CN101619298B - 5千亿活芽胞每克枯草芽胞杆菌原粉制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种5千亿活芽胞每克枯草芽胞杆菌原粉制备方法，其步骤是：A.Bs菌种的筛选，从土壤和水体中收集样品，在无菌超净台上，称取样品装入小三角瓶中，加入无菌水，静置；B.Bs菌种的确认，根据16S rDNA序列进行分子分类，该菌株的16SrDNA共测定有效碱基，鉴定该菌株；C.Bs的培养基，采用Box-Behken设计的响应面实验，以芽胞数为筛选指标，利用单因子实验首先从众多碳源、氮源、微量元素因子中选择因子；D.高密度液体补料发酵技术提高发酵生物量，以响应面法的培养基进行分批发酵，以发酵前期，对数期，稳定期OD、溶氧、pH、芽胞数为指标；E.芽胞提取与回收工艺；F.活芽胞数检测。由该工艺生产的枯草芽胞杆菌原药中的活芽胞数达5,000亿/克。

Description

5千亿活芽胞每克枯草芽胞杆菌原粉制备方法

技术领域

本发明涉及饲料工业和水体净化剂一种枯草芽胞杆菌原药(5,000亿活芽胞/克)的制备方法，将在饲料工业和水产养殖方面上得到广泛应用。随着芽胞杆菌功能还在不断地被发现，应用范围也在不断扩大，该产品将应用到如污染水体净化、水果保鲜、垃圾除臭等新领域，在国内国际市场上有很强的竞争力。 

背景技术

自20世纪50年代以来，抗生素作为疾病治疗剂和动物生长促进剂发挥了重大作用。然而，由于抗生素负面效果越来越严重，世界卫生组织已禁止在饲料中使用任何抗菌药物，一些发达国家对兽用抗生素的使用也有明确规定。饲料和养殖业以添加抗生素预防和促进动物生长的饲养方式已经受到了很大冲击，抗生素替代品的使用和推广成为养殖业发展的必然方向。芽胞杆菌益生菌具备抗生素预防疾病和促进生长的特点，成为抗生素的替代品，将取得理想的应用效果，在养殖业中具有很大的开发潜力。 

益生菌又称微生态制剂，是指有益微生物经过特殊驯化和加工制成的活菌制剂，益生菌可以改善动物肠道中微生物的菌群平衡，防治某些细菌性疾病的发生，能提高动物的饲料利用率、提高机体免疫力，促进生长和改善生产性能，得到安全无药物残留的动物产品。现已开发成商品制剂的益生菌有：芽胞杆菌类、酵母、乳酸菌、双歧杆菌、链球菌、曲霉等，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtillus简称Bs)是最重要的品种。 

目前，国内芽胞杆菌益生菌制品的生成工艺主要有两种，即固体发酵法和液体深层发酵法。固体发酵法是把益生菌接种到固体培养基上进行发酵培养，其优点是相对管理比较粗放，具有生产工艺简单，投资少的特点，但同时具易受杂菌污染，菌体含量不易控制、产品质量不稳定的缺点。目前我国大多数芽胞杆菌益生菌产品都是采用该生产方法。液体深层发酵法是采用现代发酵技术，将益生菌菌种接种到反应器中进行通风培养，对整个发酵过程都可以进行精细的过程控制，具有便于无菌操作，容易控制菌体含量，产品质量稳定的特点，但技术水平要求较高，相对固体发酵投资要高，但更适合工业化生产。其一般工艺流程为：菌种接种培养→种子罐培养→发酵罐发酵培养→排放培养液→收集菌体→加入适量载体和保护剂→干燥→粉碎→过筛→稀释混和→成品包装→质检→益生菌产品。 

国内通常采用的固体发酵方式生产的枯草杆菌制剂(有效活菌数一般在200亿cfu/g左右)和部分厂家采用液体发酵生产的制剂(芽胞数一般为1000-2000亿cfu/g)。 

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种5千亿活芽胞每克枯草芽胞杆菌原粉制备方法，安全、高效优质，方法易行，由该工艺生产的枯草芽胞杆菌原药中的活芽胞数达5,000亿活芽胞/克。发明内容包括：安全的枯草芽孢杆菌益生菌的筛选；培养基优化及液体高密度补料发酵技术；高效的芽胞提取回收工艺；产品活芽胞数高。 

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施： 

1.Bs菌种的筛选： 

从全国各地不同土壤和水体中收集富含芽孢杆菌芽胞的土样和水样，将样品用无菌水稀释到100-200个芽胞/ml水，涂布在A₁分离培养基上，于29-31℃温控培养箱中培养3-5d后，挑出芽胞同步率高的菌株，经革兰氏染色后显微镜检，选出具有Bs形态特征的菌株转接到液体摇瓶发酵培养基中，29-31℃摇瓶培养后，选出生长迅速(发酵周期36小时以内)、生物量高(600nm可见光光密度OD₆₀₀≥70)的菌种KN-42转接到试管斜面生长后于4℃保种。 

2.Bs菌种的确认： 

对KN-42菌株进行了形态和生理生化特征研究，测定KN-42菌株的16SrDNA共1421个有效碱基，根据枯草芽孢杆菌在Genebank中的16SrDNA序列进行分子鉴定，结合系统发育资料及分类资料(伯杰氏细菌手册)鉴定KN-42菌株为枯草芽胞杆菌。KN-42菌株于2008年12月09日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO.M208249。 

3.高产Bs的培养基优化： 

采用Box-Behken设计的响应面实验，首先从众多因子中选择重要的部分因子 筛选设计，利用合理的试验设计，考虑碳源、氮源、无机离子等多个因素之间的协同作用，用于寻找临近最大值的优化区域的最陡坡试验(Path of Steepestascent)，和用于优化响应面最大值的中心组合设计(Central Composite Design)来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析，设计优化B49发酵培养基(葡萄糖28.84g/L，玉米浆27.92g/L，蛋白胨30.05g/L，，豆粕3.88g/L，水解植物复合氨基酸3.91g/L，，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.5g/L，氯化钠(NaCl)3g/L)。 

4.液体深层高密度补料发酵技术提高发酵生物量： 

采用Box-Behken设计的响应面实验优化的发酵培养基进行分批发酵动力学研究，以发酵前期，对数期，稳定期OD、溶氧、pH、芽胞数为指标，确定各时期迟缓期、对数生长期和稳定期最佳营养平衡(以C/N表示)，及与芽胞形成关系。在分批发酵研究基础上，优化高密度补料发酵工艺。 

5、高效的芽胞提取与回收工艺： 

芽胞提取与回收工艺：发酵罐酸化：2N稀盐酸，PH4.2，升温35℃，80目过滤，加3.18‰(质量比)硫酸锌，搅拌3分钟，再加2.27‰(质量比)黄血盐，搅拌1分钟，静置15分钟，离心菌浆进行喷雾干燥，喷雾干燥进口风温200℃，出口风温85-87℃，原粉活芽胞数达5,000亿/克。 

发明的目的在于对筛选的生长迅速、生物量高、产芽胞同步率高的枯草芽胞杆菌菌株(菌种专利保护)，采用培养基的优化和高密度发酵工艺、高效芽胞回收工艺，生产出活芽胞数达到5,000亿/克的枯草芽胞杆菌安全原药，远高于国内通常采用的固体发酵方式生产的枯草杆菌制剂(有效活菌数一般在200亿cfu/g左右)和部分厂家采用液体发酵产品(芽胞数一般为1000-2000亿cfu/g)。枯草芽胞杆菌KN-42(Bacillus subtilis KN-42)，CCTCCNO.M208249。 

一种5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原药的制备方法，其步骤是： 

1.Bs菌种的筛选： 

从全国各地不同土壤和水体中收集富含芽孢杆菌芽胞的土样和水样，将样品用无菌水稀释到100-200个芽胞/ml水，涂布在A₁分离培养基上(蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，琼脂15g，水1000mL，pH 7.0，121 ℃灭菌30min)，于29-31℃温控培养箱中培养3-5d后，挑出芽胞同步率高的菌株，经革兰氏染色后显微镜检，选出具有Bs形态特征的菌株转接到液体摇瓶发酵培养基中，29-31℃摇瓶培养后，选出生长迅速(发酵周期36小时以内)、生物量高(600nm可见光光密度OD₆₀₀≥70)的菌种KN-42转接到试管斜面生长后于4℃保种。 

2.Bs菌种的确认： 

对KN-42菌株进行了形态和生理生化特征研究，测定KN-42菌株的16SrDNA共1421个有效碱基，根据枯草芽孢杆菌在Genebank中的16SrDNA序列进行分子鉴定，结合系统发育资料及分类资料(伯杰氏细菌手册)鉴定KN-42菌株为枯草芽胞杆菌。KN-42菌株于2008年12月09日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO.M208249。 

3.高产Bs的培养基优化： 

采用Box-Behken设计的响应面实验，首先从众多因子中选择重要的部分因子筛选设计，利用合理的试验设计，考虑碳源、氮源、无机离子等多个因素之间的协同作用，用于寻找临近最大值的优化区域的最陡坡试验(Path of Steepestascent)，和用于优化响应面最大值的中心组合设计(Central Composite Design)。来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析，设计优化B49发酵培养基(B-49：为葡萄糖28.84g/L，玉米浆27.92g/L，蛋白胨30.05g/L，，豆粕3.88g/L，水解植物复合氨基酸3.91g/L，，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.5g/L，氯化钠(NaCl)3g/L)。 

4.液体深层高密度补料发酵技术提高发酵生物量： 

采用Box-Behken设计的响应面实验优化的发酵培养基进行分批发酵动力学研究，以发酵前期，对数期，稳定期OD、溶氧、pH、芽胞数为指标，确定各时期迟缓期、对数生长期和稳定期最佳营养平衡(以C/N表示)，及与芽胞形成关系。在分批发酵研究基础上，优化高密度补料发酵工艺。 

5、高效的芽胞提取与回收工艺： 

芽胞提取与回收工艺：发酵罐酸化：2N稀盐酸，PH4.2，升温35℃，80目过滤，加3.18‰(质量比)硫酸锌，搅拌3分钟，再加2.27‰(质量比)黄血盐，搅拌1分钟，静置15分钟，离心菌浆进行喷雾干燥，喷雾干燥进口风温200℃，出口风温85-87℃，原粉活芽胞数达5,000亿/克。 

6.活芽胞数检测： 

称取0.99g～1.01g试样到中性瓶中，加入100mL，浓度为0.85％(质量比)水的生理盐水，猛烈摇动混合均匀。再把混合瓶放在磁力搅拌器(CJJ-4上海君竺仪器制造有限公司)平台上混合30min后，放入超声波水浴器(KQ-600B昆山市超声仪器有限公司)中超声15min，然后再放在匀质器(Bagmixer 400W/P/VW)中混合10min。将处理好的试样溶液依次稀释到10^-8放入70℃水浴锅中水浴30min，然后稀释到10^-9取0.1mL到每个营养琼脂培养基平板中，用涂棒把试样溶液均匀涂布后，放在37℃恒温培养箱中培养16hr～20hr。计平板上的菌落数，计算试样中枯草芽胞杆菌的芽胞数。 

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果： 

(1)处理方法能有效分散粉剂中粘结集聚的芽胞、杀灭热稳定性和生物活性不稳定的无效芽胞，准确的检测出产品中有效活芽胞的数量； 

(2)重复性好； 

(3)检测过程不需要特殊昂贵的仪器； 

(4)成本低； 

(5)可以同时检测7-8个样品； 

(6)操作简单便于推广。 

具体实施方式

一种5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原药的制备方法，其步骤是： 

1.Bs菌种的筛选： 

从全国各地不同土壤和水体中收集样品，在无菌超净台上，称取样品1.0g装入小三角瓶中，加入9mL无菌水，充分振荡后静置，取上清液做浓度梯度稀释(1×10^-4，1×10^-5，，1×10^-6，1×10^-7，1×10^-8)。用移液枪吸取稀释液100ul均匀涂布在分离培养基上，于30℃温控培养箱中培养3-5d后，挑出芽胞同步率高(芽胞形成率≥90％)的菌株，经革兰氏染色后显微镜检，选出具有Bs形态特征的菌株转接到液体摇瓶发酵培养基中，500mL摇瓶装量为25mL，摇床转速为200rpm，30℃摇瓶培养后，选出生长迅速(发酵同期36小时以内)、生物量高(600nm可见光光密度OD₆₀₀≥70)的菌种KN-42转接到试管斜面生长后于4℃ 保种。 

(1)A₁分离培养基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，琼脂15g，水1000mL，pH 7.0，121℃灭菌30min； 

(2)B₁液体摇瓶发酵培养基：豆粕20g，玉米浆10g，葡萄糖25g，蛋白胨5g，氯化钠(NaCl)3g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.5g，七水硫酸镁(MgSO₄.7H₂O)0.2g，七水硫酸亚铁(FeSO₄.7H₂O)0.01g，水1000mL，pH 7.5，121℃灭菌30min。 

2.Bs菌种的确认： 

对KN-42菌株进行了形态和生理生化特征研究，根据该菌株的16SrDNA序列进行分子分类。该菌株的16SrDNA共测定1421个有效碱基，系统发育资料及分类资料(伯杰氏细菌手册)鉴定该菌株为枯草芽胞杆菌。该菌株于2008年12月09日在中国典型培养物保藏中心保藏，枯草芽胞杆菌KN-42(Bacillus subtilisKN-42)，CCTCCNO.M208249。 

(1)菌种鉴定理化实验结果见下表 

(2)菌种16S rDNA序列测定结果 

①测序试剂盒：Big Dye^TMTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PERKIN ELMER)； 

②测序分析仪器：ABI PRISM^TM 377DNA Sequencer； 

③测序引物：16(+)：5’GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’ 

            16(-)：5’CGGCTACCTTGTTACGAC3’ 

④序列，共计1421bp，如SEQ IDNO.1所示 

3.高产Bs的培养基优化： 

采用Box-Behken设计的响应面实验，以芽胞数(cfu)为筛选指标，利用单因子实验首先从众多碳源(玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、大米粉、土豆淀粉、糊精、玉米粉)；氮源(水解植物复合氨基酸、棉籽粉、豆粕、花生粕、蛋白胨、酵母粉、玉米浆粉、玉米浆、鱼粉、大豆蛋白、谷氨酸钠、天门冬氨酸、硫酸铵)；微量元素(氯化钴(CoCl₂)、碳酸钙(CaCO₃)、硫酸镁(MgSO₄)、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、氯化钠(NaCl)、硫酸亚铁(FeSO₄)、氯化锰(MnCl₂)、硫酸铜(CuSO₄)、硫酸锌(ZnSO₄))因子中选择重要的部分因子筛选设计，利用合理的试验设计，考虑重要碳源(葡萄糖和玉米淀粉)、氮源(蛋白胨、豆粕和玉米浆)及无机离子(磷酸二氢钾(KH₂PO₄)和氯化钠(NaCl))等多个因素之间的协同作用，用于寻找临近最大值的优化区域的最陡坡试验(Path of Steepest ascent)，和用于优化响应面最大值的中心组合设计(CentralComposite Design)来拟合因素与响应值之间的函数关系得到回归方程，通过对回归方程的分析来设计优化培养基B-49，芽胞数为70亿cfu/ml。 

(1)、碳源因子：通过单因子实验，从玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、大米粉、土豆淀粉、糊精、玉米粉中筛选出葡萄糖和玉米淀粉为Bs最佳碳源需求因子。 

(2)、氮源因子：通过单因子实验，从水解植物复合氨基酸、棉籽粉、豆粕、花生粕、蛋白胨、酵母粉、玉米浆粉、玉米浆、鱼粉、大豆蛋白、谷氨酸钠、天门冬氨酸、硫酸铵中筛选出蛋白胨、豆粕和玉米浆为Bs最佳氮源需求因子。 

(3)、微量元素因子：通过单因子实验，从氯化钴(CoCl₂)、碳酸钙(CaCO₃)、 硫酸镁(MgSO₄)、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)、氯化钠(NaCl)、硫酸亚铁(FeSO₄)、氯化锰(MnCl₂)、硫酸铜(CuSO₄)、硫酸锌(ZnSO₄)中筛选出磷酸二氢钾(KH₂PO₄)和氯化钠(NaCl)为Bs最佳微量元素需求因子。 

(4)、利用PB实验设计(Plackett-Burman Design)筛选影响Bs芽胞形成的重要因子，试验表明葡萄糖、玉米浆和蛋白胨对Bs芽胞形成有极显著的影响，因此增加它们的用量对促进Bs芽胞形成具有积极的意义。通过最陡坡试验(PathofSteepest ascent)最终确定葡萄糖用量为14.42g/L，玉米浆用量为18.61g/L，蛋白胨用量30.05g/L时Bs芽胞数最高。利用SAS软件设计中心组合实验(CentralComposite Design)，最终得到Bs发酵最佳配方B-49：为葡萄糖28.84g/L，玉米浆27.92g/L，蛋白胨30.05g/L，，豆粕3.88g/L，水解植物复合氨基酸3.91g/L，，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.5g/L，氯化钠(NaCl)3g/L，采用该配方，发酵液活芽胞数达70亿/ml。 

4.高密度液体补料发酵技术提高发酵生物量：以响应面法优化的培养基配方B-49进行分批发酵动力学研究，以发酵前期，对数期，稳定期OD、溶氧、pH、芽胞数为指标，确定各时期最佳营养平衡(以C/N表示)，及与芽胞数关系。在分批发酵配方上进行碳源和氮源浓度加倍，分析出现反馈抑制因素及浓度，进行分批补料发酵动力学研究，确定补料工艺为：采用初始糖浓度10g/mL，通过补加葡萄糖，使发酵过程还原糖浓度保持0.5-1.0％(质量比)水平，发酵工程共用葡萄糖7％(质量比)；，发酵过程补加氨水，使pH控制在6.8-7.2范围；发酵过程通过调节转速控制溶氧水平不低于临界氧(3ppm)。较分批发酵相比，虽然菌数和总耗量明显增加，但采用补料工艺，不仅没有出现底物反馈抑制，也没有因对数期溶解氧不能维持在临界氧之上而影响芽胞的形成。采用此工艺，发酵液活芽胞数达100亿/ml。 

5.高效的芽胞提取与回收工艺： 

芽胞提取与回收工艺：发酵罐酸化：2N稀盐酸，PH4.2，升温35℃，80目过滤，加3.18‰(质量比)硫酸锌，搅拌3分钟，再加2.27‰(质量比)黄血盐，搅拌1分钟，静置15分钟，离心菌浆进行喷雾干燥，喷雾干燥进口风温200℃，出口风温85-87℃，原粉活芽胞数达5,000亿/克。 

6.活芽胞数检测： 

称取0.99g～1.01g试样到中性瓶中，加入100mL，浓度为0.85克氯化钠/100ml水的生理盐水，猛烈摇动混合均匀。再把混合瓶放在磁力搅拌器(CJJ-4上海君竺仪器制造有限公司)平台上混合30min后，放入超声波水浴器(KQ-600B昆山市超声仪器有限公司)中超声15min，然后再放在匀质器(Bagmixer 400W/P/VW)中混合10min。将处理好的试样溶液依次稀释到10^-8放入70℃水浴锅中水浴30min，然后稀释到10^-9取0.1mL到每个营养琼脂培养基平板中，用涂棒把试样溶液均匀涂布后，放在37℃恒温培养箱中培养16hr～20hr。计平板上的菌落数，按下式计算试样中枯草芽胞杆菌的芽胞数。 

N＝C/M*10¹⁰……… 

式中： 

C----几个有效平板的平均菌落数，单位为个； 

M----试样的称样量，单位为克(g)； 

10¹⁰---试样稀释倍数。 

两次平行测定相对偏差不大于12％。 

SEQUENCE LISTING 

<110>武汉科诺生物科技股份有限公司 

<120>5千亿活芽胞每克枯草芽胞杆菌原粉制备方法 

<130>5千亿活芽胞每克枯草芽胞杆菌原粉制备方法 

<140>2009100629648 

<141>2009-07-03 

<160>1 

<170>PatentIn version 3.1 

<210>1 

<211>1421 

<212>DNA 

<213>枯草芽胞杆菌 

<400>1 

ttcggcggct ggctcctaaa aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg   60 

tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga  120 

ttactagcga ttccagcttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa ctgagaacag  180 

atttgtggga ttggcttaac ctcgcggttt cgctgccctt tgttctgtcc attgtagcac  240 

gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt  300 

ttgtcaccgg cagtcacctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag atcaagggtt  360 

gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc  420 

acctgtcact ctgcccccga aggggacgtc ctatctctag gattgtcaga ggatgtcaag  480 

acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctcaccgc ttgtgcgggc  540 

ccccgtcaat tcctttgagt ttcagtcttg cgaccgtact ccccaggcgg agtgcttaat  600 

gcgttagctg cagcactaag gggcggaaac cccctaacac ttagcactca tcgtttacgg  660 

cgtggactac cagggtatct aatcctgttc gctccccacg ctttcgctcc tcagcgtcag  720 

ttacagacca gagagtcgcc ttcgccactg gtgttcctcc acatctctac gcatttcacc  780 

gctacacgtg gaattccact ctcctcttct gcactcaagt tccccagttt ccaatgaccc  840 

tccccggttg agccgggggc tttcacatca gacttaagaa accgcctgcg agccctttac  900 

gcccaataat tccggacaac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt     960 

tagccgtggc tttctggtta ggtaccgtca aggtgccgcc ctatttgaac ggcacttgtt    1020 

cttccctaac aacagagctt tacgatccga aaaccttcat cactcacgcg gcgttgctcc    1080 

gtcagacttt cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc    1140 

gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc gtcgccttgg    1200 

tgagccgtta cctcaccaac tagctaatgc gccgcgggtc catctgtaag tggtagccga    1260 

agccaccttt tatgtctgaa ccatgcggtt caaacaacca tccggtatta gccccggttt    1320 

cccggagtta tcccagtctt acaggcaggt tacccacgtg ttactcaccc gtccgccgct    1380 

aacatcaggg agcaagctcc catctgtccg ctcgacttgc a                        1421 

Claims (2)

1.一种枯草芽胞杆菌，其特征在于：枯草芽胞杆菌KN-42(Bacillus subtilisKN-42)，保藏号为CCTCC NO：M208249。

2.使用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制备枯草芽孢杆菌原药的方法，其步骤是：

A.将菌种KN-42转接到试管斜面生长后于4℃保种；

B.对KN-42菌株进行了形态和生理生化特征研究，测定KN-42菌株的16SrDNA共1421个有效碱基，根据枯草芽孢杆菌在Genebank中的16SrDNA序列进行分子鉴定，结合系统发育资料及分类资料鉴定KN-42菌株为枯草芽胞杆菌；

C.Bs的培养基：采用Box-Behken设计的响应面实验，以芽胞数为筛选指标，利用单因子实验首先从碳源、氮源、微量元素因子中选择因子筛选设计，采用多元一次和二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系得到回归方程，通过对回归方程来设计培养基B-49，芽胞数为70亿cfu/ml；

(1)、碳源因子：通过单因子实验，从玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、大米粉、土豆淀粉、糊精、玉米粉中筛选出葡萄糖和玉米淀粉为Bs碳源需求因子；

(2)、氮源因子：通过单因子实验，从水解植物复合氨基酸、棉籽粉、豆粕、花生粕、蛋白胨、酵母粉、玉米浆粉、玉米浆、鱼粉、大豆蛋白、谷氨酸钠、天门冬氨酸、硫酸铵中筛选出蛋白胨、豆粕和玉米浆为Bs氮源需求因子；

(3)、微量元素因子：通过单因子实验，从氯化钴、碳酸钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸亚铁、氯化锰、硫酸铜、硫酸锌中筛选出磷酸二氢钾和氯化钠为Bs微量元素需求因子；

(4)、利用PB实验设计筛选Bs芽胞形成的因子，确定葡萄糖用量为14.42g/L，玉米浆用量为18.61g/L，蛋白胨用量30.05g/L时Bs芽胞数，利用SAS软件设计中心组合实验，得到Bs发酵配方B-49为：葡萄糖28.84g/L，玉米浆27.92g/L，蛋白胨30.05g/L，豆粕3.88g/L，水解植物复合氨基酸3.91g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化钠3g/L；

D.高密度液体补料发酵技术提高发酵生物量：采用Box-Behken设计的响应面实验优化的培养基进行分批发酵，以发酵前期，对数期，稳定期OD、溶氧、pH值、芽胞数为指标，确定营养平衡，及与芽胞数关系，在分批发酵配方上进行碳源和氮源浓度加倍，采用糖浓度10g/ml，通过补加葡萄糖，使发酵过程还原糖浓度为0.5-1.0％质量比，发酵过程共用葡萄糖7％质量比，发酵过程补加氨水，使pH控制在6.8-7.2范围，发酵液活芽胞数达100亿/ml；

E.芽胞提取与回收工艺：发酵罐酸化：2N稀盐酸，PH4.2，升温35℃，80目过滤，加3.18‰质量比硫酸锌，搅拌3分钟，再加2.27‰质量比黄血盐，搅拌1分钟，静置15分钟，离心菌浆进行喷雾干燥，喷雾干燥进口风温200℃，出口风温85-87℃，原粉活芽胞数达5,000亿/克；

F.活芽胞数检测：称取0.99g～1.01g试样到中性瓶中，加入100mL，0.85％质量比的生理盐水，摇动混合均匀，再把混合瓶放在磁力搅拌器平台上混合30min后，放入超声波水浴器中超声15min，然后再放在匀质器中混合10min，将处理的试样溶液依次稀释到10^-8放入70℃水浴锅中水浴30min，然后稀释到10^-9取0.1mL到每个营养琼脂培养基平板中，用涂棒把试样溶液均匀涂布后，放在37℃恒温培养箱中培养16hr～20hr。