突变后的基因命名为ilvBN^*C基因)，得到PCR扩增产物(模板与突变后的环状质粒的混合物)。

4)、将步骤3)的PCR扩增产物用DPNⅠ酶处理1小时(去除模板)，并转化感受态细胞JM109，得到重组载体pMDBN^*C(结构示意图见图1)。

根据测序结果，重组载体pMDBN^*C为将序列表的序列1自5’末端第1至3700位核苷酸所示的ilvBN^*C基因插入载体pMD-18T中得到的重组载体，ilvBN^*C基因与野生型ilvBNC基因的差异仅在于第2381位的核苷酸由G突变为了A。

BN^*C-F:5’-CGAACTGATCCAATCCGACAGATTGCACTCAAC-3’；

BN^*C-R:5’-CGGATTGGATCAGTTCGCGGATTCCGAATGGT-3’

2、重组载体pZ8-1BN^RC的构建

1)、用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pMDBN^*C载体，回收约3750bp的基因片段；

2)、用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切载体pZ8-1(Expression of theCorynebacterium glutamicum panD Gene Encoding L-Aspartate-a-DecarboxylaseLeads to Pantothenate Overproduction in Escherichia coli，APPLIED ANDENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,Vol.65,No.4；1530–1539，1999.见图2；公众可从福建师范大学和福建省麦丹生物集团有限公司获得)，回收约7000bp的载体骨架；

3)、将步骤1)的基因片段和步骤2)的载体骨架片段连接，得到重组质粒pZ8-1BN^*C。

经过测序，重组质粒pZ8-1BN^*C为将序列表的序列1自5’末端第1至3700位核苷酸所示的ilvBN^*C基因(编码乙酰羟酸合成酶突变体和乙酰羟酸同分异构酶)插入载体pZ8-1的BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切位点间得到的载体，其结果示意图如图3所示。

其中序列1自5’末端第21-2382位核苷酸为乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分子ilvBN^*，序列1自5’末端第2614-3630位核苷酸乙酰羟基酸异构还原酶编码DNA分子ilvC。

二、ilvE基因和ilvD基因的扩增及融合

1、ilvD基因的扩增及纯化

1)、根据已公布在NCBI的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组信息及基因功能注释，设计引物ilvD-F、ilvD-R，以黄色短杆菌20160基因组为模板，PCR扩增ilvD基因，及其自身携带启动及终止序列,得到完整基因片段扩增产物——ilvD基因片段。

ilvD-F:5’-TAGGTTCTAGGTCTGTAGTT GTACTTGGAGCGCCAAAAGGCACT-3’；

ilvD-R:5’-AGATCT GAGTCGAGGCAGAGTTCGCTGGTT-3’。

其中上游引物ilvD-F带有20bp的用于重叠延伸的融合碱基序列，酶切位点(下划线序列)，下游引物ilvD-R带有BglⅡ酶切位点(下划线序列)

PCR扩增条件：95℃预变性5分钟；94℃变性40秒、59℃退火1分钟、72℃延伸3分，30个循环；72℃10分钟，4℃保存。

2)、采用PCR产物凝胶回收试剂盒(购自于上海生工)将步骤1的PCR扩增产物进行回收和纯化，得到纯化的ilvD基因片段，经过测序，其核苷酸序列为序列表中序列2。

2、ilvE基因的扩增及纯化

1)、根据已公布在NCBI的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组信息及基因功能注释，设计引物ilvE-F、ilvE-R，以黄色短杆菌20160基因组为模板，PCR扩增ilvE基因，及其自身携带的SD序列,得到扩增产物——ilvE基因片段。

ilvE-F:5’-

AGATCT GAAAGGAGATATACCGTGTATCTGTCAGGTAGCAGGTGT-3’；

ilvE-R:5’-

AACTACAGACCTAGAACCTA TTAGCCAACCAGTGGGTAAAGCCAT-3’。

其中上游引物ilvE-F带有BglⅡ酶切位点，酶切位点(下划线序列)，下游引物ilvE-R带有20bp的用于重叠延伸融合的碱基序列(下划线序列)

PCR扩增条件：95℃预变性5分钟；94℃变性40秒、55℃退火1分钟、72℃延伸1分30秒，30个循环；72℃10分钟，4℃保存。

2)、采用PCR产物凝胶回收试剂盒(购自于上海生工)将步骤1的PCR扩增产物进行回收和纯化，得到纯化的ilvE基因片段，经过测序，其核苷酸序列为序列表中序列3。

3、ilvE基因和ilvD基因的融合

1)、以上述获得的纯化的ilvE基因片段和ilvD基因片段互为模板和引物，进行PCR，进行十个PCR循环，PCR扩增条件：95℃预变性5分钟；94℃变性40秒、55℃退火1分钟、72℃延伸2分30秒，10个循环，72℃保存。

2)、上述反应进行了10个循环之后，再加入引物ilvE-F和引物ilvD-R继续进行PCR反应二十五循环，PCR扩增条件：95℃预变性5分钟；94℃变性40秒、55℃退火1分钟、72℃延伸4分30秒，25个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

3)、采用PCR产物凝胶回收试剂盒(购自于上海生工)将步骤2的PCR扩增产物进行割胶回收和纯化，割取大小约为4400bp的目的条带，得到纯化的ilvED片段，经测序，其核苷酸序列为序列表中序列4。

4)、将上述纯化的ilvED片段插入载体Simple pMD-18T(购自于宝生物工程(大连)有限公司)，得到载体pMDilvED(结构示意图见图4)。

三、外源表达载体pZ8-1BN^*CED的构建

将上述二制备的重组载体pMDilvED进行BglⅡ酶切，并采用去磷酸化酶(购自于宝生物工程(大连)有限公司)进行末端去磷化，并采用电泳割胶纯化回收约为4400bp融合的ilvED基因的酶切片段。

另外，将pZ8-1BN^*C载体进行BamHⅠ酶切，并采用去磷酸化酶(购自于宝生物工程(大连)有限公司)进行末端去磷化，并采用电泳割胶纯化回收约为11000bp的线性载体基因片段。

将上述纯化回收的ilvED和线性的pZ8-1BN^*C基因片段采用T4连接酶(购自于宝生物工程(大连)有限公司)，16℃连接反应过夜，并转化感受态的JM109细胞，采用质粒提取试剂盒(购自于上海生工)进行重组质粒抽提和验证(BamHⅠ酶切，得到4400bp片段为阳性)，确认重组质粒pZ8-1BN^*CED构建成功，外源表达载体pZ8-1BN^*CED结构示意图见图5。

经过测序，重组载体pZ8-1BN^*CED为将序列表的序列4所示的ilvED插入上述一制备的载体pZ8-1BN^*C的BamHⅠ酶切位点间得到的载体。

其中序列4自5’末端第16-1155位核苷酸为支链氨基酸转氨酶编码DNA分子ilvE，序列4自5’末端第1464-3302位核苷酸为二羟酸脱水酶编码DNA分子ilvD。

四、高产L-缬氨酸工程菌MDV-07的构建

将外源表达载体pZ8-1BN^*CED电击转化黄色短杆菌CICC 20160(购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心，目录编号20160)，采用含卡那霉素抗性(终浓度30-50μg/mL)平板进行筛选，然后用ilvE-F和ilvD-R组成的引物对进行PCR鉴定(显示约4400bp的特异条带的为PCR鉴定阳性)，得到工程菌。

将工程菌命名为黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)MDV-07。黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)MDV-07简称黄色短杆菌MDV-07，已于2014年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO:M 2014621，分类命名为Brevibacterium flavum MDV-07。

采用同样的方法，将空载体pZ8-1转入黄色短杆菌20160中，得到重组菌20160/pZ8-1。

实施例2、黄色短杆菌MDV-07在生产L-缬氨酸中的应用

一、培养基的制备

种子培养基(pH＝6.5-7.5)：取100g葡萄糖、5g玉米浆、100g黄豆饼粉酶解液、3g酵母膏、5g(NH₄)₂SO₄、0.2g MgSO₄·7H₂O、0.3g KH₂PO₄·3H₂O、0.03g单硫酸卡那霉素和10g碳酸钙用去离子水溶解并定容至1L；

其中黄豆饼粉酶解液的制备方法为：将100g黄豆磨粉，加400mL去离子水拌匀，调pH值为6.5-7.0，加入1％终浓度中性蛋白酶(购自于上海佳和生物科技有限公司)，60℃酶解3h即成黄豆饼粉酶解液。125℃灭菌25min。

发酵培养基(pH＝6.5-7.5)：取120g葡萄糖、20g玉米浆、50g黄豆饼粉酶解液、7g(NH₄)₂SO₄、1.0g KH₂PO₄·3H₂O、2g K₂HPO₄·3H₂O、0.2g MgSO₄·7H₂O、0.02g FeSO₄·7H₂O、0.02g MnSO₄·H₂O、130ug维生素H、1mg维生素B1、1mg维生素B6、、0.03g单硫酸卡那霉素、20gCaCO₃用去离子水溶解并定容至1L；所述黄豆饼粉酶解液的制备方法为：将100g黄豆磨粉，加400mL去离子水拌匀，调pH值为6.5-7.0，加入1％终浓度中性蛋白酶(购自于上海佳和生物科技有限公司)，60℃酶解3h即成黄豆饼粉酶解液。125℃灭菌25min。

二、摇瓶发酵生产L-缬氨酸

1、应用黄色短杆菌MDV-07生产L-缬氨酸

(1)种子培养

将一环实施例1制备的黄色短杆菌MDV-07斜面种子接种至装有30mL种子培养基的250mL摇瓶中，8层纱布封口，28-33℃振荡培养(200-250r/min)至对数生长中后期(14-18小时)，得到种子液(种子液的OD_562nm＝40-45)。

(2)发酵培养

将3mL种子液接种至装有30mL发酵培养基的250mL三角瓶中，8层纱布封口，28-33℃，振荡培养(200-250r/min)50-60小时，具体为28℃，振荡培养250r/min、60小时。

(3)将步骤(2)的发酵体系离心(4℃、5000g、15min)，收集上清液(发酵液)。

2、对照液的制备

将黄色短杆菌20160代替黄色短杆菌MDV-07进行步骤1的实验，收集上清液(对照液)。

将重组菌20160/pZ8-1代替黄色短杆菌MDV-07进行步骤1的实验，收集上清液(对照液空载体)。

3、检测L-缬氨酸含量

检测发酵液、对照液和照液空载体中的L-缬氨酸含量(采用日立L-8800型氨基酸自动分析仪进行测定)。

发酵液中的L-缬氨酸浓度为22g/L(上清液)，对照液中的L-缬氨酸浓度为4g/L。

对照液和对照液空载体的结果无显著差异。

三、工业发酵生产L-缬氨酸

将黄色短杆菌MDV-07(或黄色短杆菌20160或重组菌20160/pZ8-1)进行30L全自动发酵罐进行补料分批发酵，具体步骤如下：

1、第一阶段培养

采用30L发酵罐，种子培养基的装液量为15L，培养时间为14-18小时，溶氧(DO)30-50％，温度28-33℃；得到种子液(种子液的OD_562nm＝40-45)。

2、第二阶段培养

采用30L发酵罐，发酵培养基的装液量为15L，培养时间为70-80小时(通过控制流加75％的葡萄糖水溶液，维持发酵罐中的葡萄糖含量为0.8-1.0g/100mL)，溶氧(DO)30-50％，温度28-33℃，具体为培养时间为70小时(通过控制流加75％的葡萄糖水溶液，维持发酵罐中的葡萄糖含量为0.8-1.0g/100mL，溶氧(DO)30-50％，温度28℃。

3、将步骤2的发酵体系(4℃、5000g、15min)，收集上清液(发酵液)。

糖酸转化率(糖酸转化率(％)＝培养过程中总的葡萄糖消耗量g÷(放罐L-缬氨酸浓度g/L×放罐体积L)×100％)

采用上述一的方法检测，结果如下：

黄色短杆菌MDV-07发酵液中的L-缬氨酸浓度为92.5g/L，糖酸转化率达38.4％；黄色短杆菌20160发酵液中的L-缬氨酸浓度为10g/L，糖酸转化率为13％。

对照液和对照液空载体的结果无显著差异。

Claims (4)

1.一种重组菌，按照如下方法制备：将乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分子、乙酰羟基酸异构还原酶编码DNA分子、支链氨基酸转氨酶编码DNA分子和二羟酸脱水酶编码DNA分子导入目的菌中，得到重组菌；

所述乙酰羟酸合成酶突变体为仅将乙酰羟酸合成酶氨基酸序列第782位的甘氨酸突变为谷氨酸，且不改变其他氨基酸残基得到的蛋白质；

所述乙酰羟酸合成酶的氨基酸序列为序列表中序列5；

所述目的菌为黄色短杆菌Brevibacterium flavum；

所述乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分子、乙酰羟基酸异构还原酶编码DNA分子、支链氨基酸转氨酶编码DNA分子和二羟酸脱水酶编码DNA分子通过重组载体导入目的菌中；

所述重组载体为将含有所述支链氨基酸转氨酶编码DNA分子和所述二羟酸脱水酶编码DNA分子的DNA片段插入中间载体得到的载体；

所述中间载体为将含有所述乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分子和所述乙酰羟基酸异构还原酶编码DNA分子的DNA片段插入表达载体得到的载体；

所述含有所述支链氨基酸转氨酶编码DNA分子和所述二羟酸脱水酶编码DNA分子的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列4；

所述含有所述乙酰羟酸合成酶突变体编码DNA分子和所述乙酰羟基酸异构还原酶编码DNA分子的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列1；

所述中间载体为载体pZ8-1。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)MDV-07CCTCC NO:M 2014621。

3.权利要求1或2所述的重组菌在制备L-缬氨酸中的应用。

4.一种制备L-缬氨酸的方法，包括如下步骤：发酵权利要求1或2所述的重组菌，收集发酵产物的上清液，即得到L-缬氨酸。