CN106701648B - 一株高产l-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一株高产l-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106701648B
CN106701648B CN201611146169.3A CN201611146169A CN106701648B CN 106701648 B CN106701648 B CN 106701648B CN 201611146169 A CN201611146169 A CN 201611146169A CN 106701648 B CN106701648 B CN 106701648B
Authority
CN
China
Prior art keywords
alat
argg
gene
corynebacterium glutamicum
ilvc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201611146169.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106701648A (zh
Inventor
苏海霞
邢盼盼
王炯
梅雪臣
宋盟军
万坤
刘爱福
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Grand Hoyo Co ltd
Original Assignee
Wuhan Grand Hoyo Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Grand Hoyo Co ltd filed Critical Wuhan Grand Hoyo Co ltd
Priority to CN201611146169.3A priority Critical patent/CN106701648B/zh
Publication of CN106701648A publication Critical patent/CN106701648A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106701648B publication Critical patent/CN106701648B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/04—Other carbon-nitrogen ligases (6.3.4)
    • C12Y603/04005—Argininosuccinate synthase (6.3.4.5)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一株高产L‑异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，该菌是将谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum H5菌株敲除了编码精氨基琥珀酸合成酶的argG基因及编码氨基转移酶的alaT基因，且在alaT基因被敲除的位点插入了编码乙酰羟酸还原异构酶的ilvC基因的操纵子，所述谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum H5保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016609。本发明还公开了该基因工程菌的构建方法及应用，本发明提供的基因工程菌用于发酵生产L‑异亮氨酸，可提高产量和糖酸转化率。

Description

一株高产L-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及一株高产L-异亮氨酸的基因工程菌，其构建方法及应用，属于生物技术领域。
背景技术
L-异亮氨酸，又称L-异白氨酸，化学名为L-α-氨基-β-甲基戊酸，属于天冬氨酸族非极性、输水性氨基酸的一种。L-异亮氨酸作为人体必需的8种氨基酸之一，是合成人体激素、酶类的原料，具有促进蛋白质合成和抑制分解的效果，成年人每天需要从外界摄取20mg/kg(体重)的L-异亮氨酸。因此，L-异亮氨酸在食品、医药、饲料和运动保健领域具有广泛的应用及商业价值。
由于L-异亮氨酸具有2个不对称碳原子，所以用化学合成方法生产比较困难，成本很高。生物转化法制造L-异亮氨酸是将α氨基丁酸和α-氧代丁酸等作为前体原料进行生物合成，但由于原料昂贵，同样存在生产成本过高的问题。因此，通过微生物发酵来生产L-异亮氨酸是一种必然的发展趋势。
CN 105176907 A公布了一株通过重组大肠杆菌构建的L-异亮氨酸基因工程菌，通过大肠杆菌发酵生产L-异亮氨酸，最终产量为16.05±0.16g/L，糖酸转化率达40.78％。
CN 104480057 A构建了alr基因缺陷的谷氨酸棒杆菌宿主菌，再将fusA、frr、ilvBN、ilvA、ppnk等基因连接到过表达载体，然后电转入alr缺陷的宿主菌中，获得一株谷氨酸棒杆菌基因工程菌，通过发酵产L-异亮氨酸，产量达到28.6g/L。
CN 105886431 A公布了一株诱变筛选得到的谷氨酸棒杆菌菌株，通过发酵产L-异亮氨酸，产量为28g/L。
CN 104212756 A公布了一株过表达fusA基因的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，摇瓶发酵产L-异亮氨酸为8.7g/L。
发明内容
本发明的目的是提供一株高产L-异亮氨酸的基因工程菌及其构建和应用。本发明根据筛选得到的谷氨酸棒杆菌突变菌株Corynebacterium glutamicum H5的代谢特点，利用基因工程技术来改造其基因组，通过敲除或者插入相关基因，减弱代谢支路的杂酸如丙氨酸、缬氨酸等的合成；增加L-异亮氨酸的前体如天冬氨酸及苏氨酸的合成，促进碳通量更多流向L-异亮氨酸合成途径，使其在发酵过程中能大幅提高产L-异亮氨酸的能力，从而降低生产成本，具有广阔的工业应用前景。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一株高产L-异亮氨酸的基因工程菌，命名为C.glutamicum H5ΔargGΔalaT：：ilvC，其分类为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，该基因工程菌是将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)H5菌株敲除了编码精氨基琥珀酸合成酶的argG基因及编码氨基转移酶的alaT基因，且在alaT基因被敲除的位点插入了编码乙酰羟酸还原异构酶的ilvC基因的操纵子。
其构建方法包括以下步骤：
(1)出发菌株是本实验室筛选得到的突变菌株，命名为Corynebacteriumglutamicum H5，其分类为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，属于革兰氏阳性菌。
(2)利用EcoRI/SalI双酶切载体pk18mobsacB，回收5.6kb核苷酸片段；以Corynebacterium glutamicum H5基因组为模板，设计引物，扩增argG基因上游1.22kb的核苷酸片段argG-L、及下游1.31kb的核苷酸片段argG-R，通过GIBSON连接上述3个片段，构建重组质粒argG-pk18mobsacB，该质粒即argG基因的敲除载体。其中，扩增argG-L、argG-R上下游片段所用的引物为：
argG-L-FP:5‘-CTATGACATGATTACGAATTCGTGCCACTGGTGAACTCCTTG-3’
argG-L-RP:5‘-TGAAAAGGTGGCTTATGCATGTGTTGAAAGGGTTGGTATT-3’
argG-R-FP:5‘-AACCCTTTCAACACATGCATAAGCCACCTTTTCAAGCATC-3’
argG-R-RP:5‘-AGGTCGACTCTAGAGGATCCTTCTTCATCAGTGAGATCGA-3’
(3)将步骤(2)中的重组质粒转化步骤(1)中所述出发菌株Corynebacteriumglutamicum H5，通过同源重组获得argG基因缺陷的基因工程菌C.glutamicum H5ΔargG。
(4)继续利用EcoRI/SalI双酶切载体pk18mobsacB，回收5.6kb核苷酸片段；以Corynebacterium glutamicum H5基因组为模板，设计引物，扩增alaT基因上游1.42kb的核苷酸片段alaT-L、及下游1.51kb的核苷酸片段alaT-R，通过GIBSON连接上述3个片段，构建包含alaT基因上下游片段的重组质粒alaT-pk18mobsacB，该质粒即alaT基因的敲除载体。其中，扩增alaT上下游片段的引物为：
alaT-L-FP:5‘-ATGACATGATTACGAATTCGCCACTTTGGACTAATCAATAT-3’
alaT-L-RP:5‘-ATGCGGCCGCTTTTATGCATTGGAAGGTTGGCGATCATG-3’
alaT-R-FP:5‘-CAATGCATAAAAGCGGCCGCATCTCCTTTGCATCACATAC-3’
alaT-R-RP:5‘-TTGCATGCCTGCAGGTCGACCGGTGTTTCCACCATGCGG-3’
(5)将将步骤(4)中的重组质粒转化步骤(3)中所述的基因工程菌C.glutamicumH5ΔargG，通过同源重组获得alaT基因缺陷的基因工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT。
(6)利用NsiI/NotI双酶切载体alaT-pk18mobsacB，回收8.7kb核苷酸片段；以Corynebacterium glutamicum H5基因组为模板，设计引物扩增ilvC基因片段；以大肠杆菌表达载体PVB220为模板，设计引物扩增PlacUV5启动子片段；以大肠-谷氨酸棒杆菌穿梭载体PXMJ19为模板，设计引物扩增终止子rrnB片段；通过GIBSON连接上述4个片段，构建重组质粒ilvC-alaT-pk18mobsacB，该质粒即为ilvC操纵子的插入载体。其中，ilvC操纵子包括PlacUV5启动子、ilvC基因及rrnB终止子3个片段。扩增3个片段所用的引物为：
placUV5 FP:5‘-TCGCCAACCTTCCAATGCATGTAGAGGATCGAGATCTCCA-3’
placUV5 RP:5‘-TAAAGCAGTTCAATAGCCATATGGCTGCTGCCCATGGAAT-3’
ilvC FP:5‘-ATTCCATGGGCAGCAGCCATATGGCTATTGAACTGCTTTA-3’
ilvC RP:5‘-tctcatccgccaaaacagccTTAAGCGGTTTCTGCGCGAG-3’
rrnB FP:5‘-CTCGCGCAGAAACCGCTTAAggctgttttggcggatgaga-3’
rrnB RP:5‘-TGCAAAGGAGATGCGGCCGCagagtttgtagaaacgcaaa-3’
(7)将步骤(6)中的插入载体转化步骤(5)中所述的工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT，通过同源重组获得在alaT基因被敲除的位点插入了ilvC操纵子的基因工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT：：ilvC。
所述的基因工程菌的应用，在于通过发酵生产L-异亮氨酸，其方法为：将基因工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT：：ilvC活化后转接种子培养基培养，种液再转接至5L发酵罐直接发酵，最终L-异亮氨酸产量为48g/L。
所述活化培养基配方为：玉米浆5％、胰蛋白胨1％、氯化钠0.5％、硫酸铵0.4％、葡萄糖0.3％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、丙氨酸0.004％、琼脂粉2％，余量为去离子水，pH为7，均为重量百分比。
所述种子培养基配方为：葡萄糖3％、硫酸铵2.5％、玉米浆3.5％、酵母膏0.3％、丝肽粉0.3％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、维生素B1 0.00003％、生物素0.00002％、硫酸铁0.00001％、碳酸钙4％、丙氨酸0.004％、余量为去离子水，pH为7，均为重量百分比。
所述发酵培养基配方为：葡萄糖16％、硫酸铵0.8％、玉米浆3.5％、酵母膏0.3％、丝肽粉0.3％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、维生素B1 0.00003％、生物素0.00002％、硫酸铁0.00001％、丙氨酸0.004％，余量为去离子水，pH为7，均为重量百分比。
本发明的有益效果是：本发明根据谷氨酸棒杆菌突变菌株Corynebacteriumglutamicum H5的代谢特点，利用基因工程技术来改造H5的基因组，通过敲除或者插入相关基因，减弱代谢支路的杂酸如丙氨酸、缬氨酸等的合成、增加L-异亮氨酸的前体如天冬氨酸及苏氨酸的合成，促进碳通量更多流向L-异亮氨酸合成途径，使其在发酵过程中能大幅提高产L-异亮氨酸的能力，L-异亮氨酸的产酸率相对出发菌株提高了2.18倍，在5L发酵罐中，L-异亮氨酸产量达48g/L，糖酸转化率达18％以上，大幅降低了生产成本，具有广阔的工业应用前景。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案进行详细地说明。
实施例1 L-异亮氨酸突变菌株H5的获得
1.1材料与试剂
谷氨酸棒杆菌ATCC13032，为广泛应用的标准菌株，购自上海复祥生物科技有限公司；
硫酸二乙酯(EDS)，购自武汉申试化工；蛋白胨、酵母、玉米浆等购自Biosharp公司；丙氨酸、磺胺胍、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸盐酸盐、α-氨基丁酸、DL-α-氨基-β-羟基戊酸等均购自sigma公司；其余化学药品试剂均为国药分析纯。
1.2制备出发型菌株
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，在LBG固体培养基上活化，31℃培养12h；
从斜面接种一环菌体到30mL LBG培养基中，31℃、200rpm，培养12h；取菌液1mL，12000rpm离心2min，弃上清，用生理盐水对细胞进行洗涤3次，用pH7.0的磷酸缓冲液重悬菌体，制成10-3-10-7倍的菌悬液备用。
LBG培养基配方为：蛋白胨1.0％、酵母0.5％、氯化钠1.0％、葡萄糖0.5％，余量为去离子水，pH为6.5-7.0。
1.3 EDS诱变筛选
取2-10mL菌悬液，加入过无菌瓶中，加入1％(V/V)硫酸二乙酯，反应0.5-1h；用无菌水稀释103倍，涂布于含有磺胺胍、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸盐酸盐、α-氨基丁酸、DL-α-氨基-β-羟基戊酸等L-异亮氨酸结构类似物的抗性筛选培养基上，31℃，培养6-48h待单菌落长出；
单菌落转接10mL发酵培养基，31℃，200rpm振荡培养72h，HPLC检测各单菌落发酵得到的L-异亮氨酸产量，其中，出发菌株ATCC13032产L-异亮氨酸小于0.02g/L，突变株H5产L-异亮氨酸为22g/L。将该突变菌株命名为Corynebacterium glutamicum H5，并于2016年11月1日保藏于位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2016609。
发酵培养基配方为：葡萄糖24.0％、硫酸铵0.8％、玉米浆3.5％、酵母膏0.3％、磷酸氢二钾0.12％、硫酸镁0.05％、维生素B1 0.00003％、生物素0.00002％、硫酸铁0.00001％、丙氨酸0.004％，余量为去离子水，pH为7。
实施例2基因工程菌C.glutamicumH5ΔargG的构建
2.1实验材料与试剂
质粒pk18mobsacB、大肠杆菌DH5α均为商业途径购买；
DNA聚合酶(KOD DNA Polymerase)购自toyobo东洋纺(上海)生物科技有限公司；限制性内切酶(EcoRI、SalI、NsiI、NotI)、DNAmarker、质粒小提取试剂盒、DNA胶回收纯化试剂盒，均购自takara宝生物工程(大连)有限公司；Gibson克隆重组试剂盒购自NEB北京公司；硫酸卡那霉素购自Biosharp公司；蔗糖等其余化学药品试剂均为国药分析纯。
2.2敲除载体argG-pk18mobsacB的构建
利用EcoRI/SalI双酶切载体pk18mobsacB，反应体系为：质粒1ug、10×buffer5ul、BamHI 1ul、EcoRI 1ul、补水至50ul，37℃酶切5h。1％琼脂糖凝胶电泳检测并DNA胶回收纯化试剂盒回收5.6kb核苷酸片段；
甘油保存的菌株Corynebacterium glutamicum H5接种至1-4mL的LBG液体培养基中，31℃、200rpm振荡培养16h；取1-4mL的菌液，10,000rpm离心2分钟，弃上清；湿菌体用天根基因组提取试剂盒抽提基因组DNA。
以Corynebacterium glutamicum H5基因组为模板，设计argG基因上下游片段argG-L(SEQ ID NO:1所示)、argG-R(SEQ ID NO:2所示)的引物：
argG-L-FP:5‘-CTATGACATGATTACGAATTCGTGCCACTGGTGAACTCCTTG-3’
argG-L-RP:5‘-TGAAAAGGTGGCTTATGCATGTGTTGAAAGGGTTGGTATT-3’
argG-R-FP:5‘-AACCCTTTCAACACATGCATAAGCCACCTTTTCAAGCATC-3’
argG-R-RP:5‘-AGGTCGACTCTAGAGGATCCTTCTTCATCAGTGAGATCGA-3’
高保真KOD聚合酶PCR扩增1.22kb的核苷酸片段argG-L、及1.31kb的核苷酸argG-R。PCR反应体系(50ul)为：5×PCR buffer10μL、dNTP 5μL、引物各1.5μL、模板1μL、KOD酶1μL、加水至50μL。反应条件为：95℃5min，95℃30s，55℃30s，68℃2min，30个循环；68℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测且DNA胶回收纯化试剂盒回收1.1kb的2个PCR产物。
Gibson克隆重组试剂盒重组上述双酶切产物及两个PCR产物，重组产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含硫酸卡那霉素的平板，经过37℃过夜培养后，挑选转化子送武汉天一辉远生物技术公司测序，测序正确的转化子即含有重组质粒argG-pk18mobsacB。
2.3 Corynebacterium glutamicum H5基因组敲除argG基因
将测序正确的转化子转接3mL LB培养基，37℃、200rpm振荡培养16h，取1-4mL的菌液，10,000rpm离心2分钟，弃上清；湿菌体用质粒小量提取试剂盒抽提质粒。将质粒转入出发菌株Corynebacterium glutamicum H5中，转化产物涂布于含硫酸卡那霉素的LBHIS固体培养基中，30℃培养48h至长出转化子，挑选转化子转接3mL LB培养基，30℃、200rpm振荡培养24h，菌液稀释涂布于含10％蔗糖的平板，30℃培养48h至长出单菌落，挑选单菌落分别接种于含硫酸卡那霉素的平板及含10％蔗糖的平板，挑选在10％的蔗糖平板上生长而在硫酸卡那霉素平板上不生长的单菌落送测序，测序正确的单菌落即为argG基因缺陷的工程菌C.glutamicum H5ΔargG。
LBHIS培养基配方为：蛋白胨1％、酵母0.5％、氯化钠1％、脑心津液2％、山梨醇4％、琼脂粉2％、硫酸卡那霉素100ug/mL、余量为去离子水，pH为7。
10％蔗糖培养基配方为：蛋白胨1％、酵母0.5％、氯化钠1％、葡萄糖0.5％、蔗糖10％、余量为去离子水，pH为7。
实施例3基因工程菌C.glutamicumH5ΔargGΔalaT的构建
3.1敲除载体alaT-pk18mobsacB的构建
利用EcoRI/SalI双酶切载体pk18mobsacB，反应体系为：质粒1ug、10×buffer5ul、BamHI1ul、EcoRI1ul、补水至50ul，37℃酶切5h。1％琼脂糖凝胶电泳检测并DNA胶回收纯化试剂盒回收5.6kb核苷酸片段；
甘油保存的菌株Corynebacterium glutamicum H5接种至1-4mL的LBG液体培养基中，31℃、200rpm振荡培养16h；取1-4mL的菌液，10,000rpm离心2分钟，弃上清；湿菌体用天根基因组提取试剂盒抽提基因组DNA。
以Corynebacterium glutamicum H5基因组为模板，设计alaT基因上下游片段alaT-L(SEQ ID NO:3所示)、alaT-R(SEQ ID NO:4所示)的引物：
alaT-L-FP:5‘-ATGACATGATTACGAATTCGCCACTTTGGACTAATCAATAT-3’
alaT-L-RP:5‘-ATGCGGCCGCTTTTATGCATTGGAAGGTTGGCGATCATG-3’
alaT-R-FP:5‘-CAATGCATAAAAGCGGCCGCATCTCCTTTGCATCACATAC-3’
alaT-R-RP:5‘-TTGCATGCCTGCAGGTCGACCGGTGTTTCCACCATGCGG-3’
高保真KOD聚合酶PCR扩增1.42kb的核苷酸片段alaT-L、及1.51kb的核苷酸片段alaT-R。PCR反应体系(50ul)为：5×PCR buffer 10μL、dNTP 5μL、引物各1.5μL、模板1μL、KOD酶1μL、加水至50μL。反应条件为：95℃5min，95℃30s，55℃30s，68℃2min，30个循环；68℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测且DNA胶回收纯化试剂盒回收1.5kb的2个PCR产物。
Gibson克隆重组试剂盒重组上述双酶切产物及两个PCR产物，重组产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含硫酸卡那霉素的平板，经过37℃过夜培养后，挑选转化子送武汉天一辉远生物技术公司测序，测序正确的转化子即含有重组质粒alaT-pk18mobsacB。
3.2 C.glutamicum H5ΔargG基因组敲除alaT基因
将测序正确的转化子转接3mL LB培养基，37℃、200rpm振荡培养16h，取1-4mL的菌液，10,000rpm离心2分钟，弃上清；湿菌体用质粒小量提取试剂盒抽提质粒。将质粒转入出发菌株C.glutamicum H5ΔargG中，转化产物涂布于含硫酸卡那霉素的LBHIS固体培养基中，30℃培养48h至长出转化子，挑选转化子转接3mL LB培养基，30℃、200rpm振荡培养24h，菌液稀释涂布于含10％蔗糖的平板，30℃培养48h至长出单菌落，挑选单菌落分别接种于含硫酸卡那霉素的平板及含10％蔗糖的平板，挑选在10％的蔗糖平板上生长而在硫酸卡那霉素平板上不生长的单菌落送测序，测序正确的单菌落即为alaT基因缺陷的工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT。
实施例4基因工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT：：ilvC的构建
4.1实验材料
质粒pk18mobsacB、PVB220、PXMJ19等均为商业途径购买。
4.2插入载体ilvC-alaT-pk18mobsacB的构建
利用NsiI/NotI双酶切载体pk18mobsacB，反应体系为：质粒1ug、10×buffer 5ul、NsiI 1ul、NotI 1ul、补水至50ul。37℃酶切5h。1％琼脂糖凝胶电泳检测并DNA胶回收纯化试剂盒回收8.7kb核苷酸片段。
甘油保存的菌株Corynebacterium glutamicum H5接种至1-4mL的LBG液体培养基中，31℃、200rpm振荡培养16h；取1-4mL的菌液，10,000rpm离心2分钟，弃上清；湿菌体用天根基因组提取试剂盒抽提基因组DNA。
以Corynebacterium glutamicum H5基因组为模板，设计引物ilvC FP/RP，高保真KOD聚合酶PCR扩增ilvC基因片段(SEQ ID NO:6所示)；以大肠杆菌表达载体PVB220为模板，设计引物placUV5 FP/RP，高保真KOD聚合酶PCR扩增PlacUV5启动子片段(SEQ ID NO:5所示)；以大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体PXMJ19为模板，设计引物rrnB FP/RP，高保真KOD聚合酶PCR扩增终止子rrnB片段(SEQ ID NO:7所示)；PCR反应体系(50ul)为：5×PCRbuffer 10μL、dNTP 5μL、引物各1.5μL、模板1μL、KOD酶1μL、加水至50μL。反应条件为：95℃5min，95℃30s，55℃30s，68℃2min，30个循环；68℃10min。扩增3个片段所用的引物分别为：
placUV5 FP:5‘-TCGCCAACCTTCCAATGCATGTAGAGGATCGAGATCTCCA-3’
placUV5 RP:5‘-TAAAGCAGTTCAATAGCCATATGGCTGCTGCCCATGGAAT-3’
ilvC FP:5‘-ATTCCATGGGCAGCAGCCATATGGCTATTGAACTGCTTTA-3’
ilvC RP:5‘-tctcatccgccaaaacagccTTAAGCGGTTTCTGCGCGAG-3’
rrnB FP:5‘-CTCGCGCAGAAACCGCTTAAggctgttttggcggatgaga-3’
rrnB RP:5‘-TGCAAAGGAGATGCGGCCGCagagtttgtagaaacgcaaa-3’
1％琼脂糖凝胶电泳检测且DNA胶回收纯化试剂盒回收3个PCR产物。Gibson克隆重组试剂盒重组上述双酶切产物3个PCR产物，重组产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含硫酸卡那霉素的平板，经过37℃过夜培养后，挑选转化子送武汉天一辉远生物技术公司测序，测序正确的转化子即含有重组质粒ilvC-alaT-pk18mobsacB，该质粒中ilvC操纵子包括PlacUV5启动子、ilvC基因及rrnB终止子3个片段。
4.3 C.glutamicum H5ΔargGΔalaT基因组中插入ilvC操纵子
将测序正确的转化子转接3mL LB培养基，37℃、200rpm振荡培养16h，取1-4mL的菌液，10,000rpm离心2分钟，弃上清；湿菌体用质粒小量提取试剂盒抽提质粒。将质粒转入出发菌株C.glutamicum H5ΔargGΔalaT中，转化产物涂布于含硫酸卡那霉素的LBHIS固体培养基中，30℃培养48h至长出转化子，挑选转化子转接3mL LB培养基，30℃、200rpm振荡培养24h，菌液稀释涂布于含10％蔗糖的平板，30℃培养48h至长出单菌落，挑选单菌落分别接种于含硫酸卡那霉素的平板及含10％蔗糖的平板，挑选在10％的蔗糖平板上生长而在硫酸卡那霉素平板上不生长的单菌落送测序，测序正确的单菌落即为工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT：：ilvC。
实施例5菌株的培养、发酵
5.1种子培养
取一支甘油管保存的工程菌菌种C.glutamicum H5ΔargGΔalaT：：ilvC，室温放置融化，吸取1mL菌液至固态活化培养基上划线，30℃培养16h；从活化培养基上挑一接种环菌苔转接到种子培养基中，30℃、200rpm振荡培养16h。
活化培养基配方为：玉米浆5％、胰蛋白胨1％、氯化钠0.5％、硫酸铵0.4％、葡萄糖0.3％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、丙氨酸0.004％、琼脂粉2％，余量为去离子水，pH为7。
种子培养基培养为：葡萄糖3％、硫酸铵2.5％、玉米浆3.5％、酵母膏0.3％、丝肽粉0.3％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、维生素B1 0.00003％、生物素0.00002％、硫酸铁0.00001％、碳酸钙4％、丙氨酸0.004％、余量为去离子水，pH为7。
5.2发酵培养
按10％的体积比接种种子至3L发酵培养基中，控温30℃，氨水控制pH在7.0，通过调整转速及通气量维持溶氧在30％，当残糖含量低于1.5％时，流加80％的葡萄糖，维持残糖含量在1.5～2.5％，发酵时间为65h。最终通过HPLC检测到发酵液中L-异亮氨酸含量为4.8％。
发酵培养基配方为：葡萄糖16％、硫酸铵0.8％、玉米浆3.5％、酵母膏0.3％、丝肽粉0.3％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、维生素B1 0.00003％、生物素0.00002％、硫酸铁0.00001％、丙氨酸0.004％，余量为去离子水，pH为7。
序列表
<110> 武汉远大弘元股份有限公司
<120> 一株高产L-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用
<160> 7
<210> 1
<211> 1220
<212> DNA
<213> 精氨基琥珀酸合成酶上游argG-L核苷酸片段
<400> 1
GTGCCACTGGTGAACTCCTTGTCCGATGATCTGCACCCATGCCAGATTCTGGCTGATCTGCAGACCATCGTGGAAAACCTCAGCCCTGAAGAAGGCCCAGCAGGCCTTAAGGGTAAGAAGGCTGTGTACCTGGGCGATGGCGACAACAACATGGCCAACTCCTACATGATTGGCTTTGCCACCGCGGGCATGGATATCTCCATCATCGCTCCTGAAGGGTTCCAGCCTCGTGCGGAATTCGTGGAGCGCGCGGAAAAGCGTGGCCAGGAAACCGGCGCGAAGGTTGTTGTCACCGACAGCCTCGACGAGGTTGCCGGCGCCGATGTTGTCATCACCGATACCTGGGTATCCATGGGTATGGAAAACGACGGCATCGATCGCACCACACCTTTCGTTCCCTACCAGGTCAACGATGAGGTCATGGCGAAAGCTAACGACGGCGCCATCTTCCTGCACTGCCTTCCTGCCTACCGCGGCAAAGAAGTGGCAGCCTCCGTGATTGATGGACCAGCGTCCAAAGTTTTCGATGAAGCAGAAAACCGCCTCCACGCTCAGAAAGCACTGCTGGTGTGGCTGCTGGCCCACCAGCCGAGGTAAGACATGTCCCTTGGCTCAACCCCGTCAACACCGGAAAACTTAAATCCCGTGACTCGCACTGCACGCCAAGCTCTCATTTTGCAGATTTTGGACAAACAAAAAGTCACCAGCCAGGTACAACTGTCTGAATTGCTGCTGGATGAAGGCATCGATATCACCCAGGCCACCTTGTCCCGAGATCTCGATGAACTCGGTGCACGCAAGGTTCGCCCCGATGGGGGACGCGCCTACTACGCGGTCGGCCCAGTAGATAGCATCGCCCGCGAAGATCTCCGGGGTCCGTCGGAGAAGCTGCGCCGCATGCTTGATGAACTGCTGGTTTCTACAGATCATTCCGGCAACATCGCGATGCTGCGCACCCCGCCGGGAGCTGCCCAGTACCTGGCAAGTTTCATCGATAGGGTGGGGCTGAAAGAAGTCGTTGGCACCATCGCTGGCGATGACACCGTTTTCGTTCTCGCCCGTGATCCGCTCACAGGTAAAGAACTAGGTGAATTACTCAGCGGGCGCACCACTTAAAGCGCCCCTAGTTCAAGGCTTGTTAATCGCTTGTTAATGCAGGCAGGTAAGGTATAACCCGAGTGTTTTTTCGAGGAATACCAACCCTTTCAACACATGCATAA
<210> 2
<211> 1313
<212> DNA
<213> 精氨基琥珀酸合成酶下游argG-R核苷酸片段
<400> 2
AAGCCACCTTTTCAAGCATCCAGACTAGAACTTCAAGTATTTAGAAAGTAGAAGAACACCACATGGAACAGCACGGAACCAATGAAGGTGCGCTGTGGGGCGGCCGCTTCTCCGGTGGACCCTCCGAGGCCATGTTCGCCTTGAGTGTCTCCACTCATTTCGACTGGGTTTTGGCCCCTTATGATGTGTTGGCCTCCAAGGCACACGCCAAGGTTTTGCACCAAGCAGAGCTACTTTCTGATGAAGATCTAGCCACCATGCTGGCTGGGCTTGATCAGCTGGGCAAGGATGTCGCCGACGGAACCTTCGGTCCGCTGCCTTCTGATGAGGATGTGCACGGCGCGATGGAACGCGGTCTGATTGACCGCGTTGGTCCTGAGGTGGGCGGCCGTCTGCGCGCTGGTCGTTCCCGCAATGACCAGGTGGCAACCCTGTTCCGCATGTGGGTCCGCGACGCAGTGCGCGACATCGCGCTGGGAACAACCGAGCTTGTCGACGCCCTCAGCGCCCAAGCTAAGGCACATGCAGACGCGATCATGCCAGGCAAGACCCACTTCCAGGCAGCTCAGCCGGTCCTTCTGGCACACCAGCTGCTGGCACACGCACAGCCTTTGCTGCGCGATATTGATCGTATCCGTGACCTGGACAAGCGTCTTGCGGTGTCTCCTTACGGTTCCGGCGCACTTGCTGGTTCCTCTTTGAAGCTCAACCCTGAAGCAATCGCTGAAGAACTCGGCTTTGATTCCGCAGCAGATAACTCCATTGATGCCACCAGCTCCCACGATTTCGCATCTGAAACCGCCTTCGTGCTGGCGCAGCTTGCAGTGGATATGTCCCGCTTGGCTGAAGAAATCATCGCATGGTGCACCCCAGAATTTGGTTACATCACCTTGTCTGATTCCTGGTCCACAGGCAGCTCAATCATGCCGCAGAAGAAGAACCCTGACGTGGCAGAGCTGACCCGTGGCAAGTCTGGTCGCTTGATCGGTAACCTCACCGGTCTGCTGGCTACCCTGAAGGCACAGCCTTTAGCGTACAACCGCGACCTGCAGGAAGATAAGGAACCAATCGTAGATTCCGTGGCGCAGCTCAACCTGCTGCTCCCTGCAATGACTGGTTTGGTTTCCACCTTGACCTTCAACACCGAGCGCATGCGTGAACTTGCACCAGCAGGTTTCACCCTTGCCACCGACTTGGCTGAGTGGATGGTGCGCCAGGGCGTTCCATTCCGTGAGGCACACGAAGCATCCGGCGCTTGCGTGCGGATCGCGGAGTCCAGGGGAGTGGACCTTATCGATCTCACTGATGAAGAA
<210> 3
<211> 1420
<212> DNA
<213> 氨基转移酶上游alaT-L核苷酸片段
<400> 3
GCCACTTTGGACTAATCAATATCTTCACCTGGTTTTTTCTGGAAACCCACACCTCATCCGGTCAGTACCACCTCGGCACCGTCTTTCATGGCAAGCACAACATTATTGTTGAGCACTCTCAACCCTTTCACCGAAGTGACACCTACCTTTATTTCTTAGGATTCCAGGCTTTCGCCATTGGTGGCGATGACGTCGCGGCACCAATCAAAGGACTTCTTCTTGTAGCGCTTCAAGATTCCTGAGCCGCCGTCGTCGAGGTATTTGATGCGGTAGTCATCGTTTACTGTTGGGCCGGAGGGTCCGTCGATAAGCACGTCCTTTGCTCCTAGTCCGTTTTCGACGATGAACAGTGGCTTCTGCCAGCGCTCCCAGTAGTTGTTCAGGACGATGCGCAAACCGAGGGGATCAACTTGCCAACCCCATTCGGAAGCCGCGAGAGTGGGGCTGACCACTCCGCCGATGATGTTACCGCCACCGGTTGAGTAGTTTTCGGGGTTGTGGGCTTCACATACGGACATGTAATAGGAGAAGGAAATGAAATCGACGGTGTTTTTTTAAAATCTCACGGTCTTCATCTGTGATGTCGATGGTGATACCCTTTCGCGGAATTTGCGCAGCAAGTAGCCTGGGTATTCGCCACGGACGTGAATATCGCCGAAGGCATAGTCCTCGTGGGACTTTTGCTGGGCGGTAAGTTGATCGCGTGGGTCCGGGGTAATGCCATAACGAGGAACGGCAATAATCATGCAACCGATCTGGTTTTGTGGGTCGATCTCATGAGCAATCTTAGTTGCCAAAGCACTTGCTACTCAATCATGGTAAACAGCCTGGTCGCAGTCCTTCACGATTCAAACTTTGCCTTCCGCTACGCCTTCCACCTGATCATCATAGAAGACGGTGAAGTAACAGCAGCCGGAGATCCCACAGAGATCGTCACTGCGGGACTGATCGAAGAAGTCTACAACGTCAAAGCCTGTGCATCCCAGACCCCGTGAACAGCAAACCGATGATCGTGCCACTGGAAAGATCTTAGGCAGCCGTGGGATTACACCCTTTTAGAGTTAGAACAGTAAAAATTCGCCCAATAGCTTTCAACTACGCACACAAAGTGGCAACATTGAGCGGGTGACTACAGACAAGCGCAAAACCTCTAAGACCACCGACACCGCCAACAAGGCTGTGGGCGCGGATCAGGCGGCGCGTCCCACTCGGCGAACAACTCGCCGCATCTTCGATCAGTCGGAGAAGATGAAGGACGTGCTGTACGAGATCCGTGGCCCGGTGGCCGCGGAGGCGGAACGCATGGAGCTTGATGGGCACAACATCTTAAAGCTCAACACGGGAAATCCAGCCGTGTTCGGATTCGATGCCCCCGACGTGATTATGCGTGACATGATCGCCAACCTTCCAATGCATAAAA
<210> 4
<211> 1509
<212> DNA
<213> 氨基转移酶下游alaT-R核苷酸片段
<400> 4
GCGGCCGCATCTCCTTTGCATCACATACAACGGTCTATCCAAGGCATACCGCGTCGCAGGATACCGAGCTGGCTGGATGGTATTGACTGGACCAAAGCAATACGCACGTGGATTTATTGAGGGCCTCGAACTCCTCGCAGGCACTCGACTCTGCCCGAATGTCCCAGCTCAGCACGCTATTCAGGTGGCTCTCGGTGGACGCCAGTCCATCTACGACCTCACTGGCGAACACGGCCGACTCTTGGAACAGCGCAACATGGCATGGACGAAACTCAACGAAATCCCAGGTGTCAGCTGTGTGAAACCAATGGGAGCTCTATACGCGTTCCCCAAGCTCGACCCCAACGTGTACGAAATCCACGACGACACCCAACTCATGCTGGATCTTCTCCGTGCCGAGAAAATCCTCATGGTTCAGGGCACTGGCTTCAACTGGCCACATCACGATCACTTCCGAGTGGTCACCCTGCCATGGGCATCCCAGTTGGAAAACGCAATTGAGCGCCTGGGTAACTTCCTGTCCACTTACAAGCAGTAGTAGTTGTTAGGATTCACCACGAATCTCAGGATTTTTGAGATTCGTGGTGAATTTTTGCGTTTTCCAGTCAGGCTCTTGCAACTTTCGGACCGATTTCAGAGGGGCGGAGCTGGTTTGTGGTGGATCCTTGCAATGGAACCGCTTAGGAATACCAAGTTGGAGGCCAGGGTGTTGGGATTGCAAAAATCCGTCCCCAGTTCGTTGTAAAATATCGATCTTGATCGAATATTAGAGCTAATATTGGACTATTATGCAAAAACTCGTTCGATTCAAGGATCTCCTAGCGATCTGAGACGAGAAGTTGGACAGCTAACCTGCAGAAACCTTGCAAGAATCACAACAGCCCCAATGGCCTCAAAAGTCACGCCCTCAGAATCGCTGCCAAGCGTCTAAATCCCCTAAAACGGGACAATAGGTCACTGGGCGATCCCAAGCCCTTAAAACGTGATCCTTAAATACCCACTGTCCTCTATTCTGGGTTAGGCTTCACTGGGTAAAAGTGCCTGCCTATGCCTGAAACTTGAGCATGGCAACAGCAAGGAGACACCGTGGGAAAACATGCAGCTGAAACATCGGAACCGAAGAAAAATTCACCGTGGCGCATTGGTTTGTTGACGTTTTTGATTTCTTCAGTTGTCGTGACGCTGGTGGGCATGGTGATGCTGTGGCCGGATTCTGATGATGTGGTGTTGGCGGATAACTTTTCGCAGACGTTTGCGGGAAATCATGAGCAGGTGGATGGAACGATCACGCTCGTTGATAATTCTGCGTGTAATTCGCCAGACACCGGCCGAGTTTTTGCGGAAAGCCCCACGATTTCTGCGGAGCCGGCAACGTTGGAGTGCGTGCGTGCACTCGTAGACATCACATCGGGTGCCAATGAGGGGCAGAAAACTCAGCTGATCACTTACGCGCAACCTGGTGATCCGGAGTTTTCCGAGGGCGACAAGATCCGCATGGTGGAAACACCG
<210> 5
<211> 116
<212> DNA
<213> 启动子PlacUV5
<400> 5
GTAGAGGATCGAGATCTCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGAATTCCATGGGCAGCAGCCAT
<210> 6
<211> 1017
<212> DNA
<213> 乙酰羟酸还原异构酶ilvC
<400> 6
ATGGCTATTGAACTGCTTTATGATGCTGACGCTGACCTCTCCTTGATCCAGGGCCGTAAGGTTGCCATCGTTGGCTACGGCTCCCAGGGCCACGCACACTCCCAGAACCTCCGCGATTCTGGCGTTGAGGATGTCATTGGTCTGCACGAGGGCTCCAAGTCCGCAGAGAAGGCAAAGGAAGCAGGCTTCGAGGACAAGACCACCGCTGAGGCTGCAGCTTGGGCTGACGTCATCATGCTCCTGGCTCCAGACACCTCCCAGGCAGAAATCTTCACCAACGACATCGAGCCAAACCTGAACGCAGGCGACGCACTGCTGTTCGGCCACGGCCTGAACATTCACTTCGACCTGATCAAGCCAGCTGACGACATCATCGTTGGCATGGTTGCGCCAAAGGGCCCAGGCCACTTGGTTCGCCGTCAGTTCGTTGATGGCAAGGGTGTTCCTTGCCTCATCGCAGTCGACCAGGACCCAACCGGAACCGCACAGGCTCTGACCCTGTCCTACGCAGCAGCAATCGGTGGCGCACGCGCAGGCGTTATCCCAACCACCTTCGAAGCTGAGACCGTCACCGACCTCTTCGGCGAGCAGGCTGTTCTCTGCGGTGGCACCGAGGAACTGGTCAAGGTTGGCTTCGAGGTTCTCACCGAAGCTGGCTACGAGCCAGAGATGGCATACTTCGAGGTTCTTCACGAGCTCAAGCTCATCGTTGACCTCATGTTCGAAGGTGGCATCAGCAACATGAACTACTCTGTTTCTGACACCGCTGAGTTCGGTGGCTACCTCTCCGGCCCACGCGTCATCGATGCAGACACCAAGTCCCGCATGAAAGACATCCTGACCGATATCCAGGACGGCACCTTCACCAAGCGCCTCATCGCAAACGTTGAGAACGGCAACACCGAGCTTGAGGGCCTTCGTGCTTCCTACAACAACCACCCAATCGAGGAGACCGGCGCTAAGCTCCGCGACCTCATGAGCTGGGTCAAGGTTGACGCTCGCGCAGAAACCGCTTAA
<210> 7
<211> 426
<212> DNA
<213> 终止子rrnB
<400> 7
GGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCT

Claims (6)

1.一株高产L-异亮氨酸的基因工程菌，命名为C.glutamicum H5ΔargGΔalaT：：ilvC，其分类为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，该基因工程菌是将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)H5菌株敲除了编码精氨基琥珀酸合成酶的argG基因及编码N-乙酰鸟氨酸-δ-氨基转移酶的alaT基因，且在alaT基因被敲除的位点插入了编码乙酰羟酸还原异构酶的ilvC基因的操纵子，所述谷氨酸棒杆菌H5菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016609。
2.如权利要求1所述的高产L-异亮氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)出发菌株是筛选得到的突变菌株，命名为Corynebacterium glutamicum H5，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016609，其分类为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，属于革兰氏阳性菌；
(2)利用EcoRI/SalI双酶切质粒pk18mobsacB，回收5.6kb核苷酸片段；以Corynebacterium glutamicum H5基因组为模板，设计引物，扩增argG基因上游1.22kb的核苷酸片段argG-L、及下游1.31kb的核苷酸片段argG-R，通过GIBSON连接上述3个片段，构建重组质粒argG-pk18mobsacB，该质粒即为argG基因的敲除载体，其中，扩增argG-L、argG-R核苷酸片段所用的引物为：
argG-L-FP:5‘-CTATGACATGATTACGAATTCGTGCCACTGGTGAACTCCTTG-3’
argG-L-RP:5‘-TGAAAAGGTGGCTTATGCATGTGTTGAAAGGGTTGGTATT-3’
argG-R-FP:5‘-AACCCTTTCAACACATGCATAAGCCACCTTTTCAAGCATC-3’
argG-R-RP:5‘-AGGTCGACTCTAGAGGATCCTTCTTCATCAGTGAGATCGA-3’
(3)将步骤(2)中的重组质粒转化步骤(1)中所述出发菌株Corynebacteriumglutamicum H5，通过同源重组获得argG基因缺陷的基因工程菌C.glutamicum H5ΔargG；
(4)继续利用EcoRI/SalI双酶切质粒pk18mobsacB，回收5.6kb核苷酸片段；以Corynebacterium glutamicum H5基因组为模板，设计引物，扩增alaT基因上游1.42kb的核苷酸片段alaT-L、及下游1.51kb的核苷酸片段alaT-R，通过GIBSON连接上述3个片段，构建重组质粒alaT-pk18mobsacB，该质粒即alaT基因的敲除载体，其中，扩增alaT-L、alaT-R核苷酸片段的引物为：
alaT-L-FP:5‘-ATGACATGATTACGAATTCGCCACTTTGGACTAATCAATAT-3’
alaT-L-RP:5‘-ATGCGGCCGCTTTTATGCATTGGAAGGTTGGCGATCATG-3’
alaT-R-FP:5‘-CAATGCATAAAAGCGGCCGCATCTCCTTTGCATCACATAC-3’
alaT-R-RP:5‘-TTGCATGCCTGCAGGTCGACCGGTGTTTCCACCATGCGG-3’
(5)将步骤(4)中的重组质粒转化步骤(3)中所述的基因工程菌C.glutamicum H5ΔargG，通过同源重组获得alaT基因缺陷的基因工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT；
(6)利用NsiI/NotI双酶切重组质粒alaT-pk18mobsacB，回收8.7kb核苷酸片段；以Corynebacterium glutamicum H5基因组为模板，设计引物扩增ilvC基因片段；以大肠杆菌表达载体PVB220为模板，设计引物扩增PlacUV5启动子片段；以大肠-谷氨酸棒杆菌穿梭载体PXMJ19为模板，设计引物扩增终止子rrnB片段；通过GIBSON连接上述4个片段，构建重组质粒ilvC-alaT-pk18mobsacB，该质粒即为ilvC操纵子的插入载体。其中，ilvC操纵子包括PlacUV5启动子、ilvC基因及rrnB终止子3个片段，扩增3个片段所用的引物为：
placUV5 FP:5‘-TCGCCAACCTTCCAATGCATGTAGAGGATCGAGATCTCCA-3’
placUV5 RP:5‘-TAAAGCAGTTCAATAGCCATATGGCTGCTGCCCATGGAAT-3’
ilvC FP:5‘-ATTCCATGGGCAGCAGCCATATGGCTATTGAACTGCTTTA-3’
ilvC RP:5‘-tctcatccgccaaaacagccTTAAGCGGTTTCTGCGCGAG-3’
rrnB FP:5‘-CTCGCGCAGAAACCGCTTAAggctgttttggcggatgaga-3’
rrnB RP:5‘-TGCAAAGGAGATGCGGCCGCagagtttgtagaaacgcaaa-3’
(7)将步骤(6)中的插入载体转化步骤(5)中所述的基因工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT，通过同源重组获得在alaT基因被敲除的位点插入了ilvC操纵子的基因工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT：：ilvC。
3.权利要求1所述的基因工程菌在发酵生产L-异亮氨酸中的应用，其特征在于：将菌种活化培养后转接种子培养基培养，种液转接至发酵罐直接发酵。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述活化培养的培养基配方为：玉米浆5％、胰蛋白胨1％、氯化钠0.5％、硫酸铵0.4％、葡萄糖0.3％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、丙氨酸0.004％、琼脂粉2％，余量为去离子水，pH为7，均为重量百分比。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述种子培养基配方为：葡萄糖3％、硫酸铵2.5％、玉米浆3.5％、酵母膏0.3％、丝肽粉0.3％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、维生素B1 0.00003％、生物素0.00002％、硫酸铁0.00001％、碳酸钙4％、丙氨酸0.004％、余量为去离子水，pH为7，均为重量百分比。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述发酵培养基配方为：葡萄糖16％、硫酸铵0.8％、玉米浆3.5％、酵母膏0.3％、丝肽粉0.3％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、维生素B1 0.00003％、生物素0.00002％、硫酸铁0.00001％、丙氨酸0.004％，余量为去离子水，pH为7，均为重量百分比。
CN201611146169.3A 2016-12-13 2016-12-13 一株高产l-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用 Active CN106701648B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611146169.3A CN106701648B (zh) 2016-12-13 2016-12-13 一株高产l-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611146169.3A CN106701648B (zh) 2016-12-13 2016-12-13 一株高产l-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106701648A CN106701648A (zh) 2017-05-24
CN106701648B true CN106701648B (zh) 2019-09-20

Family

ID=58937316

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611146169.3A Active CN106701648B (zh) 2016-12-13 2016-12-13 一株高产l-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106701648B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109536428B (zh) * 2018-12-07 2022-08-30 武汉远大弘元股份有限公司 一种产l-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用
CN109554324A (zh) * 2018-12-14 2019-04-02 江南大学 一株产l-异亮氨酸的黄色短杆菌重组菌及其构建方法
CN110004102A (zh) * 2019-04-23 2019-07-12 南京工业大学 一种利用马来酸全细胞催化合成l-天冬氨酸的菌株与方法
CN111321100B (zh) * 2020-02-28 2022-03-25 江南大学 一株产l-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104480057A (zh) * 2014-12-04 2015-04-01 江南大学 一株产l-异亮氨酸基因工程菌的构建方法及应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3009504B1 (en) * 2013-06-11 2020-12-02 Cj Cheiljedang Corporation Microorganism producing l-isoleucine and method for preparing l-isoleucine using the same

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104480057A (zh) * 2014-12-04 2015-04-01 江南大学 一株产l-异亮氨酸基因工程菌的构建方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌生产L-异亮氨酸";赵建勋;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20151215;第2页图1-1，第4页第1.2.2节 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106701648A (zh) 2017-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110607268B (zh) 一株高产l-缬氨酸的基因工程菌及发酵生产l-缬氨酸方法
CN106701648B (zh) 一株高产l-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用
CN102453691B (zh) 高产l-色氨酸的大肠杆菌工程菌
CN110964683B (zh) 生产l-精氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
CN110468092B (zh) 一株高产l-缬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
CN109536428A (zh) 一种产l-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用
CN104878034B (zh) L-赖氨酸基因工程生产菌
CN109055290A (zh) 一种高产l-高丝氨酸的重组大肠杆菌及其应用
CN106520655A (zh) 重组菌株及其制备方法和生产l‑缬氨酸的方法
CN107002027A (zh) 用于生产l‑精氨酸的棒状杆菌属微生物和使用其的l‑精氨酸生产方法
CN110106206A (zh) 一种提高l-赖氨酸产量及稳定性的谷氨酸棒状杆菌构建方法
CN104480058A (zh) 一株高产l-亮氨酸工程菌及其应用
CN106574237A (zh) 生产o‑乙酰高丝氨酸的微生物和使用其生产o‑乙酰高丝氨酸的方法
CN109852572A (zh) 一种敲除大肠杆菌pts系统提高l-苏氨酸产量的方法
CN111321100B (zh) 一株产l-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌
CN105400801B (zh) 解除反馈抑制的thrA基因突变体及其应用
CN106591209A (zh) 重组菌株及其制备方法和生产l‑苏氨酸的方法
CN106635944A (zh) 一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
CN105907692A (zh) 一种高产l-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法
CN113278571A (zh) 一种棒状杆菌工程菌构建方法及应用
CN108611308A (zh) 一种高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌的制备方法及应用
CN110055201B (zh) 一种高产透明质酸寡糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法
CN111286520B (zh) 用于发酵生产l-赖氨酸的重组dna、菌株及其应用
CN113736719A (zh) 一种谷氨酸棒杆菌基因工程菌及其在亚精胺生产中的应用
CN110387344A (zh) 生产l-亮氨酸的重组菌、其构建方法及l-亮氨酸的生产方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant