DE69731016T2

DE69731016T2 - Herstellung einer Trehalulose enthaltende Polysaccharidzusammensetzung.

Info

Publication number: DE69731016T2
Application number: DE69731016T
Authority: DE
Inventors: Tomoyuki Nishimoto; Hiroto Okayama-shi Chaen; Shigeharu Fukuda; Toshio Miyake
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1996-03-04
Filing date: 1997-03-03
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2017-03-04
Also published as: EP0794259B1; KR970065725A; EP0794259A3; TW482656B; US6294360B1; EP0794259A2; US5824521A; DE69731016D1; KR100464831B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer Trehalulose enthaltenden Saccharid-Verbindung sowie ihre Verwendung, insbesondere bezieht sie sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer Saccharid-Verbindung, welches einen Schritt umfasst, ein Maltose/Trehalose umwandelndes Enzym auf eine Saccharose-Lösung einwirken zu lassen, um Trehalulose herzustellen.
Trehalulose, ein aus Glucose und Fructose bestehendes Disaccharid, ist ein reduzierendes Saccharid, das durch die chemische Formel l-O-α-D-Glucopyranosyl-D-fructose wiedergegeben wird. In der Natur enthält Honig nur einen geringen Anteil an Trehalulose. Da Trehalulose ein nichtkristallines Saccharid ist, welches sich leicht in Wasser löst, im Wesentlichen keine Karies verursachende Wirkung besitzt und etwa 40% der Süßkraft von Saccharose besitzt, setzt man große Erwartungen darauf, dass sie in Lebensmittelprodukten, insbesondere in Lebensmittel, die mit Süßstoffen angereichert sind, wie z. B. Marmeladen, „an" (Bohnenmarmeladen) und süßen Gelees aus Bohnen eingesetzt werden kann. Wie in „Seito-Gijutsu-Kenkyu-Kaishi" Vol. 34, Seiten 37–44 (1985) beschrieben wird, ist es bekannt, dass Trehalulose aus Saccharose über ein Verfahren, das eine α-Glucosidase aus Protaminobacter rubrum mit einer Aktivität zur Umwandlung von Sacchariden benutzt, hergestellt wird. Bei solch einer Enzymreaktion wird Trehalulose als Nebenprodukt von kristalliner Palatinose oder 6-O-α-D-Glucopyranosyl-D-fructose als Hauptprodukt hergestellt. Obwohl ein Verfahren zur Herstellung von Trehalulose enthaltenden Saccharid-Verbindungen, das Trehalulose aus Saccharose gewinnt, unter Einsatz von fixierten Zellen des Pseudomonas mesoacidophila MX-45 vorgeschlagen wurde, wie es in der japanischen Offenlegungsschrift No. 169,190/92 beschrieben wird, oder des Agrobacterium radiobacter MX-232, wie es in der japanischen Offenlegungsschrift No. 130,886/93 beschrieben wird, wurde es bis jetzt wegen ihrer unzureichenden Enzymaktivität und thermischen Stabilität noch nicht im industriellen Maßstab eingesetzt.
Eine aus Pseudomonas mesoacidophila MX-45 erhaltene α-Glucosyltransferase liefert Saccharose, Trehalulose und Isomaltulose, wenn sie auf Saccharose einwirkt (siehe Biosci. Biotech. Biochem., 58(10), 1789–1793, 1994).
Die EP-0 636 693 beschreibt ein Maltose/Trehalose umwandelndes Enzym, das aus Mikroorganismen der Stämme Pimelobacter, Pseudomonas und Thermus isoliert wurde.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Trehalulose enthaltenden Saccharid-Verbindung zur Verfügung, welches die Schritte umfasst, ein Maltose/Trehalose umwandelndes Enzym auf eine Saccharose-Lösung einwirken zu lassen, um die besagte Trehalulose herzustellen, sowie die resultierende, Trehalulose enthaltende Mischung aufzufangen.
Unter einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Lebensmittelproduktes, eines kosmetisch verwendbaren Produktes oder eines pharmazeutisch verwendbaren Produktes, welches die Schritte umfasst, die nach dem oben beschriebenen Verfahren erhaltene Saccharid-Verbindung in Ausgangsmaterial für Lebensmittelprodukte, kosmetisch verwendbares Ausgangsmaterial oder pharmazeutisch verwendbares Ausgangsmaterial einzubauen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Trehalulose zur Verfügung, das Trehalulose aus Saccharose mit einer zufriedenstellend hohen Ausbeute produziert und leicht in einem industriellen Maßstab umsetzbar ist, und stellt eine Saccharid-Verbindung, welche die durch das Verfahren erhaltene Trehalulose enthält, sowie ihre Verwendung zur Verfügung.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben sich intensiv mit Verfahren zur Herstellung von Trehalulose auseinandergesetzt. Als Ergebnis fanden sie überraschenderweise, dass das Maltose/Trehalose umwandelnde Enzym, das in der japanischen Offenlegungsschrift No. 170,977/95, die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung angemeldet wurde, beschrieben, wird, Maltose in Trehalose umwandelt und leicht Trehalulose aus Saccharose mit einer zufriedenstellend hohen Ausbeute produziert, legten ein Verfahren zur Herstellung einer Trehalulose enthaltenden Saccharid-Verbindung fest, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es einen Schritt umfasst, ein Maltose/Trehalose umwandelndes Enzym auf eine Saccharose-Lösung einwirken zu lassen, und legten eine Saccharid-Verbindung fest, die eine nach diesem Verfahren erhaltene Trehalulose enthält, sowie Verbindungen in Form von Lebensmitteln, Kosmetika oder Arzneimitteln, welche die Saccharid-Verbindung enthalten. Auf diese Weise stellten die Erfinder die vorliegende Erfindung fertig.
Die Maltose/Trehalose umwandelnden Enzyme, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind intramolekulare Saccharid-Transfer-Enzyme, die durch Mikroorganismen der Spezies Pimelobacter sp. R48 (FERM BP-4315) und Pseudomonas putida H262 (FERM BP-4579) hergestellt werden, wie es in der japanischen Offenlegungsschritt No. 170,977/95 beschrieben wird, sowie solche vom Stamm Thermus, und sie wandeln Maltose in Trehalose um und umgekehrt. Diese Enzyme haben zum Beispiel die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften:

(1) Wirkung Umwandlung von Maltose in Trehalose und umgekehrt;
(2) Molekulargewicht Etwa 57,000–120,000 Dalton, bestimmt über Natrium-dodecyl-sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE);
(3) Isoelektrischer Punkt (pI) Etwa 3.8–5.1, bestimmt über Isoelektrophorese unter Einsatz eines Ampholyten;
(4) Hemmung der Aktivität werden gehemmt durch 1 mM Cu²⁺, Hg²⁺ und Tris-HCl-Puffer
(5) Herkunft stammen aus Mikroorganismen.

Der Gleichgewichtspunkt des Reaktionssystems der Maltose/Trehalose umwandelnden Enzyme liegt auf der Seite der Trehalose-Bildung und die Ausbeute an Trehalose erhöht sich auf etwa 80 Gew.-% (die Bezeichnung „Gew.-%" wird als „%" abgekürzt, sofern es nicht anderweitig spezifiziert ist), wenn Maltose als Substrat eingesetzt wird.
Zusätzlich zu den oben genannten Mikroorganismen können andere Stränge und Mutanten, die solche Maltose/Trehalose umwandelnde Enzyme produzieren und zu den Mikroorganismen der Stämme Pimelobacter, Pseudomonas und Thermus gehören, wahlweise eingesetzt werden. Mikroorganismen des Stammes Thermus, wie z. B. Thermus aquaticus ATCC 25104, Thermus aquaticus ATCC 27634, Thermus aquaticus ATCC 33923, Thermus filiformis ATCC 43280, Thermus ruber ATCC 35948, Thermus sp. ATCC 43814 und Thermus sp. ATCC 43815 können wahlweise eingesetzt werden.
Jede synthetische und natürliche Nährlösung zum Züchten der oben genannten Mikroorganismen kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, solange die Mikroorganismen darin wachsen können und die Maltose/Trehalose umwandelnden Enzyme produzieren. Die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Quellen für Kohlenstoff umfassen solche, die von den Mikroorganismen verwertet werden: Zum Beispiel können Saccharide, wie z. B. Glucose, Fructose, Melasse, Trehalose, Lactose, Saccharose, Mannitol, Sorbitol und partielle Stärkehydrolysate, sowie organische Säuren, wie z. B. Zitronensäure und Succinsäure, ebenso wie ihre Salze eingesetzt werden. Die Konzentration der Kohlenstoffquellen in der Nährlösung wird auf geeignete Weise in Abhängigkeit von der Art der Kohlenstoffquelle ausgewählt. Im Falle des Einsatzes von Glucose als Quelle für Kohlenstoff, liegt eine bevorzugte Konzentration bei 40 Gew.-% oder weniger, insbesondere ist eine Konzentration von 10 Gew.-% oder weniger geeignet im Hinblick auf das Wachstum der Mikroorganismen. Anorganische Stickstoffverbindungen, wie z. B. Ammoniumsalze und Nitrate, sowie organische, Stickstoff enthaltende Substanzen, wie z. B. Harnstoff, flüssiges eingeweichtes Getreide, Kasein, Pepton, Hefeextrakt und Fleischextrakt, können im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Stickstoffquellen eingesetzt werden. Salze von Calcium, Magnesium, Kalium, Natrium, Phosphor, Mangan, Zink, Eisen, Kupfer, Molybdän und Kobalt können wahlweise als anorganische Zusatzstoffe eingesetzt werden.
Die Züchtungsbedingungen für die Mikroorganismen sind solche, unter welchen die Mikroorganismen wachsen und die Maltose/Trehalose umwandelnden Enzyme produzieren. Üblicherweise werden die Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von etwa 4–80°C, vorzugsweise 20–75°C, und pH-Werten von 5–9, vorzugsweise 6–8.5, gezüchtet. Die bevorzugte Züchtungsdauer ist auf solche Zeiten eingestellt, in denen die Mikroorganismen wachsen können, vorzugsweise etwa 10–100 Stunden. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff (DO) ist nicht besonders begrenzt, aber üblicherweise wird sie auf etwa 0.5–20 ppm eingestellt. Der DO wird durch Regulieren der Verhältnisse von Belüftung und Rühren, Sauerstoffzugabe und Erhöhung des inneren Druckes des Gärbehälters in dem Bereich gehalten. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können Züchtungsverfahren im Batch-Betrieb oder als kontinuierliches Verfahren eingesetzt werden.
Nach Abschluss der Züchtung der Mikroorganismen werden die gewünschten Enzyme aus der Kultur aufgefangen. Da die Aktivität des Maltose/Trehalose umwandelnden Enzyms intra- und extrazellular zu finden ist, können zellfreie Kulturen und Zellen als Rohenzym aufgefangen werden. Ebenfalls können intakte Kulturen als ein Rohenzym eingesetzt werden. Beispiele für Methoden zur Trennung von Kulturen in Zellen und zellfreie Kulturen umfassen konventionelle Fest-Flüssigphasen-Trennverfahren: Zum Beispiel Zentrifugierverfahren, um intakte Kulturen aufzutrennen, Filtrationsverfahren, die einen Schritt umfassen, die Filtrationsmittel zu den Kulturen zu geben oder intakte Kulturen mit Anschwemmfiltern zu behandeln, sowie Verfahren der Membranfiltration unter Einsatz von Flachfiltern und Hohlfasern. Zellfreie Kulturen können als ein Rohenzym eingesetzt werden, vorzugsweise werden sie auf die übliche Weise vor ihrem Einsatz konzentriert: Zum Beispiel können Aussalzen unter Einsatz von Ammoniumsulfat, ein Sedimentationsverfahren unter Einsatz von Aceton und Alkoholen sowie Konzentrationsverfahren unter Einsatz von Membranfiltern, wie z. B. Flachfilter und Hohlfasern, zu diesem Zweck eingesetzt werden.
Intrazellurare Enzyme können, nachdem sie auf konventionelle Weise von den Zellen extrahiert wurden, als ein Rohenzym eingesetzt werden. Klare Rohenzyme können beispielsweise durch Extrahieren der Enzyme von den Zellen über Zerkleinerungsverfahren unter Einsatz von Ultraschall oder einer französischen Presse oder mechanischen Trennverfahren unter Einsatz von Glasperlen und Aluminiumoxid sowie durch Behandlung der Extrakte durch Zentrifugation oder Membranfiltration.
Zellfreie Kulturen, ihre Konzentrate und Extrakte aus den Zellen können auf konventionelle Art fixiert werden: Zum Beispiel können Verfahren der Bindung an Ionenaustauschern, kovalente Bindung und Absorptionsverfahren an Harzen und Membranen sowie Einschlussverfahren unter Einsatz von Substanzen mit hohem Molekulargewicht eingesetzt werden. Auch wenn die von den Kulturen getrennten Zellen als Rohenzym eingesetzt werden können, können die Zellen zum Beispiel durch Mischen der Zellen mit Natriumalginat, Tropfen der Mischung zur Gelierung und Bildung von Zellgranulaten in eine Calciumchlorid-Lösung und Behandlung der Zellgranulate mit Polyäthylenimin und Glutaraldehyd, fixiert werden, um ein fixiertes Enzym zu erhalten.
Die Rohenzyme können ohne irgendeine zusätzliche Behandlung auf konventionelle Art gereinigt werden. Zum Beispiel kann ein elektrophoretisch homogenes Enzym erhalten werden durch Aussalzen eines Extrakts aus zerkleinerten Zellen mit Ammoniumsulfat, Konzentrieren der erhaltenen Lösung, Dialysieren der Konzentrate sowie durch sukzessives Unterziehen des Konzentrats einer Anionenaustauscher-Säulenchromatographie unter Einsatz von „DEAE-TOYOPEARL^®", einer hydrophoben Säulenchromatographie unter Einsatz von „BUTYL-TOYOPEARL^®" einer Anionenaustauscher-Säulenchromatographie unter Einsatz von „MONO Q HR5/5"-Harz und einer Gel-Filtration-Säulenchromatographie unter Einsatz von „TOYOPEARL HW-55" erhalten werden.
Die Aktivität der in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Maltose/Trehalose umwandelnden Enzyme wird wie folgt geprüft: Man gebe 1 ml der Enzym-Lösung zu 1 ml 10 mM Phosphat-Puffer (pH 7.0), der 20 Gew.-% Maltose als Substrat enthält, lässt die Mischung bei 25°, 35° oder 60°C für 60 Minuten reagieren und erwärme die Mischung bei 100°C für 10 Minuten, um die Enzymreaktion zu unterbrechen. Man verdünne die Reaktionsmischung mit genau 50 mM Phosphat-Puffer (pH 7.5) um das 11-fache, gebe 0.1 ml einer Lösung, die eine Einheit Trehalose pro ml enthält, zu 0.4 ml der verdünnten Lösung, züchte die erhaltene Mischung bei 45°C für 120 min und bestimme quantitativ den Glucose-Gehalt in der Mischung unter Einsatz des Glucose-Oxidase-Verfahrens. Zur Kontrolle setze man Trehalase und eine Enzym-Lösung ein, die vorher durch Erhitzen für 10 min bei 100° C deaktiviert wurde, und man bestimmt den Glucose-Gehalt ähnlich wie oben beschrieben. Man bestimmt mit der oben beschriebenen Analyse auf Basis des erhöhten Glucose-Gehalts den Gehalt an Trehalose, die durch das Maltose/Trehalose umwandelnde Enzym produziert wurde. Eine Aktivitätseinheit des Maltose/Trehalose ummwandelnden Enzyms ist definiert als die Menge, die ein μmol Trehalose pro Minute bildet.
Die Reaktionstemperaturen für die Maltose/Trehalose umwandelnden Enzyme aus Mikroorganismen der Stämme Pimelobacter, Pseudomonas und Thermus lagen bei 25°, 35° beziehungsweise 60°C.
Die Substrat-Konzentration für die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Maltose/Trehalose umwandelnden Enzyme ist nicht besonders eingeschränkt. Die Enzyme reagieren und produzieren Trehalulose selbst wenn sie als Substrat auf eine 0.1 Gew.-% oder 50 Gew.-%ige Saccharose-Lösung einwirken. Lösungen mit einer beträchtlich hohen Substrat-Konzentration oder mit ungelösten Substrat können ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Bevorzugte Reaktionstemperaturen sind beispielsweise solche, welche die Enzyme nicht deaktivieren, insbesondere solche bis zu etwa 80°C, bevorzugt solche im Bereich von 0–70°C. Ganz besonders ergeben die Maltose/Trehalose umwandelnde Enzyme aus Mikroorganismen von dem Stamm Thermus bei Temperaturen von etwa 30–50°C aus Saccharose eine größere Ausbeute an Trehalulose. Die pH-Werte der Reaktion werden üblicherweise auf einen pH von etwa 5.5–9.0 eingestellt, bevorzugt von etwa 6.0–8.5. Die Reaktionszeit kann ausgewählt werden indem man die Bedingungen der Enzymreaktion beobachtet, üblicherweise wird sie zwischen etwa 0.1–200 Stunden ausgewählt, wenn etwa 10–1,000 Einheiten des Maltose/Trehalose umwandelnden Enzyms, berechnet auf trockner und fester Basis (d. s. b.), pro g Substrat eingesetzt werden.
Es wurde gefunden, dass der auf diese Weise erhaltene Trehalulose-Gehalt in den Reaktionsmischungen gewöhnlich über 10% liegt, vorzugsweise über 30%, und der höchste Anteil bei etwa 80% liegt.
Die so erhaltenen Reaktionsmischungen können einer Filtration oder Zentrifugation unterzogen werden, um die unlöslichen Substanzen zu entfernen, mit Aktivkohle entfärbt, mit Ionenaustauschern in der H-Form und OH-Form entsalzt und zu sirupartigen Produkten konzentriert werden. Bei Bedarf können die Konzentrate weiter zu pulverförmigen Produkten getrocknet werden.
Wenn die Notwendigkeit besteht, können die sirupartigen und pulverförmigen Produkte weiter gereinigt werden. Zum Beispiel können diese Produkte leicht durch Fraktionierung über Ionenaustauscher-Säulenchromatographie, Säulenchromatographie unter Einsatz von Aktivkohle und/oder Säulenchromatographie unter Einsatz von Silikagel gereinigt werden. Die bei diesen säulenchomatographischen Verfahren abgetrennte Saccharode kann als Substrat für das Maltose/Trehalose umwandelnde Enzym wiederverwendet werden, um Trehalulose zu produzieren.
Bei Bedarf können die erfindungsgemäßen, Trehalulose enthaltenden Saccharid-Verbindungen in ihrer Süßkraft und Viskosität kontrolliert werden, indem man sie mit einer Invertase hydrolysiert oder sie der Einwirkung von Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase oder Glycosyltransferase aussetzt, um die Saccharide darin umzuwandeln. Darüber hinaus können die Saccharid-Verbindungen mit Hefe behandelt werden, um die fermentierbaren Saccharide zu entfernen. Die erhaltenen Produkte können den oben genannten Reinigungsverfahren, wie z. B. Ionenaustauscher-Säulenchromatographie, unterzogen werden, um Glucose und Fructose zu entfernen und Produkte mit einem hohen Trehalulose-Gehalt zu erhalten, gefolgt von einer Reinigung und Konzentration der Produkte zu sirupartigen Produkten. Bei Bedarf können die sirupartigen Produkte wahlweise zu pulverförmigen Produkten getrocknet werden.
Die in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Ionenaustauscher-Säulenchromatographie umfasst Säulenchromatographie unter Einsatz eines stark sauren Kationenaustauscherharzes, wie sie in den japanischen Offenlegungsschriften Nos. 23,799/83 und 72,598/83 beschrieben wird, um verunreinigende Saccharide zu entfernen und Fraktionen mit einem hohen Trehalulose-Anteil zu erhalten. Bei einer solchen Säulenchromatographie können wahlweise Festbett, Fließbett- oder simulierte Fließbettverfahren eingesetzt werden.
Die so erhaltenen erfindungsgemäßen, Trehalulose enthaltenden Saccharide besitzen eine relativ hohe Wasserlöslichkeit sowie eine hohe Qualität und eine spürbare Süße. Da Trehalulose durch im Dünndarm vorhandene Hydrolasen zu Glucose und Fructose hydrolysiert wird, wird sie von lebenden Organismen leicht als Energiequelle. assimiliert, absorbiert und genutzt, wenn sie oral verabreicht wird. Da Trehalulose nicht wesentlich durch Karies verursachende Mikroorganismen abgebaut wird und die Synthese von unlöslichen Glucanen aus Saccharose durch solche Mikroorganismen behindert, kann sie als nicht Karies verursachender Süßstoff eingesetzt werden.
Wie oben beschrieben, können die erfindungsgemäßen Saccharid-Verbindungen zufriedenstellend als Süßstoff, Geschmacksverbesserer, Mittel zur Qualitätsverbesserung oder Stabilisator in Verbindungen, wie z. B. Lebensmittelprodukten, Tabak, Zigaretten, Futter, Tiernahrung, Kosmetika und Arzneimitteln, eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Saccharid-Verbindungen können unbehandelt als Würze zum Süßen eingesetzt werden. Bei Bedarf können die Saccharid-Verbindungen zusammen mit adäquaten Mengen eines oder mehrerer anderer Süßstoffe, zum Beispiel pulverisiertem Sirup, Glucose, Maltose, Saccharose, Isomerzucker, Honig, Ahornzucker, Sorbitol, Maltitol, Lactitol, Dihydrochalcon, Steviosid, α-Glycosyl-steviosid, Rebaudiosid, Glycyrrhizin, L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, Saccharin, Glycin und Alanin, und/oder einem Füllstoff, wie z. B. Dextrin, Stärke und Lactose, eingesetzt werden.
Da die erfindungsgemäßen Saccharid-Verbindungen einen Geschmack besitzen, der gut mit anderen Substanzen, die säuerlich, sauer, salzig, bitter, zusammenziehend und wohlschmeckend sind, harmoniert und weil die Verbindungen eine relativ hohe Säureverträglichkeit und thermische Stabilität besitzen, können die wahlweise in Lebensmittelprodukten allgemein als Süßstoff, Mittel zur Geschmacksverbesserung und Mittel zur Qualitätsverbesserung eingesetzt werden.
Die Saccharid-Verbindungen können eingesetzt werden als Gewürzstoff für Sojasauce, pulverförmige Sojasauce, „miso", „funmatsu-miso" (ein pulverisiertes Miso), „moromi" (ein raffiniertes Sake), „hishio" (eine raffinierte Sojasauce), „furikake" (ein gewürztes Fischmehl), Mayonnaise, Dressing, Essig, „sanbai-zu" (eine Sauce aus Zucker, Sojasauce und Essig), „funmatsu-sushi-su" (pulverisierter Essig für Sushi), „chuka-no-moto" (eine Fertigmischung für chinesische Speisen), „tentsuyu" (eine Sauce für japanische, in Fett gebackene Speisen), „mentsuyu" (eine Sauce für japanische Nudeln), Sauce, Ketchup, „takuan-zuke-no-moto" (eine Fertigmischung für japanischen Rettich), „hakusai-zuke-no-moto" (eine Fertigmischung für chinesischen Kohl), „yakiniku-no-tare" (eine Sauce für japanisches Grillfleisch), Curry-Mehlschwitze, Fertigmischung für Braten, Fertigmischung für Suppen, „dashi-no-moto" (Instant-Vorratsmischung), Gewürzmischung, „mirin" (ein süßer Sake), „shin-mirin" (ein synthetischer Mirin), Tafelzucker und Zucker für Kaffee.
Die erfindungsgemäßen Saccharid-Verbindungen können auch eingesetzt werden zum Süßen und zur Geschmacks- und Qualitätsverbesserung von „wagashi" (japanische Kekse), wie z. B. „senbei" (ein Reiskeks), „arare-mochi" (ein würfelförmiger Reiskeks), „okoshi" (ein Hirse/Reis-Keks), „mochi" (eine Reispaste), „manju" (ein süßes Brötchen mit Bohnenmarmelade) „uiro" (ein süßes Reisgelee), „an" (eine Bohnenmarmelade), „yokan" (ein süßes Bohnengelee), „mizuyokan" (ein leichtes Adzuki-Bohnengelee), „kingyoku" (eine Art Yokan), Gelee, pao de Castella und „amedama" (ein japanisches Karamelbonbon); Süßigkeiten, wie z. B. süße Brötchen, Biskuit, Kekse, Plätzchen, Torte, Pudding, Buttercreme, Eierschaumcreme, Windbeutel, Waffeln, Schaumpudding, Berliner, Schokolade, Kaugummi, Karamelbonbons und Hartbonbons; gefrorenen Nachspeisen, wie z. B. Eiscreme und Sorbet; Sirup, wie z. B. „kajitsu-no-syrup-zuke" (eine eingelegte Frucht) und „korimitsu" (ein Zuckersirup für zerstoßenes Eis); Pasten, wie z. B. Mehlpaste, Erdnußbutter, Fruchtbrei und Brotaufstrich; eingemachte Früchte und Gemüse, wie z. B. Konfitüre, Marmelade, „syrup-zuke" (eingelegte Früchte) und „toka" (Konserven); Gurken und eingelegte Produkte, wie z. B. „fukujin-zuke" (rot gefärbte Rettich-Gurken), „bettara-zuke" (eine Art von ganzen, frischen Rettich-Gurken), „semai-zuke" (eine Art von in Scheiben geschnittenen Rettich-Gurken) und „rakkyo-zuke" (eingelegte Schalotten); Fleischprodukte, wie z. B. Schinken und Wurst; Fischprodukte, wie z. B. Fischschinken, Fischwurst, „kamaboko", (eine gekochte Fischpaste), „chikuwa" (eine Art Fischpaste) und „tenpura" (eine japanische in Fett gebackene Fischpaste); „chinmi" (Appetitanreger), wie z. B. „uni-no-shiokara" (gesalzene Eingeweide vom Seeigel), „ika-no-shiokara" (gesalzene Eingeweide vom Tintenfisch), „su-konbu" (eingemachter Tang), „saki-surume" (getrocknete Tintenfischstreifen) und „fugu-no-mirin-boshi" (ein getrockneter mit Mirin gewürzter Kugelfisch); „tsukudani" (in Sojasauce gekochte Lebensmittel), wie z. B. solche aus Algen, essbaren Wildpflanzen, getrocknetem Tintenfisch, Fischen und Schalentiere; Beilagen, wie z. B. „nimame" (gekochte Bohnen), Kartoffelsalat und „konbu-maki" (eine Tangrolle); Milchprodukte; Produkte in Dosen und Flaschen, wie z. B. solche mit Fleisch, Fisch, Früchten und Gemüse; alkoholische Getränke, wie z. B. Sake, synthetischer Sake, Wein und Liköre; alkoholfreie Getränke, wie z. B. Kaffee, Tee, Kakao, Saft, kohlensäurehaltige Getränke, Milchsäure enthaltende Getränke und Getränke, die Milchsäurebakterien enthalten; Fertiggerichte, wie z. B. Instant-Puddingmischungen, Instant-Pfannkuchenmischungen und „sokuseki-shiruko" (eine Fertigmischung aus Adzuki-Bohnen-Suppe mit Reis-Keksen) und Instant-Suppenmischungen; und Getränke, wie z. B. Babynahrung, Nahrungsmittel zur Therapie, sowie mit Nährstoffen ergänzte Getränke.
Die vorliegenden Saccharid-Verbindungen können darüber hinaus in Futtermitteln und Tiernahrung für Tiere, wie z. B. Haustiere, Geflügel, Seidenraupen und Fischen eingesetzt werden, um ihre Geschmacksvorlieben und das Wachstum der Tiere zu fördern. Diese Verbindungen können wahlweise als Süßstoff, Mittel zur Geschmacksverbesserung, Mittel zur Geschmacksüberdeckung oder Mittel zur Qualitätsverbesserung in weiteren Produkten, einschließlich Tabak, Zigaretten, Kosmetika und Arzneimitteln in fester, pastöser oder flüssiger Form eingesetzt werden, wie z. B. als Zahnpasta, Lippenstift, Rouge, Creme für rissige Lippen, innere Medizin, Tabletten, Dragees, Lebertran in Tropfenform, Katechu, Mundspray und Mundwasser.
Die Verfahren die erfindungsgemäßen Saccharid-Verbindungen in die oben genannten Verbindungen einzubauen, umfassen konventionelle Verfahren, zum Beispiel Mischen, Kneten, Lösen, Schmelzen, Eintauchen, Tränken, Besprühen, Auftragen, Ummanteln, Versprühen, Injizieren, Kristallisieren und Ausfällen. Die Saccharid-Verbindungen werden allgemein in die oben genannten Verbindungen zur einem Anteil von 0.1% oder mehr, vorzugsweise 1% oder mehr Trehalulose, d. s. b., eingebaut. Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung detaillierter beschrieben:
Experiment 1
Enzymherstellung
Eine flüssige Nährlösung für Kulturen, bestehend aus 0.5 Gew.-% Polypepton, 0.1 Gew.-% Hefeextrakt, 0.07 Gew.-% Natriumnitrat, 0.01 Gew.-% Di-natriumhydrogenphosphat, 0,01 Gew.-% Magnesiumsulfat und Wasser, wurde auf pH 7.5 eingestellt. Proben der Kultur von jeweils einhundert ml wurden in 500 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben, die dann für 20 Minuten bei 120°C im Autoklaven umgesetzt, gekühlt und mit einer Vorratskultur Thermus aquaticus ATCC 33923 geimpft und anschließend bei 60°C für 24 Stunden unter Schütteln mit 200 rpm gezüchtet wurden, um eine Kultur als Keimkultur zu erhalten.
Etwa 20 l Proben eines frischen Präparats der gleichen flüssigen Nährlösung für Kulturen, wie sie oben eingesetzt wurde, wurden in zwei 30 l Gärbehälter gegeben, durch Erhitzen sterilisiert, auf 60°C gekühlt und mit einem Vol.-% der Keimkultur geimpft und anschließend bei 60°C und pH 6.5–8.0 für etwa 20 Stunden unter Rühren und Belüften gezüchtet.
Experiment 2
Reinigung des Enzyms
Die in Experiment 1 erhaltene Kultur wurde zentrifugiert, um etwa 0.28 kg nasse Zellen zu erhalten, und die Zellen wurden in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) suspendiert. Etwa 1.9 l der Zellsuspension wurde mit „Model US300", einem Ultraschall-Zerkleinerer, der von Nihonseiki Kaisha, Ltd., Tokyo, Japan vertrieben wird, behandelt, um die Zellen zu zerkleinern. Die erhaltenen Mischung wurde bei 15,000 G für 30 Minuten zentrifugiert, um etwa 1.8 l einer überstehenden Flüssigkeit zu erhalten. Es wurde Ammoniumsulfat zugegeben und in der überstehenden Flüssigkeit gelöst, um einen Sättigungsgrad von 0.7 zu erhalten, bei 4°C über Nacht stehengelassen, um einen Niederschlag zu bilden, und dann zentrifugiert, um den Niederschlag aufzufangen.
Der Niederschlag wurde in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) gelöst, für 24 Stunden gegen ein frisches Präparat des gleichen Puffers dialysiert und dann zentrifugiert, um die unlöslichen Substanzen zu entfernen. 1,560 ml der dialysierten Lösung wurden in drei Teile aufgeteilt, die dann separat einer Ionenaustauscher-Säulenchromatographie unter Einsatz von 530 ml „DEAE-TOYOPEARL 650", einem Gel, das von Tosoh Corporation, Tokyo, Japan vertrieben wird, unterzogen.
Ein Maltose/Trehalose umwandelndes Enzym wurde an dem Gel adsorbiert und mit einem frischen Präparat des gleichen, Salz enthaltenden Puffers eluiert. Das Eluat mit Enzymaktivität wurde aufgefangen und gesammelt und die Lösung wurde einer hydrophoben Säulenchromatographie unterzogen unter Einsatz einer mit 380 ml „BUTYL-TOYOPEARL^® 650", einem Gel, das von Tosoh Corporation, Tokyo, Japan vertrieben wird, gepackten Säule. Das an dem Gel adsorbierte Maltose/Trehalose umwandelnde Enzym wurde aus der Säule mit einer Ammoniumsulfat enthaltenden Lösung mit einem linearen Gradienten, abnehmend von 1 nach 0 M, eluiert und anschließend wurden die Fraktionen mit Enzymaktivität aufgefangen.
Die Fraktionen wurden zusammengefasst und einer Gel-Filtration-Chromatographie unter Einsatz von 380 ml „TOYOPEARL^® HW-55S", einem Gel, das von Tosoh Corporation, Tokyo, Japan vertrieben wird, unterzogen, anschließend wurden die Fraktionen mit der Enzymaktivität aufgefangen.
Die Fraktionen wurden zusammengefasst und einer Ionenaustauscher-Säulenchromatographie unter Einsatz von 1.0 ml „MONO Q HR5/5", einem Gel, das von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden vertrieben wird, unterzogen, anschließend wurde die Säule mit einer Salzlösung mit einem linearen Gradienten, aufsteigend von 0.1 bis 0.35 M, beschickt und die Fraktionen mit der Enzymaktivität wurden aufgefangen. Auf diese Weise wurde ein Maltose/Trehalose umwandelndes Enzym mit einem elektrophoretisch einzelnen Proteinband erhalten. Die spezifische Aktivität des Enzyms betrug 135 Einheiten pro mg Protein.
Experiment 3
Umsetzung mit Sacchariden
Fünfzig Einheiten des Maltose/Trehalose umwandelnden Enzym ließ man pro g Saccharid, d. s. b., auf Saccharide einwirken, um festzustellen, ob die Saccharide als Substrate für die Enzyme eingesetzt werden können. Zu diesem Zweck, wurden Glucose, Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Trehalose, Neotrehalose, Kojibiose, Isomaltose, Maltitol, Cellobiose, Gentiobiose, Saccharode, Trehalulose, Turanose, Maltulose, Platinose oder Lactose zu einer Lösung mit einer Endkonzentration von 5 Gew.% aufbereitet.
Jede Lösung wurde pro g Substrat, d. s. b., mit 50 Einheiten eines Enzyms, das nach dem Verfahren in Experiment 2 erhalten wurde, versetzt und einer Enzymreaktion bei 50°C und einem pH von 7.0 für 48 Stunden unterzogen. Von den Reaktionsmischungen wurden vor und nach der Enzymreaktion Proben genommen, um festzustellen, ob das Enzym mit den Sacchariden reagiert, indem man die Proben auf Platten für Dünnschichtchromatographie (hier später als „TCL" abgekürzt) unter Einsatz von „KIESELGEL 60", einer Aluminiumplatte, 20 × 20 cm, die von Merck & Co., Inc., N.J., USA vertrieben wird, aufträgt. Für die TCL wurde ein Lösungsmittelsystem von 1-Butanol, Pyridin und Wasser (= 6 : 4 : 1 im Volumen) eingesetzt und jede Probe wurde einmal entwickelt. Die Färbung wurde durch Besprühen der Platten mit 20 Vol.-% Schwefelsäure in Methanol und Erwärmen der Platten für 10 Minuten auf 110°C erreicht. Reaktionsmischungen, in denen Enzymprodukte festgestellt wurden, wurden über Gaschromatographie (hier später als „GLC" abgekürzt) auf die Saccharid-Verbindung analysiert. Von den Reaktionsmischungen wurden Proben gezogen, die getrocknet, in Pyridin gelöst, mit Trimethylsilan umgesetzt wurden, nachdem sie in die Oxime überführt worden waren, und die erhaltenen Produkte wurden zur Analyse eingesetzt. Bei dem in diesem Experiment eingesetzten Gaschromatographen und Versuchsbedingungen handelte es sich um einen „GC-16A", der von Shimadzu Corporation, Tokyo, Japan vertrieben wird, eine Edelstahlkolonne, 3 mm im Durchmesser und 2 m lang, gepackt mit 2% „OV-17/CHROMOSOLVE W", eine Kolonne, die von GL Sciences Inc., Tokyo, Japan vertrieben wird; eine Fließrate des Stickstoffs als Trägergas von 40 ml/min; die Temperatur des Säulenofens bei 160–320°C; eine zunehmende Heizrate von 7.5°C/min; und als Detektor einen Wasserstoff-Flammenionisationsdetektor. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1
Anmerkung: In den Spalten „Enzymreaktion" bedeutet das Symbol „–„: unverändert vor und nach der Enzymreaktion; „+„: das Substrat wurde reduziert und die Produktausbeute betrug weniger als 25%; „++„: das Substrat wurde reduziert und die Produktausbeute betrug mindestens 25% aber weniger als 75%; und „+++„: das Substrat wurde reduziert und die Produktausbeute betrug mindestens 75%.
Wie aus den Ergebnissen in der Tabelle 1 ersichtlich, wurde überraschenderweise gefunden, dass das in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Maltose/Trehalose umwandelnde Enzym mit Maltose und Trehalose reagiert, ebenso wie mit Neotrehalose, Saccharose, Trehalulose, Turanose, Maltulose und Palatinose, bei den getesteten Sacchariden, insbesondere mit Saccharose.
Experiment 4
Produkt der Enzymreaktion
Experiment 4-1
Produkt aus Saccharose
Einhundert Einheiten eines Maltose/Trehalose umwandelnden Enzyms, das nach dem Verfahren in Experiment 2 erhalten wurde, wurden pro g Substrat, d. s. b., zu einer wässerigen Saccharose-Lösung mit einer Endkonzentration von 10 Gew.-% gegeben und die Mischung wurde für 48 Stunden einer Enzymreaktion bei 50°C und pH 6.5 unterzogen. Die Zusammensetzung der Reaktionsmischung wurde über GLC, ähnlich wie in Experiment 3, analysiert. Um den tatsächlichen Werte zu finden, wurden auch mit Trimethylsilan umgesetzte Derivate, die nicht in Oxime umgewandelt worden waren, als Proben zur Analyse eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben.
Tabelle 2
Anmerkung: In der Tabelle bedeuten die Symbole „A" und „B" „Reaktionsmischung" bzw. „Standard-Saccharid"
Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 2 ersichtlich, wurde gefunden, dass eine unbekannte Substanz „X" in großen Mengen aus Saccharose gebildet wurde und die Retentionszeiten des mit Trimethylsilan umgesetzten Derivats der Substanz „X", bevor und nachdem sie in das Oxim umgewandelt wurde, mit denen der Trehalulose übereinstimmen. Um die Substanz „X" zu identifizieren, wurden die folgenden Tests zur Bestätigung unter Einsatz eines hochreinen Saccharid-Pulvers, das Trehalulose enthält und nach Experiment 8 hergestellt wurde, durchgeführt:
(1) Saccharid-Bestandteil

Die GLC-Analyse der Produkte, die nach der Hydrolyse der Substanz „X" mit 0.5 N Schwefelsäure durchgeführt wurde, zeigte neben der intakten Substanz „X" Glucose und Fructose in einem molaren Verhältnis von 1 : 0.83 an. Wenn man die Stabilität von Hexose und Ketose gegenüber Säuren berücksichtigt, kann man festhalten, dass die Substanz „X" aus äquimolaren Mengen Glucose und Fructose besteht.

(2) Hydrolyse durch Enzyme

Wird nicht hydrolysiert durch eine Invertase aus Hefe. Wird durch eine α-Glucosidase aus Hefe in Glucose und Fructose in einem molaren Verhältnis von 1 : 1 hydrolysiert.

(3) Masse

342 über FD-MS-Analyse

(4) Spezifische Drehung

[α]²⁰ _D + 57.7° (H₂O, c = 5) für eine Standard-Trehalulose: [α]²⁰ _D + 57.1° (H₂O, c = 5)

Aufgrund der Tatsache, dass es sich bei der Substanz „X" um ein Disaccharid handelt, das aus Glucose und Fructose besteht und dessen weitere Eigenschaften mit denen der Standard-Trehalulose übereinstimmen, kann festgehalten werden, dass es sich bei der Substanz um Trehalulose, 1-O-D-Glucopyranosyl-D-fructose, handelt. Der Vergleich der Retentionszeiten mit denen des Standardpräparats über GLC-Analyser zeigte, dass weitere Nebenbestandteile, die aus Saccharose nach der Hydrolyse mit dem Maltose/Trehalose umwandelnden Enzym gebildet wurden, Palatinose und Turanose waren.
Aus diesen Ergebnissen wird ersichtlich, dass das Maltose/Trehalose umwandelnde Enzym Maltose in Trehalose und vice versa umwandelt sowie Saccharose in Trehalulose umwandelt. Das Enzym wandelte im Wesentlichen keine Trehalulose in Saccharose um.
Experiment 4-2
Zucker-Zusammensetzung des Produktes aus Saccharose
Etwa 330 Einheiten/g eines gereinigten Maltose/Trehalose umwandelnden Enzyms, das nach dem Verfahren in Experiment erhalten worden war, wurde zu einer wässerigen Saccharose-Lösung mit einer Endkonzentration von 10 Gew.-% gegeben und die Mischung wurde für 30 Minuten einer Enzymreaktion bei 40–70°C und pH 6.5 unterzogen. Danach wurde die Zucker-Zusammensetzung der Reaktionsmischung, ähnlich wie in Experiment 3, über GLC analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Tabelle 3
Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 3 ersichtlich, bildet das in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Maltose/Trehalose umwandelnde Enzym eine Saccharid-Verbindung, die etwa 45–80% Trehalulose, d. s. b., enthält. Die Ausbeute an Trehalulose steigt an, wenn die Temperatur abnimmt, während die Ausbeute abnimmt, wenn die Temperatur ansteigt. Typisch für das Enzym ist, dass es ein höheres Verhältnis von Trehalulose zu Palatinose ergibt, d. h. das Verhältnis von Trehalulose/Palatinose beträgt 14 oder mehr, und es produziert Trehalulose enthaltende Saccharid-Verbindungen mit einem Palatinose Gehalt von nur 4% oder weniger, d. s. b. Die erfindungsgemäße Saccharid-Verbindung, die Trehalulose enthält, die über das Enzym produziert wurde, unterscheidet sich deutlich im Verhältnis von Trehalulose/Palatinose und dem Anteil an Palatinose von konventionellen Saccharid-Verbindungen, die Trehalulose enthalten, die mit konventionellen Enzymen produziert wurden.
Experiment 5
Einfluss des Anteils an Enzym auf die Bildung der Trehalulose
Zu einer 10%igen Saccharose-Lösung wurden pro g Saccharose 2, 5, 10, 20, 50, 100 oder 200 Einheiten eines gereinigten Maltose/Trehalose umwandelnden Enzyms, das nach dem Verfahren in Experiment 2 erhalten wurde, gegeben und man ließ die Mischung bei 40°C und pH 6.5 enzymatisch reagieren, wobei man in einem vorgeschriebenen Zeitintervall Proben entnahm. Die Proben wurden für 10 Minuten auf 100°C erhitzt, um das restliche Enzym zu deaktivieren und, ähnlich wie in Experiment 3, über GLC analysiert. Der Anteil des eingesetzten Enzyms und der Gehalt an Trehalulose in der Reaktionsmischung zu der jeweiligen Reaktionszeit sind in Tabelle 4 wiedergegeben.
Tabelle 4
Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 4 ersichtlich, wurde gefunden, dass 10 Einheiten des Enzyms pro g Saccharose, d. s. b., Trehalulose mit einer Ausbeute von 10% oder mehr und 100 Einheiten pro g Saccharose Trehalulose in einer Ausbeute von 80% oder mehr produzierten. Es kann abgeschätzt werden, das selbst 10 Einheiten des Enzyms pro g Saccharose, d. s. b., Trehalulose in einer Ausbeute von 30% oder mehr produzieren werden, wenn man allein das Enzym länger auf das Substrat einwirken lässt.
Experiment 6
Einfluss der Konzentration der Saccharose auf die Bildung von Trehalulose
Pro g Saccharose, d. s. b., ließ man 100 Einheiten eines gereinigten Maltose/Trehalose umwandelnden Enzyms, das nach dem Verfahren in Experiment 2 erhalten wurde, auf eine Lösung einwirken, die 2.5%, 5%, 10%, 20%, oder 40% Saccharose enthielt, und man ließ die Mischung bei 40°C und pH 6.5 für 96 Stunden enzymatisch reagieren und erhitzte sie dann für 10 Minuten auf 100°C, um das restliche Enzym zu deaktivieren. Die Saccharid-Zusammensetzung sämtlicher Reaktionsmischungen wurde, ähnlich wie in Experiment 3, über GLC analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 wiedergegeben.
Tabelle 5
Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 5 ersichtlich, betrug die Ausbeute an Trehalulose aus Saccharose selbst bei einer 2.5%igen Saccharose-Lösung 70% oder mehr. Je höher die Konzentration an Saccharose war, um so mehr wurde die Enzymreaktion gefördert. Die Ausbeute an Trehalulose betrug etwa 80%, wenn man das Enzym auf 10%ige oder stärkere Saccharose-Lösungen einwirken ließ.
Experiment 7
Einfluss der Temperatur auf die Bildung der Trehalulose
Eine 10%ige Saccharose-Lösung wurde auf pH 6.5 eingestellt, mit 100 Einheiten eines gereinigten Maltose/Trehalose umwandelnden Enzyms, das nach dem Verfahren in Experiment 2 erhalten wurde, pro g Saccharose, d. s. b., versetzt und die Mischung ließ man enzymatisch bei 20°, 30°, 40°, 50° oder 60°C reagieren, wobei in einem vorgeschriebenen Zeitintervall der Reaktionsmischung Proben entnommen wurden. Die Proben wurden für 10 Minuten auf 100°C erhitzt, um das restliche Enzym zu deaktivieren. Die Saccharid-Zusammensetzungen sämtlicher Reaktionsmischungen wurden, ähnlich wie in Experiment 3, über GLC analysiert. Der Gehalt an Trehalulose sämtlicher Reaktionsmischungen bei verschiedenen Reaktionszeiten und Temperaturen ist in Tabelle 6 wiedergegeben.
Tabelle 6
Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 6 ersichtlich, produziert das Enzym Trehalulose mit einer hohen Ausbeute von etwa 70% oder mehr, wenn es bei etwa 30–50°C reagiert.
Experiment 8
Herstellung von Trehalulose aus Saccharose
Zehn Gewichtsanteile Saccharose wurden in 40 Gewichtsanteilen Wasser gelöst und mit 100 Einheiten eines gereinigten Maltose/Trehalose umwandelnden Enzym, das nach dem Verfahren in Experiment 2 erhalten wurde, pro g Saccharose, d. s. b., vermischt und anschließend für 90 Stunden einer Enzymreaktion bei 40°C und pH 6.5 unterzogen. Danach wurde die Reaktionsmischung für 10 Minuten auf 100°C erhitzt, um das restliche Enzym zu deaktivieren, und auf 40°C gekühlt. Um die restliche Saccharose zu zersetzen, wurde die Reaktionsmischung auf pH 4.0 eingestellt, pro g Saccharode, d. s. b., mit 20 Einheiten einer Invertase aus Hefe versetzt, gefolgt von einer Enzymreaktion für 24 Stunden bei 40°C und der Inkubation bei 100°C für 10 Minuten, um das restliche Enzym zu deaktivieren. Die so erhaltene Mischung enthielt etwa 80% Trehalulose, d. s. b. Die Mischung wurde mit Aktivkohle entfärbt, entsalzt und gereinigt über Ionenaustauscher in der H- und OH-Form und auf eine etwa 50%ige Saccharid-Lösung zu einer Lösung für Saccharid-Ausgangsmaterial konzentriert. Um den Trehalulose-Anteil zu erhöhen, wurde die Saccharid-Lösung einer Ionenaustauscher-Säulenchromatographie unterzogen unter Einsatz von 4 ummantelten Edelstahl-Kolonnen mit 5.4 cm Durchmesser, die in einer Reihe kaskadenförmig angeordnet waren, um eine Gesamttiefe des Gelbades von 20 m zu ergeben, gepackt waren sie mit „DOWEX 50WX4 (Ca⁺⁺-Form)", einem stark sauren Kationenaustauscherharz, das von Dow Chemical Company, Midland, Mich., USA vertrieben wird.
Fünf Vol.-% der Saccharid-Lösung wurde zu dem Harz gegeben, während die Innentemperatur der Kolonne auf 40°C gehalten wurde, die Saccharid-Lösung wurde anschließend fraktioniert, um die nebeneinander vorliegenden Saccharide, wie z. B. Fructose und Glucose zu entfernen, indem die Kolonne mit heißem Wasser, das auf 40°C erwärmt wurde, mit einer SV (Fließgeschwindigkeit) von 0.2 beschickt wurde und die mit Trehalulose angereicherten Fraktionen aufgefangen wurden. Die Fraktionen wurden zusammengefasst, gereinigt, konzentriert, im Vakuum getrocknet und pulverisiert, um ein mit Trehalulose angereichertes Saccharid-Pulver mit einer Reinheit von 98% und einer Ausbeute von etwa 70%, d. s. b., zu erhalten.
Experiment 9
Produktion von Trehalulose aus Saccharose mit einem Maltose/Trehalose umwandelnden Enzym aus anderen Mikroorganismen
Gemäß dem Verfahren in den Experimenten 1 und 2 wurden Maltose/Trehalose umwandelnde Enzyme aus Pimelobacter sp. R48 (FERM BP-4315) und Pseudomonas putida H262 (FERM BP-4579) und solche aus Thermus aquaticus ATCC 27634, Thermus ruber ATCC 35948, Thermus sp. ATCC 43815 und Thermus aquaticus ATCC 33923 über Säulenchromatographie unter Einsatz von „DEAE TOYPPEARL 650" partiell gereinigt. Jedes Enzym ließ man unter den Bedingungen in Tabelle 7 für 96 Stunden mit einer 20%igen Saccharose-Lösung reagieren und die Saccharid-Zusammensetzung der Reaktionsmischung wurde über GLC analysiert. Die Ausbeute an Trehalulose für jedes Enzym ist in Tabelle 7 wiedergegeben.
Tabelle 7
Es wurde festgestellt, dass alle Enzyme aus den oben genannten Mikroorganismen Trehalulose mit einer Ausbeute von über 70% aus Saccharose produzierten.
Experiment 10
In vivo Eignungstest
Gemäß dem Verfahren, wie es von H. Atsuji et al. in „Journal of Clinical Nutrition", Vol. 41, No. 2, Seiten 200–208 (1972) beschrieben wird, wurden 30 g des mit Trehalulose angereicherten Saccharid-Pulvers mit einer Reinheit von 98%, d. s. b., aus Experiment 8 zu einer 20 Gew.-%igen wässerigen Lösung aufbereitet, die dann 3 gesunden männlichen Freiwilligen im Alter von 25, 27 und 30 Jahren oral verabreicht wurde und es wurden in einem vorgeschriebenen Zeitinterval ihrem Blut Proben entnommen und anschließend wurden die Blutzucker- und die Insulinwerte bestimmt. Zur Kontrolle wurde Glucose eingesetzt. Als Ergebnis wurde gefunden, dass die Blutzucker- und Insulinwerte ungefähr die Hälfte der Werte der Glucose, die den Freiwilligen mit Trehalulose verabreicht worden war, und sie zeigten den höchsten Wert etwa 0.5–1 Stunde nach der Einnahme. Auf Basis der Tatsache, dass Trehalulose aus Glucose und Fructose in einem molaren Verhältnis von 1 : 1 besteht, wurde geschlossen, dass das getestete Saccharid leicht assimiliert, absorbiert und als eine Energiequelle eingesetzt wird.
Experiment 11
Test der akuten Toxizität
Unter Einsatz von 7 Wochen alten dd-strain-Mäusen wurde das in Experiment 8 hergestellte, mit Trehalulose angereicherte Saccharid-Pulver mit einer Reinheit von 98%, d. s. b., den Mäusen für den akuten Toxizitätstest oral verabreicht. Bis zu einer Dosis von 15 g/kg Gewicht der Maus starb keine Maus und es war nicht möglich, einen Test mit einer höheren Dosis durchzuführen. Somit ist die Toxizität des Saccharids äußerst niedrig.
Referenzbeispiele, Beispiele A und Beispiele B beschreiben die Herstellung von Maltose/Trehalose umwandelnden Enzymen, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, die erfindungsgemäßen Saccharid-Verbindungen, welche die durch die Enzyme hergestellte Trehalulose enthalten, und die erfindungsgemäßen Verbindungen, die die Saccharid-Verbindungen enthalten:
Referenzbeispiel 1
Eine Keimkultur von Pimelobacter sp. R48 (FERM BP-4315) wurde in ein flüssiges Nährmedium für Kulturen injiziert, das aus 4.0 Gew.-% Glucose, 0.5 Gew.-% Polypepton, 0.1 Gew.-% Hefeextrakt, 0.1 Gew.-% Di-kaliumhydrogenphosphat, 0.06 Gew.-% Natriumdihydrogenphosphat, 0.05 Gew.-% Magnesiumsulfatheptahydrat, 0.05 Gew.-% Calciumcarbonat und Wasser bestand, und in einem Gärbehälter für 60 Stunden unter Rühren und Belüften gezüchtet, ähnlich wie in Experiment 1, mit Ausnahme der Inkubationstemperatur, die auf 27°C festgelegt wurde. Etwa 18 l der erhaltenen Kultur wurden mit „MINI-RABO", einer Hochdruck-Zellzerkleinerungsapparatur, die von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan vertrieben wird, behandelt, um die Zellen zu zerstören, und die Mischung wurde zentrifugiert, um eine überstehende Flüssigkeit zu erhalten. Danach wurde die überstehende Flüssigkeit unter Einsatz einer UF-Membran konzentriert, um ein Enzymkonzentrat von 300 ml zu erhalten, das etwa 30 Einheiten des Maltose/Trehalose umwandelnden Enzyms pro ml enthält.
Referenzbeispiel 2
Eine Keimkultur von Pseudomonas putida H262 (FERM BP-4579) wurde in ein flüssiges Nährmedium für Kulturen injiziert, das aus 2.0 Gew.-% Glucose, 1.0 Gew.-% Ammoniumsulfat, 0.1 Gew.-% Di-kaliumhydrogenphosphat, 0.06 Gew.-% Natriumdihydrogenphosphat, 0.05 Gew.-% Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0.3 Gew.-% Calciumcarbonat und Wasser bestand, und in einem Gärbehälter für etwa 20 Stunden unter Rühren und Belüften gezüchtet, ähnlich wie in Experiment 1, mit Ausnahme der Inkubationstemperatur, die auf 27°C festgelegt wurde. Etwa 18 l der erhaltenen Kultur wurden zentrifugiert, um etwa 0.4 kg nasse Zellen zu erhalten, die dann in 4 l eines 10 mM Phosphatpuffers suspendiert und in einer Ultraschall-Schleudermühle behandelt wurden, um die Zellen zu zerstören. Die Zell-Suspension wurde zentrifugiert, um eine überstehende Flüssigkeit zu erhalten, welche dann über eine UF-Membran konzentriert wurde, um etwa 100 ml eines Enzymkonzentrats zu erhalten, das etwa 15 Einheiten eines Maltose/Trehalose umwandelnden Enzyms pro ml enthält.
Referenzbeispiel 3
Gemäß dem Verfahren in Experiment 1 wurde der Thermus aquaticus ATCC 33923 für etwa 20 Stunden unter Rühren und Belüften kultiviert. 0.18 kg nasse Zellen, die aus etwa 18 l der Kultur aufgefangen wurden, wurden in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) suspendiert und in einer Ultraschall-Schleudermühle behandelt, um die Zellen zu zerstören. Die erhaltene Mischung wurde zentrifugiert, um eine überstehende Flüssigkeit zu erhalten, welche dann mit einer UF-Membran konzentriert wurde, um etwa 100 ml eines Enzymkonzentrats zu erhalten, das etwa 50 Einheiten eines Maltose/Trehalose umwandelnden Enzyms pro ml enthält.
Beispiel A-1
Saccharose wurde zu einer Lösung mit einer Endkonzentration an Saccharose von 30 Gew.-% und 25 Einheiten eines Maltose/Trehalose umwandelnden Enzyms, das nach dem Verfahren in Referenzbeispiel 1 erhalten wurde, pro g trockenem Feststoff aufbereitet und anschließend wurde die Mischung bei 10°C und pH 7.0 für 150 Stunden gezüchtet. Die Reaktionbsmischung wurde für 10 Minuten auf 95°C erhitzt, aufgefangen und auf konventionelle Art mit Aktivkohle entfärbt und gefiltert, entsalzt und gereinigt über Ionenaustauscher in der H- und OH-Form und mit einer Ausbeute von etwa 95% zu einem etwa 75%igen Trehalulose-Sirup konzentriert. Der Sirup enthielt etwa 75% Trehalulose, d. s. b. Da der Sirup eine qualitativ hochwertige Süße, eine passende Viskosität und einen zufriedenstellende Feuchtigkeitsgehalt aufweist, kann er als Süßstoff, Mittel zur Qualitätsverbesserung oder Stabilisator für Lebensmittelprodukte, Kosmetika und Arzneimittel eingesetzt werden. Der Sirup kann eingesetzt werden nach dem Hydrieren der reduzierenden Trehalulose sowie der anderen Saccharode in dem Sirup zu ihren korrespondierenden Zuckeralkoholen.
Beispiel A-2
Saccharose wurde zu einer Lösung mit einer Endkonzentration an Saccharose von 20 Gew.-% und 20 Einheiten eines Maltose/Trehalose umwandelnden Enzyms pro g trockenem Feststoff, das nach dem Verfahren in Referenzbeispiel 2 erhalten wurde, aufbereitet und anschließend wurde die Mischung bei 25°C und pH 7.0 für 120 Stunden gezüchtet. Die Reaktionsmischung wurde für 10 Minuten auf 95°C erhitzt, aufgefangen und auf konventionelle Art mit Aktivkohle entfärbt und gefiltert, entsalzt und gereinigt über Ionenaustauscher in der H- und OH-Form, konzentriert, im Vakuum getrocknet und mit einer Ausbeute von etwa 90% zu einem Trehalulose-Sirup pulverisiert. Der Sirup enthielt etwa 70% Trehalulose, d. s. b. Da der Sirup eine qualitativ hochwertige Süße aufweist, kann er als Süßstoff, Mittel zur Qualitätsverbesserung, Stabilisator, Füllstoff oder Bindemittel in Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln eingesetzt werden.
Beispiel A-3
Eine Reaktionsmischung, die über eine Enzymreaktion unter Einsatz eines Maltose/Trehalose umwandelnden Enzyms, das nach dem Verfahren in Beispiel A-1 hergestellt wurde, erhalten wurde, wurde auf pH 4.5 eingestellt und pro g trockenem Feststoff mit 5 Einheiten Invertase versetzt und anschließend für 24 Stunden einer Enzymreaktion bei 40°C unterzogen. Die so erhaltene Reaktionsmischung wurde für 10 Minuten bei 95°C gezüchtet, abgekühlt, auf konventionelle Weise mit Aktivkohle entfärbt und gefiltert, entsalzt und gereinigt über Ionenaustauscher in der H- und OH-Form und zu einer etwa 55%igen Saccharid-Lösung konzentriert. Die Saccharid-Lösung wurde als eine Ausgangssaccharid-Lösung, ähnlich wie in Experiment 8, einer Säulen chromatographie unter Einsatz von „DOWEX 99 (Ca⁺⁺-Form, Polymerisationsgrad von 6%)", einem stark sauren Kationenaustauscherharz, das von Dow Chemical, Midland, Mich., USA vertrieben wird, unterzogen, um die mit Trehalulose angereicherten Fraktionen zu sammeln. Die Fraktionen wurden zusammengefasst, gereinigt und konzentriert, um mit einer Ausbeute von etwa 60%, d. s. b., einen Sirup mit einem hohen Trehalulose-Anteil zu erhalten, der etwa 75% Trehalulose enthielt. Da der Sirup etwa 95% Trehalulose, d. s. b., enthält und eine qualitativ hochwertige Süße, eine passende Viskosität und einen zufriedenstellende Feuchtigkeitsgehalt aufweist, kann er wahlweise als Süßstoff, Mittel zur Qualitätsverbesserung oder Stabilisator in Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln eingesetzt werden.
Beispiel A-4
Saccharose wurde zu einer Lösung mit einer Endkonzentration an Saccharose von 40 Gew.-%. Die Saccharose-Lösung wurde mit pro g trockenem Feststoff mit 50 Einheiten eines Maltose/Trehalose umwandelnden Enzyms, das nach dem Verfahren in Referenzbeispiel 3 erhalten wurde, vermischt und für 96 Stunden bei 40°C und pH 6.5 einer Enzymreaktion unterzogen. Die Reaktionsmischung wurde auf pH 4.5 eingestellt, mit 5 Einheiten Invertase pro g Trockenstoff vermischt und für 24 Stunden einer Enzymreaktion bei 40°C unterzogen. Nachdem sie für 10 Minuten bei 95°C gehalten wurde, wurde die Reaktionsmischung gekühlt, mit Aktivkohle entfärbt und gefiltert, entsalzt und gereinigt über einen Ionenaustauscher in H- und OH-Form und zu einer etwa 55%igen Saccharid-Lösung konzentriert. Die Saccharid-Lösung wurde als eine Ausgangssaccharid-Lösung, ähnlich wie in Experiment 8, einer Säulenchromatographie unter Einsatz von „DOWEX 99 (Ca⁺⁺-Form, Polymerisationsgrad von 6%)", einem stark sauren Kationenaustauscherharz, das von Dow Chemical, Midland, Mich., USA vertrieben wird, unterzogen, um die mit Trehalulose angereicherten Fraktionen zu sammeln. Die Fraktionen wurden zusammengefasst, gereinigt und konzentriert und sprühgetrocknet, um mit einer Ausbeute von etwa 60%, d. s. b., ein Pulver mit einem hohen Trehalulose-Anteil zu erhalten. Da der Sirup etwa 95% Trehalulose, d. s. b., enthält und eine qualitativ hochwertige Süße, eine passende Viskosität und einen zufriedenstellende Feuchtigkeitsgehalt aufweist, kann er wahlweise als Süßstoff, Mittel zur Qualitätsverbesserung oder Stabilisator in Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln eingesetzt werden.
Beispiel B-1
Süßstoff
Ein Gewichtsanteil eines Pulvers mit einem hohen Trehalulose-Gehalt, das nach dem Verfahren in Beispiel A-4 erhalten wurde, wurde homogen mit 0.05 Gewichtsanteilen „α-G SWEET", α-Glycosyl-steviosid, das von Toyo Sugar Refining Co., Ltd., Tokyo, Japan vertrieben wird, vermischt und die Mischung wurde in einen Granulator gegeben, um ein Süßstoff-Granulat zu erhalten. Das Produkt besitzt eine hochwertige Süße, eine etwa zweimal so hohe Süßkraft wie Saccharose und etwa die Hälfte des Kalorienwertes von Saccharose pro Süßkraft. Das Produkt kann vorteilhaft als kalorienarmer Süßstoff eingesetzt werden, um kalorienarme Lebensmittel für Übergewichtige und Diabetiker zu süßen, die ihre Kalorienaufnahme einschränken müssen. Da Karies bildende Mikroorganismen weniger Säuren und unlösliche Glucane bilden, wenn sie das Produkt aufnehmen, kann es zufriedenstellend zum Süßen von Lebensmittelprodukten eingesetzt werden, um Zahnkaries zu unterdrücken.
Beispiel B-2
Hartbonbon
100 Gewichtsanteile einer 55%igen Saccharose-Lösung wurden unter Erwärmen mit 30 Gewichtsanteilen eines Trehalulose-Sirups, der nach dem Verfahren in Beispiel A-1 erhalten wurde, vermischt, dann unter Erwärmen bei vermindertem Druck konzentriert, um einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 2% zu erhalten, mit einem Gewichtsanteil Zitronensäure und geeigneten Anteilen eines Zitronenaromas und eines Farbstoffes vermischt. Die Mischung wurde auf konventionelle Weise zu dem gewünschten Produkt geformt. Das Produkt ist ein qualitativ hochwertiges Hartbonbon, das eine unwesentliche Kristallisation von Saccharose aufweist und eine zufriedenstellende Bisseigenschaft sowie einen zufriedenstellenden Geschmack besitzt.
Beispiel B-3
Erdbeermarmelade
Einhundertundfünfzig Gewichtsanteile frische Erdbeeren, 20 Gewichtsanteile Maltose, 40 Gewichtsanteile eines Trehalulose- Sirups, der nach dem Verfahren in Beispiel A-1 erhalten wurde, 5 Gewichtsanteile Pektin und ein Gewichtsanteil Zitronensäure wurden vermischt und die Mischung wurde in einem flachen Kessel aufgekocht und in Gläser gefüllt, um als gewünschtes Produkt eine schmackhafte und schön gefärbte Erdbeermarmelade zu erhalten.
Beispiel B-4
Milchsäure-Getränk
10 Gewichtsanteile fettarmer Milch wurden durch Erhitzen auf 80°C für 20 Minuten sterilisiert, auf 40°C gekühlt, mit 0.3 Gewichtsanteilen eines Startmaterials geimpft und bei etwa 37°C für 10 Stunden vergoren. Danach wurde die vergorene Mischung homogenisiert, mit 4 Gewichtsanteilen eines Trehalulose enthaltenden Saccharid-Pulvers, das nach dem Verfahren in Beispiel A-2 erhalten wurde, einem Gewichtsanteil Saccharose und 2 Gewichtsanteilen eines Isomerzucker-Sirups vermischt und durch Erhitzen auf 70°C sterilisiert. Die so erhaltene Mischung wurde gekühlt, mit einer adäquaten Menge eines Aromastoffes vermischt und in Flaschen gefüllt, um als gewünschtes Produkt ein qualitativ hochwertiges Milchsäure-Getränk zu erhalten, das eine Säure besitzt, die gut mit dem Geschmack und der Süße harmoniert.
Beispiel B-5
Gesüßte Kondensmilch
Zu 100 Gewichtsanteilen frischer Milch wurden 3 Gewichtsanteile eines Sirups mit einem hohen Trehalulose-Gehalt, der nach dem verfahren in Beispiel A-3 erhalten wurde, und ein Gewichtsanteil Saccharose gegeben und die Mischung wurde durch Erhitzen auf einer Heizplatte sterilisiert, zu einem etwa 70%igen Sirup konzentriert und steril abgefüllt, um das gewünschte Produkt zu erhalten. Da das Produkt eine milde Süße und einen milden Geschmack besitzt, kann es wahlweise eingesetzt werden, um Lebensmittel für Kinder, Säfte, Kaffee, Kakao und Tee zu süßen.
Beispiel B-6
Kaugummi
Drei Gewichtsanteile einer Gummibasis wurden unter Erhitzen geschmolzen, um die Konsistenz aufzuweichen, mit 6 Gewichtsanteilen Saccharose, einem Gewichtsanteil eines mit Trehalulose angereicherten Saccharid-Pulvers, das nach dem Verfahren in Beispiel A-4 erhalten wurde, und darüber hinaus mit adäquaten Mengen eines Aroma- und eines Farbstoffes vermischt, auf konventionelle Weise mit einer Rolle geknetet, geformt und verpackt, um als gewünschtes Produkt einen Kaugummi mit einer zufriedenstellenden Konsistenz und einem zufriedenstellendem Geschmack zu erhalten.
Beispiel B-7
Eiermilch-Creme
Einhundert Gewichtsanteile Kornstärke, 100 Gewichtsanteile eines Sirups mit einem hohen Trehalulose-Gehalt, der nach dem Verfahren in Beispiel A-3 erhalten wurde, 80 Gewichtsanteile Maltose, 20 Gewichtsanteile Saccharose und ein Gewichtsanteil Salz wurden ausreichend geknetet und anschließend mit 280 Gewichtsanteilen frischen Eiern vermischt. Eintausend Gewichtsanteile kochender Milch wurden schrittweise zu der Mischung gegeben und es wurde unter Rühren erhitzt, das Erhitzen wurde eingestellt, sobald die Anteile geliert waren und halbtransparent aussahen, die Mischung wurde anschließend gekühlt, mit einer adäquaten Menge eines Vanille-Aromas, abgewogen und abgefüllt, um das gewünschte Produkt zu erhalten, das einen gleichmäßigen Glanz, eine milde Süße und einen zufriedenstellenden Geschmack hat.
Beispiel B-8
Uiro-no-moto (Vormischung für süßes Reisgelee)
Uiro-no-moto wurde durch homogenes Vermischen von 90 Gewichtsanteilen Reispulver mit 20 Gewichtsanteilen Kornstärke, 120 Gewichtsanteilen eines mit Trehalulose angereicherten Saccharid-Pulvers, das nach dem Verfahren in Beispiel A-4 erhalten wurde, und 4 Gewichtsanteilen Pullulan hergestellt. Das Produkt wurde mit einer adäquaten Menge matcha und Wasser vermischt und geknetet und die Mischung wurde in einen Behälter gegeben und für 60 Minuten mit Dampf behandelt, um ein uiro zu erhalten. Das uiro besitzt eine gute Bissqualität, einen zufriedenstellenden Geschmack und eine relativ lange Haltbarkeit, da die Rückbildung von Stärke wirkungsvoll unterdrückt wird.
Beispiel B-9
Feste Zusammensetzung für Intubationsnahrung
Eine feste Zusammensetzung wurde durch Vermischen von 500 Gewichtsanteilen eines mit Trehalulose angereicherten Saccharid-Pulvers, das nach dem Verfahren in Beispiel A-4 erhalten wurde, 270 Gewichtsanteilen pulverisiertem Eigelb, 209 Gewichtsanteilen fettarmer Milch, 4.4 Gewichtsanteilen Natriumchlorid, 1.85 Gewichtsanteilen Kaliumchlorid, 4 Gewichtsanteilen Magnesiumsulfat, 0.01 Gewichtsanteilen Thiamin, 0.1 Gewichtsanteilen Natriumascorbat, 0.6 Gewichtsanteilen Vitamin-E-acetat und 0.04 Gewichtsanteilen Nicotinsäureamid hergestellt. Proben der Zusammensetzung zu jeweils 25 g wurden in kleine wasserdichte, laminierte Beutel injiziert, anschließend wurde die Beutel hitzeversiegelt. Ein Beutel mit dieser Zusammensetzung wird vor dem Gebrauch in etwa 150–300 ml Wasser gelöst und den Patienten oral verabreicht oder durch Intubation über die Nasenhöhle, den Magen und den Darm.
Beispiel B-10
Wundsalbe
Zu 500 Gewichtsanteilen eines mit Trehalulose angereicherten Saccharid-Pulvers, das nach dem Verfahren in Beispiel A-4 erhalten wurde, wurden 3 Gewichtsanteile Jod, gelöst in 50 Gewichtsanteilen Methanol, gegeben und anschließend mit 200 Gewichtsanteilen einer 10%igen wässerigen Pullulan-Lösung vermischt, um eine Wundsalbe mit einer zufriedenstellenden Streichfähigkeit und einem zufriedenstellenden Haftvermögen zu erhalten. Die Salbe verkürzt die Heilperiode und heilt die verletzte Hautfläche Oberfläche.
Effekt der Erfindung
Aus dem oben Gesagten ist ersichtlich, dass die Saccharid-Verbindungen, die Trehalulose enthalten, die dadurch erhalten wurde, dass man ein Maltose/Trehalose umwandelndes Enzym auf eine wässerige Saccharose-Lösung einwirken lässt, mit einer relativ hohen Ausbeute an Trehalulose aus Saccharose hergestellt und leicht abgetrennt und gereinigt werden können. Trehalulose ist ein aus Glucose und Fructose bestehendes reduzierendes Disaccharid und besitzt eine hohe Qualität und eine milde Süße. Die Saccharid-Verbindungen können Menschen oral und parenteral verabreicht werden und werden vom lebenden Organismus leicht aufgenommen, ohne Gefahr, Toxizität oder Nebenwirkungen hervorzurufen.
Die erfindungsgemäßen Saccharid-Verbindungen, die Trehalulose in flüssiger Form oder als Pulver enthalten, sind leicht zu handhaben und haben die folgenden Eigenschaften: die Fähigkeit zur Kontrolle der Osmose, die Fähigkeit zum Einsatz als Füllstoff, die Fähigkeit Glanz zu verleihen, die Fähigkeit zur Feuchtigkeitsaufnahme, die Fähigkeit zur Einstellung der Viskosität, die Fähigkeit zur Unterdrückung der Kristallisation sowie die unbedeutende Fermentierbarkeit. Diese Eigenschaften können vorteilhaft genutzt werden in Verbindungen, wie z. B. einem Süßstoff, einem Mittel zur Geschmacksverbesserung, einem Mittel zur Qualitätsverbesserung oder einem Stabilisator. Somit besitzt die Einführung der erfindungsgemäßen Saccharid-Verbindungen, ihre Herstellung und ihre Verwendung eine große Bedeutung für die Lebensmittel-, Kosmetik- und Arzneimittelindustrie.
Während hier beschrieben wurde, was aus heutiger Sicht die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind, versteht es sich von selbst, dass gleichzeitig unterschiedliche Modifikationen, die dabei vorgenommen werden können, zur Verfügung gestellt werden und unter den Umfang der Ansprüche fallen.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Trehalulose enthaltenden Saccharid-Verbindung, welches die Schritte umfasst, ein Maltose/Trehalose umwandelndes Enzym auf eine Saccharose-Lösung einwirken zu lassen, um die besagte Trehalulose herzustellen, sowie die resultierende, Trehalulose enthaltende Mischung aufzufangen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei man mindestens 10 Einheiten pro g des besagten Maltose/Trehalose umwandelnden Enzyms, bezogen auf den trockenen Feststoff, auf die besagte Saccharose-Lösung einwirken lässt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Konzentration der besagten Saccharose-Lösung mindestens 0.1 wt.-% beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei man das besagte Enzym auf die besagte Saccharose-Lösung in einer Menge von etwa 10–1.000 Einheiten pro g Saccharose, bezogen auf eine trockene feste Basis, bei einer Temperatur unterhalb von etwa 80°C und einem pH von etwa 5.5–9.0 für etwa 0.1–200 Stunden einwirken lässt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Maltose/Trehalose umwandelnde Enzym aus einem Mikroorganismus erhalten wird.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der besagte Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe der Mikroorganismen der Stämme Pimelobacter, Pseudomonas und Thermus.
Verfahren gemäß Anspruch 1, welches zusätzlich die Schritte umfasst, eine Invertase auf die aufgefangene, Trehalulose enthaltende Mischung einwirken zu lassen und die resultierende Mischung einer Säulenchromatographie unter Einsatz eines stark sauren Kationenaustauscherharzes zu unterziehen, um den Trehalulose-Anteil zu erhöhen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die besagte Saccharid-Verbindung aus Trehalulose und einem oder mehreren Sacchariden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fructose, Glucose, Saccharose, Turanose und Palatinose, besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei der Anteil der besagten Trehalulose mindestens 10 wt.-%, berechnet auf trockner und fester Basis, und der Anteil des besagten einen oder der besagten mehreren Saccharide höchstens 90 wt.-%, berechnet auf trockner und fester Basis, beträgt.
Verfahren zur Herstellung eines Lebensmittelproduktes, kosmetisch einsetzbaren Produktes oder pharmazeutisch einsetzbaren Produktes, welches einen Schritt umfasst, die durch das Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9 erhaltene Saccharid-Verbindung in einen Rohstoff für Lebensmittel, einen kosmetisch verwendbaren oder einen pharmazeutisch verwendbaren Rohstoff einzulagern.