KR860000913B1 - 감미료의 제조방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

감미료의 제조방법

본 발명은 수크로오스에 프룩토실트란스페라제를 작용시켜 얻어진 올리고당으로, 이것을 조성으로 보면 수크로오스에 1분자 내지 4분자의 프룩토오스가 결합한 올리고당을 함유하는 카리에스유발성(Cariogenicity)이 어려운 우식성(齒食性)감미료의 제조방법에 관한 것이다. 종래에는 수크로오스가 우수한 감미와 보디감(body taste), 결정성등의 우수한 특질 때문에 널리 과자와 식품에 응용되었다. 그러나, 수크로오스는 구중미생물(口中微生物)에 의하여 생성된 덱스트란수크라제(dextran sucrase)의 기질로 되어, 그 결과 수크로오스를 연속 채취하면 구중(口中)에서 불용성 덱스트란이 다량으로 생성되어 치대(齒대)(tooth dirt)형성이 촉진되므로 충치유발의 원인이 되었다.

본 발명자들은 수크로오스가 가진 우수한 성질을 발휘하면서 충치유발의 원인이 발생되기가 어려운 수크로오스 연관당질에 대하여 검토한 결과 수크로오스에프룩토실 트란스페라제를 작용시켜 얻어진 올리고당류, 즉 수크로오스에프룩토오스 1분자가 결합한 물질(이하 GF₂라함), 수크로오스에 프룩토오스 2분자가 결합한 물질(이하 GF₃라함), 수크로오스에 프룩토오스 3분자가 결합한 물질(이하 GF₄라함), 수크로오스에 프룩토오스 4분자가 결합한 물질(이하 GF₅라함) 등 올리고당이, 스트렙토콕커스 무탄스(Streptococcus mutans)등 구중미생물에 의해 생산되는 덱스트란 수크라제의 작용을 받지 아니할뿐만 아니라 덱스트란 수크라제에 의한 수크로오스에서의 불용성 덱스트란의 생성을 억제하는 효과가 있음을 발견하였다.

여기서 사용된 GF₂, GF₃, GF₄, GF₅등 올리고당은 수크로오스에 프룩토실 트란스페라제를 작용시켜 얻어진 전이당조성물에서 예로서 카본크로마토그래피(Carbon chromatography), 이온교환크로마토그래피등의 처리수단에 의해 분리정제할 수 있으나 실용적인면에서 볼때 이들의 올리고당의 조성물을 사용하는 것이 바람직하며, 이와같은 전이당조성물은 그 성분중에 미반응된 수크로오스 전이반응에 의해 생성된 GF₂, GF₃등 올리고당 및 전이반응에 의해 부생한 글루코오스등을 포함하고 있다. 그러나, 이와같은 전이당조성물도 역시 구중미생물에 의해 생성된 덱스트란수크라제의 작용을 받기가 어려우며, 그결과 불용성 덱스트란의 생성량도 적다.

이것은 조성물중에 수크로오스가 존재하여도 GF₂, GF₃등 올리고당이 수크로오스에서 불용성 덱스트란의 생성을 억제하며, 또 GF₂, GF₃등 올리고당에서는 불용성 덱스트란이 생성하지 않는데 기인된다.

이와같이, 성분중에 수크로오스에 프룩토오스 1분자 내지 4분자가 결합한 올리고당을 함유한 조성물은 그 자체충치 발생의 주요인이 되는 불용성 덱스트란의 생성량이 적어지며, 또 GF₂, GF₃등 올리고당 그 자체가 수크로오스에서 덱스트란 생성을 억지하는등 그 특성을 갖고 있다.

더 나아가서, 본 발명의 조성물은 카리에스유발성이 어려운 우식성이며, 동시에 우수한 감미, 적당한 보디감(body taste), 보습성등의 감미료로서 우수한 특성을 갖고 있다. 위에서와 같이, 성분중에 수크로오스에 프룩토오스 1분자 내지 4분자가 결합한 올리고당을 함유한 조성물(이하, 카리에스 유발성이 어려운 우식성 감미료라함)은 충치유발의 원인이 발생하기가 어려운 감미조성물인바, 본 발명자들은 이 카리에스유발성이 어려운 우식성 감미료의 공업적 제조법에 대하여서도 검토한결과 본 발명을 완성하였다. 즉, 수크로오스에 프룩토실트란스페라제를 작용시킴으로써 그 감미료를 얻을 수 있다.

본 발명에 사용되는 프룩토실트란스페라제는 주로 수크로오스에 작용하여 프룩토오스와 글루코오스의 β-1,2 결합을 절단한 다음 그 프룩토오스를 수크로오스로 전이하여 GF₂를 생성하며, 또 GF₂에프룩토오스를 전이하여 GF₃를 생성하는 작용을 가진다.

반응생성물이 이와같이 GF₂, GF₃등과 같이 수크로오스에 프룩토오스가 결합한 올리고당인점에서, 엔짐노멘클래취(Enzyme Nomenclature)(Academic Press, 1978년)에 기재된 이누로 수크라제(Inulosucrase)[2.4.1.9]와 레반수크라제(Levansucrase)[2.4.1.10]는 상이하다.

이 효소는 아스페르길러스(Aspergillus) 속(Aspergillusniger[The genus Aspergillus, Williams & Wilkins Co., 1965, 293면] 등), 페니실륨(Penicillium)속(Penicillium nigricans 등), 푸자륨(Fusarium) 속(Fusarium lini IAM 5008 등), 글레오스포륨(Gloeosporium) 속(Gloeosporium kaki IAM 5011 등) 등의 균류(fungi), 삭카로미세스(Saccharomyces) 속(Saccharomyces cererisiae 등), 로도토룰라(Rhodotorulla) 속(Rhodotorulla glutinis 등), 피히아(pichia) 속(pichia miso 등), 한제눌라(Hansenula) 속(Hansenula miso 등), 칸디다(Candida) 속(Candida tropicalis 등) 효모의 미생물 기원효소와 아스파라가스오피날리스(Asparagus offioinalis), 헬리안터스 튜버로서스엘(Helianthus tuberosus L.)등 식물기원효소가 사용된다.

미생물기원의 프룩토실 트란스페라제는 적당한 배지, 예로서 수크로오스 5.0%, 펩톤(peptone) 1.0%, 고기엑스(meat extract) 0.7%, Nacl 0.3%를 함유한 배지에 감각의 미생물의 최적온도, 즉 25-30℃에서 24-96시간 배양하여 완료한후 균체를 여과 또는 원심분리등의 처리수단으로 제거한 배양여액, 또 그 배양여액에서 한외(限外)여과법, 소듐설페이트염석법, 용제침전법, 겔여과법, 이온교환 크로마토그라피법등 효소정제에 관한 통상의 방법에 의해 정제한 효소를 사용할 수 있다.

또, 식물기원의 효소는 식물조직을 파쇄등 물리적수단에 의해 파괴한 다음, 효소를 추출하여 그 추출액 또는 추출액에서 통상의 방법으로 정제한 효소를 사용할 수 있다. 이와같이 하여 얻어진 효소를 수크로오스에 작용시켜 목적으로 하는 카리에스 유발성이 어려운 우식성감미료를 얻을 수 있는바, 공업적 전이반응조건에 대하여 여러가지로 검토한 결과 다음의 조건에서 실시하는 것이 바람직하였다.

즉, 전이반응시 수크로오스농도를 5-70%, 바람직하게는 30-60%로 하며, 또 반응 PH, 반응온도는 효소의 기원에 의해 다르나 pH 4.0-7.0, 온도 25-65℃, 바람직하게는 50-60℃로 한다.

효소사용량에 대해서는 수크로오스 1g당 5-200 단위, 바람직하게는 20-80 단위로 하며, 여기서 효소의 단위는 5% 크로오스용액 1.0㎖, PH 5.0의 완충액 1.0㎖에 효소액 0.5㎖를 첨가하여 40℃에서 60분간 반응시킬때 반응액 2.5m 중에서 60분간에 1㎛ole의 글루코오스를 생성하는 효소량을 1단위로 표시한다.

전이반응이 완료된 후, 가열하여 효소를 탈활(脫活)시켜 활성탄에 의해 탈색하고, 또 이온교환수지로 탈염한 다음 농축하여 목적물을 얻는다.

전이조성물의 분석은 예로서 마이크로본다펙 CH 컬럼(micro bonda pack CH Column)(Waters Limited제)을 사용하여 아세토니트릴 : 물(80 : 20(V/V))의 용제계를 사용한 고속액체크로마토그라피법으로 실시하였다. 이와같이하여 얻어진 카리에스유발성이 어려운 우식성 감미료의 조성은 예로서 글루코오스 30%, 수크로오스 11%, GF₂28%, GF₃25%, GF₄5%, GF₅1%인바, 각각의 구성당의 조성은 반응조건에 의해 여러가지의 값을 취할 수 있다.

올리고당의 GF₂로는 O-β-D-프룩토푸라노실-(2→1)-O-β-D-프룩토푸라노실(2→1)-α-D-글루코피라노시드, O-β-D-프룩토푸라노실-(2→6)-O-β-D-글루코피라노실-(1→2)-β-D-프룩토푸라노실, O-β-D-프룩토푸라노실(2→6)-O-β-프룩토푸라노실-(2→1)-α-D-글루코피라노시드등을 들 수 있으며, GF₃로서는 O-β-D-프룩토푸라노실-(2[1-O-β-D-프룩토푸라노실]₂→1)-α-D-글루코피라노시드, O-β-D-프룩토푸라노실-(2→6)-O-[β-D-프룩토푸라노실-(2→2)]-O-α-D-글루코피라노실-(1→2)-β-D-프룩토푸라노시드 등이 있고, GF₄로서는 O-β-D-프룩토푸라노실(2→[1-O-β-D-프룩토푸라노실-2]₃→1)-α-D-글루코피라노시드 등이 있다.

다음으로, 본 발명의 감미료 그 성분인 GF₂, GF₃, GF₄, GF₅의 효과에 대하여서는 실험예를 예시하여 상술한다. 스트랩토콕커스 무탄스(Streptococcus mutans) ATCC 25175주를 배양하여 얻은 덱스트란수크라제를 사용하여 GF₂, GF₃, GF₄, GF₅에서의 불용성덱스트란의 생성량을 수크로오스와 비교한 것을 다음의 실험예 1의 표 1에 표시하였다.

이 표에서 명백한 바와같이 GF₂, GF₃, GF₄, GF₅에서 불용성덱스트란은 전혀 생성되지 않았다. 동일하게 GF₂, GF₃가 덱스트란수크라제에 의한 수크로오스에서의 불용성덱스트란의 생성을 억제시키느냐의 여부를 검토한 결과를 다음 실험예 2의 표 2에 표시하였다. 이 표에서 명백한 바와같이, GF₂, GF₃는 어느 것이나 수크로오스에서의 불용성덱스트란의 생성을 억제하고 있음을 확인하였다.

또, 여러가지의 전이조건에서 조성이 다른 감미료를 조제하여 그 조성물에서의 불용성덱스트란의 생성량을 수크로오스와 비교한 것을 다음 실험예 3의 표 4에 표시하였다. 이 표에서 명백한 바와같이, 수크로오스와 비교하여 어느 조성물에 있어서도 불용성덱스트란의 생성량이 낮다.

특히, 그 감미료 조성물의 총고형분 중량에 있어서 수크로오스의 함유률(중량 %)에 대하여 GF₂, GF₃, GF₄등 올리고당의 합계중량(중량 %)이 2배 이상, 즉 총고형분중 수크로오스함유률(중량 %)에 대한 올리고당류의합계함유률(중량 %)의 비가 2.0 이상인 경우에는 불용성덱스트란의 생성량은 수크로오스의 50% 이하로 되어 실용적으로 바람직하다.

[실험예 1]

스트렙토콕커스무탄스 ATCC 25175주를 글루코오스, 트립토케이스(Tripto Case)를 함유한 배지에서 염기적 조건하에 배양하여 균체를 제거한후, 한외여과법에 의해, 농축, 정제하여 덱스트란수크라제를 조제하였다.

다음으로 1% 당액 1.0㎖, 067M 인산완충액(PH7.0) 1.5㎖, 위 효소액 0.25㎖를 혼합하여 37℃에서 4시간 반응시간 다음, 생성한 불용성 덱스트란을 3000rpm으로 15분간 원심분리에 의하여 침전시켜 침전부분을 모아, 이것을 70% 에타놀 5㎖로 2회 세척한 다음 2.5㎖의 IMKOH 용액에 용해하여 페놀-황산법에 의해 덱스트란 생성량을 정량하였다.

이에 또, 당액으로 수크로오스 GF₂, GF₃, GF₄, GF₅의 각각 1% 용액을 사용하였다.

GF₂, GF₃, GF₄, GF₅는 수크로오스에 프룩토실트란트란스페라제를 작용시켜 얻은 전이당조성물을 원료로 하여 이것을 카본크로마토그라피법에 의해 분리정제하여 박층크로마토그라피에 의해 단일스포트를 나타낸 프락숀(fraction)을 사용하였다.

그 결과를 표 1에 표시하였다.

[표 1]

표 1에서와 같이, GF₂, GF₃, GF₄, GF₅에서의 덱스트란의 생성은 확인되지 않았다.

[실험예 2]

실험예 1에서 조제한 덱스트란수크라제를 사용하여 수크로오스의 존재하에서 GF₂, GF₃를 첨가할때 수크로오스에서의 불용성 덱스트란의 생성을 GF₂, GF₃가 억제하느냐의 여부를 조사하였다.

이에 또, 반응조건은 당액 1.0㎖(각각의 표 2에 표시된 당질을 포함), 0.67M 인산완충액(PH 7.0) 1.5㎖, 효소액 0.25㎖를 각각 혼합하여 37℃에서 4시간 반응한후, 실험예 1과 동일한 방법으로 반응액중에 생성하는 불용성 덱스트란을 정량하였다.

[표 2]

여기서 표 2중 괄호내의 숫자는 수크로오스에서의 불용성덱스트란의 생성량을 100으로 할 경우의 지수를 나타낸다.

[실험예 3]

수크로오스에 프룩토실트란스페라제를 여러가지의 조건으로 작용시켜 다음의 조성을 가진 감미료를 제조하였다.

[표 3]

실험예 1과 동일한 방법으로 위 전이당조성물에서 생성된 불용성덱스트란생성량을 측정하여 표 4와 같은 결과를 얻었다.

[표 4]

괄호내의 숫자는 수크로오스에서 생성된 불용성 덱스트란 생성량을 100으로한 경우의 지수를 나타낸다.

[실시예 1]

수크로오스 5.0%, 펩톤 1.0%, 고기엑스(meat extract) 0.7%, Nacl 0.3%를 함유한 BS 배지 10㎖를 각각 시험과 2개에 나누어 넣고 120℃에서 30분간 살균한 다음 여기에 아스페르길러스니가(Aspergillumniger)[The genus Aspergillus, Williams & Wilking 1965, 293면]의 백금와이어루우프(platinum wireloop)를 식균(植菌)하고 28℃에서 24시간 배양하였다.

BS 배지 200㎖를 함유한 3각플라스크(120℃에서 30분간 살균함) 2개에 각각 얻어진 배양액 10㎖씩 식균하며 28℃에서 24시간 진탕배양을 하고 전배양(前培養)을 하였다.

BS 배지 20ℓ를 30ℓ를 자퍼멘터(Jar Fermentor)에 넣고 120℃에서 30분간 살균한 다음, 냉각하여 위의 전배양액 400㎖를 식균하여 300rpm, 28℃에서 72시간 배양하였다. 배양을 완료한 다음, 균체를 여과에 의해 제거하여 배양여액 20ℓ를 얻었다. 이 배양여액 20ℓ를 한외여과법에 의해 농축, 정제하여 효소액 2ℓ를 얻었다.

이 효소활성은 240 단위/㎖이었다. 수크로오스 10kg에 물 6.7ℓ를 가하여 용해하고, PH를 5.0으로 조정한 다음, 효소를 수크로오스 1g당 48 단위의 량을 첨가하여 50℃에서 48시간 전이반응을 실시하였다.

전이반응을 종료한 다음, 100℃에서 15분간 가열하여 효소를 탈활시킨 후 고형분에 대하여 0.5%의 활성탄을 가하여 탈색하였다. 활성탄을 제거한 다음, 앰버라이트 IR. 120B와 앰버라이트 IRA. 411의 이온교환수지로 처리하고 그 다음 75%w/w 농도로 농축하여 카리에스유발성이 어려운 우식성 감미료(less Cariogenic Sweeting) 12kg을 얻었다. 얻어진 감미료의 당조성은 글루코오스 26%, 프룩토오스 2%, 수크로오스 18%, GF₂40%, GF₃14%이었다.

[실시예 2]

실시예 1에서와 같은 방법으로 푸자륨리니(Fusarium lini IAM 5008)를 배양하여 20ℓ의 배양액을 얻어 이것을 한외여과법에 의해 농축정제하여 효소액 2ℓ를 얻었다. 효소활성은 200단위/㎖이었다.

수크로오스 3kg에 물 7ℓ를 가하여 용해하고 PH를 6.0으로 조절한 다음, 효소를 수크로오스 1g당 16단위를 첨가하여 50℃에서 24시간 전이반응을 실시하였다. 반응을 종료시킨 다음, 100℃에서 15분간 가열하여 효소를 탈활(脫活)한 다음 고형분에 대하여 0.5%의 활성탄을 가하여 탈색하고 이온교환수지에 의하여 탈염하여 75%w/w까지 농축하여 카리에스유발성이 어려운 우식감미료 3.7kg을 얻었다.

이 감미료의 당조성은 글루코오스 38.2%, 프룩토오스 7.8%, 수크로오스 17.2%, GF₂25.4%, GF₃11.4%이었다.

[실시예 3]

실시예 1에서와 같은 방법으로 글레오스포륨카키(Gloeosporium kaki IAM 5011)를 배양하여 20ℓ의 여액을 얻었다. 이것을 한외여과법에 의하여 농축, 정제하여 효소액 1.5ℓ를 얻었다. 효소활성은 200단위/㎖이었다. 수크로오스 3kg에 물 7ℓ를 가하여 용해하고 pH를 6.0으로 조절한 다음 효소를 수크로오스 1g당 20단위를 첨가하여 50℃에서 24시간 전이반응을 실시하였다. 반응을 완성한 다음 100℃에서 15분간 가열하여 효소를 탈활시킨후 실시예 1에서와 같은 방법으로 탈색, 탈열하여 75%w/w 농도까지 농축하여 카리에스 유발성이 어려운 감미료 3.8kg을 얻었다. 얻어진 감미료의 당조성은 글루코오스 25%, 프룩토오스 9%, 수크로오스 36%, GF₂24%, GF₃6%이었다.

Claims (1)

1. 아스페르길러스(Aspergillus)속, 푸자륨(Fusarium)속 또는 글레오스포륨(Gloeosporium)속에 의해 생산되는 프룩토신트란스페라제(fructosyl transferase)를 선택적으로 사용하여, 수크로오스에 상기 프룩토신트란스페라제를 작용시킴을 특징으로 하는 감미료의 제조방법.