DE69735123T2

DE69735123T2 - Trehalose phosphorylase, deren Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE69735123T2
Application number: DE69735123T
Authority: DE
Inventors: Tetsuya Okayama-shi Nakada; Michio Okayama-shi Kubota; Hiroto Okayama-shi Chaen; Toshio Okayama-shi Miyake
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1996-11-08
Filing date: 1997-11-07
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2017-11-08
Also published as: US5843748A; US5910436A; US5876975A; EP0841397A3; EP0841397B1; TW565611B; DE69735123D1; EP0841397A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Trehalosephosphorylase, ihre Herstellung und Verwendungen, genauer eine neue Trehalosephosphorylase, die Trehalose in der Gegenwart einer anorganischen Phosphorsäure und/oder ihrem Salz (hier nachstehend als „anorganische Phosphorsäure" überall in der vorliegenden Beschreibung abgekürzt, wenn nicht irgendeine Schwierigkeit auftritt) hydrolysiert, um D-Glucose und β-D-Glucose-1-Phosphorsäure und/oder ihr Salz (hier nachstehend als „β-D-Glucose-1-Phosphorsäure" überall in der vorliegenden Beschreibung abgekürzt, wenn nicht irgendeine Schwierigkeit auftritt) zu bilden, und die umgekehrt Trehalose und anorganische Phosphorsäure aus β-D-Glucose-1-Phosphorsäure und D-Glucose bildet, und die Verfahren der Trehalosephosphorylase, Saccharid-Zusammensetzungen, die Glucosyl-transferierte Saccharide enthalten, welche unter Verwendung der Trehalosephosphorylase hergestellt wurden, und Zusammensetzungen, die die Saccharid-Zusammensetzungen enthalten.
Vor kurzem wurden Oligosaccharide wie Maltose und Trehalose und Funktionen davon hervorgehoben und wurden im Hinblick auf verschiedene Aspekte auf ihre einmaligen und unterschiedlichen Vorgänge untersucht. Es ist bekannt, dass Phosphorylasen, wie Maltose-, Trehalose-, Saccharose-, Trehalose-, und Cellobiosephosphorylasen als Methoden zur Herstellung der vorstehenden Oligosaccharide verwendet werden können.
L.R. Maréchal et al. berichteten in „The Journal of Biological Chemistry", Bd. 247, Nr. 10, S. 3.223-3.228 (1972), dass Euglena gracilis intrazellulär Trehalosephosphorylase herstellt; und S. Murao et al. berichteten in „Agriculture and Biological Chemistry", Bd. 49, Nr. 7, S. 2.113-2.118 (1985) die Eigenschaften des Enzyms. K. Aisaka et al. offenbarten im Japanischen Patent (Kokai) Nr. 59,584/95 eine bakterielle Trehalosephosphorylase, die durch einen Mikroorga nismus der Art Catellatospora ferruginea und einen der Art Kineosporia aurantiaca hergestellt wird. H. Kizawa et al. berichteten in „Bioscience, Biotechnology and Biochemistry", Bd. 59, Nr. 10, S. 1.908-1.912 (1995), dass ein Mikroorganismus der Art Micrococcus varians ein solches Enzym herstellt, und M. Yoshida et al. berichteten in „Oyo-Toshitsu-Kagaku", Bd. 42, Nr. 1, S. 19-25 (1995), dass ein Mikroorganismus der Art Plesiomonas sp. SH-35 Trehalosephosphorylase herstellt. Unter diesen Trehalosephosphorylasen weisen die Enzyme der Mikroorganismen der Arten Micrococcus varians, Euglena gracilis und Plesiomaonas sp. niedrigere thermische Stabilitäten von weniger als 30, 40 bzw. 45°C auf, was sowohl in einer relativ niedrigen Reaktionseffizienz bei einer Herstellung im Industriemaßstab als auch in einer bakteriellen Verunreinigung während einer enzymatischen Reaktion resultiert.
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Trehalosephosphorylase mit einer industriell vorteilhaften Thermostabilität, ein Verfahren davon, Saccharid-Zusammensetzungen, die die Glucosyl-transferierten Saccharide enthalten, welche unter Verwendung des Enzyms hergestellt wurden, und Verwendungen davon bereit.
Um die vorstehende Aufgabe zu lösen und um eine unbekannte Trehalosephosphorylase mit einer zufriedenstellenden Thermostabilität zu erhalten, musterten die Erfinder in umfangreicher Weise Mikroorganismen durch, die ein solches Enzym herstellen. Als ein Ergebnis fanden sie, dass Thermoanaerobium brockii, ATCC 35047, welcher der Gattung Thermoanaerobium angehört, eine neue Trehalosephosphorylase herstellt, und etablierten die Herstellung. Sie etablierten auch eine Saccharid-Zusammensetzung, die Glucosyl-transferierte Saccharide enthält, welche durch Inkontaktbringen des Enzyms mit β-D-Glucose-1-Phosphorsäure als ein Sacchariddonor in der Gegenwart von Sacchariden hergestellt werden, und Zusammensetzungen, die die Saccharid-Zusammensetzung enthält. So erreichten sie diese Erfindung.
Die vorliegende Erfindung wird nun lediglich beispielhaft mit Bezug auf die angefügten Zeichnungen beschrieben, wobei:
1 den Einfluss der Temperaturen auf die Aktivität der Trehalosephosphorylase gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
2 den Einfluss der pHs auf die Aktivität der Trehalosephosphorylase gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
3 den Einfluss der Temperaturen auf die Stabilität der Trehalosephosphorylase gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
4 den Einfluss der pHs auf die Stabilität der Trehalosephosphorylase gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
5 eine Restriktionskarte der vorliegenden rekombinanten DNS ist. In der Figur zeigt ein Pfeil eine DNS, die die vorliegende Trehalosephosphorylase codiert.
Die Trehalosephosphorylase gemäß der vorliegenden Erfindung schließt Enzyme ein, die von Mikroorganismen der Gattung Thermoanaerobium erhältlich sind und die Trehalose in der Gegenwart einer anorganischen Phosphorsäure hydrolysieren, um D-Glucose und β-D-Glucose-1-Phosphorsäure zu bilden. Die Trehalosephosphorylase kann die folgenden Wirkungen und physikochemischen Eigenschaften aufweisen:

(1) Wirkung
(a) Hydrolysieren von Trehalose in der Gegenwart einer anorganischen Phosphorsäure, um D-Glucose und β-D-Glucose-1-Phosphorsäure zu bilden;
(b) Bilden von Trehalose und einer anorganischen Phosphorsäure aus D-Glucose und β-D-Glucose-1-Phosphorsäure und Katalysieren der Übertragungsreaktion einer Glucosylgruppe auf andere Sac charide unter Nutzung von β-D-Glucose-1-Phosphorsäure als einen Sacchariddonor;
(2) Molekulargewicht 88.000 ± 5.000 Dalton nach SDS-PAGE;
(3) Isoelektrischer Punkt pl 5,4 ± 0,5 nach Elektrophorese unter Verwendung eines Ampholyten;
(4) Optimale Temperatur Ca. 70°C bei Inkubation bei pH 7.0 für 30 min;
(5) Optimaler pH Ca. 7.0 bis 7.5 bei Inkubation bei 60°C für 30 min;
(6) Thermische Stabilität Stabil bis zu einer Temperatur von ca. 60°C bei Inkubation bei pH 7.0 für eine Stunde;
(7) pH-Stabilität Stabil bei pHs von ca. 6.0 bis 9.0 bei Inkubation bei 4°C für 24 Stunden;
(8) Aktivierung und Stabilisierung Aktiviert durch ein mM Dithiothreitol; und
(9) Aktivitätsinhibierung Inhibiert durch ein mM Cu⁺⁺, Pb⁺⁺, Zn⁺⁺, Ng⁺⁺, Mg⁺⁺ oder Mn⁺⁺.

Die Trehalosephosphorylase kann die Aminosäuresequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3 als eine Aminosäureteilsequenz aufweisen und kann insgesamt die Aminosäuresequenz SEQ ID No. 4 haben. Es können, wenn ein isolierter Mikroorganismus vorliegt, der ein gewünschtes Protein herstellt, auf diesem Fachgebiet funktionelle Äquivalente des Proteins einfach durch Behandeln des Mikroorganismus mit einem geeigneten Mutagen erhalten werden, oder wenn eine DNS vorliegt, die ein gewünschtes Protein codiert, können funktionelle Äquivalente des Proteins im Allgemeinen einfach durch Anwenden von rekombinanter DNS-Technologie auf die DNS erhalten werden. Die vorliegende Trehalosephosphorylase schließt natürlich solche funktionellen Äquivalente ein. Die Formulierung „funktionelle Äquivalente" bedeutet Proteine, die noch im Wesentlichen die gleiche Aktivität der Trehalosephosphorylase aufweisen und die die Aminosäuresequenz des Enzyms aufweisen, wobei eine oder mehrere Aminosäuren mit davon verschiedenen ersetzt sind, eine oder mehrere Aminosäuren entweder an den N- und/oder C-Termini ergänzt sind oder in die innere Aminosäuresequenz eingebracht sind, eine oder mehrere Aminosäuren in den N- und/oder C-terminalen Bereichen gelöscht sind, und eine oder mehrere Aminosäuren in der inneren Aminosäuresequenz gelöscht sind. Die vorliegende Trehalosephosphorylase, wie vorstehend erwähnt, kann zufriedenstellend durch Abtrennen davon von natürlichen Ressourcen wie Kulturen von Mikroorganismen, die das Enzym herstellen, Mutanten davon, die durch Behandeln mit Mutagenen erhalten werden, und künstlich Synthetisieren des Enzyms durch Verwenden von rekombinanten DNS- und Peptidsynthesetechnologien erhalten werden.
Die DNS gemäß der vorliegenden Erfindung schließt alle vorstehenden DNSs ein, die die vorliegende Trehalosephosphorylase codieren. Beispiele von solchen DNSs sind jene, die die Aminosäuresequenz SEQ ID No. 4 enthalten und die Nucleotidsequenz SEQ ID No. 5 codieren, und funktionelle Äquivalente davon. Die Formulierung „funktionelle Äquivalente" bedeutet DNSs, die Proteine codieren, die im Wesentlichen die gleiche Aktivität wie die Trehalosephosphorylase haben und die die Nucleotidsequenz SEQ ID No. 5 aufweisen, wobei eine oder mehrere Basen mit davon verschiedenen ersetzt sind. Zusätzlich zu den vorstehenden DNSs schließt die vorliegende DNS andere DNSs ein, wobei die 5'- und/oder 3'-Termini an eine oder mehrere DNSs, die unterschiedlich sind zu den vorstehenden DNSs, wie Startcodoninitiatoren, Stopcodons, Shine-Dalgarno-Sequenz, Signalpeptide codierende Nucleotidsequenzen, Erkennungssequenzen durch geeignete Restriktionsenzyme, Promotoren, Enhancersequenzen und Terminationssequenzen, gebunden sind.
Die Ressourcen und Herstellungen von diesen DNSs sind in der vorliegenden Erfindung nicht speziell eingeschränkt. Zum Beispiel können Mikroorganismen der Gattung Thermoanaerobium, einschließlich Thermoanaerobium brockii, ATCC 35047, als natürliche Ressourcen der DNSs erwähnt werden. DNSs, die die vorliegende DNS enthalten, können durch Abnehmen von DNS-Fraktionen aus den Zelltrümmern von kultivierten Mikroorganismen erhalten werden. Die abgenommenen DNSs können per se in der vorliegenden Erfindung verwendet werden und sie können durch Einführen eines Fragments, welches die vorliegende DNS enthält, in einen selbstreplizierenden Vektor zu einer sehr günstigen rekombinanten DNS zubereitet werden. Die rekombinante DNS kann im Allgemeinen durch Anwenden der rekombinanten DNS-Technologie im Allgemeinen auf die vorstehende DNS, wobei eine Genbibliothek erhalten wird, und Verwenden einer Auswahlmethode wie eine Hybridisierungsmethode zum Auswählen der gewünschten rekombinanten DNS aus der Genbibliothek, bezogen auf die Nucleotidsequenz, die die vorliegende Trehalosephosphorylase codiert, wie SEQ ID No. 5, erhalten werden. Die so erhaltene rekombinante DNS kann amplifiziert werden durch kultivierte Transformante, die durch Einführen in geeignete Wirte wie Mikroorganismen der Gattung Escherichia erhalten werden, gefolgt von Anwenden der Alkali-SDS-Methode im Allgemeinen auf die Kulturen, wobei die vorliegende DNS in einer gewünschten Menge einfach erhalten wird. Die vorliegende DNS kann einfach durch Verwenden der PCR-Methode in einer herkömmlichen Weise unter Verwendung der aufgebrochenen Zellen der vorstehenden Mikroorganismen oder der DNS, die von den Zellen abgenommen wird, als ein Templat und unter Verwendung einer DNS, die basierend auf SEQ ID No. 5 chemisch synthetisiert wurde, als ein Primer oder durch chemisch Synthetisieren einer DNS, die die SEQ ID No. 5 enthält, erhalten werden. Die vorstehenden funktionellen Äquivalente der vorliegenden DNS können zum Beispiel erhalten werden durch Anwenden der ortsspezifischen Mutagenese auf die vorstehende rekombinante DNS oder durch Verwenden der PCR-Methode unter Verwendung von sowohl der rekombinanten DNS als ein Templat als auch einer chemisch synthetisierten DNS, die eine Nucleotidsequenz enthält, die in die gewünschte Nucleotidsequenz umgewandelt wurde, als ein Primer.
Die vorliegende DNS schließt jene in der Form einer rekombinanten DNS, die in einen selbstreplizierenden Vektor eingeführt ist, ein. Wie vorstehend beschrieben, sind diese rekombinanten DNSs bei der Herstellung der vorliegenden DNS sehr nützlich und sind auch bei der Herstellung der vorliegenden Trehalosephosphorylase nützlich. Nachdem die gewünschte DNS wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, können jene rekombinanten DNSs relativ einfach durch Verwenden der rekombinanten DNS-Technologie im Allgemeinen durch Einbringen der DNS in einen geeigneten Vektor erhalten werden. Beispiele von einem solchen Vektor sind jene, die eine Replikationseigenschaft in geeigneten Wirten aufweisen. Die folgenden Vektoren können in der vorliegenden Erfindung beliebig verwendet werden: pUC18, Bluescript^® II SK(+), pKK223-3 und λgt·λC, die Mikroorganismen der Gattung Escherichia als Wirte erfordern; pUB110, pTZ4, pC194, pII, Φ1 und Φ105, die Mikroorganismen der Gattung Bacillus als Wirte erfordern; und pHY300PLK, pHV14, TRp7, YEp7 und pBS7, die mindestens zwei Wirttypen erfordern. Bezugnehmend auf ein Beispiel einer Methode zur Einbringung der vorliegenden DNS in die Vektoren werden ein geeigneter Vektor und entweder die so erhaltene vorliegende DNS oder eine DNS, die die vorliegende DNS enthält, mit einem Restriktionsenzym gespalten und die gebildeten DNS-Fragmente und Vektorfragmente werden ligiert. Beispiele von einem solchen Restriktionsenzym, das geeigneterweise verwendet wird, sind Acc I, Alu I, Bam HI, Bgl II, Bst XI, Eco RI, Hind III, Not I, Pst I, Sac I, Sal I, Sma I, Spe I, Xba I und Xho I. Im Falle des Ligierens der DNS- und Vektorfragmente können zum Beispiel chemisch synthetisierte DNSs mit geeigneten Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme verwendet werden. Um die DNSs mit anderen zu ligieren, werden sie mit DNS-Ligasen intra- und extrazellulär nach dem Aufschmelzen in Kontakt gebracht.
Die vorliegende DNS schließt jene in der Form eines Transformanten, in welchen die DNS eingeführt ist, ein. Ein solcher Transformant ist sehr nützlich, um die vorliegende Trehalosephosphorylase und DNS zu erhalten. Zum Beispiel können Mikroorganismen der Gattungen Escherichia und Bacillus, Aktinomyzeten und Hefen beliebig als Wirtmikroorganismen für den Transformanten verwendet werden. Der Transformant kann normalerweise durch Einführen der vorstehend erwähnten rekombinanten DNS in einen geeigneten Wirt erhalten werden; wenn ein Mikroorganismus der Gattung Escherichia verwendet wird, werden der Mikroorganismus und die rekombinante DNS in der Gegenwart von Calciumionen kultiviert, während die Methode der funktionsfähigen Zellen und die Protoplasten-Methode verwendet werden, wenn ein Mikroorganismus der Gattung Bacillus verwendet wird. Die vorstehend erwähnten Methoden zur Herstellung der vorliegenden DNS sind selbst herkömmliche Methoden, die auf dem Fachgebiet verwendet werden, wie sie zum Beispiel von J. Sumbruck et al. in „Molecular Cloning A Laboratory Manual", 2. Ausgabe, veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) beschrieben werden.
Das vorliegende Verfahren zur Herstellung von Trehalosephosphorylase ist dadurch gekennzeichnet, dass es Kultivieren von Mikroorganismen, die das vorliegende Enzym herstellen, und Abnehmen des hergestellten Enzyms aus den Kulturen umfasst. Die Gattung und Art von solchen Mikroorganismen und die Kultivierungsmethoden, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind nicht speziell eingeschränkt. Beispiele von solchen Mikroorganismen schließen jene ein, die zur Gattung Thermoanaerobium, bevorzugt Thermoanaerobium brockii, ATCC 35047, gehören und Transformanten, die durch Einführen der vorliegenden DNS in geeignete Wirtmikroorganismen erhalten werden.
Jedwede natürlichen und synthetischen Nährmedien können zur Kultivierung der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismen verwendet werden, solange die Mikroorganismen darin wachsen können und das vorliegende Enzym herstellen. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Kohlenstoffquellen sind jene, die von den Mikroorganismen verwendet werden können; zum Beispiel Saccharide wie Maltose, Trehalose, Dextrine und Stärken, und natürliche Substanzen, die Saccharide enthalten, wie Melassen und Hefeextrakte können verwendet werden. Die Konzentration dieser Kohlenstoffquellen, die in den Kulturmedien enthalten sind, wird abhängig von ihren Typen gewählt. Zum Beispiel sind bevorzugte Saccharid-Konzentrationen nicht höher als 20 w/v % und hinsichtlich des Wachstums und der Proliferation der Mikroorganismen nicht höher als 5 w/v %. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Stickstoffquellen sind zum Beispiel anorganische Stickstoff enthaltende Verbindungen wie Ammoniumsalze und Nitrate und organische Stickstoff enthaltende Verbindungen wie Harnstoff, Cornsteep-Lösung, Casein, Pepton, Hefeextrakt und Fleischextrakt. Wenn notwendig, können anorganische Verbindungen, zum Beispiel Salze von Calcium, Magnesium, Kalium, Natrium, Phosphorsäure, Mangan, Zink, Eisen, Kupfer, Molybdän und Kobalt in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die Mikroorganismen werden anaerob unter den Bedingungen kultiviert, die aus Temperaturen von 50 bis 80°C, bevorzugt 60 bis 70°C, und pHs von 5 bis 8, bevorzugt 6.5 bis 7.5, ausgewählt sind. Jede Kultivierungszeit kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, solange sie für das Wachstum der Mikroorganismen ausreichend ist, bevorzugt 10 bis 50 Stunden. Für die Kultur der vorstehenden Transformanten werden sie im Allgemeinen bei Temperaturen von 20 bis 65°C und pH-Werten von 2 bis 9 für ca. 1 bis 6 Tage unter aeroben Bedingungen durch eine Belüftungs-Bewegungs-Methode kultiviert.
Nach dem Kultivieren der Mikroorganismen kann das vorliegende Enzym aus den Kulturen abgenommen werden. Da die Enzymaktivität im Allgemeinen intrazellulär vorhanden sein kann, können intakte und verarbeitete Zellen als Rohenzyme erhalten werden. Ganze Kulturen können auch als Rohenzyme verwendet werden. Herkömmliche fest-flüssig-Trennmethoden können zur Trennung von Zellen und Nährmedien verwendet werden; zum Beispiel können Methoden, wobei die Kulturen direkt zentrifugiert werden, jene, wobei die Kulturen nach Zugeben von Filtrierhilfsmitteln zu den Kulturen oder nach Vorbeschichten filtriert werden, und jene, wobei die Kulturen unter Verwendung von Membranen wie Rundfiltern und Hohlfasern filtriert werden, verwendet werden. Die intakten und verarbeiteten Zellen können per se als Rohenzyme verwendet werden und gegebenenfalls können sie zu teilweise gereinigten Enzymen zubereitet werden.
Die Typen der verarbeiteten Zellen schließen Proteinfraktionen von Zellen, immobilisierte Zubereitungen von intakten und verarbeiteten Zellen und Zellen, die getrocknet, lyophilisiert und mit grenzflächenaktiven Mitteln, Enzymen, Ultraschall, mechanischem Mahlen und mechanischem Druck behandelt wurden, ein. Das vorliegende Enzym kann in einer rohen oder gereinigten Form verwendet werden und die verarbeiteten Zellen können normalerweise weiter mit herkömmlichen Methoden behandelt werden, die zur Reinigung von Enzymen verwendet werden, zum Beispiel Aussalzen unter Verwendung von Ammoniumsulfat, Sedimentation unter Verwendung von Aceton und Alkohol und Membraneinengung/Dialyse unter Verwendung von glatten Membranen und Hohlfasern.
Die intakten und verarbeiteten Zellen können durch herkömmliche Methoden immobilisiert werden; zum Beispiel durch Bindungsmethoden mit Ionenaustauschern, kovalente Bindungs-/Adsorptions-Methoden mit Harzen und Membranen und Einschlussmethoden unter Verwendung von hochmolekularen Substanzen.
Die Rohenzyme können intakt verwendet werden oder können durch herkömmliche Reinigungsmethoden gereinigt werden. Zum Beispiel werden die verarbeiteten Zellen zu Rohenzymen unter Verwendung von Ammoniumsulfat ausgesalzt, gefolgt von Dialysieren der Enzyme und Behandeln von ihnen aufeinanderfolgend mit Anionenaustausch-Säulenchromatographie unter Verwendung von „DEAE-TOYOPEARL^®", ein Kationenaustauscher, der kommerziell von Tosoh Corporation, Tokio, Japan vertrieben wird, Anionenaustausch-Säulenchromatographie unter Verwendung von „CM-TOYOPEARL^®", ein Harz, das kommerziell von Tosoh Corporation vertrieben wird, einer hydrophoben Säulenchromatographie unter Verwendung von „BUTYL-TOYOPEARL^®", ein hydrophobes Harz, das kommerziell von Tosoh Corporation, Tokio, Japan vertrieben wird, und Gelfiltrations-Säulenchromatographie unter Verwendung von „ULTROGEL^® AcA44 RESIN", ein Gel für Gelfiltrations-Säulenchromatographie, das kommerziell von Sepracor/IBF s.a. Villeneuve Ia Garenne, Frankreich, vertrieben wird, wobei elektrophoretisch eine einzelne Enzymproteinbande erhalten wird.
Die vorliegende Trehalosephosphorylaseaktivität wird wie folgt getestet: Zugeben von 0,2 ml einer Enzymlösung zu 2 ml 20 mM Phosphat-Puffer (pH 7.0), der 1,0 w/v % Trehalose als ein Substrat enthält, inkubieren der Lösung bei 60°C für 30 min, nehmen einer Probe des Reaktionsgemisches in einer Menge von 0,5 ml und inkubieren der Probe bei 100°C für 10 min, um die enzymatische Reaktion abzustoppen. Zugeben von 0,5 ml D-Glucose-Oxidase/Peroxidase-Reagenz zu der erwärmten Probe, rühren des Gemisches, halten des Gemisches für 30 min bei 40°C, zugeben von 2,5 ml 5 N Salzsäure, rühren des resultierenden Gemisches und messen der Extinktion des Gemisches bei einer Wellenlänge von 525 nm. Eine Einheit der Enzymaktivität ist als das Enzym definiert, das ein μmol D-Glucose pro eine Minute bildet. Die Aktivität von Maltose- und Kojibiosephosphorylasen kann in einer ähnlichen Weise wie der gleiche Test wie vorstehend angegeben getestet werden, außer, dass die Trehalose als ein Substrat jeweils mit Maltose und Kojibiose ersetzt wird.
Bei der vorliegenden enzymatischen Reaktion unter Verwendung der Trehalosephosphorylase zur Herstellung von Saccharid-Zusammensetzungen, die Glucosyl-transferierte Saccharide enthalten, kann es im Allgemeinen erlaubt sein, dass das Enzym mit β-D-Glucose-1-Phosphorsäure als ein Sacchariddonor zusammen mit anderen geeigneten Sacchariden als Akzeptoren, zum Beispiel Monosacchariden wie D-Xylose, D-Galactose, G-Glucose, D-Fucose und L-Fucose, in Kontakt gebracht wird, um eine Glucosylgruppe auf die vorstehenden reduzierenden Saccharide zu übertragen, was in der Bildung von Glucosyl-D-xylosid, Glucosyl-D-galactosid, Trehalose, Glucosyl-D-fucosid bzw. Glucosyl-L-fucosid resultiert.
Kommerziell erhältliche β-D-Glucose-1-Phosphorsäure als ein Reagenz kann intakt als ein Sacchariddonor in der vorliegenden Erfindung verwendet werden und sie kann durch Inkontaktbringen einer geeigneten Phosphorylase mit einem Saccharid als ein Substrat in der Gegenwart einer anorganischen Phosphorsäure und/oder ihres Salzes hergestellt werden; zum Beispiel kann sie in der Gegenwart einer anorganischen Phosphorsäure und/oder ihres Salzes durch Inkontaktbringen der Trehalosephosphorylase mit Trehalose, Inkontaktbringen von Maltose mit Maltosephosphorylase oder Inkontaktbringen von Kojibiose mit Kojibiosephosphorylase hergestellt werden. Wenn eine der vorstehenden Reaktionen der Phosphorylasen, die β-D-Glucose-1-Phosphorsäure bilden, im selben Reaktionssystem unter Verwendung der vorliegenden Trehalosephosphorylase zur Bildung von Glucosyl-transferierten Sacchariden durchgeführt wird, kann sie direkt β-D-Glucose-1-Phosphorsäure in dem System bereitstellen, was in einer Verringerung der Herstellungskosten und einer Ver einfachung der Herstellungsschritte als vorteilhafte Merkmale resultiert. Die anorganische Phosphorsäure, wie vorstehend erwähnt, schließt Orthophosphorsäure und kondensierte Phosphorsäure ein und normalerweise wird die erstgenannte Säure bevorzugt verwendet. Das Salz der anorganischen Phosphorsäure schließt im Allgemeinen Verbindungen von Phosphor enthaltenden Ionen, die von der vorstehenden anorganischen Phosphorsäure abgeleitet sind, ein und normalerweise werden bevorzugt hoch wasserlösliche Natrium- und Kaliumsalze von Phosphorsäure verwendet.
Zum Beispiel kann das vorliegende Enzym als die vorstehende Trehalosephosphorylase verwendet werden und kommerziell erhältliche bakterielle Maltosephosphorylasen können als solche verwendet werden. Für die Kojibiosephosphorylase kann das Enzym verwendet werden, das in der Japanischen Patentanmeldung Nr. 311,235/96, angemeldet durch den selben Anmelder wie die vorliegende Erfindung, mit dem Titel „Kojibiose phosphorylase, its preparation and uses" offenbart wird. Genauere Beschreibungen sind in der Beschreibung; zum Beispiel wurde für den Mikroorganismus eine Impfkultur von Thermoanaerobium brockii, ATCC 35047, in das Nährmedium überimpft, wie in „ATCC Cafalogue of BACTERIA AND BACTERIOPHAGES", 18. Ausgabe, S. 452-456 (1992) beschrieben, und in dem Medium bei 65°C unter anaeroben Bedingungen kultiviert, gefolgt von Zentrifugieren der Kultur, Aufbrechen der Zellen mit Ultraschall und Abnehmen des resultierenden Überstandes, wobei die gewünschte Fraktion mit Kojibiosephosphorylaseaktivität erhalten wurde.
Die Substratkonzentration, die bei der Bildungsreaktion von Glucosyltransferiertem Saccharid unter Verwendung der vorliegenden Trehalosephosphorylase verwendet wird, ist nicht speziell eingeschränkt. Im Allgemeinen werden bevorzugt Lösungen verwendet, die 1 bis 20 w/w % (die Formulierung „w/w %" wird überall in der Beschreibung als „%" abgekürzt, wenn nichts anderes angegeben ist) β-D-Glucose-1-Phosphorsäure als einen Sacchariddo nor und 1 bis 20 % eines Akzeptors enthalten. Wenn wie vorstehend beschrieben die Bildungsreaktion von β-D-Glucose-1-Phosphorsäure durch die Wirkung einer geeigneten Phosphorylase im selben Reaktionssystem der vorstehenden Bildungsreaktion von Glucosyl-transferiertem Saccharid durchgeführt wird, ist das Folgende empfehlenswert: Wenn Trehalosephosphorylase mit ihren Substraten in Kontakt gebracht wird, werden ca. 1 bis 20 %ige Trehalose-Lösungen anstelle von β-D-Glucose-1-Phosphorsäure als ein Substrat der Glucosyltransferierenden Reaktion in der Gegenwart von ca. 0,5 bis 20 mM Phosphaten wie Natriumdihydrogenphosphat verwendet. Wenn andere Phosphorylasen mit ihren Substraten in Kontakt gebracht werden, können ca. 1 bis 20 % Maltose oder Kojibiose zusammen mit ca. 0,5 bis 20 mM Phosphaten wie Natriumdihydrogenphosphat anstelle der β-D-Glucose-1-Phosphorsäure als ein Substrat für die Glucosyl-transferierende Reaktion gemeinsam vorliegen. Abhängig vom Typ der verwendeten Saccharide können entweder Maltose- oder Kojibiosephosphorylase bevorzugt in einer Menge von ca. 0,1 bis 50 Einheiten/g Saccharid, bezogen auf eine Trockenfeststoffbasis (Tfb.), gemeinsam vorliegen.
Die vorstehende Reaktion kann bei Temperaturen durchgeführt werden, die die in der Gegenwart der Substrate verwendeten Enzyme nicht inaktivieren, d.h. bis zu ca. 70°C, bevorzugt ca. 15 bis 65°C. Der Reaktions-pH kann normalerweise auf pH-Werte von ca. 4.0 bis 9.0, bevorzugt ca. 5.0 bis 7.5 eingestellt werden. Die Reaktionszeit kann geeigneter Weise abhängig von den enzymatischen Reaktionsgeschwindigkeiten gewählt werden, wobei sie normalerweise 0,1 bis 100 Stunden beträgt, wenn die Enzyme normalerweise in einer Menge von ca. 0,1 bis 50 Einheiten/g Substrat, Tfb., verwendet werden. Wenn wie vorstehend beschrieben die Bildungsreaktion von β-D-Glucose-1-Phosphorsäure durch die Wirkung von verschiedenen Phosphorylasen im selben Reaktionssystem der Bildungsreaktion des Glucosyl-transferierten Saccharids durchgeführt wird, werden die Reaktionstemperaturen und pH-Werte bevorzugt auf diejenigen Werte eingestellt, die abhängig von ihren thermischen Stabilitäten die verwendeten Phosphorylasen nicht inaktivieren.
Folglich enthalten die resultierenden Reaktionsgemische Glucosyltransferierte Saccharide, die den als Substrate verwendeten Sacchariden entsprechen. Die Ausbeuten der Glucosyl-transferierten Saccharide variieren abhängig von den Substratkonzentrationen, Substrattypen und Reaktionsbedingungen, die bei den enzymatischen Reaktionen verwendet werden. Zum Beispiel wird im Falle einer Verwendung von 10 % Trehalose und 5 % D-Galactose als Substrate in der Gegenwart einer anorganischen Phosphorsäure Glucosylgalactosid in einer Ausbeute von ca. 30 % gebildet. Überall in der Beschreibung bedeuten die Ausbeuten der Glucosyl-transferierten Saccharide ihre Prozentanteile (%) der gebildeten Saccharide in Bezug auf die gesamten Saccharide in den Reaktionsgemischen, Tfb.
Um den Gehalt der Glucosyl-transferierten Saccharide in den Reaktionsgemischen auf den höchstmöglichen Level zu erhöhen, können Enzymquellen, die die in den Reaktionsgemischen gebildete D-Glucose zersetzen und entfernen, vorteilhafter Weise in den Gemischen gemeinsam vorliegen, um die Saccharid-Übertragungsreaktionen zu fördern. Eine solche Technik kann zufriedenstellend zur Zersetzung und Entfernung von D-Glucose als ein Nebenprodukt, das während der Reaktionsvorgänge gebildet wird, und zur Förderung der Saccharid-Übertragungsreaktion verwendet werden, wenn die vorstehende Bildungsreaktion von β-D-Glucose-1-Phosphorsäure unter Verwendung einer geeigneten Phosphorylase im selben Reaktionssystem der Glucosyl-Übertragungsreaktion durchgeführt wird, um direkt Sacchariddonoren bereit zu stellen.
Die Enzymquellen sind Mikroorganismen, die eine D-Glucose-Zersetzungsaktivität aufweisen, Kulturen von solchen Mikroorganismen, ihre intakten und verarbeiteten Zellen und Enzyme mit einer D-Glucose-Zersetzungsaktivität. Jedwede Mikroorganismen können verwendet werden, solange sie eine relative hohe D-Glucose-Zersetzungsaktivität aufweisen, aber keine oder im Wesentlichen keine Aktivität zur Zersetzung der gebildeten transferierten Saccharide aufweisen; bevorzugte Enzymquellen sind Hefen. Jedwede Enzyme wie Glucoseoxidase, Catalase, Pyranoseoxidase, Glucosedehydrogenase, Glucokinase und Hexokinase können verwendet werden. Unter diesen Enzymen können die Glucoseoxidase und Catalase bevorzugt verwendet werden.
Die Reaktionsgemische, die die so hergestellten Glucosyl-transferierten Saccharide enthalten, können in einer herkömmlichen Weise filtriert und zentrifugiert werden, um Verunreinigungen zu entfernen, dann Reinigungsschritten wie Entfärbung mit Aktivkohle und Entsalzen mit Ionenaustauschern in H- und OH-Form unterworfen werden und zu sirupartigen Produkten eingeengt werden. Gegebenenfalls können die sirupartigen Produkte beliebig durch Sprühtrocknen, usw. zu pulverförmigen Produkten getrocknet werden.
Die vorliegenden Saccharid-Zusammensetzungen, die die Glucosyltransferierten Saccharide enthalten, können zu Produkten verarbeitet werden, die reich an den Sacchariden sind, indem die Saccharide von den Reaktionsgemischen abgetrennt werden und die resultierenden Gemische gereinigt werden. Beispiele von solchen Trennmethoden sind jene, die Verunreinigungen abtrennen und entfernen; Hefen benutzende Fermentationsmethoden zur Entfernung von Monosacchariden oder Hefefermentationsmethoden und Methoden zum Entfernen von begleitenden Sacchariden wie Membranfiltrationen, Säulenchromatographien und Methoden, die das Einstellen der Reaktionsgemische auf alkalische pH-Werte und Erwärmen der Gemische zur Zersetzung von reduzierenden Sacchariden umfassen. Genauer werden in einem industriellen Maßstab vorteilhafter Weise Methoden zur Entfernung von begleitenden Sac chariden verwendet, um Fraktionen zu sammeln, die reich an den gewünschten Glucosyl-transferierten Sacchariden sind, indem begleitende Saccharide durch Säulenchromatographien unter Verwendung von stark sauren Kationenaustauscherharzen entfernt werden, wie im Japanischen Patent (Kokai) Nr. 23,799/83 und 72,598/83 offenbart. In diesem Fall können herkömmliche Festbett-, Wanderbett- und Halbwandermethoden beliebig verwendet werden.
Die Lösungen, von welchen die Verunreinigungen abgetrennt wurden, können in einer herkömmlichen Weise filtriert und zentrifugiert werden, um unlösliche Substanzen zu entfernen, Reinigungsschritten wie Entfärbung mit Aktivkohle und Entsalzen mit Ionenaustauscherharzen in H- und OH-Form unterworfen werden und zu sirupartigen Produkten eingeengt werden. Gegebenenfalls können die sirupartigen Produkte durch Methoden wie Sprühtrocknen zu pulverförmigen Produkten getrocknet werden.
Die vorliegenden Saccharid-Zusammensetzungen, die die so erhaltenen Glucosyl-transferierten Saccharide enthalten, enthalten normalerweise mindestens 5 %, bevorzugt mindestens 10 % der Glucosyl-transferierten Saccharide, Tfb.
Die vorliegenden Saccharid-Zusammensetzungen, die Glucosyltransferierte Saccharide enthalten, weisen einen zufriedenstellenden Geschmack und Süße, Osmosekontrollvermögen, Benetzungsvermögen, Vermögen zum Verleihen von Glanz, Kristallisationsvorbeugungsvermögen und Retrogradationsvorbeugungsvermögen, Kariesvorbeugungsvermögen, Wachstum-fördernde Aktivität für Bifidobakterien und Mineralabsorption-fördernde Aktivität auf. Wegen dieser zufriedenstellenden Eigenschaften und Funktionen können die vorliegenden Saccharid-Zusammensetzungen beliebig und weit verbreitet in Zusammensetzungen wie Nahrungsmittelprodukten, Tabakwaren, Zigaretten, Futtern, Haustierfuttern, Kosmetika, Apothekerwaren, Formkörpern, täglichen Nahrungsmitteln und Produkten, Produkten für Forstwirtschaft und Fischereiwesen, Reagenzien und Produkten für chemische Industrien verwendet werden.
Die vorliegenden Saccharid-Zusammensetzungen, die Glucosyltransferierte Saccharide enthalten, können intakt als ein Würzmittel zum Süßen verwendet werden. Falls notwendig, können die vorliegenden Saccharid-Zusammensetzungen zusammen mit geeigneten Mengen von einem oder mehreren anderen Süßungsmitteln, zum Beispiel gepulvertem Sirup, Glucose, Maltose, Trehalose, Saccharose, isomerisiertem Zucker, Honig, Ahornzucker, Sorbit, Maltitol, Lactitol, Dihydrocharcon, Steviosid, α-Glycosylsteviosid, Rebaudiosid, Glycyrrhizin, L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester, Saccharin, Glycin und Alanin, sowie Füllstoffen wie Dextrinen, Stärken und Lactose verwendet werden.
Die vorliegenden Saccharid-Zusammensetzungen haben eine Süße, die gut mit Substanzen mit Herbheit, Säure, Salzigkeit, Bitterheit, Adstringenz und Wohlgeschmack harmonieren, sowie eine zufriedenstellende Säure- und Wärmetoleranz. Folglich können sie beliebig in Nahrungsmittelprodukten im Allgemeinen als ein Süßungsmittel, ein Geschmack-verbesserendes Mittel und ein Qualität-verbesserndes Mittel verwendet werden.
Die vorliegenden Saccharid-Zusammensetzungen können in Würzmitteln verwendet werden, wie Sojasoßen, pulverisierten Sojasoßen, „Miso", „Funmatsu-miso" (eine pulverisierte Miso), „Moromi" (ein raffinierter Reiswein), „Hishio" (eine raffinierte Sojasauce), „Furikake" (ein gewürztes Fischmehl), Majonäse, Dressings, Essigen, „Sanbai-zu" (eine Soße aus Zucker, Sojasoße und Essig), „Funmatsu-sushi-su" (gepulverter Essig für Sushi), „Chuka-no-moto" (eine Instantmischung für chinesische Speisen), „Tentsuyu" (eine Soße für japanische frittierte Nahrungsmittel mit viel Fett), „Mentsuyu" (eine Soße für japanische Fadennudeln), Soßen, Ketchups, Vormischungen für Pickles und eingelegte Produkte wie „Takuan-zuke-no-moto" (eine Vormischung für eingelegten Rettich) und „Hakusai-zuke-no-moto" (eine Vormischung für frische weiße Rapspickles), „Yakiniku-no-tare" (eine Soße für japanisches gegrilltes Fleisch), Curryeinbrenne, Instanteintopfmischungen, Instantsuppenmischungen, „Dashi-no-moto" (eine Instantbrühemischung), Würzmittelmischungen, „Mirin" (ein süßer Reiswein), „Shin-mirin" (ein synthetischer Mirin), Tafelsirupen und Kaffeesirupen.
Die vorliegende Saccharid-Zusammensetzung kann frei verwendet werden zum Süßen von „Wagashi" (japanische Kuchen) wie „Senbei" (ein Reiskräcker), „Arare-mochi" (ein Reiskuchenwürfel), „Okoshi" (ein Kuchen aus Hirse und Reis), „Mochi" (eine Reispaste), „Manju" (ein Brötchen mit einer Bohnenmarmelade), „Uiro" (ein süßes Reisgelee), „An" (eine Bohnenmarmelade), „Yokan" (ein süßes Gelee aus Bohnen), „Mizu-yokan" (ein mildes Adzuki-Bohnengelee), „Kingyoku" (eine Art von Yokan), Gelees, Pao de Castellas und „Amedama" (ein japanisches Sahnebonbon); Konditorwaren wie Brötchen, Biskuits, Kräcker, Keks, Torten, Puddings, Buttercremes, Eiercremes, Windbeuteln, Waffeln, Biskuitkuchen, Krapfen, Schokoladen, Kaugummis, Karamelle und Konfekten; gefrorenen Desserts wie Eiscremes und Sorbets; Sirupen wie „Kajitsu-no-syrup-zuke" (eine konservierte Frucht) und „Korimitsu" (ein Zuckersirup für offenes Eis); Pasten wie Mehlpasten, Erdnusspasten, Fruchtpasten und Brotaufstrichen; verarbeiteten Früchten und Gemüse wie Marmeladen, Marmeladen aus Zitrusfrüchten, „Syrup-zuke" (Früchtepickles) und „Toka" (Konserven); Pickles und eingelegten Produkten wie „Fukujin-zuke" (rote gefärbte Rettichpickles), „Bettara-zuke" (eine Art von ganzen frischen Rettichpickles), „Senmai-zuke" (eine Art von aufgeschnittenen frischen Rettichpickles) und „Rakkyo-zuke" (eingelegte Schalotten); Fleischprodukten wie Schinken und Würsten; Produkten aus Fischmehl wie Fischschinken, Fischwürsten, „Kamaboko" (eine mit Dampf behandelte Fischpaste), „Chikuwa" (eine Art von Fischpaste) und „Tenpura" (eine japanische Paste aus frittiertem Fisch mit viel Fett); „Chinmi" (ein Gewürz) wie „Uni-no-shiokara" (gesalzene Eingeweide vom Seeigel), „Ika-no-shiokara" (gesalzene Eingeweide vom Tintenfisch), „Su-konbu" (verarbeiteter Tang), „Saki-surume" (getrocknete Tintenfischstreifen) und „Fugu-no-mirinboshi" (ein getrockneter mit Mirin gewürzter Schwellfisch); „Tsukudani" (mit Sojasoße verkochte Nahrungsmittel) wie jene von Lavern, essbaren wilden Pflanzen, getrockneten Tintenfischen, Fischen und Schalentieren; täglichen Speisen wie „Nimame" (gekochte Bohnen), Kartoffelsalaten und „Konbu-maki" (ein Tangring); Milchprodukten; Konserven und Produkten in Flaschen wie jene aus Fleisch, Fischmehl, Früchten und Gemüse; alkoholischen Getränken wie Reisweinen, synthetischen Reisweinen, Weinen und Spirituosen; alkoholfreien Getränken wie Kaffees, Tees, Kakaos, Säften, Getränken mit Kohlensäure, Sauermilchgetränken und Getränken, welche Milchsäurebakterien enthalten; Instantnahrungsmittelprodukten wie Instantpuddingmischungen, Instantmischungen für heißen Kuchen und „Sokuseki-shiruco" (eine Instantmischung für Adzuki-Bohnensuppe mit Reiskuchen) und Instantsuppenmischungen; und Nahrungsmitteln wie Babynahrungsmitteln, Nahrungsmitteln für Therapie, Getränken, die mit Nährstoffen ergänzt wurden, Produkten aus gekochtem Reis, Nudeln und gefrorenen Nahrungsmitteln; sowie zum Verbessern des Geschmacks und der Qualität der vorstehenden Nahrungsmittelprodukte.
Die vorliegenden Saccharid-Zusammensetzungen können auch in Futtern und Haustiernahrungsmitteln für Tiere wie Haustiere, Geflügel und Fische verwendet werden, um ihre Geschmacksvorzüge zu verbessern. Die vorliegenden Saccharid-Zusammensetzungen können beliebig als ein Süßungsmittel, geschmacksverbesserndes Mittel und qualitätsverbesserndes Mittel in anderen Zusammensetzungen in einer Pasten- und flüssigen Form wie Tabakwaren, Zigaretten, Zahnputzmitteln, Lippenstiften, Rouges, Lippenbalsams, inneren Medikamenten, Tabletten, Pastillen, Lebertranen in der Form von Tropfen, Cachous, oralen kühlenden Mitteln, Gurgelmitteln, Kosmetika und Apothekerwaren verwendet werden.
Die vorliegenden Saccharid-Zusammensetzungen können als ein qualitätsverbesserndes Mittel und Stabilisator in biologisch aktiven Substanzen verwendet werden, die für einen Verlust ihrer Wirkstoffe und Aktivitäten empfindlich sind, sowie in Reformkost und Apothekerwaren, die die vorstehenden biologisch aktiven Substanzen enthalten. Beispiele von solchen biologisch aktiven Substanzen sind Lösungen von Cytokinen wie α-, β- und γ-Interferone, Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), Tumornekrosefaktor-β (TNF-β), inhibitorischer Makrophagenmigrationsfaktor, Kolonie-stimulierender Faktor, Transferfaktor und die Interleukine 1, 2, 6, 12, 15 und 18; Hormone wie Insulin, Wachstumshormon, Prolaktin, Erythropoietin, Gewebeplasminogenaktivator, Follikel-stimulierendes Hormon und Plazentahormon; biologische Zubereitungen wie BCG-Vakzine, japanisches Enzephalitisvakzine, Masernvakzine, Polio-Lebendvakzine, Pockenvakzine, Tetanusanatoxin, Trimeresurus-Antitoxin und menschliches Immunglobulin; Antibiotika wie Penicillin, Erythromycin, Chloramphenicol, Tetracyclin, Streptomycin und Kanamycinsulfat; Vitamine wie Thiamin, Riboflavin, L-Ascorbinsäure, Lebertran, Karotinoid, Ergosterol und Tocopherol; Enzyme wie Lipase, Elastase, Urokinase, Protease, β-Amylase, Isoamylase, Glucanase und Lactase; Extrakte wie Ginsengextrakt, Schnappschildkrötenextrakt, Chlorellaextrakt, Aloeextrakt und Propolisextrakt; lebende Mikroorganismen wie Viren, Milchsäurebakterien und Hefen; und andere biologisch aktive Substanzen wie Königsgelee. Unter Verwendung der vorliegenden Saccharid-Zusammensetzungen werden die vorstehend erwähnten biologisch aktiven Substanzen beliebig zu Reformkost und Apothekerwaren mit einer zufriedenstellend hohen Stabilität und Qualität ohne eine Angst von Verlieren oder Inaktivieren ihrer Wirkstoffe und Aktivitäten zubereitet.
Wie vorstehend beschrieben, schließt die Formulierung „Zusammensetzungen", auf welche die vorliegende Erfindung Bezug nimmt, oral und parenteral verwendbare Nahrungsmittelprodukte, Kosmetika und Apothekerwaren, sowie tägliche Produkte, Produkte für die Forstwirtschaft und das Fischereiwesen, Reagenzien und Produkte für chemische Industrien ein.
Die Methoden zum Einbringen der vorliegenden Saccharid-Zusammensetzungen in die vorstehenden Zusammensetzungen schließen herkömmliche Methoden, zum Beispiel Mischen, Kneten, Lösen, Schmelzen, Einweichen, Permeieren, Besprengen, Aufbringen, Beschichten, Sprühen, Einspritzen und Verfestigen, ein. Die vorliegende Saccharid-Zusammensetzung wird normalerweise in die Zusammensetzungen in einer Menge von 0,1 % oder mehr, bevorzugt 0,5 % oder mehr eingebracht.
Die folgenden Versuche erläutern die vorliegende Erfindung genauer:
Versuch 1
Herstellung der Trehalosephosphorylase
Gemäß der Herstellung des Mediums für Thermoanaerobium brockii, wie in „ATCC Catalogue of BACTERIA AND BACTERIOPHAGES", 18. Ausgabe, S. 452-456 (1992) offenbart, außer, dass 0,5 w/v % Glucose mit 0,5 w/v % Trehalose als eine Kohlenstoffquelle ersetzt wurde, wurde ein Medium hergestellt und 100 ml-Aliquote des Mediums wurden in 100 ml-Druckflaschen gegeben, gefolgt von Animpfen einer Impfkultur von Thermoanaerobium brockii, ATCC 35047, und Stehenlassen einer Impfkultur bei 60°C für 48 Stunden.
Ca. 10 l-Aliquote einer frischen Zubereitung des gleichen Nährmediums, wie für die Herstellung der Impfkultur verwendet wurde, wurden in vier 11 l-Edelstahlflaschen gegeben, durch Erwärmen sterilisiert, auf 60°C gekühlt und mit einem v/v % der Impfkultur in dem Kulturmedium angeimpft, gefolgt von der stationären Kultur bei 60°C für ca. 40 Stunden.
Ca. 40 l der resultierenden vereinigten Kulturen wurden zentrifugiert, wobei 92 g feuchte Zellen erhalten wurden, die dann in 10 mM Phosphat-Puffer suspendiert, mit Ultraschall behandelt und zentrifugiert wurden, wobei ein Überstand der Suspension aus aufgebrochenen Zellen erhalten wurde. Der Überstand wies eine Aktivität von 0,3 Einheiten/ml Trehalosephosphorylase auf.
Versuch 2
Reinigung der Trehalosephosphorylase
Der Überstand von Versuch 1 wurde unter Verwendung einer UF-Membran zu ca. 360 ml Enzymkonzentrat mit einer Aktivität von ca. 30 Einheiten/ml Trehalosephosphorylase konzentriert.
Dreihundert ml des Enzymkonzentrats wurden gegen 10 mM Phosphat-Puffer (pH 7.0) für 24 Stunden dialysiert und zentrifugiert, um unlösliche Substanzen zu entfernen. Dreihundertachtzig ml des resultierenden Überstandes wurden einer Ionenaustausch-Säulenchromatographie unter Verwendung von 380 ml „DEAE-TOVOPEARL^® 650 GEL", ein Gel für Ionenaustausch-Säulenchromatographie, das kommerziell von Tosoh Corporation, Tokio, Japan vertrieben wird, unterworfen.
Man ließ die vorliegende Trehalosephosphorylase an dem Gel adsorbieren und eluierte von der Säule durch Aufbringen eines linearen Gradienten von Natriumchlorid, der von 0 M nach 0,5 M anstieg. Fraktionen mit der Enzymaktivität, die bei ca. 0,1 M Natriumchlorid eluiert wurden, wurden gesammelt und vereinigt und das Enzym in der vereinigten Lösung wurde dann wie folgt gereinigt: Dialysieren der Lösung gegen eine frische Zubereitung des gleichen Puffers, der 1,5 M Ammoniumsulfat enthielt, Zentrifugieren der dialysierten Lösung, um unlösliche Substanzen zu entfernen, und Unterwerfen des Überstandes einer hydrophoben Säulenchromatographie unter Verwendung von 100 ml „BUTYL-TOYOPEARL^® 650 GEL". Eluieren der an dem Gel adsorbierten Trehalosephosphorylase mit einem linearen Gradienten von Ammoniumsulfat, der von 1,5 M nach 0,5 M abnahm, und Sammeln von Fraktionen mit der Enzymaktivität.
Die Fraktionen wurden vereinigt und einer Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von 300 ml „ULTROGEL^® AcA44 RESIN", ein Gel für Gelfiltrations-Säulenchromatographie, das kommerziell von Sepracor/IBF s.a. Villeneuve Ia Garenne, Frankreich vertrieben wird, unterworfen, gefolgt von Sammeln von Fraktionen mit der Enzymaktivität.
Die Ausbeute des gereinigten Enzyms für Prüfzwecke, welche bei den vorstehenden Reinigungsschritten erhalten wurde, betrug ca. 25 %, bezogen auf die Enzymaktivität des Überstandes der Suspension der aufgebrochenen Zellen. Das Enzym für Prüfzwecke hatte eine spezifische Aktivität von 78,2 Einheiten/mg Protein. Das Protein wurde gemäß der Lowry-Methode unter Verwendung von Kälberserumalbumin als ein Standardprotein quantifiziert.
Eine Untersuchung der Reinheit des Prüfenzyms an Gelelektrophorese unter Verwendung von 7,5 w/v % Polyacrylamid enthüllte, dass das Prüfenzym ein Protein mit relativ hoher Reinheit war, das als eine einzelne Proteinbande nachgewiesen wurde.
Versuch 3
Eigenschaft der Trehalosephosphorylase
Die Trehalosephosphorylase für Prüfzwecke von Versuch 2 wurde SDS-PAGE unter Verwendung von 10 w/v % Gel unterworfen. Im Vergleich mit Markerproteinen, die kommerziell von Japan Bio-Rad Laboratories, Tokio, Japan vertrieben werden und welche parallel elektrophoretisiert wurden, wurde das Molekulargewicht des Enzyms gemessen, wobei enthüllt wurde, dass es ein Molekulargewicht von 88.000 ± 5.000 Dalton hatte, und es ergab sich ein Molekulargewicht von 190.000 ± 10.000 Dalton bei Gelfiltration unter Verwendung einer Säule mit 7,5 mm im Durchmesser und 600 mm in der Länge, die mit „TSKgel G4000SW" gepackt war, ein Gel für Gelfiltration, das kommerziell von Tosoh Corporation, Tokio, Japan vertrieben wird.
Die gereinigte Trehalosephosphorylase wurde einer Polyacrylamidgelelektrophorese unter Verwendung von 2 w/v % „AMPHOLINE", ein Ampholyt, der kommerziell von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden vertrieben wird, unterworfen, gefolgt von Messen der pHs der Proteinbanden und Gels, wobei enthüllt wurde, dass das Enzym einen pl von 5,4 ± 0,5 hatte.
Die Einflüsse von Temperaturen und pHs auf die vorliegende Trehalosephosphorylaseaktivität wurden gemäß dem Test auf Enzymaktivität untersucht. Um den Einfluss der Temperaturen zu untersuchen, ließ man das Enzym bei Temperaturen von ca. 50 bis 85°C anstelle von 60°C, wie im Enzymtest verwendet, umsetzen. Im Falle der Untersuchung des Einflusses der pH-Werte ließ man das Enzym bei pH-Werten von ca. 4 bis 9 anstelle der pH-Werte der Puffer, wie im Test auf die Enzymaktivität verwendet, umsetzen. In beiden Fällen wurden die enzymatischen Reaktionen in einer ähnlichen Weise wie im Enzymtest abgestoppt, gefolgt von der Quantifizierung der gebildeten Glucose. Diese Ergebnisse sind in den 1 und 2 gegeben, welche jeweils die Daten für die Einflüsse der Temperaturen und der pH-Werte sind und als relative Werte zu den Maxima ausgedrückt sind. Das Enzym hatte eine optimale Temperatur von ca. 70°C, wenn bei pH 7.0 für 30 min inkubiert wurde, und der optimale pH war ca. 7.0 bis 7.5, wenn bei 60°C für 30 min inkubiert wurde. Die thermische Stabilität des Enzyms wurde durch Inkubieren des in 10 mM Phosphat-Puffer (pH 7.0) gelösten Enzyms bei einer Temperatur von ca. 40 bis 85°C für eine Stunde, Abkühlen des inkubierten Enzyms und Testen auf die verbleibende Enzymaktivität gemäß dem Enzymtest bestimmt. Die pH-Stabilität des Enzyms wurde durch Lösen des Enzyms in Puffern mit unterschiedlichen pH-Werten von ca. 4 bis 10, Halten von jeder Enzymlösung bei 4°C für 24 Stunden, Einstellen von jeder Lösung, um einen pH von 7.0 zu ergeben, und Testen auf die verbleibende Enzymaktivität gemäß dem Enzymtest bestimmt. Diese Ergebnisse sind in den 3 und 4 gegeben, welche jeweils die Daten für die thermische und pH-Wert-Stabilitäten des Enzyms sind und als relative Werte zu den Maxima ausgedrückt sind. Das Enzym hatte eine thermische Stabilität von bis zu ca. 60°C und eine pH-Stabilität von ca. 6.0 bis 9.0. Die Enzymaktivität wurde durch ein mM Cu⁺⁺, Pb⁺⁺, Zn⁺⁺, Hg⁺⁺, Mg⁺⁺ oder Mn⁺⁺ inhibiert.
Versuch 4
Aminosäureteilsequenz von Trehalosephosphorylase Versuch 4-(1)
N-terminale Aminosäureseguenz
Ein Anteil eines gereinigten Enzyms für Prüfzwecke, das durch das Verfahren von Versuch 2 erhalten wurde, wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert und ca. 40 μg des dialysierten Enzyms, bezogen auf das Proteingewicht, wurden als eine Probe zum Analysieren der N-terminalen Aminosäuresequenz verwendet. „PROTEIN SEQUENCER MODEL 473A", ein Gerät, das kommerziell von Applied Biosystems, Inc., Foster City, USA vertrieben wird, wurde zum Analysieren von bis zu fünf Aminosäureresten vom N-Terminus verwendet. Die analysierte Aminosäureteilsequenz war SEQ ID No. 1. Eine genauere Analyse unter Verwendung einer frischen Zubereitung des gleichen Enzyms für Prüfzwecke enthüllte, dass das Enzym die Aminsäuresequenz SEQ ID No. 6 am N-Terminus aufweist.
Versuch 4-(2)
Innere Aminosäureteilseguenz
Ein Anteil eines gereinigten Enzyms für Prüfzwecke, das durch das Verfahren von Versuch 2 erhalten wurde, wurde gegen 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9.0) dialysiert und die dialysierte Lösung wurde mit einer frischen Zubereitung des gleichen Puffers verdünnt, um eine Proteinkonzentration von einem mg/ml zu ergeben. Ein ml der resultierenden Lösung wurde mit 10 μg Lysylendopeptidase, ein Enzym für Prüfzwecke, das kommerziell von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japan vertrieben wird, gemischt und einer enzymatischen Reaktion bei 30°C für 22 Stunden unterworfen, um Peptide zu bilden. Reversed-Phase-HPLC (Hochleistungsflüssigchromatographie) wurde durchgeführt, um die Peptide unter den Bedingungen der Verwendung einer „μBON-DASPHERE C-18 COLUMN" (2,1 mm im Durchmesser und 150 mm in der Länge), eine Säule für Reversed-Phase-HPLC, die kommerziell von Waters Chromatography, Abt., MILLIPORE Corp., Milford, MA, USA vertrieben wird, einer Fließrate von 0,9 ml/min, von Umgebungstemperatur und eines linearen Gradienten von Acetonitril, der von 0 v/v % auf 48 v/v % anstieg, in 0,1 v/v % Trifluoressigsäure über 120 min zu isolieren. Peptide, die von der Säule eluiert wurden, wurden durch Messen ihrer Extinktionen bei 210 nm nachgewiesen. Zwei Peptide, d.h. TP10 mit einer Retentionszeit von 66 min und TP14 mit einer Retentionszeit von 86 min, die klar von anderen abgetrennt waren, wurden getrennt gesammelt, in Vakuum getrocknet und in 200 μl einer Lösung von 0,1 v/v % Trifluoressigsäure und 50 v/v % Acetonitril gelöst. Jedes Peptid wurde an einer Proteinsequenziervorrichtung analysiert, um bis zu fünf Aminosäurereste vom N-Terminus zu enthüllen. Die TP10 und TP14 ergaben die Aminosäuresequenzen SEQ ID No. 2 beziehungsweise SEQ ID No. 3. Eine genauere Analyse einer frischen Zubereitung des gleichen Enzyms für Prüfzwecke durch die gleiche Analyse enthüllte, dass das TP14 am N-Terminus die SEQ ID No. 7 aufwies.
Versuch 5
Substratspezifität für die Saccharid-Hydrolysereaktion durch Trehalosephosphorylase
Eine wässrige Lösung eines Saccharids, das aus D-Glucose, Maltose, Saccharose, Lactose, Trehalose, Neotrehalose, Cellobiose, Melibiose, Kojibiose, Isomaltose, Sophorose, Gentibiose, Nigerose, Laminaribiose, Maltopentaose und 4-O-α-D-Glucosyltrehalose ausgewählt war, wurde mit 10 Einheiten/g Saccharid, Tfb., einer gereinigten Trehalosephosphorylase, die durch das Verfahren von Versuch 2 erhalten wurde, gemischt und in der Gegenwart von 5 mM Dinatriumhydrogenphosphat bei 60°C und einem pH von 7.0 für 24 Stunden inkubiert. Die Saccharid-Konzentration von jeder Reaktionslösung betrug 2 w/v %. Lösungen von vor der Reaktion und Gemische von nach der Reaktion wurden Dünnschichtchromatographie (hier nachstehend als „DC" abgekürzt) unter Verwendung von „KIESELGEL 60" (20 × 20 cm), eine Aluminiumplatte für DC, die kommerziell von Merck & Co., Inc., Rahway, USA vertrieben wird, unterworfen. Die Proben wurden einmal bei Umgebungstemperatur auf der Platte unter Verwendung von 1-Butanol/Pyridin/Wasser (= 7:3:1, bezogen auf das Volumen) als ein Entwicklungslösungsmittelsystem entwickelt und die Platte wurde zum Anfärben mit 20 v/v % Schwefelsäure/Methanol-Lösung besprüht und bei 110°C für ca. 10 min erwärmt. Durch Vergleichen von Flecken der Lösungen und der Gemische, die auf den Platten nachgewiesen wurden, wurde überprüft, ob das Enzym auf die Saccharide eingewirkt hatte. Die Ergebnisse waren wie in Tabelle 1: Tabelle 1
Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurde gefunden, dass die vorliegende Trehalosephosphorylase eine starke Substratspezifität für Trehalose zeigte und auf sie wirkte, indem sie D-Glucose und β-D-Glucose-1-Phosphorsäure bildete, aber, dass sie nicht auf andere Saccharide wirkte.
Versuch 6
Spezifität bezüglich des Akzeptors bei der Glucosyl-übertragenden Saccharid-Bildungsreaktion durch Trehalosephosphorylase
Eine wässrige Lösung, in der in gleichen Mengen, bezogen auf das Trockengewicht, β-D-Glucose-1-Phosphorsäure als ein Sacchariddonor und eines von Monosaccharide, Oligosaccharide und Zuckeralkohole als Akzeptoren in Tabelle 2 gelöst war, wurde mit 10 Einheiten/g β-D-Glucose-1-Phosphorsäure einer gereinigten Trehalosephosphorylase, die durch das Verfahren von Versuch 2 erhalten wurde, gemischt und enzymatisch bei 60°C und einem pH von 7.0 für 24 Stunden umgesetzt. Ähnlich wie in Versuch 5 wurden die Lösungen von vor der Reaktion und die Gemische von nach der Reaktion DC unterworfen, gefolgt vom Anfärben der Platten. Durch Vergleichen von Flecken der Proben der Lösungen und der Gemische, die auf den Platten nachgewiesen wurden, wurde beurteilt, ob, bezogen auf neu nachgewiesene Flecken der Gemische von nach der Reaktion, transferierte Saccharide gebildet worden waren. Durch makroskopische Beobachtung des Färbungsgrades der neu nachgewiesenen Flecken wurde relativ die Ausbeute der transferierten Saccharide bewertet. Die Ergebnisse waren wie in Tabelle 2: Tabelle 2
Es wurde enthüllt, wie in Tabelle 2 gezeigt, dass die vorliegende Trehalosephosphorylase Glucosyl-transferierte Saccharide bildet, indem sie wirksam eine Glucosylgruppe von β-D-Glucose-1-Phosphorsäure als ein Sacchariddonor auf reduzierende Aldosen als Akzeptoren wie Monosaccharide wie D-Xylose, D-Galactose, D-Glucose, 2-Deoxy-D-glucose, D-Fucose, L-Fucose, Glucosamin und N-Acetylglucosamin überträgt. Unter Berücksichtigung der Substratspezifität des vorliegenden Enzyms wurden diese Glucosyl-transferierten Saccharide als nicht-reduzierende Saccharide beurteilt. Kein Glucosyl-transferiertes Saccharid wurde erhalten, als α-D-Glucose-1-Phosphorsäure als ein Sacchariddonor anstelle von β-D-Glucose-1-Phosphorsäure verwendet wurde.
Einige der Glucosyl-transferierten Saccharide, von welchen in Versuch 6 enthüllt wurde, dass sie über die Saccharid-Übertragungsreaktion durch die vorliegende Trehalosephosphorylase gebildet werden, werden bezüglich ihrer genauen Strukturen mit Bezug auf die folgenden Versuche 7 und 8 erklärt.
Versuch 7
Glucosyl-transferiertes Saccharid von D-Glucose und β-D-Glucose-1-Phosphorsäure
Ein Anteil des Reaktionsgemisches, das unter Verwendung von D-Glucose und β-D-Glucose-1-Phosphorsäure als Substrate in Versuch 6 erhalten wurde, wurde mit 10 mM Phosphat-Puffer (pH 7.0) verdünnt, wobei eine Konzentration von einem Prozent erhalten wurde, mit 0,5 ml einer Trehalase für Prüfzwecke, die kommerziell von Sigma Chemical Company, St. Louis, USA vertrieben wird, gemischt und enzymatisch bei 45°C für 20 Stunden umgesetzt. Jeder Anteil der Reaktionsgemische, mit Trehalase behandelt oder nicht behan delt, wurde getrocknet, in Pyridin gelöst und trimethylsilyliert. Die resultierenden Produkte wurden durch Gaschromatographie (hier nachstehend als „GC" abgekürzt) unter den Bedingungen der Verwendung einer Edelstahlsäure mit 3 mm im Durchmesser und 2 m in der Länge, gepackt mit 2 % „SILICONE OV-17/CHROMOSOLH W", ein Harz für GC, das kommerziell von GL Sciences Inc., Tokio, Japan vertrieben wird, von Stickstoffgas als ein Trägergas, einer Fließrate von 40 ml/min, von Säulenofentemperaturen von 160 bis 320°C und einer Erwärmungsrate von 7,5 °C/min analysiert. Saccharid-Komponenten wurden durch eine Wasserstoffflammenionisationsdetektionsvorrichtung nachgewiesen.
Als ein Ergebnis wurde enthüllt, dass die Retentionszeit eines Peaks für ein Glucosyl-transferiertes Saccharid, das aus D-Glucose und β-D-Glucose-1-Phosphorsäure durch die Wirkung der vorliegenden Trehalosephosphorylase gebildet wurde, mit der von authentischer Trehalose übereinstimmte und dass die Trehalase-Behandlung den Peak verkleinerte und D-Glucose bildete. Unter Berücksichtigung der Substratspezifität von Trehalase wurde vermutet, dass das Glucosyl-transferierte Saccharid Trehalose war.
Versuch 8
Glucosyl-D-galactosid
Um das Glucosyl-transferierte Saccharid zu identifizieren, das über die Saccharid-Übertragungsreaktion auf D-Galactose durch die vorliegende Trehalosephosphorylase gebildet wurde, wurde das Glucosyl-transferierte Saccharid hergestellt, isoliert und auf seine Struktur hin untersucht. Die Verfahren waren wie folgt: Bereitstellen einer wässrigen Lösung, die 5 % Trehalose, 2,5 % D-Galactose und 5 mM Natriumdihydrogenphosphat enthielt, Einstellen der wässrigen Lösung, um einen pH von 5.0 zu ergeben, Zugeben von 15 Einheiten/g β-D-Glucose-1-Phosphorsäure einer gereinigten Trehalosephosphorylase, die durch das Verfahren von Versuch 2 erhalten wurde, zu der Lösung, enzyma tisches Umsetzen der Lösung bei 60°C für 72 Stunden, Erwärmen des Reaktionsgemisches bei 100°C für 10 min, um das restliche Enzym zu inaktivieren, und Analysieren einer Probe von dem resultierenden Gemisch gemäß dem Verfahren von Versuch 7 durch GC. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass das Reaktionsgemisch eine relativ große Menge einer Substanz mit einer Retentionszeit, die sich von jenen von Trehalose, D-Galactose, D-Glucose und β-D-Glucose-1-Phosphorsäure unterschied, enthielt, wodurch angenommen wurde, dass es das Glucosyl-transferierte Saccharid war. Bezogen auf die Daten der GC betrug die Ausbeute des Saccharids ca. 30 %. Das restliche Reaktionsgemisch wurde eingestellt, um einen pH von 7.0 zu ergeben, mit 25 Einheiten/g verbliebener Trehalose gemischt und enzymatisch bei 45°C für 20 Stunden umgesetzt, um die in dem Reaktionsgemisch verbliebene Trehalose zu zersetzen. Das resultierende Produkt wurde bei 100°C für 10 min erwärmt, um restliche Trehalase zu inaktivieren, mit Aktivkohle entfärbt, filtriert, entsalzt und unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen in H- und OH-Form gereinigt, eingeengt, um eine Konzentration von ca. 50 % zu ergeben, und der nachstehenden Säulenchromatographie unterworfen, gefolgt von Sammeln der Fraktionen, die reich an Glucosyl-transferiertem Saccharid waren.
Das Harz, das zur Fraktionierung verwendet wurde, war „XT-1016", ein stark saures Alkalimetall-Kationenaustauscherharz, Na-Form, mit einem Polymerisationsgrad von 4 %, das kommerziell von Tokyo Organic Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japan vertrieben wird, und das Harz wurde in Wasser suspendiert und in vier ummantelte Edelstahlsäulen mit jeweils 3 cm im Durchmesser und einem Meter in der Länge in Kaskadenreihenschaltung gepackt, um eine Gesamtgelbetttiefe von ca. 4 m zu ergeben. Unter Aufrechterhalten der Säuleninnentemperatur bei 40°C wurde eine Saccharid-Lösung auf die Säulen in einem Volumen von 5 v/v % zum Harz aufgebracht, gefolgt von Aufbringen von auf 40°C erwärmtem Wasser auf die Säulen bei einer Fließrate von RG (Raumgeschwindigkeit) von 0,15, wobei die Saccharid-Lösung fraktioniert wurde und die Fraktionen, die reich an Glucosyl-transferiertem Saccharid waren, gesammelt wurden.
Die Fraktionen wurden vereinigt, entsalzt, gereinigt und zu einem ca. 40 %igen Konzentrat eingeengt, das dann an einer Säule chromatographiert wurde, die mit „YMC-Pack OSD" gepackt worden war, einem Octadecyl-Kieselgel, das kommerziell von YMC Co., Ltd., Kyoto, Japan vertrieben wird, wobei Fraktionen gesammelt wurden, die das Glucosyl-transferierte Saccharid enthielten. Die Fraktionen wurden vereinigt und zu einem ca. 40 %igen Konzentrat eingeengt, auf das dann wieder die vorstehende Säulenchromatographie angewendet wurde. Die resultierende Lösung, die reich an dem Glucosyltransferierten Saccharid war, wurde entsalzt, gereinigt, eingeengt und in Vakuum getrocknet, wobei ein pulverförmiges Produkt erhalten wurde, das das Saccharid in einer Ausbeute von ca. 20 %, Tfb., bezogen auf das Saccharid-Material, das bei der enzymatischen Reaktion verwendet wurde, enthielt. Gemäß dem Verfahren von Versuch 7 wurde das pulverförmige Produkt durch GC analysiert, wobei enthüllt wurde, dass es ca. 98 % Glucosyl-transferiertes Saccharid, Tfb., enthielt.
Das pulverförmige Produkt, das reich an Glucosyl-transferiertem Saccharid war, wurde nach dem Zersetzen mit Säuren einer GC-Analyse unterworfen, wobei enthüllt wurde, dass das Saccharid D-Glucose und D-Galactose in einem Molverhältnis von ca. 1:1 erzeugte, wenn es mit Säuren zersetzt wurde. Das pulverförmige Produkt wurde methyliert, mit Säuren hydrolysiert, reduziert und acetyliert, wobei partielles Methylhexytolacetat erhalten wurde, das dann durch GC analysiert wurde, wobei 2,3,4,6-tetra-O-Methyl-1,5-di-O-acetylglucitol und 2,3,4,6-tetra-O-Methyl-1,5-di-O-acetylgalactitol nachgewiesen wurden. Die Daten weisen daraufhin, dass das Glucosyl-transferierte Saccharid aus D-Glucose und D-Galactose in einem Molverhältnis von 1:1 zusammengesetzt ist, wobei sowohl die OH-Gruppe an C-1 von D-Glucose als auch die OH-Gruppe an C-1 von D-Galactose mit der Bindung zwischen diesen Sacchariden in Zusammenhang stehen.
Um die Struktur des Glucosylgalactosids genauer zu untersuchen, wurden von dem Saccharid die spezifische Drehung und ein ¹³C-NMR-Spektrum gemessen. Als ein Ergebnis erhielt man [α]^D ₂₀ = +223° (c=0,97, H₂O) und ¹³C-NMR-Spektren (100 MHz, D₂O): σ ppm von TSP von 96,16, 95,97, 75,37, 74,94, 74,14, 73,90, 72,53, 72,11, 71,80, 70,76, 64,03 und 63,37. Diese Daten stimmten nahezu mit den authentischen Daten einer chemisch synthetisierten Verbindung, α-D-Galactopyranosyl-α-D-glucopyranosid, überein und dies bestätigte, dass das Glucosylgalactosid Glucosyl-D-galactosid, d.h. α-D-Galactopyranosyl-α-D-glucopyranosid, ein Disaccharid, das aus D-Glucose und D-Galactose zusammengesetzt ist, die über eine α-1,1-Verknüpfung verbunden sind, war.
Versuch 9
Test auf akute Toxizität
Tests auf akute Toxizität eines pulverförmigen Produkts, das reich an Glucosyl-D-galactosid war, welches durch das Verfahren von Versuch 8 erhalten wurde, eines pulverförmigen Produkts, das reich an Glucosyl-D-xylosid war, welches durch das Verfahren von Beispiel A-12 erhalten wurde, eines pulverförmigen Produkts, das reich an Glucosyl-D-fucosid war, welches durch das Verfahren von Beispiel A-14 erhalten wurde, und eines pulverförmigen Produkts, das reich an Glucosyl-L-fucosid war, welches durch das Verfahren von Beispiel A-15 erhalten wurde, wurden jeweils durch orale Verabreichung an 7 Wochen alte Mäuse der dd-Rasse durchgeführt. Als ein Ergebnis starb keine Maus, sogar als ihre maximalen Dosen, d.h. 50 g/kg Maus, bezogen auf das Gewicht, verabreicht wurden. Die Daten weisen daraufhin, dass diese Saccharide eine sehr niedrige Toxizität haben.
Das Beispiel A erläutert die vorliegende Trehalosephosphorylase, die DNS, die das Enzym codiert, und das Verfahren zur Herstellung von Sacchariden, die Glucosyl-transferierte Saccharide enthalten, welche unter Verwendung des Enzyms hergestellt wurden, und natürlich schränken diese Ausführungsformen die vorliegende Erfindung nicht ein:
Beispiel A-1
Enzymlösung
Thermoanaerobium brockii, ATCC 35047, wurde für ca. 30 Stunden in einer frischen Zubereitung des gleichen Mediums, wie in Versuch 1 verwendet, außer, dass die Temperatur auf 65°C gesetzt wurde, unter Verwendung eines Fermenters unter anaeroben Bedingungen gemäß dem Verfahren von Versuch 1 kultiviert. Die resultierende Kultur wurde zentrifugiert, wobei Zellen erhalten wurden, die dann durch Ultraschall aufgebrochen und zentrifugiert wurden. Der Überstand wurde auf eine Säule aufgebracht, die mit „DEAE-TOYOPEARL^® GEL" gepackt war, um daran adsorbiert zu werden, und wurde von der Säule durch Aufbringen eines wässrigen linearen Gradienten von Natriumchlorid, der von 0 M auf 0,5 M anstieg, eluiert, gefolgt von Sammeln der Fraktionen mit einer Trehalosephosphorylaseaktivität, die bei ca. 0,1 M Natriumchlorid eluiert wurden. Die Fraktionen wurden vereinigt und mit einer Ultrafiltrationsmembran konzentriert, wobei eine Enzymlösung mit ca. 20 Einheiten/ml Trehalosephosphorylase in einer Ausbeute von ca. 40 %, bezogen auf die Gesamtaktivität des Kulturmaterials, erhalten wurde.
Beispiel A-2
Herstellung der DNS
Gemäß dem Verfahren von Versuch 1 wurde eine Impfkultur von Thermoanaerobium brockii, ATCC 35047, in 11 l einer frischen Zubereitung des gleichen Nährmediums, wie in Versuch 1 verwendet, überimpft und bei 60°C für 24 Stunden kultiviert. Die proliferierten Zellen wurden von der Kultur durch Zentrifugation abgetrennt, in einer geeigneten Menge Tris-EDTA-Salzlösungspuffer (hier nachstehend als „TES-Puffer" abgekürzt) (pH 8.0) suspendiert, 0,05 w/v % Lysozym wurden zu der Zellsuspension gemischt und es wurde bei 37°C für 30 min inkubiert. Danach wurde das mit Enzym behandelte Gemisch bei -80°C für eine Stunde gefroren und aufeinanderfolgend mit TES-Puffer (pH 9.0) und einem Lösungsgemisch von TES-Puffer/Phenol, welches auf 60°C erwärmt worden war, gemischt, gefolgt von ausreichendem Rühren und Kühlen des Gemisches, Zentrifugieren des resultierenden Produkts und Abnehmen der gebildeten oberen Schicht. Das zweifache Volumen an gekühltem Ethanol wurde zu der Schicht gegeben und das gebildete Sediment wurde abgenommen, in einer geeigneten Menge SSC-Puffer (pH 7.1) gelöst, mit 7,5 μg Ribonuclease und 125 μg Protease gemischt und bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Zu dem resultierenden Gemisch wurde ein Lösungsgemisch von Chloroform und Isoamylalkohol gegeben, gefolgt von Rühren und Stehenlassen des Gemisches und Abnehmen der gebildeten oberen Schicht. Nach dem Zugeben von gekühltem Ethanol zu der Schicht wurde das gebildete Sediment abgenommen, mit 70 v/v % gekühltem Ethanol gespült und in Vakuum getrocknet, wobei eine DNS erhalten wurde. Die DNS wurde in SSC-Puffer (pH 7.1) gelöst, wobei eine Konzentration von ca. einem mg/ml erhalten wurde, und bei -80°C gefroren.
Beispiel A-3
Herstellung des Transformanten und der rekombinanten DNS
Ein ml der DNS-Lösung von Beispiel A-2 wurde in einen Behälter gegeben, mit ca. 20 Einheiten eines Restriktionsenzyms, Alu I, gemischt und bei 37°C für 30 min inkubiert, um die DNS teilweise aufzuspalten. Das resultierende Gemisch wurde einer Saccharose-Dichteultrafiltration unterworfen, um ein DNS-Fragment mit ca. 2.000 bis 5.000 Basenpaaren abzunehmen. Parallel dazu wurde „Bluescript^® II SK(+)", ein Plasmidvektor, der kommerziell von Stratagene Cloning Systems, Kalifornien, USA vertrieben wird, vollständig mit einem Restriktionsenzym, Sma I, gespalten und 0,3 μg des gespaltenen Vektors und ca. 3 μg des DNS-Fragments wurden unter Verwendung des „DNA LIGATION KIT", Takara Shuzo Co., Ltd., Otsu, Shiga, Japan, gemäß dem Kit beigefügten Verfahren ligiert. Unter Verwendung der so erhaltenen rekombinanten DNS wurden 100 μg „EPICURIAN COLI^® XL1-BLUE", ein Mikroorganismus der Art Escherichia coli, der kommerziell von Stratagene Cloning Systems, Kalifornien, USA vertrieben wird, durch eine herkömmliche Methode mit funktionsfähigen Zellen transformiert, wobei eine Genbibliothek erhalten wurde.
Mit den resultierenden Transformanten als eine Genbibliothek wurde eine Agarplatte (pH 7.0) angeimpft, die in einer herkömmlichen Weise hergestellt wurde und 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l Natriumchlorid, 75 mg/l Natriumsalz von Ampicillin und 50 mg/l 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-galactosid enthielt, und es wurde bei 37°C für 18 Stunden kultiviert, gefolgt von Fixieren von ca. 5.000 weißen Kolonien, die auf der Platte gebildet worden waren, an „HYBOND-N+", einer Nylonfolie, die kommerziell von Amersham Corp., Abt. Amersham International, Arlington, Heights, USA vertrieben wird. Basierend auf den Aminosäuren 9 bis 15 im N-terminalen Bereich von SEQ ID No. 6, die in Versuch 4 enthüllt wurde, wurde chemisch ein Oligonucleotid mit einer Nucleotidsequenz, die durch 5'-TAYCCNTTYGARGAYTGGGT-3' dargestellt wird, synthetisiert und mit [γ-³²P]ATP und T4 Polynucleotidkinase markiert, um eine synthetisierte DNS als eine erste Probe zu erhalten. Unter den an der Nylonfolie fixierten Kolonien wurden drei Kolonien, die stark mit der ersten Probe hybridisierten, durch Verwenden einer herkömmlichen Koloniehybridisierungsmethode ausgewählt. Diese drei Kolonien wurden an einer Nylonfolie fixiert, in einer ähnlichen Weise wie vorstehend. Basierend auf den Aminosäuren 1 bis 7 von SEQ ID No. 7, die in Versuch 4 enthüllt wurde, wurde chemisch ein Oligonucleotid mit einer Nucleotidsequenz, die durch 5'-AAYTAYGAYTAYTAYGARCC-3' dargestellt wird, synthetisiert und mit [γ-³²P]ATP und T4 Polynucleotidkinase markiert, um eine synthetisierte DNS als eine zweite Probe zu erhalten. Unter den vorstehenden drei an der Nylonfolie fixierten Kolonien wurde eine Kolonie, die stark mit der zweiten Probe hybridisierte, durch Verwenden einer herkömmlichen Koloniehybridisierungsmethode als ein Transformant ausgewählt und als „TTP4" bezeichnet.
Der Transformant TTP4 wurde in einer herkömmlichen Weise in L-Nährflüssigkeit (pH 7.0), die 100 μg/ml Natriumsalz von Ampicillin enthielt, überimpft und bei 37°C für 24 Stunden unter Bedingungen von Rotation und Schütteln inkubiert. Nach der Vervollständigung der Kultur wurde die Kultur zentrifugiert, um Zellen zu erhalten, die dann mit einem herkömmlichen Alkali-SDS-Verfahren behandelt wurden, um eine rekombinante DNS zu extrahieren. Eine herkömmliche Dideoxy-Analyse der rekombinanten DNS enthüllte, dass sie eine DNS mit der Nucleotidsequenz SEQ ID No. 8 enthielt, die aus 3.345 Basenpaaren besteht, welche von Thermoanaerobium brockii, ATCC 35047, abgeleitet sind. Es wurde enthüllt, wie in SEQ ID No. 8 gezeigt, dass eine Nucleotidsequenz, die aus den Basen 596 bis 2.917 in SEQ ID No. 8 besteht, eine Aminosäuresequenz codiert, die aus 774 Aminosäuren besteht. Bei einem Vergleich der von der Nucleotidsequenz abgeleiteten Aminosäuresequenz und den N-terminalen und inneren Aminosäuresequenzen der vorliegenden Trehalosephosphorylase, die in Versuch 4 bestätigt wurden, d.h. SEQ ID No. 1 bis 3 und SEQ ID No. 6 und 7, stimmten die SEQ ID No. 1 bis 3 jeweils mit den Aminosäuren 2 bis 6, 308 bis 312 und 633 bis 637 in SEQ ID No. 8 überein, während die SEQ ID No. 6 und 7 jeweils mit den Aminosäuren 2 bis 31 und 633 bis 647 in SEQ ID No. 8 übereinstimmten.
Diese Daten weisen daraufhin, dass die vorliegende Trehalosephosphorylase die Aminosäuresequenz SEQ ID No. 4 aufweist und dass das Enzym Thermoanaerobium brockii, ATCC 35047, durch eine DNS mit der Nucleotidsequenz SEQ ID No. 5 codiert wird. Die rekombinante DNS, die durch die vorstehenden Verfahren erhalten wurde und von welcher die Nucleotidsequenz enthüllt wurde, wurde „pTTP4" genannt. Wie in 5 gezeigt, ist die rekombinante DNS nach der Erkennungsstelle durch ein Restriktionsenzym, Pst I, positioniert.
Beispiel A-4
Herstellung der Trehalosephosphorylase durch einen Transformanten
Einhundert ml einer wässrigen Lösung, die 16 g/l Polypepton, 10 g/l Hefeextrakt und 5 g/l Natriumchlorid enthielt, wurden in einen 500 ml-Erlenmeyerkolben gegeben, bei 121 °C für 15 min autoklaviert, gekühlt, aseptisch auf einen pH von 7.0 eingestellt und aseptisch mit 10 mg Natriumsalz von Ampicillin in ein flüssiges Nährmedium gemischt. Der Transformant TTP4 von Beispiel A-3 wurde in das Medium überimpft und bei 37°C für ca. 20 Stunden unter Belüftungs-Bewegungs-Bedingungen inkubiert, um eine Impfkultur zu erhalten. Gemäß der Herstellung der Impfkultur wurden 7 l einer frischen Zubereitung des gleichen Nährmediums, wie in der Impfkultur verwendet, in einen 10 1-Fermenter gegeben, mit 70 ml der Impfkultur angeimpft und einer Inkubation für ca. 20 Stunden unter Belüftungs-Bewegungs-Bedingungen unterworfen. Die resultierende Kultur wurde in einer herkömmlichen Weise zentrifugiert, um die Zellen abzunehmen, die dann in 10 mM Phosphat-Puffer (pH 7.0) suspendiert wurden, zum Aufbrechen der Zellen Ultraschall ausgesetzt wurden und zentrifugiert wurden, um unlösliche Substanzen zu entfernen, gefolgt von Abnehmen eines Überstandes. Der Überstand wurde gegen 10 mM Phosphat-Puffer dialysiert und im Überstand wurde auf Trehalosephosphorylaseaktivität getestet, was enthüllte, dass ca. 700 Einheiten/l Kultur des Enzyms hergestellt worden waren.
Als eine erste Kontrolle wurde eine Impfkultur des Escherichia coli XL1-Blue-Stammes in ein Nährmedium in einer ähnlichen Weise wie bei der Kultur des vorstehenden Transformanten, außer, dass kein Ampicillin zu dem Kulturmedium gegeben wurde, überimpft und kultiviert. Die proliferierten Zellen wurden aufgebrochen, gefolgt von Abnehmen und Dialysieren des Überstandes. Als eine zweite Kontrolle wurde gemäß dem Verfahren von Versuch 1 eine Impfkultur von Thermoanaerobium brockii, ATCC 35047, stationär bei 60°C in einem Nährmedium kultiviert, das aus den gleichen Bestandteilen bestand, wie in der Kultur für den Transformanten verwendet wurden, außer, dass kein Ampicillin verwendet wurde, und ähnlich wie im Falle des Transformanten wurden die Zellen in der Kultur aufgebrochen, gefolgt von Abnehmen und Dialysieren des Überstandes. Es wurde keine Enzymaktivität des vorliegenden Enzyms in der dialysierten Lösung als die erste Kontrolle nachgewiesen. Die dialysierte Lösung als die zweite Kontrolle wies eine Enzymaktivität von ca. 2 Einheiten/l Kultur auf, welche niedriger als die des Transformanten TTP4 war.
Gemäß dem Verfahren von Versuch 2 wurde die dialysierte Lösung von Beispiel A-4 durch Säulenchromatographien unter Verwendung von „DEAE-TOYOPEARL^® 650 GEL" und „ULTROGEL^® AcA44 RESIN" gereinigt und das gereinigte Enzym wurde gemäß dem Verfahren von Versuch 3 analysiert, wobei enthüllt wurde, dass es ein Molekulargewicht von 88.000 ± 5.000 Dalton nach SDS-PAGE, ein Molekulargewicht von 190.000 ± 10.000 Dalton nach Gelfiltrationschromatographie, einen isoelektrischen Punkt von 5,4 ± 0,5 nach Elektrofokussierung unter Verwendung von Polyacrylamidgel, eine optimale Temperatur von ca. 70°C, einen optimalen pH von ca. 7.0 bis 7.5, eine thermische Stabilität von bis zu 60°C und eine pH-Stabilität von ca. 6.0 bis 9.0 hatte, wobei alle davon im Wesentlichen gleich waren, wie jene des Enzyms, welches in den Versuchen 1 und 2 hergestellt wurde. Diese Ergebnisse weisen daraufhin, dass die vorliegende Trehalosephosphorylase ausreichend durch die rekombinante DNS-Technologie hergestellt werden kann und dass die Enzymausbeute dabei wesentlich erhöht werden kann.
Beispiel A-5
Enzymlösung
Der Transformant TTP4 von Beispiel A-3 wurde in einem Nährmedium durch das Verfahren von Beispiel A-4 kultiviert. Zellen, die durch Zentrifugieren der Kultur erhalten wurden, wurden durch Ultraschall aufgebrochen und in einem Überstand der Suspension der aufgebrochenen Zellen wurde die Trehalosephosphorylaseaktivität gemessen. Die Aktivität betrug ca. 0,7 Einheiten/ml Kultur. Der Überstand wurde mit einer Ultrafiltrationsmembran konzentriert und das Konzentrat wurde dialysiert, wobei eine Enzymlösung mit einer Aktivität von ca. 10 Einheiten/ml Trehalosephosphorylase in einer Ausbeute von ca. 70 %, bezogen auf die Gesamtenzymaktivität der Kultur, erhalten wurde.
Beispiel A-6
Saccharid-Lösung, die Trehalose enthält
Zu 25 mM Dikaliumhydrogenphosphat/Zitronensäure-Puffer (pH 6.0), der 5 % Maltose enthielt, wurden 5 Einheiten/g Maltose einer kommerziell erhältlichen bakteriellen Maltosephosphorylase und 50 Einheiten/g Maltose Trehalosephosphorylase, die durch das Verfahren von Beispiel A-1 erhalten wurde, gegeben, gefolgt von der Inkubation bei 30°C für 120 Stunden. Das Reaktionsgemisch wurde bei 100°C für 30 min erwärmt, um die restlichen Enzyme zu inaktivieren, gekühlt, mit Aktivkohle in einer herkömmlichen Weise entfärbt, filtriert, entsalzt und mit Ionenaustauscherharzen in H- und OH-Form gereinigt und weiter eingeengt, wobei eine 75 %ige sirupartige Saccharid-Lösung, die Trehalose enthielt, in einer Ausbeute von ca. 95 %, bezogen auf das Material, Tfb., erhalten wurde.
Das Produkt, das ca. 45 % Trehalose, Tfb., enthält und eine zufriedenstellende Süße und eine geeignete Viskosität und Benetzungsfähigkeit aufweist, kann beliebig in Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika, Apothekerwaren und Formkörpern als ein Süßungsmittel, ein Geschmacksverbesserer, ein Stabilisator, ein Wachstumsförderer für Bifidobakterien und ein Mineralabsorptionsförderer verwendet werden.
Beispiel A-7
Mit Trehalose angereichertes Pulver
Eine Saccharid-Lösung als ein Material, das ca. 45 % Trehalose, Tfb., enthält, welche durch die Reaktion und Reinigung von Beispiel A-6 erhalten wurde, wurde eingestellt, um eine Konzentration von ca. 20 %, Tfb., zu ergeben, wobei dann mit 5 Einheiten/g trockener Feststoff von Glucoamylase gemischt wurde und bei einem pH von 4.5 und 40°C für 16 Stunden inkubiert wurde, um die restliche Maltose zu zersetzen. Das Reaktionsgemisch wurde bei 100°C für 30 min erwärmt, um die enzymatische Reaktion abzustoppen, und dann zu einer ca. 40 %igen Lösung eingeengt. Um den Trehalose-Gehalt zu erhöhen, wurde die konzentrierte Lösung fraktioniert, durch Bereitstellen von vier ummantelten Edelstahlsäulen mit jeweils 3 cm im Durchmesser und einem Meter in der Länge, die mit einer Wassersuspension von „XT-1016", ein stark saures Alkalimetallkationenaustauscherharz, Na-Form, das einen Polymerisationsgrad von 4 % aufweist und kommerziell von Tokyo Organic Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japan vertrieben wird, in einer Kaskadenreihenschaltung gepackt wurden, um eine Gesamtgelbetttiefe von ca. 4 m zu ergeben, wobei 5 v/v % der Lösung auf das Harz aufgebracht wurden, die Lösung durch Aufbringen von auf 40°C erwärmtem Wasser auf die Säulen bei einer RG von 0,15 fraktioniert wurde und die resultierenden an Trehalose reichen Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen wurden vereinigt, eingeengt, in Vakuum getrocknet und pulverisiert, wobei ein an Trehalose reiches Pulver in einer Ausbeute von ca. 40 %, bezogen auf das Material, Tfb., erhalten wurde.
Das Produkt enthält ca. 95 % Trehalose, Tfb., und weist eine zufriedenstellende Süße, die man schmecken kann, und eine geeignete Benetzungsfähigkeit auf und es kann beliebig in Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika, Apothekerwaren und Formkörpern als ein Süßungsmittel, ein Geschmacksverbesserer, ein Stabilisator, ein Wachstumsförderer für Bifidobakterien und ein Mineralabsorptionsförderer verwendet werden.
Beispiel A-8
Saccharid-Lösung, die Glucosyl-D-galactosid enthält
Eine wässrige Lösung, die 5 % Trehalose, 5 % D-Galactose und 5 mM Natriumdihydrogenphosphat enthielt, wurde eingestellt, um einen pH von 5.0 zu ergeben, mit 10 Einheiten/g Trehalose einer Trehalosephosphorylase, die durch das Verfahren von Beispiel A-1 erhalten wurde, gemischt und enzymatisch bei 60°C für 72 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 90°C für 30 min erwärmt, um das restliche Enzym zu inaktivieren, gekühlt, mit Aktivkohle in einer herkömmlichen Weise entfärbt, filtriert, entsalzt und mit Ionenaustauscherharzen in H- und OH-Form gereinigt und weiter eingeengt, wobei eine ca. 75 %ige sirupartige Saccharid-Lösung, die Glucosylsorbose enthielt, in einer Ausbeute von ca. 95 %, bezogen auf das Material, Tfb., erhalten wurde.
Das Produkt enthält ca. 22 % Glucosyl-D-galactosid, Tfb., und weist eine Süße von hoher Qualität und eine geeignete Viskosität und Benetzungsfähigkeit auf und es kann beliebig in Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika, Apothekerwaren und Formkörpern als ein Süßungsmittel, ein Geschmacksverbesserer, ein Stabilisator, ein Wachstumsförderer für Bifidobakterien und ein Mineralabsorptionförderer verwendet werden.
Beispiel A-9
Saccharid-Lösung, die Glucosyl-D-galactosid enthält
Eine wässrige Lösung, die 10 % Trehalose, 5 % D-Galactose und 5 mM Natriumdihydrogenphosphat enthielt, wurde eingestellt, um einen pH von 6.0 zu ergeben, mit 30 Einheiten/g Trehalose einer Trehalosephosphorylase, die durch das Verfahren von Beispiel A-1 erhalten wurde, gemischt und enzymatisch bei 60°C für 96 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 90°C für 30 min erwärmt, um das restliche Enzym zu inaktivieren, und gekühlt. Danach wurden 5 %, bezogen auf das Feuchtgewicht, von kommerziell erhältlichen Bäckerhefen zu dem resultierenden Gemisch gegeben, um D-Glucose in dem Reaktionsgemisch zu assimilieren, während der pH durch die Zugabe von 1 N Natriumchlorid-Lösung bei 5 bis 6 kontrolliert wurde und die Reaktionstemperatur bei 27°C für 6 Stunden gehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert, um die Hefen zu entfernen, und der resultierende Überstand wurde in einer herkömmlichen Weise mit Aktivkohle entfärbt, filtriert, entsalzt und mit Ionenaustauschern in H- und OH-Form gereinigt und eingeengt, wobei ein ca. 75 %iger Sirup, Tfb., in einer Ausbeute von ca. 65 %, bezogen auf das Material, Tfb., erhalten wurde.
Das Produkt enthält ca. 40 % Glucosyl-D-galactosid, Tfb., und weist eine Süße von hoher Qualität und eine geeignete Viskosität und Benetzungsfähigkeit auf und es kann beliebig in Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika, Apothekerwa ren und Formkörpern als ein Süßungsmittel, ein Geschmacksverbesserer, ein Stabilisator, ein Wachstumsförderer für Bifidobakterien und ein Mineralabsorptionsförderer verwendet werden.
Beispiel A-10
An Glucosyl-D-galactosid reiches Pulver
Eine Saccharid-Lösung als ein Material, das ca. 22 % Glucosyl-D-galactosid, Tfb., enthält, welches durch die Reaktion und Reinigung von Beispiel A-8 erhalten wurde, wurde eingestellt, um eine Konzentration von ca. 45 %, Tfb., zu ergeben. Um den Gehalt an Glucosyl-D-galactosid zu erhöhen, wurde die resultierende Lösung fraktioniert, durch Bereitstellen von vier ummantelten Edelstahlsäulen mit jeweils 3 cm im Durchmesser und einem Meter in der Länge, die mit einer Wassersuspension von „XT-1016", ein stark saures Alkalimetallkationenaustauscherharz, Na-Form, das einen Polymerisationsgrad von 4 aufweist und kommerziell von Tokyo Organic Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japan vertrieben wird, in einer Kaskadenreihenschaltung gepackt wurden, um eine Gesamtgelbetttiefe von ca. 4 m zu ergeben, wobei 5 v/v % der Lösung auf das Harz aufgebracht wurden, die Lösung durch Aufbringen von auf 40°C erwärmtem Wasser auf die Säulen bei einer RG von 0,15 fraktioniert wurde, während die Säuleninnentemperatur von 40°C gehalten wurde, und die resultierenden an Glucosyl-D-galactosid reichen Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen wurden vereinigt, eingeengt, in Vakuum getrocknet und pulverisiert, wobei ein an Glucosyl-D-galactosid reiches Pulver in einer Ausbeute von ca. 25 %, bezogen auf das Material, Tfb., erhalten wurde.
Das Produkt enthält ca. 70 % Glucosyl-D-galactosid, Tfb., und weist eine Süße von hoher Qualität und eine geeignete Viskosität und Benetzungsfähigkeit auf und es kann beliebig in Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika, Apothekerwaren und Formkörpern als ein Süßungsmittel, ein Geschmacksverbesserer, ein Stabilisator, ein Wachstumsförderer für Bifidobakterien und ein Mineralabsorptionsförderer verwendet werden.
Beispiel A-11
Saccharid-Lösung, die Glucosyl-D-xylosid enthält
Eine wässrige Lösung, die 5 % Trehalose, 2,5 % D-Xylose und 5 mM Natriumdihydrogenphosphat enthielt, wurde auf einen pH von 5.0 eingestellt, mit 15 Einheiten/g Trehalose einer Trehalosephosphorylase, die durch das Verfahren von Beispiel A-1 erhalten wurde, gemischt und enzymatisch bei 60°C für 72 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 90°C für 30 min erwärmt, um das restliche Enzym zu inaktivieren, gekühlt, mit Aktivkohle in einer herkömmlichen Weise entfärbt, filtriert, entsalzt und mit Ionenaustauscherharzen in H- und OH-Form gereinigt und weiter eingeengt, wobei ein ca. 75 %iger Sirup in einer Ausbeute von ca. 95 %, bezogen auf das Material, Tfb., erhalten wurde.
Das Produkt enthält ca. 20 % Glucosyl-D-xylosid, Tfb., und weist eine Süße von hoher Qualität und eine geeignete Viskosität und Benetzungsfähigkeit auf und es kann beliebig in Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika, Apothekerwaren und Formkörpern verwendet werden.
Beispiel A-12
An Glucosyl-D-xylosid reiches Pulver
Eine Saccharid-Lösung als ein Material, das ca. 20 % Glucosyl-D-xylosid, Tfb., enthält, welches durch die Reaktion und Reinigung von Beispiel A-11 erhalten wurde, wurde eingestellt, um eine Konzentration von ca. 45 %, Tfb., zu ergeben. Um den Gehalt an Glucosyl-D-xylosid zu erhöhen, wurde die resultierende Lösung gemäß dem Verfahren von Beispiel A-10 säulenchroma tographiert, außer, dass „DOWEX 50WX4 (Ca-Form)", ein stark saures Erdalkalimetallkationenaustauscherharz, das kommerziell von The Dow Chemical Co., Midland, Michigan, USA vertrieben wird, zum Sammeln von an Glucosyl-D-xylosid reichen Fraktionen verwendet wurde. Die Fraktionen wurden vereinigt, gereinigt, eingeengt, in Vakuum getrocknet und pulverisiert, wobei ein an Glucosyl-D-xylosid reiches Pulver in einer Ausbeute von ca. 25 %, Tfb., erhalten wurde.
Das Produkt enthält ca. 60 % Glucosyl-D-xylosid, Tfb., und weist eine Süße von hoher Qualität und eine geeignete Viskosität und Benetzungsfähigkeit auf und es kann beliebig in Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika, Apothekerwaren und Formkörpern verwendet werden.
Beispiel A-13
Saccharid-Lösung, die Glucosyl-D-fucosid enthält
Eine wässrige Lösung, die 5 % Trehalose, 2,5 % D-Fucose und 5 mM Dinatriumhydrogenphosphat enthielt, wurde eingestellt, um einen pH von 5.0 zu ergeben, mit 20 Einheiten/g Trehalose einer Trehalosephosphorylase, die durch das Verfahren von Beispiel A-1 erhalten wurde, gemischt und enzymatisch bei 60°C für 72 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 90°C für 30 min erwärmt, um das restliche Enzym zu inaktivieren, gekühlt, mit Aktivkohle in einer herkömmlichen Weise entfärbt, filtriert, entsalzt und mit Ionenaustauscherharzen in H- und OH-Form gereinigt und weiter eingeengt, wobei ein ca. 75 %iger Sirup in einer Ausbeute von ca. 95 %, bezogen auf das Material, Tfb., erhalten wurde.
Das Produkt enthält ca. 20 % Glucosyl-D-fucosid, Tfb., und weist eine Süße von hoher Qualität und eine geeignete Viskosität und Benetzungsfähigkeit auf und es kann beliebig in Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika, Medikamenten und Formkörpern verwendet werden.
Beispiel A-14
Saccharid-Pulver, das reich an Glucosyl-D-fucosid ist
Eine wässrige Lösung, die ca. 5 % Trehalose, 2,5 % D-Fucose und 5 mM Natriumdihydrogenphosphat enthielt, wurde eingestellt, um einen pH von 5.0 zu ergeben, mit 20 Einheiten/g Trehalose einer Trehalosephosphorylase, die durch das Verfahren von Beispiel A-1 erhalten wurde, gemischt und enzymatisch bei 60°C für 72 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 100°C erwärmt, während der pH bei alkalischen pHs von über 10 gehalten wurde, gekühlt, mit Aktivkohle in einer herkömmlichen Weise entfärbt, filtriert, entsalzt und mit Ionenaustauscherharzen in H- und OH-Form gereinigt und weiter eingeengt, wobei ein Pulver, das Glucosyl-D-fucosid enthält, in einer Ausbeute von ca. 60 %, bezogen auf das Material, Tfb., erhalten wurde.
Das Produkt enthält ca. 50 % Glucosyl-D-fucosid, Tfb., und weist eine Süße von hoher Qualität und eine geeignete Viskosität und Benetzungsfähigkeit auf und es kann beliebig in Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika, Apothekerwaren und Formkörpern verwendet werden.
Beispiel A-15
Saccharid-Pulver, das Glucosyl-L-fucosid enthält
Eine wässrige Lösung, die ca. 5 % Trehalose, 2,5 % L-Fucose und 5 mM Natriumdihydrogenphosphat enthielt, wurde eingestellt, um einen pH von 6.0 zu ergeben, mit 15 Einheiten/g Trehalose einer Trehalosephosphorylase, die durch das Verfahren von Beispiel A-1 erhalten wurde, gemischt und enzymatisch bei 60°C für 72 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 90°C für 30 min erwärmt, um das restliche Enzym zu inaktivieren, gekühlt, mit Aktivkohle in einer herkömmlichen Weise entfärbt, filtriert, entsalzt und mit Ionenaustauscherharzen in H- und OH-Form gereinigt und weiter eingeengt, wobei ein Pulver, das Glucosyl-L-fucosid enthielt, in einer Ausbeute von ca. 95 %, bezogen auf das Material, Tfb., erhalten wurde.
Das Produkt enthält ca. 20 % Glucosyl-L-fucosid, Tfb., und weist eine Süße von hoher Qualität und eine geeignete Benetzungsfähigkeit auf und es kann beliebig in Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika, Apothekerwaren und Formkörpern verwendet werden.
Beispiel A-16
Saccharid-Lösung, die Trehalose enthält
Zu 25 mM Dikaliumhydrogenphosphat/Zitronensäure-Puffer (pH 6.0), der 5 % Maltose enthielt, wurden 5 Einheiten/g Maltose einer kommerziell erhältlichen Maltosephosphorylase und 50 Einheiten/g Maltose einer Trehalosephosphorylase, die durch das Verfahren von Beispiel A-5 erhalten wurde, gegeben und es wurde einer enzymatischen Reaktion bei 30°C für 120 Stunden unterworfen. Das Reaktionsgemisch wurde bei 100°C für 30 min erwärmt, um die restlichen Enzyme zu inaktivieren, gekühlt, mit Aktivkohle in einer herkömmlichen Weise entfärbt, filtriert, entsalzt und mit Ionenaustauscherharzen in H- und OH-Form gereinigt und weiter eingeengt, wobei ein ca. 75 %iger Sirup, Tfb., in einer Ausbeute von ca. 95 %, bezogen auf das Material, Tfb., erhalten wurde.
Das Produkt enthält ca. 45 % Trehalose, Tfb., und weist eine Süße von hoher Qualität und eine geeignete Viskosität und Benetzungsfähigkeit auf und es kann beliebig in Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika, Apothekerwaren und Formkörpern als ein Süßungsmittel, ein Geschmacksverbesserer, ein Stabilisa tor, ein Wachstumsförderer für Bifidobakterien und ein Mineralabsorptionsförderer verwendet werden.
Beispiel A-17
Saccharid-Lösung, die Glucosyl-D-fucosid enthält
Eine wässrige Lösung, die 5 % Trehalose, 2,5 % D-Fucose und 5 mM Dinatriumhydrogenphosphat enthielt, wurde eingestellt, um einen pH von 5.0 zu ergeben, mit 20 Einheiten/g Trehalose einer Trehalosephosphorylase, die durch das Verfahren von Beispiel A-5 erhalten wurde, gemischt und enzymatisch bei 60°C für 72 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 90°C für 30 min erwärmt, um das restliche Enzym zu inaktivieren, gekühlt, mit Aktivkohle in einer herkömmlichen Weise entfärbt, filtriert, entsalzt und mit Ionenaustauscherharzen in H- und OH-Form gereinigt und weiter eingeengt, wobei ein ca. 75 %iger Sirup in einer Ausbeute von ca. 95 %, bezogen auf das Material, Tfb., erhalten wurde.
Das Produkt enthält ca. 20 % Glucosyl-D-fucosid, Tfb., und weist eine Süße von hoher Qualität und eine geeignete Viskosität und Benetzungsfähigkeit auf und es kann beliebig in Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika, Apothekerwaren und Formkörpern verwendet werden.
Das folgende Beispiel B erläutert die vorliegenden Saccharid-Zusammensetzungen, die Glucosyl-transferierte Saccharide enthalten:
Beispiel B-1
Süßungsmittel
Zu einem Gewichtsteil eines an Glucosyl-D-galactosid reichen Pulvers, das durch das Verfahren von Beispiel A-10 erhalten wurde, wurden 0,05 Ge wichtsteile „αG SWEET", ein α-Glycosylsteviosid, das kommerziell von Toyo Sugar Refining Co., Ltd., Tokio, Japan vertrieben wird, gegeben und das Gemisch wurde zur Homogenität zu einem pulverförmigen Süßungsmittel gemischt. Das Produkt ist ein Süßungsmittel von hoher Qualität mit einer ca. zweifach höheren Süβkraft als Saccharose und der Hälfte des kalorischen Werts von Saccharose bezüglich des süßenden Pulvers. Deshalb kann das Produkt zufriedenstellend als ein Süßungsmittel mit wenig Kalorien zum Süßen von Nahrungsmittelprodukten mit wenig Kalorien für Personen, die auf die Aufnahme von wenig Kalorien eingeschränkt sind, wie korpulente Personen und Diabetiker, verwendet werden. Da das Produkt wenig unlösliche Glucane und Säuren durch Zahnkaries-hervorrufende Mikroorganismen erzeugt, kann es geeigneterweise zum Süßen von Zahnkaries-inhibierenden Nahrungsmittelprodukten verwendet werden.
Beispiel B-2
Bonbon
Dreißig Gewichtsteile einer Saccharid-Lösung, die Glucosyl-D-galactosid enthielt, das durch das Verfahren von Beispiel A-9 erhalten wurde, wurden zu 80 Gewichtsteilen eines hydrierten Malzsirups mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 25 % gegeben und durch Mischen gelöst und die resultierende Lösung wurde eingeengt, um einen Feuchtigkeitsgehalt von unter 2 % zu ergeben, unter verringerten Drucken, mit einem Gewichtsteil Zitronensäure und geeigneten Mengen eines Zitronenaromas und eines farbgebenden Mittels geknetet, gefolgt von Kneten und Formen des Gemisches zu einem Bonbon. Das Produkt hat eine Süße von hoher Qualität, eine niedrigere Benetzungsfähigkeit und eine zufriedenstellende scharte Eigenschaft ohne Schmelzen zu verursachen.
Beispiel B-3
Kaugummi
Vier Gewichtsteile eines Pulvers, das reich an Glucosyl-D-xylosid war, welches durch das Verfahren von Beispiel A-12 erhalten wurde, wurden mit 3 Gewichtsteilen Glucose und 2 Gewichtsteilen einer Gummigrundlage gemischt, die durch Erwärmen geschmolzen wurde, bis sie erweichte, und es wurde weiter mit einer geeigneten Menge eines Minzearomas gemischt, gefolgt von Formen des Gemisches durch Kneten mit einer Walze zu einem Kaugummi. Das Produkt hat eine zufriedenstellende Textur und Aroma.
Beispiel B-4
Schokolade
Fünfzehn Gewichtsteile eines Pulvers, das reich an Glucosyl-D-fucosid war, welches durch das Verfahren von Beispiel A-14 erhalten wurde, wurden mit 40 Gewichtsteilen Kakaopaste, 10 Gewichtsteilen Kakaobutter, 10 Gewichtsteilen Saccharose und 15 Gewichtsteilen Magermilch gemischt und das Gemisch wurde durch eine Mahlvorrichtung geführt, um die Korngröße zu erniedrigen. Danach wurde das resultierende Gemisch in eine Konche gegeben, mit 0,5 Gewichtsteilen Lecithin gemischt und bei 50°C für zwei Tage und Nächte durchgeknetet. Das geknetete Gemisch wurde in eine Formgebungsmaschine gegossen, geformt und zu einer Schokolade verfestigt. Das Produkt, das frei von Fett- und Zuckerausblühungen war, wies einen zufriedenstellenden Geschmack, Aroma und Schmelzvermögen auf unserer Zunge auf.
Beispiel B-5
Eiercreme
Zu 400 Gewichtsteilen eines Pulvers, das reich an Glucosyl-L-fucosid war, welches durch das Verfahren von Beispiel A-15 erhalten wurde, wurden 500 Gewichtsteile Maisstärke, 500 Gewichtsteile Maltose und 5 Gewichtsteile Salz gegeben und das Gemisch wurde ausreichend durch Passieren durch ein Sieb gemischt, mit 1.400 Gewichtsteilen frischen Eiern gemischt, gerührt, schrittweise mit 5.000 Gewichteilen einer siedenden Milch gemischt und über einem schwachen Feuer während Rühren erwärmt. Das Erwärmen wurde beendet, als die Maisstärke vollständig geliert war, wobei es halb durchsichtig war, dann wurde gekühlt, mit einer kleinen Menge an Vanillearoma gemischt, wobei eine Eiercreme erhalten wurde. Das Produkt weist eine glatte Oberfläche und einen zufriedenstellenden Geschmack, der frei von starker Süße ist, auf.
Beispiel B-6
Uiro Stärkepaste)
Zu 90 Gewichtsteilen einer Saccharid-Lösung, die Glucosyl-D-fucosid enthielt, welches durch das Verfahren von Beispiel A-13 erhalten wurde, wurden 90 Gewichtsteile Reispulver, 20 Gewichtsteile Maisstärke, 20 Gewichtsteile Zucker, ein Gewichtsteil Matcha (ein grüner Tee)-Pulver und eine geeignete Menge an Wasser gegeben und das Gemisch wurde geknetet, in einen Behälter gegeben und für 60 min zu einer Matcha-uiro gedämpft. Das Produkt hat einen zufriedenstellenden Glanz, eine scharte Eigenschaft, Aroma und Geschmack. Die Retrogradation der Stärke wird gut verhindert, was in einer relativ langen Haltbarkeitsdauer resultiert.
Beispiel B-7
Bettara-zuke (frische Rettichpickles)
Es wurde eine Vormischung für Bettara-zuke hergestellt, indem ein Gewichtsteil einer Saccharid-Lösung, die Glucosyl-D-galactosid enthielt, welches durch das Verfahren von Beispiel A-8 erhalten wurde, mit 3 Gewichtsteilen Maltose, 0,05 Gewichtsteilen einer Lakritzzubereitung, 0,008 Gewichtsteilen Äpfelsäure, 0,07 Gewichtsteilen Natriumglutamat, 0,03 Gewichtsteilen Kaliumsorbat und 0,2 Gewichtsteilen Pullulan bis zur Homogenität gemischt wurden. Dreißig Kilogramm Rettich wurden zuerst mit Salz in einer herkömmlichen Weise eingelegt, dann mit Zucker eingelegt und in einer Würzlösung eingeweicht, die mit 4 kg der Vormischung hergestellt worden war, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde. Das Produkt hat eine zufriedenstellende Farbe, Glanz und Duft, sowie eine geeignete Süße und eine zufriedenstellende scharfe Eigenschaft.
Beispiel B-8
Getränk mit Milchsäurebakterien
Einhundertdreißig Gewichtsteile einer Saccharid-Lösung, die Glucosyl-D-xylosid enthielt, welches durch das Verfahren von Beispiel A-11 erhalten wurde, 175 Gewichtsteile Magermilch und 50 Gewichtsteile „NYUKAOLIGO^®", ein Pulver mit hohem Gehalt an Lactosaccharose, das kommerziell von Hayashibara Shoji, Inc., Okayama, Japan vertrieben wird, wurden in 1.150 Gewichtsteilen Wasser gelöst und die Lösung wurde bei 65°C für 30 min sterilisiert, auf 40°C gekühlt und in einer herkömmlichen Weise mit 30 Gewichtsteilen Milchsäurebakterien als ein Starter angeimpft, gefolgt von der Inkubation bei 37°C für 8 Stunden, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde. Das Produkt ist ein Getränk, das Milchsäurebakterien enthält und ein zufrieden stellendes Aroma und Geschmack aufweist. Das Produkt enthält Oligosaccharide, die die Bakterien stabilisieren und das Wachstum fördern.
Beispiel B-9
Hautcreme
Zu 4 Gewichtsteilen eines Pulvers, das reich an Trehalose war, welches durch das Verfahren von Beispiel A-7 erhalten wurde, wurden 2 Gewichtsteile Polyoxyethylenglycolmonostearat, 5 Gewichtsteile selbstemulgierendes Glycerinmonostearat, 2 Gewichtsteile α-Glycosylrutin, ein Gewichtsteil Paraffinöl, 10 Gewichtsteile Glyceroltrioctanat und eine geeignete Menge eines Antiseptikums gegeben und das Gemisch wurde durch Erwärmen in einer herkömmlichen Weise gelöst, mit 5 Gewichtsteilen 1,3-Butylenglycol und 66 Gewichtsteilen veredeltem Wasser gemischt, mit einer Homogenisiervorrichtung emulgiert und mit einer geeigneten Menge eines Aromas zu einer Hautcreme gemischt. Das Produkt mit einer guten Ausbreitungsfähigkeit kann beliebig als ein Sonnenschutzmittel, Hautpflegemittel und Hautbleichungsmittel verwendet werden.
Beispiel B-10
Zahnpasta
Fünfundvierzig Gewichtsteile Calciumhydrogenphosphat, 1,5 Gewichtsteile Natriumlaurylsulfat, 25 Gewichtsteile Glycerin, 0,5 Gewichtsteile Polyoxyethylensorbitanlaurat, 0,02 Gewichtsteile Saccharin, 0,05 Gewichtsteile eines Antiseptikums und 13 Gewichtsteile Wasser wurden mit 15 Gewichtsteilen einer Saccharid-Lösung, die reich an Trehalose war, welche durch das Verfahren von Beispiel A-6 erhalten wurde, zu einer Zahnpasta gemischt.
Das Produkt mit einem hervorragenden Glanz und Reinigungsvermögen kann geeigneterweise als ein Zahnputzmittel verwendet werden.
Beispiel B-11
Nahrung für Intubationsernährung
Es wurde eine Zusammensetzung hergestellt, die aus den folgenden Bestandteilen bestand: 80 Gewichtsteile eines Pulvers, das reich an Glucosyl-D-galactosid war, welches durch das Verfahren von Versuch 8 erhalten wurde, 190 Gewichtsteile getrockneter Eidotter, 209 Gewichtsteile Magermilch, 4,4 Gewichtsteile Natriumchlorid, 1,85 Gewichtsteile Kaliumchlorid, 4 Gewichtsteile Magnesiumsulfat, 0,01 Gewichtsteil Thiamin und 0,1 Gewichtsteil Natriumascorbat, 0,6 Gewichtsteile Vitamin E-acetat und 0,04 Gewichtsteile Nicotinamid. Fünfundzwanzig Gramm-Aliquote der Zusammensetzung wurden in kleine laminierte Aluminiumtüten gespritzt, die dann wärmeversiegelt wurden, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde.
Eine Tüte des Produkts wird in ca. 150 bis 300 ml Wasser zu einer Ergänzungsnahrung gelöst, bevor es über die Nasenhöhle, den Rachen oder den Magen verabreicht wird.
Beispiel B-12
Erdbeermarmelade
Einhundertfünfzig Gewichtsteile frische Erdbeeren, 60 Gewichtsteile Saccharose, 20 Gewichtsteile Maltose, 40 Gewichtsteile einer Saccharid-Lösung, die Trehalose enthielt, welche durch das Verfahren von Beispiel A-16 erhalten wurde, 5 Gewichtsteile Pektin und ein Gewichtsteil Zitronensäure. Das Gemisch wurde in einer Pfanne aufgekocht und für das gewünschte Produkt in Flaschen abgefüllt. Das Produkt hat einen zufriedenstellenden Geschmack, Aroma und Farbe.
Beispiel B-13
Gesüßte Kondensmilch
In 100 Gewichtsteilen Frischmilch wurden ein Gewichtsteil Saccharose und 3 Gewichtsteile einer Saccharid-Lösung, die Glucosyl-D-fucosid enthielt, welches durch das Verfahren von Beispiel A-17 erhalten wurde, gelöst und die Lösung wurde durch Erwärmen auf einer Plattenheizvorrichtung sterilisiert, kondensiert, um eine Konzentration von ca. 70 % zu ergeben, und aseptisch für das gewünschte Produkt in Dosen abgefüllt. Das Produkt hat eine milde Süße, Aroma und Geschmack und es kann beliebig als ein Würzmittel für Nahrungsmittel für Kinder, Früchte, Kaffees, Kakaos und Tees verwendet werden.
[Wirkung der Erfindung]
Wie aus dem Vorstehenden ersichtlich ist, wurde die vorliegende Erfindung basierend auf einer Entdeckung einer neuen Trehalosephosphorylase gemacht, die eine höhere optimale Temperatur und thermische Stabilität aufweist, als jene von herkömmlichen Trehalosephosphorylasen sind. Die Trehalosephosphorylase gemäß der vorliegenden Erfindung weist eine pH-Stabilität in einem relativ großen Bereich auf, in welchem der optimale pH liegt. Die Trehalosephosphorylase kann durch Mikroorganismen hergestellt werden, die zur Herstellung des Enzyms in einer zufriedenstellend hohen Ausbeute in der Lage sind. Folglich können, wenn die vorliegende Trehalosephosphorylase mit β-D-Glucose-1-Phosphorsäure als ein Sacchariddonor in der Gegenwart von anderen Sacchariden in Kontakt gebracht wird, Glucosyl-transferierte Saccharide, einschließlich Glucosyl-D-galactosid, die herkömmlich bekannt sind, aber kaum erhalten werden können, in einem industriellen Maßstab und zu relativ niedrigen Kosten hergestellt werden.
Die Glucosyl-transferierten Saccharide und Saccharid-Zusammensetzungen, die die gleichen enthalten, können als Süßungsmittel mit einer Süße von relativ hoher Qualität, Geschmacksverbesserer, Qualitätsverbessernde Mittel, Körpergestalt verleihende Mittel, viskositätsregulierende Mittel, feuchtigkeitsregulierende Mittel, Glanz verleihende Mittel und Ergänzungsnahrungsmittel in Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika, Medikamenten und Formkörpern verwendet werden. Wegen dieser herausragenden Charakteristika der vorliegenden Erfindung leistet sie einen großen Beitrag auf den Gebieten Nahrungsmittel, Kosmetika und Medikamenten und für die Landwirtschaft, das Fischereiwesen, die Tier- und Pflanzenzucht und die chemischen Industrien. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Eine Trehalosephosphorylase, die erhältlich ist von einem Mikroorganismus der Gattung Thermoanaerobium und die folgenden Eigenschaften hat: (1) Wirkung Fähig zur Bildung von D-Glucose und β-D-Glucose-1-Phosphorsäure und/oder ihres Salzes aus Trehalose und anorganischer Phosphorsäure und/oder ihres Salzes und umgekehrt, und fähig zur Katalyse der Übertragungsreaktion einer Glucosylgruppe auf Galactose unter Nutzung von β-D-Glucose-1-Phosphorsäure und/oder ihres Salz als Glucosyldonor; (2) Thermische Stabilität Stabil bis zu einer Temperatur von ca. 60°C bei Inkubation bei pH 7.0 für eine Stunde; und (3) Aminosäuresequenz Aufweisend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der in SEQ ID No. 4 gezeigten und Varianten davon, wobei ein oder mehrere Aminosäurereste in SEQ ID No. 4 gelöscht, ersetzt und/oder ergänzt sind mit einer oder mehr Aminosäuren.
Eine Trehalosephosphorylase gemäß Anspruch 1, die die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat: (1) Molekulargewicht 000 ± 5.000 Dalton nach Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE); (2) Optimale Temperatur Ca. 70°C bei Inkubation bei pH 7.0 für 30 Minuten; (3) Optimaler pH Ca. 7.0 bis 7.5 bei Inkubation bei 60°C für 30 Minuten; und (4) pH-Stabilität Stabil bei pHs von ca. 6.0 bis 9.0 bei Inkubation bei 4°C für 24 Stunden.
Eine DNS, die die Trehalosephosphorylase aus Anspruch 1 oder Anspruch 2 kodiert.
Eine DNS gemäß Anspruch 3, die eine Nucleotidsequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No. 5 und ihren komplementären:
Eine DNS gemäß Anspruch 4, wobei eine oder mehrere Basen ersetzt sind durch andere Basen hinsichtlich der Entartung des genetischen Codes ohne Veränderung der durch die DNS kodierten Aminosäuresequenz.
Ein selbstreplizierender Vektor, enthaltend die DNS gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5.
Ein Wirtsmikroorganismus, enthaltend die DNS gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5.
Ein Verfahren zur Herstellung der Trehalosephosphorylase nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, mit den Schritten der Kultivierung eines Mikroorganismus, der die Trehalosephosphorylase nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 in einem Nährmedium produziert, um Trehalosephosphorylase herzustellen, und der Abnahme der produzierten Trehalosephosphorylase aus der Kultur.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei der Mikroorganismus der Gattung Thermoanaerobium angehört.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei der Mikroorganismus der Art Thermoanaerobium brockii angehört.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei der Mikroorganismus ein Transformant ist, der hergestellt wird durch Einführung einer DNS, die die Trehalosephosphorylase nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 kodiert, in einen geeigneten Wirt.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die hergestellte Trehalosephosphorylase abgenommen wird durch eine oder mehrere Techniken aus der Gruppe bestehend aus Dialyse, Aussalzen, Gelfiltration, Einengung, Trennsedimentation, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Adsorptionschromatographie, hydrophobe Chromatographie, Reversed-Phase-Chromatographie, Affinitätschromatographie, Gelelektrophorese und Elektrofokusierung.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Saccharid-Zusammensetzung, enthaltend ein D-Glucosyl-transferiertes Saccharid, mit einem Schritt des Inkontaktbringens der Trehalosephosphorylase nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 mit β-D-Glucose-1-Phosphorsäure und/oder ihrem Salz und anderem Saccharid zur Herstellung des D-Glukosyl-transferierten Saccharids.
Ein Verfahren nach Anspruch 13, wobei die β-D-Glucose-1-Phosphorsäure und/oder ihr Salz erhalten wird durch Inkontaktbringen der Trehalosephosphorylase mit Trehalose in der Gegenwart einer anorganischen Phosphorsäure und/oder ihres Salzes, Inkontaktbringen einer Maltosephosphorylase mit Maltose in der Gegenwart einer anorganischen Phosphorsäure und/oder ihres Salzes oder Inkontaktbringen einer Kojibiosephosphorylase mit Kojibiose in der Gegenwart einer anorganischen Phosphorsäure und/oder ihres Salzes.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 13 oder Anspruch 14, wobei das andere Saccharid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus D-Xylose, D-Galactose, D-Glucose, D-Fucose und L-Fucose.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15, mit einer Technik ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Säulenchromatographien und Hefen-benutzenden Fermentationsmethoden als Methoden zur Entfernung von anderen Verunreinigungen als Glucosyl-transferierten Sacchariden, die während der enzymatischen Reaktion hergestellt wurden und/oder in der Reaktionsmischung verblieben.
Ein Verfahren zur Herstellung von Trehalose, mit dem Inkontaktbringen der Trehalosephosphorylase nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 mit Maltose zusammen mit einer Maltosephosphorylase in der Gegenwart einer anorganischen Phosphorsäure und/oder ihres Salzes zur Herstellung von Trehalose oder Inkontaktbringen der Trehalosephosphorylase mit Kojibiose zusammen mit einer Kojibiosephosphorylase in der Gegenwart einer anorganischen Phosphorsäure und/oder ihres Salzes zur Herstellung von Trehalose.