CN106754527A - 一种中草药复合微生态制剂及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种中草药复合微生态制剂及其制备方法，和在水产养殖中的用途，该微生态制剂主要由中草药提取液、发酵培养基、以及复合菌液发酵制备得到，中草药提取液主要由30‑35％黄芪、10‑15％艾叶、15‑20％决明子、15‑20％当归、10‑15％杜仲提取得到；复合菌液主要分别由乳酸杆菌、枯草芽胞杆菌、酵母菌、光合细菌发酵后混合得到。本发明的中草药复合微生态制剂，能够在水产养殖过程中起到净化水质、提高水产动物免疫力的作用，既能快速降低水体中的有害物质，改善水质；又能抑制病原微生物的繁殖生长，激发水产动物的自身免疫力和抗应激能力，减少疾病发生，提高水产动物成活率，降低死亡率，提高饲料利用率及转化率。

Description

一种中草药复合微生态制剂及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种中草药复合微生态制剂及其制备方法，和在水产养殖中的用途。
背景技术
近年来，水产动物的需求量不断加大，仅靠捕捞已经远远无法满足市场需求，因此，催生了水产动物人工养殖业的迅猛发展。
我国是目前世界第一水产养殖消费大国，随着水产养殖技术的进步，规模化水产养殖行业得到了迅猛发展并带来越来越多的经济价值，然而，规模化水产养殖在发展的同时，也存在水体环境恶化，且病害频发的问题，同时，抗生素类药物的滥用及其他药物的使用导致水产动物肠胃正常微生态菌群失调，并且产生细菌抗药性及药物残留，给人类健康带来了潜在危害，这些都严重影响制约了规模化水产养殖的健康可持续发展。
开发安全、优质、营养的绿色无公害水产品已成为当今社会的共识。目前，现有技术关于微生态制剂的研究，或者可以用于改善水质，或者可以用于提高水产动物免疫力，并且用于提高水体动物免疫力的微生态制剂基本都要依靠添加到饲料中投喂的方式，例如，在专利申请号CN201010602297.0的公开文本中公开了“多功能型海参养殖用复合微生态制剂”，该微生态制剂采用萎缩芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌，将该制剂添加到饲料中进行投喂，具有抗菌、免疫、促生长等功效，但不具备改善水质的作用；在专利申请号为CN20140461391.7的公开文本中公开了“一种复合微生态制剂及其制备方法”，该微生态制剂采用枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、屎肠球菌、短小乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌和酿酒酵母等，可以用于降解水体氨氮、硫化氢等有害物质从而改善水质，但不能激发水产动物自身免疫力；在专利申请号CN201310210210.09的公开文本中公开了“一种提高水产动物免疫力的中草药饲料添加剂”，该中草药添加剂是通过添加到饲料中使用，该添加剂仅能促进水产动物的免疫力，对养殖水体改善并无功效。这些微生态制剂功效单一，并且使用方法也受到限制，不易推广使用，经济价值有限。
因此，寻求一种既能改善水质，又能提高水产动物免疫力的微生态制剂是非常有意义的工作。
发明内容
一方面，本发明提供既可改善水质，又可提高水生动物免疫力从而提高成活率的中草药复合微生态制剂，该微生态制剂既能促进有益微生物增长以降解水中有毒有害物如氨氮、亚硝基氮及硫化氢等有害有毒物质，改善养殖水体环境，促进水产动物的生长；又能抑制水体环境病原微生物，激发水产动物的自发免疫力和抗应激能力，提高饲料利用率及转化率，提高水产动物的成活率，促进水产动物的快速健康生长，进而增加水产养殖效益。
一种中草药复合微生态制剂，主要由中草药提取液、发酵培养基、以及复合菌液发酵制备得到，其中，所述中草药提取液主要由30-35％黄芪、10-15％艾叶、15-20％决明子、15-20％当归、10-15％杜仲提取得到；所述复合菌液主要分别由乳酸杆菌、枯草芽胞杆菌、酵母菌、光合细菌发酵后混合得到。
优选的，上述发酵培养基主要由以下组分制成：糖蜜4～5重量份、玉米浆粉4～5重量份、葡萄糖8～10重量份、氯化钠0.4～0.5重量份、磷酸二氢钾0.2～0.25重量份、磷酸二氢铵0.2～0.25重量份、硫酸镁0.15～0.2重量份、硫酸亚铁0.004～0.005重量份、吐温-800.5～1重量份，水950～1000体积份。
优选的，上述复合菌液中乳酸杆菌、枯草芽胞杆菌、酵母菌、光合细菌的体积比为2～4：1～3：2～5：1～3。
优选的，上述中草药复合微生态制剂的活菌数≥1.0×109cfu/mL。
另一方面，本发明提供一种制备上述中草药复合微生态制剂的方法，包括：
(1)制备中草药提取液：将所述中草药提取液原料粉碎混合，加水浸泡，在100-110℃下煎煮1-2小时后分离过滤，滤液即为中草药提取液；
(2)制备复合菌液：将组成复合菌液的菌种分别进行一级种子液培养及二级种子液培养后，将得到的二级种子液混合后即为复合菌液；
(3)混合发酵：发酵培养基和复合菌液混合，其中，中草药提取液、发酵培养基的体积比为6～7：3～4(例如7:3)，复合菌液的接种量为1～2％(V/V％)，通气量1-1.5VVM，搅拌转速150-200r/min，温度35-37℃，发酵溶解氧控制在15-20％之间，混合发酵48-50h，当pH至低于3.5时，结束发酵，得到中草药复合微生态制剂。
优选的，上述步骤(1)中分离过滤得到滤液后，还可将滤渣重复进行煎煮提取1-3次后，将每次煎煮的滤液合并得到中草药提取液。
优选的，上述步骤(1)中加水量为中草药的3～11倍体积，加水浸泡8-10小时。
优选的，上述步骤(2)中一级种子液的培养包括：分别将菌种接种到种子培养基中培养，接种量为2～3％(V/V％)，在28～35℃、150～200r/min下培养12-16h，得到一级种子液。
优选的，上述步骤(2)中二级种子液的培养包括：将一级种子培养液分别以2-3％(V/V％)的接种量接种至种子培养基中培养，通气量1-1.5VVM，搅拌转速150-200r/min，温度35-37℃，发酵溶解氧15-20％之间，发酵16～24h，得到二级种子液。
优选的，上述步骤(2)中将上述菌种进行一级种子液培养前，先进行菌种的活化复壮。
优选的，上述种子培养基主要由以下组分制成：酵母粉4～5重量份、蛋白胨8～10重量份、牛肉膏3～5重量份、葡萄糖7～10重量份、氯化钠0.3～0.5重量份、磷酸二氢钾0.1～0.25重量份、磷酸二氢铵0.2～0.25重量份、硫酸镁0.15～0.2重量份、硫酸亚铁0.004～0.005重量份，水950～1000体积份。
另一方面，本发明还提供一种上述制备方法制备得到的中草药复合微生态制剂。
再一方面，本发明还提供一种上述中草药复合微生态制剂的用途，可用于增强水生动物免疫力，和/或调节水质，从而可用于制备用于增强水生动物免疫力的制剂，和/或用于调节水质的制剂。
再一方面，本发明还提供上述中草药复合微生态制剂的使用方法，可以采用泼洒或者投喂的方式，泼洒时按0.5-1.0L/亩*m、投喂时按所投喂饲料质量的0.5-1.0‰，都可以达到既增强水深动物免疫力又调节水质的效果。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的一种水产养殖用中草药复合微生态制剂，能够在水产养殖过程中起到净化水质、提高水产动物免疫力的作用，既能快速降低水体中的氨氮、亚硝基氮以及硫化氢等有害物质，改善水质，为水产动物提供适宜的生长环境；又能抑制病原微生物的繁殖生长，激发水产动物的自身免疫力和抗应激能力，减少疾病发生，提高水产动物成活率，降低死亡率，提高饲料利用率及转化率，从而增加养殖效益。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
本发明针对目前规模化水产养殖水体水质差、水产动物防病能力低下的问题，应用现代生物工程技术和中草药技术，创造性的发现一种既可以用于水产养殖净化水质、又可以提高水产动物免疫力的中草药复合微生态制剂。
在第一方面，本发明提供一种中草药复合微生态制剂，主要由中草药提取液、发酵培养基、以及复合菌液发酵制备得到，其中，
所述中草药提取液主要由30-35％黄芪、10-15％艾叶、15-20％决明子、15-20％当归、10-15％杜仲提取得到；
所述复合菌液主要分别由乳酸杆菌、枯草芽胞杆菌、酵母菌、光合细菌发酵后混合得到。
作为本发明的一种优选，上述发酵培养基主要由以下组分制成：糖蜜4～5重量份(g)、优选5重量份(g)，玉米浆粉4～5重量份(g)、优选5重量份(g)，葡萄糖8-10重量份(g)、优选10重量份(g)，氯化钠0.4-0.5重量份(g)、优选0.5重量份(g)，磷酸二氢钾0.2-0.25重量份(g)、优选0.25重量份(g)，磷酸二氢铵0.2-0.25重量份(g)、优选0.25重量份(g)，硫酸镁0.15-0.2重量份(g)、优选0.2重量份(g)，硫酸亚铁0.004-0.005重量份(g)、优选0.005重量份(g)，吐温-80 0.5-1重量份(g)、优选1重量份(g)，水950-1000体积份(mL)，优选1000体积份(mL)。
作为本发明的一种优选，上述发酵培养基主要由以下组分制成：糖蜜5g、玉米浆粉5g、葡萄糖10g、氯化钠0.5g、磷酸二氢钾0.25g、磷酸二氢铵0.25g、硫酸镁0.2g、硫酸亚铁0.005g、吐温-80 1g，水1L。
作为本发明的一种优选，上述发酵培养基的pH为7.0-7.2。
作为本发明的一种优选，上述复合菌液中乳酸杆菌、枯草芽胞杆菌、酵母菌、光合细菌的体积比为2～4：1～3：2～5：1～3。
作为本发明的一种优选，上述中草药复合微生态制剂的活菌数≥1.0×109cfu/mL。
在第二方面，本发明还提供一种制备上述的中草药复合微生态制剂的方法，包括：
(1)制备中草药提取液：将所述中草药提取液原料粉碎混合，加水浸泡，在100-110℃下煎煮1-2小时后，例如包括煎煮2小时后，分离过滤，滤液即为中草药提取液；
(2)制备复合菌液：将组成复合菌液的菌种分别进行一级种子液培养及二级种子液培养后，将得到的二级种子液混合后即为复合菌液；
(3)混合发酵：发酵培养基和复合菌液混合，其中，中草药提取液、发酵培养基的体积比为6～7：3～4(例如7:3)，复合菌液的接种量为1～2％(V/V％)，通气量1-1.5VVM，搅拌转速150-200r/min，温度35-37℃，发酵溶解氧控制在15-20％之间，混合发酵48-50h，当pH至低于3.5时，结束发酵，得到中草药复合微生态制剂。
作为本发明的一种优选，所述步骤(1)中分离过滤得到滤液后，还可将滤渣重复进行煎煮提取1-3次后，将每次煎煮的滤液合并得到中草药提取液。
作为本发明的一种优选，第一次将滤渣重复煎煮为100-110℃下煎煮1～2小时，例如将步骤(1)中分离过滤得到的滤渣加入3～4倍体积水后，在100-110℃下煎煮1～2小时，分离过滤，得到第一次重复煎煮滤液和第一次重复煎煮后的滤渣。
作为本发明的一种优选，第二次将滤渣重复煎煮为100-110℃下煎煮0.5～1小时，例如将第一次重复煎煮后的滤渣加3～4倍体积水后，在100-110℃下煎煮0.5～1小时，分离过滤，得到第二次重复煎煮滤液和第二次重复煎煮后的滤渣。作为本发明的一种优选，第三次将滤渣重复煎煮为100-110℃下煎煮0.5～1小时，例如将将第二次重复煎煮后的滤渣加入2～3倍体积水后，在100-110℃下煎煮0.5～1小时，分离过滤，得到第三次重复煎煮滤液和第三次重复煎煮后的滤渣。
作为本发明的一种优选，所述步骤(1)中加水量为中草药的3～11倍，例如加水量为中草药的4倍体积，加水浸泡8-10小时。
上述制备方法中，对中草药原料进行浸泡的加水量体积和后续对滤渣进行重复煎煮提取的加水量体积，可以相同或不同。
上述制备方法中，对中草药原料或对滤渣进行重复煎煮提取时，煎煮时间可以相同或者不同，作为一种优选，每次滤渣的煎煮提取时间根据实际情况而有所不同。
上述制备方法中，根据重复煎煮提取次数，将滤液和后续重复煎煮滤液合并，得到中草药提取液，例如当重复煎煮三次时，将滤液和第一次重复煎煮滤液、第二次重复煎煮滤液、第三次重复煎煮滤液合并后得到中草药提取液。
作为本发明的一种优选，上述制备方法中的步骤(1)包括：将中草药提取液的原料包括黄芪、艾叶、决明子、当归、杜仲经粉碎、混合均匀后，加3-11倍(例如4倍)体积水浸泡8～10h，在100～110℃下煎煮1-2小时(例如2小时)后，分离过滤，得到滤渣和滤液，将滤渣加3-4倍体积水(例如4倍体积水)，再在100～110℃下煎煮1-2小时(例如1小时)，再过滤分离，得到第一次重复煎煮的滤液后第一次重复煎煮后的滤渣，向第一次重复煎煮后的滤渣中再加3-4倍体积水(例如3倍体积水)，在100～110℃下煎煮0.5-1小时(例如0.5小时)后，分离过滤，得到第二次重复煎煮的滤液，将滤液、第一次重复煎煮的滤液和第二次重复煎煮的滤液混合，得到中草药提取液。
上述制备方法中步骤(1)中所述的中草药提取液的原料包括30-35％黄芪、10-15％艾叶、15-20％决明子、15-20％当归、10-15％杜仲。
作为本发明的一种优选，上述步骤(2)中一级种子液的培养包括：分别将菌种接种到种子培养基中培养，接种量为2～3％(V/V％)，在28～35℃(例如35℃)、150～200r/min(例如160r/min)下培养12～16h，得到一级种子液。
作为本发明的一种优选，所述步骤(2)中二级种子液的培养包括：将一级种子培养液分别以2-3％的接种量(V/V％)接种至种子培养基中培养，通气量1-1.5VVM，搅拌转速150-200r/min，温度35-37℃，发酵溶解氧控制在15-20％之间，发酵16-24h，得到二级种子液。
作为本发明的一种优选，所述菌种进行一级种子液培养前，进行菌种的活化复壮。特别是针对低温保存的菌种或长时间保存的菌种，优选进行活化复壮，活化复壮可以采用本领域通用方法，也可以采用本发明提供的活化复壮方法，包括：将菌种(例如斜面菌种)分别在无菌条件下接种至种子培养基中，在28～35℃(例如35℃)、150～200r/min(例如160r/min)进行复壮培养12～16h，即为活化后菌种。
作为本发明的一种优选，上述步骤(2)制备复合菌液包括：分别将菌种接种到种子培养基中培养，接种量为2～3％(V/V％)，在28～35℃(例如35℃)、150～200r/min(例如160r/min)下培养12～16h，得到一级种子液；将一级种子培养液分别以2-3％(V/V％)的接种量接种至种子培养基中培养，通气量1-1.5VVM，搅拌转速150-200r/min，温度35-37℃，发酵溶解氧控制在15-20％之间，发酵16-24h，得到二级种子液；将得到的二级种子液混合后即为复合菌液。
作为本发明的一种优选，上述步骤(2)制备复合菌液包括：将菌种(例如斜面菌种)分别在无菌条件下接种至种子培养基中，在28～35℃(例如35℃)、150～200r/min(例如160r/min)进行复壮培养12～16h，即为活化后菌种；分别将菌种接种到种子培养基中培养，接种量为2～3％(V/V％)，在28～35℃(例如35℃)、150～200r/min(例如160r/min)下培养12～16h，得到一级种子液；将一级种子培养液分别以2-3％的接种量(V/V％)接种至种子培养基中培养，通气量1-1.5VVM，搅拌转速150-200r/min，温度35-37℃，发酵溶解氧控制在15-20％之间，发酵16-24h，得到二级种子液；将得到的二级种子液混合后即为复合菌液。
作为本发明的一种优选，上述种子培养基主要由以下组分制成：酵母粉4～5重量份(g)、优选5重量份(g)，蛋白胨8～10重量份(g)、优选10重量份(g)，牛肉膏3-5重量份(g)、优选4重量份(g)，葡萄糖7-10重量份(g)、优选10重量份(g)，氯化钠0.3-0.5重量份(g)、优选0.5重量份(g)，磷酸二氢钾0.1-0.25重量份(g)、优选0.25重量份(g)，磷酸二氢铵0.2-0.25重量份(g)、优选0.25重量份(g)，硫酸镁0.15-0.2重量份(g)、优选0.2重量份(g)，硫酸亚铁0.004-0.005重量份(g)，优选0.005重量份(g)，水950～1000体积份(mL)，优选1000体积份(mL)。
作为本发明的一种优选，上述种子培养基主要由以下组分制成：酵母粉4～5重量份、蛋白胨8～10重量份、牛肉膏3～5重量份、葡萄糖7～10重量份、氯化钠0.3～0.5重量份、磷酸二氢钾0.1～0.25重量份、磷酸二氢铵0.2～0.25重量份、硫酸镁0.15～0.2重量份、硫酸亚铁0.004～0.005重量份，水950～1000体积份。
作为本发明的一种优选，上述种子培养基主要由以下组分组成：酵母粉5g、蛋白胨10g、牛肉膏4g、葡萄糖10g、氯化钠0.5g、磷酸二氢钾0.25g、磷酸二氢铵0.25g、硫酸镁0.2g、硫酸亚铁0.005g，水1L。
作为本发明的一种优选，上述种子培养基的pH为7.0-7.2。
上述制备方法中，步骤(2)中所述的菌种包括乳酸杆菌、枯草芽胞杆菌、酵母菌、光合细菌。
在上述制备方法的步骤(3)混合发酵中，中草药提取液、发酵培养基以及复合菌液的混合加入不限定加入顺序，可以将中草药提取液、发酵培养基、以及复合菌液同时混合，或将中草药提取液、发酵培养基混合后，再与复合菌液混合，或将中草药提取液与复合菌液混合后，再与发酵培养基混合，或将发酵培养基与复合菌液混合后，再与中草药提取液混合。
本发明中所述的将物资A与物资B混合，可以采用将物资A加入到物资B中的方式，或将物资B加入到物资A中的方式，或将物资A、物资B不分顺序地同时加入第三容器中。
作为一种优选，当发酵的pH低于3.5，发酵制剂的活菌数≥1.0×109cfu/mL时，结束发酵，得到中草药复合微生态制剂。
在本发明的一个优选实施例中，一种水产养殖用中草药复合微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备中草药提取液：
将中草药提取液的原料包括黄芪、艾叶、决明子、当归、杜仲经粉碎、混合均匀后，加3-11倍(例如4倍)体积水浸泡8～10h，在100～110℃下煎煮1-2小时(例如2小时)后，分离过滤，得到滤渣和滤液，将滤渣加3-4倍体积水(例如4倍体积水)，再在100～110℃下煎煮1-2小时(例如1小时)，再过滤分离，得到第一次重复煎煮的滤液后第一次重复煎煮后的滤渣，向第一次重复煎煮后的滤渣中再加3-4倍体积水(例如3倍体积水)，在100～110℃下煎煮0.5-1小时(例如0.5小时)后，分离过滤，得到第二次重复煎煮的滤液，将滤液、第一次重复煎煮的滤液和第二次重复煎煮的滤液混合，得到中草药提取液；
(2)制备复合菌液：
将菌种(例如斜面菌种)分别在无菌条件下接种至种子培养基中，在28～35℃(例如35℃)、150～200r/min(例如160r/min)进行复壮培养12～16h，即为活化后菌种；分别将活化后的菌种接种到种子培养基中培养，接种量为2～3％(V/V％)，在28～35℃(例如35℃)、150～200r/min(例如160r/min)下培养12～16h，得到一级种子液；将一级种子培养液分别以2-3％的接种量(V/V％)接种至种子培养基中培养，通气量1-1.5VVM，搅拌转速150-200r/min，温度35-37℃，发酵溶解氧控制在15-20％之间，发酵16-24h，得到二级种子液；将得到的二级种子液混合后即为复合菌液；(3)混合发酵：将中草药提取液与发酵培养基按照6～7：3～4体积比例如包括按照7：3的体积比，混合，并将上述复合菌液按照1～2％体积的接种量接入，通气量1-1.5VVM，搅拌转速150-200r/min，温度35-37℃，发酵溶解氧控制在15-20％之间，混合发酵48-50h，当pH至低于3.5时，结束发酵，得到中草药复合微生态制剂。
上述本发明的制备方法中的步骤和优选条件等技术特征可以任意组合。
在第三方面，本发明提供一种根据上述的制备方法制备得到的中草药复合微生态制剂。
在第四方面，本发明还提供一种上述中草药复合微生态制剂的用途，可用于增强水生动物免疫力，和/或调节水质，从而可用于制备用于增强水生动物免疫力的制剂，和/或用于调节水质的制剂。
所述增强水生动物免疫力可以理解为包括提高免疫力、提高成活率、降低死亡率、提高抗应激能力、提高饲料利用率、提高饲料转化率等。
所述调节水质可以理解为包括降解水体中有害物质N\S等(例如氨氮、亚硝基氮、硫化氢等)、改善水体环境、改善水体颜色、降低水体化学需氧量(COD)等。
在第五方面，本发明还提供上述中草药复合微生态制剂的使用方法，可以采用泼洒或者投喂的方式，泼洒时按0.5-1.0L/亩*m、投喂时按所投喂饲料质量的0.5-1.0‰，两种使用方法都可以达到既增强水深动物免疫力又调节水质的效果。
近年来，高密度、集约化水产养殖模式极易打破池塘原有的生态平衡，有害耐药细菌及有害藻类大量繁殖，池塘中分解氨氮、亚硝酸盐及硫化氢等有害物质的微生物不足，水提中氨氮、亚硝酸盐等有害物质累积，因此，养殖环境中有害物质含量是养殖生产中急待解决的问题。
随着水产品在人们日常饮食中越来越占据重要的份额，为了满足不断增长的水产品的需求，解决因水产养殖规模不断扩大和生长周期缩短而导致的生理机能紊乱、疾病频发成为水产养殖的重点问题，也是水产饲料产业发展的关键。
本发明创造性的发现，通过将特定组合的复合菌液和中草药提取液进行混合发酵，得到的制剂可以既净化水质，又提高免疫力，并且还能采用泼洒或投喂等多种方式进行使用而不影响其多方面功效，弥补了现有技术的空白。
本发明进一步地通过将特定配方的中草药原料进行提取、将特定菌种发酵的菌液组合，与中草药提取液一起进行深层发酵的方式，得到了一种功效全面的制剂。进一步，经过对提取过程参数筛选、菌液发酵过程参数筛选、深层发酵参数筛选以及深层发酵培养基的筛选，得到了一种不仅具有多种功效的，而且每方面效果都非常好的、质量稳定的微生态制剂，在水体净化、水产动物免疫力提高从而提高成活率等方面，都得到验证，使用方便而质量稳定性好，非常适合于在水产养殖中推广，极大提高养殖经济价值。
本发明微生态制剂中微生物菌种间的协作关系好，协同效应好，各个菌种经过与中草药提取液混合深层发酵后的活性物质能显著提高免疫力，增强水产动物抵抗疾病的水平，有效促进水中有毒有害物如氨氮、亚硝基氮及硫化氢等有害有毒物质分解，改善养殖水体环境，质量稳定、活力高、效果好，并且使用方便。
本发明提供的一种水产养殖用中草药复合微生态制剂，能够在水产养殖过程中起到净化水质、提高水产动物免疫力的作用，一方面能快速降低水体中的氨氮、亚硝基氮以及硫化氢等有害物质，改善水质，为水产动物提供适宜的生长环境；另一方面能激发水产动物的自身免疫力，减少疾病发生。
实施例
实施例1
一种水产养殖用中草药复合微生态制剂的制备，具体步骤如下：
(1)制备中草药提取液：以30-35％黄芪、10-15％艾叶、15-20％决明子、15-20％当归、10-15％杜仲为原料，原料经过粉碎、混合均匀后，加4倍水浸泡9h，在105℃下煎煮2h分离过滤，滤渣加4倍水再煎煮1h，再次过滤分离，分离滤渣再加3倍水煎煮0.5h后分离过滤，三次过滤的滤液混合，即为中草药提取液；
(2)制备复合菌液：
①菌种活化复壮：将乳酸杆菌、枯草芽胞杆菌、酵母菌、光合细菌4种菌的斜面菌种分别在无菌条件下用接种环接种至装有经121℃高温灭菌25min后冷却的液体种子培养基的小摇瓶中，分别在35℃、160r/min摇床中进行复壮培养16h，即为活化复壮的菌种；
②一级种子液培养：将活化复壮后的4种菌分别在无菌条件下接种至装有经121℃高温灭菌25min后冷却的液体种子培养基的大摇瓶中，接种量为2％(V/V％)，接种后放置在35℃、160r/min摇床中进行培养16h，即为一级种子液；
③二级种子液培养：将发酵罐按70％装液量装入液体种子培养基，在125℃高温高压灭菌25min，冷却至35℃后在火焰保护下分别接种经检验合格的4种菌的一级种子液，接种量为2％(V/V％)，调节通气量1～1.5VVM，搅拌转速150～200r/min，温度35～37℃，使发酵溶解氧控制在15～20％之间，发酵24h，即为二级种子液；
④复合菌液：将4种二级种子液按照2：2：2：2的比例混合后，得到复合菌液；
种子培养基为：酵母粉5g、蛋白胨10g、牛肉膏4g、葡萄糖10g、氯化钠0.5g、磷酸二氢钾0.25g、磷酸二氢铵0.25g、硫酸镁0.2g、硫酸亚铁0.005g，水1L，pH 7.0-7.2；
(3)混合发酵：将中草药提取液与发酵培养基按体积比7:3进行混合，125℃高温高压下灭菌25min，冷却至35℃，将复合菌液按2％的接种量(V/V％)依次接种至发酵罐，接种后调节通气量1～1.5VVM，搅拌转速150～200r/min，温度35～37℃，使发酵溶解氧控制在15～20％之间，进行混合发酵48h，当pH至低于3.5时结束发酵，放罐、冷却、分装即得本发明中草药复合微生态制剂，活菌数可达2.0×109cfu/mL；
发酵培养基为：糖蜜5g、玉米浆粉5g、葡萄糖10g、氯化钠0.5g、磷酸二氢钾0.25g、磷酸二氢铵0.25g、硫酸镁0.2g、硫酸亚铁0.005g、吐温-80 1g，水1L，pH 7.0-7.2。
实施例2
一种水产养殖用中草药复合微生态制剂的制备，除中草药比例发生改变之外，其他制备步骤同实施例1，得到中草药复合微生态制剂活菌数为1.6×109cfu/mL。
中草药提取液以质量百分比计的原料组分为30％黄芪、20％艾叶、20％决明子、15％当归、15％杜仲。
实施例3
一种水产养殖用中草药复合微生态制剂的制备，除中草药比例发生改变之外，其他制备步骤同实施例1，得到中草药复合微生态制剂活菌数为2.1×109cfu/mL。
中草药提取液以质量百分比计的原料组分为30％黄芪、10％艾叶、20％决明子、20％当归、15％杜仲。
实施例4
一种中草药复合微生态制剂，该微生态制剂的活菌数≥1.0×109cfu/m，由中草药提取液、发酵培养基、以及复合菌液混合后进行发酵得到，其中：
1、培养基的制备：
种子培养基组成：酵母粉5g、蛋白胨10g、牛肉膏4g、葡萄糖10g、氯化钠0.5g、磷酸二氢钾0.25g、磷酸二氢铵0.25g、硫酸镁0.2g、硫酸亚铁0.005g，水1L；
发酵培养基组成：糖蜜5g、玉米浆粉5g、葡萄糖10g、氯化钠0.5g、磷酸二氢钾0.25g、磷酸二氢铵0.25g、硫酸镁0.2g、硫酸亚铁0.005g、吐温-80 1g，水1L，pH为7.0-7.2；
2、中草药提取液的制备：将30-35％黄芪、10-15％艾叶、15-20％决明子、15-20％当归、10-15％杜仲粉碎混合，加水浸泡，在100-110℃下煎煮1.5小时后，分离过滤，滤液即为中草药提取液；3、复合菌液的的制备：分别将乳酸杆菌、枯草芽胞杆菌、酵母菌、光合细菌的菌种进行一级种子液培养，再将一级种子液进行培养得到二级种子液，将4种菌种发酵得到的二级种子液混合，即为复合菌液，其中，种子液培养在种子培养基中进行；
4、混合发酵：将上面制备的中草药提取液和发酵培养基按照体积比6：4混合，然后接种1％的复合菌液，发酵48-50h，发酵的参数为：通气量1-1.5VVM，搅拌转速150-200r/min，温度35-37℃，发酵溶解氧控制在15-20％之间，当pH至低于3.5时，结束发酵，得到中草药复合微生态制剂。
实施例5
一种制备中草药复合微生态制剂的方法及该方法制备得到的微生态制剂：
(1)制备中草药提取液：
将中草药提取液的原料30-35％黄芪、10-15％艾叶、15-20％决明子、15-20％当归、10-15％杜仲经粉碎、混合均匀后，加4倍体积水浸泡8～10h，在100～110℃下煎煮2小时后，分离过滤，得到滤渣和滤液，将滤渣加4倍体积水，再在100～110℃下煎煮1小时，再过滤分离，得到第一次重复煎煮的滤液后第一次重复煎煮后的滤渣，向第一次重复煎煮后的滤渣中再加3倍体积水，在100～110℃下煎煮0.5小时后，分离过滤，得到第二次重复煎煮的滤液，将滤液、第一次重复煎煮的滤液和第二次重复煎煮的滤液混合，得到中草药提取液；
(2)制备复合菌液：
将乳酸杆菌、枯草芽胞杆菌、酵母菌、光合细菌的斜面菌种分别在无菌条件下接种至种子培养基中，在35℃、160r/min进行复壮培养12～16h，即为活化后菌种；分别将活化后的菌种接种到种子培养基中培养，接种量为2～3％(V/V％)，在35℃、160r/min下培养12～16h，得到一级种子液；将一级种子培养液分别以2-3％的接种量(V/V％)接种至种子培养基中培养，通气量1-1.5VVM，搅拌转速150-200r/min，温度35-37℃，发酵溶解氧控制在15-20％之间，发酵16-24h，得到二级种子液；将得到的二级种子液混合后即为复合菌液；
种子培养基组成：酵母粉5g、蛋白胨10g、牛肉膏4g、葡萄糖10g、氯化钠0.5g、磷酸二氢钾0.25g、磷酸二氢铵0.25g、硫酸镁0.2g、硫酸亚铁0.005g，纯净水1L；
(3)混合发酵：将中草药提取液与发酵培养基按照6.5：3.5体积比，混合，并将上述复合菌液按照1～2％的接种量(V/V％)接入，通气量1-1.5VVM，搅拌转速150-200r/min，温度35-37℃，发酵溶解氧控制在15-20％之间，混合发酵48-50h，当pH至低于3.5时，结束发酵，得到中草药复合微生态制剂。
实施例6
一种制备中草药复合微生态制剂的方法及该方法制备得到的微生态制剂：
(1)制备中草药提取液：
将中草药提取液的原料30-35％黄芪、10-15％艾叶、15-20％决明子、15-20％当归、10-15％杜仲经粉碎、混合均匀后，加9倍体积水浸泡8～10h，在100～110℃下煎煮2小时后，分离过滤，得到滤渣和滤液，将滤渣加3倍体积水，再在100～110℃下煎煮1小时，再过滤分离，得到第一次重复煎煮的滤液后第一次重复煎煮后的滤渣，向第一次重复煎煮后的滤渣中再加3倍体积水，在100～110℃下煎煮1小时后，分离过滤，得到第二次重复煎煮的滤液，将滤液、第一次重复煎煮的滤液和第二次重复煎煮的滤液混合，得到中草药提取液；
(2)制备复合菌液：
将乳酸杆菌、枯草芽胞杆菌、酵母菌、光合细菌的保藏的菌种分别在无菌条件下接种至种子培养基中，在30℃、200r/min进行复壮培养12～16h，即为活化后菌种；分别将菌种接种到种子培养基中培养，接种量为2～3％(V/V％)，在32℃(例如35℃)、180r/min下培养12～16h，得到一级种子液；将一级种子培养液分别以2-3％的接种量(V/V％)接种至种子培养基中培养，通气量1-1.5VVM，搅拌转速150-200r/min，温度35-37℃，发酵溶解氧控制在15-20％之间，发酵16-24h，得到二级种子液；将得到的二级种子液混合后即为复合菌液；
种子培养基组成：酵母粉5g、蛋白胨10g、牛肉膏4g、葡萄糖10g、氯化钠0.5g、磷酸二氢钾0.25g、磷酸二氢铵0.25g、硫酸镁0.2g、硫酸亚铁0.005g，纯净水1L；
(3)混合发酵：将中草药提取液与发酵培养基按照7：4体积比，混合，并将上述复合菌液按照1～2％的接种量(V/V％)接入，通气量1-1.5VVM，搅拌转速150-200r/min，温度35-37℃，发酵溶解氧控制在15-20％之间，混合发酵48-50h，当pH至低于3.5时，结束发酵，得到中草药复合微生态制剂。
该微生态制剂用于养殖水体的水质调节及养殖水生动物免疫力的增强，采用泼洒到养殖水体中或者与饲料一起混合后投喂，泼洒时按0.5-1.0L/亩*m，投喂时按所投喂饲料质量的0.5-1.0‰。
试验例1
中草药复合微生态制剂的应用
将实施例1-2制备得到的水产养殖用中草药复合微生态制剂用于室内4m×6m养虾池养殖水质改良试验。按0.5L/亩*m的用量比例泼洒分别泼洒实施例1、2的中草药复合微生态制剂至水体，每10天泼洒一次，直至养殖结束。其中泼洒实施例1的复合微生态制剂的养虾池为实验组1，泼洒实施例2的复合微生态制剂的养虾池为实验组2。对照组不泼洒本发明中草药复合微生态制剂。
监控实验组1、2和对照组的养虾池的相应天数的水质，结果如表1所示，监控实验组1、2和对照组的养虾池的虾的发病率、成活率、增重率和饲料系数，结果如表2所示。表1对虾养殖水质的影响
表2对虾成活率及疾病防治的影响
编号 发病率 成活率 增重率 饲料系数
对照组 8.2 63.8 192.5 1.89
实验组1 4.1 80.2 231.6 1.67
实验组2 3.5 78.4 238.7 1.66
从表1结果可以看出，与不使用微生态制剂的养虾池相比，使用本发明实施例1-2的中草药复合微生态制剂的养虾池的氨、氮、及COD含量明显得到控制，说明本发明的中草药复合微生态制剂调节水质效果显著；从表2的结果可以看出，与不使用微生态制剂的养虾池相比，使用本发明实施例1-2的中草药复合微生态制剂的养虾池的虾的发病率降低、成活率增加，增重率增加，饲料系数降低，说明使用本发明中草药复合微生态制剂通过增强对虾的免疫力而在对虾的生长及疾病防治方面发挥了显著效果。本发明的其他实施例指标的中草药复合微生态制剂也具有相似的效果。
试验例2
水产养殖用中草药复合微生态制剂的应用：
2015年6月-8月，在珠海一个鲤鱼养殖场，选取四个养殖池塘进行试验。池塘大小均为8亩，水深2.5m，主养鲤鱼，套养白鲢、团头鲂、草鱼。养殖密度每亩放养鱼1600尾，规格200g/尾，白鲢300尾，规格150g/尾，团头鲂100尾，规格150g/尾，草鱼10尾，规格500g/尾。
实验组1使用实施例3制备的中草药复合微生态制剂进行泼洒试验，泼洒量为1.0L/亩*m，隔10天泼洒一次；实验组2采取实施例3制备的中草药复合微生态制剂进行隔天拌料投喂试验，按饲料投喂质量的0.5‰添加，与饲料混合均匀投入池塘；对照组为对照池塘，不使用复合微生态制剂。
试验30天后，测试实验组1、2和对照组池塘的水质参数，包括水体颜色、NH4+-N含量、NO2-N含量、COD、H2S、透明度、pH值等，结果如表3所示。测试试验90天后，实验组1、2和对照组池塘的鲤鱼死亡率、增重率、饲料系数，结果如表4所示。
表3试验30天后各池塘水质的变化
指标 实验组1 实验组2 对照组
水体总体颜色 嫩绿色 嫩绿色 浓绿色
NH4+-N(mg/L) 0.14 0.17 0.61
NO2-N(mg/L) 0.03 0.04 0.14
COD(mg/L) 8.7 8.4 41.8
透明度(cm) 32 29 16
pH值 8.32 8.36 8.61
浮头次数 0次 1次 4次
表4试验90天后各池塘的鲤鱼生长状态对比结果
指标 实验组1 实验组2 对照组
患病死亡率 1.2 1.0 3.4
增重率 785％ 810％ 724％
饲料系数 1.87 1.81 1.99
从表3可以看出，实验组1、2的水体总体颜色明显好于对照组，NH4+-N、NO2-N和COD含量也显著低于对照组，透明度显著好于对照组，这说明，本发明实施例1-2的微生态制剂对于鲤鱼养殖场的池塘的水质改善具有明显效果；并且实验组1、2的NH4+-N、NO2-N、COD、透明度方面具有相似的效果，这说明，实施例1、2的微生态制剂的调节水质效果一致。本发明其他实施例的微生态制剂也具有相似的效果。
从表4可以看出，实验组1、2的患病死亡率明显低于对照组，实验组1、2的增重率明显高于对照组，饲料系数明显低于对照组，并且在死亡率、增重率、饲料系数方面，实验组1和2的微生态制剂的效果相似，这说明，实施例1、2的微生态制剂在提高水产动物免疫力，从而减少死亡率，提高水生动物增重率方面都具有明显效果，并且它们的效果比较一致。本发明其他实施例的微生态制剂也具有相似的效果。
以上结果说明，使用本发明中草药复合微生态制剂泼洒和投喂均能对水质改善、鲤鱼生长有显著地效果，并且本发明的微生态制剂的质量稳定。
试验例3
水产养殖用中草药复合微生态制剂的应用：
恩平一个罗非鱼养殖场，选择两个网箱进行对比试验，每个网箱投放200尾罗非鱼苗。实验组使用实施例4制备的中草药复合微生态制剂进行拌料投喂试验，按饲料投喂质量的0.5‰添加，与饲料混合均匀投入池塘；对照组不使用复合微生态制剂；每天的饲料投加与实验组相同。试验30天，比较实验组和对照组的罗非鱼的生长情况、饲料系数，如表5所示。
表5饲养30天后罗非鱼生长状态对比
指标 对照组 实验组
死亡率 0.3％ 1.4％
平均增重率 645％ 583％
饲料系数 1.76 1.86
从表5可以看出，实验组的复合微生态制剂作为罗非鱼养殖饲料添加剂使用，能显著降低降低死亡率，降低饲料系数，并加快罗非鱼的生长，降低养殖成本。本发明其他实施例指标的中草药复合微生态制剂也能达到相似的效果。
以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种中草药复合微生态制剂，其特征在于，主要由中草药提取液、发酵培养基、以及复合菌液发酵制备得到，其中，
所述中草药提取液主要由30-35％黄芪、10-15％艾叶、15-20％决明子、15-20％当归、10-15％杜仲提取得到；
所述复合菌液主要分别由乳酸杆菌、枯草芽胞杆菌、酵母菌、光合细菌发酵后混合得到。
2.根据权利要求1所述的一种中草药复合微生态制剂，其特征在于，所述发酵培养基主要由以下组分制成：糖蜜4～5重量份、玉米浆粉4～5重量份、葡萄糖8～10重量份、氯化钠0.4～0.5重量份、磷酸二氢钾0.2～0.25重量份、磷酸二氢铵0.2～0.25重量份、硫酸镁0.15～0.2重量份、硫酸亚铁0.004～0.005重量份、吐温-80 0.5～1重量份，水950～1000体积份。
3.根据权利要求1或2所述的一种中草药复合微生态制剂，其特征在于，所述复合菌液中乳酸杆菌、枯草芽胞杆菌、酵母菌、光合细菌的体积比为2～4：1～3：2～5：1～3。
4.一种制备根据权利要求1-3中任一项所述的中草药复合微生态制剂的方法，其特征在于，包括：
(1)制备中草药提取液：将所述中草药提取液原料粉碎混合，加水浸泡8～12小时，然后在100-110℃下煎煮1～2小时后分离过滤，滤液即为中草药提取液；
(2)制备复合菌液：将组成复合菌液的菌种分别进行一级种子液培养及二级种子液培养后，将各菌种发酵得到的二级种子液混合后即为复合菌液；
(3)混合发酵：将中草药提取液、发酵培养基和复合菌液混合，其中，中草药提取液、发酵培养基的体积比为6～7：3～4，复合菌液的接种量为总体积的1～2％，通气量1-1.5VVM，搅拌转速150-200r/min，温度35-37℃，发酵溶解氧15-20％，混合发酵48-50h，当pH至低于3.5时，结束发酵，得到中草药复合微生态制剂。
5.根据权利要求4所述一种制备中草药复合微生态制剂的方法，其特征在于，
所述步骤(1)中分离过滤得到滤液后，还可将滤渣重复进行煎煮提取1-3次后，将每次煎煮的滤液合并得到中草药提取液；
进一步优选的，所述步骤(1)中加水量为中草药的3～11倍体积，加水浸泡8-10小时。
6.根据权利要求4或5所述一种制备中草药复合微生态制剂的方法，其特征在于，所述步骤(2)中一级种子液的培养包括：分别将菌种接种到种子培养基中培养，接种量为2～3％(V/V％)，在28～35℃、150～200r/min下培养12～16h，得到一级种子液；
进一步优选的；
所述步骤(2)中二级种子液的培养包括：将一级种子培养液分别以2-3％(V/V％)的接种量接种至种子培养基中培养，通气量1-1.5VVM，搅拌转速150-200r/min，温度35-37℃，发酵溶解氧15-20％之间，发酵16～24h，得到二级种子液。
7.根据权利要求4至6中任一项所述一种制备中草药复合微生态制剂的方法，其特征在于，所述菌种进行一级种子液培养前，进行菌种的活化复壮。
8.根据权利要求6或7所述一种制备中草药复合微生态制剂的方法，其特征在于，所述种子培养基主要由以下组分制成：酵母粉4～5重量份、蛋白胨8～10重量份、牛肉膏3～5重量份、葡萄糖7～10重量份、氯化钠0.3～0.5重量份、磷酸二氢钾0.1～0.25重量份、磷酸二氢铵0.2～0.25重量份、硫酸镁0.15～0.2重量份、硫酸亚铁0.004～0.005重量份，水950～1000体积份。
9.一种根据权利要求5-8中任一权利要求所述的制备方法制备得到的中草药复合微生态制剂。
10.一种权利要求1-3、或权利要求9所述的中草药复合微生态制剂在制备增强水生动物免疫力和/或调节水质的制剂中的用途。
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