DE60128944T2 - Polypeptide mit alpha-isomaltosyl transferase aktivität - Google Patents

Polypeptide mit alpha-isomaltosyl transferase aktivität Download PDF

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Description

  • Technischer Bereich
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Polypeptide, welche eine Aktivität zur Bildung eines cyclischen Tetrasaccharids mit einer Cyclo-{→6)-α-D-Glucopyranosyl-(1→3)-α-D-Glucopyranosyl-(1→6)-α-D-Glucopyranosyl-(1→3)-α-D-Glucopyranosyl-(1→}-Struktur aus einem Saccharid mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 3 oder höher haben und das sowohl die α-1,6 glykosidische Bindung als eine Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende als auch die α-1,4 glykosidische Bindung außer der genannten Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende aufweist und die eine Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 umfassen, wobei die Aminosäurensequenz Deletion, Austausch oder Addition in einer bis zehn Aminosäureresten aufweist.
  • Genauer, bezieht sich die Erfindung auf Polypeptide, welche die Aktivität zur Herstellung eines cyclischen Tetrasaccharids mit einer Cyclo-{→6)-α-D-Glucopyranosyl-(1→3)-α-D-Glucopyranosyl-(1→6)-α-D-Glucopyranosyl-(1→3)-α-D-Glucopyranosyl-(1→}-Struktur aus einem Saccharid mit Glukose-Polymerisationsgrad von drei oder höher haben und das sowohl die α-1,6 glykosidische Bindung als eine Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende als auch die α-1,4 glykosidische Bindung außer der genannten Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende aufweist, und welche die Aminosäurensequenz von entweder SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 aufweisen, wobei die Aminosäurensequenz Deletion, Substitution oder Addition von einer bis zehn Aminosäureresten der SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 aufweist, in einer DNA, welche die Aminosäurensequenz oder die Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 in einer replizierbaren rekombinanten DNA kodiert, welche eine DNA umfasst, die das Polypeptid und einen autonom replizierbaren Vektor zu Transformanten kodiert, die geschaffen wurden, indem die rekombinanten DNAs in geeignete Wirte eingeführt wurden, und auf ein Verfahren zur Herstellung der Polypeptide.
  • STAND DER TECHNIK
  • Es sind etliche Saccharide bekannt, die aus Glukosemolekülen als Bestandteile zusammengesetzt sind, beispielsweise partielle Stärkehydrolysate, die aus Stärken als Materialien einschließlich Amylosen, Amylodextrinen, Maltodextrinen, Maltooligosacchariden und Isomaltooligosacchariden hergestellt wurden. Von diesen Sacchariden ist auch bekannt, dass sie für gewöhnlich nicht-reduzierende und reduzierende Gruppen an ihren Molekülenden haben und Reduzierbarkeit zeigen. Normalerweise sind partielle Stärkehydrolysate, die eine starke Reduktionskraft auf einer trockenen Feststoffbasis haben, dafür bekannt, dass sie die Eigenschaften eines relativ niedrigen Molekulargewichts und einer relativ niedrigen Viskosität, einer relativ starken Süße und Reaktivität, einer hohe Reaktivität mit Aminogruppen enthaltenen Substanzen aufweisen, wie zum Beispiel Aminosäuren und Proteine, durch eine Aminocarbonylreaktion, die Bräunen und unangenehmen Geruch hervorrufen und leicht Verderb verursachen kann. Daher werden seit langem Verfahren zur Verringerung oder Beseitigung der Reduktionsstärke von reduzierenden Sacchariden gefordert, ohne dass die Glukosereste verändert werden. Wie zum Beispiel im „Journal of American Chemical Society, Vol. 71, 353-358 (1949)" offenbart wurde, wurde von Verfahren zur Bildung von α-, β-, ☐ Cyclodextriden berichtet, die aus 6, 7 oder 8 Glukosemolekülen zusammengesetzt sind, welche über die α-1,4 glykosidische Bindung verbunden sind, indem „Macerans Amylase" mit Stärken in Kontakt gebracht wird. Heutzutage werden diese Cyclodextrine in einem industriellen Maßstab hergestellt und in unterschiedlichsten Gebieten unter Verwendung ihrer inhärenten Eigenschaften verwendet, wie zum Beispiel ihrer Nicht-Reduzierbarkeit, Geschmacksneutralität und ihrer Fähigkeiten, Einschlüsse zu bilden. Wie zum Beispiel in dem japanischen Patent Kokai mit Nummern 143,876/95 und 213,283 offenbart ist, die vom Anmelder der vorliegenden Erfindung angemeldet wurden, ist ein Verfahren zur Herstellung von Trehalose bekannt, die aus zwei, über die α,α-Bindung verbundene Glukosemoleküle zusammengesetzt ist, indem ein nicht-reduzierendes Saccharid bildendes Enzym und ein Trehalose freisetzendes Enzym mit partiellen Stärkehydrolysaten, wie zum Beispiel Maltooligosacchariden, in Kontakt gebracht wird. Gegenwärtig wird Trehalose industriell aus Stärken hergestellt und in verschiedenen Gebieten verwendet, indem ihre vorteilhafte Nicht-Reduzierbarkeit, milde und hochwertige Süße eingesetzt wird. Wie oben beschrieben, wird Trehalose mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 2, und α-, β- und ☐-Cyclodextrin mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 6, 7 und 8 in industriellem Maßstab hergestellt und angesichts ihrer vorteilhaften Eigenschaften verwendet, jedoch sind die Arten der nicht- oder gering-reduzierenden Sacchariden beschränkt, so dass weitere verschiedene Saccharide außer diesen Sacchariden stark benötigt werden.
  • Kürzlich wurde ein neues cyclisches Tetrasaccharid, das aus Glukosen aufgebaut ist, offenbart. Zum Beispiel zeigt das „Eu ropean Journal of Biochemistry, Vol. 226, 641-648 (1994)", dass ein cyclisches Tetrasaccharid mit einer Cyclo-{→6)-α-D-Glucopyranosyl-(1→3)-α-D-Glucopyranosyl-(1→6)-α-D-Glucopyranosyl-(1→3)-α-D-Glucopyranosyl-(1→}-Struktur (in der vorliegenden Beschreibung nachfolgend „Cyclotetrasaccharid" genannt, soweit nicht anders angegeben) hergestellt wird, indem ein hydrolysierendes Enzym, Alternanase, mit Alternan in Kontakt gebracht wird, das mit Glukosemolekülen über die abwechselnden α-1,3 und α-1,6 Bindungen verbunden ist, worauf die Kristallisation in Anwesenheit von Methanol folgt. Da Cyclotetrasaccharid ein Zucker ist mit einer cyclischen Struktur und keine Reduktionsstärke hat, wird erwartet, dass das Saccharid keine Amino-Carbonylreaktivität zeigt, und nützlich ist, durch seine Fähigkeit, Einschlüsse zu bilden, flüchtige organische Verbindungen zu stabilisieren, und dass es verarbeitet werden kann, ohne dass Bräunung und Verderb zu befürchten sind. Es ist jedoch schwierig, Alternan als ein Material und Alternanase als ein Enzym zur Herstellung von Cyclotetrasaccharid zu erhalten. Darüber hinaus war es äußerst schwierig, einen Mikroorganismus, der das Enzym produziert, zu erhalten.
  • Unter diesen Umständen unternahmen die Erfinder der vorliegenden Erfindung jede Anstrengung, ein neuartiges Verfahren zur industriellen Produktion von Cyclotetrasaccharid zu untersuchen. Wie in der PCT/JP01/04276 offenbart, entdeckten die Erfinder der vorliegenden Erfindung Mikroorganismen der Gattungen Bacillus und Arthrobakter, die ein absolut neues und bislang unbekanntes Enzym herstellen, ein α-Isomaltosyl transferierendes Enzym zur Herstellung eines Cyclotetrasaccharids aus einem Saccharid mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 3 oder höher, und das sowohl die α-1,6 glykosidische Bindung als eine Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende als auch die α-1,4 glykosidische Bindung außer der Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende aufweist. Sie entdeckten und offenbarten in der PCT/JP01/06412 , dass diese Mikroorganismen ein weiteres, neues Enzym produzierten, ein α-Isomaltosylglukosaccharid bildendes Enzym, das ein Saccharid mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 3 oder höher herstellt und das sowohl die α-1,6 glykosidische Bindung als eine Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende als auch die α-1,4 glykosidische Bindung außer der Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende aufweist, aus Sacchariden mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 2 oder höher. Ferner entdeckten die Erfinder der vorliegenden Erfindung, dass Cyclotetrasaccharid aus Stärkesacchariden mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 3 oder höher erhalten werden kann, unter Verwendung des α-Isomaltosyl transferierenden Enzyms und des α-Isomaltosylglukosaccharid bildenden Enzyms. Da jedoch die Produktivitäten des α-Isomaltosyl transferierenden Enzyms dieser Mikroorganismen nicht ausreichend waren, ist eine Kultivierung dieser Mikroorganismen in großem Maßstab schwierig für die Produktion von Cyclotetrasaccharid in industriellem Maßstab.
  • Zurzeit stellt sich heraus, dass die Art des Enzyms ein Polypeptid ist und dass die enzymatische Aktivität durch seine Aminosäurensequenz gesteuert wird, und auch, dass eine DNA die Aminosäurensequenz kodiert. Falls ein Gen, das das Polypeptid kodiert, isoliert wird, und falls seine Nukleotidsequenz bestimmt wird, wird es daher relativ einfach sein, die gewünschte Menge des Polypeptids mit einem Verfahren herzustellen, das folgende Schritte des Schaffens einer rekombinanten DNA, die ein Gen enthält, das das Polypeptid kodiert, des Einführens der rekombinanten DNA in Wirtszellen von Mikroorganismen, Tie ren oder Pflanzen und des Kultivierens der erhaltenen Transformanten umfasst.
  • Unter diesen Umständen sind die Isolierung eines Gens, das ein Polypeptid als Art eins α-Isomaltosyl transferierenden Enzyms kodiert, das Sequenzieren der Nukleotidsequenz und ein stabile Darstellung des Polypeptids in großem Maßstab und zu relativ geringen Kosten gefordert.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Die erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Polypeptid zu etablieren, das eine α-Isomaltosyl transferierende enzymatrische Aktivität hat, welche die Bildung von Cyclotetrasaccharid aus einem Saccharid mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 3 oder höher katalysiert, und das sowohl die α-1,6 glykosidische Bindung als eine Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende als auch die α-1,4 glykosidische Bindung außer der Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende aufweist (nachfolgend kann das oben beschriebene Polypeptid als „das Polypeptid der vorliegenden Erfindung" abgekürzt werden).
  • Die zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, eine DNA zur Verfügung zu stellen, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert.
  • Die dritte Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, eine replizierbare rekombinante DNA zur Verfügung zu stellen, die die DNA umfasst.
  • Die vierte Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, einen durch die rekombinante DNA transformierten Transformanten zur Verfügung zu stellen.
  • Die fünfte Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung unter Verwendung des Transformanten zur Verfügung zu stellen.
  • Die vorliegende Erfindung löst die erste Aufgabe, indem ein Polypeptid, das eine Aktivität zur Herstellung eines Cyclotetrasaccharids mit einer Cyclo-{→6)-α-D-Glucopyranosyl-(1→3)-α-D-Glucopyranosyl-(1→6)-α-D-Glucopyranosyl-(1→3)-α-D-Glucopyranosyl-(1→}-Struktur aus einem Saccharid mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 3 oder höher und das sowohl die α-1,6 glykosidische Bindung als eine Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende als auch die α-1,4 glykosidische Bindung außer der genannten Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende hat, und ein Polypeptid, das eine Aminosäurensequenz mit Deletion, Substitution oder Addition von einem bis zehn Aminosäureresten der SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 umfasst, bereitgestellt wird.
  • Die vorliegende Erfindung löst die zweite, oben beschriebene Aufgabe, indem sie eine DNA bereitstellt, die das Polypeptid kodiert, das die Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 oder das oben beschriebene Polypeptid umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung löst die dritte, oben beschriebene Aufgabe, indem sie eine replizierbare rekombinante DNA bereitstellt, die eine DNA, die das Polypeptid kodiert, und einen autonom replizierbaren Vektor umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung löst die vierte, oben beschriebene Aufgabe, indem ein Transformant bereitgestellt wird, der durch Einführen der rekombinanten DNA in einen geeigneten Wirt hergestellt wurde.
  • Die vorliegende Erfindung löst die fünfte, oben beschriebene Aufgabe, indem ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids bereitgestellt wird, das die Schritte des Kultivierens des Transformanten, der durch Einführen einer replizierbaren rekombinanten DNA hergestellt wurde, die eine das Polypeptid kodierende DNA und einen autonom replizierbaren Vektor enthält, in geeignete Wirte, und des Aufnehmens des Polypeptids aus der resultierenden Kultur umfasst.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die optimale Temperatur für ein Polypeptid mit α-Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität aus einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus globisporus, C11 Stamm.
  • 2 zeigt den optimalen pH für ein Polypeptid mit α-Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität aus einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus globisporus, C11 Stamm.
  • 3 zeigt die thermische Stabilität eines Polypeptids mit α-Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität aus einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus globisporus, C11 Stamm.
  • 4 zeigt die pH-Stabilität eines Polypeptids mit α-Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität aus einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus globisporus, C11 Stamm.
  • 5 zeigt die optimale Temperatur für ein Polypeptid mit α-Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität aus einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus globisporus, N75 Stamm.
  • 6 zeigt den optimalen pH für ein Polypeptid mit α-Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität aus einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus globisporus, N75 Stamm.
  • 7 zeigt die thermische Stabilität eines Polypeptids mit α-Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität aus einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus globisporus, N75 Stamm.
  • 8 zeigt die pH-Stabilität eines Polypeptids mit α-Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität aus einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus globisporus, N75 Stamm.
  • 9 zeigt die Abbildung eines Restriktionsenzyms einer rekombinanten DNA, pBGC1, der vorliegenden Erfindung. In der Figur ist ein Abschnitt, der mit einer schwarzen, fetten Linie angezeigt ist, eine DNA, die ein Polypeptid mit α-Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität aus einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus globisporus, C11 Stamm, kodiert.
  • 10 zeigt die Abbildung eines Restriktionsenzyms einer rekombinanten DNA, pBGC1, der vorliegenden Erfindung. In der Figur ist ein Abschnitt, der durch eine schwarze, fette Linie angezeigt ist, eine DNA, die ein Polypeptid mit α-Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität aus einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus globisporus, N75 Stamm, kodiert.
  • BESTES VERFAHREN ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung wurde basierend auf der Entdeckung von absolut neuen und bisher unbekannten Enzymen gemacht, die die Bildung des Cyclotetrasaccharids aus einem Saccharid mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 3 oder höher katalysieren, das sowohl die α-1,6 glykosidische Bindung als eine Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende als auch die α-1,4 glykosidische Bindung außer der genannten Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende hat. Diese Enzyme können als Polypeptide aus der Kultur mit den neuen Mikroorganismen erhalten werden, Stamm C11 und Stamm N75, die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung aus Böden isoliert wurden. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung nannten den Stamm C11 „Bacillus globisporus C11", und hinterlegten ihn am 25. April 2000 am International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Tsukuba Central 6, 1-1 Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan. Die Hinterlegung des Mikroorganismus wurde unter der Zugangsnummer FERM BP-7144 angenommen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung benannten auch den Stamm N75 „Bacillus globisporus N75" und hinterlegten ihn am 16. Mai 2001 am International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan. Die Hinterlegung des Mikroorganismus wurde unter der Zugangsnummer FERN BP-7591 angenommen. Wie durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung in der PCT/JP01/06412 offenbart, erzeugen die Stämme C11 und N75 auch das α-isomaltosylglukosaccharidbildende Enzym, das ein Saccharid mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 3 oder höher bildet, und das sowohl die α-1,6 glykosidische Bindung als eine Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende als auch die α-1,4 glykosidische Bindung außer der genannten Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende aufweist, aus Maltodextrin mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 2 der höher. Nachfolgend werden die bakteriologischen Eigenschaften der Stämme C11 und N75 aufgeführt.
  • < Bacillus globisporus C11 >
  • < A. Morpholgie >
  • Eigenschaften der Zellen, wenn sie bei 27°C in Agar-Nährlösung inkubiert werden;
    gewöhnliches Vorkommen in einer Stäbchenform von 0,5-1,0 × 1,5–5 μm,
    kein Aufweisen von Polymorphie,
    Besitzen von Motilität,
    Bildung von kugelförmigen Sporen an einem intrazellulären Ende
    und angeschwollene Sporangia, und
    positive Gram-Färbung;
  • < B. Kultivierungseigenschaften >
    • (1) Eigenschaften der gebildeten Kolonien, wenn sie bei 27°C auf einer Agar-Nährlösungsplatte inkubiert werden; Form: kreisförmige Kolonie mit einem Durchmesser von 1–2 mm nach 2-tägiger Inkubationszeit Rand: vollständig Projektion: Halbkugelform Glanz: stumpf Oberfläche: glatt Farbe: opak und blassgelb
    • (2) Eigenschaften einer gebildeten Kolonie, wenn sie bei 27°C auf einer Agar-Nährlösungsschrägfläche inkubiert wurde; Wachstum: ungefähr mittel Form: strahlenförmig
    • (3) Eigenschaften einer gebildeten Kolonie, wenn sie bei 27°C in Agar-Nährlösung auf einer Platte befestigt kultiviert wurde; Verflüssigen der Agarplatte.
  • < C. physiologische Eigenschaften >
    • (1) VP-Test: negativ
    • (2) Indolbildung: negativ
    • (3) Gasbildung mit Salpetersäure: positiv
    • (4) Stärkehydrolyse: positiv
    • (5) Pigmentbildung: kein lösliches Pigment gebildet
    • (6) Urease: positiv
    • (7) Oxidase: positiv
    • (8) Katalase: positiv
    • (9) Wachstumsbedingungen: Wachsen bei einem pH von 5,5–9,0
    • und einer Temperatur von 10–35°C
    • (10) Sauerstoffbedarf: aerob
    • (11) Verwendung der Kohlenstoffquelle und Säurebildung
  • Kohlenstoffquelle Verwendung Säurebildung
    D-Glukose + +
    Glyzerin + +
    Saccharose + +
    Laktose + +
    • Bemerkung: Das Symbol „+" bedeutet ja oder positiv.
    • (14) Mol % von Guanin (G) plus Zytosin (C) der DNA: 39 %
  • < Bacillus globisporus N75 >
  • < A. Morphologie >
  • (1) Eigenschaften der Zellen, wenn sie bei 27°C in einer Agar-Nährlösung inkubiert werden;
    gewöhnliches Vorkommen in einer Stäbchenform von 0,5–1,0 × 1,5–5 μm,
    kein Aufweisen von Polymorphie,
    Besitzen von Motilität,
    Bildung von kugelförmigen Sporen an einem intrazellulären Ende
    und angeschwollene Sporangia, und
    positive Gram-Färbung
  • < B. Kultivierungseigenschaften >
    • (1) Eigenschaften der gebildeten Kolonien, wenn sie bei 27°C auf einer Agar-Nährlösungsplatte inkubiert wurden; Form: kreisförmige Kolonie mit einem Durchmesser von 1–2 mm nach 2-tägiger Inkubationszeit Rand: vollständig Projektion: Halbkugelform Glanz: stumpf Oberfläche: glatt Farbe: opak und blassgelb
    • (2) Eigenschaften einer gebildeten Kolonie, wenn sie bei 27°C auf einer Agar-Nährlösungsschrägfläche inkubiert wird; Wachstum: ungefähr mittel Form: strahlenförmig
    • (3) Eigenschaften einer gebildeten Kolonie, wenn sie bei 27°C auf einer Platte aus Agar-Nährlösung befestigt kultiviert wird; Verflüssigung der Agarplatte.
  • < C. physiologische Eigenschaften >
    • (1) VP-Test: negativ
    • (2) Indolbildung: negativ
    • (3) Gasbildung mit Salpetersäure: positiv
    • (4) Stärkehydrolyse: positiv
    • (5) Pigmentbildung: kein lösliches Pigment gebildet
    • (6) Urease: positiv
    • (7) Oxidase: positiv
    • (8) Katalase: positiv
    • (9) Wachstumsbedingungen: Wachsen bei einem pH von 5,5– 9,0 und einer Temperatur von 10–35° C
    • (10) Sauerstoffbedarf: aerob
    • (11) Verwendung der Kohlenstoffquelle und Säurebildung
  • Kohlenstoffquelle Verwendung Säurebildung
    D-Glukose + +
    Glyzerin + +
    Saccharose + +
    Laktose + +
    • Bemerkung: Das Symbol „+" bedeutet ja oder positiv.
    • (12) Mol % von Guanin (G) plus Zytosin (C) der DNA: 40 %
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung reinigten und charakterisierten das α-Isomaltosyl transferierende Enzym, das aus der Kultur von Bacillus globisporus C11 (FERN BP-7144) oder Bacillus globisporus N75 (FERN BP-7591) erhalten werden kann. Als Ergebnis zeigte sich, dass das Enzym eine Aktivität zur Bildung von Cyclotetrasaccharid mit einer Cyclo-{→6)-α-D-Glucopyranosyl-(1→3)-α-D-Glucopyranosyl-(1→6)-α-D-Glucopyranosyl-(1→3)-α-D-Glucopyranosyl-(1→}-Struktur aus einem Saccharid mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 3 oder höher hat, das sowohl die α-1,6 glykosidische Bindung als eine Bildung an dem nicht-reduzierenden Ende als auch die α-1,4 glykosidische Bindung außer der genannten Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende hat, und ein Polypeptid ist, das die Aminosäurensequenzen der SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 umfasst. Darüber hinaus sind die physikochemischen Eigenschaften der Polypeptide wie folgt;
    • (1) Molekulargewicht Sie haben ein Molekulargewicht von ungefähr 82.000 bis ungefähr 132.000 Daltons, wenn mit SDS-PAGE bestimmt;
    • (2) Optimale Temperatur Sie haben eine optimale Temperatur bei ungefähr 50°C, wenn sie bei einem pH von 6,0 30 Minuten lang inkubiert werden;
    • (3) Optimaler pH Sie haben einen optimalen pH von ungefähr 5,5 bis 6,0, wenn sie bei 35°C 30 Minuten lang inkubiert werden;
    • (4) Thermische Stabilität Sie haben einen wärmebeständigen Bereich bei Temperaturen von ungefähr 45°C oder darunter, wenn sie bei einem pH von 6,0 30 Minuten lang inkubiert werden;
    • (5) pH-Stabilität Sie haben einen stabilen pH Bereich bei ungefähr 4,5 bis 10,0, wenn sie bei 4°C 24 Stunden lang inkubiert werden.
  • Die folgenden Experimente erklären die physikochemischen Eigenschaften des Polypeptids mit α-Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität der vorliegenden Erfindung.
  • Experiment 1
  • Herstellung eines Polypeptids aus Bacillus globisporus
  • Experiment 1–1
  • Herstellung des Rohpolypeptids
  • Ein flüssiges Kulturmedium, das aus 4 % (M/V) „PINE-DEX # 4", einem partiellen Stärkehydrolysat, 1,8 % (M/V) „ASAHIMEAST", einem Hefeextrakt, 0,1 % (M/V) Dikaliumphosphat, 0,06 % (M/V) Natriumphosphat Dodeka-Hydrat, 0,05 % (M/V) Magnesiumsulfat Hepta-Hydrat und Wasser besteht, wurde in 500 ml Erlenmeyerkolben in einer jeweiligen Menge von 100 ml eingebracht, durch Autoklavieren bei 121°C 20 Minuten lang sterilisiert, abgekühlt und mit dem Bacillus globisporus C11 Stamm, FERM BP-7144, geimpft, worauf das Kultivieren unter Rotationsschütteln bei 27°C und 230 U/min 48 Stunden lang je Startkultur folgte.
  • Ungefähr 20 l einer frischen Zubereitung des gleichen flüssigen Kulturmediums, das in der obigen Startkultur verwendet wurde, wurden in einen 30 l Fermenter eingebracht, durch Erhitzen sterilisiert und dann auf 27°C abgekühlt und mit 1 % (V/V) der Startkultur geimpft, gefolgt von Kultivieren bei 27°C und pH 6,0 bis 8,0 48 Stunden lang unter belüftetem Bewe gen. Nach Abschluss der Kultivierung wurden ungefähr 1,8 Einheiten/ml des α-Isomaltosyl transferierenden Enzyms und ungefähr 0,55 Einheiten/ml des α-Isomaltosylglukosaccharid bildenden Enzyms in der resultierenden Kultur durch Messen der Enzymaktivitäten detektiert. Ungefähr 18 l des Überstands, der durch Zentrifugieren bei 10.000 Umdrehung/min. 30 Minuten lang erhalten wurde, hatten ungefähr 1,7 Einheiten/ml eine α-Isomaltosyl transferierende Enzymaktivität, d. h. eine Gesamtaktivität von ungefähr 30.400 Einheiten; und 0,51 Einheiten der α-Isomaltosylglukosaccharid bildenden Enzymaktivität, d. h. eine gesamte enzymatische Aktivität von ungefähr 9.180 Einheiten. Es stellte sich heraus, dass diese Enzyme Sekretionspolypeptide waren, die in der Kultur abgesondert wurden.
  • Die Aktivität des α-Isomaltosyl transferierenden Enzyms wurde durch die folgende Untersuchung gemessen: Eine Substratlösung wurde hergestellt, indem Panose in 100 mM Acetatpuffer (pH 6,0) aufgelöst wurde, sodass sich eine Konzentration von 2 % (M/V) ergibt. Ein Reaktionsgemisch wurde hergestellt, indem 0,5 ml der Substratlösung und 0,5 ml einer Enzymlösung gemischt wurden und bei 35°C 30 Minuten lang inkubiert wurden. Nachdem die Reaktion durch 10 minütiges Kochen beendet wurde, wurde die Menge der in dem Reaktionsgemisch gebildeten Glukose durch das Glukoseoxidase-Peroxidaseverfahren bestimmt. Eine Einheit der α-Isomaltosyl transferierenden Aktivität wurde als die Menge des Enzyms definiert, das ein μMol Glukose pro Minute unter den obigen Bedingungen bildet.
  • Die Aktivität des α-Isomaltosylglukosaccharid bildenden Enzyms wurde mit der folgenden Untersuchung gemessen: Eine Substratlösung wurde hergestellt, indem Maltotriose in 100 mM Acetatpuffer (pH 6,0) aufgelöst wurde, sodass sich eine Konzentration von 2 % (M/V) ergibt. Ein Reaktionsgemisch wurde herge stellt, indem 0,5 ml der Substratlösung und 0,5 ml einer Enzymlösung gemischt wurden und bei 35°C 60 Minuten lang inkubiert wurden. Nachdem die Reaktion durch 10 minütiges Kochen beendet wurde, wurde die Menge der in dem Reaktionsgemisch gebildeten Glukose durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt. Eine Einheit der α-Isomaltosylglukosaccharid bildenden Aktivität wurde als die Menge des Enzyms definiert, das ein μMol Maltose pro Minute unter den obigen Bedingungen bildet. HPLC wurde durchgeführt unter Verwendung einer „SHODEX KS-801 Säule", Showa Denko K. K., Tokyo, Japan, bei einer Säulentemperatur von 60°C und einer Durchflussrate von 0,5 ml/min. Wasser, und unter Verwendung eines „RI-8012", einem Differentialrefraktometer, vertrieben durch Tosho Corporation, Tokyo, Japan.
  • Ungefähr 18 l des oben beschriebenen Kulturüberstands wurden mit 80 % gesättigter Ammoniumsulfatlösung ausgesalzt und bei 4°C 24 Stunden lang stehen gelassen, und die gebildeten Niederschläge wurden durch 30 minütiges Zentrifugieren bei 10.000 Upm aufgefangen, in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,5) aufgelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert, so dass ungefähr 416 ml einer Rohenzymlösung erhalten wurden. Die Rohenzymlösung hatte ungefähr 28.000 Einheiten des α-Isomaltosyl transferierenden Enzyms und 8.440 Einheiten des α-Isomaltosylglukosaccharid bildenden Enzyms. Die Rohenzymlösung wurde einer Innenaustausch-Säulenchromatographie unter Verwendung eines „SEPABEADS FP-DA13" Gels, eines Ionenaustauschharzes, vertrieben von Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan, unterzogen. Sowohl das α-Isomaltosyl transferierende Enzym als auch das α-Isomaltosylglukosaccharid bildende Enzym wurden als nicht-adsorbierte Fraktionen eluiert, ohne an das „SEPABEADS FP-DA13" Gel zu adsorbieren. Die nicht-adsorbierte Fraktion wurde aufgefangen und gegen 10 mM Natri umphosphatpuffer (pH 7,0) mit 1 M Ammoniumsulfat dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde zentrifugiert, um Verunreinigungen zu entfernen, und einer Affinitätssäulenchromatographie unter Verwendung von 500 ml eines „SEPHACRYL HR S-200" Gels, ein von Amersham Corp., Div. Amersham International, Arlington heights, IL, USA, vertriebenen Gels, unterzogen. Enzymatisch aktive Komponenten adsorbierten an das „SEPHACRY HR S-200" Gel und, wenn sie sequentiell mit einem linearen Gradienten, der von 1 M zu 0 M Ammoniumsulfat abnimmt, und einem linearen Gradienten, der von 0 mM zu 100 mM Maltotetraose zunimmt, eluiert wurden, wurden das α-Isomaltosyl transferierende Enzym und das α-Isomaltosylglukosaccharid bildende Enzym getrennt eluiert, d. h. das erstere wurde mit einem linearen Gradienten von Ammoniumsulfat bei ungefähr 0 M eluiert und das letztere wurde mit einem linearen Gradienten von Maltotetraose bei ungefähr 30 mM eluiert. Auf diese Weise wurden Fraktionen mit α-Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität und jene mit der α-Isomaltosylglukosaccharid bildenden Enzymaktivität getrennt als Rohpeptide des α-Isomaltosyl transferierenden Enzyms und des α-Isomaltosylglukosaccharid bildenden Enzyms aufgefangen. Ferner wurden die Polypeptide mit einer α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität oder einer α-Isomaltosylglukosaccharid bildenden Enzymaktivität jeweils gereinigt und mit den nachfolgend beschriebenen Verfahren aufbereitet.
  • Experiment 1–2
  • Reinigung eines Polypeptids mit einer α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität
  • Das Rohpolypeptid mit einer α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität, das in Experiment 1–1 erhalten wurde, wurde gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) mit 1 M Ammoniumsul fat dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde zentrifugiert, um Verunreinigungen zu entfernen, und einer hydrophoben Säulenchromatographie unter Verwendung von 350 ml eines „BUTYL-TOYOPEARL 650 M" Gels, eines hydrophoben Gels, vertrieben durch Tosho Corporation, Tokyo, Japan, unterzogen. Die Enzyme adsorbierten an dem „BUTYL-TOYOPEARL 650 M" Gel und, wenn sie mit einem linearen Gradienten, der von 1 M zu 0 M Ammoniumsulfat abnimmt, eluiert wurden, wurden die enzymatisch aktiven Fraktionen mit einem linearen Gradienten von Ammoniumsulfat bei ungefähr 0,3 M eluiert, und die Fraktionen mit der Enzymaktivität wurden gesammelt. Die gesammelte Lösung wurde gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) mit 1 M Ammoniumsulfat dialysiert und die dialysierte Lösung wurde zentrifugiert, um Verunreinigungen zu entfernen, und durch Affinitätschromatographie unter Verwendung des „SEPHACRYL HR S-200" Gels gereinigt. Die Menge an Enzymaktivität, spezifischer Aktivität und Ausbeute des α-Isomaltosyl transferierenden Enzyms bei jedem Reinigungsschritt sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1
    Reinigungsschritt Enzym * Aktivität (Einheiten) Spezifische Aktivität des Enzyms * (Einheiten/mg Protein) Ausbeute (%)
    Kulturüberstand 30 400 0,45 100
    Dialysierte Lösung nach Aussalzen mit Ammoniumsulfat 28 000 1,98 92,1
    Eluat aus Ionenaustauschsäulen-Chromatographie 21 800 3,56 71,7
    Eluat aus Affinitätssäulen-Chromatographie 13 700 21,9 45,1
    Eluat aus hydrophober Säulen-Chromatographie 10 300 23,4 33,9
    Eluat aus Affinitätssäulen-Chromatographie 5 510 29,6 18,1
    • Bemerkung: Das Symbol "*" gibt das α-Isomaltosyl transerierende Enzym der vorliegenden Erfindung an.
  • Die endgültig gereinigte α-Isomaltosyl transferierende Enzymprobe wurde auf Reinheit mit Gelelektrophorese unter Verwendung eines 7,5 % (M/V) Polyacrylamidgels untersucht und auf dem Gel als eine einzelne Proteinbande gefunden, d. h. als eine hochreine Probe.
  • Experiment 1–3
  • Reinigung des α-Isomaltosylglukosaccharid bildenden Enzyms
  • Das Rohpolypeptid mit der α-Isomaltosylglukosaccharid bildenden Enzymaktivität, das in Experiment 1–1 erhalten wurde, wurde gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) mit 1 M Ammoniumsulfat dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde zentrifugiert, um Verunreinigungen zu entfernen, und einer hydrophoben Säulenchromatographie unter Verwendung von 350 ml des „BUTYL-TOYOPEARL 650 M" Gels, eines hydrophoben Gels, vertrieben durch Tosho Corporation, Tokyo, Japan, unterzogen. Das Enzym wurde an das „BUTYL-TOYOPEARL 650 M" Gel adsorbiert, und als es mit einem linearen Gradienten, der von 1 M zu 0 M von Ammoniumsulfat abnimmt, eluiert wurde, wurde die enzymatische Aktivität mit einem linearen Gradienten von Ammoniumsulfat bei ungefähr 0,3 M eluiert und die Fraktionen mit der Enzymaktivität wurden aufgefangen. Die aufgefangene Lösung wurde gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) mit 1 M Ammoniumsulfat dialysiert, und die dialysierte Lösung wurde zentrifugiert, um Verunreinigungen zu entfernen, und mit Affinitätschromatographie unter Verwendung des „SEPHACRYL HR S-200" Gels gereinigt. Die Menge an Enzymaktivität, spezifischer Aktivität und Ausbeute des α-Isomaltosylglukosaccharid bildenden Enzyms in jedem Reinigungsschritt sind in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2
    Reinigungsschritt Enzym * Aktivität (Einheiten) Spezifische Aktivität des Enzyms * (Einheiten/mg Protein) Ausbeute (%)
    Kulturüberstand 9 180 0,14 100
    Dialysierte Lösung nach Aussalzen mit Ammoniumsulfat 8 440 0,60 91,9
    Eluat aus Ionenaustauschsäulen-Chromatographie 6 620 1,08 72,1
    Eluat aus Affinitätssäulen-Chromatographie 4 130 8,83 45,0
    Eluat aus hydrophober Säulen-Chromatographie 3 310 11,0 36,1
    Eluat aus Affinitätssäulen-Chromatographie 2 000 13,4 21,8
    • Bemerkung: Das Symbol „*" gibt das α-Isomatosylglukosaccharid bildende Enzym an.
  • Die endgültig gereinigte α-Isomaltosylglukosaccharid bildende Enzymprobe wurde auf Reinheit mit Gelelektrophorese unter Verwendung eines 7,5 % (M/V) Polyacrylamidgels untersucht und auf dem Gel als eine einzelne Proteinbande gefunden, d. h. eine hochreine Probe.
  • Experiment 2
  • Physikochemische Eigenschaften des Polypeptids mit einer α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität
  • Experiment 2–1
  • Ablauf
  • Eine wässrige Lösung, die 10 mM Glukose, 6-O-α-Glukosylglukose (Isomaltose), 62-O-α-Glukosylmaltose (Panose), 63-O-α-Glukosylmaltotriose (Isomaltosylmaltose), 64-O-α-Glukosylmaltotetraose oder 65-O-α-Glukosylmaltopentaose enthält, wurde als Substratlösung zubereitet. Zu jeder der obigen Substratlösungen wurden zwei Einheiten/mM-Substrat der gereinigten α-Isomaltosyl transferierenden Enzymprobe, die in Experiment 1–2 erhalten wurde, zugefügt und bei 30°C und bei pH 6,0 für 12 Stunden inkubiert. Nach Deionisierung durch herkömmliche Verfahren wurden die sich ergebenden Reaktionslösungen auf ihre Saccharidzusammensetzung mit HPLC unter Verwendung einer „MCI GEL CKO4SS", einer von Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan, vertriebenen Säule, bei einer Säulentemperatur von 80°C und einer Durchflussrate von 0,4 ml/min. Wasser und unter Verwendung eines Detektors „RI-8012", eines Differentialrefraktometers, vertrieben durch Tosoh Corporation, Tokyo, Japan, gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3
    Substrat Saccharid in dem Reaktionsgemisch Gehalt (%)
    Glukose Glukose 100
    6-O-α-Glukosylglukose 6-O-α-Glukosylglukose 100
    62-O-α-Glukosylmaltose Glukose Isomaltose 62-O-α-Glukosylmaltose Cyclotetrasaccharid Isomaltosylpanose Isomaltosypanosid andere 32,2 2,1 4,6 43,5 4,8 1,8 11,0
    63-O-α-Glukosylmaltotriose Maltose Isomaltose 63-O-α-Glukosylmaltotriose Cyclotetrasaccharid adere 50,6 2,0 4,2 30,8 12,4
    64-O-α-Glukosylmaltotetraose Isomaltose Maltotriose Cyclotetrasaccharid 64-O-α-Glukosylmaltotetraose andere 1,9 60,7 25,6 3,4 8,4
    65-O-α-Glukosylmaltopentaose Isomaltose Maltotetraose Cyclotetrasccharid 65-O-α-Glukosylmaltopentaose andere 1,6 66,5 18,2 4,3 9,4
  • In Tabelle 3 bedeutet Isomaltosylpanose zwei Formen von Sacchariden mit der Struktur der Strukturformel 1 oder 2, und Isomaltosylpanosid ist ein Saccharid mit der Struktur der Formel 3. Formel 1
    Figure 00260001
    Formel 2
    Figure 00260002
    Formel 3
    Figure 00260003
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 3 erwiesen ist, stellte sich heraus, dass das Polypeptid mit der α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität aus Bacillus globisporus C11 auf Saccharide mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 3 oder höher einwirkte, die sowohl eine α-1,6-glykosidische Bindung an ihrem nicht-reduzierenden Ende als auch die α-1,4-glykosidische Bindung außer der genannten Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende haben, wie zum Beispiel 62-O-α-Glukosylmaltose, 63-O-α-Glukosylmaltotriose, 64-O-α-Glukosylmaltotetraose und 65-O-α-Glukosylmaltopentaose, und hauptsächlich Cyclotetrasaccharid und Maltooligosaccharid erzeugte, was einen Glukose-Polymerisationsgrad von 2 von dem Substrat senkte. Zusätzlich zu Cyclotetrasaccharid wurde Maltooligosaccharid, das einen Glukose-Polymerisationsgrad von 2 aus dem Substrat senkte, und das übrige Substrat, Spuren aus Isomaltose, die als hydrolysiertes Produkt betrachtet werden, und ein weiteres Saccharid, das sich von Cyclotetrasaccharid unterscheidet und für ein Glykosyltransferprodukt gehalten wird, in dem Reaktionsgemisch gefunden. Die Ausbeute an Cyclotetrasaccharid auf Trockenbasis von jedem der Substrate, d. h. 62-O-α-Glukosylmaltose, 63-O-α-Glukosylmaltotriose, 64-O-α-Glukosylmaltotetraose und 65-O-α-Glukosylmaltopentaose lag bei 43,5 %, 30,8 %, 25,6 % beziehungsweise 18,2 %. Von Glukose und 6-O-α-Glukosylglukose wurde kein Produkt gefunden.
  • Experiment 2–2
  • N-terminale Aminosäurensequenz
  • Das Polypeptid mit der α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität hatte eine Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:5 an der N-terminalen Stelle, als die Aminosäurensequenz mit dem „Gasphasen-Proteinsequenzermodel 473 A", einem Gerät von Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, USA, analysiert wurde.
  • Experiment 2–3
  • Partielle Aminosäurensequenz
  • Ein Teil einer gereinigten Probe des Polypeptids mit der α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität, die in Experiment 1–2 erhalten wurde, wurde gegen 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) bei 4°C 18 Stunden lang dialysiert, und die dialysierte Lösung wurde mit einer frischen Zubereitung des gleichen Puffers verdünnt, so dass sich eine Konzentration von ungefähr einem mg/ml ergab. Ein ml der verdünnten Lösung wurde als eine Testprobe mit 10 μg von „Lysyl Endopeptidase", die durch Wako Pure Chemicals, Ltd, Tokyo, Japan, vertrieben wird, vermischt und bei 30°C 22 Stunden lang inkubiert, um Peptide zu bilden. Das resultierende Hydrolysat wurde die HPLC unterzogen, um die Peptide unter Verwendung einer „μ-BONDAPAK C18 Säule", die einen Durchmesser von 2,1 mm und eine Länge von 150 mm hat, ein Produkt von Waters Chromatography Div., MILLIPORE Corp., Milford, USA, die zuvor mit 0,1 % (V/V) Trifluoracetat, das 8 % (V/V) Acetonitril enthält, pre-equilibriert wurde, bei einer Flussrate von 0,9 ml/min. und bei Raumtemperatur und unter Verwendung eines linearen Gradienten von Acetonitril, der von 8 % (V/V) auf 40 % (V/V) in 0,1 % (V/V) Trifluoracetat anwächst während 120 Minuten zu trennen. Von der Säule eluierte Peptidfragmente wurden detektiert, in dem die Absorption bei einer Wellenlänge von 210 nm überwacht wurde. Peptidfraktionen mit einer Retentionszeit von ungefähr 22 Minuten, ungefähr 38 Minuten, ungefähr 40 Minuten, ungefähr 63 Minuten und ungefähr 71 Minuten wurden getrennt aufgefangen und in vacuo getrocknet und dann in einer Lösung von 0,1 % (V/V) Trifluoracetat und 50 % (V/V) Acetonitril gelöst. Es wurden 5 Peptidfragmente erhalten, und jedes der Peptidfragmente wies Aminosäurensequenzen der SEQ ID NO:6 bis 10 auf, als diese Aminosäurensequenzen entsprechend dem Verfahren, das in Experiment 2–2 beschrieben wurde, analysiert wurden.
  • Experiment 2–4
  • Molekulargewicht
  • Wenn eine gereinigte Probe des Polypeptids mit der α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität, die mit dem Verfahren in Experiment 1–2 erhalten wurde, einer SDS-PAGE unterzogen wurde, entsprechend dem Verfahren, von dem U. K. Laemmli in Nature, Vol. 227, Seiten 680-685 (1970) berichtet, wurde eine einzelne Proteinbande mit der enzymatischen Aktivität an der Position beobachtet, die dem Molekulargewicht von ungefähr 82.000 bis 122.000 Daltons entspricht. Molekulargewichtsmarker, die in diesem Experiment verwendet wurden, waren Myosin (200.000 Daltons), β-Galaktosidase (116.250 Daltons), Phosphorylase B (97.400 Daltons), Serumalbumin (66.200 Daltons) und Ovalbumin (45.000 Daltons).
  • Experiment 2–5
  • Optimale Temperatur
  • Wie in 1 gezeigt, hatte das Polypeptid eine optimale Temperatur bei ungefähr 50°C, wenn eine gereinigte Probe des Polypeptids mit der α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität, die mit dem Verfahren in Experiment 1–2 erhalten wurde, auf das Substrat 30 Minuten lang bei verschiedenen Temperaturen mit herkömmlichen Verfahren einwirkte.
  • Experiment 2–6
  • Optimaler pH
  • Wie in 2 gezeigt, hatte das Polypeptid einen optimalen pH bei ungefähr 5,5 bis 6,0, wenn eine gereinigte Probe des Polypeptids mit der α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität, die mit dem Verfahren im Experiment 1–2 erhalten wurde, in MacIlvaine Puffer bei verschiedenen pHs 30 Minuten lang bei 35°C in herkömmlichen Verfahren auf das Substrat einwirkte.
  • Experiment 2–7
  • Thermische Stabilität
  • Wie in 3 gezeigt, hatte das Polypeptid eine thermische Stabilität bis zu ungefähr 40°C, wenn eine gereinigte Probe des Polypeptids mit der α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität, die mit dem Ver fahren in Experiment 1–2 erhalten wurde, in 20 mM Acetatpuffer (pH 6,0) bei verschiedenen Temperaturen 60 Minuten lang durch herkömmliche Verfahren inkubiert wurde.
  • Experiment 2–8
  • pH-Stabilität
  • Wie in 4 gezeigt, hatte das Polypeptid eine pH-Stabilität von ungefähr 4,5 bis ungefähr 9,0, wenn eine gereinigte Probe des Polypeptids mit α-Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität, die mit dem Verfahren in Experiment 1–2 erhalten wurde, in dem MacIlvain-Puffer oder in 50 mM Dinatriumkarbonat-Natriumbikarbonatpuffer in herkömmlichen Verfahren bei verschiedenen pHs 24 Stunden lang bei 4°C gelassen wurde.
  • Experiment 3
  • Polypeptid aus Bacillus globisporus N75
  • Experiment 3–1
  • Herstellung des Rohpolypeptids
  • Ein flüssiges Kulturmedium, das aus 4 % (M/V) „PINE-DEX # 4", einem partiellen Stärkehydrolysat, 1,8 % (M/V) „ASAHIMEAST", einem Hefeextrakt, 0,1 % (M/V) Dikaliumphosphat, 0,06 % (M/V) Natriumphosphat-Dodekahydrat, 0,05 % (M/V) Magnesiumsulfat-Heptahydrat und Wasser besteht, wurde in 500 ml Erlenmeyerkolben in einer entsprechenden Menge von 100 ml eingebracht, durch Autoklavieren bei 121°C 20 Minuten lang sterilisiert, abgekühlt und mit dem Bacillus globisporus N75 Stamm, FERM BP-7591, geimpft, gefolgt von 48 ständigem Kultivieren unter Rotationsschütteln bei 27°C und bei 130 Upm je Startkultur.
  • Ungefähr 20 l einer frischen Zubereitung des selben flüssigen Kulturmediums, das bei der obigen Startkultur verwendet wurde, wurden in einen 30 l Fermenter eingebracht, durch Erhitzen sterilisiert und dann auf 27°C abgekühlt und mit 1 % (V/V) der Startkultur geimpft, gefolgt von Kultivieren bei 27°C und pH 6,0 bis 8,0 48 Stunden lang unter belüftetem Bewegen. Die sich ergebende Kultur mit 1,1 Einheiten/ml α-Isomaltosyl transferierendem Enzym wurde bei 10.000 Upm 30 Minuten lang zentrifugiert, um ungefähr 18 l Überstand zu erhalten. Eine Messung des Überstands ergab, dass er ungefähr 1,1 Einheiten/ml α-Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität enthielt, d. h. eine Gesamtenzymaktivität von ungefähr 19.800 Einheiten; ungefähr 0,33 Einheiten/ml α-Isomaltosylglukosaccharid bildende Enzymaktivität, d. h. eine gesamte Enzymaktivität von ungefähr 5.490 Einheiten. Es stellte sich heraus, dass beide Enzyme Sekretionspolypeptide waren, die in dem Kultivierungsüberstand gefunden wurden.
  • Ungefähr 18 l des oben beschriebenen Kultivierungsüberstands wurden mit 60 % gesättigter Ammoniumsulfatlösung ausgesalzt und bei 4°C 24 Stunden lang stehen gelassen, und die gebildeten Niederschlägen wurde durch 30 minütiges Zentrifugieren bei 10.000 Upm aufgefangen, in 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,3) aufgelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert, sodass ungefähr 450 ml einer Rohenzymlösung erhalten wurden. Die Rohenzymlösung hatte ungefähr 15.700 Einheiten der α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität und 4.710 Einheiten der α-Isomaltosylglukosaccharid bildenden Enzymaktivität. Die Rohenzymlösung wurde einer Ionenaustauschsäulenchromatographie unter Verwendung des „SEPABEADS FP-DA13" Gels unterzogen, das in Experiment l-1 offenbart wurde. Das α-Isomaltosyl transferierende Enzym wurde als nicht-adsorbierte Fraktion eluiert, ohne an das „SEPABEADS FP-DA13" Gel zu adsorbieren, und das α-Isomaltosylglukosaccharid bildende Enzym wurde auf das „SEPA-BEADS FP-DA13" adsorbiert. Nachfolgend wurde das α- Isomaltosylglukosaccharid bildende Enzym mit einem linearen Gradienten, der von 0 M auf 1 M Natriumchlorid anstieg, eluiert, wobei das Enzym mit dem linearen Gradienten von Natriumchlorid bei einer Konzentration von ungefähr 0,25 M eluiert wurde. Daher wurden die Fraktionen mit dem α-Isomaltosyl transferierenden Enzym und mit dem α-Isomaltosylglukosaccharid bildenden Enzym getrennt als Rohpolypeptid mit α-Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität beziehungsweise das mit der α-Isomaltosylglukosaccharid bildenden Enzymaktivität gesammelt.
  • Ferner wurden das Polypeptid mit dem α-Isomaltosyl transferierenden Enzym und das mit dem α-Isomaltosylglukosaccharid bildenden Enzym getrennt gereinigt und durch die nachfolgend beschriebenen Verfahren aufbereitet.
  • Experiment 3–2
  • Reinigung eines Polypeptids mit einer α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität
  • Das Rohpolypeptid mit der α-Isomaltosyl transferierenden Aktivität, das in Experiment 3–1 erhalten wurde, wurde gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) mit 1 M Ammoniumsulfat dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde zentrifugiert, um Verunreinigungen zu entfernen, und einer Affinitätssäulenchromatographie unterzogen unter Verwendung von 500 ml des „SEPHCRYL HR S-200" Gels, einem Gel, das durch Amersham Corp., Div. Amersham International, Arlington heights, IL, USA, vertrieben wird. Das Polypeptid wurde an „SEPHACRYL HR S-200" Gel adsorbiert und als es mit einem von 1 M auf 0 M fallenden linearen Gradienten eluiert wurde, wurde die enzymatische Aktivität mit einem linearen Gradienten von Ammoniumsulfat bei ungefähr 0,3 M eluiert und Fraktionen mit der Enzymaktivität wurden aufgefangen. Die gesammelte Lösung wurde gegen 10 mM Natriumphos phatpuffer (pH 7,0) mit 1 M Ammoniumsulfat dialysiert, und die dialysierte Lösung wurde zentrifugiert, um Verunreinigungen zu entfernen, und durch hydrophobe Säulenchromatographie gereinigt unter Verwendung des „BUTYL-TOYOPEARL 650 M" Gels, einem hydrophoben Gel, das durch Tosho Corporation, Tokyo, Japan, vertrieben wird. Das Polypeptid war auf dem „BUTYL-TOYOPEARL 650 M" Gel adsorbiert, und, als es mit einem linearen Gradienten, der von 1 M auf 0 M von Ammoniumsulfat abnimmt, eluiert wurde, wurde die enzymatische Aktivität mit einem linearen Gradienten von Ammoniumsulfat bei ungefähr 0,3 M eluiert, und Fraktionen mit der Enzymaktivität wurden aufgesammelt. Die gesammelte Lösung wurde gegen 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) dialysiert und die dialysierte Lösung wurde zentrifugiert, um Verunreinigungen zu entfernen, und durch Ionenaustauschsäulenchromatographie unter Verwendung von 380 ml des „SuperQ-TOYOPEARL 650 C" Gels, einem Ionenaustauschgel, das durch Tosho Corporation, Tokyo, Japan vertrieben wird, gereinigt. Das Polypeptid wurde als nicht-adsorbierte Fraktion eluiert, ohne an dem „SuperQ-TOYOPEARL 650 C" Gel zu adsorbieren. Die gereinigte Polypeptidprobe mit der α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität wurde erhalten, in dem die Fraktionen aufgefangen wurden. Die Menge an Enzymaktivität, die spezifische Aktivität und die Ausbeute des α-Isomaltosyl transferierenden Enzyms in jedem Reinigungsschritt sind in Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 4
    Reinigungsschritt Enzym * Aktivität (Einheiten) Spezifischer Aktivität des Enzyms * (Einheiten/mg Protein) Ausbeute (%)
    Kulturüberstand 19 000 0,33 100
    Dialysierte Lösung nach Aussalzen mit Ammoniumsulfat 15 700 0,64 82,6
    Eluat aus Ionenaustauschsäulen-Chromatographie 12 400 3,56 65,3
    Eluat aus Affinitätssäulen-Chromatographie 8 320 11,7 43,8
    Eluat aus hydrophober Säulen-Chromatographie 4 830 15,2 25,4
    Eluat aus Affinitätssäulen-Chromatographie 3 850 22,6 20,3
    • Bemerkung: Das Symbol „*" gibt das α-Isomaltosyl transferierende Enzym der vorliegenden Erfindung an.
  • Die endgültig gereinigte α-Isomaltosyl transferierende Enzymprobe wurde mit Gelelektrophorese unter Verwendung eines 7,5 % (M/V) Polyacrylamidgels auf Reinheit untersucht und auf dem Gel als eine einzelne Proteinbande gefunden, d. h. eine hochreine Probe.
  • Experiment 3–3
  • Reinigung des α-Isomaltosylglukosaccharid bildenden Enzyms
  • Das Rohpolypeptid mit der α-Isomaltosylglukosaccharid bildenden Enzymaktivität, das in Experiment 3–1 erhalten wurde, wurde gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) mit 1 M Ammoniumsulfat dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde zentrifugiert, um Verunreinigungen zu entfernen, und einer Affinitätssäulenchromatographie unter Verwendung von 500 ml des „SEPHAC-RYL HR S-200" Gels, einem Gel das durch Amersham Corp., Div. Amersham International, Arlington heights, IL, USA, vertrieben wird, unterzogen. Das Enzym war an „SEPHACRYL HR S-200" Gel adsorbiert und, als es sequenziell und mit einem von 1 M auf 0 M Ammoniumsulfat fallenden linearen Gradienten, und einem von 0 mM auf 100 mM Maltotetraose anwachsenden linearen Gradienten eluiert wurde, wurde die enzymatische Aktivität mit einem linearen Gradienten von Maltotetraose bei ungefähr 30 mM eluiert, und Fraktionen mit der Enzymaktivität wurden aufgesammelt. Die gesammelte Lösung wurde gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) mit 1 M Ammoniumsulfat dialysiert, und die dialysierte Lösung wurde zentrifugiert, um Verunreinigungen zu entfernen und durch hydrophobe Säulenchromatographie unter Verwendung von 350 ml des „BUTYL-TOYOPEARL 650 M" Gels, einem hydrophoben Gel, das durch Tosho Corporation, Tokyo, Japan vertrieben wird, gereinigt. Das Enzym wurde auf dem „BUTYL-TOYOPEARL 650 M" Gel adsorbiert und, als es mit einem linearen von 1 M auf 0 M Ammoniumsulfat fallenden Gradienten eluiert wurde, wurde die enzymatische Aktivität mit einem linearen Gradienten von Ammoniumsulfat bei ungefähr 0,3 M eluiert und Fraktionen mit der Enzymaktivität wurden aufgesammelt. Die ge sammelte Lösung wurde gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) mit 1 M Ammoniumsulfat dialysiert, und die dialysierte Lösung wurde zentrifugiert, um Verunreinigungen zu entfernen, und durch Affinitätschromatographie unter Verwendung des „SEPHACRLY HR S-200" Gels gereinigt. Die Menge an Enzymaktivität, die spezifische Aktivität und die Ausbeute des α-Isomaltosylglukosaccharid bildenden Enzyms in jedem Reinigungsschritt sind in Tabelle 5 aufgeführt. Tabelle 5
    Reinigungsschritt Enzym * Aktivität (Einheiten) Spezifischer Aktivität des Enzyms * (Einheiten/mg Protein) Ausbeute (%)
    Kulturüberstand 5 940 0,10 100
    Dialysierte Lösung nach Aussalzen mit Ammoniumsulfat 4 710 0,19 79,3
    Eluat aus Ionenaustauschsäulen-Chromatographie 3 200 2,12 53,9
    Eluat aus Affinitätssäulen-Chromatographie 2 210 7,55 37,2
    Eluat aus hydrophobe Säulen-Chromatographie 1 720 10,1 29,0
    Eluat aus Affinitätssäulen-Chromatographie 1 320 12,5 22,2
    • Bemerkung: Das Symbol „*" gibt das α-Isomaltosylglukosaccharid bildende Enzym an.
  • Die endgültig gereinigte α-Isomaltosylglukosaccharid bildende Enzymprobe wurde mit Gelelektrophorese unter Verwendung eines 7,5 % (M/V) Polyacrylamidgels auf Reinheit untersucht und es wurde auf dem Gel als eine einzelne Proteinbande gefunden, d. h. als eine hochreine Probe.
  • Experiment 4
  • Physikochemische Eigenschaften des Polypeptids mit einer α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität
  • Experiment 2–1
  • Ablauf
  • Eine wässrige Lösung, die 10 mM Glukose, 6-O-α-Glukosylglukose (Isomaltose), 62-O-α-Glukosylmaltose (Panose), 63-O-α-Glukosylmaltotriose (Isomaltosylmaltose), 64-O-α-Glukosylmaltotetraose oder 65-O-α-Glukosylmaltopentaose enthält, wurde als Substratlösung zubereitet. Zu jeder der obigen Substratlösungen wurden zwei Einheiten pro Millimol Substrat der gereinigten α-Isomaltosyl transferierenden Enzymprobe, die in Experiment 3–2 erhalten wurde, zugefügt und bei 30°C und bei pH 6,0 12 Stunden lang inkubiert. Nach Deionisierung mit einem herkömmlichen Verfahren wurden die resultierenden Reaktionslösungen auf ihre Saccharidzusammensetzung mittels HPLC gemessen, aufgeführt in Experiment 2–1. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6
    Substrat Saccharid in dem Reaktionsgemisch Gehalt (%)
    Glukose Glukose 100
    6-O-α-Glukosylglukose 6-O-α-Glukosylglukose 100
    62-O-α-Glukosylmaltose Glukose Isomaltose 62-O-α-Glukosylmaltose Cyclotetrasaccharid Isomaltosylpanose Isomaltosypanosid andere 31,8 2,0 4,4 43,2 6,5 2,4 9,7
    63-O-α-Glukosylmaltotriose Maltose Isomaltose 63-O-α-Glukosylmaltotriose Cyclotetrasaccharid andere 50,3 1,9 4,5 30,9 12,4
    64-O-α-Glukosylmaltotetraose Isomaltose Maltotriose Cyclotetrasaccharid 64-O-α-Glukosylmaltotetraose andere 1,5 60,9 25,8 3,2 8,6
    65-O-α-Glukosylmaltopentaose Isomaltose Maltotetraose Cyclotetrasccharid 65-O-α-Glukosylmaltopentaose andere 1,4 66,6 18,7 4,2 9,1
  • Wie durch die Ergebnisse in Tabelle 6 gezeigt ist, stellte sich heraus, dass das Polypeptid mit der α-Isomaltosyl transferierenden Aktivität aus Bacillus globisporus N75 auf Saccharide mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 3 oder höher einwirkte und sowohl die α-1,6-glykosidische Bindung als eine Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende als auch die α-1,4-glykosidische Bindung außer der genannten Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende hat, wie zum Beispiel 62-O-α-Glukosylmaltose, 63-O-α-Glukosylmaltotriose, 64-O-α-Glukosylmaltotetraose und 65-O-α-Glukosylmaltopentaose, und hauptsächlich Cyclotetrasaccharid und Maltooligosaccharide erzeugte, was einen Glukose-Polymerisationsgrad von 2 von dem Substrat senkte. Zusätzlich zu Cyclotetrasaccharid, Maltooligosaccharid, das einen Glukose-Polymerisationsgrad von 2 aus dem Substrat senkte, und dem übrigen Substrat, wurden Spuren von Isomaltose, die als Hydrolyseprodukt betrachtet wurden, und ein weiteres Saccharid, das sich von Cyclotetrasaccharid unterscheidet und für ein Glukosyltransferprodukt betrachtet wird, wurden in dem Reaktionsgemisch gefunden. Die Ausbeute an Cyclotetrasaccharid in trockener Basis aus 62-O-α-Glukosylmaltose, 63-O-α-Glukosylmaltotriose, 64-O-α-Glukosylmaltotetraose und 65-O-α-Glukosylmaltopentaose betrugen 43,2 %, 30,9 %, 25,8 % beziehungsweise 18,7 %. Es wurde kein Produkt aus 6-O-α-Glukosylglukose entdeckt.
  • Experiment 4–2
  • N-terminale Aminosäurensequenz
  • Das Polypeptid mit der α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität, das in Experiment 3–2 hergestellt wurde, hatte eine Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:5 an der N-terminalen Stelle, wenn die Aminosäurensequenz mit dem „Proteinsequenzer Modell 473A", einem Gerät von Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, USA, analysiert wurde.
  • Experiment 4–3
  • Partielle Aminosäurensequenz
  • Ein Teil einer gereinigten Probe des Polypeptids mit α-Isomaltosyl transferierender Aktivität, das in Experiment 3–2 erhalten wurde, wurde gegen 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) bei 4°C dialysiert, und die dialysierte Lösung wurde mit einer frischen Zubereitung des gleichen Puffers verdünnt, sodass sich eine Konzentration von ungefähr 1 mg/ml ergab. Ein Milliliter der verdünnten Lösung wurde als eine Testprobe mit 10 μg „Lysyl-Endopeptidase", die durch Wako Pure Chemicals, Ltd, Tokyo, Japan, vertrieben wird, vermischt und bei 30°C 22 Stunden lang inkubiert, um Peptide zu bilden. Das sich ergebende partielle Hydrolysat wurde unter Verwendung einer „μ-BONDASPHERE C18 Säule", mit einem Durchmesser von 3,9 mm und einer Länge von 150 mm, einem Produkt von Waters Chromatography Div., MILLIPORE Corp., Milford, USA, die zuvor mit 0,1 % (V/V) Trifluoracetat, das 4 % (V/V) Acetonitril enthält, und vor-equilibriert wurde, bei einer Flussrate von 0,9 mm/min und bei Raumtemperatur einer HPLC unterzogen, um die Peptide zu trennen, und unter Verwendung eines linearen Gradienten von Acetonitril, der von 8 % (V/V) auf 42,4 % (V/V) in 0,1 % (V/V) Trifluoracetat über 90 Minuten ansteigt. Von der Säule eluierte Peptidfragmente wurden gefunden, in dem die Absorptivität bei einer Wellenlänge von 210 nm überwacht wurde. Peptidfraktionen mit einer Retentionszeit von ungefähr 21 Minuten, ungefähr 38 Minuten, ungefähr 56 Minuten und ungefähr 69 Minuten wurden getrennt aufgefangen und in vacuo getrocknet und dann in einer Lösung aus 0,1 % (V/V) Trifluoracetat und 50 % (V/V) Acetonitril aufgelöst. Fünf Peptidfragmente wurden erhalten, und jedes Peptidfragmente wies Aminosäurensequenzen der SEQ ID NO:8 und 11 bis 14 auf, als diese Aminosäurensequenzen entsprechend dem Verfahren, das in Experiment 2–2 beschrieben wurde, analysiert wurden.
  • Experiment 4–4
  • Molekulargewicht
  • Wenn eine gereinigte Probe des Polypeptids mit α-Isomaltosyl transferierender Aktivität, das durch das Verfahren in Experiment 3–2 erhalten wurde, der SDS-PAGE entsprechend dem Verfahren, das in Experiment 2–4 offenbart wurde, unterzogen wurde, wurde eine einzelne Proteinbande mit der Enzymaktivität an der Stelle beobachtet, die dem Molekulargewicht von ungefähr 92.000 bis 132.000 Daltons entspricht im Vergleich zu den Molekularmarkern, die durch Bio-Rad Laboratories, Hercules, California 94547, USA, vertrieben werden und der SDS-PAGE zur gleichen Zeit unterzogen werden.
  • Experiment 4–5
  • Optimale Temperatur
  • Eine gereinigte Probe des Polypeptids mit α-Isomaltosyl transferierender Aktivität, das mit dem Verfahren in Experiment 3–2 erhalten wurde, wurde auf das Substrat in 20 mM Acetatpuffer (pH 6,0) bei verschiedenen Temperaturen 30 Minuten lang einwirken gelassen, entsprechend dem Untersuchungsverfahren des α-Isomaltosyl transferierenden Enzyms, das in Experiment 1–1 offenbart wurde. Wie in 5 gezeigt, hatte das Polypeptid eine optimale Temperatur bei ungefähr 50°C.
  • Experiment 4–6
  • Optimaler pH
  • Eine gereinigte Probe des Polypeptids mit α-Isomaltosyl transferierender Aktivität, das mit dem Verfahren in Experiment 3–2 erhalten wurde, wurde in MacIIvaine Puffer bei verschiedenen pHs bei 35°C 30 Minuten lang auf das Substrat einwirken gelassen, entsprechend dem Untersuchungsverfahren des α-Isomaltosyl transferierenden Enzyms, das in Experiment 1–1 offenbart wurde. Wie in 6 gezeigt, hatte das Polypeptid einen optimalen pH bei ungefähr 6,0.
  • Experiment 4–7
  • Thermische Stabilität
  • Eine gereinigte Probe des Polypeptids mit α-Isomaltosyl transferierender Aktivität, das mit dem Verfahren in Experiment 3–2 erhalten wurde, wurde in 20 mM Acetatpuffer (pH 6,0) bei verschiedenen Temperaturen 60 Minuten lang inkubiert, entsprechend dem Untersuchungsverfahren des α-Isomaltosyl transferierenden Enzyms, das in Experiment 1–1 offenbart wurde. Wie in 7 gezeigt, hatte das Polypeptid eine thermische Stabilität von bis zu ungefähr 45°C.
  • Experiment 4–8
  • pH-Stabilität
  • Eine gereinigte Probe des Polypeptids mit α-Isomaltosyl transferierender Aktivität, das mit dem Verfahren in Experiment 3–2 erhalten wurde, wurde MacIIvaine Puffer oder 50 mM Dinatriumkarbonat-Natriumbikarbonatpuffer bei verschiedenen pHs bei 4°C 24 Stunden lang inkubiert, entsprechend dem Untersuchungsverfahren des α-Isomaltosyl transferierenden Enzyms, das in Experiment 1–1 offenbart wurde. Wie in 8 gezeigt, hatte das Polypeptid eine pH-Stabilität von ungefähr 4,5 bis ungefähr 10,0.
  • Experiment 5
  • Rekombinante DNA, die eine DNA enthält, die ein Polypeptid aus Bacillus globisporus C11 kodiert, und einen Transformant enthält
  • Experiment 5–1
  • Herstellung von chromosomaler DNA aus Bacillus globisporus C11
  • Ein flüssiges Kulturmedium, das aus 2 % (M/V) „PINE-DEX # 4", einem partiellen Stärkehydrolysat, 1,0 % (M/V) „ASHIMEAST", einem Hefeextrakt, 0,1 % (M/V) Dikaliumphosphat, 0,06 % (M/V) Natriumphosphat-Dodekahydrat, 0,05 % (M/V) Magnesiumsulfat-Heptahydrat und Wasser besteht, wurden in 500-ml-Erlenmeyerkolben in einer jeweiligen Menge von 100 ml eingebracht, durch Autoklavieren bei 121°C 20 Minuten lang sterilisiert, abgekühlt und mit Bacillus globisporus C11, FERM BP-7144, geimpft, gefolgt von Kultivieren unter 24-stündigem Rotationsschütteln bei 27°C und 230 Upm. Die durch Zentrifugieren aus der Kultur gesammelten Zellen wurden in TES Puffer (pH 8,0) suspendiert, die suspendierte Lösung wurde mit Lysozym vermischt, so dass sich eine Konzentration von 0,05 % (M/V) ergibt, und bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert. Nach dem das Lysat bei –80°C 1 Stunde lang eingefroren wurde, wurde dem Lysat TES Puffer (pH 9,0) zugefügt und es wurde auf 60°C erhitzt. Der Lösung wurde eine Mischung aus TES Puffer und Phenol zugefügt, und sie wurde kräftig fünf Minuten lang in einem Eisbad geschüttelt, und der Überstand wurde durch Zentrifugieren aufgefangen. Dem Überstand wurde ein doppeltes Volumen an kaltem Ethanol zugefügt, und der resultierende Rohniederschlag wurde als eine chromosomale Roh-DNA aufgefangen. Die chromosomale Roh-DNA wurde in SSC Puffer (pH 7,1) aufgelöst, und mit 7,5 μg Ribonuklease und 124 μg Proteinase vermischt, und bei 37°C eine Stunde lang inkubiert. Die chromosomale DNA wurde aus dem Reaktionsgemisch extrahiert, in dem eine Chloroform/Isoamylalkoholmischung zugegeben wurde, danach kaltes Ethanol zugefügt wurde, und der sich ergebende Niederschlag, der die chromosomale DNA enthält, wurde aufgefangen. Die gereinigte chromosomale DNA, die gemäß dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, wurde in einem SSC Puffer (pH 7,1) gelöst, so dass sich eine Konzentration von ungefähr einem mg/ml ergibt, und bei –80°C eingefroren.
  • Experiment 5–2
  • Herstellung einer rekombinanten DNA, pBGC1 und einem Transformant, BGC1
  • Ein Milliliter der gereinigten chromosomalen DNA Lösung, die mit dem Verfahren in Experiment 5–1 hergestellt wurde, wurde mit ungefähr 35 Einheiten eines Restriktionsenzyms Sau 3AI, vermischt und bei 37°C 20 Minuten lang zum partiellen Aufschluss der chromosomalen DNA inkubiert. Die resultierenden DNA Fragmente, die ungefähr 2.000 bis 6.000 Basenpaaren entsprechen, wurden durch Saccharose Dichtegradienten-Zentrifugieren aufgefangen. Ein Plasmidvektor, Bluescript II SK (+), der durch Stratagene Cloning System vertrieben wird, wurde vollständig mit einem Restriktionsenzym Bam HI, durch ein herkömmliches Verfahren aufgeschlossen. Eine rekombinante DNA wurde erhalten, indem 0,5 μg des aufgeschlossenen Plasmidvektors an ungefähr 5 μg des zuvor hergestellten DNA Fragments unter Verwendung eines „DNA ligation kit", der durch Takara Shuzo Co., Ltd., vertrieben wird, ligiert wurden, entsprechend dem Verfahren, das in einem dem Kit beigefügten Dokument beschrieben ist.
  • Dann wurde eine Genbibliothek hergestellt, indem ein 100 μl Anteil der kompetenten Zelle, „Epicurian Coli XL2-Blue", ver trieben durch Stratagene Cloning System, mit der rekombinanten DNA durch ein herkömmliches Kompetenzzellenverfahren transformiert wurde. Die so als Genbibliothek erhaltenen Transformanten wurden in ein frisches Agarplattenmedium (pH 7,0), das 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l Natriumchlorid, 100 mg/l Ampicillin-Natriumsalz und 50 mg/l 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-Galaktosid enthielt, geimpft und bei 37°C 24 Stunden lang inkubiert. Ungefähr 5.000 weiße Kolonien, die auf der Platte wuchsen, wurden auf eine Nylonmembran, „Hybond-N+", vertrieben durch Amasham Bioscience K. K., überführt und darauf fixiert. Ein Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz von "5'-AAYTGGTGGATGWSNAA-3'" wurde auf der Basis einer Aminosäurensequenz der ersten bis zur sechsten der SEQ ID NO:8 chemisch synthetisiert, die durch das Verfahren in Experiment 2–3 offenbart ist. Eine synthetische DNA (Sonde 1) wurde erhalten, indem das Oligonukleotid mit einem Radioisotop unter Verwendung von [☐ – 32p]ATP und T4 Polynukleotidkinase entsprechend dem herkömmlichen Verfahren markiert wurde. Nachfolgend wurden vier Arten der Transformanten, die merkliche Hybridisierung mit der Sonde 1 zeigten, aus den Kolonien ausgewählt, die auf der zuvor erhaltenen Nylonmembran fixiert waren, wobei herkömmliche Kolonie-Hybridisierung verwendet wurde. Die rekombinanten DNAs wurden aus diesen vier Typen der Transformanten mit einem herkömmlichen Verfahren eingesammelt. Andererseits wurde Sonde 2 mit der Nukleotidsequenz „5'-GTNTTYAAYCARTAYAA-3'" basierend auf einer Aminosäurensequenz der neunten bis vierzehnten der SEQ ID NO:7 chemisch synthetisiert und mit einem Radioisotop auf die gleiche Art und Weise markiert. Die erhaltenen rekombinanten DNAs und Sonde 2 wurden für herkömmliche Southern-Hybridisierung verwendet, und eine rekombinante DNA, die eine merkliche Hybridisierung mit Sonde 2 zeigte, wurde ausgewählt. Ein auf diese Weise ausgewählter Transformant wurde „BGC1" genannt. Entsprechend dem herkömmlichen Ver fahren wurde der Transformant, BGC1, in ein L-Nährlösungsmedium (pH 7,0), das 100 μg/ml Ampicillinatriumsalz enthält, geimpft und unter Rotationsschütteln bei 37°C 24 Stunden lang kultiviert. Nach Abschluss der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugieren eingesammelt, und die rekombinante DNA wurde aus den Zellen durch ein herkömmliches alkalisches SDS-Verfahren extrahiert. Wenn die Nukleotidsequenz der rekombinanten DNA durch das herkömmliche Didesoxy-Verfahren analysiert wurde, stellte sich heraus, dass die rekombinante DNA eine DNA mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:15, 3.869 Basenpaare, die von Bacillus globisporus C11 (FERM BP-7144) stammten, enthielt. In der rekombinanten DNA wurde eine DNA mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:15 erhalten, die in 9 durch den Teil mit der schwarz-fetten Linie gezeigt ist, und wurde stromabwärts der Erkennungsstelle eines Restriktionsenzyms, Xba I, ligiert.
  • Die Aminosäurensequenz, die sich aus der Nukleotidsequenz ableitet, liegt, wie gezeigt, parallel in SEQ ID NO:15 vor. Die Aminosäurensequenz wurde mit der Aminosäurensequenz des Polypeptids mit α-Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität verglichen, d. h. mit der N-terminalen Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:5, die durch das Verfahren in Experiment 2–2 offenbart wurde, und mit den internen partiellen Aminosäurensequenzen der SEQ ID NO:6 bis 10, die durch das Verfahren in Experiment 2–3 offenbart wurden. Eine Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:5 war vollständig identisch mit der der 30. bis 48. der Aminosäurensequenz, die parallel in SEQ ID NO:15 gezeigt wurde. Aminosäurensequenzen der SEQ ID NO:6, 7, 8, 9 und 10 waren vollständig identisch mit jenen der 584. bis 597., 292. bis 305., 545. bis 550., 66. bis 77. und 390. bis 400. der Aminosäurensequenz, die jeweilig parallel in SEQ ID NO:15 gezeigt wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Polypeptid mit α- Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität die Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:1 enthält und dass das Polypeptid durch die DNA mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:3 im Fall von Bacillus globisporus C11 (FERM BP-7144) kodiert wird. Es wurde vermutet, dass eine Aminosäurensequenz der ersten bis zur 29. von der parallel in SEQ ID NO:15 gezeigten, eine Sekretionssignalsequenz des Polypeptids ist. Entsprechend der oben beschriebenen Ergebnisse stellte sich heraus, dass das Precursorpeptid des Polypeptids vor der Sekretion die Aminosäurensequenz aufwies, die parallel in SEQ ID NO:15 gezeigt ist, und dass die Aminosäurensequenz durch die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:15 kodiert wurde. Die rekombinante DNA, die die Nukleotidsequenz wie oben beschrieben herstellte und bestätigte, wurde „pBGC1" genannt.
  • Experiment 6
  • Herstellung einer rekombinanten DNA, die eine DNA enthält, die ein Polypeptid aus Bacillus globisporus N75 kodiert, und einen Transformanten enthält
  • Experiment 6–1
  • Herstellung von chromosomaler DNA aus Bacillus globisporus N75
  • Ein flüssiges Kulturmedium, das aus 2 % (M/V) „PINE-DEX # 4", einem partiellen Stärkehydrolysat, 1,0 % (M/V) „ASAHIMEAST", einem Hefeextrakt, 0,1 % (M/V) Dikaliumphosphat, 0,06 % (M/V) Natriumphosphat-Dodekahydrat, 0,05 % (M/V) Magnesiumsulfat-Heptahydrat und Wasser besteht, wurde in 500-ml-Erlenmeyerkolben in einer jeweiligen Menge von 100 ml eingebracht, durch Autoklavieren bei 121°C 20 Minuten lang sterilisiert, abgekühlt und mit Bacillus globisporus N75, FERM BP-7591, geimpft, gefolgt von 24-stündigen Kultivieren unter Rotationsschütteln bei 27°C und 230 Upm Die aus der Kultur aus Zentrifugieren aufgefangenen Zellen wurden in TES-Puffer (pH 8,0) suspendiert, die suspendierte Lösung wurde mit Lysozym vermischt, sodass sich eine Konzentration von 0,05 % (M/V) ergab, und bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert. Nachdem das Lysat bei –80°C eine Stunde lang eingefroren wurde, wurde dem Lysat TES-Puffer (pH 9,0) zugefügt, und es wurde auf 60°C erhitzt. Der Lösung wurde eine Mischung aus TES-Puffer und Phenol zugefügt, und sie wurde kräftig 5 Minuten lang in einem Eisbad geschüttelt, und der Überstand wurde durch Zentrifugieren aufgefangen. Dem Überstand wurde ein doppeltes Volumen an kaltem Ethanol zugegeben, und der sich ergebende Rohniederschlag wurde als chromosomale Roh-DNA aufgefangen. Die chromosomale Roh-DNA wurde in SSC-Puffer (pH 7,1) aufgelöst und mit 7,5 μg Ribonuklease und 125 μg Proteinase vermischt und eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die chromosomale DNA wurde aus dem Reaktionsgemisch extrahiert, indem eine Chloroform/Isoamylalkoholmischung zugegeben wurde, dann kaltes Ethanol zugefügt wurde, und dann wurde der sich ergebende Niederschlag, der die chromosomale DNA enthält, aufgefangen. Die gereinigte chromosomale DNA, die entsprechend dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, wurde in SSC-Puffer (pH 7,1) gelöst, sodass sich eine Konzentration von ungefähr 1 mg/ml ergab, und bei –80°C eingefroren.
  • Experiment 6–2
  • Herstellung einer rekombinanten DNA, pBGN1 und eines Transformanten, BGN1
  • Einhundert μl (0,1 ml) der gereinigten chromosomalen DNA-Lösung, die mit dem Verfahren aus Experiment 6–1 hergestellt wurde, wurden mit ungefähr 100 Einheiten eines Restriktionsenzyms, Sac I, vermischt und bei 37°C 6 Stunden lang inkubiert, sodass die chromosomale DNA aufgeschlossen wurde. Die resultierenden DNA-Fragmente wurden durch Agarosegel-Elektrophorese getrennt und die DNA-Fragmente, die ungefähr 3.000 bis 7.000 Basenpaaren entsprechen, wurden aufgefangen unter Verwendung eines DNA-Reinigungskits, „GENECLEAN II KIT", vertrieben durch Quantum Biotechnologies, Carlsbad, CA 92008, USA, gemäß dem in einem dem Kit beigefügten Dokument beschriebenen Verfahren. Ein Plasmidvektor, Bluescript II SK(+), vertrieben durch Stratagene Cloning System, wurde vollständig mit einem Restriktionsenzym, Sac I, aufgeschlossen. Eine rekombinante DNA wurde erhalten, indem 0,5 μg des aufgeschlossenen Plasmidvektors mit ungefähr 5 μg der zuvor hergestellten DNA-Fragmente ligiert wurden unter Verwendung eines „DNA Ligierungskits", vertrieben durch Takara Shuzo Co., Ltd., entsprechend dem in einem dem Kit beigefügten Dokument beschriebenen Verfahren. Danach wurde eine Genbibliothek hergestellt, indem ein 100 μl Anteil der kompetente Zelle, „Epicurian Coli XL2-Blue", vertrieben durch Stratagene Cloning System, mit der rekombinanten DNA durch ein herkömmliches Kompetenzzellenverfahren transformiert wurde. Die so als eine Genbibliothek erhaltenen Transformanten wurden in ein frisches Agarplattenmedium (pH 7,0) geimpft, das 10 g/l Trypton, 5 g/l eines Hefeextrakts, 5 g/l Natriumchlorid, 100 mg/l Ampicillinnatriumsalz und 50 mg/l 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-Galaktosid enthält und bei 37°C 24 Stunden lang inkubiert. Ungefähr 4.000 weiße Kolonien, die auf der Platte gewachsen waren, wurden auf eine Nylonmembran, „Hybond-N+", vertrieben durch Amasham Bioscience K. K., transferiert und darauf fixiert. Ein Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz "5'-AAYTGGTGGATGWSNAA-3'" wurde chemisch auf der Basis einer Aminosäurensequenz der ersten bis sechsten der SEQ ID NO:8 synthetisiert, das durch das Verfahren aus Experiment 2–3 offenbart ist. Eine synthetische DNA (Sonde 1) wurde erhalten, indem das Oligonukleotid mit einem Radioisotop unter Verwendung von
    [☐ – 32p]ATP und T4 Polynukleotidkinase entsprechend dem her kömmlichen Verfahren markiert wurde. Nachfolgend wurden zwei Transformanttypen, die merkliche Hybridisierung mit Sonde 1 zeigten, von den zuvor erhaltenen auf der Nylonmembran fixierten Kolonien ausgewählt unter Verwendung herkömmlicher Kolonie-Hybridisierung. Die rekombinanten DNAs wurden aus diesen zwei Transformanttypen durch ein herkömmliches Verfahren aufgefangen. Andererseits wurde Sonde 2 mit der Nukleotidsequenz "5'-GAYTGGATHGAYTTYTGGTTYGG-3'" chemisch auf der Basis einer Aminosäurensequenz der achten bis fünfzehnten der SEQ ID NO:14 synthetisiert und mit einem Radioisotop auf die gleiche Weise markiert. Die erhaltenen rekombinanten DNAs und Sonde 2 wurden für herkömmliche Southern-Hybridisierung verwendet, und eine rekombinante DNA, die eine merkliche Hybridisierung mit Sonde 2 zeigte, wurde ausgewählt. Ein so ausgewählter Transformant wurde „BGN1" genannt. Entsprechend dem herkömmlichen Verfahren wurde der Transformant BGN1 in ein L-Nährlösungsmedium (pH 7,0), das 100 μg/ml Ampicillinnatriumsalz enthält, geimpft und unter Rotationsschütteln bei 37°C 24 Stunden lang kultiviert. Nach Abschluss der Kultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, und die rekombinante DNA wurde aus den Zellen mit einem herkömmlichen alkalischen SDS-Verfahren extrahiert. Als die Nukleotidsequenz der rekombinanten DNA mittels herkömmlichen Didesoxy-Verfahren analysiert wurde, stellte sich heraus, dass die rekombinante DNA eine DNA mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:16, 4.986 Basenpaare enthielt, die von dem Bacillus globisporus N75 (FERM BP-591) stammten. In der rekombinanten DNA wurde eine DNA mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:16 in 10 durch den Teil mit der schwarz-fetten Linie gezeigt und stromabwärts der Erkennungsstelle eines Restriktionsenzyms, Sac I, ligiert.
  • Die Aminosäurensequenz, die sich aus der Nukleotidsequenz ableitet, ist wie parallel in SEQ ID NO:16 gezeigt. Die Amino säurensequenz wurde mit der Aminosäurensequenz des Polypeptids mit der α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität verglichen, d. h. der N-terminalen Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:5, die durch das Verfahren in Experiment 4–2 offenbart wurde, und der internen partiellen Aminosäurensequenzen der SEQ ID NO:8 und 11 bis 14, die durch das Verfahren aus Experiment 4–3 offenbart wurde. Eine Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:5 war vollständig identisch mit der der 30. bis 48. der Aminosäurensequenz, die parallel in SEQ ID NO:16 gezeigt wurde. Die Aminosäurensequenzen der SEQ ID NO:8, 11, 12, 13 und 14 waren vollständig identisch mit jenen von der 545. bis 550., 565. bis 582., 66. bis 83., 390. bis 406. und 790. bis 809. der Aminosäurensequenz, die entsprechend parallel in SEQ ID NO:16 gezeigt wurden. Diese Ergebnisse indizieren, dass das Polypeptid mit der α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität die Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:2 enthält und dass das Polypeptid durch die DNA mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:4 im Fall von Bacillus globisporus N75 (FERN BP-7591) kodiert ist. Es wurde vermutet, dass eine Aminosäurensequenz der ersten bis 29. von derjenigen, die parallel in SEQ ID NO:16 gezeigt wurde, eine Sekretionssignalsequenz des Polypeptids ist. Entsprechend der oben beschriebenen Ergebnisse stellte sich heraus, dass das Precursor-Peptid des Polypeptids vor der Sekretion die Aminosäurensequenz, die in SEQ ID NO:16 parallel gezeigt ist, hatte und dass die Aminosäurensequenz durch die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:16 kodiert wurde. Die rekombinante DNA, die die oben beschriebene Nukleotidsequenz herstellte und bestätigte, wurde „BGN1" genannt.
  • Experiment 7
  • Herstellung eines Polypeptids mit α-Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität durch Transformanten
  • Experiment 7–1
  • Ein Transformant, BGC1
  • Ein flüssiges Kulturmedium, das aus 5 g/l „PINE-DEX # 4", einem partiellen Stärkehydrolysat, 20 g/l Polypepton, 20 g/l eines Hefeextrakts, 1 g/l Natriumphosphat-Dodekahydrat und Wasser besteht, wurde in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben in einer Menge von 100 ml eingebracht, durch 15 Minuten Autoklavieren bei 121°C sterilisiert und abgekühlt. Dann wurde das flüssige Medium steril auf pH 7,0 eingestellt und steril mit 10 mg Ampicillinnatriumsalz vermischt. Ein Transformant, BGC1, der durch das Verfahren aus Experiment 5–2 erhalten wurde, wurde in das obige flüssige Medium geimpft und bei 27°C 48 Stunden lang unter belüfteten bewegen kultiviert. Um die Lokalisierung des Polypeptids in der Kultur zu untersuchen, wurden Zellen und Überstand separat durch herkömmliches Zentrifugieren aufgefangen. Im Fall der Zellen wurden ein Ganzzellenextrakt, das durch Ultraschallaufschluss erhalten wurde, und ein periplasmisches Extrakt, das durch ein Osmoseschockverfahren erhalten wurde, separat hergestellt. Im Fall des Ultraschallaufschlusses wurden die Zellen in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert und dann in einem Eisbad unter Verwendung eines Ultraschallhomogenisators, „Model UH-600", vertrieben durch die MST Corporation, Aichi, Japan, aufgeschlossen. Im Fall des Osmoseschockverfahrens wurden die Zellen mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,3), der 30 mM Natriumchlorid enthält, gewaschen, und die gewaschenen Zellen wurden in 33 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,3), der 200 g/l Saccharose und 1 mM EDTA enthält, suspendiert, bei 27°C 20 Minuten lang geschüttelt und dann zentrifugiert, um die Zellen aufzufangen. Nachfolgend wurden die Zellen in 0,5 mM Magnesiumchloridlösung suspendiert, die zuvor auf ungefähr 4°C gekühlt wurde, und in einem Eisbad 20 Minuten lang geschüttelt, um die periplasmische Fraktion zu extrahieren. Die α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivitäten des Kulturüberstands, des Ganzzellenextrakts und des periplasmischen Extrakts, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, wurden untersucht, und diese Werte wurden entsprechend in Form von Aktivitäten/ml-Kultur ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 aufgeführt. Tabelle 7
    Probe α-Isomaltosyl transferierende Enzymaktivität (Einheiten/ml-Kultur)
    Kulturüberstand 0,0
    Ganzzellenextrakt 3,4
    periplasmischer Extrakt 3,0
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 7 offenkundig wird, stellte sich heraus, dass der Transformant, E. Coli BGC1 das Polypeptid mit α-Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität der vorliegenden Erfindung intrazellulär erzeugte und das meiste davon in der periplasmischen Fraktion absonderte.
  • Als das erste Kontrollexperiment wurde E. Coli XL2-Blue unter den gleichen Bedingungen im Fall des oben beschriebenen Transformanten ausgenommen der Zugabe von Ampicillin kultiviert, und ein Überstand und ein Zellextrakt wurden aus der Kultur hergestellt. Als zweites Kontrollexperiment wurde Bacillus globisporus C11, FERM BP-7144, unter den gleichen Bedingungen wie im Fall des oben beschriebenen Transformanten ausgenommen der Zugabe von Ampicillin kultiviert, und ein Überstand und ein Zellextrakt wurden aus der Kultur hergestellt. In dem ersten Kontrollexperiment wurde keine Enzymaktivität, weder im Kulturüberstand noch im Zellextrakt, gefunden. Im zweiten Kontrollexperiment lag die Enzymaktivität des Kulturüberstands und des Zellextrakts bei ungefähr 1,2 Einheiten, beziehungsweise 0,1 Einheiten, und die Gesamtenzymaktivität pro einem ml Kultur lag bei ungefähr 1,3 Einheiten. Verglichen mit der Gesamtenzymaktivität von 3,4 Einheiten/ml-Kultur für den Transformanten BGC1 lag die Enzymaktivität offensichtlich bei Werten auf geringem Niveau.
  • Die periplasmische Fraktion wurde weiter gereinigt durch Aussalzen, Dialyse und aufeinander folgende Säulenchromatographien auf „SEPABEADS FP-DA13" Gel, „SEPHACRYL HR S-200" Gel und „BUTYL-TOYOPEARL 650 M" Gel gemäß den in Experiment 1 beschriebenen Verfahren, und das gereinigte Polypeptid wurde gemäß den im Experiment 2 beschriebenen Verfahren analysiert. Im Ergebnisse betrug das Molekulargewicht ungefähr 82.000 bis 122.000 Daltons durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, der isoelektrische Punkt wurde mit etwa 5,1 bis 6,1 durch Polyarylamidgel-Isoelektrophorese bestimmt, die optimale Temperatur für α-Isomaltosyl transferierende Enzymaktivität lag bei ungefähr 50°C, der optimale pH für das Enzym lag bei ungefähr 5,5 bis 6,0, die thermische Stabilität betrug bis zu ungefähr 40°C, und die pH-Stabilität lag im Bereich von ungefähr pH 4,5 bis ungefähr 9. Diese physikochemischen Eigenschaften waren praktisch identisch mit jenen des Polypeptids mit der α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität, das in Experiment 1 hergestellt wurde. Die oben beschriebenen Ergebnisse indizieren, dass die Techniken zur rekombinanten DNA fähig sind, ein Polypeptid mit der α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität der vorliegenden Erfindung stabil und im großen Maßstab und bei relativ geringen Kosten herzustellen.
  • Experiment 7–2
  • Ein Transformant, BGN1
  • Ein flüssiges Kulturmedium, das aus 5 g/l „PINE-DEX # 4", einem partiellen Stärkehydrolysat, 20 g/l Polypepton, 20 g/l eines Hefeextrakts, 1 g/l Natriumphosphat-Dodekahydrat und Wasser besteht, wurde in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben in einer Menge von 100 ml eingebracht, durch Autoklavieren 15 Minuten lang bei 121°C sterilisiert und abgekühlt. Dann wurde das flüssige Medium steril auf pH 7,0 eingestellt und steril mit 10 mg Ampicillinnatriumsalz vermischt. Ein mit dem Verfahren aus Experiment 6–2 erhaltener Transformant, BGN1, wurde in das obige flüssige Medium geimpft und bei 27°C 48 Stunden lang unter belüftetem Bewegen kultiviert. Um die Stelle des Polypeptids in der Kultur zu untersuchen, wurden die Zellen und der Überstand separat durch herkömmliches Zentrifugieren aufgefangen. Wie in Experiment 7–1 beschrieben wurden der Ganzzellenextrakt, der durch Ultraschallaufschluss erhalten wurde, und der periplasmische Extrakt, der durch das Osmoseschockverfahren erhalten wurde, separat hergestellt. Die α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivitäten des Kulturüberstands, des Ganzzellenextrakts und des periplasmischen Extrakts wurden untersucht, und diese Werte wurden in Form von den entsprechenden Aktivitäten pro ml Kultur ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 aufgeführt. Tabelle 8
    Probe α-Isomaltosyl transferierende Enzymaktivität (Einheiten/ml-Kultur)
    Kulturüberstand 0,2
    Ganzzellenextrakt 3,1
    periplasmischer Extrakt 2,9
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 8 offenkundig wird, stellte sich heraus, dass der Transformant, E. coli BGN1, das Polypeptid mit α-Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität der vorliegenden Erfindung intrazellulär erzeugte und das meiste davon in der periplasmischen Fraktion absonderte. Die Enzymaktivität wurde auch in dem Kulturüberstand gefunden.
  • Als erstes Kontrollexperiment wurde E. coli XL2-Blue unter den gleichen Bedingungen wie im Fall des oben beschriebenen Transformanten ausgenommen der Zugabe von Ampicillin kultiviert, und ein Überstand und ein Zellextrakt wurden aus der Kultur hergestellt. Als zweites Kontrollexperiment wurde Bacillus globisporus N75, FERM BP-7591, unter den gleichen Bedingungen wie im Fall des oben beschriebenen Transformanten ausgenommen der Zugabe von Ampicillin kultiviert, und ein Überstand und ein Zellextrakt wurden aus der Kultur hergestellt. Im ersten Kontrollexperiment wurde keine Enzymaktivität, weder im Kulturüberstand noch im Zellextrakt, gefunden. Im zweiten Kontrollexperiment lag die Enzymaktivität des Kulturüberstands und des Zellextrakts bei ungefähr 0,7 Einheiten beziehungsweise ungefähr 0,1 Einheiten, und die Gesamtenzymaktivität pro 1 ml-Kultur lag bei ungefähr 0,8 Einheiten. Verglichen mit der Gesamtenzymaktivität von 3,3 Einheiten pro ml-Kultur des Transformanten BGN1, lag die Enzymaktivität offensichtlich bei Werten auf geringem Niveau.
  • Die periplasmische Fraktion wurde weiter gereinigt durch Aussalzen, Dialyse und aufeinander folgende Säulenchromatographien auf „ SEPABEADS FP-DA13" Gel, „SEPHACRYL HR S-200" Gel und „BUTYL-TOYOPEARL 650 M" Gel gemäß den in Experiment 3 beschriebenen Verfahren, und das gereinigte Polypeptid wurde gemäß den in Experiment 4 beschriebenen Verfahren analysiert. Im Ergebnis betrug das Molekulargewicht ungefähr 92.000 bis 132.000 Daltons, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, der isoelektrische Punkt wurde mit ungefähr 7,3 bis 8,3 durch Polyacrylamidgel-Isoelektrophorese bestimmt, die optimale Temperatur der α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität lag bei ungefähr 50°C, der optimale pH für das Enzym lag bei ungefähr 6,0, die thermische Stabilität war bis zu ungefähr 45°C gegeben, und die pH-Stabilität lag im Bereich von ungefähr pH 4,5 bis ungefähr 10. Diese physikochemischen Eigenschaften waren praktisch identisch mit jenen des Polypeptids mit α-Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität, das in Experiment 3 hergestellt wurde. Die oben beschriebenen Ergebnisse indizieren, dass rekombinanten DANN-Techniken es ermöglichen, ein Polypeptid mit der α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität der vorliegenden Erfindung stabil und in großem Maßstab und zu relativ geringen Kosten herzustellen.
  • Als eines der Produkte aus lang währenden Untersuchungen durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung wurde, wie oben beschrieben, ein Polypeptid mit einer Aktivität gefunden zur Bildung eines Cyclotetrasaccharid aus einem Saccharid mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 3 oder höher, und das sowohl die α-1,6 glykosidische Bindung als eine Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende als auch die α-1,4 glykosidische Bin dung außer der genannten Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende trägt, umfassend die Aminosäurensequenzen von entweder SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2, oder die Aminosäurensequenzen mit Deletion, Austausch oder Einführung einer oder mehrerer Aminosäuren der SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2, und es weist einzigartige physikochemische Eigenschaften im Vergleich mit den bisher bekannten Enzymen auf. Die vorliegende Erfindung beabsichtigt, das Polypeptid durch Anwenden rekombinanter DNA-Techniken zu schaffen. Das Folgende erklärt das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, seine Herstellungsverfahren und seine Verwendungen detailliert unter Bezugnahme auf die Beispiele.
  • Das Polypeptid, worauf sich die vorliegende Erfindung bezieht, bedeutet die gesamten Polypeptide, die eine Aktivität aufweisen, ein Cyclotetrasaccharid aus einem Saccharid mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 3 oder höher zu bilden, und das sowohl die α-1,6 glykosidische Bindung als eine Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende als auch die α-1,4 glykosidische Bindung außer der genannten Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende hat, und Aminosäurensequenzen von entweder SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 aufweist, oder die Aminosäurensequenzen mit Deletion, Austausch oder Addition von einer oder mehrerer Aminosäuren der SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 umfasst. Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung umfasst für gewöhnlich eine gelöste Aminosäurensequenz, zum Beispiel eine Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 oder eine homologe Aminosäurensequenz davon. Mutanten mit den homologen Aminosäurensequenzen mit SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 können durch Deletion, Austausch oder Addition von einer oder mehrerer, d. h. zumindest einer oder zwei, entsprechend der Situation, 1–50, 1–30 oder 1–10 Aminosäuren der SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 erhalten werden, praktisch ohne die inhärenten physikochemischen Eigenschaften des Enzyms zu verändern. Sogar unter Verwendung der gleichen DNA wird die Modifikation des Polypeptids nach der Translation durch extra-/intrazelluläre Enzyme des Wirts durch verschiedene Bedingungen beeinflusst, wie zum Beispiel Arten des Wirts, Nährstoffe oder Zusammensetzung von Kultivierungsmedien, Temperaturen oder pHs für die Kultivierung eines Transformanten mit der DNA. Unter diesen Bedingungen ist es möglich, einige Mutanten mit Deletion oder Austausch von einer oder mehrerer, d. h. zumindest einer oder zwei, entsprechend der Situation 1–30, 1–20 oder 1–10 Aminosäuren des N-terminalen Bereichs der SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 entstehen zu lassen, oder mit Addition von einer oder mehrerer, d. h. zumindest einer oder zwei, entsprechend der Situation 1–30, 1–20 oder 1–10 Aminosäuren an jenen N-Terminus, ohne die inhärente Aktivität zu verändern. Es ist geeignet, dass das Polypeptid der vorliegenden Erfindung diese Mutanten mit einschließt, sofern sie die gewünschten physikochemischen Eigenschaften aufweisen.
  • Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann durch die Schritte des Einführens der DNA der vorliegenden Erfindung in geeignete Wirte und des Auffangens aus der erhaltenen Kultur der Transformanten erhalten werden. Der in der vorliegenden Erfindung verwendbare Transformant ist ein Transformant, der eine DNA enthält, die zum Beispiel eine Nukleotidsequenz aus dem 5'-Terminus der SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 mit Deletion, Austausch oder Einführung von einem oder mehreren Nukleotiden derselben, Anti-Sense-Nukleotidsequenzen derselben hat oder die Austausch von einem oder mehreren Nukleotiden basierend auf Gen-Degeneration aufweist, ohne die kodierte Aminosäurensequenz zu verändern. Die Nukleotidsequenz mit Austausch von einem oder mehrerer, d. h. zumindest einer oder zwei, entsprechend der Situation 1–190, 1–60 oder 1–30 Nukleotiden der SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 basierend auf Gen-Degeneration, ohne die kodierte Aminosäurensequenz zu verändern, kann als die oben beschriebene Nukleotidsequenz verwendet werden.
  • Die DNA der vorliegenden Erfindung umfasst eine DNA, die aus der Natur stammt, und die künstlich synthetisierte, sofern die DNA die oben beschriebenen Nukleotidsequenzen aufweist. Mikroorganismen, die zu der Gattung Bacillus, zum Beispiel Bacillus globisporus C11 (FERN BP-7144) und Bacillus globisporus N75 (FERN BP-7591) gehören, waren als natürliche Quellen verwendbar. Ein Gen, das die DNA der vorliegenden Erfindung enthält, kann aus den Zellen dieser Mikroorganismen erhalten werden. Insbesondere kann ein Gen, das die DNA enthält, durch die Schritte des Impfens des Mikroorganismus' in ein Nährmedium, des Kultivierens über einen bis drei Tage unter aeroben Bedingungen, des Auffangens der Zellen aus der Kultur, des Behandelns der Zellen mit zell-lysierenden Enzymen, wie zum Beispiel Lysozym und β-Glukanase oder mittels Ultraschall extrazellulär freigesetzt werden. Zusätzlich zu den oben beschriebenen Verfahren ist die Verwendung von proteinhydrolysierenden Enzymen, wie zum Beispiel Proteinasen, Detergenzien, wie zum Beispiel Natriumdodecylsulfat und Auftau-Einfrier-Verfahren ebenfalls anwendbar. Die Ziel DNA kann aus den aufgeschlossenen Zellen unter Verwendung herkömmlicher Verfahren des Stands der Technik, zum Beispiel Phenol-Extraktion, Alkoholausfällung, Zentrifugieren und Ribonuklease-Aufbereitung erhalten werden. Um die DNA künstlich zu synthetisieren, ist die chemische Synthese der DNA basierend auf der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 anwendbar. Das PCR-Verfahren ist ebenfalls geeignet, die DNA zu erhalten unter Verwendung eines Gens, das die DNA als Template und geeignete chemisch synthetisierte DNA als ein Primer enthält. Die DNA kann durch die Schritte des Einführens der chemisch synthetischen DNA, die SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 in einen geeigneten, autonom replizierbaren Vektor kodiert, des Einbringens der resultierenden rekombinanten DNA in geeignete Wirte, des Kultivierens des resultierenden Transformanten, des Auffangens der Zellen aus der Kultur und des Auffangens der rekombinanten DNA, die die DNA aus den Zellen enthält, erhalten werden.
  • Die DNAs werden für gewöhnlich in Wirtszellen in Form von rekombinanten DNAs eingeführt. Rekombinante DNAs sind für gewöhnlich aus einer DNA und einem autonom replizierbaren Vektor aufgebaut und können relativ einfach durch die herkömmlichen Techniken für rekombinante DNA hergestellt werden, falls die DNA erhalten ist. Als Vektoren können zum Beispiel Plasmidvektoren wie pBR322, pUC18, Bluescript II SK(+), pUB110, pTZ4, pC194, pHV14, TRp7, YEp7 und pBS7; oder Phagenvektoren wie ☐gt·☐c, ☐gt·☐b, ☐11, Φ1 und Φ105 verwendet werden. Um die DNAs der vorliegenden Erfindung in E. coli zu exprimieren sind pBR322, pUC18, Bluescript II SK(+), ☐gt·☐c und ☐gt·☐b bevorzugt. Um die DNAs der vorliegenden Erfindung in B. subtilis zu exprimieren, werden pUB110, pTZ4, pC194, ☐11, Φ1 und Φ105 bevorzugt. Plasmide pHV14, TRp7, YEp7 und pBS7 sind für den Fall nützlich, wenn die rekombinanten DNAs in zwei oder mehr Wirten repliziert werden. Um die DNA in diese Vektoren einzufügen, können herkömmliche Verfahren, die im Stand der Technik gebräuchlich sind, verwendet werden. Insbesondere kann die DNA durch die folgenden Schritte in einen Vektor eingeführt werden: Spalten eines Gens, das die DNA und autonom replizierbare Vektoren enthält, durch Restriktionsenzyme und/oder Ultraschall und Ligieren des resultierenden DNA-Fragments mit dem resultierenden Vektorfragment. Das Ligieren des DNA-Fragments und des Vektorfragments ist einfach, insbesondere von Typ II-Restriktionsenzymen wie zum Beispiel Sau 3AI, Eco RI, Hind III, Bam HI, Sal I, Xba I, Sac I und Pst I, zum Spalten von Genen und Vektoren verwendet wird. Nach dem Annealing von beiden ist die gewünschte rekombinante DNA, falls nötig, erhältlich, indem sie in vivo oder in vitro unter Verwendung einer DNA-Ligase ligiert werden. Die so erhaltene rekombinante DNA ist durch die Schritte des Einführens in geeignete Wirte und des Kultivierens der resultierenden Transformanten unbeschränkt replizierbar.
  • Die so erhaltene rekombinante DNA kann in geeignete Wirt-Mikroorganismen, wie zum Beispiel E. coli, B. subtilis, Actinomyces und Hefen eingeführt werden. Die gewünschten Klone können aus den Transformanten durch Anwendung des Koloniehybridisierungsverfahrens oder durch Auswählen mittels der Schritte des Kultivierens in Nährmedien, die Saccharide mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 3 oder höher enthalten und die sowohl den α-1,6 glykosidischen Bindungsrest als eine Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende als auch die α-1,4 glykosidische Bindung außer der genannten Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende tragen, und des Auswählens von Stämmen, die Cyclotetrasaccharide aus den Sacchariden herstellen, erhalten werden,.
  • Die so erhaltenen Transformanten produzieren das Polypeptid der vorliegenden Erfindung extra/intrazellulär, wenn sie in Nährmedien kultiviert werden. Herkömmliche flüssige Medien, die mit Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und Mineralien, darüber hinaus falls nötig, mit Spuren-Nährstoffen, wie zum Beispiel Aminosäuren und Vitaminen, supplementiert worden sind, werden für gewöhnlich als Nährmedien verwendet. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Saccharide einschließlich Stärke, Stärkehydrolisate, Glukose, Fruktose, Saccharose, α,α-Trehalose, α, β-Trehalose und β, β-Trehalose. Beispiele von Stickstoffquellen sind stickstoffhaltige anorganische und or ganische Substanzen einschließlich Ammoniak, Ammoniumsalz, Harnstoff, Nitrat, Pepton, Hefeextrakt, entfettete Sojabohnen, Flüssigkeit von eingeweichtem Getreide und Fleischextrakt. Kulturen, die das Polypeptid enthalten, werden durch die Schritte des Impfens des Transformanten in die Nährmedien, des Kultivierens über einen bis sechs Tage unter aeroben Bedingungen, wie zum Beispiel unter Belüften und Bewegen, während die Temperatur und der pH für gewöhnlich bei 20–40°C und der pH bei 2–10 beibehalten wird, erhalten. Obwohl die Kultur zur Enzymherstellung intakt verwendet werden kann, werden die Polypeptide der vorliegenden Erfindung für gewöhnlich, falls nötig, aus den Zellen oder der Zelldebris getrennt und vor der Verwendung durch Filtration oder Zentrifugieren gereinigt, nachdem sie aus den Zellen unter Verwendung des Osmoseschockverfahrens oder der Behandlung mit Detergenzien extrahiert wurden, oder die Zellen durch Ultraschall oder unter Verwendung von zell-lysierenden Enzymen aufgeschlossen wurden. Die Polypeptide können gereinigt werden durch Anwendung der Reinigungsverfahren für Polypeptide, die im Allgemeinen verwendet werden, zum Beispiel eine geeignete Kombination von einem oder mehreren Verfahren wie zum Beispiel Aufkonzentrierung, Aussalzen, Dialyse, Ausfällung, Gelfiltrationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie, Affinitätschromatographie, Gelelektrophorese und Isoelektrofokussierung.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung haben einzigartige Eigenschaften, da sie eine Aktivität aufweisen zur Bildung eines Cyclotetrasaccharids aus Sacchariden mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 3 oder höher und die sowohl die α-1,6 glykosidische Bindung als eine Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende als auch die α-1,4 glykosidische Bindung außer der genannten Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende tragen, und die Aminosäurensequenzen der SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 oder die Aminosäurensequenzen mit Deletion, Austausch oder Einführung von einer oder mehrerer Aminosäuren der SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 umfassen. Ein Cyclotetrasaccharid, das durch die Einwirkung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, zeigt keine Amino-Carbonylreaktivität und weniger Bräunen und Verderb, da es nicht reduziert werden kann. Das Saccharid weist auch eine Fähigkeit, Einschlüsse flüchtiger Substanzen, wie zum Beispiel Ethylalkohol und Essigsäure zu bilden, aufgrund seiner cyclischen Struktur auf. Ferner hat das Cyclotetrasaccharid nützliche Merkmale, wie zum Beispiel Milde und geringe Süße, welche den inhärenten Geschmack von Nahrungsmitteln weniger durch übermäßige Süße verderben, geringe Gärfähigkeit und niedrige Verdaubarkeit, sodass es geeignet als Ballaststoff ist.
  • Nachfolgend wird die Bildung des Cyclotetrasaccharids erklärt. Cyclotetrasaccharid kann erhalten werden, indem das Polypeptid der vorliegenden Erfindung auf das Substrat einwirkt, Saccharide mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 3 oder höher, und die sowohl die α-1,6 glykosidische Bindung als eine Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende als auch die α-1,4 glykosidische Bindung außer der genannten Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende tragen. Die Saccharide können als Transferprodukte erhalten werden, in dem α-Glukosidase, Dextrindextranase oder α-Isomaltosylglukosaccharid bildendes Enzym, das in PTC/JP01/06412 von den Erfindern der vorliegenden Erfindung offenbart ist, auf Stärke, Stärkeverbindungen wie zum Beispiel Amylopektin, Amylose und Glykogen, oder jene partiellen Hydrolysate, die durch die Verwendung von Säuren und/oder Amylasen erhalten werden, einwirken gelassen wird. Die Saccharide können auch erhalten werden, indem β-Amylase und Pullulanase auf Pullulan einwirken. Beispiele dieser Saccharide sind ein oder mehrere Saccharide mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 3 oder höher, und sowohl die α-1,6 glykosidische Bindung als eine Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende als auch die α-1,4 glykosidische Bindung außer der genannten Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende, wie zum Beispiel 62-O-α-Glukosylmaltose, 63-O-α-Glukosylmaltotriose, 64-O-α-Glukosylmaltotetraose und 65-O-α-Glukosylmaltopentaose, tragen.
  • Beim Herstellungsprozess des Cyclotetrasaccharids kann das Polypeptid der vorliegenden Erfindung vorteilhaft zum Einwirken beim Beginn, Verlauf oder am Ende der Saccharidbildung mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 3 oder höher, und das sowohl die α-1,6 glykosidische Bindung als eine Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende als auch die α-1,4 glykosidische Bindung außer der genannten Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende trägt, zugefügt werden. Für gewöhnlich lässt man das Polypeptid der vorliegenden Erfindung auf geeignete Lösungen, die ein oder mehrere der oben beschriebenen Saccharide als das Substrat enthalten, unter Beibehalten der gewünschten Temperatur und pH einwirken, bis die gewünschte Menge an Cyclotetrasaccharid gebildet ist. Obwohl die enzymatische Reaktion bei einer Substratkonzentration von ungefähr 0,1 % (M/M) abläuft, werden 1 %-ige oder höhere Substratkonzentrationen (in der gesamten Beschreibung wird nachfolgend (M/M)" mit „%" abgekürzt, sofern nicht anders spezifiziert), stärker bevorzugt werden 5–50 % für die Herstellung im industriellen Maßstab verwendet. Die Temperaturen für die enzymatische Reaktion, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind diejenigen, bei denen die enzymatische Reaktion abläuft, d. h. jene bis zu ungefähr 60°C, vorzugsweise ungefähr 30°C bis ungefähr 50°C. Die pHs für die enzymatische Reaktion werden für gewöhnlich auf 4,5 bis 8, vorzugsweise ungefähr 5,5 bis ungefähr 7 eingestellt. Da die Menge des Polypeptids der vorlie genden Erfindung eng mit der Zeit für die Reaktion zusammenhängt, kann diese passend festgesetzt werden abhängig vom Wirkungsgrad der enzymatischen Reaktion. Das Polypeptid kann vorteilhaft als ein immobilisiertes Polypeptid verwendet werden, indem es auf geeignete Träger unter Verwendung herkömmlicher Verfahren immobilisiert wird.
  • Das Reaktionsgemisch, das aus der oben beschriebenen Reaktion erhalten wird, umfasst für gewöhnlich Cyclotetrasaccharid, Glukose, Maltodextrine, wie zum Beispiel Maltose, ein Saccharid mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 3 oder höher, und das sowohl die α-1,6 glykosidische Bindung als eine Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende als auch die α-1,4 glykosidische Bindung außer der genannten Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende, und kann vollständig als eine Cyclotetrasaccharid enthaltene Lösung verwendet werden. Nachdem man das Polypeptid der vorliegenden Erfindung auf das Substrat einwirken gelassen hat, können, falls nötig, verunreinigende Oligosaccharide in der Lösung hydrolysiert werden durch ein oder mehrere Enzyme, ausgewählt aus der Gruppe, die α-Amylase, β-Amylase, Glukoamylase und α-Glukosidase umfasst. Für gewöhnlich kann die Zuckerlösung nach weiterer Reinigung verwendet werden. Als Reinigungsverfahren können vorteilhaft ein oder mehrere herkömmliche Verfahren verwendet werden, zum Beispiel ausgewählt aus der Gruppe von Entfärbung mit Aktivkohle, Entsalzen durch H- oder OH-Ionenaustauscherharz und Säulenchromatographien, wie zum Beispiel Ionenaustauschsäulenchromatographie, Aktivkohle-Säulenchromatographie und Silikagel-Säulenchromatographie, Trennung unter Verwendung organischer Lösungsmittel wie zum Beispiel Alkohol und Aceton, Membrantrennung unter Verwendung geeigneter Trennbarkeit, Fermentierung durch Mikroorganismen, die fähig sind, die verunreinigenden Saccharide zu verwerten oder abzubauen, ohne das Cyclo tetrasaccharid auszunutzen, wie zum Beispiel Laktobacillus, Acetobakter und Hefe, und alkalische Aufbereitung, um die verbleibenden reduzierenden Zucker abzubauen. Insbesondere wird vorzugsweise Ionenaustauschchromatographie als Herstellungsverfahren im industriellen Maßstab verwendet; eine Säulenchromatographie, die ein stark saures Kationenaustauscherharz verwendet, wie zum Beispiel in den japanischen Patenten Kokai Nos. 23,799/83 und 72,598/98 offenbart ist. Bei Verwendung der Säulenchromatographie können die verunreinigenden Saccharide entfernt werden, sodass vorteilhaft Cyclotetrasaccharid mit einem verbesserten Gehalt an dem Zielsaccharid oder Saccharidzusammensetzungen, die selbiges umfassen, erzeugt werden. In diesem Fall kann jedes der Verfahren, Festbett-, Wirbelbett-, Fließbett-, Batch-, halbkontinuierliches und kontinuierliches Verfahren geeignet verwendet werden.
  • Das resultierende Cyclotetrasaccharid oder Saccharidzusammensetzungen, die selbiges mit verbessertem Gehalt umfassen, sind wässrige Lösungen, die Cyclotetrasaccharid für gewöhnlich 10 %-ig oder höher, d. s. b., vorzugsweise 40 %-ig oder höher, d. s. b., enthalten. Für gewöhnlich können das resultierende Cyclotetrasaccharid oder die Saccharidzusammensetzungen, die seliges umfassen, zu Sirupprodukten aufkonzentriert werden, und sie können optional weiter zu pulverförmigen Produkten getrocknet werden. Um Cyclotetrasaccharidkristalle herzustellen, können für gewöhnlich Saccharidlösungen, die ein wie oben beschrieben gereinigtes Cyclotetrasaccharid enthalten, vorzugsweise eine Cyclotetrasaccharidlösung mit einer Konzentration von ungefähr 40 % oder mehr, d. s. b., verwendet werden. Im Fall dass Cyclotetrasaccharid-Penta-bis-Hexa-Hydratkristalle erzeugt werden sollen, werden die Saccharidlösungen für gewöhnlich in eine übersättigte Lösung überführt, zum Beispiel mit einer Konzentration von ungefähr 40–90 %, und in einen Kristalisator eingebracht und dann stufenweise abgekühlt, während sie in Anwesenheit von 0,1–20 % d. s. b., eines Impfkristalls mit einer Temperatur, die die Übersättigung hält, vorzugsweise 10–90°C, gerührt werden, sodass Melasses erzeugt werden, die die Kristalle enthalten. Im Fall, dass Cyclotetrasaccharidmono-Hydrat oder wasserfreie Kristalle erzeugt werden, werden die Bedingungen der Übersättigung von höherer Temperatur und höherer Konzentration verwendet. Die Verfahren, Cyclotetrasaccharid-Kristalle und Melassen mit solchen Kristallen aufzufangen, umfassen zum Beispiel herkömmliche Verfahren wie zum Beispiel Abtrennung, Blockpulverisierung, fluidisierte Granulation und Sprühtrocknungsverfahren. Cyclotetrasaccharid-Mono-Hydrat und wasserfreie Kristalle können durch Dehydrieren und Trocknen von Cyclotetrasaccharid-Penta-bis-Hexa-Hydratkristallen hergestellt werden. Der resultierende Cyclotetrasaccharidkristall oder ein Pulver mit hohem Cyclotetrasaccharidgehalt ist ein nicht-reduzierendes oder gering reduzierendes weißes Pulver mit delikater und milder schwacher Süße, und ist ein stabiles Saccharid mit hoher Säuretoleranz und thermischer Stabilität. Das Pulver ist fast frei von Bräunung, Geruchsbildung und Verderb von Materialien, sogar wenn sie damit vermischt oder verarbeitet werden: Die Materialien sind insbesondere, beispielsweise aminosäurenhaltige Substanzen, wie Aminosäuren, Oligopeptide und Proteine. Ferner weist das Pulver eine geringe Hygroskopizität auf und ist fähig, Adhesion und Verfestigung pulvriger Substanzen zu verhindern.
  • Da das Cyclotetrasaccharid die Fähigkeit zum Einschluss aufweist, verhindert es wirksam die Zerstreuung und die Qualitätsminderung von geschmackvollen Komponenten und wirksamen Zutaten. Daher kann Cyclotetrasaccharid vorteilhaft als Geschmack erhaltendes Mittel und Stabilisator verwendet werden. Zu diesem Zweck kann, falls nötig, die kombinierte Verwendung von Cyclotetrasaccharid und einem anderen cyclischen Saccharid (anderen cyclischen Sacchariden), wie zum Beispiel Cyclodextrinen, verzweigten Cyclodextrinen, Cyclodextranen und Cyclofruktanen vorteilhaft verwendet werden, um die stabilisierenden Effekte zu verbessern.
  • Da Cyclotetrasaccharid nicht durch Amylase und α-Glukosidase hydrolysiert wird, wird es im Wesentlichen nicht von dem Körper assimiliert, wenn es oral verabreicht wird. Außerdem wird das Saccharid im Wesentlichen nicht durch Inestinalbakterien assimiliert und kann daher als extrem niederkalorische, wasserlösliche Diätfaser verwendet werden. In anderen Worten kann Cyclotetrasaccharid, obwohl es ein Gewicht und ein Volumen hat, welches ein volles Gefühl ergibt, wird es im Wesentlichen nicht assimiliert, wenn es oral verabreicht wird. Daher kann es vorteilhaft als niederkalorisches Nahrungsmaterial und Diätnahrungsmittel-Materiali verwendet werden. Cyclotetrasaccharid kann ebenfalls als ein Süßungsmittel verwendet werden, im Wesentlichen ohne dentale Karies zu verursachen, da es kaum durch die Bakterien, die zu der dentalen Karies führen, assimiliert wird.
  • Cyclotetrasaccharid an sich ist ein natürlicher Süßstoff mit einer guten Säuretoleranz, Alkalitoleranz und thermischer Stabilität, jedoch ohne dabei giftig und schädlich zu sein. Daher kann es im Fall eines kristallinen Produkts vorteilhaft für Tabletten und zuckerüberzogene Tabletten verwendet werden in Kombination mit Bindemitteln, wie zum Beispiel Pullulan, Hydroxyethylstärke und Polyvinylpyrrolidon. Ferner weist Cyclotetrasaccharid die Eigenschaften der Osmose steuernden Fähigkeit, der Füllstoff bereit stellenden Fähigkeit, der Glanz verleihenden Fähigkeit, der Feuchtigkeit rückhaltenden Fähigkeit, der Viskosität, der Synerese verhindernden Fähigkeit, der Fähigkeit zum Verhindern von Verfestigung, der Fähigkeit zum Beibehalten von Geschmack, Stabilität, der Fähigkeit zur Verhinderung von Kristallisierung für andere Zucker, unwesentlicher Fähigkeit zur Fermentierung, der Fähigkeit zur Verhinderung von Stärke-Retrogradation, der Fähigkeit zur Verhinderung von Proteindenaturierung, der Fähigkeit zur Verhinderung von Lipidverfall, etc. auf.
  • Daher können das Cyclotetrasaccharid und die Saccharidzusammensetzungen, die selbiges umfassen, vollständig als ein Süßungsmittel, ein gering gärfähiges Nahrungsmittelmaterial, ein gering verdauliches Nahrungsmittelmaterial, ein wenig kariogenes Nahrungsmittelmaterial, ein niederkalorisches Nahrungsmittelmaterial, als ein Mittel zum Geschmack verbessern, als ein Mittel zum Verbessern des Aromas, als ein qualitätsverbesserndes Mittel, zur Verhinderung von Synerese, zur Verhinderung von Verfestigung, als ein Mittel zur Beibehaltung des Aromas, zur Verhinderung von Stärke-Retrogradation, zur Verhinderung von Proteindenaturierung, zur Verhinderung von Lipidverfall, als Stabilisator, als Hilfsstoff, als Einschlussmittel, als Basis der Pulverisierung etc. verwendet werden. Falls nötig, kann die kombinierte Verwendung des Cyclotetrasaccharids und herkömmlicher Materialien vorteilhaft in verschiedenen Zusammensetzungen verwendet werden, zum Beispiel für Nahrungsmittelprodukte, Tabak, Zigaretten, Nahrungsmittel, Haustierfutter, Kosmetik und Arzneimittel. Würzmittel, Mittel, die Farbe und Aroma verleihen, Verstärkungsmittel, Emulgatoren, Mittel zur Vorbeugung gegen Oxidation und ultraviolette Strahlen und medizinische Wirkkomponenten können geeignet als herkömmliche Materialien verwendet werden.
  • Cyclotetrasaccharid und die Saccharidzusammensetzungen, die selbiges umfassen, können vollständig als Süßungsmittel ver wendet werden. Falls nötig, können sie vorteilhaft in Kombination mit weiteren Süßungsmitteln verwendet werden, zum Beispiel mit pulvrigem Sirup, Glukose, Fruktose, isomerisiertem Zucker, Saccharose, Maltose, α, α-Trehalose, α, β-Trehalose, β, β-Trehalose, Honig, Ahornzucker, Erythrit, Xylit, Sorbit, Maltit, Dihydrochalkon, Stevioside, α-Glykosylstevioside, Süßungsmittel der Momordica grosvenori, Glycyrrhizin, Thaumatin, L-Aspartyl-L-Phenylalanin-Methylester, Saccharin, Acesulfam K, Sukralose, Glycin und Alanin, und Füllstoffe wie zum Beispiel Dextrin, Stärke und Laktose. Insbesondere können Cyclotetrasaccharid und die Saccharidzusammensetzungen, die selbiges umfassen, geeignet als ein niederkalorisches Süßungsmittel, diätetisches Süßungsmittel oder ähnliches verwendet werden in Kombination mit einem oder mehreren niederkalorischen Süßungsmitteln, wie zum Beispiel Erythrit, Xylit und Maltit, und/oder einem oder mehreren Süßungsmitteln mit einer relativ hohen Süßkraft, wie zum Beispiel α-Glykosylstevioside, Thaumatin, L-Aspartyl-L-Phenylalanin-Methylester, Saccharin, Acesulfam K und Sukralose.
  • Pulverförmige und/oder kristalline Produkte aus Cyclotetrasaccharid und den Saccharidzusammensetzungen, die selbiges umfassen, können beliebig verwendet werden ganz oder, falls nötig, nach Mischen mit Füllstoffen, Hilfsstoffen, Bindemittel, etc. und dann zu Produkten mit verschiedenen Formen gebildet werden, wie zum Beispiel zu Granulaten, Kugeln, Stäben, Platten, Würfeln und Tabletten.
  • Cyclotetrasaccharid und die Saccharidzusammensetzungen, die selbiges umfassen, harmonisieren gut mit anderen schmeckbaren Materialien mit saurem, salzigen, bitteren, astringierenden, delikaten und bitteren Geschmack; und sie haben eine hohe Säure- und Wärmetoleranz. So können sie vorteilhaft verwendet werden als Süßungsmittel, Geschmacksverbesserer, aromaverbesserndes Mittel, qualitätsverbesserndes Mittel etc., um den Geschmack, das Aroma und die Qualität des Nahrungsmittelprodukts im Allgemeinen zu süßen und/oder zu verbessern, zum Beispiel eine Sojasoße, pulverförmige Sojasoße, miso, „funmatsu-miso" (einem pulverförmigen miso), „moromi" (einem veredelten Sake), „hishio" (einer veredelten Sojasoße), „furikake" (einer gewürzten Fischmahlzeit), Mayonnaise, Dressing, Essig, „sanbai-zu" (einer Soße aus Zucker, Sojasoße und Essig), „funmatsusushi-zu" (pulverförmigen Essig für Sushi), „chuka-no-moto" (einer Instantmischung für ein chinesisches Gericht), „tentsuyu" (einer Soße für japanisches, in tiefem Fett frittierten Essen), „mentsuyu" (einer Soße für japanische Vermicelli), Soße, Ketchup, „yakiniku-no-tare" (einer Soße für japanisches Grillfleisch), Curryschwitze, einer Instanteintopfmischung, einer Instantsuppenmischung, „dashi-no-moto" (einer Instantbrühenmischung), gemischten Würzmittel, „mirin" (einem süßem Sake), „shin-mirin" (einem synthetischen mirin), Tischzucker und Kaffeezucker. Ebenso können Cyclotetrasaccharid und die Saccharidzusammensetzungen, die selbiges umfassen, beliebig verwendet werden, um den Geschmack, das Aroma und die Qualität von „wagashi" (japanische Kuchen) zu süßen und zu verbessern, wie zum Beispiel „senbei" (ein Reiskräcker), „arare" (ein Reiskuchenwürfel), „okoshi" (ein Hirse- und Reiskuchen), „gyuhi" (eine Stärkepaste), „mochi" (eine Reispaste) und ähnlichem, „manju" (ein Brötchen mit einer Bohnen-Marmelade), „uiro" (ein süßes Reisgelee), „an" (eine Bohnen-Marmelade) und ähnlichem, „yokan" (ein süßes Gelee aus Bohnen), „mizu-yokan" (ein weiches Azuki-Bohnengelee), „kingyoku" (eine Art von Yokan), Gelee, pao de Castella und „amedama" (ein japanisches Karamell); westliche Süßwaren, wie zum Beispiel ein Brötchen, Keks, Kräcker, Plätzchen, Kuchen, Pudding, Buttercreme, Eiercreme, Windbeutel, Waffel, Biskuit, Donut, Schokolade, Kaugummi, Karamell, Nougat und Bonbons; gefrorene Desserts, wie zum Beispiel eine Eiscreme und Sorbet; Sirupe, wie zum Beispiel ein „kajitsu-no-syrup-zuke" (einer konservierten Frucht) und „korimitsu" (ein Zuckersirup für geschabtes Eis); Pasten, wie zum Beispiel eine Getreidepaste, Erdnusspaste und Fruchtpaste, verarbeitete Früchte und Gemüse, wie zum Beispiel eine Konfitüre, Marmelade, „syrup-zuke" (Fruchtpickles), und „toka" (Eingemachtes), Pickles und eingemachte Produkte, wie zum Beispiel ein „fukujin-zuke" (rot gefärbte Rettichpickles), „bettara-zuke" (eine Art ganze frische Rettichpickles), „senmai-zuke" (eine Art geschnittene frische Rettichpickles) und „rakkyo-zuke" (eingemachte Schalloten); eine Vormischung für Pickles und eingemachte Produkte, wie zum Beispiel ein „takuan-zuke-no-moto" (einer Vormischung für eingemachten Rettich) und „hakusai-zuke-no-moto" (eine Vormischung für frische weiße Rübsamenpickles), Fleischprodukte, wie zum Beispiel ein Schinken und Wurst; Produkte aus Fischfleisch, wie zum Beispiel Fischschinken, Fischwurst, „kamaboko" (eine gedämpfte Fischpaste), „chikuwa" (eine Art Fischpaste) und „tenpura" (eine japanische, in tiefem Fett frittierten Fischpaste); „chinmi" (relisch), wie zum Beispiel ein „uni-noshiokara" (gesalzene Eingeweide von Igel), „ika-no-shiokara" (gesalzene Eingeweide von Tintenfisch), „su-konbu" (verarbeiteter Tang), „saki-surume" (getrocknete Tintenfischstreifen), „fugu-no-mirin-boshi" (ein getrockneter, mirin-gewürzter Kugelfisch), gewürztes Fischmehl, wie zum Beispiel aus pazifischem Kabeljau, Seebrasse, Garnelen, etc., „tsukudani" (in Sojasoße eingekochte Nahrungsmittel), wie zum Beispiel jene aus Leber, essbaren wilden Pflanzen, getrockneter Tintenfisch, kleinen Fischen und Schalentieren, tägliche Gerichte, wie zum Beispiel ein „nimame" (gekochte Bohnen), Kartoffelsalat und „konbu-maki" (eine Tangrolle), Milchprodukte, in Dosen und in Flaschen abgefüllte Produkte, wie jene aus Fleisch, Fisch fleisch, Früchten und Gemüse, alkoholische Getränke, wie zum Beispiel ein synthetischer sake, fermentierter Likör, Fruchtlikör und sak,; Softdrinks, wie zum Beispiel ein Kaffee, Kakao, Saft, Sprudelgetränk, Sauermilchgetränk und ein Getränk, das eine Milchsäurebakterie enthält, Instant-Nahrungsmittelprodukte, wie zum Beispiel eine Instant-Puddingmischung, eine Instant-Kuchenbackmischung, ein Instant-Saft, ein Instant-Kaffee, „sokuseki-shiruko" (eine Instant-Mischung aus Azuki-Bohnensuppe mit Reiskuchen) und eine Instant-Suppenmischung, und weitere Nahrungsmittel und Getränke, wie zum Beispiel feste Nahrungsmittel für Babys, Nahrungsmittel zur Therapie, Drinks, Getränke, die Aminosäuren enthalten, Peptidnahrungsmittel und gefrorene Nahrungsmittel.
  • Cyclotetrasaccharid und die Saccharidzusammensetzungen, die selbiges umfassen, können beliebig verwendet werden, um den bevorzugten Geschmack zu verbessern oder den Kaloriengehalt von Futter und Haustierfutter für Tiere und Haustiere, wie zum Beispiel für Nutztiere, Geflügel, Honigbienen, Seidenrauben und Fische, zu reduzieren; und sie können auch beliebig verwendet werden als ein Süßungsmittel und Geschmacksverbesserer, Geschmack erhaltendes Mittel, qualitätsverbesserndes Mittel und Stabilisator für weitere Produkte in einer pastösen oder flüssigen Form, zum Beispiel für Tabak, Zigaretten, Zahnpasta, Lippenstift, Rouge, Lippencreme, flüssige Medizin zur inneren Anwendung, Tabletten, Pastillen, Lebertranöl in Form von Tropfen, orales kühlendes Mittel, Cachou, Gurgelwasser, Kosmetik und Arzneimittel. Wenn es als ein qualitätsverbesserndes Mittel oder Stabilisator verwendet wird, können Cyclotetrasaccharid und die Saccharidzusammensetzungen, die selbiges umfassen, beliebig in biologisch aktiven Substanzen verwendet werden, die hinsichtlich des Verlustes ihrer wirksamen Bestandteile und Aktivitäten anfällig sind, sowie in Gesundheitsnahrungs mitteln, Kosmetik und Arzneimitteln, die biologisch aktive Substanzen enthalten. Beispiele für solche biologisch aktiven Substanzen sind flüssige Zubereitungen, die Zytokine, wie zum Beispiel α-, β-, und ☐-Interferone, Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), Tumornekrosefaktor-β (TNF-β), Makrophagen-Bewegungs-Inhibierungsfaktor, Kolonie stimulierender Faktor, Transferfaktor und Interleukin 2; flüssige Zubereitungen, die Hormone enthalten, wie zum Beispiel Insulin, Wachstumshormone, Prolaktin, Erythropoietin und Follikel stimulierendes Hormon; biologische Zubereitungen, wie zum Beispiel BCG Impfstoff, Impfstoff für japanischer Encephalitis, Masernimpfstoff, lebender Polioimpfstoff, Kleinpockenimpfstoff, Tetanusimpfstoff, Trimeresurus-Antitoxin und humanes Immunoglobulin; Antibiotika, wie zum Beispiel Penicillin, Erythromycin, Chloramphenikol, Tetracyclin, Streptomyzin und Kanamyzinsulfat; Vitamine, wie zum Beispiel Thiamin, Riboflavin, L-Askorbinsäure, Lebertranöl, Karotenoide, Ergosterol, Tocopherol; Lösungen von Enzymen, wie zum Beispiel Lipase, Esterase, Urokinase, Protease, β-Amylase, Isoamylase, Glukanase und Laktase; Extrakte, zum Beispiel Ginsengextrakt, Schildkrötenextrakt, Chlorellaextrakt, Aloeextrakt, Bambusblätterextrakt, Pfirsichblätterextrakt, Wollmispelblattextrakt, Zitronenschalenextrakt, Propolisextrakt; biologisch aktive Substanzen, zum Beispiel eine Paste aus lebenden Mikroorganismen wie einem Virus, Milchsäurebakterien und Hefe und Geleeroyal. Durch Verwendung des Cyclotetrasaccharids und den Saccharidzusammensetzungen, die selbiges umfassen, können die obigen biologisch aktiven Substanzen beliebig in Gesundheitsnahrungsmitteln, Kosmetika und Arzneimitteln in einer flüssigen, pastösen oder festen Form zubereitet werden, die eine zufrieden stellend hohe Stabilität und Qualität aufweisen, ohne dass befürchtet werden muss, dass sie ihre wirksamen Zutaten und Aktivitäten verlieren oder inaktivieren.
  • Die Verfahren zum Inkorporieren von Cyclotetrasaccharid oder der Saccharidzusammensetzung, die selbiges umfasst, in die vorgenannten Zusammensetzungen sind jene, die Cyclotetrasaccharid und die Saccharidzusammensetzungen in eine Vielfalt von Zusammensetzungen inkorporieren können, bevor deren Verarbeitung abgeschlossen ist, und die auf geeignete Weise aus den folgenden herkömmlichen Verfahren ausgewählt werden können; vermischen, kneten, auflösen, schmelzen, einweichen, durchdringen, dispergieren, applizieren, beschichten, sprühen, injizieren, kristallisieren und verfestigen. Um die verschiedenen Eigenschaften von Cyclotetrasaccharid zu gebrauchen, insbesondere die Einschlussfähigkeit, die Geschmacksverbesserungsfähigkeit und die Aromaverbesserungsfähigkeit, liegt die Menge von Cyclotetrasaccharid oder der Saccharidzusammensetzungen, die selbiges umfassen, die vorzugsweise in die Endzusammensetzung eingearbeitet werden, bei einer Größe von 0,1 % oder höher, wünschenswert wäre 1 % oder höher.
  • Die folgenden Beispiele erklären detailliert die Produktionsverfahren für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, das dadurch erhaltbare Cyclotetrasaccharid und die Saccharide, die selbiges umfassen:
  • Beispiel 1
  • Herstellung eines Polypeptids
  • Ein flüssiges Medium, das 5 g/l „PINE-DEX # 4", ein partielles Stärkehydrolysat, 20 g/l Polypepton, 20 g/l eines Hefeextrakts, 1 g/l Natriumphosphat und Wasser enthält, wurde in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben in einer Menge von 100 ml einge bracht, 15 Minuten lang bei 121°C sterilisiert und abgekühlt. Dann wurde das flüssige Medium steril auf pH 7,0 eingestellt und mit einem Ampicillinnatriumsalz vermischt, sodass sich eine Endkonzentration von 100 μg/ml ergab. Ein Transformant, BGC1, der mit dem Verfahren aus Experiment 5–2 erhalten wurde, wurde in das obige liquide Medium geimpft und bei 27°C und 230 Upm 24 Stunden lang kultiviert, um die Impfkultur zu erhalten. Nachfolgend wurden ungefähr 18 l einer frischen Zubereitung des gleichen flüssigen Kulturmediums, wie für die obige Impfkultur verwendet, in einen 30 l Fermenter eingebracht, auf die gleiche Weise sterilisiert, auf 27°C abgekühlt und dann mit Ampicillin vermischt, um eine Endkonzentration von 50 μg/ml zu ergeben, und mit 1 % (V/V) der Impfkultur geimpft, gefolgt von 48-stündigem Kultivieren bei 27°C unter belüftetem Bewegen. Nachdem die Zellen in der Kultur durch Ultraschall aufgeschlossen wurden und die Zell-Debris durch Zentrifugieren entfernt wurde, wurde die Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in dem sich ergebenden Überstand untersucht. Der Überstand hatte ungefähr 3.100 Einheiten/l an α-Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität. Ungefähr 74 ml Enzymlösung, die ungefähr 135 Einheiten/ml des Polypeptids der vorliegenden Erfindung enthalten, mit der α-Isomaltosyl transferierenden Enzymaktivität, deren spezifische Aktivität bei ungefähr 30 Einheiten/mg Protein liegt, wurden erhalten, indem der Überstand gemäß dem in Experiment 1 beschriebenen Verfahren gereinigt wurde.
  • Beispiel 2
  • Herstellung eines Polypeptids
  • Entsprechend dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurde BGN1, ein aus Experiment 6–2 erhaltener Transformant, durch Impfung kultiviert und dann unter Verwendung eines 30 l Fer menters hauptkultiviert. Nachdem die Zellen in der Kultur durch Ultraschall aufgeschlossen wurden und die Zell-Debris durch Zentrifugieren entfernt wurde, wurde die Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in dem sich ergebenden Überstand untersucht. Der Überstand hatte eine α-Isomaltosyl transferierende Enzymaktivität von ungefähr 3.000 Einheiten/l. Ungefähr 150 ml Enzymlösung, die ungefähr 72 Einheiten/ml des Polypeptids der vorliegenden Erfindung enthalten, mit α-Isomaltosyl transferierender Enzymaktivität, deren spezifische Aktivität bei ungefähr 30 Einheiten/mg Protein liegt, wurden erhalten, indem der Überstand entsprechend dem in Experiment 3 beschriebenen Verfahren gereinigt wurden.
  • Beispiel 3
  • Herstellung eines pulverförmigen Produkts, das Cyclotetrasaccharid enthält
  • Zu einen wässrigen Lösung, die 10 % Panose, die durch Hayashibara Biochemical Laboratories Inc. vertrieben wird und die auf pH 6,0 und 35°C eingestellt wird, wurde Enzympolypeptid, das durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren erhalten wurde, zugefügt, sodass sich eine Konzentration von 2 Einheiten/g Panose ergibt, und für 36 Stunden inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde auf 95°C erhitzt und 10 Minuten lang gehalten, dann abgekühlt und gefiltert, um ein Filtrat zu erhalten. Entsprechend dem herkömmlichen Verfahren wurde das sich ergebende Filtrat mit Aktivkohle entfärbt, entsalzt und mit Ionenaustauschern in H- und OH-Formen gereinigt, dann aufkonzentriert und zu pulverförmigen Produkten getrocknet, die Cyclotetrasaccharid mit einem Gehalt von ungefähr 91 %, d. s. b., enthielten. Da das Produkt auf einer trockenen festen Basis 34,0 % Glukose, 2,1 % Isomaltose, 2,3 % Panose, 45,0 % Cyclotetrasaccharid, 4,8 % Isomaltosylpanose, 1,8 % Isomaltosylpanosid und 10,0 % weitere Saccharide enthält und eine milde Süße, eine adäquate Viskosität, eine Fähigkeit zur Feuchtigkeitsrückhaltung und Einschlussfähigkeit aufweist, kann es vorteilhaft in einer Vielfalt von Zusammensetzungen verwendet werden, zum Beispiel Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln als ein Süßungsmittel, Geschmacksverbesserer, qualitätsverbesserndes Mittel, Synerese verhinderndes Mittel, Stabilisator, Hilfsstoff, Einschlussmittel und als Basis zum Pulverisieren.
  • Beispiel 4
  • Herstellung einer sirupartigen Zusammensetzung, die Cyclotetrasaccharid enthält
  • „SUNMALT®", eine pulverförmigen Maltose, vertrieben durch Hayashibara Co., Ltd., wurde in Wasser aufgelöst, sodass sich eine Konzentration von 30 % ergab, und mit 0,08 %, d. s. b., „TRANSGLUCOSIDASE L AMANOTM", eine α-Glukosidase, vertrieben durch Amano Pharmaceutical Co., Ltd., vermischt und dann auf pH 5,5 eingestellt, worauf die enzymatische Reaktion bei 55°C 18 Stunden lang erfolgte. Nachdem die Reaktion durch Erhitzen beendet wurde, wurde das Reaktionsgemisch auf pH 6,0 und 35°C eingestellt und mit 2 Einheiten/g trockener fester Basis des Enzympolypeptids, das in Beispiel 1 erhalten wurde, vermischt und dann 36 Stunden lang inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde auf 95°C erhitzt und 10 Minuten lang gehalten, dann abgekühlt und filtriert, um ein Filtrat zu erhalten. Entsprechend dem herkömmlichen Verfahren wurde das sich ergebende Filtrat mit Aktivkohle entfärbt, entsalzt und mit Ionenaustauschern in Hund OH-Formen gereinigt, und dann zu einem 70 % Sirup mit einem Gehalt von ungefähr 92 %, d. s. b., aufkonzentriert. Da das Produkt auf einer trockenen festen Basis 32,5 % Glukose, 15,7 % Maltose, 9,8 % Isomaltose, 4,0 % Maltotriose, 0,3 % Panose, 1,6 % Isomaltotriose, 17,5 % Cyclotetrasaccharid, 1,2 % Isomaltosylpanose, 0,7 % Isomaltosylpanosid und 16,7 % weitere Saccharide enthält und eine milde Süße, eine adäquate Viskosität, eine Fähigkeit zur Feuchtigkeitsrückhaltung und Einschlussfähigkeit aufweist, kann es vorteilhaft in einer Vielfalt von Zusammensetzungen verwendet werden, zum Beispiel in Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln als ein Süßungsmittel, Geschmacksverbesserer, qualitätsverbesserendes Mittel, Synerese verhinderndes Mittel, Stabilisator, Hilfsstoff, Einschlussmittel und als Basis zum Pulverisieren.
  • Beispiel 5
  • Herstellung eines kristallinen Pulvers aus Cyclotetrasaccharid
  • Eine Kartoffelstärke wurde zu einer 15 %-igen Stärkesuspension angesetzt, mit Kalziumkarbonat vermischt, sodass sich eine Endkonzentration von 0,1 % ergibt, auf pH 6,0 eingestellt und mit 0,2 % pro g Stärke „THERMAMYL 60 L" vermischt, einer α-Amylase, vertrieben durch Novo Industries A/S, Kopenhagen, Dänemark, und dann bei 95°C 15 Minuten lang erhitzt. Nach 30-minütigem Autoklavieren bei 2 kg/cm2 wurde das Reaktionsgemisch auf 35°C abgekühlt, mit 7,5 Einheiten/g-Stärke des Polypeptids der vorliegenden Erfindung vermischt, was in Beispiel 1 erhalten wurde, 2 Einheiten/g-Stärke des α-Isomaltosyl-Glukosaccharid bildenden Enzyms, das durch das Verfahren aus Experiment 1–3 erhalten wurde, und 10 Einheiten/g-Stärke von Cyclomaltodextringlukanotransferase, vertrieben durch Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., vermischt, worauf die enzymatische Reaktion 48 Stunden lang erfolgte. Nach 30 minütigem Erhitzen auf 95°C wurde das Reaktionsgemisch bei 5 % auf pH 5,0 und 45°C eingestellt mit 1500 Einheiten/g-Stärke „TRANSGLUCOSIDASE L AMANOTM", einer α-Glukosidase und 75 Einheiten/g-Stärke „GLUCOZYME", einer Glukoamylasezubereitung, vertrieben durch Nagase Biochemicals, Ltd, Kyoto, Japan, vermischt und dann 24 Stunden lang enzymatisch reagieren gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde auf 95°C erhitzt und 10 Minuten lang gehalten, danach abgekühlt und gefiltert, um ein Filtrat zu erhalten. Entsprechend des herkömmlichen Verfahrens wurde das sich ergebende Filtrat mit Aktivkohle entfärbt, entsalzt und mit Ionenaustauschern H- und OH-Formen gereinigt und dann zu einem 60 %-igem Sirup aufkonzentriert. Der sich ergebende Sirup enthielt auf einer trockenen festen Basis 27,5 % Glukose, 65,1 % Cyclotetrasaccharid und 7,5 % andere Saccharide. Die sich ergebende Saccharidlösung wurde einer Säulenchromatographie unter Verwendung von „AMBERLITE CR-1310 (Na-Form)", einem starken sauren Kationen-Austauscherharz, vertrieben durch Japan Organo Co., Ltd., Tokyo, Japan, unterzogen. Das Harz wurde in vier ummantelte Säulen aus rostfreiem Stahl mit einem Durchmesser von 5,4 cm gepackt, die stufenförmig in Serie geschaltet wurden, sodass sich eine gesamte Gelbetttiefe von 20 m ergab. Unter den Bedingungen, dass die innere Säulentemperatur bei 60°C beibehalten wurde, wurde die Saccharidlösung den Säulen in einem Volumen von 5 % (V/V) zugeführt und fraktioniert, indem den Säulen auf 60°C erhitztes heißes Wasser mit einer SV (Raumgeschwindigkeit) von 0,13 zugeführt wurde, sodass Fraktionen mit hohem Cyclotetrasaccharidgehalt erhalten wurde, während die Saccharidzusammensetzung des Eluats durch HPLC überwacht wurde, und dann wurden die Fraktionen mit hohem Cyclotetrasaccharidgehalt aufgefangen. Die Lösung mit hohem Cyclotetrasaccharidgehalt wurde mit einer Ausbeute von ungefähr 21 %, d. s. b. erhalten. Die Lösung enthielt ungefähr 98 %, d. s. b. Cyclotetrasaccharid.
  • Die Lösung wurde aufkonzentriert, sodass sich eine Konzentration von 70 % ergab, und dann in einen Kristallisator eingebracht, mit ungefähr 2 % kristallinem Cyclotetrasaccharidpen ta- oder Hexa-Hydrat als Impfkristalle vermischt und schrittweise abgekühlt, um eine Melasse mit einer Kristallinität von 45 % zu erhalten. Die Melasse wurde von einer Düse, die am Kopf des Trocknungsturms eingerichtet war, bei hohem Druck von 150 kg/m2 zerstäubt. Gleichzeitig wurde die auf 85°C erhitzte heiße Luft vom oberen Teil des Trocknungsturms gesenkt, und das sich ergebende Kristallpulver wurde auf einem Förderdrahtband aufgefangen, das am Fuß des Turms bereitgestellt wurde, und schrittweise aus dem Turm bewegt, während auf 45°C erhitzte heiße Luft dazu geblasen wurde. Das sich ergebende kristalline Pulver wurde in einen Reifungsturm injiziert und 10 Stunden lang reifen gelassen, während heiße Luft zu der Befüllung geblasen wurde, um die Kristallisierung und Trocknung abzuschließen, sodass ein kristallines Pulver aus Cyclotetrasaccharidpenta- oder Hexa-Hydrat erhalten wurde.
  • Da das Produkt eine relativ geringe Reduktionsfähigkeit hat, verursacht es im Wesentlichen weder die Amino-Karbonylreaktion noch zeigt es Hygroskopizität und hat eine zufrieden stellende Handhabbarkeit, milde geringe Süße, adäquate Viskosität, Fähigkeit zur Feuchtigkeitsrückhaltung, Einschlussfähigkeit und ist im Wesentlichen nicht verdaubar, kann es vorteilhaft in einer Vielfalt von Zusammensetzungen verwendet werden, zum Beispiel Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln als ein Süßungsmittel, für niederkalorische Nahrungsmittel, als Geschmacksverbesserer, aromaverbesserndes Mittel, qualitätsverbesserndes Mittel, Synerese verhinderndes Mittel, Stabilisator, Hilfsstoff, Einschlussmittel und als Basis zum Pulverisieren.
  • Beispiel 6
  • Herstellung eines kristallinen Pulvers aus Cyclotetrasaccharid
  • Eine Maisstärke wurde zu einer 28-igen % Stärkesuspension angesetzt, mit Kalziumkarbonat vermischt, sodass sich eine Konzentration von 0,1 % ergab, auf pH 6,5 eingestellt und mit 0,3 %/g-Stärke „THERMAMYL 60 l", einer α-Amylase, vertrieben durch Novo Industries A/S, Copenhagen, Dänemark, vermischt und dann bei 95°C 15 Minuten lang erhitzt. Nach 30-minütigem Autoklavieren bei 2 kg/cm2 wurde das Reaktionsgemisch auf 50°C abgekühlt, mit 6 Einheiten/g-Stärke des Polypeptids der vorliegenden Erfindung, erhalten in Beispiel 2, 1,8 Einheiten/g-Stärke des α-Isomaltosylglukosaccharid bildenden Enzyms, das durch das Verfahren aus Experiment 3–3 erhalten wurde, und einer Einheit/g-Stärke von Cyclomaltodextringlukanotransferase, vertrieben durch Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., vermischt, worauf die enzymatische Reaktion 72 Stunden lang erfolgte. Nach 30 minütigem Erhitzen auf 95°C wurde das Reaktionsgemisch auf pH 5,0 und 50°C eingestellt, mit 300 Einheiten/g-Stärke „TRANSGLUCOSIDASE L AMANOTM", einer α-Glukosidase, vermischt, 24 Stunden lang reagieren gelassen und dann mit 10 Einheiten/g d. s. b. „GLUCOZYME", einer Glukoamylasezubereitung, vertrieben durch Nagase Biochemicals, Ltd, Kyoto, Japan, und 20 Einheiten/g d. s. b. „NEO-SPITASE PK2", einer α-Amylasezubereitung, vermischt und dann 17 Stunden lang reagieren gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde auf 95°C erhitzt und 30 Minuten lang gehalten, dann abgekühlt und filtriert, um ein Filtrat zu erhalten. Entsprechend des herkömmlichen Verfahrens wurde das sich ergebende Filtrat mit Aktivkohle entfärbt, entsalzt und mit Ionenaustauschern in H- und OH-Formen gereinigt und dann zu einem 60 %-igem Sirup aufkonzentriert. Der sich ergebende Sirup enthielt auf einer trockenen festen Basis 35,1 % Glukose, 51,1 % Cyclotetrasaccharid und 13,8 % andere Saccharide. Die sich ergebende Saccharidlösung wurde durch eine Säulenchromatographie unter Verwendung eines starken sauren Kationenaustauscherharzes, das in Beispiel 5 beschrieben wurde, fraktioniert, und dann wurden die Fraktionen mit hohem Cyclotetrasaccharidgehalt in einer Ausbeute von ungefähr 39 % d. s. b. aufgefangen. Die Lösung enthielt ungefähr 80 % d. s. b., Cyclotetrasaccharid.
  • Die Lösung wurde kontinuierlich während des Aufkonzentrierens kristallisiert. Die resultierende Melasse wurde durch eine Zentrifuge vom Korbtyp getrennt, um Kristalle zu erhalten, die dann mit einer kleinen Wassermenge zerstäubt wurden, um ein hochreines Cyclotetrasaccharidpenta- oder Hexa-Hydrat in einer Ausbeute von ungefähr 23 % d. s. b., zu erhalten.
  • Da das Produkt eine relativ geringe Reduktionsfähigkeit hat, verursacht es im Wesentlichen weder die Amino-Karbonylreaktion noch zeigt es Hygroskopizität und hat eine zufrieden stellende Handhabbarkeit, milde geringe Süße, adäquate Viskosität, Fähigkeit zur Feuchtigkeitsrückhaltung, Einschlussfähigkeit und ist im Wesentlichen nicht verdaubar, kann es vorteilhaft in einer Vielfalt von Zusammensetzungen verwendet werden, zum Beispiel Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln als ein Süßungsmittel, für niederkalorische Nahrungsmittel, als Geschmacksverbesserer, aromaverbesserndes Mittel, qualitätsverbesserndes Mittel, Synerese verhinderndes Mittel, Stabilisator, Hilfsstoff, Einschlussmittel und als Basis zum Pulverisieren.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Wie oben beschrieben, ist die vorliegende Erfindung eine Erfindung, die ein neuartiges Polypeptid, das eine α-Isomaltosyl transferierende Aktivität hat, bereit stellt sowie dessen Herstellungsverfahren und Verwendungen. Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann in großer Menge und bei relativ geringen Kosten durch rekombinante DNA-Techniken stabil zur Verfügung gestellt werden. Daher kann gemäß der vorliegenden Erfindung ein Cyclotetrasaccharid mit einer Cyclo {→6)-α-D-Glucopyranosyl-(1→3)-α-D-Glucopyranosyl-(1→6)-α-D-Glucopyranosyl-(1→3)-α-D-Glucopyranosyl-(1→}-Strukur, eine Saccharidmischung, die selbiges umfasst, und eine Vielfalt von Zusammensetzungen, die selbiges umfassen, stabil in industriellem Maßstab und bei relativ geringen Kosten hergestellt werden. Da das Cyclotetrasaccharid eine relativ geringe Reduktionsfähigkeit hat, verursacht es im Wesentlichen weder die Amino-Karbonylreaktion noch zeigt es Hygroskopizität und hat eine zufrieden stellende Handhabbarkeit, milde geringe Süße, adäquate Viskosität, Fähigkeit zur Feuchtigkeitsrückhaltung, Einschlussfähigkeit und ist im Wesentlichen nicht verdaubar, kann es vorteilhaft in einer Vielfalt von Zusammensetzungen verwendet werden, zum Beispiel Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln als ein Süßungsmittel, für niederkalorische Nahrungsmittel, als Geschmacksverbesserer, aromaverbesserndes Mittel, qualitätsverbesserndes Mittel, Synerese verhinderndes Mittel, Stabilisator, Hilfsstoff, Einschlussmittel und als Basis zum Pulverisieren.
  • Die vorliegende Erfindung mit diesen außerordentlichen Funktionen und Wirkungen ist eine bedeutende wichtige Erfindung, die sehr zu dieser Technik beiträgt. SEQUENZLISTING
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Claims (11)

  1. Polypeptid, welches durch eine α-Isomaltosyl transferreaktion eine enzymatische Aktivität zur Herstellung eines Saccharids mit einer Cyclo {→6)-α-D-Glucopyranosyl-(1→3)-α-D-Glucopyranosyl-(1→6)-α-D-Glucopyranosyl-(1→3)-α-D-Glucopyranosyl-(1→}-Struktur eines Saccharids mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 3 oder höher hat und welches sowohl die α-1,6 glykosidische Bindung als eine Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende als auch die α-1,4 glykosidische Bindung außer der genannten Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende hat und das eine Aminosäurensequenz mit Deletion, Austausch oder Addition von einem bis zehn Aminosäureresten der SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 umfasst.
  2. Isolierte DNA, welche ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 oder das Polypeptid nach Anspruch 1 umfasst.
  3. DNA nach Anspruch 2, die eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 umfasst; eine Nukleotidsequenz mit Deletion, Austausch oder Einführung von einem bis dreißig Nukleotiden der SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4; oder dazu komplementäre Nukleotidsequenzen.
  4. DNA nach Anspruch 2 oder 3, welche erhältlich ist, indem ein oder mehr Nukleotide der SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 ausgetauscht werden, ohne die Aminosäurensequenz der SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2, basierend auf Degeneration des genetischen Codes, zu ändern.
  5. DNA nach einem der Ansprüche 2 bis 4, welche von einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus stammt.
  6. Replizierbare rekombinante DNA, welche die DNA nach einem der Ansprüche 2 bis 5 und einen autonom replizierbaren Vektor umfasst.
  7. Replizierbare rekombinante DNA nach Anspruch 6, wobei der autonom replizierbare Vektor ein Plasmid-Vektor, Bluescript II SK(+), ist.
  8. Transformant, der durch Einführung der rekombinanten DNA nach Anspruch 6 oder 7 in einen geeigneten Wirt geschaffen wurde.
  9. Transformant nach Anspruch 8, wobei der Wirt Escherichia coli ist.
  10. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit einer enzymatischen Aktivität, um durch eine α-Isomaltyl-Transferreaktion ein Saccharid einer Cyclo {→6)-α- D-Glucopyranosyl-(1→3)→α-D-Glucopyranosyl-(1→6)-D-Glucopyranosyl-(1→3)–α-D-Glucopyranosyl-(1→}-Struktur aus einem Saccharid mit einem Glukose-Polymerisationsgrad von 3 oder höher und mit sowohl der α-1,6 glykosidischen Bindung als einer Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende als auch der α-1,4 glykosidischen Bindung außer der Bindung an dem nicht-reduzierenden Ende herzustellen, was die Schritte des Kultivierens des Transformanten nach Anspruch 8 oder 9 und des Aufnehmens des Polypeptids aus der resultierenden Kultur umfasst.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 durch eine oder mehr Techniken aufgenommen wird, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Zentrifugieren, Filtration, Konzentration, Aussalzen, Dialyse, Konzentration, Trennausfällung, Ionenaustausch-Chromatographie, Gelfiltrations-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie, Affinitätschromatographie, Gel-Elektrophorese und isoelektrischer Fokussierung.
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